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Durchführung
Verwendet werden folgende Lösungen, die für alle Gruppen angesetzt werden:
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HBTU in DMF: HBTU (Xn) dient als Aktivator, DMF(T) als Lösungsmittel
20% Piperidin in DMF (v/v): Piperidin (T, F) dient zur Abspaltung der temporären
-Aminoschutzgruppen (Fmoc)
20% DIPEA in DMF (v/v) : DIPEA (F,C) dient als Base
TFA:Wasser:Triisopropylsilan 95:2,5:2,5 (v/v/v): TFA (C) dient zum Abspalten der
Peptidkette vom Harz
Tert-Butyl-Methylether(F,Xi) /Hexan(F,Xn,N) 1:1
DMF zum Waschen
Vorbereitung des Arbeitsplatzes unter dem Abzug:
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!!! Handschuhe anziehen !!!
- 3 Schnappdeckelgläser mit DMF ( eines für den Vor-, eines für den Hauptwaschgang und
eins für den Abfall)
bereitstellen
Foto 1: Schnappdeckelgläser mit DMF
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4 eq. der Aminosäuren in Eppendorf-Gefäße einwiegen
Ansatzberechnung :
Beladungsgrad-Harz: Harz: 0,47 mmol/g
Name
Rink
Phe
Asp
Met
Trp
Rhoda
FITC
HBTU
0
1
2
3
4
5a
5b
X
Masse-Harz:50 mg = 0,0235 mmol
Molmasse
X
388
412
372
427
479
389
379
4 eq. = mg
0,0367
36,47
38,73
34,97
40,14
45,03
36,57
35,63
Die einzuwiegende Masse an Aminosäure hängt vom Beladungsgrad des Harzes ab
und kann nach folgender Formel berechnet werden:
Beispiel Phe:
Vorbereitung des Harzes:
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eine 2,5 ml Kunststoffspritze wird mit einer ausgestanzten porösen Platte (Polypropylen)
als Filtriereinheit versehen
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in diese Spritze wird das unbeladene Harz eingewogen
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der Stempel wird wieder eingesetzt
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über eine Nadel werden 500 µl Dichlormethan (zum Quellen des Harzes) aufgezogen
Foto 2: Spritze während der Harzquellung
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1 Stunde stehen lassen, herausdrücken
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500µl DMF aufziehen, 1 Minute warten und ebenfalls herausdrücken
Synthesezyklus:
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500 µl Piperidin-Lösung aufziehen, unter gelegentlichem Schütteln 5 min umsetzen
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Flüssigkeit aus Spritze herausdrücken und das Harz 5 mal mit 1 ml DMF waschen, dabei
Schütteln
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Die jeweilige Aminosäure (1.Phe,2.Asp,3.Met,4.Trp) in 1 ml der HBTU-Lösung in DMF
plus 250 µl der DIPEA-Lösung lösen.
Nach 1 Minute in die Spritze saugen und 10 Minuten lang schütteln.
Foto 3: Aminosäure während des Synthesecyclus
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Flüssigkeit herausdrücken und 5 mal mit 1 ml DMF waschen
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Wieder 500 µl Piperidin-Lösung aufziehen und genau so verfahren wie eben beschrieben
Farbstoffkopplung:
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!!!Wichtig ist nun, dass man das erneute Entschützen mit 500 µl Piperidin-Lösung
nicht vergisst, da sonst der Farbstoff nicht koppeln kann!!!
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Rhodamin: in 1 ml HBTU-Lösung und 250 µl DIPEA-Lösung ( unbedingt komplett)
wird es gelöst und nach 10 Minuten Wartezeit in die Spritze aufgezogen und 30 Minuten
lang geschüttelt
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FITC: 1 ml einer Lösung des FITC in DMF ( ohne HBTU) und 250 µl DIPEA-Lösung
wird in die Spritze aufgezogen und 30 Minuten lang geschüttelt
Foto 4: links- Rhodamin; rechts- FITC
Abspaltung:
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nachdem der Farbstoff angekoppelt wurde wird 5 mal mit 1 ml DMF gewaschen
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danach wird 5 mal mit 1 ml Dichlormethan gewaschen und anschließend das Harz im
Vakuum getrocknet
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zum getrockneten Harz zieht man 500 µl TFA-Abspaltungslösung auf und setzt es 1
Stunde lang unter gelegentlichem Bewegen um
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ein Zentrifugenglas wird gewogen und dessen Gewicht notiert, außerdem werden 10 ml
tert-Butyl-Methylether/Hexan 1:1 hinein gegeben
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hier wird die Abspaltungslösung hineingedrückt (Video (1. Rhodamin; 2. FITC))
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mit 200 µl TFA wird das Harz nachgewaschen und diese Lösung ebenfalls in das
Zentrifugenglas gedrückt
Aufarbeitung:
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zwei Mal nimmt man mit 5 ml reinem tert-Butyl-Methylether auf, schlemmt auf und
zentrifugiert
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der Niederschlag wird erst an der Luft trocknen gelassen und danach im Vakuum
getrocknet
Foto 5: rechts-FITC; links-Rhodamin
Auswertung:
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Im Versuch HPLC-2 wird mit Hilfe einer HPLC-MS das Molekulargewicht
bestimmt.
Im Versuch UV-2 wird das Absorptionsspektrum aufgenommen.
Zu beiden Versuchen ist die Probe mitzubringen.