8 Theorie Proteinbestimmung und

Theorie: Proteinbestimmung und proteolytischer Verdau von Bacteriorhodopsin
8 Theorie Proteinbestimmung und proteolytischer Verdau
von Bacteriorhodopsin
8.1 Quantitative Proteinbestimmung
8.1.1 Einführung
Bevor Proteine weitergehend charakterisiert werden, ist es meist erforderlich festzustellen, welche
Proteinmenge in einer gegebenen Lösung vorhanden ist. Hierzu existieren viele unterschiedliche Methoden. Zu den meisten Bestimmungen gibt es darüber hinaus etliche Modifikationen und diverse
kommerziell erhältliche Varianten. Auch nach jahrzehntelangen Untersuchungen auf dem Gebiet der
quantitativen Proteinbestimmung ist noch kein Verfahren bekannt, das universell und einfach einsetzbar ist. Ein Hauptproblem neben dem komplexen und sehr variablen Aufbau von Proteinen ist, dass
eine biochemische Probe neben Protein und Wasser noch eine Vielfalt unterschiedlicher Substanzen
enthält. Salze, Puffer, Reduktionsmittel und Detergenzien beeinflussen die Verfahren in ganz unterschiedlichem Ausmaß. Wenn also ein und dieselbe Probe mit diversen Verfahren gemessen wird,
muss daraus nicht das gleiche Ergebnis resultieren.
Im Folgenden sind zwei kolorimetrische Verfahren vorgestellt, deren Farbreaktion Proben denaturieren. Im Gegensatz dazu bleibt bei der UV-Spektroskopie die biologische Funktion erhalten, dafür
muss eine geringere Sensitivität in Kauf genommen werden.
8.1.2 Verfahren A: Bradford
Die Bradford-Methode[1] beruht auf
+
der
Anlagerungsreaktion
von
H 3C
N
Coomassie Brillant Blue G-250
-O3S
SO3H 3C
(CBBG) an Proteine (vor allem kationische und nichtpolare, hydrophobe
N
H3C
Seitenketten). Dadurch kommt es zur
CH 3
Verschiebung
des
AbsorptionsCH 3
maximums des Farbstoffs von 450 nm
N
O
H
zu 590 nm. Die Zunahme der AbsorpAbb. 8. 1: Coomassie Brillant Blue G-250
tion bei 590 nm ist proportional zur
Proteinkonzentration in der Lösung.
Eine bessere Linearität lässt sich erreichen, indem man das Verhältnis A590 nm/A450 nm gegen die
Proteinkonzentration aufträgt. Die Proteinbestimmung nach der Bradford-Methode ist schnell und
einfach durchzuführen, und weniger störanfällig insbesondere gegenüber Reduktionsmitteln als die
Lowry- oder BCA-Methode. Nachteilig ist, dass die Bradford-Methode störanfällig gegenüber Substanzen ist, die das Absorptionsmaximum von CBBG beeinflussen (z.B. Detergenzien). Außerdem
adsorbiert der Farbstoff an Gefäßwänden und der Haut.
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8.1.3 Verfahren B: Pyrogallolrot
Die Pyrogallol-Methode[2] beruht auf der Farbreaktion eines
Pyrogallolrot-Molybdat-Komplexes mit Proteinen. Hierbei kommt es
unter sauren Bedingungen zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums von 600 zu 470 nm. Störend wirken bei diesem Test
Aminoglycoside und Ampholyte. Im Gegensatz zum Bradford-Test
ist die Pyrogallol-Methode[3] robuster gegenüber Detergenzien, und
der Pyrogallol-Farbstoff adsorbiert nicht an Gefäße. Ein weiterer
Vorteil ist der große dynamische Bereich.
O
S
O
O
HO
OH
O
OH
OH
Abb. 8. 2: Pyrogallolrot
8.1.4 Auswertung der Proteinbestimmung
Bei allen kolorimetrischen Verfahren wird zunächst die Proteinmenge im Testansatz bestimmt und
diese anschließend unter Berücksichtigung der Verdünnungen und der eingesetzten Volumina auf die
Proteinkonzentration der Ausgangslösung umgerechnet. Für diese Verfahren ist eine Kalibrierung mit
einem Proteinstandard erforderlich, in diesem Versuch die BSA-Verdünnungsreihe mit bekannten
Proteinmengen. Zur Erleichterung der Auswertung ist es empfehlenswert, die Absorption als x-Achse
zu wählen und die Proteinmasse als y-Achse. Dies hat den Vorteil, dass man nach Erstellen einer Regressionsgerade sofort die geeignete Gleichung zur Bestimmung der unbekannten Proben erhält (siehe
Abb. 8. 3: Auftragung der Absorption einer Proteinstandardreihe).
Abb. 8. 3: Auftragung der Absorption einer Proteinstandardreihe
Zur Auswertung der kolorimetrischen Verfahren sollte also zunächst eine Tabelle für die BSAStandardreihe angefertigt werden, wie z.B.:
BSA-Masse
40 µg
20 µg
Absorption bei 600 nm
Absorption bei 470 nm
0,434
0,481
0,215
0,228
0,648
0,712
0,640
0,690
Quotient der
Absorptionen
0,670
0,676
0,336
0,330
Mittelwert der
Quotienten
0,673
0,333
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Theorie: Proteinbestimmung und proteolytischer Verdau von Bacteriorhodopsin
Hierbei wurde als Beispiel die Pyrogallolrot-Methode verwendet, wobei jeweils 20 µL von jeder Proteinlösung eingesetzt werden. Die berechneten Mittelwerte für die Absorption bzw. des Quotienten
können dann wie in Abb. 8. 3: Auftragung der Absorption einer Proteinstandardreihe aufgetragen
werden, um eine Regressionsgerade zu erhalten. Durch diese Gerade wird jedem Wert für die Absorption (bzw. Quotient) eine Proteinmasse zugeordnet.
Der Zusammenhang zwischen der Proteinmenge und dem zugehörigem Absorptionswert ist nur in
einem bestimmten Bereich linear. Es gibt aber immer einen mehr oder weniger stark ausgeprägten
hyperbolischen Kurvenverlauf.
Allen Methoden gemeinsam ist die Tatsache, dass sie keine absoluten, von der Art des Proteins völlig
unabhängigen Konzentrationswerte ergeben. Die als Messgröße dienende Farbentwicklung ist nicht
nur von der Proteinmenge, sondern auch von der Art des Proteins, d.h. von den jeweiligen Anteilen
bestimmter Aminosäuren, abhängig.
Nach der Auswertung für die BSA-Standardreihe ist nun an Hand der Regressionsgeraden die Proteinmasse in den unbekannten Proben zu bestimmen. Im nächsten Schritt wird die Proteinmasse auf das
eingesetzte Probenvolumen (bei Verdünnung A: 20 µL bzw. Verdünnug B: 15 µL) bezogen und
schließlich die Verdünnung einbezogen, um die Proteinkonzentration zu ermitteln. (z.B.
Pyrogallolrot):
Probe
A
B
Mittelwert
der Quotienten
0,201
0,206
0,133
0,132
Proteinmasse
[µg]
10,9
11,2
8,1
8,0
Konz. der 1:10Verdünnung
[µg/µL]
0,545
0,560
0,540
0,533
Konz. der
Stammlösung
[mg/mL]
5,45
5,60
5,40
5,33
Mittelwert
Konzentration
[mg/mL]
5,53
5,37
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8.2 Proteolytischer Verdau
In diesem Versuchsteil soll Bacteriorhodopsin in Purpurmembranen mit Proteasen behandelt und
durch SDS-Gelelektrophorese analysiert werden.
Abb. 8. 4: Modell von Bacteriorhodopsin mit möglichen Schnittstellen verschiedener Proteasen[4]
Als Beispiel ist die Spaltung von Bacteriorhodopsin mit Papain und Chymotrypsin aufgeführt[5].
Papain ist eine Cystein-Protease, die aus Papaya isoliert werden kann. Papaya-Extrakte werden schon
seit Tausenden Jahren zum Zartmachen von Fleisch eingesetzt und finden auch heute noch Verwendung in der Lebensmittelindustrie. In der Biochemie ist die Spaltung von Antikörpern eine bekannte
Anwendung der Protease. Papain hat eine molare Masse von 23 kD. Das native Enzym ist recht inaktiv und bedarf einer Aktivierung durch Reduktionsmittel.
Chymotrypsin[6] ist eine Serin-Protease und spaltet bevorzugt an der carboxyterminalen Seite von
aromatischen Aminosäureresten, Leucin und Methionin. Es ist ein proteolytisches Enzym, welches im
Verdauungssystem von vielen Säugetieren und anderen Organismen vorkommt.
8.3 Quellenverzeichnis
[1] Marshall, T. and K. M. Williams (2004). "Interference in the Coomassie Brilliant Blue and
Pyrogallol Red protein dye-binding assays is increased by the addition of sodium dodecyl sulfate
to the dye reagents." Analytical Biochemistry 331(2): 255-259.
[2] Watanabe, N., S. Kamei, et. al. (1986). "Urinary protein as measured with pyrogallol redmolybdate complex, manually and in Hitachi 726 automated analyzer." Clin Chem 32 (8): 1551-4
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Theorie: Proteinbestimmung und proteolytischer Verdau von Bacteriorhodopsin
[3] Marshall, T. and K. M. Williams (2004). "Interference in the Coomassie Brilliant Blue and
Pyrogallol Red protein dye-binding assays is increased by the addition of sodium dodecyl sulfate
to the dye reagents." Analytical Biochemistry 331(2): 255-259.
[4] Liao, M. J. and H. G. Khorana (1984). "Removal of the carboxy-terminal peptide does not effect
refolding of function of bacteriorhodopsin as a light-dependent proton pump." J Biol Chem
259 (7): 4194-9
[5] Wölfer, U., et al. (1988). "Bacteriorhodopsin precursor is processed in two steps." European Journal of Biochemistry 174 (1): 51-57.
[6] Berg J. M., Tymoczko J. L., Stryer L., Häcker B. (2007): Stryer Biochemie, Spektrum Akademischer Verlag.
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