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Toxikologie für Chemiker, Dortmund Teil 4 Karzinogenese: • Molekulare Mechanismen • Mehrschrittkonzept • Reversibilität Multistep Process of Carcinogenesis Procarcinogen Threshold mechanisms Metabolic activation Genotoxic carcinogen DNA damage Proliferation DNA mutations Metabolic inactivation DNA repair Cell cycle arrest Apoptosis Proliferation Multistep process of oncogene activation and tumor suppressor inactivation Proliferation Tumor Apoptosis Control by immune system Aflatoxin B1: an example of a non-threshold carcinogen Liver tumors (Ο) and DNA adducts (♦) induced by Aflatoxin B1 in male Fisher rats. Phase I Metabolismus von Aflatoxin B1 O O O OH O OMe O O 2 O O H 3 O AFM1 O H 9 9a 8 O OMe OH H O 6a O H OMe AFB1 O O H AFQ1 O O O O O O O H O H OMe OMe O O H AFB1-endo-8,9-oxide O O H AFB1-exo-8,9-oxide 3‘ | T C G A | 5‘ 5‘ | A G C T | 3‘ DNA with AFB1 adduct 3‘ | T A G A | 5‘ 5‘ | A G C T | 3‘ Second replication 3‘ | T A G A | 5‘ 5‘ | A T C T | 3‘ G→T Transversion 3‘ | T C G A | 5‘ 5‘ | A G C T | 3‘ 3‘ | T C G A | 5‘ From: Hengstler, Bogdanffy, Bolt and Oesch, Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003;43:485-520 5‘ | A G 3‘ | First replication T C C A T A | | 3‘ 5‘ 5‘ | A G 3‘ | Second T replication C C A T A | | 3‘ 5‘ 5‘ | A G T T | 3‘ C→T Transition Begriffe zur Karzinogenese Initiation: • Irreversible, vererbbare Veränderung der DNA • Beispiele: DNA-Mutation, Chromosomenaberration, DNA-Amplifikation • Häufig: Dosis-Wirkungsbeziehung ohne Schwelle Promotion: • Proliferationsstimulus • Beispiele: Ersatzwachstum nach Entzündung oder chronischer Einwirkung toxischer Substanzen, Hormonelle Stimulation (Östrogen) • Häufig: Dosis-Wirkungsbeziehung mit Schwelle Definitionen chemischer Karzinogene Komplettes Karzinogen: • wirkt initiierend und promovierend • Beispiel: Aflatoxin B1 Promovierende Substanz: • beschleunigt die Karzinogenität durch initiierernde Substanzen • Beispiel: 2,3,7,8-TCDD Direktes Karzinogen: • Keine metabolische Aktivierung erforderlich • Beispiele: Ethylenoxid, Styroloxid Indirektes Karzinogen: • Benötigt metabolische Aktivierung • Beispiele: Styrol, PAHs Karzinogenese am Beispiel der Rezeptortyrosinkinase HER-2 (Synonyme: erbB-2, neu) - Molekulare Mechanismen - Signaltransduktion - Penetranz - Reversibilität HER-2 mRNA expression is associated with survival in patients with primary ovarian cancer 100 P=0.0001 Survival (%) 80 60 Low HER-2 expression 40 20 High HER-2 expression 0 0 1000 2000 3000 4000 5000 Time after surgery (days) Hengstler et al., Cancer Res., 1999 NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP PIP2 kinase↑ PIP2 Ras-GTP PIP3 Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 IKK (IκB kinase complexes) P IκB NF-κB IκB NF-κB Bcl2↑ Bad↓ Caspase 9↓ Antiapoptosis Nucleus Cell cycle progression Dimerization of HER-2 Binding site 1 (low affinity) NDF Binding site 2 (high affinity) HER-2 HER-3 Signal transduction inactive Dimerization of HER-2 Binding site 2 (high affinity) NDF HER-2 HER-3 Signal transduction inactive Dimerization of HER-2 Binding site 1 (low affinity) NDF HER-2 P P Signal transduction active HER-3 NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Nucleus NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Nucleus NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Nucleus NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP Nucleus Ras-GTP NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GTP Ras-GDP Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a Nucleus ERK1/2i NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GTP Ras-GDP Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 Nucleus ERK1/2i NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GTP Ras-GDP Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 Nucleus Cell cycle progression NDF Dimerization partner Dimerization PIP2 kinase↑ HER-2 Ras-GTP Ras-GDP Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 Nucleus Cell cycle progression NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 PIP2 kinase↑ PIP2 PIP3 Ras-GTP Ras-GDP Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 Nucleus Cell cycle progression NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP PIP2 kinase↑ PIP2 Ras-GTP PIP3 Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 Bcl2↑ Bad↓ Caspase 9↓ Nucleus Cell cycle progression NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP PIP2 kinase↑ PIP2 Ras-GTP PIP3 Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 Bcl2↑ Bad↓ Caspase 9↓ Antiapoptosis Nucleus Cell cycle progression NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP PIP2 kinase↑ PIP2 Ras-GTP PIP3 Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 IKK (IκB kinase complexes) Bcl2↑ Bad↓ Caspase 9↓ Antiapoptosis Nucleus Cell cycle progression NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP PIP2 kinase↑ PIP2 Ras-GTP PIP3 Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 IKK (IκB kinase complexes) P IκB NF-κB IκB NF-κB Bcl2↑ Bad↓ Caspase 9↓ Antiapoptosis Nucleus Cell cycle progression NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP PIP2 kinase↑ PIP2 Ras-GTP PIP3 Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 IKK (IκB kinase complexes) P IκB NF-κB IκB NF-κB Bcl2↑ Bad↓ Caspase 9↓ Antiapoptosis Nucleus Cell cycle progression SH2-Domäne Phosphat • Protein (z.B. HER-2) mit der Sequenz: Phosphotyrosin (P-TYR)-Glutaminsäure (GLU)Glutaminsäue (GLU)-Isoleucin (ILE). Hierbei bilden P-TYR und ILE Ausbuchtungen, die in dem unteren Protein verankert sind wie Stecker in den Buchsen einer Steckdose. • Protein (z.B. GRB2) mit zwei Einbuchtungen („Buchsen“) • Die Region mit den beiden Buchsen nennt man „SH2-Domäne“ • Die SH2-Domäne bindet Peptide der Sequenz: P-TYR-GLU-GLUILE. Dabei „stecken“ P-TYR und ILE in den „Buchsen“. Abbildung aus Lodish et al., Molekulare Zellbiologie NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP PIP2 kinase↑ PIP2 Ras-GTP PIP3 Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 IKK (IκB kinase complexes) P IκB NF-κB IκB NF-κB Bcl2↑ Bad↓ Caspase 9↓ Antiapoptosis Nucleus Cell cycle progression SH3-Domäne • Protein (z.B. SOS) mit Prolin (PRO)-reicher Region bildet drei Ausbuchtungen. • Protein (z.B. GRB2) mit drei Einbuchtungen („Buchsen“) • Die Region mit den drei Buchsen nennt man „SH3-Domäne“ • Über diese SH3-Domäne vermittelt das „Adapterprotein“ GRB2 den Kontakt zu SOS. Abbildung aus Lodish et al., Molekulare Zellbiologie NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP PIP2 kinase↑ PIP2 Ras-GTP PIP3 Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 IKK (IκB kinase complexes) P IκB NF-κB IκB NF-κB Bcl2↑ Bad↓ Caspase 9↓ Antiapoptosis Nucleus Cell cycle progression Aufbau von Ras Nukleotid-Bindungsstellen 1 10 16 57 62 32 40 Switch I 60 116 119 189 72 Switch II Mutation in Codon 61: - Aktivierung des Protoonkogens ras zum Onkogen - ras ist nach Aktivierung permanent aktiv - Die meisten gentoxischen Karzinogene, welche Punktmutationen verursachen, können ras aktivieren - ras-Mutationen sind in den meisten Tumoren nachweisbar Ras-GTP Switch II • Ras-GTP ist durch eine Farnesylgruppe kovalent an der Zellmembran fixiert • Wie eine Klemme fixiert Ras mit zwei Armen GTP. Jeder Arm hat ein „Gelenk“ (auch Switch bzw. Schalter genannt). • Ras-GTP aktiviert Raf. Hierzu wird Raf gebunden und an die Zellmembran angelagert. Das aktive Raf phosphoryliert (und aktiviert) sodann MEK. • Während der Aktivierung von Raf durch Ras wird GTP zu GDP hydrolysiert und somit inaktiv • In mutierter (onkogener) Form ist Ras konstitutiv aktiv GTP Switch I Abbildung aus Lodish et al., Molekulare Zellbiologie NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP PIP2 kinase↑ PIP2 Ras-GTP PIP3 Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 IKK (IκB kinase complexes) P IκB NF-κB IκB NF-κB Bcl2↑ Bad↓ Caspase 9↓ Antiapoptosis Nucleus Cell cycle progression Aktivierung von Ras-GDP durch SOS • SOS „greift“ in die beiden Arme von Ras-GTP und öffnet sie. Dadurch wird GDP aus der Umklammerung durch Ras gelöst. SOS Ras-GDP Switch II GDP • GDP diffundiert passiv aus Ras heraus. Da im Zytoplasma viel mehr GTP als GDP vorliegt, wird GDP durch GTP ersetzt. • SOS gleitet aus Ras heraus und die Arme von Ras schließen sich wieder um das GTP. Somit ist Ras-GTP bereit für die nächste Runde Aktivierung von Raf. Switch I • Bei mutiertem onkogenem Ras erfolgt die Aktivierung (d.h. GTP-Beladung) konstitutiv auch ohne Einsatz von SOS NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP PIP2 kinase↑ PIP2 Ras-GTP PIP3 Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 IKK (IκB kinase complexes) P IκB NF-κB IκB NF-κB Bcl2↑ Bad↓ Caspase 9↓ Antiapoptosis Nucleus Cell cycle progression Aufbau von Raf1 ATP-Bindungsstellen minimale Ras-Bindungsstelle 355 1 51 26 131 302 AS 26 - 302 fehlen bei BXB-Raf1 363 375 648 NDF Dimerization partner Dimerization HER-2 Ras-GDP PIP2 kinase↑ PIP2 Ras-GTP PIP3 Rafi Rafa Meka Meki ERK1/2a ERK1/2i Akt-kinase (PKB) Transcription: c-myc, c-fos, c-jun, cyclin D1 IKK (IκB kinase complexes) P IκB NF-κB IκB NF-κB Bcl2↑ Bad↓ Caspase 9↓ Antiapoptosis Nucleus Cell cycle progression Aktivierung der MAP-Kinase (ERK1/2) Inaktiv Aktiv • Die Aktivierung erfolgt durch Phosphorylierung in zwei Positionen • Die Phosphorylierung führt zu einer Konformationsänderung, welche eine Dimerierung ermöglicht • Erst als Dimer gelangt die MAP Kinase in den Zellkern • Im Zellkern phosphoryliert ERK1/2 hauptsächlich Transkriptionsfaktoren Abbildung aus Lodish et al., Molekulare Zellbiologie Wiederholung: Die Ras – MAP-Kinase – Kaskade aus: Molekulare Zellbiologie, Darnell et al The multistep process of carcinogenesis (Mehrstufenkonzept der Kanzerogenese) • Activation of oncogenes • Inactivation of tumor suppressor genes Normal Cell Preneoplastic Cell Tumor Cell Experimentelle Beweise für das Mehrstufenkonzept aus Mausexperimenten Ca. 1 Mio Zellen eines malignen Tumors Makroskopisch sichtbarer, rasch wachsender Tumor ca. 10 Tage erst nach ca. 60-180 Tagen Massive Überexpression des Onkogens HER-2 in mehreren Millionen Epithelzellen der Brustdrüse Makroskopisch sichtbarer, rasch wachsender Tumor der Brustdrüse Makroskopisch sichtbarer, rasch wachsender Tumor der Brustdrüse Ca. 1 Mio Zellen aus dem Tumor der Brustdrüse Makroskopisch sichtbarer, rasch wachsender Tumor ca. 10 Tage Schlussfolgerungen: -Überexpression des Onkogens HER-2 in gesunden Brustdrüsenepithezellen der Maus führt nicht unmittelbar zu Tumorwachstum -Weitere Ereignisse sind Voraussetzung für Tumorwachstum (sogenannte „second hits“). Diese treten in der durch HER-2 initialisierten Brustdrüsenepithelzelle in einem Zeitraum von ca. 50-170 Tagen auf. Expression von Onkogenen in Ovarepithelzellen der Maus (Varmus-Modell; Cancer Cell, 1, 53-62, 2002) Ovarialepithel (Ausgangszellen des epithelialen Ovarialkarzinoms) Stroma Ovar Retransplantation in das Ovar Ovar Entnahme von Ovarialepithelzellen Virale Transduktion von Onkogenen Ovarialtumore? Ergebnis: Expression von p53 Hintergrund der Mäuse Ovarialtumore innerhalb von 8 Wochen AP marker (neg. Kontrolle) c myc K ras Akt wt wt wt wt - C myc + K ras K ras + Akt Akt + c myc Akt + c myc + K ras wt wt wt wt - AP marker (neg. Kontrolle) C myc K ras Akt -/-/-/-/- - C myc + K ras K ras + Akt Akt + c myc Akt + c myc + K ras -/-/-/-/- + + + + Schlußfolgerung: Für die Transformation gesunder Ovarepithelzellen der Maus ist (i) die Inaktivierung eines Tumorsuppressorgens (p53) (ii) die Aktivierung von zweien der Onkogene c-myc, K-ras oder Akt erforderlich. The multistep process of carcinogenesis (Mehrstufenkonzept der Kanzerogenese) • Activation of oncogenes • Inactivation of tumor suppressor genes Normal Cell Preneoplastic Cell Tumor Cell Ist die Mehrschrittkanzerogenese reversibel? • Activation of oncogenes • Inactivation of tumor suppressor genes Normal Cell Tumor Cell Preneoplastic Cell ? ? Reversibility of carcinogenesis by • Down regulation of oncogenes? • Activation of tumor suppressor genes? XhoI Pbla bla CMVmin pUHD 15-1 EcoR1 Werkzeug: Tetracyclin kontrollierte Expression von Her-2 tTA ColE1 BamHI Asel Xmnl Sspl Xhol Xmnl EcoR1 Asel tetO7 TthIIII tTA CMVmin ORI Amp R Sspl Xhol EcoR1 Xba1 tetO7 CMVmin Amp R TthIIII Hygro SV40pa her-2 pTBC Hygro R SacII ORI SacII SEAP SV40pa IRES BamH1 EcoR1 Not1 TthIIII Not1 IRES HindIII XhoI Pbla bla CMVmin pUHD 15-1 EcoR1 Tetracyclin tTA →TET-OFF ColE1 BamHI Asel Xmnl Sspl Xhol Xmnl EcoR1 Asel tetO7 TthIIII tTA - CMVmin ORI Amp R Sspl Xhol EcoR1 Xba1 tetO7 CMVmin Amp R TthIIII Hygro SV40pa her-2 pTBC Hygro R SacII ORI SacII SEAP SV40pa IRES BamH1 EcoR1 Not1 TthIIII Not1 IRES HindIII marker HER-2 Down regulation of HER-2 by anhydrotetracycline (10 ng/ml) in NIH3T3-her2 cells in vitro (Western blot analysis) 120 kDa 100 kDa 80 kDa 60 kDa 50 kDa 40 kDa 30 kDa control 1d 3d 7d marker β-actin 20 kDa control 1d 3d 7d marker Coomassie HER-2 positive cells (%) 100 80 60 40 20 0 ** controls 11d Controls d 33dd 77d d 99dd Incubation with anhydrotetracycline control 1d 3d 7d marker Marker HER-2 Down regulation of HER-2 by anhydrotetracycline (10 mg/kg) in tumors of nude mice (Western blot analysis) 120 kDa 100 kDa 80 kDa 60 kDa 50 kDa 40 kDa 30 kDa 1d 3d 7d 1d 3d 7d 20 kDa Controls ATc Marker 1d 3d 7d 1d Controls 3d 7d ATc Marker HER-2 positive cells (%) β-actin 100 80 60 40 20 0 Controls Coomassie 11dd * * 33dd 77dd* Treatment with anhydrotetracycline * Incubation with anhydrotetracycline 1d 3d 7d Controls 1d 3d ATc 7d Marker Before therapy Day 4 Day 6 ATc treated tumor Control mouse Cancer Res., 63, 7221-7231, 2003 Down regulation of HER-2 in tumor tissue by daily administration of 10 mg/kg anhydrotetracycline (ATc): influence on tumor development Start of ATc administration: day 0 Cancer Res., 63, 7221-7231, 2003 Tumor volume (cm3) 5 Controls 4 3 2 1 ATc administration 0 -10 -5 0 5 10 15 20 Days 25 30 35 40 45 50 No detectable HER-2 protein expression in recurrent tumors A. C. HER-2 HER-2 Ko. 1d 3d ATc 50 10 2 0.4 0.016 3.2 x 103 Different amounts of protein [µg] of a HER-2 dependent tumor 7d 6 Recurrent tumors B. 2 Recurrenttumors (each 50 µg protein) D. β -Actin β-Actin Ko. 1d 3d ATc 7d 6 Recurrent tumors 50 10 2 0.4 0.016 3.2 x 103 2 RecurrentDifferent amounts of protein [µg] of a tumors (each 50 µg protein) HER-2 dependent tumor Schiffer, Brenner, Spangenberg, Prawitt, Zabel, Oesch and Hengstler, Cancer Res., 2003 Schlussfolgerung: • Nach Abschalten eines transformierenden Onkogens ist der maligne Phänotyp der Mehrzahl individueller Tumorzellen reversibel • Aber: Einzelne Tumorzellen erwerben sogenannte „second hits“, wodurch Tumorwachstum unabhängig vom ursprünglich transformierenden Onkogen ermöglicht wird. Diese „second hits“ sind im Mausmodell seltener als 1 in 7x107 Millionen Zellen. Aber alle bisher untersuchten Tumore ab einem Volumen von 0,2 cm3 enthalten bereits „second hits“. Daher ist davon auszugehen, dass makroskopisch sichtbare Tumore durch das Abschalten der ursprünglich transformierenden Onkogene nicht dauerhaft reversibel sind. Krebsforschung Therapeutische Möglichkeiten Wie sieht die Zukunft aus? Akute lymphatische Leukämie ca. 1000 Neuerkrankungen in Deutschland im Jahr • Allgemeine Schwäche • Blässe • Blutgerinnungsstörungen • Fieber mit schwer verlaufenden Infekten • Knochenschmerzen Vor 40 Jahren: Tod innerhalb von wenigen Wochen Bei ca. 70-80 % aller Kinder mit intensiver Chemotherapie heilbar (z.B.: Doxorubicin, Cyclophosphamid, Vincristin) Hodenkarzinom einer von 250 Männern • Meist junge Männer (15-35 Jahre) • Sehr wichtig: Selbstuntersuchung durch Abtasten • harter Knoten im Hoden (schmerzlos) Behandlung • Operation: Entfernung des befallenen Hodens • Eventuell zusätzlich: Bestrahlung und Chemotherapie Beste Heilungsrate von allen Krebsarten: >90% Brustkrebs Jede achte bis zehnte Frau • Wahrscheinlichkeit, dass tödlich: ca. 30 % • Prognose abhängig von Früherkennung → Abtasten der Brust nach Knoten → Krebs-Frühuntersuchungsprogramms ab dem 30. Lebensjahr Röntgen-Mammographie, Mamma-Kernspintomographie Behandlung: • Operation • Bestrahlung • Chemotherapie • Antihormonelle Therapie Dickdarmkrebs • 5-Jahres-Überlebensrate von 40 bis 60 % (Kolorektales Karzinom) 6 % aller Deutschen erkranken 2,5–3 % versterben • Sehr wichtig: Darmspiegelung („Vorsorge-Koloskopie“) Behandlung: Operation und Chemotherapie Pankreaskarzinom Bauchspeicheldrüse, nur etwa 2% aller Karzinome Überleben: weniger als 5% Organisationsprinzip der Zelle DNA RNA Protein Organisationsprinzip der Zelle DNA Variabilität zwischen Individuen durch EinzelnukleotidPolymorphismen (SNPs) RNA Protein Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) sind Austausche einzelner Basen in der DNA • Häufigkeit: etwa alle 500 Basen • Ursache für Unterschiede zwischen Individuen Stand der Technik bei der Untersuchung von Einzelnukleotidpolymorphismen Most recent version: Genome-Wide Human SNP Array 6.0 Each SNP on a GeneChip Mapping Array is interrogated with approximately 40 different probes • 906,600 SNPs • 946,000 copy number probes Analysis of 302,140 SNPs in: 1,803 bladder cancer cases and 34,336 controls Confirmation in: 2,165 bladder cancer cases and 3,800 controls Result: • rs9642880 T, chomosome 8q24, 30 kb upstream of c-MYC • OR = 1.49 • P=9.34 × 10-12 Population attributable risk: 17% • Die genetische vorgegebene Ausstattung an SNPs bestimmt das Risiko an Blasenkrebs zu erkranken • Für das Auftreten von „spontanem“ und beruflich bedingtem Blasenkrebs sind unterschiedliche SNPs verantwortlich Berufliche Belastung gegenüber Blasenkarzinogenen Kohorte Überrepräsentierter Polymorphismus P-Wert Aromatische Amine Polycyclische aromatische Kohlenwasserstoffe Azo-Farben Apollensdorf Patienten 8% 9% 7% rs9642880 T 0,029 Berufskrankheiten 63% 28% 64% GSTM1*0 0,017 0% 52% 8% GSTM1*0 0,001 Dortmund Kohorte Nat Genet. 2008 Nov;40(11):1307-12. Organisationsprinzip der Zelle DNA RNA Protein Vorhersage von Prognose und Chemosensitivität von Patientinnen mit Mammakarzinom • 788 Patientinnen mit Brustkrebs • Alle ohne befallene Lymphknoten • Untersuchung aller ca. 22.000 RNA Spezies mittels Gene Array Hengstler et al., Cancer Res. 2008 Jul 1;68(13):5405-13. „Omics-Technologien“: Einsatz in Tumorbiologie breast cancer specimens 2579 probesets Hierarchical clustering Metagene Schmidt et al., Cancer Res. 68(13):5405-13, 2008 Principle Component Analysis: Relationship between metagene expression and time to metastasis Time to metastasis High 3.0 2.5 2.0 Proliferation metagene 1.5 1.2 Long 180 PCA component 2 1.0 0.9 0.8 0.7 143 140 137 Low 0.6 149 0.5 0.4 116 High 3.0 122 2.5 2.0 111 1.5 104 100 98 92 1.2 1.0 0.9 78 0.8 76 71 68 0.7 Low 0.6 61 56 PCA component 3 15 10 8 3 0.4 High 3.0 Short PCA component 1 46 44 40 37 32 30 26 22 18 0.5 2.5 2.0 1.5 1.2 1.0 0.9 0.8 0.7 Low 0.6 Schmidt et al., Cancer Res. 68(13):5405-13, 2008 Estrogen receptor metagene 0.5 0.4 B-cell metagene Percent survival Mainz Proliferation MainzFast cohort 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 B-cell Metagene high B-cell Metagene low p = 0.006 hazard ratio = 0.259 95% CI of ratio = 0.173-0.75 N=200 0 50 150 100 200 Confirmation of results in independent cohorts Influence of the B-cell metagene in the training cohort 250 MFI (month) Percent survival Rotterdam Fast Proliferation Rotterdam cohort 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 B-cell Metagene high B-cell Metagene low p = 0.005 hazard ratio = 0.3691 95% CI of ratio = 0.279-0.799 N=286 0 150 100 50 Influence of the B-cell metagene in two independent validation cohorts 200 MFI Percent survival TRANSBIG Fastcohort Proliferation TRANSBIG 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 B-cell Metagene high B-cell Metagene low p = 0.0005 hazard ratio = 0.317 95% CI of ratio = 0.218-0.651 N=309 0 50 100 150 MFI 200 250 Schmidt et al., Cancer Res. 68(13):5405-13, 2008 Tanner et al., J Clin Oncol. 10:4317-23, 2007 Organisationsprinzip der Zelle DNA RNA Protein Growth factors (neuregulins) Stress HER-2 Ras-GTP PI 3-kinase Rac1 TRAF6 TAB1 Raf1 PIP3 MEKK1 TAK MEK1/2 PDK1 MKK4/7 MKK3/6 ERK1/2 Akt/ PKB JNK/ SAPK p38 MAPK Cell cycle progression Anti-apoptosis Cell cycle arrest Pro-apoptosis - + Tumor volume HER-2 downregulation in vivo leads to tumor remission Schiffer et al., Cancer Res. 63, 7221-31, 2003 5 HER-2 control 1d 3d 7d marker Tumor volume (cm3) Controls 4 3 2 1 ATc administration β-actin 0 control 1d 3d 7d marker -10 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Days Anhydrotetracycline administration (ATc, 10 mg/kg, daily, s.c.) 0d: 0.85 cm3 2d: 0.4 cm3 4d: 0.1 cm3 7d: 0.03 cm3 Growth factors (neuregulins) Stress HER-2 Ras-GTP PI 3-kinase Rac1 TRAF6 TAB1 Raf1 PIP3 MEKK1 TAK MEK1/2 PDK1 MKK4/7 MKK3/6 ERK1/2 Akt/ PKB JNK/ SAPK p38 MAPK Cell cycle progression Anti-apoptosis Cell cycle arrest Pro-apoptosis - + Tumor volume Modelling of cell fate decisions on the single cell level Signalling network constellations determine whether to proliferate or to differentiate Stimulation of PC-12 cells with NGF or EGF Differentiation Proliferation Santos, Verveer, Bastiaens, Nat Cell Biol. 2007 Mar;9(3):324-30. Modelling of cell fate decisions on the single cell level Signalling network constellations determine whether to proliferate or to differentiate Stimulation of PC-12 cells with NGF or EGF RTKi EGF/ NGF RTKa Santos, Verveer, Bastiaens, Nat Cell Biol. 2007 Mar;9(3):324-30. Modelling of cell fate decisions on the single cell level Signalling network constellations determine whether to proliferate or to differentiate Stimulation of PC-12 cells with NGF or EGF EGF (5 min) -0.53 NGF (5 min) 0.25 → Distinct dynamics of Erk activation can be explained by differences in network wiring Santos, Verveer, Bastiaens, Nat Cell Biol. 2007 Mar;9(3):324-30. Organisationsprinzip der Zelle DNA RNA Protein
