Anaplasma phagocytophilum IFA IgM (OUS)
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Anaplasma phagocytophilum IFA IgM (Auf Deutsch) Anaplasma phagocytophilum IFA IgM REF IF1450M Rev. H Indirekter Immunofluoreszenz-Assay (IFA) zum Nachweis humaner Serum-IgM-Antikörper gegen Anaplasma phagocytophilum Diese Packungsbeilage ist nur für den Export und nicht für den Vertrieb in den USA. Außerhalb der Vereinigten Staaten: Für die in vitro-Diagnostik ANWENDUNGSBEREICH Der Anaplasma phagocytophilum Indirekte Immunfluoreszenz Antikörpertest (IFA) ist zum semiquantitativen Nachweis humaner IgM Serumantikörper gegen Anaplasma phagocytophilum als Hilfe zur Diagnose einer humanen granulozytären Anaplasmosis vorgesehen. ZUSAMMENFASSUNG UND ERLÄUTERUNG DES TESTVERFAHRENS 2001 wurde von Dumler et al. vorgeschlagen, das die humane granulozytäre Anaplasmosis (HGA) verusachende Agens als Anaplasma phagocytophila1 zu klassifizieren. Nach Prüfung der Nomenklatur wurde Anaplasma phagocytophilum als korrekter Name akzeptiert. Die Gattungen Anaplasma, Ehrlichia, Cowdria, Neorickettsia und Wolbachia umfassen eine Bakteriengruppe, die früher nach morphologischen, ökologischen, epidemiologischen und klinischen Merkmalen klassifiziert wurde. Kürzlich durchgeführte, genetische Analysen haben allerdings die folgende Grobeinteilung der Gattungen nahe gelegt: 1. 2. 3. 4. Anaplasma (einschließlich die Gruppe Ehrlichia phagocytophila, Ehrlichia platys und Ehrlichia bovis) Ehrlichia (einschließlich Cowdria ruminantium) Wolbachia Neorickettsia (einschließlich Ehrlichia sennetsu und Ehrlichia risticii) Die Unterschiede zwischen E. phagocytophila, Ehrlichia equi und dem die humane granulozytäre Ehrlichiose (HGE) verursachenden Agens sind für eine individuelle Artenzuweisung nicht ausreichend. A. phagocytophila wurde erstmals entdeckt, nachdem bei einer Anzahl von Patienten in Minnesota und Wisconsin zwischen 1990 und 1993 eine akute fiebrige Erkrankung auftrat. Obwohl in der mikroskopischen Untersuchung membrangebundene Mikrokolonien (Morulae) in den Granulozyten dieser Patienten sichtbar waren, waren anfängliche Versuche der Kultur dieser Organismen nicht erfolgreich. Durch PCR identifizierten Chen et al das Agens als ein Mitglied der Genogruppe E. Phagocytophilia2, danach erfolgte die Isolation des Organismus in HL60 Zellen durch Goodman et al3. Humane granulozytäre Anaplasmosis ist eine Zoonose, die durch Nymphen und erwachsene Zecken der folgenden Arten übertragen wird: Ixodes scapularis in den Vereinigten Staaten und Ixodes ricinus in Europa4,5. In den USA wurde das A. phagocytophilum im nördlichen Bereich des Mittleren Westens, dem Nordosten und Nordkalifornien entdeckt. In Europa sind 3 bis 17% der Patienten mit Zeckenbissen aus Italien, Schweden und der Schweiz, die einem Arzt vorstellig werden, seropositiv6. Koinfektion mit Borrelia burgdorferi, dem Verursacher der Lyme Krankheit, wird durch einen gemeinsamen Vektor ermöglicht7. Die klinischen Manifestationen in den meisten Patienten äußern sich zuerst als grippe-ähnliche Symptome, darunter Fieber, Muskelschmerzen, Versteifungen und Kopfschmerzen: Ausschläge treten selten auf. Die Laborwerte weisen leicht erhöhte Spiegel an Aspartataminotransferase. Laktatdehydrogenase und Kreatinin, sowie erhöhte Blutsenkungswerte auf. Nach Bakken et al besteht ein umgekehrtes Verhältnis zwischen der Wahrscheinlichkeit einer HGA Infektion und den Absolutwerten der weißen Blutkörperchen (WBZ) und/oder der Anzahl der Blutplättchen8. HGA spricht besonders auf die Behandlung mit Doxycyclin oder Tetracyclin an, dabei tritt ein Rückgang des Fiebers innerhalb von 48 Stunden und eine vollständige Genesung innerhalb von 7 Tagen ein. HGA Patienten zeigen in vielen Fällen eine robuste Immunantwort gegen A. phagocytophilum. Ohne Behandlung steigen die IgM Titer in der Regel 3 bis 5 Tage nach der Infektion, oder 24 Stunden nach erstmaligem Auftreten des Fiebers, an und fallen danach innerhalb von 30 bis 60 Tagen bis unter die Nachweisgrenze ab. IgG Titer sind in vielen Fällen etwa 7 bis 10 Tage nach der Infektion nachweisbar, erreichen ihr Maximum nach 14 bis 21 Tagen und persistieren über die Dauer von einem Jahr. Die Rate der Seropositivität für IgG und IgM Antikörper ist im Juli, August und September am höchsten. Da das A. phagocytophilum nur bei 20% der untersuchten Patienten in den peripheren Granulozyten beobachtet wurde8, kann dies nicht als sensitiver diagnostischer Tests verwendet werden. Serologische Methoden, darunter der Western Blot und der indirekte Immunfluoreszenztest (IFA) sind zuverlässigere Tests. Die am häufigsten angewandte Methode bei der HGA Diagnostik ist der IFA, der zur Sicherstellung der Diagnose die Untersuchung sowohl der IgG als auch der IgM Antikörpern beinhalten sollte. Der Anaplasma phagocytophilum IFA IgM Assay von Focus Diagnostics benutzt HL60 Zellen, die mit dem HGE-1 Stamm infiziert wurden. Auf jedem Objektträger befinden sich 12 Reaktionsfelder. DAS TESTPRINZIP Der indirekte Immunfluoreszenz-Antikörper (IFA) Assay ist ein Zwei-Schritt - Verfahren, ein sogenanntes Sandwich. Im ersten Schritt werden Patientenseren mit IgM Verdünnungslösung verdünnt. Die verdünnten Seren werden auf die einzelnen Reaktionsfelder pipettiert und zur Erkennung und Reaktion mit dem Substrat inkubiert. Im Anschluss an die Inkubation, wird der Objektträger in gepufferter Salzlösung gewaschen, um ungebundene Serumantikörper zu entfernen. Im zweiten Schritt wird jedes Antigen-Reaktionsfeld mit fluoreszein-markierten Antikörpern gegen humanes IgM inkubiert. Auf diese Weise können AntigenAntikörper-Komplexe mit fluoreszein-markiertem Anti-IgM reagieren. Nachdem die Objektträger gewaschen, getrocknet und eingedeckt sind, können sie im Fluoreszenzmikroskop untersucht werden. Im Falle einer positiven Reaktion erscheinen die Morulae hell und apfelgrün fluoreszierend. Halb-quantitative Endtiter der positiven Proben werden in einer seriellen Verdünnungsreihe bestimmt. Anaplasma phagocytophilum IFA IgM Seite 2 GELIEFERTES MATERIAL Der Anaplasma phagocytophilum IFA IgM Testkit von Focus Diagnostics enthält ausreichend Material für 120 Bestimmungen. IgM Substratobjektträger REF IF1404 Ag IgM Substrate Slides 10 Objektträger mit jeweils 12 Reaktionsfeldern. Jedes Reaktionsfeld enthält inaktivierte Zellen, die mit A. phagocytophilum infiziert sind. Verschlossene Packungen bei 2 bis 8°C aufbewahren. Die verschlossenen Objektträger sind stabil bis zum Verfallsdatum auf dem Packungsetikett. Um Kondensation zu vermeiden, die Objektträger vor dem Öffnen auf Raumtemperatur erwärmen lassen. IgM Konjugat, 3.3 mL REF IF0002-3 CONJ IgM IgM Conjugate 3.3 mL Ein Röhrchen mit affinitätsgereinigtem und fluorezein-markiertem, mü-kettenspezifischem Ziegen-Anti-human IgM. Enthält Evan's Blue Gegenfärbelösung mit Proteinstabilisator und Konservierungsmittel. Das Konjugat ist bei +2 bis +8°C bis zum auf dem Packungsetikett angegebenen Datum haltbar. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen beeinträchtigt die Qualität des Produkts und sollte vermieden werden. IgM Nachweisbare Kontrolle, 0.3 mL REF IF1412 CONTROL > IgM Detectable Control, 0.3 mL Ein Röhrchen mit menschlichem Serum, unverdünnt verwendbar. Enthält Konservierungsmittel. Bei 2 bis 8°C bis zum auf dem Packungsetikett angegebenen Datum haltbar. Bei längerer Aufbewahrung, in kleinen Mengen (25 µL) bei mindestens –70°C einfrieren. Nicht verwenden bei Eintrübung, Einfärbung oder anderen Anzeichen einer bakteriellen Kontamination. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen beeinträchtigt die Qualität des Produkts und sollte vermieden werden. Nicht Nachweisbare Kontrolle, 0.25 mL REF IF1411 CONTROL < Non-Detectable Control, 0.25 mL Ein Röhrchen mit menschlichem Serum, gebrauchsfertig, entspricht einer Testverdünnung von 1:20. Enthält Konservierungsmittel. Bei 2 bis 8°C bis zum auf dem Packungsetikett angegebenen Datum haltbar. Nicht verwenden bei Eintrübung, Einfärbung oder anderen Anzeichen einer bakteriellen Kontamination. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Nicht verdünnen. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen beeinträchtigt die Qualität des Produkts und sollte vermieden werden. IgM Verdünnungslösung, 12 mL REF IF0609 DIL IgM IgM Pretreatment Diluent, 12 mL Ein Röhrchen mit PBS und Ziegen Anti-human IgG monospezifisches Antiserum, mit Konservierungsmittel. Bei 2 bis 8°C bis zum auf dem Packungsetikett angegebenen Datum haltbar. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Eindeckmedium, 2.5 mL REF IF0007 REAG MONT Mounting Medium, 2.5 mL Eine Tropfenspenderflasche mit phosphatgepuffertem Glycerin, pH 7,2 ± 0.1. Enthält Konservierungsmittel. Bei 2 bis 8°C bis zum auf dem Etikett angegebenen Datum haltbar. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. PBS REF IF0005 BUF PBS Ein Röhrchen mit gepufferter Salzlösung in Pulverform. In 1L destilliertem (oder gereinigten) Wasser auflösen. Die Lösung ist 0,01 M mit einem pH von 7,2 ± 0,1. PBS vor und nach dem Auflösen bei 2 bis 8°C aufbewahren. Vor Gebrauch auf Raumtemperatur erwärmen lassen. Nicht verwenden bei Eintrübung, Einfärbung oder anderen Anzeichen einer bakteriellen Kontamination. BENÖTIGTE MATERIALIEN, DIE NICHT IM LIEFERUMFANG ENTHALTEN SIND 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 24 x 50mm Deckgläser Teströhrchen und Gestell, Mikrozentrifugenröhrchen oder Mikrotiterplatte zur Herstellung von Serumverdünnungen. Klinische Zentrifuge 35 bis 37°C Inkubator oder Wasserbad zur Inkubation der Objektträger 2 bis 8°C Kühlschrank Spülflasche aus Plastik Kalibrierte Pipetten oder Pipettoren mit Einwegspitzen Coplingefäß oder Färbebesteck mit Objektträgerhalter Saubere Reagenzbecher oder geeichte Zylinder , 1 Liter Feuchte Kammer zur Inkubation der Objektträger Destilliertes (oder gereinigtes) Wasser Stoppuhr Absorbierendes Papier zum Abtupfen der Objektträger Fluoreszenzmikroskop; empfohlene Parameter: Exzitationsfilter 470 – 490 nm Barrierenfilter 520 – 560 nm Lichtquelle HBO 100W, Hg Objektiv 20 – 40X, Fluoreszenz, hoch trocken HALTBARKEITSDAUER UND HANDHABUNG DER KITS 1. 2. 3. Alle Komponenten sind stabil bis zum Monatsende des Verfalldatums bei einer Lagerung bei +2 bis +8°C. Testausrüstung und deren Bestandteile nur bis Ablauf des Verfalldatums verwenden. Reagenzien während der Lagerung oder Inkubation vor starkem Lichteinfall schützen. Anaplasma phagocytophilum IFA IgM Seite 3 WARNUNGEN UND SICHERHEITSVORKEHRUNGEN 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Diese Packungsbeilage ist nur für den Export und nicht für den Vertrieb in den USA. Außerhalb der Vereinigten Staaten ist dieser Kit nur für die In-vitroDiagnostik bestimmt. Alle Blutprodukte sollten als potentiell infektiös angesehen werden. Das Ursprungsmaterial dieses Produktes (einschließlich der Nicht Nachweisbare Kontrollen), ist mit US-FDA- anerkannten Methoden auf HBs-Antigen, Hepatitis C-Antikörper und HIV-1/2 (AIDS) Antikörper untersucht und für negativ befunden worden. Dennoch gewährleistet keine der bekannten Testmethoden absolute Garantie dafür, dass Produkte, die aus menschlichem Blut gewonnen wurden, die genannten oder andere infektiöse Krankheiten nicht übertragen können. Alle Kontrollen, Serumproben und Geräte, die in Kontakt mit den Proben kommen, sollten daher als potentiell infektiös angesehen und durch entsprechende Sicherheitsmaßnahmen dekontaminiert oder beseitigt werden.9,10,11 Die Substratobjektträger enthält inaktivierte Zellen, die mit A. phagocytophilum infiziert sind. Dennoch sollten die Objektträger als potentiell infektiös betrachtet und dementsprechend behandelt werden. Evans-Blau ist potenziell krebserregend. Die Konzentration dieses Produkts liegt jedoch unter dem meldepflichtigen Grenzwert von weniger als 0,1%. Reagenzien nicht durch Komponenten anderer Packungen oder durch Reagenzien anderer Hersteller ersetzen. Nur die Protokolle auf diesem Beipackzettel verwenden. Veränderung der angegebenen Inkubationszeiten oder Temperaturen kann zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. Kreuzkontaminationen von Patientenproben auf den Objektträgern können zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. Patientenproben daher vorsichtig auf die Objektträger auftragen, um ein Zusammenmischen von Seren benachbarter Reaktionsfelder zu vermeiden. Bakterielle Kontamination von Serumproben oder Reagenzien kann zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen. Zur Vermeidung von Kontamination sterile Arbeitstechniken benutzen. Das Eindeckmedium enthält 30 bis 60 % Glycerin, welches bei Inhalation oder Hautkontakt zu Reizungen führen kann. Nach Inhalation oder Berührung sollten Erste-Hilfe-Maßnahmen eingeleitet werden. PROBENENTNAHME UND VORBEREITUNG Serum ist die bevorzugte Probenquelle. Es wurde nicht untersucht, ob auch andere Proben mit diesem Test untersucht werden können. Hyperlipaemische, hämolysierte oder kontaminierte Seren können zu einer Verfälschung der Testergebnisse führen und ihr Gebrauch sollte daher vermieden werden. Probenentnahme und Handhabung Blutproben aseptisch unter Anwendung standardisierter Blutabnahme-Techniken entnehmen.9,10,11 Vor dem Zentrifugieren bei Raumtemperatur koagulieren lassen. Sterile Abnahme des Serums in einem fest verschließbaren, sterilen Behälter für die Lagerung bei +2 bis +8 Grad Celsius. Kann der Test erst nach mehr als 5 Tagen durchgeführt werden, sollten die Proben bei mindestens -20 Grad Celsius eingefroren und erst kurz vor Gebrauch wieder aufgetaut und gut durchmischt werden. Bei Lagerung in Kühlanlagen mit automatischer Abtauvorrichtung können die Proben durch wiederholtes Auftauen und Gefrieren beschädigt werden. Probenvorbehandlung Serum IgG Antikörper kann mit IgM kompetitieren, was zu einem falsch-negativen Ergebnis führt. Falsch-positive Ergebnisse treten auf, wenn Rheumafaktor (komplexbildende IgG) in der Probe vorhanden ist. Es wird daher dringend eine Vorbehandlung der Seren zur Entfernung von freiem und komplexbildenden IgG-Antikörpern empfohlen. Eine 1:20 Verdünnung der Patientenseren wie folgt vorbereiten: 5 µL Patientenserum mit 95 µL IgM Verdünnungslösung verdünnen. Mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur präzipitieren lassen.. Die verdünnte Probe kann unmittelbar verwendet oder zusätzlich zentrifugiert werden, um die Präzipitate aus dem Serum zu entfernen. Das Präzipitat beeinträchtigt den Test jedoch nicht. Für die Herstellung einer seriellen Verdünnungsreihe der vorbehandelten Screening-Verdünnungen zur Bestimmung des Endtiters kann PBS verwendet werden. TESTVERFAHREN 1. 2. Objektträger aus dem Kühlschrank nehmen und vor dem Öffnen der Packung Raumtemperatur annehmen lassen, um Kondensation zu vermeiden. 25 µL der gebrauchsfertigen IgM Nachweisbaren Kontrolle auf das vorgesehene Reaktionsfeld geben. Zur seriellen 32-fachen Verdünnung der Nachweisbaren Kontrolle PBS verwenden und davon jeweils 25 µl in die vorgesehenen Reaktionsfelder geben. 3. 25 µL der gebrauchsfertigen Nicht Nachweisbaren Kontrolle auf das vorgesehene Reaktionsfeld geben. Nicht Nachweisbare Kontrolle nicht verdünnen. 4. 25 µL der verdünnten/vorbehandelten Serumproben (siehe Probenvorbehandlung, oben) auf die vorgesehenen Reaktionsfelder geben. Zur besseren Identifikation beim Ablesen der Ergebnisse Auftragsreihenfolge markieren. 5. Objektträger in einer feuchten Kammer für 90 ± 2 Minuten bei 35 bis 37°C inkubieren. 6. Objektträger aus der feuchten Kammer entfernen und die Reihen einzeln vorsichtig mit PBS spülen. Dabei nicht direkt auf die Reaktionsfelder zielen. Objektträger durch Eintauchen in Coplingefäß oder Färbetrog mit PBS für 10 Minuten waschen. 7. Gewaschene Objektträger kurz in destilliertes (oder gereinigtes) Wasser tauchen und an der Luft trocknen. 8. Ungefähr 25 µL IgM Konjugat auf jedes Reaktionsfeld geben. 9. Objektträger in einer feuchten Kammer für 30 ± 2 Minuten bei 35 bis 37°C inkubieren. 10. Wasch-Schritte 6 und 7 wiederholen. 11. Einige Topfen Eindeckmedium auf die Objektträger auftropfen und mit einem Deckglas (24 x 50 mm) eindecken. Luftblasen absaugen und überschüssiges Eindeckmedium abtupfen. 12. Reaktionsfelder bei 400-facher Vergrößerung mit einem Fluoreszenzmikroskop untersuchen. Für optimale Fluoreszenz, die Objektträger am selben Tag untersuchen; ansonsten im Dunkeln bei 2 bis 8°C bis zu 24 Stunden aufbewahren. QUALITÄTSKONTROLLE Jedes Mal, wenn ein oder mehrere Objektträger benutzt werden, sollten sowohl Nachweisbare - als auch Nicht Nachweisbare Kontrollen enthalten sein. 1. Der Endtiter der Nachweisbare Kontrolle sollte bei einer Verdünnung von 1:8 der Lösung in der Flasche liegen. Je nach Laborbedingungen bzw. Technischer Ausstattung kann der Endpunkt zwischen einer Verdünnung von 1:4 und 1:16 der Lösung in der Flasche liegen. 2. Die Nicht Nachweisbare Kontrolle kann in den Reaktionsfeldern eine unbedeutende Fluoreszenz zeigen. Eine Fluoreszenzreaktion die eine andere Morphologie oder Verteilung als die der Nachweisbaren Kontrolle aufweist, muß als nicht nachweisbare gewertet werden. Weichen die Ergebnisse der Kontrollen von diesen Angaben ab, sollten die Patiententests als ungültig betrachtet und der Test wiederholt werden. INTERPRETATION DER TESTERGEBNISSE Die Intensität der Fluoreszenz und des Endtiters werden durch die Art und optische Beschaffenheit des Mikroskops und des Typs der Lichtquelle bestimmt. Bei jeder Testreihe daher die Kontrollfelder zuerst ablesen, um eine korrekte Interpretation zu gewährleisten. Ablesen der Objektträger Die Intensität der Fluoreszenz der Morula nach dem Ablesen wie folgt einordnen: 2 bis 4+ 1+ Negativ mittlere bis starke apfelgrüne Fluoreszenz der Morula. eindeutige, aber schwache Fluoreszenz, ähnlich wie die der Nachweisbare Kontrolle beim Endtiter. keine Fluoreszenz oder Fluoreszenz ähnlich wie auf der Reaktionsstelle der Nicht Nachweisbaren Kontrolle (oder weniger als Endtiter). Anaplasma phagocytophilum IFA IgM Seite 4 Interpretation der Patientenprobenergebnisse Der reziproke Wert der höchsten Serumverdünnung, die eine eindeutige (1+) apfelgrüne Fluoreszenz der Morula aufweist, wird als Endtiter bezeichnet. ≥1:20 <1:20 IgM Endtiter von 1:20 und höher deuten auf eine kürzliche oder zum Untersuchungszeitpunkt vorhandene HGA Infektion. Ein IgM Endtiter geringer als 1:20 deutet an, dass der Patient keine akute Infektion aufweist. Ein vierfacher oder höherer Anstieg des IgM Titers zwischen zwei Serumproben, die dem Patienten im Abstand von 1 bis 2 Wochen abgenommen wurden, gilt als vorläufiger Nachweis für eine zum Zeitpunkt der Untersuchung vorliegende HGA Infektion. EINSCHRÄNKUNGEN 1. 2. 3. Es ist wichtig, dass alle Ergebnisse aus A. phagocytophilum Serologien mit der klinischen Anamnese und anderen Informationen korrelieren, die dem Arzt vorliegen. Die Intensität der Fluoreszenz und des Endtiters werden durch die Art und optische Beschaffenheit des Mikroskops und des Typs der Lichtquelle bestimmt. Bei jeder Testreihe daher die Kontrollfelder zuerst ablesen, um eine korrekte Interpretation zu gewährleisten. Zu früh gewonnene Proben während der primären Infektion weisen unter Umständen keine nachweisbaren Antikörper auf. Bei Verdacht auf eine Infektion mit Bartonella, sollte eine zweite Serumprobe 10 bis 21 Tage später entnommen und parallel mit der Orginalprobe untersucht werden. ERWARTETE WERTE In Italien, Schweden und der Schweiz weisen 3 bis 17% der Patienten, die mit Zeckenbissen vorstellig werden, Seropositivität auf 6. SPEZIFISCHE LEISTUNGSDATEN Kunden außerhalb der Vereinigten Staaten finden die spezifischen Leistungsdaten des Tests auf einem separaten Blatt. LITERATUR 1. Dumler JS, Barbet AF, Bekker CP, Dasch GA, Palmer GH, Ray SC, Rikihisa Y, Rurangirwa FR. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and 'HGE agent' as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila. Int J Syst Evol Microbiol 2001 Nov;51(Pt 6):2145-65. 2. Chen, S., J.S. Dumler, J.S. Bakken and D.H. Walker. 1994. Identification of a granulocytic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease. Jour. Clin. Micro, 32:589-595. 3. 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