Dissertation D.P. Hoyer

Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln
Klinik III für Innere Medizin
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. E. Erdmann
Bedeutung der G-Proteine Gα11 und Gαq für die Entstehung der
Myokardhypertrophie bei Typ-1-Diabetes
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Dieter Paul Hoyer
aus Hannover
Promoviert am 13. Januar 2010
Aus dem Zentrum für Innere Medizin der Universität zu Köln
Klinik III für Innere Medizin
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. E. Erdmann
Bedeutung der G-Proteine Gα11 und Gαq für die Entstehung der
Myokardhypertrophie bei Typ-1-Diabetes
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Dieter Paul Hoyer
aus Hannover
Promoviert am 13. Januar 2010
Gedruckt mit der Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln, 2010
Dekan:
Universitätsprofessor Dr. med. J. Klosterkötter
1. Berichterstatter: Privatdozent Dr. med. H. Reuter
2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. W. Bloch
Erklärung:
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und
ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus
fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche
kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des
Manuskripts habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten:
Privatdozent
Dr.
med.
Jochen
Müller-Ehmsen,
Leiter
des
Labors
für
Herzmuskelphysiologie und molekulare Kardiologie, Klinik III für Innere Medizin der
Universität zu Köln.
Privatdozent Dr. med. Hannes Reuter, wissenschaftlicher Mitarbeiter im Labor für
Herzmuskelphysiologie und molekulare Kardiologie, Klinik III für Innere Medizin der
Universität zu Köln.
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht
beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch
genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorgelegten Dissertation stehen.
Die Arbeit wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder
ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt und ist auch noch nicht
veröffentlicht.
Köln, den 22. Februar 2009
Dieter P. Hoyer
Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung
durch Herrn Priv.-Doz. Dr. med. Hannes Reuter von mir selbst durchgeführt worden.
Danksagung
Herrn Professor Dr. med. E. Erdmann danke ich für die großzügige Bereitstellung der
Rahmenbedingungen, die diese Arbeit erst ermöglicht haben.
Weiterhin gilt mein Dank Herrn Priv.-Doz. Dr. med. Jochen Müller-Ehmsen, Leiter
des Labors für Herzmuskelphysiologie und molekulare Kardiologie. Mit freundlicher
und konstruktiver Kritik war er stets ein wertvoller Ansprechpartner.
Meinen außerordentlichen Dank möchte ich Herrn Priv.-Doz. Dr. med. Hannes
Reuter aussprechen. Mit Überlassung dieses Themas ermöglichte er mir,
wissenschaftliches Denken und Arbeiten zu erlernen. Durch sachkundige
Unterstützung und überaus kompetente, sowie freundliche Betreuung lieferte er mir
wichtige Informationen zur Durchführung der Experimente und war ein exzellenter
Ansprechpartner im Rahmen wissenschaftlicher Diskussionen.
Danken möchte ich Herrn Dr. med. dent. Yüksel Korkmaz, der für die
immunhistochemischen Experimente ein wertvoller Mentor war.
Den medizinisch-technischen Assistentinnen, Frau Katja Rösler und Frau Esra
Koroglu, habe ich für ihre fachliche Unterstützung zu danken.
Für
Karin und Peter
Heike, Felix, Johanna, Cornelia
und Katja
Inhaltsverzeichnis
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen ......................................................... IV
1
Einleitung ........................................................................................................... 1
1.1 Untersuchungen zum Diabetes mellitus und diabetesbedingter Komplikationen
am Kleintiermodell nach Streptozotocin-Injektion ................................................... 2
1.2 Bedeutung der G-Proteine Gαq/Gα11 für die Entstehung diabetesbedingter
Komplikationen am Herzen ..................................................................................... 3
1.3 Evidenz zur Bedeutung Gαq/Gα11-unabhängiger Mechanismen bei der
Entstehung diabetesbedingter Komplikationen am Herzen..................................... 6
1.4 Arbeiten zum Modell der Gαq/Gα11 Doppelknockout Maus.............................. 9
1.5 Proteinkinase C.............................................................................................. 10
1.6 Funktion und Bedeutung von Proteinen der Calcium-induzierten-CalciumFreisetzung und der Ca2+-Homöostase................................................................. 11
1.6.1
Ryanodin-Rezeptor Typ 2 ................................................................... 11
1.6.2
Sorcin .................................................................................................. 12
1.6.3
FKBP12.6............................................................................................ 13
1.6.4
Annexin VII.......................................................................................... 14
1.6.5
Natrium-Calcium-Austauscher ............................................................ 14
1.6.6
Calsequestrin ...................................................................................... 15
1.7 Fragestellungen ............................................................................................. 16
2
Material & Methoden ....................................................................................... 18
2.1 Materialien ..................................................................................................... 18
2.1.1
Versuchstiere ...................................................................................... 18
2.1.2
Verwendete Substanzen und Lösungen ............................................. 18
2.1.2.1
Tierexperimentelle Methoden....................................................... 18
2.1.2.2
DNA-Isolation............................................................................... 18
2.1.2.3
PCR ............................................................................................. 19
2.1.2.4
Herstellung von Homogenaten für Western Blot-Untersuchungen20
2.1.2.5
Bestimmung der Proteinkonzentration ......................................... 20
2.1.2.6
SDS-Gelelektrophorese und Western Blots ................................. 20
2.1.2.7
Quantitative Bestimmung des Ca2+-Verlustes an isolierten
Membranpartikeln .......................................................................................... 21
2.1.2.8
Immunhistochemie ....................................................................... 21
2.2 Methoden....................................................................................................... 23
2.2.1
Tierexperimentelle Methoden.............................................................. 23
I
Inhaltsverzeichnis
2.2.1.1
Induktion eines Diabetes Mellitus................................................. 23
2.2.1.2
Bestimmung der Blutzuckerwerte und des Körpergewichtes ....... 24
2.2.1.3
Opferung der Tiere und Organentnahme ..................................... 24
2.2.1.4
Echokardiographische Bestimmung funktioneller und
morphologischer Veränderungen am Herzen in vivo ..................................... 24
2.2.2
Genotypisierung der Mäuse ................................................................ 26
2.2.2.1
DNA Isolation ............................................................................... 26
2.2.2.2
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)............................................... 26
2.2.3
Untersuchungen zur Proteinexpression .............................................. 29
2.2.3.1
Herstellung von Homogenaten für Western Blot-Untersuchungen29
2.2.3.2
Bestimmung der Proteinkonzentration ......................................... 29
2.2.3.3
SDS-Gelelektrophorese ............................................................... 29
2.2.3.4
Western Blot ................................................................................ 30
2.2.4
Untersuchungen zur Funktion ............................................................. 31
2.2.4.1
Herstellung von Homogenaten und Bestimmung der
Proteinkonzentration für die quantitative Bestimmung des Ca²+-Verlustes an
isolierten Membranvesikeln ........................................................................... 31
2.2.4.2
Quantitative Bestimmung des Ca²+-Verlustes an isolierten
Membranvesikeln........................................................................................... 31
3
2.2.5
Immunhistochemie .............................................................................. 32
2.2.6
Statistische Methoden......................................................................... 34
Ergebnisse ....................................................................................................... 35
3.1 Charakterisierung der Versuchstiere.............................................................. 35
3.2 Genotypisierung der Mäuse........................................................................... 40
3.3 Echokardiographische Bestimmung funktioneller und morphologischer
Veränderungen am Herzen in vivo........................................................................ 41
3.4 Untersuchungen der Proteinexpression......................................................... 43
3.4.1
Expression des Ryanodinrezeptors Typ 2........................................... 44
3.4.2
Phosporylierung des RYR2 an Serin 2809.......................................... 46
3.4.3
Expression des Sorcin ........................................................................ 48
3.4.4
Expression des FKBP12.6 .................................................................. 50
3.4.5
Expression des Annexin VII ................................................................ 52
3.4.6
Expression des Na+-Ca2+-Austauschers ............................................. 54
3.5 Quantitative Bestimmung des Ca²+-Verlustes an isolierten Membranvesikeln57
II
Inhaltsverzeichnis
3.6 Immunhistochemie......................................................................................... 59
3.6.1
Immunhistochemische Ergebnisse zum Einfluss eines Typ1-Diabetes
auf die kardiale Expression und Translokation von PKC-Isoformen bei
Wildtypmäusen.................................................................................................. 59
3.6.2
Immunhistochemische Ergebnisse zum Einfluss eines Typ1-Diabetes
auf die kardiale Expression und Translokation von PKC-Isoformen bei Gα11
Knockoutmäusen............................................................................................... 63
4
Diskussion ....................................................................................................... 71
4.1 Das G-Protein Gα11 ist wesentlich an der Entwicklung einer Hypertrophie des
Herzens bei Typ1-Diabetes beteiligt ..................................................................... 71
4.2 Die Signalkaskade der pathophysiologischen Veränderungen bei Typ1Diabetes weisen Hinweise auf eine Beteiligung der Proteinkinas C auf ............... 73
4.3 Die Struktur und die Funktion des Proteinkomplexes der Ca2+-Freisetzung
zeigt eine Beeinflussung durch einen Typ1-Diabetes und die G-Proteine Gα11 und
Gαq 77
4.4 Klinische Bedeutung der vorliegenden Arbeit ................................................ 80
5
Zusammenfassung.......................................................................................... 81
6
Literaturverzeichnis ........................................................................................ 84
7
Lebenslauf ....................................................................................................... 91
III
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
ACE
Angiotensin-Converting-Enzyme
AGEs
Advanced Glycation End Products
AT1
Angiotensin-II-Rezeptor Typ 1
BSA
Bovines Serumalbumin
CaMK
Calmodulin-abhängige Kinase
CICR
Calcium-induzierte Calcium-Freisetzung
DAG
Diacylglycerol
DE
Densitometrische Einheiten
DM
Diabetes Mellitus
DNA
Desoxyribonukleinsäure
FKBP12.6
FK506-Binding-Protein 12,6 kDa
G-Proteine
Guanosintriphosphat-abhängige Proteine
HbA1c
Hämoglobin A1c
IP3
Inositol-1,4,5-triphosphat
JNK
c-Jun N-terminale Kinase
MAPK
Mitogen-aktivierte Proteinkinase
mRNA
messenger-Ribonukleinsäure
NCX
Natrium-Calcium-Austauscher
ND
Nicht diabetisierte Tiere
NGS
Normal Goat Serum
PBS
Phosphatpuffer-Natriumchlorid
PKA
Proteinkinase A
PKC
Proteinkinase C
RAAS
Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
RR
Ruthenium Rot
RT
Raumtemperatur
RYR1
Ryanodin-Rezeptor-Typ1
RYR2
Ryanodin-Rezeptor-Typ2
SDS
Natriumduodecylsulfat
SERCA
Ca2+-ATPase des Sarkoplasmatischen-Retikulums
SR
Sarkoplasmatisches Retikulum
STZ
Streptozotocin
Taq-DNA-Polymerase
Thermus aquaticus Polymerase
IV
Einleitung
1 Einleitung
Die Zuckerkrankheit, Diabetes mellitus, ist eine Volkskrankheit mit zunehmender
Prävalenz in unserer Gesellschaft. Aktuellen Schätzungen zufolge wird sich die
heutige Zahl von weltweit 150 Millionen Betroffenen bis zum Jahr 2025 auf 300
Millionen Diabetiker verdoppeln (69). Dies hat weitreichende volkswirtschaftliche
Folgen und muss medizinisch als Herausforderung in der Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen aufgefasst werden.
Unter dem Begriff Diabetes mellitus werden chronische Stoffwechselkrankheiten
zusammengefasst, die durch das Leitsymptom der Hyperglykämie charakterisiert
sind und zu typischen Komplikationen, dem so genannten diabetischen
Spätsyndrom, führen können. Generell können durch einen langjährigen Diabetes
mellitus alle Organsysteme geschädigt werden. Als häufige Manifestationen des
diabetischen Spätsyndroms ist neben der Vaskulopathie, Nephropathie und
Neuropathie die Schädigung des Herzmuskels zu nennen. Viele dieser
Komplikationen lassen sich pathophysiologisch als Folge von Gefäßveränderungen,
der diabetischen Mikroangiopathie und systemischen Gefäßsklerose, erklären. Eine
Besonderheit im klinischen Bild des herzkranken Diabetikers besteht jedoch in der
häufigen Vergesellschaftung von kongestiver Herzmuskelinsuffizienz mit fehlender
oder nur gering ausgeprägter Koronarsklerose (27, 103). Diabetiker zeigen eine
Häufung von Herzinsuffizienz, die im Vergleich zu anderen Patienten auch dann
noch gehäuft nachweisbar ist, wenn die Einflüsse von Alter, Blutdruck, Gewicht,
Cholesterinwerten und koronarer Herzkrankheit ausgeglichen werden. Bei einer
Diabetes-Prävalenz von ca. 6% in der Bevölkerung macht zudem der deutlich
erhöhte Anteil an Diabetikern in verschiedenen Herzinsuffizienz-Studien, wie z.B. in
der SOLVD-Studie (26%) (119) oder der ATLAS-Studie (19%) (112), die
pathophysiologische Bedeutung des Diabetes mellitus für diese Erkrankung deutlich.
Diese Beobachtungen unterstützen die Annahme, dass bei Diabetes mellitus direkte
zelluläre Veränderungen für die Entwicklung der Herzinsuffizienz von Bedeutung sind
und die diabetische Kardiomyopathie eine eigene Entität im Formenkreis der
Herzinsuffizienzen darstellt (109). Dabei konnte für beide Formen der
Zuckerkrankheit, sowohl dem Insulin-abhängigen Typ 1-Diabetes als auch dem
primär nicht Insulin-abhängigen Typ 2-Diabetes die frühzeitige Entwicklung einer
diastolischen Dysfunktion und ventrikulären Hypertrophie nachgewiesen werden, der
1
Einleitung
im Spätstadium eine systolische Pumpfunktionsstörung folgt (27, 103, 129). Wie im
Folgenden näher erläutert wird, kommen ursächlich für die gestörte Kontraktilität des
Herzens bei Diabetes mellitus Veränderungen u.a. des Myokardstoffwechsels, der
extrazellulären Matrix und der elektromechanischen Kopplung in Betracht.
1.1 Untersuchungen zum Diabetes mellitus und diabetesbedingter
Komplikationen am Kleintiermodell nach StreptozotocinInjektion
Das Modell des experimentellen Diabetes nach Streptozotocin-Injektion ist eines der
am besten untersuchten Tiermodelle zur Identifikation von Veränderungen der
Signaltransduktion bei Zuckerkrankheit auf zellulärer Ebene. Streptozotocin (STZ) ist
ein Zytotoxin, bestehend aus einem Glukosemolekül mit einer NitrosoharnstoffSeitenkette(38). Dieses Glukosemolekül scheint von Bedeutung für die Anreicherung
des STZ in den Inselzellen des Pankreas zu sein, die sodann durch die hochreaktive
Nitrosoharnstoff-Seitenkette zerstört werden. Verschiedene Kleintiere wie Ratten und
Mäuse zeigen nach Injektion von STZ innerhalb weniger Tage eine ausgeprägte
Hyperglykämie (25 bis 30 mmol/l), eine mäßige Hypertriglyzeridämie (200 bis 400
µmol/l) und Ketose bei stark reduzierten Insulinspiegeln (<20 pmol/l) (34, 129).
Ähnlich dem Krankheitsbild des Menschen entwickeln diese Tiere zunächst eine
diastolische Dysfunktion mit verzögerter isovolumetrischer Relaxation (43, 62). Im
Verlauf weniger Wochen entwickelt sich daraus eine manifeste Herzinsuffizienz. Am
Rattenmodell des STZ-induzierten Diabetes konnten weder Zeichen des
Bluthochdrucks noch der Atherosklerose nachgewiesen werden, so dass die
resultierende Kardiomyopathie primär als Folge des Diabetes angesehen werden
muss. Es ist wissenschaftlich belegt, dass die gestörte Kontraktilität bei
Herzinsuffizienz unterschiedlicher Ätiologie wesentlich durch eine gestörte
intrazelluläre Ca2+-Homöostase, strukturelle Veränderungen, u.a. mit Veränderungen
der extrazellulären Matrix und einer erhöhten Apoptoserate beeinflusst wird (134).
Dies konnte in mehreren Untersuchungen auch am Tiermodell der diabetischen
Ratte nach STZ-Injektion nachgewiesen werden.
Zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Diabetes-Induktion zeigten sich dabei
spezifische Veränderungen von Expression und Funktion Ca2+-regulierender
Proteine des Sarkoplasmatischen Retikulums (SR) und der Plasmamembran. So
bestand bereits in der frühen Phase (4 - 6 Wochen nach Diabetes-Induktion) eine
2
Einleitung
verminderte Ca2+-Aufnahme in das SR durch vermehrte Expression und verminderte
Phosphorylierung des Regulatorproteins Phospholamban (137, 151), sowie eine
verminderte Expression und Funktion der Ca2+-ATPase des SR (SERCA-2) (138,
151) und des SR Ca2+-Freisetzungskanals (Ryanodin Rezeptor) (8, 151). Diese
Veränderungen stellen wahrscheinlich eine wesentliche Ursache für die Abnahme
des Ca2+-Gehaltes im SR bei Diabetes mellitus dar (58).
Bei Diabetes mellitus kommt es durch die Hyperglykämie und eine vermehrte
Stimulation von Angiotensin II-Rezeptoren auch zur Bildung reaktiver
Sauerstoffgruppen und einer erhöhten Apoptoserate. Dies wurde von mehreren
Arbeitsgruppen u.a. am Myokard der diabetischen Ratte nach STZ-Injektion
beschrieben und ist als eine weitere wesentliche Ursache für die Entstehung der
kontraktilen Dysfunktion und struktureller Veränderungen bei Diabetes mellitus zu
berücksichtigen (37, 66, 102). Zudem beeinflussen Veränderungen der
extrazellulären Matrix, insbesondere in der Zusammensetzung der Kollagene, bei
Diabetes mellitus wesentlich die mechanischen Eigenschaften des Herzmuskels und
sind daher von entscheidender Bedeutung für die Hämodynamik des Herzens (12,
131, 135).
Für die Entstehung dieser diabetesbedingten Folgekrankheiten am Herzen könnten
sowohl Rezeptor-vermittelte Mechanismen über die G-Proteine Gαq und Gα11, als
auch Mechanismen über den veränderten Glukosemetabolismus bei Hyperglykämie
verantwortlich sein. Es ist nach wie vor unklar, welchen Stellenwert diese
konkurrierenden Mechanismen für die Pathogenese des Diabetes am Herzen haben.
Die folgenden Kapitel fassen den aktuellen Stand der Forschung zu diesem Thema
zusammen.
1.2 Bedeutung der G-Proteine Gα
αq/Gα
α11 für die Entstehung
diabetesbedingter Komplikationen am Herzen
Angiotensin II (Ang II) ist ein inotropes Hormon, das durch Induktion von
Hypertrophie und Fibrose eine zentrale Bedeutung für das kardiovaskuläre
Remodeling hat, z.B. unter Druckbelastung oder nach Myokardinfarkt (104). Auch bei
Patienten mit Diabetes mellitus wurden erhöhte Serumspiegel von Ang II gemessen
(56, 136). Auch konnte eine erhöhte Ang II-Rezeptorendichte im Myokard von
Diabetikern nachgewiesen werden (105). Zudem zeigte sich u.a. am STZ-Modell der
diabetischen Ratte unter Angiotensin-Rezeptorblockade eine signifikante
3
Einleitung
Verbesserung sowohl der systolischen als auch der diastolischen Pumpfunktion (78,
98, 102). Am Menschen haben mehrere große klinische Studien darüber hinaus eine
signifikante Reduktion kardiovaskulärer Endpunkte, wie Myokardinfarkt, Schlaganfall
und kardiovaskulärem Tod, unter Blockade des Renin-Angiotensin Systems (RAS)
insbesondere bei Patienten mit Diabetes mellitus zeigen können (48, 57, 73).
Ang II aktiviert Rezeptoren an der myokardialen Zelloberfläche, die an die G-Proteine
der Gαq-Familie gekoppelt sind. Neben Ang II vermitteln auch andere Hormone, wie
z.B. Endothelin und Noradrenalin ihre Wirkung über Gαq. Gαq ist ein übergeordneter
Begriff, der die Isoformen Gαq, Gα11, Gα14 und Gα15/16 umfasst. Gαq und Gα11 werden
ubiquitär exprimiert, wohingegen Gα14 und Gα15/16 nur in wenigen Geweben, nicht
jedoch im Herzen nachgewiesen werden können (4, 142). Die Aktivierung sog.
Mitogen-aktivierter Proteinkinasen (MAPKs) und die Stimulation der Phospholipase C
zur Synthese von Diacylglycerol (DAG) und Inositol-1,4,5-triphosphat (Ins[1,4,5]P3)
sind die zentralen Effektoren der Signalkaskade über Gαq und Gα11 (Abbildung
1;(51)). DAG ist ein direkter Aktivator verschiedener Isoformen der Proteinkinase C
(PKC). Ins[1,4,5]P3 vermittelt die Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern,
das wiederum zur Stimulation der Phosphatase Calcineurin und der Calmodulinabhängigen Kinase (CaM-Kinase) benötigt wird. PKC, MAPKs, Calcineurin und CaMKinase stellen nach heutigem Kenntnisstand die wesentlichen Signalwege dar, über
die die G-Proteine Gαq und Gα11 zur Induktion von Hypertrophie und Fibrose führen
können (51, 126). Abbildung 1 fasst schematisch die Signalwege zusammen, über
die o.g. Mediatoren nukleäre Transkriptionsfaktoren aktivieren und das
Genexpressionsmuster der Herzmuskelzelle anpassen können.
4
Einleitung
Sarkolemm
GPCR
Gαq/α11
PLC
Ins[1,4,5]P3
DAG
MAPK Kinasen
Ca2+
Calcineurin
Calmodulin/CaMK
PKC
JNK
ERK
p38
Nukleus
T r a n s k r i p t i o n s f a k t o r e n (NFAT, HDAC 4/5/7/9, u.a.)
Abbildung 1 Schematische Darstellung wesentlicher Signaltransduktionswege, über die eine
Stimulation der G-Proteine Gαq/Gα11 nukleäre Transkriptionsfaktoren aktivieren kann. Es gibt
Hinweise, dass diese Signalwege über ein verändertes Genexpressionsmuster die Entstehung von
Hypertrophie und Herzinsuffizienz begünstigen können.
GPCR: G-Protein gekoppelter Rezeptor, PLC:Phospholipase C, Ins[1,4,5]P3: Inositol-1,4,5triphosphat, DAG: Diacylglycerol, MAPK: Mitogen-aktivierte Proteinkinase, PKC: Proteinkinase C,
JNK: c-Jun N-terminale Kinase, ERK: extrazellulär regulierte Kinase, CaMK: Calmodulin-abhängige
Kinase. Modifiziert nach Heineke und Molkentin (51).
Eine vermehrte Stimulation von Angiotensin II (Typ 1)-Rezeptoren (AT1-Rezeptoren)
führt zu einer gesteigerten Expression von Gαq. Entsprechend konnte auch in
diabetischen Ratten nach STZ-Injektion eine erhöhte Gαq-Dichte in der myozytären
Plasmamembran gezeigt werden (146). Auch transgene Gαq-überexprimierende
Mäuse entwickeln den Phänotyp einer kardialen Hypertrophie mit kontraktiler
Dysfunktion und gestörten sarkolemmalen und sarkoplasmatischen Ca2+-Strömen
(25, 149). Andere Arbeitsgruppen konnten eine gesteigerte Aktivität und Expression
der PKC als primären Effektor der Signalkaskade über Gαq und Gα11 in diabetischen
Ratten nach STZ-Injektion zeigen (46, 70, 146), die durch Ang II zusätzlich stimuliert
werden konnte (80). Diese Ergebnisse unterstützen die viel zitierte Hypothese, dass
u.a. Ang II und Endothelin über Gαq und Gα11 einen wesentlichen Einfluss auf die
5
Einleitung
Entstehung der diabetischen Kardiomyopathie und anderer diabetischer
Komplikationen haben können. Entsprechend sind ACE-Hemmer oder AT1Rezeptorantagonisten heute fester Bestandteil einer leitliniengerechten Therapie zur
kardiovaskulären und renalen Protektion bei Patienten mit Diabetes mellitus (106).
1.3 Evidenz zur Bedeutung Gα
αq/Gα
α11-unabhängiger Mechanismen
bei der Entstehung diabetesbedingter Komplikationen am
Herzen
Neuere Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass der Nutzen einer
Behandlung mit ACE-Hemmern nicht allein auf die Blockade des RAS
zurückzuführen ist. So konnte unter langfristiger Therapie mit ACE-Hemmern auch in
maximaler Dosierung eine Reaktivierung von Ang II im Serum von Patienten mit
Herzinsuffizienz nachgewiesen werden (63, 77). Auch ohne Therapie mit ACEHemmern werden bis zu 40% des Ang II unabhängig des Angiotensin converting
enzyme (ACE) gebildet und diese alternativen Synthesewege sind bei Diabetes
mellitus möglicherweise sogar gesteigert (110). Eine komplette Blockade des RAS
scheint somit durch ACE-Hemmer nicht möglich zu sein. Eine Hemmung der
Konversion von Ang I zu Ang II durch ACE-Hemmer führt zu einem verminderten
Abbau von Bradykinin, einem Kinin, das eine teilweise antagonistische Wirkung zu
Ang II vermittelt, u.a. mit verbesserter Koronarperfusion, Regression einer
linksventrikulären Hypertrophie und Stimulation der myokardialen Glukoseaufnahme
(44, 71, 152). Zudem haben Kinine antifibrotische Eigenschaften. In kultivierten
Fibroblasten konnte unter Behandlung mit Bradykinin eine verminderte mRNA
Expression von Fibronectin und der Kollagene I und III nachgewiesen werden(68).
Entsprechend war die antifibrotische Wirkung einer ACE-Hemmer Therapie in
Bradykinin-Rezeptor Knockout Mäusen nach Myokardinfarkt deutlich vermindert
(147). Aufgrund dieser Ergebnisse wurde postuliert, dass die kardioprotektive
Wirkung der ACE-Hemmer zumindest teilweise auf eine Erhöhung der Kinine
zurückzuführen ist (26, 152).
Strukturelle und funktionelle Veränderungen im Myokard und der extrazellulären
Matrix bei Diabetes mellitus können aber auch direkt Folge der Hyperglykämie sein.
Hyperglykämie führt zu einer vermehrten Glukoseoxidation und mitochondrialen
Bildung von Superoxid (17, 35, 90). Superoxid wiederum schädigt die nukleäre DNA
und aktiviert dadurch das Reparationsenzym Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP)
6
Einleitung
(31). PARP hemmt aber gleichzeitig die Phosphoglycerinaldehyd-Dehydrogenase
(GAPDH), ein zentrales Enzym der Glykolyse, so dass Glukose vermehrt über
alternative Stoffwechselwege metabolisiert werden kann. Diese alternativen
Stoffwechselwege führen zur vermehrten Bildung fortgeschrittener
Glykosylierungsendprodukte (Advanced Glycation Endproducts, AGEs), Aktivierung
konventioneller Isoformen der PKC und vermehrter Bildung von Sorbitol mit
Stimulation des Polyol-Signalweges (31, 90). Tabelle 1 fasst diese alternativen Wege
des Glukosestoffwechsels bei Hyperglykämie und ihre Auswirkungen auf die
strukturellen und funktionellen Eigenschaften des Herzens zusammen. Diese
Zusammenfassung verdeutlicht, dass es anhand der aktuellen Datenlage unklar ist,
inwieweit die strukturellen und funktionellen Veränderungen am diabetischen Herzen
Folge einer Rezeptor-abhängigen Stimulation der G-Proteine Gαq/Gα11 sind oder
Rezeptor-unabhängig über einen veränderten Glukosemetabolismus bei
Hyperglykämie vermittelt werden.
7
Einleitung
Mediatoren
Strukturelle Veränderungen
Konsequenz
AGE-Bildung (9,
Glykosylierung von
Verminderte SR Ca2+-
10, 18, 54)
Ryanodinrezeptoren
Freisetzung und
und der SERCA
Kontraktilität
Glykosylierung von Kollagen Typ III
Versteifung der Ventrikel
Verminderte ventrikuläre
Füllung
Vermehrte Apoptoserate
Polyol Signalweg
Gesteigerter Oxidativer Stress
(31, 40, 90)
Sorbitol-induzierte Bildung von AGEs Kontraktile Dysfunktion
Vermehrte DNA-Strangbrüche
Versteifung der Ventrikel
Aktivierung der
Kardiale Hypertrophie
Gestörte Relaxation
PKC
Verminderte SERCA Aktivität
Versteifung der Ventrikel
(46, 70, 139)
Vermehrte Bildung extrazellulärer
Matrix
Tabelle 1 Alternative Mechanismen einer Rezeptor-unabhängigen Schädigung des Herzmuskels
induziert durch Hyperglykämie
AGE: fortgeschrittene Glykosylierungsendprodukte, PKC: Proteinkinase C, SR: sarkoplasmatisches
2+
Retikulum, SERCA: Ca -ATPase des SR
8
Einleitung
1.4 Arbeiten zum Modell der Gα
αq/Gα
α11 Doppelknockout Maus
Das Knockout Mausmodell wurde von der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. S.
Offermanns, Institut für Pharmakologie der Universität Heidelberg, erstellt und
besteht aus einem globalen Gα11 Knockout und einem kardial-spezifischen
konditionellen Gαq Knockout auf Basis der Cre/LoxP-Technologie (141). Die
Expression der Cre-Rekombinase steht dabei unter Kontrolle des MLC2α-Promotors.
Die Variante des konditionellen Gαq Knockout war gewählt worden, da Mäuse mit
globalem Knockout beider Gene, Gαq und Gα11, im embryonalen Alter von 11 Tagen
mit Zeichen der myokardialen Hypoplasie versterben (92). In einer ersten,
hochrangig publizierten Arbeit an diesem Doppelknockout Mausmodell wurde der
Einfluss der G-Proteine Gαq und Gα11 auf die Entwicklung der linksventrikulären
Hypertrophie unter Druckbelastung durch aortale Konstriktion (aortic banding)
untersucht (141). Dabei zeigte sich 14 Tage nach operativer Intervention an den
Herzen der Tiere vom Wildtyp erwartungsgemäß eine ausgeprägte Hypertrophie mit
Zunahme des Herz-Körpergewichtsquotienten um 58% und einer deutlichen
Verschiebung der Druck-Volumen-Beziehung im Sinne einer linksventrikulären
Dilatation und Compliancestörung. Unter identischen Bedingungen konnten jedoch
an den Herzen der Gαq/Gα11 Doppelknockoutmäuse keine strukturellen oder
funktionellen Veränderungen nach Aortenkonstriktion im Vergleich zu shamoperierten Tieren festgestellt werden. Die Unterbrechung der Gαq/Gα11Signaltransduktion durch Doppelknockout hatte somit wahrscheinlich einen
protektiven Einfluss auf das kardiale Remodeling unter Druckbelastung.
Bei Untersuchungen an genetisch veränderten Tiermodellen muss davon
ausgegangen werden, dass in dem sehr komplexen zellulären Stoffwechsel
Kompensationsmechanismen auftreten, die auch bei sorgfältiger Untersuchung
unerkannt bleiben. Dies stellt generell ein methodisches Problem auch bei Knockout
Modellen dar und muss bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden.
9
Einleitung
1.5 Proteinkinase C
Die Mitglieder der Proteinkinase C-Familie spielen bei der hormonellen
Signaltransduktion eine wichtige Rolle und sind u.a. in die Regulation von
Zellwachstum und Zelldifferenzierung eingeschaltet (23, 74, 91). Derzeitig sind
mindestens elf verschiedene Isoformen dieses Enzyms bekannt, die als α-, βI-, βII-,
γ-, δ-, ε-, ζ-, η-, θ-, und ι-/λ- Subtypen bezeichnet werden, und differenziert in den
unterschiedlichen Geweben exprimiert werden. (24, 32, 93, 96, 97, 99, 100, 117). Auf
der Basis ihrer enzymatischen Eigenschaften sind die Säugetier-PKC-Isotypen in
kleinere Unterfamilien unterteilt worden. Die am meisten untersuchte Gruppe ist die
der konventionellen PKCs (cPKCs), die die Isotypen α, βI, βII und γ umfasst (das
PKC β-Gen wird alternativ gespleißt) (24). Sie werden Ca2+-abhängig durch DAG
aktiviert. Die neuen PKCs (nPKCs) bestehen aus den Isotypen ε, η, δ, und θ. Sie sind
Ca2+-unabhängig, werden aber ebenfalls durch DAG aktiviert (95). Die atypischen
PKCs (aPKCs) ι und ζ sind wie die nPKCs Ca2+-unabhängig und zusätzlich auch
DAG-unabhängig (94). Die Aktivierung der PKC kann durch Autophosphorylierungen
verstärkt werden (111). Man vermutet, dass zwischen der zytosolischen und der
membrangebundenen PKC ein Gleichgewicht existiert, welches durch hydrophobe
Cofaktoren wie Diacylglycerol in Richtung Membranassoziation verschoben wird und
so bei den einzelnen Isoformen zur Translokation führt.
Die kardiale Expression umfasst die Isoformen α, βI, βII, δ, ε, λ und ζ (45, 61, 121).
Die Isoform θ zeigt neben der deutlichen Expression im Skelettmuskel auch eine
schwächere Ausprägung im Herzen (97). Die Funktionen und Substrate der
verschiedenen Isoformen der PKC sind letztendlich noch nicht geklärt, jedoch führt
eine Aktivierung der kardialen PKC zu Zellwachstum und damit zu kardialer
Hypertrophie, zu einer Veränderung der SR-Funktion u.a. über eine verminderte
Aktivität der SERCA über Veränderungen am Phospholamban (3, 14), zur
Phosphorylierung von Myofilamenten (144) und zur vermehrten Bildung von
extrazellulärer Matrix.
10
Einleitung
1.6 Funktion und Bedeutung von Proteinen der Calciuminduzierten-Calcium-Freisetzung und der Ca2+-Homöostase
Abbildung 2 Schematische Darstellung des Ryanodinkanals in der Membran des SR und seiner
2+
intrazellulären Interaktion. Nach Ca -Bindung kann Sorcin an den RYR2 binden und diesen
2+
2+
blockieren. Durch Einflussnahme auf die Ca -Freisetzung kann Sorcin die Ca -Homöostase
beeinflussen. Durch Phosphorylierung von Sorcin verliert es seine inhibitorische Eigenschaft auf den
2+
RYR2. Sorcin interagiert mit weiteren Ca -regulierenden Proteinen wie dem NCX, dem L-TypCalciumkanal und Annexin VII.
RYR2 = Ryanodin Rezeptor Typ 2; β-AR = beta-Adrenorezeptor; NCX = Natrium-CalciumAustauscher; FKBP12.6 = FK506-Binding-Protein 12,6 kDa
1.6.1 Ryanodin-Rezeptor Typ 2
Nach aktuellem Kenntnisstand bildet die kardiale Isoform des Ryanodin-Rezeptors
(RYR2) einen Makromolekularen Komplex, der die Proteinkinase A, FK506-BindingProtein 12,6 (FKBP12.6), ein Ankerprotein mAKAP, die Proteinphosphatase 1 und
die Proteinphosphatase 2A beinhaltet (82). Der Ryanodin-Rezeptor Typ 2 selber ist
ein in der Membran des SR liegendes Tetramer, deren Untereinheiten jeweils 565
kilo Dalton (kDa) schwer sind, und eine Pore durch die Membran des SR bilden.
Durch die Pore setzt der RYR2 das Ca2+ aus dem SR frei, welches für den
Kontraktionszyklus gebraucht wird. Die Aktivierung des RYR2 erfolgt über Ca2+, das
durch spannungsabhängige Ca2+-Kanäle (Dihydropyridinkanäle) freigesetzt wird (1,
11
Einleitung
33). Dieser, sich in der Theorie selbstverstärkende Mechanismus durch die Ca2+Konzentrationszunahme im Zytoplasma, wird durch bislang unbekannte Faktoren
beendet (124). Verschiedene Theorien umfassen u.a. eine Ca2+-abhängige
Inaktivierung, eine Inaktivierung durch ein regulierendes Protein wie z.B. Sorcin, eine
Wahrscheinlichkeits-abhängige Inaktivierung, oder aber noch gänzlich unbekannte
Mechanismen.
Ein bestehender Kontakt mehrerer RYR2 untereinander in der Membran des SR
konnte inzwischen gezeigt werden und führte zu der Annahme, dass die Kanäle als
vereinte Gruppe wirken, und das sogenannte „Coupled Gating“ ausführen (81).
Hierbei werden die Kanäle als Einheit gesteuert und agieren gleichzeitig und
gleichgerichtet.
Durch direkte Phosphorylierungen durch die PKA, die PKC und die Proteinkinase G
wird die Öffnungswahrscheinlichkeit des RYR2 erhöht und es kommt zu einer
größeren Ca2+-Leckage aus dem SR (128, 130). Unter pathophysiologischen
Bedingungen, wie sie bei myokardialer Hypertrophie oder Herzinsuffizienz auftreten,
ist das Öffnungsverhalten dieses Kanals verändert mit direktem Einfluss auf die Ca2+Homöostase und Kontraktilität der Herzmuskelzelle (151).
1.6.2 Sorcin
Sorcin ist ein 22 kDa schweres Protein der EF-Hand-Familie (150). Es wird in vielen
verschiedenen Geweben von Säugetieren, darunter auch der Skelett- und
Herzmuskulatur ausgebildet (85).
Interessanterweise und auch unerwarteter Weise wurde bei einer experimentellen
Überexpression des Sorcins in Fibroblasten eine Expression des RYR2
nachgewiesen (85). In dieser Arbeit konnte auch eine Copräzipitation des RYR2
durch den Sorcinantikörper gezeigt werden. Eine solche physische Verbindung der
beiden Proteine legt eine funktionelle Kopplung nahe. Demzufolge ist Sorcin in der
Lage eine völlige Blockade des RYR2 zu bewirken (75). Konsequenterweise,
nachfolgend durchgeführte Untersuchungen zeigen, dass Sorcin nicht nur die
spontane Aktivität des RYR2 (gemessen durch das auftreten von Ca2+-Sparks)
hemmt, sondern ebenso die Calcium-induzierte-Calcium-Freisetzung (CICR)
hemmen kann (36). Um diese Funktion in vivo auszuführen, muss Sorcin durch eine
hohe Ca2+-Konzentration zur Translokation aus dem Zytosol an die Membran
befähigt werden. Diese Konzentration von ungefähr 200 mM wird allerdings
12
Einleitung
intrazellulär nur an den Dyaden erreicht. Dass Sorcin gerade an diesen durch
Immunpräzipitationsexperimente lokalisiert wurde (36) lässt den Schluss zu, dass
genau diese Funktion von Sorcin ausgeführt wird. Bis zur vollständigen Hemmung
des RYR2 durch Sorcin wird ein Zeitraum von weniger als 20 ms veranschlagt, und
somit ist die Möglichkeit gegeben, dass Sorcin zur Beendigung der CICR direkt
beiträgt. Durch die Analyse von Modellen einer Sorcinüberexpression herrschen zwei
Meinungen über die Funktion von Sorcin in vivo vor. So wird einerseits davon
ausgegangen, dass eine Sorcinüberexpression zu hämodynamischen
Verschlechterungen führt (84, 115). Andererseits konnte eine kardiale
Kontraktionsverbesserung durch eine Sorcinüberexpression nachgewiesen werden
(39, 125).
1.6.3 FKBP12.6
FKBP12.6 ist eine Isoform des FKBP12 im Herzmuskel (114). Die Assoziation von
FKBP12.6 mit dem RYR2 in der Herzmuskulatur (15, 60, 133) weist darauf hin, dass
es als akzessorisches Protein des RYR eine Rolle in der Ca2+-Homöostase spielt.
Durch Blockade des FKBP12.6 in Lipidbilayermembranen konnte gezeigt werden,
dass es zu einer eingeschränkten Leitfähigkeit einzelner RYR2 kommt, vermutlich
durch eine defekte Koordination der vier Untereinheiten des Kanals hervorgerufen
(15, 65). Durch Zuführen von FKBP12 unter diesen experimentellen Bedingungen
lässt sich die Leitfähigkeit der RYR1 wiederherstellen und es kommt somit zu einer
Stabilisierung der Kanäle (15). Aufgrund dieser Erkenntnisse geht man davon aus,
dass die Familie der FKBP-Proteine u.a. einer Stabilisierung der RYR-Untereinheiten
dienen. Auch mehrere RYR2-Kanäle werden nach der Theorie des „Coupled Gating“
durch FKBP12.6 zu funktionellen Einheiten verbunden (81). Für eine physiologische
Bedeutung dieses Mechanismus spricht, dass durch eine Phosphorylierung des
RYR2 das FKBP12.6 von den Kanälen dissoziiert und die
Öffnungswahrscheinlichkeit der RYR2 erhöht. In vivo Experimente führen diese
Hypothese fort. So zeigen Mäuse mit einer FKBP12.6-Defizienz eine erhöhte
intrazelluläre Ca2+-Freisetzung, die vorerst mit einer verbesserten Kontraktilität
einhergeht, aber bei einer stressinduzierten PKA-Phosphorylierung in einer
signifikant häufigeren, tödlichen Arrhythmie mündet, die mit der unkontrollierteren
RYR2-Aktion in Verbindung gebracht wird (140). Überexpressionsmodelle des
FKBP12.6 in isolierten Kardiomyozyten hingegen führen zu einer Verminderung der
13
Einleitung
Ca2+-Sparks der RYR2 und zu einer Stabilisierung der Kanäle im geschlossenen
Zustand. Dies mündet in einer Verminderung des Ca2+-Lecks aus dem SR und
schließlich zu einer größeren Beladung des SR mit Ca2+, einem höheren Ca2+Transienten und einer verbesserten Kontraktilität (42, 101).
1.6.4 Annexin VII
Annexin A7 (Annexin VII) wird in Folge alternativen Spleißens in zwei Transkripten
exprimiert. So führt der Einbau eines weiteren Exons zu der größeren Isoform mit 51
kDa gegenüber der kleineren Isoform mit 47 kDa (87). Beide Isoformen sind im
Herzen existent (79, 116). Annexin A7 wurde an der Pasmamembran und am TTubulus des Skelettmuskels, nahe sekretorischer Vesikel, in subzellulären
Membranstrukturen und auf der Plasmamembran lokalisiert (22, 72). Über eine Ca2+abhängige Bindung an Sorcin ist Annexin A7 wahrscheinlich an der Regulation der
elektromechanischen Kopplung und der CICR beteiligt (16, 19, 116)
Der Einfluss des Annexins A7 auf die Zellverkürzungs-Frequenz-Beziehung, die in
Kardiomyozyten einer Annexin A7-defizienten Mauslinie beschrieben wurde (53),
bestätigt die Bedeutung dieses Proteins für die elektromechanische Kopplung.
1.6.5 Natrium-Calcium-Austauscher
Das in der Systole in die Zelle einfließende Ca2+muss während der Diastole wieder
aus der Zelle ausgeschleust werden, um die Ca2+-Homöostase zu wahren.
Der sarkolemmale Natrium-Calcium-Austauscher ist ein passiver
Transportmechanismus, der in Abhängigkeit des Membranpotentials und der
transmembranären Gradienten von Natrium- und Ca2+-Ionen, diese in beide
Richtungen über die Zellmembran transportieren kann. Unter physiologischen
Bedingungen führt dies zu einem kurzen systolischen Ca2+-Einstrom gefolgt von
einem prominenten Ca2+-Ausstrom in der Diastole. Inwieweit der systolische Ca2+Einstrom unter physiologischen Bedingungen an der CICR beteiligt ist, konnte noch
nicht endgültig geklärt werden (108). An einem transgenen Mausmodell mit
homozygoter Überexpression des NCX konnte jedoch der Einfluss einer erhöhten
Dichte dieses Ionentransporters auf die Ca2+-Freisetzung des SR und die Kinetik des
L-Typ Calcium-Kanals eindrucksvoll belegt werden (107). Dies ist wahrscheinlich die
direkte Folge verminderter subsarkolemmaler Ca2+-Konzentrationen.
Interessanterweise kommt es auch im Überexpressionsmodell des Sorcins zu einer
14
Einleitung
Zunahme der NCX-Aktivität, die zu einer verminderten Beladung des SR mit Ca2+
führt (115).
1.6.6 Calsequestrin
Calsequestrin ist ein 55 kDa schweres Protein, das im SR der Ca2+-Speicherung
dient (64). In der vorliegenden Arbeit wurde es als interner Standard zum Vergleich
der aufgetragenen Proteinmengen bei den Immunoblotanalysen verwendet.
15
Einleitung
1.7 Fragestellungen
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung der G-Proteine Gαq/Gα11 für die
Entwicklung der myokardialen Hypertrophie unter den speziellen Bedingungen des
Typ1-Diabetes zu untersuchen. Hierzu wurden funktionelle und biochemische
Untersuchungen an kardialem Gewebe von Wildtypmäusen, Gα11 Knockoutmäusen
und Gαq/Gα11 Doppelknockoutmäusen durchgeführt.
Im einzelnen sollten folgende Fragestellungen in der vorliegenden Arbeit beantwortet
werden:
1. Wird die kontraktile Dysfunktion bei Diabetes mellitus primär über eine
veränderte Signaltransduktion durch die G-Proteine Gα11 und Gαq vermittelt
oder sind Hypertrophie und Herzinsuffizienz bei Typ1-Diabetes im
wesentlichen Folge der Hyperglykämie?
Ein experimenteller Typ1-Diabetes wurde in Mäusen des Wildtyps sowie in Gα11
Knockoutmäusen und Gαq/Gα11 Doppelknockoutmäusen mittels intraperitonealer
Injektion von Streptozotocin induziert. 8 Wochen nach Diabetes-Induktion wurden
Herzgewicht und Lungengewicht als Marker für eine Herzhypertrophie und eine
Herzinsuffizienz gemessen und die kardiale Funktion dieser Tiere mit Hilfe
echokardiographischer Untersuchungen analysiert.
2. Über welche Signalkaskade der G-Proteine Gα11 und Gαq werden die
pathophysiologischen Veränderungen (z.B. verändertes
Proteinexpressionsmuster) vermittelt?
Immunhistochemisch wurden die PKC-Isoformen α, βΙΙ, δ, ε, ζ, θ, sowie die
Phosphorylierung der Isoformen δ/θ und ζ/λ untersucht.
3. Welchen Einfluss hat der experimentelle Diabetes mellitus auf den
Proteinkomplex und die Funktion des Ca2+-Freisetzungskanals des SR und
haben die G-Proteine Gα11 und Gαq eine Bedeutung für diese
Veränderungen?
16
Einleitung
Die Proteinexpression des RYR2, des Sorcins, des FKBP12.6, des Annexin VII und
des NCX wurde gemessen. Durch Bestimmung des quantitativen Verlustes von Ca2+
an isolierten Membranpartikeln wurde die Funktion des Ryanodinkanals in den
verschiedenen Versuchsgruppen untersucht.
17
Material & Methoden
2 Material & Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Versuchstiere
Die Untersuchungen wurden an acht Wochen alten Gαq/Gα11 Doppelknockout
Mäusen, an Gα11 Knockout Mäusen und an Wildtypmäusen des selben Stammes
(C57/Bl6) durchgeführt. Die Knockout Mäuse wurden freundlicherweise von Herrn
Prof. Dr. S. Offermanns, Direktor des Instituts für Pharmakologie der Universität
Heidelberg, zur Verfügung gestellt und in eigener Zucht vermehrt. Die
Vorgehensweise zur Generierung der Knockout Mäuse wurde bereits von der
Arbeitsgruppe Offermanns ausführlich beschrieben (141).
Die Wildtypmäuse wurden bei Charles River Laboratories im Alter von 8 Wochen
bestellt. Alle Tiere waren einem künstlichen Tag-Nacht-Rhythmus von 12 Stunden
und einer Temperatur von 20-22 °C ausgesetzt. Sie erhielten eine
Mäusestandardnahrung und Wasser aus einem Tropfenspender ad libitum.
2.1.2 Verwendete Substanzen und Lösungen
2.1.2.1 Tierexperimentelle Methoden
Zitronensäure Monohydrat, MG 210,14, Roth, Karlsruhe
•
Streptozotocin (2-Desoxy-2-(3-methyl-3-nitrosoureido)-D-glucopyranose), MG
265,2, Calbiochem, EMD Biosciences, Inc., San Diego, California, USA
•
0,45 µm Filter, Millipore, Billerica, USA
•
Glukosetestgerät: GlucoMen Glycó, A. Menarini Diagnostics, Florenz, Italien
•
Teststreifen: GlucoMen Sensor, A. Menarini Diagnostics, Florenz, Italien
•
EDTA-Blutröhrchen, Sarstedt AG & Co, Nümbrecht
•
Isofluran, Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Deutschland
•
Echokardiographiegerät Philips iE33, Schallkopf 11 MHz, Philips, Seoul,
Südkorea
2.1.2.2 DNA-Isolation
18
•
Phenolchloroform, Roth, Karlsruhe
•
Ethanol 99,8%, Roth, Karlsruhe
•
TE-(Tris-EDTA) Puffer: 10 mM Tris HCL, 1 mM EDTA, pH 8,0
Material & Methoden
•
Lysepuffer: 100 mM Tris pH 8,0, 5 mM EDTA ,1% SDS, 0,2 M NaCl
•
Proteinase K
•
Tris Puffer 99.9%, Roth, Karlsruhe
•
NaCl 99,5%, Roth, Karlsruhe
•
Natriumduodecylsulfat ultra pure (SDS), Roth, Karlsruhe
2.1.2.3 PCR
•
Deionisiertes Wasser, Milli Q
•
MgCl 25 mM, Fermentas, St. Leon-Rot
•
Taq Puffer, Fermentas, St. Leon-Rot
•
Taq DNA Polymerase, Roche, Mannheim
•
dNTP
o Desoxyadenosintriphosphat PCR Grade, Roche, Mannheim
o Desoxytyrosintriphosphat PCR Grade, Roche, Mannheim
o Desoxyguanosintriphosphat PCR Grade, Roche, Mannheim
o Desoxycytosintriphosphat PCR Grade, Roche, Mannheim
•
Primer
o Cre1TS (5´-GGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCG-´3), Mwg Biotech
Ag, Zürich, Schweiz
o Cre2TS (5´-GCATAACCAGTGAAACAGCATTGC-´3), Mwg Biotech Ag,
Zürich, Schweiz
o QIN6C (5´- AGCTTAGTCTGGTGACAGAAGC -´3), Mwg Biotech Ag,
Zürich, Schweiz
o TVQFL1 (5´- GCATGCGTGTCCTTTATGTGAG -´3), Mwg Biotech Ag,
Zürich, Schweiz
o TW25 (5´- GCCCCTTGTACAGATGGCAG -´3), Mwg Biotech Ag,
Zürich, Schweiz
o TW24 (5´- AGCATGCTGTAAGACCGTAG -´3), Mwg Biotech Ag,
Zürich, Schweiz
•
Marker
o O´gene ruler 50bp DNA-Ladder, Fermentas, St. Leon-Rot
o Middle Range Ladder, Fermentas, St. Leon-Rot
•
Agarose Gel Loading Dye Solution, Amresco, Solon, Ohio, USA
•
Universal Agarose, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen
19
Material & Methoden
•
Ethidiumbromid, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
2.1.2.4 Herstellung von Homogenaten für Western Blot-Untersuchungen
•
Präparationspuffer (Zusammensetzung in mmol/l): Saccharose 300,
EDTA 10, Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF) 1, PIPES 20; pH 7,4,
NaH2PO4 50
•
Gefrierpuffer (Zusammensetzung in mmol/l): Saccharose 400, HEPES 5,
EDTA 10, NaH2PO4 50, Tris/HCL 5; pH 7,2
2.1.2.5 Bestimmung der Proteinkonzentration
•
Rinderserumalbumin, MG ca. 68000 Dalton, Merck, Darmstadt
•
Bradford-Reagenz (Bio-Rad Protein-Assay, Dya Reagent Concentrate, BioRad, München)
2.1.2.6 SDS-Gelelektrophorese und Western Blots
•
30% Acrylamid/Bis 37, 5:1, Bio-Rad, München
•
Ammoniumperoxisulfat, MG 228,2, Merck Darmstadt
•
TEMED, MG 116,21, Roth, Karlsruhe
•
Natrium-Dodecylsulfat (SDS), MG 288,38, Serva, Heidelberg
•
PVDF Polyvinylfluorid-Membran, Serva Feinbiochemika, Heidelberg
•
Polyethylen-Sorbitan Monolaurat (Tween 20) Serva Feinbiochemika,
Heidelberg
•
Bio Magermilch Pulver, Heirler Cenovis GmbH, Radolfzell
•
Probenpuffer 2× (Zusammensetzung in mmol/l): Tris-HCL 100 (pH 6,8),
Glycerin 20%, SDS 4%, Mercaptoethanol 2%, Bromphenolblau 0,2%
•
Antikörper:
o Polyklonaler (Kaninchen) Anti-NCX-Antikörper (IgG), Prof. Dr. K. D.
Philipson, University of California, Los Angeles, CA, USA
o Monoklonaler (Maus) Anti-Ryanodine-Rezeptor Typ2- Antikörper (IgG1)
Affinity Bioreagents Inc., Golden, USA
o Monoklonaler (Maus) Anti-Sorcin-Antikörper, Zymed Laboratories Inc.,
San Francisco, USA
o Polyklonaler (Kaninchen) Anti-Calsequestrin-Antikörper, (IgG1), Upstate
Biotechnology Inc., Lake Placid, New York, USA
20
Material & Methoden
o Polyklonaler (Kaninchen) Anti-FKBP12.6-Antikörper, (IgG1) Affinity
Bioreagents Inc., Golden, USA
o Anti-Annexin A7-Antikörper (203-217, 45-4), Prof. Dr. A. A. Nögel,
Direktorin des Instituts für Biochemie, Universität zu Köln
o Polyklonaler (Kaninchen) Anti-phopho-RYR2(Ser-2809)-Antikörper,
Badrilla, Leeds, England
o Peroxidase-konjugierter Anti-Kaninchen IgG-Antikörper, Sigma
Immunochemicals, St. Louis, MO, USA
o Peroxidase-konjugierter Anti-Maus IgG-Antikörper, Sigma
Immunochemicals, St. Louis, MO, USA
•
Marker
o Page Ruler Prestained Protein Ladder, Fermentas, St. Leon-Rot
•
Enhanced Chemolumineszenz Kit (ECL), Amersham Life Science,
Buckinghamshire, Großbritannien
2.1.2.7 Quantitative Bestimmung des Ca2+-Verlustes an isolierten Membranpartikeln
•
Imidazole, MG 68,08, Merck, Darmstadt
•
Kaliumchlorid (KCl) ,MG 74,56, Merck, Darmstadt
•
Magnesiumchloridhexahydrat, MG 203,3, Merck, Darmstadt
•
Natriumazid (NaN3), MG 65,01, Merck, Darmstadt
•
Calciumchlorid (CaCl), MG 147,02, Merck, Darmstadt
•
EGTA, MG 380,4, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
•
Kaliumoxalatmonohydrat, MG 184,24, Fluka Chemie AG, Steinheim
•
Saccharose, MG 342,3, Roth, Karlsruhe
•
Kaliumphosphat, MG 136,09, Merck, Darmstadt
•
Natriumfluorid, MG 41,99, Merck, Darmstadt
•
Adenosintriphosphat, MG 605,2, Roche, Mannheim
•
1,4-Dithiothreit, MG 151,2, Roth, Karlsruhe
•
Ruthenium Rot, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München
•
Nitrocellulose Filter 0,45 µm, Millipore, Billerica, USA
•
45
Calcium, GE- Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien
2.1.2.8 Immunhistochemie
•
Phosphatpuffer-Natriumchlorid (PBS): 0.1 M PBS, pH 7.4
21
Material & Methoden
•
Di-Natriumhydrogenphosphatdihydrat, Merck, Darmstadt
•
Natriumhydrogenphosphatmonohydrat, Merck, Darmstadt
•
Natriumchlorid, Merck, Darmstadt
•
Trispuffer (TB) und Trispuffer-NaCl (TBS): 0.05 M TBS, pH 7.6
•
Tris, Roth, Karlsruhe
•
Tris-HCl Puffer
•
DAB Lösung (10 mg DAB + 5 µl Nickelsulfat-Lösung (Vector) auf 50 ml 0.05 M
Tris/HCl pH 7.6, 6 µl 30% H2O2)
Immersionsfixativ-Lösung (4% PFA + 0,1 M PBS):
•
Paraformaldehyd, Merck, Darmstadt
Entwässerungslösungen:
•
Xylol, Merck, Darmstadt
•
Ethanol, Merck, Darmstadt
Einbettmedien:
•
Tissue-Tek, O.C.T. Compound, Plano, Tx, USA
Eindeckmedien:
•
Glycerin Gelatine, Merck, Darmstadt
•
Entellan, Merck, Darmstadt
Verwendete Geräte:
•
Schneidegerät: Kryostat, Jung Frigocut 2800 E, Leica
•
Messer: Hartmetallmesser C
•
Objektträger: Shandon adhäsiv Objektträger, Life Sciences International
•
Kodak Gold 400 (Farbaufnahmen)
•
Lichtmikroskop: Leitz Orthoplan bzw. Olympus Vanox Lichtmikroskop
•
Antikörper:
o Monoklonaler (Kaninchen) Anti-Proteinkinase C δ-Antikörper, Sigma
Immunochemicals, St. Louis, MO, USA
o Monoklonaler (Kaninchen) Anti-Proteinkinase C β2-Antikörper, Sigma
Immunochemicals, St. Louis, MO, USA
o Monoklonaler (Kaninchen) Anti-Phospho-Proteinkinase C δ/θAntikörper, Cell Signaling Technology, Inc., Boston, MA, USA
o Monoklonaler (Kaninchen) Anti-Phospho-Proteinkinase C ζ/λAntikörper, Cell Signaling Technology, Inc., Boston, MA, USA
22
Material & Methoden
o Monoklonaler (Kaninchen) Anti Proteinkinase C ζ-Antikörper, Cell
Signaling Technology, Inc., Boston, MA, USA
o Monoklonaler (Kaninchen) Anti Proteinkinase C α-Antikörper, Cell
Signaling Technology, Inc., Boston, MA, USA
o Monoklonaler (Kaninchen) Anti Proteinkinase C θ-Antikörper, Cell
Signaling Technology, Inc., Boston, MA, USA
o Monoklonaler (Kaninchen) Anti-Proteinkinase C ε Antikörper, Sigma
Immunochemicals, St. Louis, MO, USA
2.2 Methoden
2.2.1 Tierexperimentelle Methoden
2.2.1.1 Induktion eines Diabetes Mellitus
Die Induktion des Diabetes Mellitus wurde durch eine einmalige intraperitoneale
Injektion des Antibiotikums Streptozotocin (2-Desoxy-2-(3-methyl-3-nitrosoureido)-Dglucopyranose), das einen hochdiabetogenen Effekt durch spezifische β-ZellToxizität durch DNA-Alkylierung und DNA-Strangbrüche zeigt, durchgeführt. Dies hat
einen Insulinmangeldiabetes zur Folge, dessen Schweregrad von der Dosis des STZ
abhängt. Die gewählte Konzentration betrug 130 mg/kg KG. Dazu wurde die
erforderliche Menge in 300 µl Zitratpuffer, 0,1 M, pH 4,5, gelöst, durch einen 0,45 µm
Millipore-Filter filtriert und sofort injiziert. Allen Kontrolltieren wurde nur die
Trägersubstanz, der Zitratpuffer, injiziert. Als Erfolgskontrolle wurden nach 24
Stunden Blutzuckermessungen durchgeführt. Tiere, die keine erhöhten
Blutzuckerspiegel aufwiesen, wurden wiederholt mit STZ behandelt. Als eine
erfolgreiche Induktion eines Diabetes Mellitus wurden Blutzuckerwerte von über 300
mg/dl gewertet. Die Tiere waren bei der Induktion des Diabetes acht Wochen alt und
wurden für weitere acht Wochen im Tierstall gehalten. Das Tierversuchsprotokoll war
vorab von der Bezirksregierung Köln geprüft und genehmigt worden (AZ 50.203.2K47,28/04)
23
Material & Methoden
2.2.1.2 Bestimmung der Blutzuckerwerte und des Körpergewichtes
Zur Bestimmung der Blutzuckerwerte wurde eine Schwanzvene der Mäuse punktiert
und der gewonnene Tropfen Blut mit Teststreifen (GlucoMen Sensor, A. Menarini
Diagnostics) und einem Glucometer (GlucoMen Glycó) analysiert. In der ersten
Woche wurden die Werte im zweitägigen Rhythmus und ab der zweiten Woche im
wöchentlichen Rhythmus erhoben. Zum selben Zeitpunkt wurde das Gewicht der
Mäuse bestimmt.
2.2.1.3 Opferung der Tiere und Organentnahme
Im Alter von 16 Wochen wurden die Tiere durch zervikale Dislokation getötet. Die
Herzen wurden entnommen, nach dem Wiegen entweder für die spätere
Immunoblotanalyse sofort in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80°C
aufbewahrt, oder für die spätere Immunhistochemie sofort in Immersionsfixativlösung
für 24 h bei 4°C fixiert. Das Lungenfeuchtgewicht wurde zur Beurteilung einer
kongestiven Herzinsuffizienz bestimmt. Das bei Trennung des Herzens von der Aorta
gewonnene Blut wurde mit Hilfe einer Spritze in EDTA-Blutröhrchen überführt. Der
HbA1c-Wert wurde aus diesem Blut im Institut für klinische Chemie der Universität zu
Köln (Direktor: Prof. Dr. K. Wielckens) bestimmt. Der HbA1c-Wert ist ein Maß für den
Anteil an glykosyliertem Hämoglobin im Blut und korreliert mit den durchschnittlichen
Blutzuckerwerten der vorangegangenen 2-3 Monaten. Der rechte Tibiaknochen der
Mäuse wurde operativ freigelegt und mit Hilfe einer handelsüblichen Schieblehre
vermessen. Die anzeigepflichtige Tötung der Versuchstiere war zu Beginn des
Projektes seitens der Bezirksregierung Köln bewilligt worden (AZ 50.203.2-K 07/06).
2.2.1.4 Echokardiographische Bestimmung funktioneller und morphologischer
Veränderungen am Herzen in vivo
Zur Bestimmung funktioneller und morphologischer Veränderungen, die durch den
Diabetes über 8 Wochen auftreten können, wurde die Ultraschalluntersuchung der
Mäuseherzen in vivo vergleichend sowohl am Tag vor Streptozotocin-Injektion als
auch unmittelbar vor Tötung der Tiere durchgeführt. Dabei wurde in der
Echokardiographie die Pumpfunktion, die Myokarddicke und die Dimensionen der
Herzhöhlen quantifiziert. Für diese Untersuchungen wurden die Tiere narkotisiert,
wobei die Dosierung von Isofluran so gering gehalten wurde, dass es zu keiner
24
Material & Methoden
Depression der Spontanatmung kam. Die Untersuchungen wurden an einem
Echokardiographiegerät (Philips iE33) mit einem hochfrequenten Schallkopf von 11
MHz durchgeführt. Im zweidimensionalen B-mode wurden die parasternale kurze
Achse auf midpapillärer Ebene und die parasternale lange Achse aufgezeichnet, mit
einer Aufnahmedauer von jeweils mindestens 20 Zyklen. In der parasternalen kurzen
Achse wurde das Myokard in sechs Segmente, in der parasternalen langen Achse in
sieben Segmente unterteilt (20). Auswertungen erfolgten nur anhand von
Aufnahmen, in denen Epikard und Endokard in mindestens fünf Segmenten
eindeutig abgegrenzt werden konnte. Im zweidimensionalen Bild wurde auch die
Ebene für den eindimensionalen M-Mode auf Höhe der Papillarmuskeln festgelegt.
Im M-Mode wurden die linksventrikulären enddiastolischen und endsystolischen
Durchmesser der Kammer (LVEDD und LVESD) ausgemessen sowie die
Längenverkürzungsfraktion und Wanddicken bestimmt.
25
Material & Methoden
2.2.2 Genotypisierung der Mäuse
2.2.2.1 DNA Isolation
Bei den Markierungen der Jungtiere wurde jeweils eine Stanzbiopsie aus dem Ohr
gewonnen, die zur Genotypisierung der Tiere verwendet wurde. Das Gewebe wurde
über Nacht in einem Lysepuffer mit der Proteinase K lysiert. Hierfür wurden die
Proben mit 8000 rpm bei 55°C in einen Thermomixer (Thermomixer 5436,
Eppendorf, Hamburg) gegeben. Am nächsten Tag wurde die Proteinase K durch
fünfminütiges Erhitzen auf 95°C inaktiviert. Zusammen mit Phenolchloroform wurde
für fünf Minuten bei 13000 rpm zentrifugiert (Beckmann Coulter Microfuge R). Die
oberste, DNA-haltige der drei Phasen wurde abgetragen und zusammen mit 100%
Ethanol zentrifugiert. Nach Entnahme des Ethanols wurde das vorhandene Pellet ein
weiteres Mal zentrifugiert, zusammen mit 70% Ethanol. Das Pellet wurde nun in TEPuffer gelöst und bis zur folgenden PCR bei –20°C aufbewahrt.
2.2.2.2 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Für die PCR wurde folgender Reaktionsansatz hergestellt:
1-fach in µl
Milli Q (deionisiertes Wasser)
38,5
Taq-Puffer
5
MgCl2
1,5
Primer 1
1
Primer 2
1
dNTP
0,5
Taq-DNA-Polymerase
0,5
Tabelle 2 Reaktionsansatz für die Polymerase-Kettenreaktion
Zwei µl der aus dem Ohrgewebe isolierten DNA wurden hinzugegeben, so dass ein
Endvolumen von 50µl resultierte. Zur Analyse und dem Nachweis der Gene wurden
verschiedene Protokolle verwendet:
26
Material & Methoden
Cre PCR
Primer:
Cre1TS (5´-GGACATGTTCAGGGATCGCCAGGCG-´3) (50 µmol/µl)
Cre2TS (5´-GCATAACCAGTGAAACAGCATTGC-´3) (50 µmol/µl)
Prg:
94°C
3 min
94°C
20 sek
62°C
20 sek
72°C
1 min 15 sek
Wiederholung ab Schritt 2, 29-fach
72°C
10 min
Ergebnis:
Cre+/- or Cre+/+: Bande bei 270 bp
Cre-/-: keine Bande
Gα
αqflox-PCR
Primer:
QIN6C (5´- AGCTTAGTCTGGTGACAGAAGC -´3) (50 µmol/µl)
TVQFL1 (5´- GCATGCGTGTCCTTTATGTGAG -´3) (50 µmol/µl)
Prg:
94°C
3 min
94°C
20 sek
60,5°C
20 sek
72°C
2 min 15 sek
Wiederholung ab Schritt 2, 29-fach
72°C
10 min
Ergebnis:
gαqwt: Bande bei 600 bp
gαqflox: Bande bei 700 bp
27
Material & Methoden
Gα
α11 PCR Wildtyp Allel
Primer:
TW25 (5´- GCCCCTTGTACAGATGGCAG -´3) (50 µmol/µl)
TW24 (5´- AGCATGCTGTAAGACCGTAG -´3) (50 µmol/µl)
Prg:
94°C
3 min
94°C
30 sek
64°C
30 sek
72°C
1 min 30 sek
Wiederholung ab Schritt 2, 29-fach
72°C
10 min
Ergebnis:
gα11: Bande bei 820 bp
Gα
α11 PCR Knockout Allel
Primer:
116ExAS (5´-CAGGGGTAGGTGATGATTGTGC-´3) (50 µmol/µl)
NeoA (5´-GACTAGTGAGACGTGCTACTTCC-´3) (50 µmol/µl)
Prg:
94°C
3 min
94°C
30 sek
57°C
30 sek
72°C
2 min
Wiederholung ab Schritt 2, 29-fach
72°C
10 min
Ergebnis:
gα11KO: Bande bei 450 bp
Das PCR-Produkt wurde in einem einprozentigen Agarose-Gel, welches
Ethidiumbromid zur Sichtbarmachung enthielt, elektrophoretisch aufgetrennt und das
28
Material & Methoden
Ergebnis unter ultraviolettem Licht abgelesen. Ein Marker erlaubte die
Größeneinordnung der DNA.
2.2.3 Untersuchungen zur Proteinexpression
2.2.3.1 Herstellung von Homogenaten für Western Blot-Untersuchungen
Nach der Entnahme der Herzen aus dem Thorax wurden diese von
Geweberestbeständen befreit, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei – 80°C
gelagert. Zur Bestimmung der Proteinexpression wurden zu einem späteren
Zeitpunkt Anteile der Herzen in einem Metallgefäß unter ständiger Kühlung in
flüssigem Stickstoff mit einem Hammer zerkleinert. Das hierbei entstehende pulvrige
Produkt wurde im zehnfachen Verhältnis mit Präparationspuffer versetzt und sofort
auf Eis gestellt. Hier wurde die weitere Homogenisierung mit einem Mixer UltraTurrax T8 (Janke & Kunkel KG, IKA-Werke, Staufen) vier mal über jeweils 20
Sekunden durchgeführt. Anschließend wurde Gefrierpuffer in gleichem Volumen
dazugegeben. Die Proben wurden nun entweder direkt zur Western Blot Analyse
weiterverarbeitet oder zur späteren Verwertung aliquotiert und bei –80°C gelagert.
2.2.3.2 Bestimmung der Proteinkonzentration
Um zu gewährleisten, dass für die folgenden Western Blots die Proben gleiche
Mengen an Protein enthielten, wurde die Proteinkonzentration nach der Methode von
Bradford bestimmt (13). Alle Proben wurden mit Hilfe des Gefrierpuffers auf eine
Konzentration von 2000-4000 µg/ml eingestellt. Als Standard diente
Rinderserumalbumin durch welches eine lineare Eichgerade erstellt wurde (r > 0,99).
2.2.3.3 SDS-Gelelektrophorese
Die SDS-Gelelektrophorese dient der quantitativen Bestimmung einzelner Proteine in
einem Homogenat. Durch Anlegen einer Spannung an ein SDS-Polyacrylamidgel
werden dabei die Proteine nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt.
Zur Vorbereitung der Proben wurden diese mit einem Probenpuffer im Verhältnis 1:2
versetzt. Für die Gelelektrophorese wurden Trenngele von 8-12 % Polyarcylamid und
Sammelgele von 4 % Polyacrylamid verwendet.
29
Material & Methoden
Nach Herstellung der entsprechenden Polyacrylamidgele und deren Aushärtung,
wurden die Proben mit einer Proteinmenge von 50 µg aufgetragen, bei 80 mA für ca.
eine Stunde gesammelt und bei 120 mA für fünf bis sechs Stunden getrennt. Neben
den Proben wurde ein Marker in den Gelen aufgetrennt, der eine
Größenidentifizierung der Proteine zuließ.
2.2.3.4 Western Blot
Der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese schloss sich der Transfer der Proteine von
den Gelen auf eine Polyvinyldienfluorid-Membran (PVDF-Membran) im NassblotVerfahren an. Es wurde über einen Zeitraum von 16 Stunden mit einem Strom von
64 mA bzw. 100 mA bei 4°C geblottet. Hierbei fand eine Hoefer-Transfer-Einheit
(Hoefer, San Francisco, CA, USA) Verwendung. Um einen erfolgreichen Transfer
nachzuweisen wurden die Gele mit Coomassie Brilliant Blue eingefärbt. Um
unspezifische Bindungsstellen der PVDF-Membran zu blocken, wurden die
Membranen nach dem Nassblot mit 5%iger Milch in TBST für 2 Stunden bei
Raumtemperatur geschüttelt. Anschließend wurden die Membranen zweimal mit
TBST für zehn Minuten gewaschen. Auf einem Schüttler wurde nun wiederum bei
4°C für mindestens 12 Stunden die Inkubation mit dem spezifischen Antikörper, der
jeweils gegen das zu untersuchende Protein gerichtet war, vorgenommen. Es folgten
sechs jeweils fünfminütige Waschungen mit TBST, eine weitere Blockung mit 5%iger
Milch für 20 Minuten und eine zehnminütige Waschung mit TBS. Die Membranen
wurden nun mit dem zweiten Antikörper bei Raumtemperatur für zwei Stunden
inkubiert. Noch einmal schlossen sich Waschvorgänge an, zwei mal zehn Minuten
mit TBST und einmal zehn Minuten mit TBS. In einem weiteren Schritt folgte die
Inkubation der Membranen für eine Minute in einer Chemiluminiszenz-Lösung (ECL,
Amersham-Buchler, Braunschweig) und dann die Exposition auf einem Röntgenfilm.
Nach Entwicklung der Filme ließ sich durch Einscannen und durch eine
computerunterstützte densitometrische Analyse (ImageQuant, PDI Imaging System,
Krefeld) eine Quantifizierung der Proteinexpression vornehmen.
30
Material & Methoden
Antikörper
Spezies
Molekulargewicht Poly/Monoklonal Verdünnung
Ryanodin-Typ-2
Maus
565 kDa
Monoklonal
1:2000
NCX
Kaninchen
72,120,160 kDa
Monoklonal
1:1000
Calsequestrin
Kaninchen
55 kDa
Polyklonal
1:2000
Sorcin
Maus
22 kDa
Monoklonal
1:1000
FKBP12.6
Kaninchen
12,6 kDa
Polyklonal
1:2000
Phospho-RYR2-
Kaninchen
565 kDa
Polyklonal
1:2500
Annexin VII
Maus
47, 51 kDa
Monoklonal
1:1000
Kaninchen IgG
Ziege
-
Monoklonal
1:2000
Maus IgG
Schaf
-
Monoklonal
1:2000
Serine 2809
Tabelle 3 Charakteristik der verwendeten Antikörper für den Western Blot
2.2.4 Untersuchungen zur Funktion
2.2.4.1 Herstellung von Homogenaten und Bestimmung der Proteinkonzentration für
die quantitative Bestimmung des Ca²+-Verlustes an isolierten
Membranvesikeln
Die Herstellung von Homogenaten folgte dem gleichen Prinzip wie die Herstellung
der Homogenate für die Western Blots (siehe 2.2.3.1). Es wurde aber statt des
Gefrier- und des Präparationspuffers ein Kaliumphosphat-Puffer verwendet. Die
Proteinkonzentrationsbestimmung wurde ebenfalls unter Verwendung des KaliumPhosphat-Puffers durchgeführt, wie in 2.2.3.2 beschrieben.
2.2.4.2 Quantitative Bestimmung des Ca²+-Verlustes an isolierten Membranvesikeln
Die Bestimmung des Ca²+-Verlustes wurde mit der Millipore-Filtrationstechnik
durchgeführt wie bei Luo et al. beschrieben (76).
31
Material & Methoden
Es wurde folgender Reaktionsansatz erstellt:
Imidazol pH 7.0
40 mM
KCl
95 mM
NaN3
5 mM
MgCl2
5 mM
EGTA
0,5 mM
K+Oxalat
5mM
2+
Tabelle 4 Reaktionsansatz für die quantitative Bestimmung des Ca -Verlustes an isolierten
Membranpartikeln.
Die Untersuchungen wurden bei pCa 5,5 durchgeführt. Um die Leckage und damit
die Funktion des Ryanodinkanals zu prüfen wurde jede Probe einmal mit, und einmal
ohne Ruthenium Rot, welches den Ryanodinkanal blockiert, in einer Konzentration
von 1 µM gemessen. Der Reaktionsansatz wurde nach Zugabe der Probe für eine
Minute bei 37°C inkubiert. Vor dem Hinzufügen von ATP (Konzentration: 5 mM)
wurde eine unspezifische Messung durchgeführt. Das ATP sorgt für die Initiierung
der Ca²+-Aufnahme über die SERCA. Messungen wurden bei 1, 2, 4, 6 und 8
Minuten unternommen. Der unspezifische Messwert wurde von den erhobenen
Messwerten abgezogen. Die Ca2+-Aufnahme wurde nach der Durchführung eines
Curve Fit der 1, 2, 4, 6 und 8 Minutenwerte berechnet.
Der Ca2+-Verlust des Ryanodinkanals konnte berechnet werden, indem man die
Werte der Ca2+-Aufnahme ohne Ruthenium Rot von den Werten der Ca2+-Aufnahme
mit Ruthenium Rot subtrahierte.
2.2.5 Immunhistochemie
Nach Opferung der Mäuse durch zervikale Dislokation wurde das Herzgewicht
bestimmt. Möglichst schnell wurden die Herzen anschließend in Immersionsfixativlösung für 24 h bei 4°C fixiert. Nach dem Waschen in 0,1 M PBS, pH 7,4, 24 h, bei
4°C, wurden die Proben mit 20% Saccharoselösung in 0,1 M PBS, pH 7,4, 48 h, bei
4°C, kryoprotektiert. Die Proben wurden dann einzeln in Tissue-Tek eingebettet und
sofort in flüssigem Stickstoff tiefgefroren. Die tiefgefrorenen Blöcke wurden bei -80°C
gelagert.
32
Material & Methoden
Es wurden Schnitte von 7 µm Dicke mit dem Kryostat angefertigt und auf
Objektträgern aufgefangen. Die Schnitte wurden bis zur Durchführung der
immunhistochemischen Untersuchungen bei –20°C aufbewahrt.
Für die immunhistochemische Inkubation wurde die Avidin-Biotin-PeroxidaseKomplex-Methode (Elite ABC Kit, Vector Labor, Peterborough, UK) angewendet, die
folgende Schritte umfasste:
1. 2x15 Min. bei RT waschen in 0,05 M TBS pH 7,6
2. 20 Min. inkubieren bei RT in 0,3% H2O2 verdünnt in 0,05 M TBS zur
Blockierung der endogenen Peroxidase.
3. 30 Min. inkubieren bei RT mit 10% normal goat serum (NGS) + 0,05 M TBS
pH 7,6 + 1% bovine serum albumine (BSA).
4. 24 Std. Inkubation bei 4 °C mit primärem Antikörper, verdünnt in 1% NGS +
0,2% Triton X-100 + 0,05 M TBS pH 7,6.
5. 2x15 Min. bei RT waschen in 0,05 M TBS, pH 7,6.
6. 1 Std. Inkubation bei RT mit sekundärem Antikörper, verdünnt in 1% NGS +
0,05 M TBS pH 7,6.
7. 2x15 Min. bei RT waschen in 0,05 M TBS pH 7,6.
8. 1 Std. Inkubation bei RT mit dem ABC-Komplex, Vectastain Elite ABC
Reagenz (1:100; Vector), verdünnt in 0,05 M TBS pH 7,6.
9. 2x15 Min. bei RT waschen in 0,05 M TBS pH 7,6.
10. 10 Min. (die Zeit wurde für jeden Antikörper gleich festgelegt) bei RT mit der
DAB-Lösung inkubieren.
11. 2x15 Min. bei RT waschen in 0,05 M TBS pH 7,6.
12. Schnitte auf beschichtete Objektträger übertragen.
13. Schnitte an der Luft trocknen.
14. Schnitte in aufsteigender Ethanolreihe dehydrieren: 30%, 50%, 70%, 90%,
95%, 100% Ethanol je 5 Min.
15. Schnitte in Xylene klären.
16. Schnitte in Entellan eindecken.
Um eine unspezifische Bindung der Antikörper auszuschließen, wurden Schnitte
angefertigt, bei denen jeweils nicht mit dem primären oder nicht mit dem sekundären
Antikörper inkubiert wurde, sowie ein Schnitt, der mit keinem Antikörper inkubiert
33
Material & Methoden
wurde. Die Befunde wurden im Lichtmikroskop in Übersichts- und Detailaufnahmen
(400-fache Vergrößerung) ausgewertet und mikrophotographisch dokumentiert.
2.2.6 Statistische Methoden
Zur Auswertung der Versuche wurde der arithmetische Mittelwert und der
dazugehörige Standardfehler des Mittelwertes (SEM) für die jeweiligen Proben
errechnet. Der Student t-Test für verbundene oder unverbundene Stichproben diente
zur Ermittlung der statistischen Signifikanz. Als statistisch signifikant wurde ein pWert < 0,05 betrachtet.
34
Ergebnisse
3 Ergebnisse
3.1 Charakterisierung der Versuchstiere
Die Versuchstiere wurden im Alter von 16 Wochen durch zervikale Dislokation
getötet. Hierbei wurden der Blutzuckerwert sowie der HbA1c–Wert zur Überprüfung
der Stoffwechsellage der Tiere ermittelt. Das Herzfeuchtgewicht diente als Marker
einer Herzhypertrophie und das Lungenfeuchtgewicht als Marker einer
Herzinsuffizienz. Um diese Größen zu normieren wurde die Länge des
Tibiaknochens bestimmt. Tabelle 5 fasst die erhobenen Daten zum Zeitpunkt des
Todes der Tiere zusammen.
Wildtyp
Wildtyp
Gα11
Gα11
Gα11/Gαq
Diabetes
Kontrolle
Knockout
Knockout
Doppelknockout Doppelknockout
Diabetes
Kontrolle
Diabetes
Kontrolle
n = 13
n = 13
n=4
n=4
n = 14
n = 10
Gα11/Gαq
Gewicht (g)
20,5 ± 2,6 ∗ 31,6 ± 2,5
25,2 ± 3,3 ∗ 32,0 ± 5,1
30,5 ± 0,2
31,5 ± 6,3
Blutzucker (mg/dl)
491 ± 91 ∗
432 ± 107 ∗ 109 ± 9
453 ± 120 ∗
111 ± 3
Herz/Tibia (g/cm)
0,07 ± 0,0 ∗ 0,05 ± 0,0
0,09 ± 0,01
0,09 ± 0,01
0,13 ± 0,0 ∗
0,08 ± 0,0
Lunge/Tibia (g/cm)
0,09 ± 0,0
0,09 ± 0,01 0,11 ± 0,01
0,10 ± 0,01
0,11 ± 0,0 ∗
0,08 ± 0,0
103 ± 12
∗ p < 0,05 vs. Kontrolle
Tabelle 5 Allgemeine Daten der verschiedenen Tiergruppen. Die Werte sind als Mittelwerte ± SEM
zum Opferungszeitpunkt der Tiere angegeben.
Das Körpergewicht der diabeteskranken Tiere ist sowohl bei den Wildtypmäusen, als
auch bei den Gα11 Knockoutmäusen gegenüber der Kontrollgruppe zum
Opferungszeitpunkt signifikant vermindert.
Der Verlauf des Körpergewichtes über den 8-wöchigen Versuchszeitraum ist in
Abbildung 4 für ein Tier nach Induktion eines Diabetes mellitus und in Abbildung 3 für
ein Kontrolltier exemplarisch dargestellt. Es zeigt sich eine Gewichtsreduktion des
Körpergewichtes bei dem diabetischen Tier gegenüber einer leichten
35
Ergebnisse
Gewichtszunahme des Kontrolltieres. Dies ist ein Hinweis auf die typische katabole
Stoffwechsellage bei Typ 1 Diabetes Mellitus.
Alle Tiere zeigten zwei Tage nach einer STZ-Injektion Blutzuckerwerte von
mindestens 200 mg/dl. Im Verlauf von fünf Tagen wiesen alle diese Tiere
Blutzuckerwerte von 300 mg/dl und mehr auf. Der typische Verlauf der
Blutzuckerwerte ist ebenfalls exemplarisch in Abbildung 4 für ein Tier, dem ein
Diabetes Mellitus induziert wurde, dargestellt. Abbildung 3 zeigt die entsprechenden
Messungen einer Kontrollmaus.
Bei der Opferung der Mäuse wurde das Herzfeuchtgewicht und das
Lungenfeuchtgewicht ermittelt und auf die Länge der Tibia des jeweiligen Tieres
normiert. Die Ergebnisse hierzu sind in Abbildung 5 und 6 dargestellt. Es zeigt sich,
dass diabeteskranke Wildtypmäuse im Vergleich zu Kontrollmäusen ein erhöhtes
Herzgewicht aufweisen. Dies ist ein deutlicher Hinweis auf eine Myokardhypertrophie
in dieser Gruppe. Das Lungenfeuchtgewicht wies bei diesen Versuchsgruppen
keinen signifikanten Unterschied auf. Dieser Befund wurde bei den diabeteskranken
Gα11 Knockoutmäusen nicht beobachtet. In dieser Gruppe hatten sowohl die
diabeteskranken Tiere, als auch die Kontrolltiere äquivalente Messwerte. Bei den
diabetischen Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen wiederum ergab sich ein signifikant
höheres Herzgewicht als auch ein signifikant erhöhtes Lungengewicht gegenüber
den Doppelknockoutmäusen ohne Diabetes Mellitus.
Zusammengefasst ergibt sich aus der Quantifizierung von Herz- und Lungengewicht
bei Wildtypmäusen der Hinweis auf eine deutliche Myokardhypertrophie bei den
diabeteskranken Tieren. Gα11/Gαq Doppelknockoutmäuse entwickeln nach Induktion
eines Diabetes eine deutliche Myokardhypertrophie und weisen sogar Zeichen der
kongestiven Herzinsuffizienz auf. Nur Mäuse mit isolierter Deletion des Gα11-Proteins
entwickeln 8 Wochen nach Induktion eines Diabetes Mellitus keinen kardialen
Phänotyp.
Zur Kontrolle der Blutzuckerstoffwechsellage bei Mäusen mit und ohne Diabetes
mellitus wurde in beiden Gruppen der HbA1c-Wert bestimmt. Abbildung 7 zeigt den
mittleren HbA1c-Wert beider Gruppen, der 8 Wochen nach Induktion eines Diabetes
einen Anstieg von 240 % aufwies.
36
Ergebnisse
600
30
500
28
400
26
300
24
200
100
22
0
20
1
7
14
21
35
42
49
Körpergewicht (g)
Blutzucker (mg/dl)
Kontrolle
56
Tag
Blutzucker (mg/dl)
Körpergewicht (g)
Abbildung 3 Repräsentativer Verlauf des Blutzuckers und des Körpergewichts eines
Kontrolltieres. Der Verlauf von Blutzucker und Körpergewicht ist repräsentativ sowohl für
Tiere des Wildtyps, als auch für Gα11- und Gα11/Gαq Doppelknockoutmäuse.
STZ-induzierter Diabetes Mellitus
600
30
28
400
26
300
24
200
Körpergewicht (g)
Blutzucker (mg/dl)
500
22
100
0
20
1
7
14
21
28
35
42
49
56
Tag
Blutzucker (mg/dl)
Körpergewicht (g)
Abbildung 4 Repräsentativer Verlauf des Blutzuckers und des Körpergewichts eines Tieres
nach Induktion eines Diabetes Mellitus durch intraperitoneale Injektion von Streptozotocin
(STZ) an Tag 1. Der Verlauf von Blutzucker und Körpergewicht ist repräsentativ sowohl für
Tiere des Wildtyps, als auch für Gα11- und Gα11/Gαq Doppelknockoutmäuse.
37
Ergebnisse
H erz gew icht
***
Herzgewicht / Tibialänge g/cm
0,14
0,12
0,1
*
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Ga11/Gaq-KO
Gα11/Gαq KO
Kontr.
Kontr.nn==44
Ga11/Gaq-KO
Gα11/Gαq KODM
DM Ga11-KO
Gα11 KOKontr.
Kontr.
nn == 44
nn==13
13
Ga11-KO
DM
Gα11 KO DM
nn==13
13
Wildty
p Kontr.
Wildtyp
Kontr.
n n= =1010
Wildty p DM
Wildtyp
DM
n n= =1414
Abbildung 5: Darstellung des Mittelwertes des Herzgewichtes ± SEM der Tiere normiert auf die Tibialänge
zum Zeitpunkt der Opferung.
Die Gα11/Gαq Doppelknockoutmäuse zeigten eine hochsignifikante Zunahme des Herzgewichtes nach
Induktion eines DM. Die Wildtypmäuse zeigten eine signifikante Zunahme des Herzgewichtes nach
Induktion eines DM. Die Gα11 Knockoutmäuse zeigten auch nach 8 Wochen Diabetes keine Veränderungen
des Herzgewichtes.
∗ p < 0,05 vs. Kontrolle; ∗∗∗ p < 0,001 vs. Kontrolle; KO = Knockout; DM = Diabetes Mellitus;
Kontr. = Kontrolle
Lungengew icht
Lungengewicht /Tibialänge g/cm
0,14
**
0,12
0,1
0,08
0,06
0,04
0,02
0
Ga11/Gaq-KO
Gα
11/Gαq KO
Kontr.nn==44
Kontr.
Ga11/Gaq-KO
DM
Gα
11/Gαq KO DM
nn==44
Ga11-KO
Kontr.
Gα
11 KO Kontr.
nn==13
13
GαGa11-KO
11 KO DMDM
nn==13
13
Wildty pKontr.
Kontr.
Wildtyp
n n= =1010
Wildty pDM
DM
Wildtyp
n =n 14
= 14
Abbildung 6: Darstellung des Mittelwertes des Lungengewichtes ± SEM der Tiere normiert auf die
Tibialänge zum Zeitpunkt der Opferung.
Nur bei den Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen zeigte sich eine signifikante Zunahme des
Lungengewichtes nach 8 Wochen Diabetes. Die anderen Versuchsgruppen hatten jeweils äquivalente
Werte zu den Kontrollen.
∗∗ p < 0,01 vs. Kontrolle; KO = Knockout; DM = Diabetes Mellitus; Kontr. = Kontrolle
38
Ergebnisse
Wildtypmäuse
***
12
10
HbA1c [%]
8
6
4
2
0
Kontrolle n = 9
Diabetes Mellitus n = 7
Abbildung 7: Anteil an glykosyliertem Hämoglobin (HbA1c) im Blut von Mäusen 8 Wochen nach Induktion
eines Diabetes Mellitus und nicht diabeteskranker Kontrolltiere.
Durch Induktion eines Diabetes Mellitus kommt es zu einer signifikanten Zunahme des HbA1c um 240 %
relativ gegenüber der Kontrolle.
∗∗∗ p < 0,001 vs. Kontrolle
39
Ergebnisse
3.2 Genotypisierung der Mäuse
Um die in eigener Zucht vermehrten Mäuse zu genotypisieren, wurden rein
qualitative PCR-Untersuchungen durchgeführt. Aus dem Ohrgewebe, welches bei
der Markierung der Mäuse gewonnen wurde, wurde die DNA isoliert und für die PCR
verwendet. Vier Gene der Mäuse wurden untersucht. Das Cre-Gen, als Nachweis
eines konditionellen Gα11/Gαq-Doppelknockouts. Das Gαq-flox-Gen als Nachweis der
spezifischen Schnittstellen für das Cre-Enzym, gleichzeitig diente das Gαq-flox-Gen
als Nachweis einer gelungenen DNA-Isolation, da dieses Gen bei allen Tieren
exprimiert wurde. Das Gα11-Wildtyp-Gen, welches nur bei Wildtypmäusen dargestellt
werden kann, um die Gα11-Defizienz zu überprüfen. Das Gα11-Knockout-Gen, das
nur bei Gα11 Knockoutmäusen nachgewiesen werden kann. Abbildung 8 zeigt
beispielhaft die Fotographie eines Agarosegels, in welchem die PCR-Produkte
verschiedener Mäuse aufgetragen wurden. Bei ca. 280 bp kommt das PCR-Produkt
des Cre-Gens als Bande zur Darstellung.
M
-
+
+
+
-
+
-
+
-
-
LK
PK
300 bp
200 bp
M = Marker
LK = Leerkontrolle
PK = Positivkontrolle
+ = Cre positiv
- = Cre negativ
Abbildung 8 Repräsentative Fotographie einer das Cre-Gen nachweisenden PCR.
40
Ergebnisse
3.3 Echokardiographische Bestimmung funktioneller und
morphologischer Veränderungen am Herzen in vivo
Die Ultraschalluntersuchung der Mäuseherzen in vivo wurde vergleichend sowohl am
Tag vor Streptozotocin-Injektion als auch unmittelbar vor Tötung der Tiere
durchgeführt, um morphologische und funktionelle Veränderungen, die durch den
Diabetes über 8 Wochen auftreten können, zu untersuchen. Die Myokarddicke und
die Dimensionen der Herzhöhlen wurden quantifiziert. Im zweidimensionalen B-mode
wurden die parasternale kurze Achse auf midpapillärer Ebene und die parasternale
lange Achse aufgezeichnet. Im zweidimensionalen Bild wurde auch die Ebene für
den eindimensionalen M-Mode auf Höhe der Papillarmuskeln festgelegt. Im M-Mode
wurden die linksventrikulären enddiastolischen und endsystolischen Durchmesser
der Kammer (LVEDD und LVESD) ausgemessen sowie die Längenverkürzungsfraktion und Wanddicken bestimmt.
Eine Übersicht über die Ergebnisse liefert Tabelle 6 und Abbildung 9.
Systolisch
Diastolisch
Gα11 Knockout
Gα11 Knockout
Wildtyp Kontrolle
Wildtyp Diabetes
Kontrolle
Diabetes
Septum (cm)
0.155 ± 0.007
0.178 ± 0.006
0.165 ± 0.005
0.142 ± 0.004 **
LVESD (cm)
0.182 ± 0.009
0.133 ± 0.016
0.178 ± 0.011
0.170 ± 0.013
LVPW (cm)
0.140 ± 0.004
0.169 ± 0.007 **
0.123 ± 0.006
0.136 ± 0.003
Septum (cm)
0.072 ± 0.004
0.102 ± 0.004 ***
0.083 ± 0.003
0.087 ± 0.005
LVEDD (cm)
0.381 ± 0.009
0.315 ± 0.017*
0.383 ± 0.012
0.351 ± 0.012
LVPW (cm)
0.080 ± 0.004
0.117 ± 0.005 ***
0.083 ± 0.003
0.085 ± 0.008
FS %
0.523 ±0.019
0.585 ± 0.031
0.536 ± 0.026
0.519 ± 0.028
∗ p < 0,05 vs. Control; ∗∗ p < 0,01 vs. Control, ∗∗∗ p < 0,001 vs. Control
Tabelle 6 Echokardiographische Daten (Mittelwert ± SEM) nach 8 Wochen eines experimentellen
Diabetes bei Wildtypmäusen und Gα11 Knockoutmäusen im Vergleich zu nicht diabeteskranken
Kontrolltieren. Die Wildtypmäuse zeigten eine signifikante Zunahme der diastolischen und
systolischen LVPW und der diastolischen Septumdicke. Der LVEDD war vermindert. Diese
Alterationen konnten nicht in der Gα11 Knockoutgruppe nach 8 Wochen Diabetes beobachtet werden.
Hier zeigte sich eine signifikante Abnahme der systolischen Septumdicke.
LVESD = linksventrikulärer endsystolischer Durchmesser
LVEDD = linksventrikulärer enddiastolischer Durchmesser
LVPW = Dicke der linksventrikulären Hinterwand
FS = Längenverkürzungsfraktion
41
Ergebnisse
Es zeigte sich nach 8 Wochen Diabetes eine signifikante Zunahme sowohl der
systolischen als auch der diastolischen Dicke der linksventrikulären Hinterwand
(LVPW) bei den Wildtypmäusen. Diese Tiere zeigten ebenfalls einen verminderten
linksventrikulären enddiastolischen Durchmesser im Vergleich zu den nicht
diabeteskranken Kontrolltieren. Diese Veränderungen, die als Hinweis auf eine
Herzhypertrophie interpretiert werden können, zeigten sich nicht bei den Gα11
Knockoutmäusen nach 8 Wochen Diabetes im Vergleich zu den nicht
diabeteskranken Kontrolltieren. Bei den Gα11 Knockoutmäusen ließ sich nach 8
Wochen eines experimentellen Diabetes lediglich eine Verminderung der
systolischen Septumdicke nachweisen. Die Längenverkürzungsfraktion blieb in allen
untersuchten Tiergruppen unverändert, was für eine unveränderte kardiale Funktion
spricht.
Wildtyp
Gα11 -Knockout
Kontrolle
Diabetes
Abbildung 9 Exemplarische Darstellung des linken Ventrikels im Querschnitt in den untersuchten Tiergruppen. Es
zeigt sich bei den Wildtypmäusen eine signifikante Zunahme der Dicke der Ventrikelwand (Pfeile) nach 8
Wochen Diabetes im Vergleich zu nicht diabeteskranken Kontrolltieren. Dieses konnte bei den Gα11
Knockouttieren nicht beobachtet werden.
42
Ergebnisse
3.4 Untersuchungen der Proteinexpression
Bei Typ 1-Diabetes kann die Proteinexpression der Herzmuskelzelle direkt durch die
Hyperglykämie als auch durch die Hypoinsulinämie moduliert werden (89, 123).
Gleichzeitig kann aber auch die gesteigerte neurohumorale Aktivität bei Diabetes
mellitus die Genexpression des Herzens wesentlich beeinflussen. Insbesondere die
G-Proteine Gα11 und Gαq, die bei Diabetes in ihrer Expression und Aktivität
gesteigert sind, haben einen wesentlichen Einfluss auf die Stimulation zahlreicher
Transkriptionsfaktoren. Über diese Signalkaskade können Veränderungen in der
Expression Ca2+-regulierender Proteine des SR vermittelt werden, die am Modell der
STZ-induzierten Ratte von mehreren Arbeitsgruppen beschrieben wurden (8, 137,
151). Diese Veränderungen kommen ursächlich für die gestörte diastolische und
systolische Pumpfunktion des diabetischen Herzens in Betracht.
Um den Einfluss einer diabetischen Stoffwechsellage auf die Proteinexpression zu
untersuchen, wurden die Herzen von diabetischen Wildtyptieren analysiert.
Außerdem konnte durch den Vergleich mit Herzen des Gα11/Gαq Knockoutmodells
die Bedeutung der G-Proteine Gα11 und Gαq auf die Proteinexpression in einem
diabetischen Zustand untersucht werden. Besonderes Augenmerk lag hierbei auf
dem Proteinkomplex des SR-Calcium-Freisetzungskanals. Nachfolgend werden im
einzelnen die Ergebnisse zur Expression des Ryanodinrezeptors Typ 2, des Sorcins,
des FKBP12.6, des Annexin VII und des Na+/Ca2+-Austauschers dargestellt.
Die Western Blots wurden sämtlich mit Calsequestrin als interner Standard
durchgeführt und alle dargestellten Ergebnisse auf Calsequestrin normiert
abgebildet.
43
Ergebnisse
3.4.1 Expression des Ryanodinrezeptors Typ 2
Der Ryanodinrezeptor, der im Herzen als Isoform 2 exprimiert wird, spielt die zentrale
Rolle in der Vermittlung der Calcium-induzierten-Calcium-Freisetzung (CICR) aus
dem Sarkoplasmatischen Retikulum.
Der Einfluss eines Diabetes mellitus auf dieses 565 kDa schwere Protein wurde
durch die vergleichende Messung der Proteinexpression von diabeteskranken
Wildtypmäusen mit Kontrollwildtypmäusen untersucht (RYR2 [densitometrische
Einheiten] ND: 4,02 ± 0,18 ; DM: 4,22 ± 0,36; p= 0,6 ) (Abb. 10). Der Einfluss der GProteine Gα11 und Gαq unter diabetischen Bedingungen wurde durch vergleichende
Messungen der Proteinexpression von Gα11 Knockoutmäusen (RYR2
[densitometrische Einheiten] ND: 5,58 ± 1,03; DM: 7,02 ± 0,8; p= 0,28) (Abb. 11) und
Gα11/ Gαq Doppelknockoutmäusen untersucht (RYR2 [densitometrische Einheiten]
ND: 1,17 ± 0,04; DM: 1,22 ± 0,02; p= 0,25) (Abb. 12).
Die Proteinexpression war in allen drei Gruppen unverändert.
RYR2 / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Wildtyp
Ryanodin-Expression
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 10
Diabetes mellitus n = 8
565 kDa
RYR2
55 kDa
Calsequestrin
DM
K DM
K
DM
K
DM
K DM
K DM
K
DM
K DM
K
K
K
Abbildung 10 Relative Expression des RYR 2 bei Wildtypmäusen 8 Wochen nach Induktion eines
Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine Veränderung der kardialen
Ryanodin-Expression von Wildtypmäusen im Vergleich mit nicht diabeteskranken Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
44
Ergebnisse
RYR2 / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Gα
α 11 Knockout
Ryanodin-Expression
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 7
Diabetes mellitus n = 8
565 kDa
RYR2
55 kDa
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
DM
Calsequestrin
Abbildung 11 Relative Expression des RYR 2 bei Gα11 Knockoutmäusen 8 Wochen nach Induktion
eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen Ryanodin-Expression von Gα11 Knockoutmäusen im Vergleich mit nicht diabeteskranken
Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
RYR2 / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Gα
α 11/Gα
α q Knockout
Ryanodin-Expression
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 4
Diabetes mellitus n = 4
RYR2
Calsequestrin
565 kDa
55 kDa
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
Abbildung 12 Relative Expression des RYR 2 bei Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen 8 Wochen nach
Induktion eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen Ryanodin-Expression von Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen im Vergleich mit nicht
diabeteskranken Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
45
Ergebnisse
3.4.2 Phosporylierung des RYR2 an Serin 2809
Die Phosphorylierungsstelle Serin 2809 wird als wichtiger Regulationsfaktor des
RYR2 bewertet. Die Phosphorylierung wird durch die Proteinkinase A und die
Calmodulin-abhängige Kinase vorgenommen (55, 83, 145). Außerdem wird eine
schwächere Phosphorylierung durch weitere Enzyme wie der Proteinkinase C und
der Proteinkinase G vorgenommen (128, 130). Durch diesen Mechanismus der
Phosphorylierung wird die Öffnungswahrscheinlichkeit des RYR2 erhöht und es
kommt zu einer größeren Ca2+-Leckage aus dem SR. Die Untersuchungen durch
einen spezifischen Antikörper, der nur am phosphorylierten Serin 2809 bindet,
konnten keine Unterschiede zwischen diabetischen Tieren und Kontrolltieren, weder
in Wildtypen (Serin 2809 [densitometrische Einheiten] ND: 4,25 ± 0,84; DM:4,41 ±
0,70; p= 0,88) (Abb.13), noch in den beiden Knockoutmodellen (Serin 2809
[densitometrische Einheiten] ND: 1,04 ± 0,11; DM: 1,13 ± 0,09; p= 0,56) (Abb. 14)
(Serin 2809 [densitometrische Einheiten] ND: 0,90 ± 0,03; DM: 0,93 ± 0,02; p= 0,37)
(Abb. 15) nachweisen. Die Ergebnisse wurden jeweils sowohl auf die Expression des
RYR2 insgesamt, als auch auf die Dichte des Calsequestrin als interner Standard
bezogen ausgewertet.
Phosphoserin 2809 / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Wildtyp
RYR2-Phosphorylierung
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 10
Diabetes mellitus n = 8
565 kDa
Serin 2809
55 kDa
Calsequestrin
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM K
DM
K
DM
K
DM
K
K
K
Abbildung 13 Relative Phosphorylierung des RYR2 an Serin 2809 bei Wildtypmäusen 8 Wochen
nach Induktion eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen Phosphorylierung des RYR2 an Serin 2809 von Wildtypmäusen im Vergleich mit nicht
diabeteskranken Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
46
Ergebnisse
Phosphoserin 2809 / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Gα
α11 Knockout
RYR2-Phosphorylierung
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 7
Diabetes mellitus n = 8
Phosphoserin
565 kDa
Calsequestrin
55 kDa
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
DM
Abbildung 14 Relative Phosphorylierung des RYR2 an Serin 2809 bei Gα11 Knockoutmäusen 8
Wochen nach Induktion eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen Phosphorylierung des RYR2 an Serin 2809 von Gα11 Knockoutmäusen im Vergleich mit
nicht diabeteskranken Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
Phosphoserin 2809 / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Gα
α11/Gα
αq Knockout
RYR2-Phosphorylierung
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 4
Diabetes mellitus n = 4
565 kDa
Phosphoserin
55 kDa
Calsequestrin
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
Abbildung 15 Relative Phosphorylierung des RYR2 an Serin 2809 bei Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen 8 Wochen nach Induktion eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken
Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen Phosphorylierung des RYR2 an Serin 2809 von Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen im
Vergleich mit nicht diabeteskranken Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
47
Ergebnisse
3.4.3 Expression des Sorcin
Sorcin ist ein 22 kDa schweres Protein. Während die Funktion noch nicht vollständig
aufgeklärt ist, ist die Assoziation des Proteins mit dem RYR2 und seine Ca2+abhängige Translokation unumstritten. Es wurde die Expression dieses potentiellen
Modulators des RYR2 unter diabetischen Bedingungen bei Wildtypmäusen, sowie
bei Gα11 Knockoutmäusen und bei Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen untersucht und
mit den jeweiligen Kontrollmäusen verglichen. Interessanterweise zeigte sich eine
unveränderte Expression bei den Wildtypmäusen (Sorcin [densitometrische
Einheiten] ND: 1,33 ± 0,08; DM: 2,18 ± 0,82; p= 0,21) (Abb. 16) und bei den Gα11
Knockoutmäusen (Sorcin [densitometrische Einheiten] ND: 0,4 ± 0,01; DM: 0,4 ±
0,03; p= 0,98) (Abb. 17), hingegen bei den Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen eine
starke Expressionszunahme (Sorcin [densitometrische Einheiten] ND: 0,26 ± 0,11;
DM: 0,77 ± 0,08; p= 0,01) nach 8 Wochen Diabetes (Abb.18).
Sorcin / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Wildtyp
Sorcin-Expression
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Kontrolle n = 10
Diabetes mellitus n = 6
Sorcin
Calsequestrin
22 kDa
55 kDa
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
K
K
K
K
Abbildung 16 Relative Expression des Sorcins bei Wildtypmäusen 8 Wochen nach Induktion eines
Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen Sorcin-Expression von Wildtypmäusen im Vergleich mit nicht diabeteskranken Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
48
Ergebnisse
Sorcin / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Gα
α11 Knockout
Sorcin-Expression
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 7
Diabetes mellitus n = 8
22 kDa
Sorcin
Calsequestrin
55 kDa
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
DM
Abbildung 17 Relative Expression des Sorcins bei Gα11 Knockoutmäusen 8 Wochen nach Induktion
eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen Sorcin-Expression von Gα11 Knockoutmäusen im Vergleich mit nicht diabeteskranken
Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
Sorcin / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Ga11/Gaq Knockout
Sorcin-Expression
**
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Kontrolle n = 4
Diabetes mellitus n = 4
Sorcin
22 kDa
55 kDa
Calsequestrin
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
Abbildung 18 Relative Expression des Sorcins bei Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen 8 Wochen nach
Induktion eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich eine signifikante, kardiale
Expressionszunahme des Sorcins bei Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen im Vergleich mit nicht
diabeteskranken Kontrollen.
∗∗ p < 0,01 vs. Kontrolle DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
49
Ergebnisse
3.4.4 Expression des FKBP12.6
Das FK506-binding-Protein, FKBP12.6, ist mit dem RYR2 assoziiert. Es scheint, bei
Verbindung mit dem RYR2, diesen in einem geschlossenen Zustand zu halten. Seine
Rolle als potentieller Antagonist zum Sorcin wird diskutiert.
Auch dieses 12,6 kDa schwere Protein wurde in allen drei Gruppen untersucht.
Nach Induktion eines Diabetes mellitus wird FKBP12.6 in Wildtypmäusen signifikant
vermindert exprimiert (FKBP12.6 [densitometrische Einheiten] ND: 3,79 ± 0,43;
DM:1,37 ± 0,34; p= 0,002 ) (Abb. 19). Bei Gα11 Knockoutmäusen konnte diese
Alteration nicht nachgewiesen werden (FKBP12.6 [densitometrische Einheiten] ND:
1,15 ± 0,2; DM:0,84 ± 0,03; p= 0,09) (Abb. 20). Gα11/Gαq Doppelknockoutmäuse
zeigten diesen Unterschied ebenfalls nicht (FKBP12.6 [densitometrische Einheiten]
ND: 0,18 ± 0,02; DM:0,19 ± 0,03; p= 0,63) (Abb. 21).
FKBP12.6 / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Wildtyp
FKBP12.6-Expression
1,2
1
0,8
0,6
*
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 10
Diabetes mellitus n = 6
12 kDa
FKBP12.6
55 kDa
Calsequestrin
DM DM DM DM
DM DM
K
K
K
K
K
K
K
K
K
K
Abbildung 19 Relative Expression des FKBP12.6 bei Wildtypmäusen 8 Wochen nach Induktion eines
Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich eine signifikante, kardiale
Expressionsreduktion des FKBP12.6 bei Wildtypmäusen im Vergleich zu nicht diabeteskranken
Kontrollen.
∗ p < 0,05 vs. Kontrolle; DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
50
Ergebnisse
FKBP12.6 / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Gα
α11 Knockout
FKBP12.6-Expression
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 7
Diabetes mellitus n = 8
12 kDa
FKBP12.6
55 kDa
Calsequestrin
K
K
K
K
K
K
K
DM
DM DM
DM
DM
DM
DM DM
Abbildung 20 Relative Expression des FKBP12.6 bei Gα11 Knockoutmäusen 8 Wochen nach Induktion
eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen FKBP12.6-Expression von Gα11 Knockoutmäusen im Vergleich mit nicht diabeteskranken
Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
FKBP12.6 / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Gα
α 11/Gα
α q Knockout
FKBP12.6-Expression
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 4
Diabetes mellitus n = 4
12 kDa
FKBP12.6
Calsequestrin
55 kDa
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
Abbildung 21 Relative Expression des FKBP12.6 bei Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen 8 Wochen nach
Induktion eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen FKBP12.6-Expression von Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen im Vergleich mit nicht
diabeteskranken Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
51
Ergebnisse
3.4.5 Expression des Annexin VII
Die schon beschriebene Lokalisation des Annexins A7 sowie die Ca2+konzentrationsabhängigen Bindung an Sorcin (16) macht eine Beteiligung des
Proteins an der CICR wahrscheinlich. Der Einfluss des Annexins A7 auf die
Zellverkürzungs-Frequenz-Beziehung, die in Kardiomyozyten einer Annexin A7defizienten Mauslinie beschrieben wurde (53), zeigt ebenfalls die Bedeutung für die
elektromechanische Kopplung. Annexin VII wird durch alternatives Spleißen bedingt
in zwei Isoformen, 47 kDa und 51 kDa, ausgeprägt. Die Untersuchungen der drei
Gruppen konnte zeigen, dass Annexin VII nach Induktion eines Diabetes mellitus in
den Herzen der Wildtypmäuse vermindert ausgeprägt vorlag (Annexin VII
[densitometrische Einheiten] ND: 1,09 ± 0,04; DM: 0,58 ± 0,06; p= 0,00 ) (Abb.22).
Diese Veränderung wurde nicht in den Herzen von Gα11 Knockoutmäusen
beobachtet (Annexin VII [densitometrische Einheiten] ND: 6,19 ± 1,77 ; DM: 5,36 ±
1,37; p= 0,71) (Abb. 23). In den Herzen der Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen
konnte Annexin VII verstärkt in der 47 kDa Isoform nachgewiesen werden (Annexin
VII [densitometrische Einheiten] ND: 0,28 ± 0,06; DM: 0,54 ± 0,03; p= 0,008) (Abb.
24), die 51 kDa Isoform hingegen zeigte keine Veränderungen (Annexin VII
[densitometrische Einheiten] ND: 0,72 ± 0,09; DM: 0,76 ± 0,05; p= 0,46) (nicht
gesondert dargestellt).
Annexin VII / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Wildtyp
AnnexinVII-Expression
47 kDa
1,2
1
0,8
***
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 10
Diabetes mellitus n = 6
50 kDa
Annexin VII
55 kDa
Calsequestrin
DM
DM DM
DM
DM
DM
K
K
K
K
K
K
K
K
K
K
Abbildung 22 Relative Expression des Annexin VII bei Wildtypmäusen 8 Wochen nach Induktion eines
Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich eine signifikante, kardiale
Expressionsreduktion des Annexin VII bei Wildtypmäusen im Vergleich zu nicht diabeteskranken
Kontrollen.
∗∗∗ p < 0,001 vs. Kontrolle; DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
52
Ergebnisse
Annexin VII / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Gα
α11 Knockout
AnnexinVII Expression, 47 kDa
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 7
Diabetes mellitus n = 8
50 kDa
Annexin VII
55 kDa
Calsequestrin
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
DM
Abbildung 23 Relative Expression des Annexin VII bei Gα11 Knockoutmäusen 8 Wochen nach
Induktion eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen Annexin VII-Expression von Gα11 Knockoutmäusen im Vergleich mit nicht diabeteskranken
Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
Annexin VII / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Gα
α11/Gα
αq Knockout
AnnexinVII-Expression, 47 kDa
**
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Kontrolle n = 4
Diabetes mellitus n = 4
50 kDa
Annexin VII
55 kDa
Calsequestrin
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
Abbildung 24 Relative Expression des Annexin VII bei Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen 8 Wochen
nach Induktion eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich eine signifikante, kardiale Expressionszunahme des AnnexinVII bei Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen im Vergleich mit nicht diabeteskranken
Kontrollen. Das Säulendiagramm zeigt die quantitative Analyse der Annexin VII-Isoform bei 47 kDa.
∗∗ p < 0,01 vs. Kontrolle; DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
53
Ergebnisse
3.4.6 Expression des Na+-Ca2+-Austauschers
Der Na+-Ca2+-Austauscher (NCX) dient der Na+-gradientenabhängigen Elimination
von Ca2+ aus der Zelle. Der NCX setzt sich im Western Blot aus drei Banden
zusammen (70 kDa, 120 kDa, 160 kDa). Die densitometrische Auswertung wurde mit
der 120 kDa-Bande vorgenommen, da diese den funktionellen, adulten NCX im
Herzen repräsentiert. Es zeigte sich eine deutliche Expressionsminderung in den
Herzen der diabeteskranken Wildtypmäuse gegenüber den Kontrollwildtypmäusen
(NCX 120 [densitometrische Einheiten] ND: 1,04 ± 0,03 ;DM: 0,81 ± 0,09; p= 0,02)
(Abb.25). Dies wurde bei den Gα11 Knockoutmäusen nicht beobachtet (NCX 120
[densitometrische Einheiten] ND: 0,68 ± 0,12 ;DM: 0,62 ± 0,12; p= 0,71) (Abb. 26).
Auch bei den Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen wurde dieser Unterschied in der
Expression nicht nachgewiesen (NCX 120 [densitometrische Einheiten] ND: 0,8 ±
0,07; DM:0,82 ± 0,09; p= 0,83) (Abb. 27).
NCX / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Wildtyp
NCX-Expression
1,2
*
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 10
Diabetes mellitus n = 6
120 kDa
NCX
55 kDa
Calsequestrin
DM DM DM DM DM DM
K
K
K
K
K
K
K
K
K
K
Abbildung 25 Relative Expression des NCX bei Wildtypmäusen 8 Wochen nach Induktion eines Diabetes
mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich eine signifikante, kardiale
Expressionsreduktion des NCX bei Wildtypmäusen im Vergleich zu nicht diabeteskranken Kontrollen.
∗ p < 0,05 vs. Kontrolle; DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
54
Ergebnisse
NCX / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Gα
α11 Knockout
NCX-Expression
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle n = 7
Diabetes mellitus n = 8
120 kDa
NCX
55 kDa
Calsequestrin
K
K
K
K
K
K
K
DM
DM
DM DM
DM
DM
DM DM
Abbildung 26 Relative Expression des NCX bei Gα11 Knockoutmäusen 8 Wochen nach Induktion eines
Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen NCX-Expression von Gα11 Knockoutmäusen im Vergleich mit nicht diabeteskranken Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
NCX / Calsequestrin
(Densitometrische Einheiten)
Gα 11/Gα q Knockout
NCX-Expression
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Kontrolle = 4
Diabetes mellitus n = 4
NCX
120 kDa
Calsequestrin
55 kDa
DM
K
DM
K
DM
K
DM
K
DM
Abbildung 27 Relative Expression des NCX bei Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen 8 Wochen nach
Induktion eines Diabetes mellitus und nicht diabeteskranken Kontrollen.
8 Wochen nach der Induktion eines Diabetes mellitus zeigte sich keine signifikante Veränderung der
kardialen NCX-Expression von Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen im Vergleich mit nicht diabeteskranken
Kontrollen.
DM = Diabetes Mellitus; K = Kontrolle
55
Ergebnisse
Wildtyp
Gα11 Knockout
Gα11/Gαq Knockout
RYR 2
⇒
⇒
⇒
Phosphorylierung des
⇒
⇒
⇒
Sorcin
⇒
⇒
⇑
FKBP 12.6
⇓
⇒
⇒
Annexin VII
⇓
⇒
⇑
NCX
⇓
⇒
⇒
RYR2 an Serin 2809
Tabelle 7 Übersicht über die vergleichende Analyse der Expression kardialer Proteine im Western
Blot-Verfahren. Dargestellt ist die signifikante, kardiale Proteinexpressionsveränderungen der
diabetischen Versuchsgruppen im Vergleich zu den Kontrollgruppen.
56
Ergebnisse
3.5 Quantitative Bestimmung des Ca²+-Verlustes an isolierten
Membranvesikeln
Die Funktion des RYR2 ist im Zusammenhang mit der Entstehung des kardialen
Phänotyps bei Diabetes Mellitus als wichtiger pathogenetischer Faktor zu deuten (68). Durch eine gestörte Funktion dieses Kanals, der für die Freisetzung des Ca2+ aus
dem SR im Kontraktionszyklus zuständig ist, kann es zu einer gestörten Ca2+Homöostase kommen und damit zu einem veränderten, pathologischen
Kontraktionsverhalten (118). Um die Funktion des RYR2 zu untersuchen wurde an
isolierten Membranvesikeln die Fähigkeit zur Ca2+-Aufnahme sowohl in An- als auch
in Abwesenheit von Ruthenium Rot, einem selektiven Hemmstoff des RYR2, durch
radioaktive Ca2+-Aufnahme-Versuche gemessen. Die Differenz der Aufnahme des
Ca2+ in die Membranvesikel bei An- und Abwesenheit des Ruthenium Rots stellt den
Ca2+-Verlust über den RYR2 dar. Dieser Verlust kann unter pathologischen
Bedingungen gesteigert sein und damit zu einer veränderten Ca2+-Homöostase und
pathologischem Kontraktionsveralten der Kardiomyozyten führen.
Die Berechnung des Ca2+-Verlustes bei den Wildtypmäusen (Abb. 28) konnte eine
signifikante Zunahme des Ca2+-Verlustes auf 300% über den RYR2 nach 8wöchigem
Diabetes mellitus nachweisen (Ca2+-Verlust [nmol/mg] ND: 15,53 ± 1,98; DM: 45,72 ±
6,7; p= 0,02). Bei den Gα11 Knockoutmäusen konnte diese Veränderung des Ca2+Verlustes nicht nachgewiesen werden (Ca2+-Verlust [nmol/mg] ND: 38,71 ± 4,83; DM:
48,44 ± 6,94; p= 0,27). Die diabeteskranken Tiere hatten äquivalente Werte zu den
Kontrolltieren (Abb. 29). Ein ähnliches Bild wurde in der Versuchsgruppe der
Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen beobachtet. Auch hier bestand kein signifikanter
Unterschied zwischen dem Ca2+-Verlust der diabeteskranken Tiere und dem Ca2+Verlust der Kontrolltiere (Ca2+-Verlust [nmol/mg] ND: 87,56 ± 24,85; DM: 77,18 ±
37,21; p= 0,82) (Abb. 30).
57
Ergebnisse
Wildtyp Kontrolle
Kontrolle
Wildtyp
0
n=4
Wildtyp DM
Wildtyp
DM
n=6
relativer Ca²+ Verlust
0,5
1
1,5
DM = Diabetes Mellitus
∗ p < 0,05 vs. Kontrolle
2
2,5
3
3,5
*
4
Gα11 KO
Kontrolle
Ga11
Kontrolle
0
n=6
Gα
DM
11 KO DM
Ga11
n=4
0,2
relativer Ca²+ Verlust
2+
Abbildung 28 Darstellung des Mittelwertes des Ca Verlustes ± SEM bei Kontrollwildtypmäusen, sowie 8
Wochen nach Induktion eines Diabetes mellitus bei
Wildtypmäusen aus isolierten Membranvesikeln des
Herzmuskelgewebes. Es kommt zu einer signifikanten
2+
Vergrößerung des Ca -Verlustes über den RYR2 nach
der Induktion des Diabetes mellitus.
0,4
0,6
2+
Abbildung 29 Darstellung des Mittelwertes des Ca Verlustes ± SEM bei Gα11 Knockoutmäusen, sowie bei
Gα11 Knockoutmäusen 8 Wochen nach Induktion eines
Diabetes mellitus aus isolierten Membranvesikeln des
Herzmuskelgewebes. Es kommt nicht zu einer
2+
Veränderung des Ca -Verlustes nach der Induktion des
Diabetes mellitus.
DM = Diabetes Mellitus
0,8
KO = Knockout
1
1,2
1,4
1,6
Gα11/GαqKontrolle
KO Kontrolle Gα
11/Gαq KO
Ga11/q
Ga11/q
DMDM
0
relativer Ca²+ Verlust
0,2
0,4
0,6
n=4
2+
Abbildung 30 Darstellung des Mittelwertes des Ca Verlustes (nmol/mg Protein) ± SEM bei Gα11/Gαq
Knockoutmäusen, sowie bei Gα11/Gαq
Knockoutmäusen 8 Wochen nach Induktion eines
Diabetes mellitus aus isolierten Membranvesikeln des
Herzmuskelgewebes. Es kommt nicht zu einer
2+
Veränderung des Ca -Verlustes nach der Induktion
des Diabetes mellitus.
DM = Diabetes Mellitus
0,8
1
1,2
1,4
58
n=4
KO = Knockout
Ergebnisse
3.6 Immunhistochemie
Bei Diabetes mellitus ist die Aktivität der PKC gesteigert (46, 70, 146). Dies ist
wahrscheinlich von wesentlicher Bedeutung für die Entstehung der Hypertrophie,
sowie für Veränderungen im Kontraktionsverhalten und der intrazellulären Ca2+Regulation des diabetischen Herzens (29). Die Aktivierung der PKC kann sowohl
Rezeptor-vermittelt durch Stimulation mit Angiotensin II, Endothelin-1, u.a. erfolgen
(29, 127), Rezeptor-unabhängig direkte Folge der Hyperglykämie sein (30, 90) oder
additiv durch beide Faktoren begünstigt werden (80). Verschiedene Stimuli
unterscheiden sich dabei durch die Aktivierung spezifischer Isoformen der PKC (29,
30, 90). Nach Aktivierung wird in Abhängigkeit der Isoform und des Stimulus eine
Translokation der Kinase aus dem Zytosol an die Plasmamembran, das Zytoskelett
oder in den Zellkern beobachtet, die dort ihre spezifische Wirkung entfaltet.
Um die verschiedenen Isoformen der PKC in ihrem Expressionsmuster, sowie ihre
intrazelluläre Verteilung im Herzen unter diabetischen Bedingungen zu untersuchen,
wurden immunhistochemische Färbungen angewandt. Außerdem wurde die
Bedeutung des G-Proteins Gα11 auf die Expression und Translokation der PKC
anhand des Gα11 Knockout-Mausmodells sowohl unter diabetischen als auch unter
Kontrollbedingungen analysiert.
3.6.1 Immunhistochemische Ergebnisse zum Einfluss eines Typ1-Diabetes auf
die kardiale Expression und Translokation von PKC-Isoformen bei
Wildtypmäusen
Die Expression der PKC α war im Herzen von Wildtypmäusen gleichmäßig über das
Myokard verteilt. Durch die Induktion eines Diabetes mellitus wurde die Expression
der PKC α in den Kardiomyozyten signifikant gesteigert (PKC α [densitometrische
Einheiten] ND: 16,14 ± 3,33; DM: 29,12 ± 1,62; p= 0,006). Die intrazelluläre
Verteilung hingegen war nicht wesentlich verändert.
Die Expression der PKC βII war im Herzen deutlich messbar, ohne jedoch durch
einen Diabetes mellitus beeinflusst zu werden (PKC βII [densitometrische Einheiten]
ND: 8,65 ± 0,76; DM: 9,67 ± 2,46; p= 0,7). Die PKC δ zeigte tendenziell eine stärkere
Ausprägung unter diabetischen Bedingungen in den Herzen von Wildtypmäusen,
doch war dieser Unterschied nicht signifikant (PKC δ [densitometrische Einheiten]
ND: 25,3 ± 1,6; DM: 31,18 ± 5,32; p= 0,31). Die PKC ε wurde im Herzen stark
exprimiert. Einen Einfluss des Diabetes mellitus auf die Ausprägung konnte man
59
Ergebnisse
nicht erkennen (PKC ε [densitometrische Einheiten] ND: 24,36 ± 2,19; DM: 18,2 ±
2,5; p= 0,1). Allerdings ist anzumerken, dass sich die intrazelluläre Verteilung
deutlich verschoben hatte, so dass von einer Translokation ausgegangen werden
muss, die abhängig vom Diabetes mellitus zu sein scheint. Die Lokalisation der PKC
ε zeigte am immunhistochemischen Präparat nach Induktion eines Diabetes mellitus
eine stärkere Membranbindung (Abb. 31). Die PKC θ zeigte eine nur mäßige
Ausprägung im Herzen. Die Expression war offensichtlich unabhängig von der
Induktion eines Diabetes (PKC θ [densitometrische Einheiten] ND: 9,44 ± 0,42; DM:
8,53 ± 1,67; p= 0,61). Die PKC ζ zeigte in den Herzen von Wildtypmäusen nur eine
geringe Expression, die unter diabetischen Bedingungen deutlich und signifikant
zunahm (PKC ζ [densitometrische Einheiten] ND: 32,16 ± 4,65; DM: 48,8 ± 3,98; p=
0,02). Auch bei dieser Isoform der PKC zeigte sich das schon bei der PKC ε
beschriebene Phänomen der Translokation. Die PKC kann u.a. durch
Phosphorylierung aktiviert werden. Die Phosphorylierung der PKC ζ und λ war unter
Kontrollbedingungen kaum zu beobachten. Ein experimenteller Diabetes mellitus
führte zu einer starken Phosphorylierung dieser Isoformen im Herzen (Phospho-PKC
ζ/λ [densitometrische Einheiten] ND: 14,5 ± 1,95; DM: 29,23 ± 3,84; p= 0,006). Die
Isoform ζ zeigte somit nach Induktion eines Diabetes mellitus sowohl eine vermehrte
Expression, als auch eine vermehrte Phosphorylierung. Um zu analysieren, ob die
Phosphorylierung unabhängig von der Expressionszunahme vermehrt auftrat,
wurden die jeweiligen Ergebnisse im Verhältnis zueinander betrachtet. Es zeigte
sich, dass die Zunahme der Phosphorylierung mit der Expressionszunahme in
gleichem Maße einherging. Das Verhältnis der phosphorylierten PKC ζ−Form zur
nicht-phosphorylierten PKC ζ-Form blieb also konstant (PKC ζ/Phospho-PKC ζ/λ
[densitometrische Einheiten] ND: 2,44 ± 0,52; DM: 1,73 ± 0,11; p= 0,18) es kam also
zu keiner zusätzlichen Aktivierung dieser Isoform durch die Induktion des Typ1Diabetes. Die Phosphorylierung der Isoformen δ und θ war sowohl bei Kontrolltieren
als auch diabetischen Tieren nur in geringem Ausmaß zu beobachten (Phospho-PKC
δ/θ [densitometrische Einheiten] ND: 14,90 ± 1,42; DM: 13,56 ± 2,14; p= 0,61) (Abb.
32).
60
Ergebnisse
Densitometrische Einheiten
60
*
50
40
**
30
20
10
0
PKC
PKCαa
Kontrolle
Kontrolle
n=6
PKCaαDM
PKC
DM
n=6
PKC α
PKC b
βΙΙII
PKC
Kontrolle
Kontrolle
n=6
PKC
PKC
b IIβΙΙDM
PKC βΙΙ
DM
n=6
PKCeε
PKC
Kontrolle
Kontrolle
n=6
PKC
ε
PKC
e DM
DM
n=6
PKC ε
PKC
PKCζz
Kontrolle
Kontrolle
n=6
PKCz ζDM
PKC
DM
n=6
PKC ζ
Kontrolle
DM
Abbildung 31 Immunhistochemische Färbungen der PKC Isoformen im Herzen bei Wildtypmäusen unter
Kontrollbedingungen, sowie nach Induktion eines Typ 1-Diabetes. Die Intensität der Färbung spiegelt die
Stärke der Expression wider. 400-fache Vergrößerung.
Die PKC Isoform α und ζ zeigten eine signifikante, kardiale Expressionzunahme nach 8 Wochen DM im
Vergleich zu der Kontrollgruppe. Die PKC Isoformen βII und ε hingegen zeigten keine veränderte
Expression.
∗ p < 0,05 vs. Kontrolle; ∗∗ p < 0,01 vs. Kontrolle; DM = Diabetes mellitus
61
Ergebnisse
Densitometrische Einheiten
40
35
**
30
25
20
15
10
5
0
Phospho-ζ/λ Phospho-PKC
Phospho- ζ/λ Phospho-PKC
Phospho- δ/θ Phospho-PKC
Phospho- δ/θ PKC
Phospho-PKC
PKCdδ
PKC-z/l
PKC-z/l
PKC-d/q
PKC-d/q
Kontrolle
Kontrolle
DM DM
Kontrolle
DM DM
n=6
Kontrolle
n=6
PhosphoPKC-ζ/λ
n=6
Kontrolle
n=6
PhosphoPKC-δ/θ
n=6
PKC
d DM
PKC
δ
DM
n=6
PKC δ
PKC
PKCqθ
Kontrolle
Kontrolle
n=6
PKC
q DM
PKC
θ
DM
n=6
PKC θ
Kontrolle
DM
Abbildung 32 Immunhistochemische Färbungen der PKC Isoformen im Herzen bei Wildtypmäusen unter
Kontrollbedingungen, sowie nach Induktion eines Typ 1-Diabetes. Die Intensität der Färbung spiegelt die
Stärke der Expression bzw. der Phosphorylierung wider. 400-fache Vergrößerung.
Die Phosphorylierung der PKC Isoformen ζ/λ zeigten eine starke kardiale Zunahme nach 8 Wochen DM
im Vergleich mit der Kontrollgruppe. Die Phosphorylierung der Isoformen δ/θ veränderte sicht nicht.
Ebenso veränderte sich die Expression der PKC Isoformen δ und θ nach 8 Wochen DM nicht.
∗∗ p < 0,01 vs. Kontrolle; DM = Diabetes mellitus
62
Ergebnisse
3.6.2 Immunhistochemische Ergebnisse zum Einfluss eines Typ1-Diabetes auf
die kardiale Expression und Translokation von PKC-Isoformen bei Gα
α11
Knockoutmäusen
Im Gegensatz zu Herzmuskelgeweben von Wildtypmäusen wurde die PKC α in
Herzen von Gα11 Knockoutmäusen nur sehr schwach exprimiert. Auch nach
Induktion eines Diabetes mellitus änderte sich dies nicht (PKC α [densitometrische
Einheiten] ND: 6,99 ± 1,14; DM: 8,16 ± 1,13; p= 0,48). Dies deutet auf eine Gα11abhängige Stimulation der PKC α hin. Die PKC βII zeigte im Herzen der Gα11
Knockoutmäuse das gleiche Verhalten wie die PKC α (PKC βII [densitometrische
Einheiten] ND: 7,09 ± 1,17; DM: 7,38 ± 0,68; p= 0,83). PKC βII ist sowohl in Wildtyp
als auch in Knockout-Herzen gering exprimiert und scheint demnach durch das
Knockout nicht beeinflusst zu werden. Im Vergleich zu Herzmuskelgewebe von
Mäusen des Wildtyps wurde die PKC δ in Knockoutmäusen deutlich schwächer
exprimiert. Nach Induktion eines Diabetes kam es hier zu einer signifikanten
Zunahme der PKC δ−Dichte, die jedoch selbst unter diesen Bedingungen nur das
Expressionsniveau der Wildtypmäuse erreichte. Dieses Ergebnis deutet daraufhin,
dass die basale Expression der PKC δ Gα11-abhängig reguliert wird. Die Zunahme
der PKC δ−Dichte bei Typ-1 Diabetes scheint jedoch unabhängig von der
Signalkaskade über Gα11 zu erfolgen. Die PKC ε wurde in den Herzen der Gα11
Knockoutmäuse stark ausgebildet. Eine Tendenz der vermehrten Expression durch
den Diabetes mellitus ließ sich erkennen, allerdings war dieser Unterschied nicht
signifikant (PKC ε [densitometrische Einheiten] ND: 21,5 ± 1,84; DM: 28,87 ± 3,18;
p= 0,06). Zu erwähnen ist auch bei den Gα11 Knockoutmäusen eine Translokation
der PKC ε an die Plasmamembran, wie sie auch im Herzen von Wildtypmäusen zu
beobachten war. Die PKC θ zeigte genauso wie bei den Wildtypmäusen nur ein
niedriges Expressionsniveau, das auch nicht durch den Diabetes mellitus beeinflusst
wurde (PKC θ [densitometrische Einheiten] ND: 10,29 ± 1,25; DM: 8,95 ± 1,07; p=
0,43). Die PKC ζ wurde in ihrem hohen Expressionsniveau nicht durch einen
Diabetes mellitus beeinflusst (PKC ζ [densitometrische Einheiten] ND: 27,04 ± 2,25;
DM: 21,38 ± 1,31; p= 0,055). Allerdings wiesen die diabeteskranken Knockouttiere im
Gegensatz zu der erhöhten Expression bei diabeteskranken Mäusen des Wildtyps
sogar die Tendenz zu einer schwächeren PKC ζ Ausbildung auf. Die
Phosphorylierung der PKC ζ und λ bzw. der PKC δ und θ war bei den Gα11
63
Ergebnisse
Knockoutmäuse lediglich auf einem niedrigen Niveau nachzuweisen, ohne eine
Änderung bei Diabetes mellitus erkennen zu lassen (Phospho-PKC ζ/λ
[densitometrische Einheiten] ND: 12,60 ± 1,09; DM: 14,60 ± 1,6; p= 0,32) (PhosphoPKC δ/θ [densitometrische Einheiten] ND: 9,15 ± 0,80; DM: 9,84 ± 1,93; p= 0,73).
Augenfällig ist hierbei, dass es zu einer Expressionszunahme der PKC δ bei
Diabetes mellitus kam, ohne dass jedoch eine vermehrte Phosphorylierung der PKC
δ auftrat. Also nahm die Gesamtmenge des Proteins zu, der relative Anteil der
phosphorylierten, und damit wahrscheinlich aktivierten Form des Proteins, nahm
hingegen ab (Abb. 33 und Abb. 34).
64
Ergebnisse
Densitometrische Einheiten
35
30
25
20
15
10
5
0
PKC
PKCαa
Kontrolle
Kontrolle
n=6
PKCaαDM
PKC
DM
n=6
PKC α
PKC βΙΙ
PKC
b II
Kontrolle
Kontrolle
n=6
PKCb βΙΙ
PKC
II DM
DM
n=6
PKC βΙΙ
PKC
PKCε e
Kontrolle
Kontrolle
n=6
PKC
ε
PKC
e DM
DM
n=6
PKC ε
PKC z
ζ
PKC
Kontrolle
Kontrolle
PKC
ζ
PKC
z DM
n=6
DM
n=6
PKC ζ
Kontrolle
DM
Abbildung 33 Immunhistochemische Färbungen der PKC Isoformen im Herzen bei Gα11 Knockoutmäusen unter Kontrollbedingungen, sowie 8 Wochen nach Induktion eines Typ 1-Diabetes. Die Intensität
der Färbung spiegelt die Stärke der Expression wider. 400-fache Vergrößerung.
Bei Gα11 Knockoutmäusen konnte keine Änderung der Expression der PKC Isoformen α, βII, ε und ζ nach
8 Wochen Diabetes mellitus beobachtet werden.
DM = Diabetes mellitus
65
Ergebnisse
**
Densitometrische Einheiten
30
25
20
15
10
5
0
Phospho-PKC
ζ/λ Phospho-PKC
PKC δd
PhosphoPhospho-ζ/λ Phospho-PKC
Phospho- δ/θ Phospho-PKC
Phospho- δ/θ PKC
Kontrolle
DM DM
Kontrolle
DM DM Kontrolle
PKC-z/l
PKC-z/l
PKC-d/q PKC-d/q
Kontrolle
n=6
Kontrolle
n=6
PhosphoPKC-ζ/λ
n=6
Kontrolle
n=6
PhosphoPKC-δ/θ
n=6
PKCd δDM
PKC
DM
n=6
PKC δ
PKC θq
PKC
Kontrolle
Kontrolle
n=6
PKC
PKC
q θDM
DM
n=6
PKC θ
Kontrolle
DM
Abbildung 34 Immunhistochemische Färbungen der PKC Isoformen im Herzen bei Gα11 Knockoutmäusen
unter Kontrollbedingungen, sowie 8 Wochen nach Induktion eines Typ 1-Diabetes. Die Intensität der
Färbung spiegelt die Stärke der Expression bzw. der Phosphorylierung wider. 400-fache Vergrößerung.
Bei den Gα11 Knockoutmäusen nahm die Expression der PKC Isoform δ nach 8 Wochen DM signifikant zu.
Die PKC Isoform θ zeigte keine signifikante Veränderung. Die Phosphorylierung der PKC Isoformen ζ/λ und
δ/θ zeigte nach der Diabetesinduktion keine Veränderungen.
∗∗ p < 0,01 vs. Kontrolle; DM = Diabetes mellitus
66
Ergebnisse
Vergleicht man die beiden Versuchsgruppen miteinander, so fällt auf, dass die
veränderte und jeweils verstärkte Expression der PKC α und ζ sowie die erhöhte
Phosphorylierung der Isoformen ζ/λ bei den Wildtypmäusen nach Induktion eines
Typ1-Diabetes bei den Gα11 Knockoutmäusen unter den selben experimentellen
Bedingungen nicht hervortreten. Dies deutet darauf hin, dass bei den Wildtypmäusen
diese Veränderungen in Abhängigkeit vom G-Protein Gα11 entstehen und
dementsprechend bei den Knockoutmäusen nicht auftreten können.
Der direkte Vergleich der Gewebeschnitte von Mäusen des Wildtyps und von Gα11
Knockoutmäusen unter Kontrollbedingungen zeigte eine verminderte Dichte der PKC
α (PKC α [densitometrische Einheiten] WT: 16,14 ± 3,33; KO: 6,98 ± 1,14; p= 0,04)
und δ (PKC δ [densitometrische Einheiten] WT: 31,18 ± 5,32; KO: 17,02 ± 1,22; p=
0,03) in den Knockouttieren. Dabei war die PKC δ bei Gα11 Knockoutmäusen sowohl
in Bezug auf die Expression des Proteins insgesamt, als auch in ihrer
phosphorylierten Form in Herzmuskelgewebe vermindert (Phospho-PKC δ/θ
[densitometrische Einheiten] WT: 14,91 ± 1,42; KO: 9,15 ± 0,8; p= 0,005). Nach
Induktion eines Typ1-Diabetes wird die Proteinexpression auf das Niveau von
Kontrolltieren des Wildtyps angehoben. Die absolute Menge an phosphorylierter PKC
δ bleibt durch die Hyperglykämie bei Gα11 Knockoutmäusen jedoch unbeeinflusst. Es
ist somit zu vermuten, dass in Abwesenheit von Gα11 auch bei vermehrter
Expression von PKC δ nach Induktion eines Typ1-Diabetes eine Phosphorylierung
und damit Aktivierung dieses second messengers ausbleibt (Abb. 35 und Abb. 36).
67
Ergebnisse
Densitometrische Einheiten
40
35
30
25
20
15
*
10
5
0
PKC
PKCαaWildtyp
Wildtyp
n=6
PKC
PKCαaKO
KO
n=6
PKC α
PKCbβΙΙ
PKCb βΙΙ
PKC
ε Wildtyp
PKCeεKO
KO PKC
Wildtyp
PKC
II WWildtyp
ildtyp PKC
II KOKO PKC
eW
ildtyp PKC
PKCzζW
ildtyp
n=6
n=6
PKC βΙΙ
n=6
n=6
PKC ε
n=6
PKCz KO
ζ KO
PKC
n=6
PKC ζ
Wildtyp
Knockout
Abbildung 35 Immunhistochemische Färbungen der PKC Isoformen im Herzen unter Kontrollbedingungen
bei Wildtypmäusen und Gα11 Knockoutmäusen. Die Intensität der Färbung spiegelt die Stärke der
Expression wider. 400-fache Vergrößerung.
Die PKC Isoform α zeigte eine signifikante, kardiale Expressionsreduktion bei Gα11 Knockoutmäusen im
Vergleich zu Wildtypmäusen. Die PKC Isoformen βII, ε und ζ waren nicht signifikant verändert bei Gα11
Knockoutmäusen im Vergleich zu Wildtypmäusen.
∗ p < 0,05 vs. Kontrolle; KO = Knockout
68
Densitometrische Einheiten
Ergebnisse
40
35
30
25
**
20
*
15
10
5
0
Phospho-
Phospho-
Phospho-
Phospho-
PKC d
PKC
d KO
PKC δ
n=6
Wildtyp
nKO
=6
n=6
Wildtyp
nKO
=6
n=6
KO
n=6
Phospho-PKC ζ/λ Phospho-PKC ζ/λ Phospho-PKC δ/θ Phospho-PKC δ/θ PKC δ
PKC-z/l
PKC-z/l
PKC-d/q
PKC-d/q
Wildtyp
Wildtyp
KO
Wildtyp
KO
Wildtyp
PhosphoPKC-ζ/λ
PhosphoPKC-δ/θ
PKC δ
PKC
q
PKC θ
Wildtyp
Wildtyp
PKC
q KO
PKC θ
n=6
KO
n=6
PKC θ
Wildtyp
Knockout
Abbildung 36 Immunhistochemische Färbungen der PKC Isoformen im Herzen unter Kontrollbedingungen
bei Wildtypmäusen und Gα11 Knockoutmäusen. Die Intensität der Färbung spiegelt die Stärke der
Expression bzw. der Phosphorylierung wider. 400-fache Vergrößerung.
PKC δ war sowohl in Bezug auf die Expression des Proteins insgesamt als auch in ihrer phosphorylierten
Form in Herzen von Gα11 Knockoutmäusen signifikant vermindert.
Bei den Gα11 Knockoutmäusen war die Phosphorylierung der PKC Isoformen ζ/λ und die Expression der
PKC Isoform θ gegenüber den Wildtypmäusen hingegen unverändert.
∗ p < 0,05 vs. Kontrolle; ∗∗ p < 0,01 vs. Kontrolle; KO = Knockout
69
Ergebnisse
DM Wildtyp
DM Gα11 Knockout
PKC α
⇑
⇒
PKC βΙΙ
⇒
⇒
PKC δ
⇒
⇑
PKC ε
⇒
⇒
PKC θ
⇒
⇒
PKC ζ
⇑
⇒
Phospho-PKC-ζ/λ
⇑
⇒
Phospho-PKC-δ/θ
⇒
⇒
Tabelle 8 Signifikante Expressionsveränderung der PKC Isoformen im Myokard von Wildtypmäusen
und von Gα11 Knockoutmäusen im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollgruppen.
Gα11 Knockout
PKC α
⇓
PKC βΙΙ
⇒
PKC δ
⇓
PKC ε
⇒
PKC θ
⇒
PKC ζ
⇒
Phospho-PKC-ζ/λ
⇒
Phospho-PKC-δ/θ
⇓
Tabelle 9 Signifikante Expressionsveränderung der PKC Isoformen im Myokard von Gα11
Knockoutmäusen im Vergleich zu Mäusen des Wildtyps jeweils unter Kontrollbedingungen.
70
Diskussion
4 Diskussion
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Bedeutung der G-Proteine Gα11 und Gαq für
die Entwicklung der myokardialen Hypertrophie unter den speziellen Bedingungen
des Typ1-Diabetes zu untersuchen. Hierzu wurden funktionelle und biochemische
Untersuchungen an kardialem Gewebe von Wildtypmäusen, Gα11 Knockoutmäusen
und Gα11/Gαq Doppelknockoutmäusen durchgeführt.
4.1 Das G-Protein Gα
α11 ist wesentlich an der Entwicklung einer
Hypertrophie des Herzens bei Typ1-Diabetes beteiligt
Die Hypertrophie und diastolische Dysfunktion des Herzmuskels gehören zu den
kardialen Manifestationsformen, die frühzeitig bei Diabetes mellitus zu beobachten
sind. In der vorliegenden Arbeit konnte durch intraperitoneale Injektion von
Streptozotocin in Mäusen eine stabile Hyperglykämie erzeugt werden, die über den
Verlauf von 8 Wochen zur Entwicklung einer ausgeprägten myokardialen
Hypertrophie führte. Dies konnte sowohl in vivo mittels echokardiographischer
Bestimmung der Septumdicke, der Wanddicken und der linksventrikulären Diameter
als auch durch direkte Messung des Herzgewichtes nachgewiesen werden. Zeichen
der Herzinsuffizienz, wie sie unter ähnlichen experimentellen Bedingungen am
Modell der Ratte beschrieben wurden, konnten in der aktuellen Untersuchung nicht
nachgewiesen werden. Dies könnte auf die verschiedenen Spezies oder die
unterschiedliche Dosierung und Applikation des Streptozotocin zurückzuführen sein.
Der Pathomechanismus, der der Entstehung einer Myokardhypertrophie bei Diabetes
mellitus zugrunde liegt, ist noch nicht bekannt. Zahlreiche Untersuchungen belegen,
dass bereits die alleinige Hyperglykämie durch Stimulation des Polyol-Pathways, der
PKC als auch der Bildung von AGEs eine zentrale Rolle bei der Entwicklung
diabetesbedingter Folgekrankheiten am Herzen spielt (9, 90, 139). Auch der direkte
Einfluss einer Hyperglykämie auf die kardiovaskuläre Genexpression konnte gezeigt
werden (123). Demgegenüber spricht ein hohes Maß an Evidenz für die Bedeutung
neurohumoraler Mechanismen, wie z.B. einer vermehrten Stimulation und
Expression des AT1-Rezeptors, bei der Entstehung der Hypertrophie am
diabetischen Herzen (105) oder erhöhter Endothelin-1-Serumspiegel bei Patienten
71
Diskussion
mit Diabetes mellitus (86). Angiotensin- und Endothelin-Rezeptoren gehören zur
Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die ihr intrazelluläres Signal über die
G-Proteine Gα11 und Gαq vermitteln. Die vorliegenden Ergebnisse unterstreichen die
Bedeutung der neurohumoralen Aktivierung für die Hypertrophieentwicklung in der
frühen Phase eines Typ1-Diabetes, da unter identischen experimentellen
Bedingungen für das Gα11 Knockout Mausmodell im Gegensatz zum Wildtyp kein
kardialer Phänotyp nachgewiesen werden konnte.
Gα11 wird in allen Organsystemen zusammen mit Gαq co-exprimiert und reguliert wie
Gαq die funktionelle Kopplung G-Protein-gekoppelter Rezeptoren mit der
Phospholipase C. Da die gezielte Deletion von Gα11 im Genom der Maus keinen
Phänotyp zeigte, wurde vermutet, dass in Anbetracht ihrer sehr ähnlichen
Rezeptoren- und Effektoren-Spezifität Gαq die gestörte Signaltransduktion über Gα11
vollständig kompensieren kann (11, 52, 92, 143). Die vorliegenden Ergebnisse
zeigen eindrucksvoll, dass eine entsprechende Kompensation unter den pathophysiologischen Bedingungen eines Typ1-Diabetes jedoch nicht stattfindet. Die
alleinige Deletion von Gα11 zeigt sowohl im Phänotyp, in der Aktivierung spezifischer
PKC-Isoformen, als auch in der Proteinexpression eindeutige Unterschiede im
Vergleich zu Kontrolltieren des Wildtyps, die zumindest in Bezug auf den Phänotyp
kardioprotektiv sind. Mäuse mit kombiniertem Knockout von Gα11 und Gαq hingegen
zeigten in der vorliegenden Arbeit 8 Wochen nach Induktion eines Diabetes einen
Anstieg von Herz- und Lungengewicht als Hinweis auf die Entwicklung einer
kongestiven Herzinsuffizienz. Dies deutet darauf hin, dass zumindest eine partielle
Aktivität der G-Proteine Gα11 und Gαq von Bedeutung für den Erhalt der
Pumpfunktion des Herzens in der frühen Phase des Diabetes mellitus ist.
Interessanterweise zeigte eine frühere Arbeit am selben Mausmodell, dass die
kombinierte Deletion von Gα11 und Gαq nach operativer Aortenkonstriktion über den
Beobachtungszeitraum von zwei Wochen der Entwicklung einer Hypertrophie
entgegenwirken und im Gegensatz zu Kontrolltieren des Wildtyps den kardialen
Phänotyp weitgehend erhalten konnte eine alleinige Deletion von Gα11 dazu aber
nicht ausreichte (141).
72
Diskussion
4.2 Die Signalkaskade der pathophysiologischen Veränderungen
bei Typ1-Diabetes weisen Hinweise auf eine Beteiligung der
Proteinkinas C auf
Die G-Proteine Gα11 und Gαq vermitteln intrazellulär diverse Signalkaskaden über die
eine Beeinflussung der Genexpression möglich erscheint. Zu den relevanten
Mechanismen, durch die die G-Proteine Gα11 und Gαq zur Induktion von
Hypertrophie und Fibrose führen können (51, 126) zählen die Aktivierung der PKC,
der MAPKs, des Calcineurin und der CaM-Kinase. Die Auswirkungen eines Diabetes
mellitus auf intrazelluläre Signalkaskaden sind Gegenstand der aktuellen Forschung
und noch nicht vollständig aufgeklärt. In zahlreichen Arbeiten konnte die PKC als
bedeutungsvoller second messenger im Zusammenhang mit der Entstehung
kardialer Folgekrankheiten bei Diabetes mellitus dokumentiert werden (46, 70, 146)
und es konnte interessanterweise auch ein kardioprotektiver Effekt bei Diabetes
mellitus durch eine unspezifische Blockade der PKC erreicht werden (148). In der
vorliegenden Arbeit war das Expressionsmuster der PKC und ihrer Isoformen in
Abhängigkeit eines Typ1-Diabetes und des G-Proteins Gα11 Gegenstand der
Analyse. Bei Mäusen des Wildtyps wurde nach Induktion eines Diabetes mellitus
über 8 Wochen eine Expressionszunahme der PKC Isoformen α und ζ beobachtet.
Die Zunahme der Phosphorylierung der PKC ζ/λ erfolgte in der gleichen Relation wie
die Expressionszunahme, sodass von keiner zusätzlichen Aktivierung dieser Isoform
ausgegangen werden kann. Die spezifischen Funktionen der einzelnen Isoformen
der PKC sind noch Gegenstand aktueller Forschung, dabei werden die Isoformen α
und ζ mit einer Stimulation der Wachstumsfaktoren für Bindegewebe und einem
damit verbundenen Remodelling und schließlich einer Fibrose assoziiert (50). Für die
PKC α ist ebenso eine pathologische Bedeutung bei Diabetes mellitus auf das
Gefäßsystem durch Erhöhung der endothelialen Permeabilität nachgewiesen (46,
67). Auch eine PKC α−vermittelte Reaktion der Kardiomyozyten auf die
Hyperglykämie wurde beschrieben (41) die genaue zelluläre Funktion ist jedoch noch
nicht endgültig geklärt.
Die übrigen in dieser Arbeit untersuchten Isoformen βII, δ, ε und θ sowie die
Phosphorylierung und damit Aktivierung der Isoformen δ/θ zeigten keine
Veränderung durch die Induktion eines Typ 1-Diabetes. Assoziiert man den kardialen
73
Diskussion
Phänotyp der Wildtypmäuse mit der Veränderung der Signalkaskade der G-Proteine
Gα11 und Gαq, so scheint ein Zusammenhang zwischen einer gesteigerten
Expression der PKC α und der PKC ζ und einem Remodelling, das zur Hypertrophie
führt, möglich. Die vorliegenden Daten stehen im Einklang mit Ergebnissen
verschiedener Publikationen, die eine Steigerung der Expression der PKC α (67),
sowie eine unveränderte Expression der Isoformen βII und δ (61, 67) am
diabeteskranken Herzen zeigen konnten. Neben diesen liegen allerdings auch
divergente Berichte vor, wie eine verminderte Expression der PKC ε und PKC βII
(113) am Herzen bei Typ1-Diabetes. Sicherlich müssen unterschiedliche Faktoren
wie u.a. die untersuchte Spezies in diesem Zusammenhang berücksichtigt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde neben der Analyse der PKC Isoformen des Wildtyps
das Expressionsmuster auch bei Gα11-Deletion untersucht. Hierbei kam es nicht zu
einer Zunahme der Expression der PKC Isoformen α und ζ nach Induktion eines
Typ1-Diabetes. Die Regulation dieser Isoformen der PKC ist also unter diabetischen
Bedingungen beim Wildtyp abhängig vom G-Protein Gα11. Lediglich die PKC δ zeigte
nach Induktion des Typ1-Diabetes eine Expressionszunahme bei Gα11-Deletion, die
jedoch dem Expressionsniveau des Wildtyps entsprach. Damit liegt also bei Gα11Deletion eine verminderte Expression der PKC δ vor, die durch den Typ1-Diabetes
auf das Kontrollniveau zurückgeführt wurde. Die PKC δ kann also eine
Expressionszunahme bei Hyperglykämie trotz Deletion des Gα11 erfahren, die im
Wildtyp nicht zu beobachten war. In diesem Zusammenhang ist wichtig zu erwähnen,
dass ein Anstieg der phosphorylierten Form der PKC δ/θ bei Gα11-Deletion ausblieb.
Dies bedeutet, dass der relative Anteil der phosphoryliert vorliegenden und damit
aktivierten Form der PKC δ abnahm. Die Funktion der PKC δ schließt den Einfluss
auf Dihydropiridinkanäle ein und hat damit vielleicht auch Auswirkung auf die Ca2+Homöostase (41). Es wird von der Zunahme des Ca2+-Einstroms über
Dihydropiridinkanäle ausgegangen (120) was eine Zunahme der Ca2+-Beladung der
Zelle zur Folge haben kann. Ebenso ist eine Assoziation der PKC δ mit einer
kardialen Hypertrophie gezeigt worden (122). Dies könnte einen Erklärungsansatz für
Beobachtungen in der vorliegenden Arbeit darstellen. Somit besteht die Möglichkeit,
dass der kardiale Phänotyp nach Induktion eines Typ1-Diabetes bei Gα11-Deletion,
der im Gegensatz zum Phänotyp beim Wildtyp keine Hypertrophie aufwies, im
74
Diskussion
Zusammenhang mit dem Vorliegen einer geringeren phosphorylierten bzw.
aktivierten PKC δ steht.
Das hier unterschiedliche Expressionsmuster der beiden Versuchsgruppen könnte
eine Erklärung für den unterschiedlichen Phänotyp nach Induktion eines Typ1Diabetes darstellen: Die bekannte Wachstumsstimulierende und Fibrosestimulierende Wirkung der PKC (51) könnte durch die verminderte Expression bei
den Gα11 Knockoutmäusen eingeschränkt sein und dies würde konsekutiv nicht zu
einer Hypertrophie des Herzens führen.
Vergleicht man die kardialen Expressionsmuster der PKC-Isoformen bei nicht
diabeteskranken Mäusen des Wildtyps und nicht diabeteskranken Gα11
Knockoutmäusen, kann für die untersuchten Isoformen die Bedeutung für die
Expression und Phosphorylierung und damit Aktivierung des G-Proteins Gα11 unter
Basalbedingungen beurteilt werden. Die Gα11 Knockoutmäuse zeigten eine
verminderte Expression der Isoformen α und δ, sowie eine Verminderung der
Phosphorylierung der Isoformen δ/θ. Dies weist auf eine Abhängigkeit der Regulation
der genannten Isoformen der PKC unter Basalbedingungen vom G-Protein Gα11 hin.
Bedeutsam ist der Nachweis einer kongruenten Verminderung sowohl der
Expression als auch der Phosphorylierung der PKC δ. Hier kann sich also schon
unter Kontrollbedingungen ein niederes Expressionsniveau dieser Wachstums- und
Fibrosefördernden Isoformen α und δ bei Gα11-Deletion abzeichnen, dass nach
Induktion des Typ1-Diabetes sich nicht verändert (PKC α) oder sich allenfalls auf das
Kontrollniveau des Wildtyps angleicht ohne eine weitere Phosphorylierung bzw.
Aktivierung aufzuzeigen (PKC δ). Die kardioprotektive Wirkung einer Gα11-Deletion
bei Typ1-Diabetes, die sich in einem unveränderten kardialen Phänotyp im
Gegensatz zur Hypertrophie des Herzens beim Wildtyp äußert, könnte teilweise auf
diese Beobachtungen zurückzuführen sein.
In der vorliegenden Arbeit ließen sich für zwei Isoformen der PKC Veränderungen in
der intrazellulären bzw. interzellulären Verteilung nachweisen. Die PKC ε zeigte nach
Induktion des Diabetes sowohl bei den Wildtypmäusen, als auch bei Gα11
Knockouttieren eine intrazellulären Translokation. Durch Analyse der
immunhistochemischen Ergebnisse erschien eine Translokation an die interzellulären
Kontaktzonen der Zellen als wahrscheinlich als Hinweis auf eine Rolle der PKC ε in
der interzellulären Signalvermittlung. Die Bedeutung der PKC ε wird bis jetzt in einer
75
Diskussion
Kardioprotektion gesehen, die über verschiedene Signalkaskaden wie u.a. der
Aktivierung von anti-Apoptose Transkriptionsfaktoren wie NF-κB vermittelt werden
soll (2). Allerdings ist ebenfalls eine exzessive Phosphorylierung des Connexin-43,
einem Molekül der interzellulären Kontaktzonen der Kardiomyozyten, beschrieben
worden, die bei Diabetes mellitus durch die PKC vermittelt werden soll und zu
Dysfunktionen der interzellulären Kommunikation führen könnte (59). Die spezielle
Rolle der PKC ε konnte in diesem Zusammenhang ebenfalls nachgewiesen werden
(28) und zeigt die Bedeutung der Ergebnisse in der vorliegenden Arbeit. Dieser
Mechanismus der pathophysiologisch zur Manifestation des Diabetes mellitus am
Herzen beitragen soll (59) tritt sowohl im Wildtyp, als auch nach Gα11-Deletion auf.
Der kardiale Phänotyp der Gα11 Knockouttiere bei Typ1-Diabetes ist also unabhängig
vom vorliegen dieses Mechanismus, welcher möglicherweise über andere
Signaltransduktionen kompensiert wird.
Auch für die PKC ζ konnten Veränderungen der intrazellulären Verteilung im Wildtyp
nach Induktion eines Typ1-Diabetes nachgewiesen werden. Die PKC ζ konnte
vermehrt perinukleär nachgewiesen werden und macht eine Einflussnahme dieser
Isoform auf die Genexpression der Zelle möglich. Die Gα11-Deletion verhinderte die
Ausprägung dieses Bildes. Dieser Mechanismus scheint also über das G-Protein
Gα11 vermittelt zu werden und muss in seiner Bedeutung noch weiter untersucht
werden.
Die in der vorliegenden Arbeit beobachteten Veränderung in der Expression,
Phosphorylierung und Translokation der PKC bei Typ1-Diabetes machen die
Bedeutung dieser Enzymfamilie als wesentlichen Signalweg für die Entstehung der
Hypertrophie als frühe kardiale Manifestationsform bei Typ1-Diabetes deutlich und
zeigen die zentrale Bedeutung des G-Proteins Gα11 für die Aktivierung der PKC und
konsekutiv die Induktion der Hypertrophie. Das komplexe Zusammenspiel auch mit
anderen Signalkaskaden der G-Proteine Gα11 und Gαq z.B. über MAPKs, Calcineurin
und die CAMkinase, ist in diesem Zusammenhang zu berücksichtigen. Dies war
jedoch nicht Gegenstand der vorliegenden Arbeit.
76
Diskussion
4.3 Die Struktur und die Funktion des Proteinkomplexes der Ca2+Freisetzung zeigt eine Beeinflussung durch einen Typ1Diabetes und die G-Proteine Gα
α11 und Gα
αq
Die Manifestationsform des Diabetes mellitus am Herzen zeigt sich früh als
Hypertrophie, die im Verlauf der Erkrankung in eine Herzinsuffizienz übergehen
kann. Die gestörte Kontraktilität bei Herzinsuffizienz kann erwiesenermaßen auf eine
gestörte intrazelluläre Ca2+-Homöostase, sowie auf strukturelle Veränderungen, u.a.
mit Veränderungen der extrazellulären Matrix und einer erhöhten Apoptoserate (134)
zurückgeführt werden. Auch im Tiermodell der diabetischen Ratte nach Injektion von
Streptozotocin konnten diese Veränderungen nachgewiesen werden. Die gestörte
Ca2+-Homöostase zeigte sich hierbei auch in spezifischen Veränderungen der
Expression und Funktion Ca2+-regulierender Proteine des SR wie der SERCA und
ihrem Regulatorprotein Phospholamban (137, 138, 151) und des SR-CalciumFreisetzungskanals (RYR2) (8, 151). Diese Veränderungen stellen wahrscheinlich
eine wesentliche Ursache für die Abnahme des Ca2+-Gehaltes im SR bei Diabetes
mellitus dar (58, 118). Die RYR2 bilden nach aktuellem Erkenntnisstand makromolekulare Komplexe, die u.a. FKBP12.6 enthalten und durch Proteine wie Sorcin
reguliert werden (36, 82). Der Komplex des Ca2+-Freisetzungskanals wurde in der
vorliegenden Arbeit unter dem Einfluss eines Typ1-Diabetes durch Analyse der
Proteinexpression mit Hilfe des WesternBlot-Verfahrens und durch Analyse der
Funktion durch Messung des Ca2+-Verlustes aus isolierten Membranvesikeln
untersucht. Das Proteinexpressionsmuster wies nach 8 Wochen Diabetes mellitus
Veränderungen auf. So wurde das regulierende Protein FKBP12.6 sowie das
Annexin VII vermindert im Western Blot-Verfahren nachgewiesen. FKBP12.6
stabilisiert die Aktion mehrerer RYR2, so dass diese in einer funktionellen Einheit
wirken (81). Dieser Mechanismus soll zu einer Verminderung des Ca2+-Lecks aus
dem SR und schließlich zu einer größeren Beladung des SR mit Ca2+, einem
höheren Ca2+-Transienten und einer verbesserten Kontraktilität führen (42, 101). Der
Nachweis der verminderten Expression des FKBP12.6 steht demnach im Einklang
mit der ebenfalls nachgewiesenen veränderten Funktion des Ca2+Freisetzungskanals, die sich in einer größeren Ca2+-Leckage des RYR2 äußerte.
Dies könnte direkt eine Verschlechterung der Kontraktilität bewirken (42, 101).
Interessanterweise dissoziiert das FKBP12.6 durch Phosphorylierung des RYR2 von
77
Diskussion
diesem (140). Eine Veränderung der Phosphorylierung des RYR2 an Serin 2809
konnte in dieser Arbeit jedoch exemplarisch nicht nachgewiesen werden. Annexin VII
hingegen scheint in der Lage zu sein, Sorcin zu binden und damit die Interaktion mit
dem RYR2 zu ermöglichen (53). Sorcin ist ein Inhibitor des RYR2, der die CICR
beenden kann. Eine verminderte Expression von Annexin VII, die eine
verschlechterte Bindung von Sorcin an den RYR2 zur Folge hätte (53), könnte
demnach auch zu einer größeren Leckage von Ca2+ aus dem RYR2 führen, wie sie
in der vorliegenden Arbeit beobachtet werden konnte. Hinzuzufügen bleibt, dass
Sorcin selbst unverändert exprimiert wurde. Die Veränderungen des Ca2+Freisetzungskomplexes nach 8 Wochen Typ1-Diabetes haben somit auch einen
Einfluss auf die Ca2+-Homöostase. Dies könnte ursächlich zum beobachteten
Phänotyp der Herzhypertrophie bei Wildtypmäusen beitragen. Der Phänotyp bei Gα11
Knockoutmäusen zeigte nach 8 Wochen Typ1-Diabetes keine Veränderungen im
Vergleich mit nicht diabeteskranken Gα11 Knockoutmäusen. Auch bei diesen Tieren
wurde die Funktion und die Expression des Ca2+-Freisetzungs-komplexes analysiert.
Die Ergebnisse konnten weder eine Veränderung der Funktion bzw. eine erhöhte
Ca2+-Leckage noch eine Veränderung der Proteinexpression von RYR2, Sorcin,
Annexin VII oder FKBP12.6 nachweisen. Die Deletion des Gα11 scheint also einen
günstigen Einfluss auf die Proteinexpression und Funktion dieser Proteine bei Typ1Diabetes zu haben. Der Phänotyp bei Gα11/ Gαq Doppelknockoutmäusen zeigte
diesen protektiven Einfluss nach 8 Wochen Diabetes mellitus nicht, sondern stellte
sich mit Zeichen der Herzinsuffizienz dar. Die kardiale Expression und Funktion des
Ca2+-Freisetzungskanals von Gα11/ Gαq Doppelknockoutmäusen nach 8 Wochen
Typ1-Diabetes wurde ebenfalls analysiert. Auch hier konnte ein spezifisches
Expressionsmuster nachgewiesen werden. Sorcin und Annexin VII zeigten eine
signifikante Steigerung in ihrer Expression. Da Annexin VII die physiologische
Wirkung von Sorcin am RYR2 möglich machen soll (53), ist es vielleicht möglich eine
kongruente Expressionssteigerung beider Proteine mit einer stärkeren Wirkung des
Sorcins zu assoziieren. Sorcin führt zu einer Inhibition des RYR2 und möglicherweise
zur Beendigung der CICR (36). Eine pathologische Steigerung der Funktion dieses
Proteins könnte demnach zu einer übermäßigen Hemmung des RYR2 führen.
Allerdings konnte keine Veränderung der Ca2+-Leckage aus isolierten
Membranvesikeln bei Mäusen dieses Genotyps über den RYR2 nach 8 Wochen
Diabetes mellitus nachgewiesen werden. Möglich erscheint als Erklärung, dass die
78
Diskussion
starke Expression beider Proteine einen Kompensationsmechanismus darstellen, der
zu einem Erhalt der Funktion des RYR2 bei Diabetes mellitus führt. Im
Zusammenhang mit einem Diabetes mellitus kann die Sorcinüberexpression sogar
zu einer Wiederherstellung normaler Kontraktionsverhältnisse führen (125).
Allerdings herrschen interessanterweise zwei gegensätzliche Meinungen über die
Wirkung einer Sorcinüberexpression vor. So wird einerseits eine hämodynamische
Verschlechterung mit der Sorcinüberexpression (84, 115), andererseits eine
Verbesserung der Kontraktilität (39, 125) mit der Sorcinüberexpression assoziiert.
Die vorliegenden Daten stehen in Einklang mit der aktuellen Literatur.
Shao und Mitarbeiter zeigten bereits eine verminderte Funktion bei unveränderter
Expression des RYR2 nach Induktion eines Typ-1-Diabetes mellitus (118). Diese
unveränderte Expression des Kanals ist allerdings von anderen Arbeitsgruppen nicht
(132) oder zeitabhängig (5, 6, 8, 21, 88, 151) nachgewiesen worden. Bei Diabetes
mellitus können auch morphologische Veränderungen an Proteinen, wie z.B. die
Bildung von Disulfidbrücken und Advanced Glycation End Products (AGEs) auftreten
(7, 9), die mit funktionellen Störungen des RYR2 einhergehen (6). Eine mögliche
Ursache für die unterschiedlichen Ergebnisse könnte die Wahl der Spezies sein. So
ist die Proteinexpressionsverminderung des RYR2 in der Regel in Rattenherzen
nachgewiesen worden. In der vorliegenden Arbeit wurde jedoch Mausgewebe
analysiert. Ebenfalls ein divergierender Faktor in den verschiedenen Arbeiten ist die
gewählte Dosis und Applikationsform des STZ. Mit einer einmaligen intraperitonealen
Gabe von 130 mg/kg KG STZ wurde in der vorliegenden Arbeit eine niedrige Dosis
gewählt, die allerdings zu äquivalenten Blutzuckerwerten führte, wie in den
angeführten Arbeiten, die in der Regel höhere Dosen verwandten und diese
intravenös applizierten.
Zusammenfassend bestehen deutliche Unterschiede im Proteinexpressionsmuster
des Ca2+-Freisetzungskanals der drei unterschiedlichen Versuchsgruppen nach
Induktion eines Diabetes mellitus. Diabetesbedingt kann es bei Mäusen des Wildtyps
zur Verminderung von Annexin VII und FKBP12.6 und damit zu einer erhöhten Ca2+Leckage des SR kommen. Diese Veränderungen konnten in der Gruppe der Gα11
Knockoutmäuse nicht beobachtet werden. In dieser Versuchsgruppe waren keine
diabetesabhängigen Veränderungen in der Expression der untersuchten Proteine zu
erkennen. Die Gruppe der Gα11/Gαq Doppelknockoutmäuse zeigte keine
Abschwächung der Proteinexpression, sondern zusätzlich eine Zunahme der
79
Diskussion
Expression von Sorcin und Annexin VII, die für die beobachteten Zeichen der
Kongestion bei diesen Tieren von Bedeutung sein könnten.
4.4 Klinische Bedeutung der vorliegenden Arbeit
Die in der vorliegenden Arbeit erarbeitete kardioprotektive Wirkung des G-Proteins
Gα11 mag einen Hinweis über die Pathogenese einer Hypertrophie durch eben
dieses Proteins im Rahmen eines Diabetes mellitus geben, die sich im vorliegenden
Modell auf Ebene des Phänotyp, auf Ebene der intrazellulären Signalvermittlung über
die Proteinkinase C und auf Ebene der Proteinexpression zeigte. Die G-Proteine
Gα11 und Gαq vermitteln das Signal diverser Hormone. Neben Endothelin und
Noradrenalin wird auch das intrazelluläre Signal von Angiotensin II über den AT1Rezeptor und damit über die G-Proteine Gα11 und Gαq vermittelt. Das Knockout des
AT1-Rezeptors, welches zu einer Hemmung des RAAS führt, kann allerdings die
Entstehung einer Hypertrophie im Tiermodell nicht verhindern (47, 49) im Gegensatz
zu der hier beobachteten kardioprotektiven Wirkung einer Gα11-Deletion. Das
auffällige Benefit der diabetischen Population durch die Gabe von ACE-Hemmern
bzw. AT1-Rezeptor-Antagonisten, also einer Hemmung des RAAS, in großen
klinischen Studien (48, 57, 73) könnte also im Zusammenhang mit der hier
nachgewiesenen kardioprotektive Wirkung einer Gα11-Deletion stehen.
80
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Hintergrund: Der Prävalenz des Diabetes mellitus wird für die nächsten Jahre eine
deutliche Zunahme vorausgesagt. Zu den multiplen Manifestationen dieser
Erkrankung gehört auch eine kardiale Kontraktionsstörung, die sich unabhängig von
einer koronaren Makroangiopathie entwickelt. Bei dieser Form der Herzinsuffizienz,
auch als diabetische Kardiomyopathie bezeichnet, zeigt sich früh eine Myokardhypertrophie mit isolierter Relaxationsstörung, aus der sich mit zunehmender
Manifestationsdauer das Vollbild einer kongestiven Herzmuskelinsuffizienz
entwickelt. Die klinische Beobachtung einer kardioprotektiven Wirkung von ACEHemmern und AT1-Rezeptorantagonisten bei Patienten mit Diabetes mellitus legt die
Vermutung nahe, dass neurohumorale Mechanismen bei der Entstehung einer
solchen diabetischen Kardiomyopathie von zentraler Bedeutung sind. Gleichzeitig
gibt es zahlreiche Hinweise, dass die strukturellen und funktionellen Veränderungen
im Myokard bei Diabetes mellitus auch direkt Folge der Hyperglykämie sein können.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, die Signalwege zu identifizieren, über die
eine Hypertrophie und Herzmuskelinsuffizienz bei Diabetes mellitus primär vermittelt
werden.
Methoden: Der Angiotensin II-Typ 1-Rezeptor (AT1-Rezeptor) gehört zur Familie der
G-Protein gekoppelten Rezeptoren und vermittelt sein Signal primär über die GProteine Gαq und Gα11. Die vorliegenden Untersuchungen wurden daher an Knockoutmäusen mit spezifischer Deletion des Gα11, einem Mausmodell mit kombinierter
Deletion der G-Proteine Gαq und Gα11, sowie an Wildtyp Mäusen durchgeführt. In
diesen Tieren wurde ein experimenteller Typ-1-Diabetes durch intraperitoneale
Injektion von Streptozotocin induziert. 8 Wochen nach Induktion eines Diabetes
wurden Herz- und Lungengewicht als Marker für Myokardhypertrophie und Herzinsuffizienz gemessen, sowie echokardiographische Untersuchungen zur Analyse
der kardialen Funktion durchgeführt. Die Isoformen α, βΙΙ, δ, ε, ζ, θ, sowie die
Phosphorylierung der Isoformen δ/θ und ζ/λ der Proteinkinase C wurden immunhistochemisch in ihrem Expressionsmuster in den verschiedenen Versuchsgruppen
untersucht. Zur Bestimmung funktioneller Veränderungen wurde der Einfluss des
experimentellen Diabetes auf den intrazellulären Calciumstoffwechsel exemplarisch
am Calcium-Freisetzungskanal des sarkoplasmatischen Retikulums analysiert.
Hierzu wurde die Proteinexpression von Ryanodin (Isoform 2; RYR2), Sorcin,
FKBP12.6, Annexin VII bestimmt, die Phosphorylierung von RYR2 an Serin 2809
81
Zusammenfassung
analysiert, und funktionell der Verlust von Calcium an isolierten Membranvesikeln in
einem Versuchsansatz mit radioaktiv markiertem Calcium in Gegenwart und in
Abwesenheit von Ruthenium Rot quantitativ in den verschiedenen
Untersuchungsgruppen verglichen.
Ergebnisse: 8 Wochen nach Induktion eines Typ-1-Diabetes konnte bei Wildtypmäusen erwartungsgemäß eine konzentrische Myokardhypertrophie mit
erhaltener Kontraktilität nachgewiesen werden. Gα11 Knockoutmäuse hingegen
zeigten unter identischen experimentellen Bedingungen keinen kardialen Phänotyp.
Im Gegensatz hierzu entwickelten Gα11/Gαq Doppelknockouttiere Zeichen einer
kongestiven Herzmuskelinsuffizienz.
Unter den untersuchten Isoformen der Proteinkinase C kam es bei Mäusen des
Wildtyps nach Induktion eines Diabetes mellitus zu einer Expressionszunahme der
Isoformen α und ζ. Zudem konnte eine spezifische Translokation der Isoformen ε
und ζ nachgewiesen werden. Gα11 Knockoutmäuse wiederum zeigten keine Veränderung in der Expression der Proteinkinase C. Lediglich die Translokation der
Isoform ε zeigte in diesen Tieren bei Diabetes ein Muster, vergleichbar mit dem der
Wildtyp Mäuse.
Der Proteinkomplex des Calciumfreisetzungskanals zeigte nach 8-wöchigem
Diabetes bei den Wildtypmäusen im Vergleich zu den nicht diabeteskranken
Kontrolltieren eine signifikant verminderte Expression von FKBP12.6 und Annexin
VII. Zudem zeigte sich funktionell ein vermehrter Verlust von 45Calcium an isolierten
Membranvesikeln. Entsprechende funktionelle und molekulare Veränderungen
konnten bei den Gα11 Knockoutmäusen nicht nachgewiesen werden. Gα11/ Gαq
Doppelknockoutmäuse wiederum zeigten ein verändertes Proteinexpressionsmuster
nach 8-wöchigem Diabetes. Hier kam es jedoch im Gegensatz zu den Wildtyp
Mäusen zu einer vermehrten Expression von Sorcin und Annexin VII. Hinweise auf
eine veränderte Funktion des Calciumfreisetzungskanals ergaben sich bei Gα11/ Gαq
Doppelknockoutmäusen nicht.
Schlussfolgerungen: Das G-Protein Gα11 ist wesentlich an der Entwicklung einer
Hypertrophie des Herzens bei Typ1-Diabetes beteiligt, da eine Deletion dieses Gens
das Auftreten von diabetesbedingten makroskopischen und molekularen,
strukturellen und funktionellen Veränderungen im Modell verhindern kann. Eine
partielle Aktivität der G-Proteine Gα11 und Gαq ist von Bedeutung für den Erhalt der
Pumpfunktion des Herzens in der frühen Phase des Diabetes mellitus, da die
82
Zusammenfassung
Deletion beider Gene zu einem Phänotyp mit Zeichen der kongestiven
Herzmuskelinsuffizienz führte.
83
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Lebenslauf
7 Lebenslauf
Name:
Dieter Paul Hoyer
Geburtsdatum:
22.08.1983
Geburtsort:
Hannover
Staatsangehörigkeit:
Deutsch
Eltern:
Univ.-Prof. Dr. med. Peter F. Hoyer
Dr. rer. nat. Karin Hoyer
Schulische Bildung:
1989-1993 Grundschule Groß-BuchholzerKirchweg, Hannover
1993-1995 Orientierungsstufe Rehmer Feld,
Hannover
1995-1998 Gymnasium Sophienschule, Hannover
1998-2002 Gymnasium Goetheschule, Essen
Juni 2002 Abitur
Zivildienst:
Juli 2002 - März 2003, Zentrallabor,
Universitätsklinikum Essen
Studium:
April 2003 Studium der Humanmedizin an der
Universität zu Köln
April 2005 Ärztliche Vorprüfung
Juni 2005 Beginn einer experimentellen
Doktorarbeit im Labor für Herzmuskelphysiologie
und molekulare Kardiologie unter Herrn PD Dr.
med. H. Reuter an der Klinik III für Innere Medizin
der Universität zu Köln (Direktor: Univ.-Prof. Dr.
med. E. Erdmann)
Februar 2008 - Januar 2009 Praktisches Jahr
Staatsexamen im Juni 2009
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