Correlation between anti-Chlamydophila antibodies and fertility in
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3. Arbeitstagung des nationalen veterinärmedizinischen Referenzlabors für Psittakose „Chlamydieninfektionen der Nutztiere - Diagnostik, Pathogenese und zoonotische Aspekte“ 13. bis 14. Oktober 2005 Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Standort Jena Naumburger Str. 96 a, 07743 Jena Programm Eberhard Straube, Jürgen Rödel, Hans Peter Saluz (Jena) Pathogenetische Mechanismen bei der Infektion mit Chlamydien Stefanie Göllner, Evelyn Schubert, Hans Peter Saluz, Konrad Sachse (Jena) Molekulare Mechanismen beim Übergang von Chlamydophila psittaci in den persistenten Zustand Gernot Walder, Helmut Hotzel, Walter Gritsch, Franz Ploner, Christoph Brezinka, Manfred P. Dierich (Innsbruck, Jena) Septikämie während der Schwangerschaft verursacht durch Chlamydophila abortus: Eine Herausforderung an Diagnose und Therapie Daisy Vanrompay (Gent) Do we know the real impact of Chlamydophila psittaci infections in the turkey industry and is there hope for the future control of chlamydiosis? Wolfgang Gaede, Barbara Dresenkamp, Susanne Kenklies, Ulrich Noack, Hanna Oppermann, Tilman Kühn, Christine Ludwig, Helmut Hotzel, Konrad Sachse (Stendal, Magdeburg, Bad Langensalza, Jena) Bericht über einen Ornithoseausbruch in Sachsen-Anhalt und Thüringen Brigitte M. Bönner, Tom Geens, Daisy Vanrompay, Erhardt F. Kaleta (Gießen, Gent) Isolation von Chlamydophila psittaci aus einem Pekingentenbestand Andreas Pospischil, Patrick Späni, Rudolf Thoma, Roseline Weilenmann, Dieter R. Zimmermann, Enrico Brugnera, Lloyd Vaughan, Nicole Borel (Zürich, Chur) La psittacose, si elle existe elle est partout Junbae Jee, Prashanth K. Jayanna, Chengming Wang, Teayoun Kim, Bernhard Kaltenböck (Auburn) Correlation between anti-Chlamydophila antibodies and fertility in heifers challenged with Chlamydophila abortus Jens Böttcher, M. Afify, A. Vossen, M. Alex, A. Gangl (Poing) Untersuchungen zur Verbreitung der Chlamydieninfektionen bei Wiederkäuern in Bayern Claudia Schröder, Julia Jäger, Rüdiger Bachmann, Falk Melzer, Evelyn Schubert, M. Rothe, Petra Reinhold (Jena, Berlin) Nachweis von Entzündungsmarkern in den Lungen von Kälbern mit klinisch inapparenten Chlamydien-Infektionen 1 Carolin Uhe, Yihang Li, Konrad Sachse, Hans-Robert Hehnen, Bernhard Kaltenböck (Auburn, Jena, Köln) Therapeutic vaccination against Chlamydophila abortus/pecorum reduces subclinical mastitis in dairy cows Hans-Heinrich Zehle (Stendal) Erfahrungen mit dem Einsatz bestandsspezifischer Vakzinen gegen Chlamydien-Erkrankungen beim Rind Levente Szeredi (Budapest) Vorkommen von Chlamydien und anderen Infektionen als Abortursachen bei Schafen und Ziegen in Ungarn (1998-2005) Martin Runge, A. Binder, U. Schotte, M. v. Keyserlingk, M. Andrzejewski, A. Hamann-Thölken, Martin Ganter (Hannover, Munster) Die Bedeutung von Chlamydien als Aborterreger in niedersächsischen Schafbeständen Dirk Theegarten, Olaf Anhenn, Britta Mentrup, Kerstin Fey, Helmut Hotzel, Konrad Sachse (Bochum, Gießen, Jena) Nachweis von Chlamydophila spp. bei Pferden mit und ohne Recurrent Airway Obstruction Konrad Sachse, Helmut Hotzel, Peter Slickers, Ralf Ehricht (Jena) Nachweis und Identifizierung von Chlamydien mittels DNA-Mikroarraytechnik Christoph Goetz ,Christoph. Egli, Peter Mauderli, Christian Schelp (Wörrstadt, Bern) CHECKIT CHLAMYDIA - ein hervorragend geeignetes Diagnostikum zur Überwachung und Bekämpfung der Chlamydiose bei Ruminanten Wolfgang Hollberg, Jürgen Apel, Wilfried Adams, Peter Heimberg, Konrad Sachse, Helmut Hotzel, Johannes Winkelmann (Münster, Jena) Prävalenz häufiger Erreger von Atemwegserkrankungen bei 0 bis 8 Wochen alten Kälbern in NRW Lothar H. Wieler, Marion Pollmann (Berlin) Bedeutung von Chlamydieninfektionen beim Schwein Petra Reinhold, Annelie Langenberg, Konrad Sachse (Jena) Experimentell induzierte Infektion mit Chlamydia suis beim Schwein: Pathophysiologische Konsequenzen für die Sauerstoffversorgung des Organismus Komkrich Teankum, Andreas Pospischil, Fredi Janett, Lloyd Vaughan, Enrico Brugnera, Esther Bürgi, Louis Corboz, Roseline Weilenmann, Carmen Kaiser, Dieter Zimmermann, Nicole Borel (Zürich) Prävalenz von Chlamydien in männlichen Geschlechtsapparaten und Ejakulaten von Schweinen und Wiederkäuern Olaf Anhenn, Matthias Sczesny, Ilka Monaca, Dirk Theegarten (Bochum) Experimentelle Chlamydieninfektion humaner Lungenschnitte zur Validierung des zoonotischen Potenzials Julia Jäger, Rüdiger Bachmann, Falk Melzer, Evelyn Schubert, Konrad Sachse, Petra Reinhold (Jena) Konsequenzen einer klinisch inapparenten Chlamydien-Infektion auf die Lungenfunktion von Schweinen und Kälbern 2 Pathogenetische Mechanismen bei der Infektion mit Chlamydien Eberhard Straube1, Jürgen Rödel1 und Hans-Peter Saluz2 1 Friedrich-Schiller-Universität Jena, Institut für Medizinische Mikrobiologie Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie - Hans-Knöll-Institut, Jena 2 Die sich ständig vergrößernde Familie der Chlamydien enthält drei humanpathogene Spezies mit gesicherter epidemiologischer Bedeutung: Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae und Chlamydophila psittaci. Die größte Verbreitung hat, wenn seroepidemiologische Daten zugrunde gelegt werden, C. pneumoniae. Nachdem aber der Anteil der durch C. pneumoniae verursachten ambulant erworbenen Pneumonien weniger als 2 % ausmacht, ein Zusammenhang mit chronisch obsruktiver Lungenerkrankung wie auch der Zusammenhang mit der Atherosklerose und der koronaren Herzkrankheit als noch nicht gesichert angesehen werden müssen, ist C. pneumoniae zur Zeit ein Krankheitserreger ohne klares Krankheitsbild. Dem gegenüber können Chlamydia trachomatis mehrere klar definierte Krankheitsentitäten mit zum Teil sehr ähnlichen Pathomechanismen zugeordnet werden. Diese sind das Trachom, verursacht durch die Serotypen A, B und C, okulo-genitale Infektionen durch die Serotypen D K, die vorwiegend sexuell übertragen werden, und schließlich das Lymphogranuloma venereum, das bislang als Tropenkrankheit galt, jetzt aber mit einer Epidemie unter HIVInfizierten auch nach Deutschland gekommen ist. Chlamydien sind obligat intrazelluläre Parasiten. Sie weisen einen Entwicklungszyklus auf, der extrazelluläre und metabolisch nicht aktive Formen, die infektiösen Elementarkörperchen, und eine intrazelluläre metabolisch aktive Form, die Retikularkörperchen, einschließt. Daneben sind intrazelluläre Formen mit nur geringer metabolischer Aktivität bekannt geworden, die offensichtlich zur Persistenz der Infektion beitragen können. Wichtige Strategien, die den Chlamydien das Überleben im Wirt sichern, bestehen zunächst in der Fähigkeit, der unspezifischen wie auch der spezifischen Abwehr des Wirtes zu entkommen. Die obligat intrazelluläre Lebensweise ist dafür eine wesentliche Voraussetzung. Des Weiteren können Chlamydien ihre Wirtszellen insbesondere hinsichtlich der Proliferation modulieren. Schließlich haben Chlamydien Pathomechanismen entwickelt, die ihnen ein lang dauerndes Überleben in der Wirtszelle sichern, indem sie diese Zellen am Sterben hindern. Die Adhäsion der Elementarkörperchen wird durch das outer membrane protein 1 (OMP1) vermittelt, das am N-terminalen Ende das Protein Pmp D besitzt, das verschiedene Rezeptoren der Wirtszelle erkennt. Dabei handelt es sich vorwiegend um sulfatierte Polyanionen und unter anderem um einen Östrogenrezeptorkomplex. Die Adhäsion der Elementarkörperchen kann durch Lektine, wie α-D-Mannose oder N-acetyl-D-Glucosamin gehemmt werden. Die Zeit für den Vermehrungszyklus von Chlamydia trachomatis wird meistens mit 36 bis 48 Stunden, für Chlamydia pneumoniae bis 72 Stunden angegeben. Diese Angabe trifft aber offensichtlich nur für bestimmte Zellkulturen zu, in denen sich die Chlamydien weitgehend ungehindert vermehren können. Werden jedoch Gewebe betrachtet, die von Chlamydieninfektionen betroffen sind, scheint sich der Vermehrungszyklus deutlich zu verlängern. Einer der Gründe dafür könnte in der Expressionssteigerung für Interferon-ß sein. Interferon-ß bewirkt eine Induktion von Indolamin 2,3-Dioxygenase, was zu einer Depletion von intrazellulärem Tryptophan und damit zu einer Teilungshemmung der Retikularkörperchen in der Zelle führt. Die Retikularkörperchen nehmen dabei ein Vielfaches ihrer normalen Größe an und sind möglicherweise metabolisch weniger aktiv. Ein solcher Effekt lässt sich auch durch die Zugabe von Interferon zur Kultur erreichen. 3 Neben IFN-β und IDO wird unter anderem auch die Expression von Wachstumsfaktoren, wie dem basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) oder IL-6 von Zellen mit aktiver Chlamydieninfektion gesteigert. Dies könnte zur Proliferation von Zellen infizierter Gewebe führen. Antigene intrazelluläre Erreger werden üblicherweise von der infizierten Wirtszelle mit Hilfe von HLA-Antigenen an der Zellmembran präsentiert. Professionelle Phagozyten verwenden dabei vorzugsweise das HLA II-Antigen, während andere Zellen Fremdantigen eher mit dem HLA IAntigen präsentieren, das gleichzeitig einen Rezeptor für zytotoxische T-Lymphozyten bildet. Durch eine von den Chlamydien in das Zytosol der Wirtszelle sezernierte Protease (CPAF) werden sowohl Transkriptionsfaktoren, die bei der Regulation der Expression von HLA I als auch von HLA II eine Rolle spielen, inaktiviert. Damit wird die Präsentation von Chlamydienantigenen durch HLA II unterbunden. Die Expression von HLA I wird jedoch durch das von infizierten Zellen freigesetzte IFN-ß wieder erhöht. Damit kann die Wirtszelle weiterhin Chlamydienantigene präsentieren und setzt sich somit dem Angriff zytotoxischer T-Zellen aus. Die durch zytotoxische T-Zellen induzierte Apoptose involviert unter anderem Caspase 8. In mit Chlamydien infizierten Zellen ist bereits unabhängig von der Anwesenheit zytotoxischer TZellen eine Aktivierung von Caspase 8 nachzuweisen. Demzufolge müssten solche Zellen unmittelbar nach der Infektion in die Apoptose gehen. Demgegenüber wird aber eine Resistenz solcher Zellen gegen Apoptoseinduktoren, wie Staurosporin beobachtet. Der Grund für diese Apoptoseresistenz von chlamydieninfizierten Zellen liegt wahrscheinlich in einem Protein, das Caspase 8 bindet und diese offensichtlich inaktivieren kann. Der Nachweis dieses Proteins gelingt mit einem Antikörper gegen einen bekannten Caspase-8-Inhibitor des Vaccinia Virus. Es handelt sich dabei wahrscheinlich um ein Protein das durch das Gen CpB0546 codiert wird. Ähnliche Nukleotidsequenzen konnten aber nicht nur bei C. pneumoniae, sondern auch bei C. trachomatis gefunden werden. Dadurch kann die durch mangelhafte Unterdrückung der Antigenpräsentation weiterhin wirksame Vernichtung der Wirtszelle durch zytotoxische T-Zellen unterlaufen werden. Möglicherweise verwirklichen Chlamydien hier einen Pathomechanismus, der von verschiedenen intrazellulären Parasiten benutzt wird. Daneben wurden chlamydienspezifische Inhibitoren der Apoptose beschrieben, die eine Reduktion der Cytochrom C-Freisetzung aus den Mitochondrien in infizierten Zellen bewirken. Chlamydien sind demnach hochgradig angepasste intrazelluläre Parasiten, die der Immunabwehr entweichen und durch Modulation der Proliferation ihrer Wirtszelle, durch Modulation der Antigenpräsentation und durch Modulation der Apoptose ihrer Wirtszelle ihr eigenes Überleben zu sichern verstehen. Molekulare Mechanismen beim Übergang von Chlamydophila psittaci in den persistenten Zustand Stefanie Göllner1, Evelyn Schubert1, Helmut Hotzel1, Hans Peter Saluz2 und Konrad Sachse1 1 Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Standort Jena Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie - Hans-Knöll-Institut, Jena 2 Chlamydien sind neben dem Durchlaufen des akuten Entwicklungszyklus in der Lage, auf intrazelluläre Umweltveränderungen wie Mangel an Nährstoffen (z.B. spezielle Aminosäuren, Eisen), Gabe von Antibiotika oder Freisetzung von Cytokinen (z.B. Interferon-γ, TNF-α) mit der Etablierung einer veränderten morphologischen Form, dem Persistenzstadium, zu reagieren. Dieser Persistenzzustand kann den Ausgangspunkt für die Etablierung einer Langzeitbeziehung mit dem Wirt darstellen, was zu chronischen Erkrankungen wie z.B. reaktiver Arthritis, Trachom 4 oder PID führen kann. Für Chlamydia trachomatis und Chlamydophila pneumoniae konnte bereits gezeigt werden, dass diese persistenten, aberranten Chlamydienformen ein differentielles Genexpressionsmuster im Vergleich zu den akuten Formen aufweisen. Für die Spezies Chlamydophila (Cp.) psittaci, welche speziell als Zoonose-Erreger von großer Bedeutung ist, existieren noch keine Daten hinsichtlich der Genexpressionsänderungen im Persistenzzustand. Ziel dieser Studie war es deshalb, Genexpressionsunterschiede zwischen akuter und persistenter Cp.-psittaci-Infektion zu untersuchen, um einen genaueren Einblick in molekulare Mechanismen während der Persistenzetablierung zu erhalten. HEp2-Zellen wurden mit Cp. psittaci DC15 (MOI 1) infiziert und jeweils mit IFN- γ (20 ng/ml), DAM (150 µM) oder Penicillin G (200 U/ml) behandelt, um Persistenz zu induzieren. Eine unbehandelte akute Infektion diente als Kontrolle. Nach 12, 24, 36 und 48 h wurde Total-RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Es wurden 27 chlamydiale Gene ausgewählt, welche im wesentlichen für Proteine der Funktionsklassen Membranproteine, Stress-Response, transkriptionelle Regulation und RB-EB-Differenzierung codieren und deren transkriptionelle Regulation mittels quantitativer Real-Time-PCR (RTQ-PCR) untersucht. Die RTQ-PCR Experimente zeigten ab 24h p.i. eine verstärkte Herunterregulation verschiedener Gentranskripte für Membranproteine (omcB, omcA, pomp´s), Sigma-Faktoren (sigA, sig28, sig54), Zellteilungsproteine (ftsW) sowie Differenzierungsproteine (atoC, atoS) in allen drei Persistenzmodellen, was bis 48h p.i. (Ende des akuten Cp. psittaci DC15 Entwicklungszyklus) aufrechterhalten wurde. Weiterhin war für den Persistenzzustand in allen drei Persistenzmodellen eine Herunterregulierung des Gentranskripts für das chlamydiale CADD (Chlamydia Protein Associating with Death Domains) zum 48h p.i. Zeitpunkt charakteristisch, was für das Bestreben der aberranten, persistenten Chlamydien sprechen würde, in der Wirtszelle zu verbleiben. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass eine Herunterregulation von Gentranskripten für RB-EB-Differenzierungsproteine, Membranproteine, der drei chlamydialen Sigma-Faktoren sowie eines Apoptose-assoziierten Proteins mit der Ausbildung und Aufrechterhaltung des persistenten Zustandes einhergehen, was dafür spricht, dass der Persistenzzustand eine Art Überdauerungszustand der Chlamydien darstellt, wobei die aberranten Chlamydien keine Zellteilung durchlaufen jedoch metabolisch aktiv bleiben. Septikämie während der Schwangerschaft verursacht durch Chlamydophila abortus: Eine Herausforderung an Diagnose und Therapie Gernot Walder1, Helmut Hotzel2, Walter Gritsch1, Franz Ploner1, Christoph Brezinka1 und Manfrad P. Dierich1 1 Medizinische Universität Innsbruck, Dep. für Hygiene, Mikrobiologie und Sozialmedizin Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Standort Jena 2 Chlamydophila (C.) abortus ist bekannt als auslösendes Agens von Aborten bei Wiederkäuern (enzootischer Schafabort). In Verbindung mit Infektionsgeschehen bei Schafen wurde in den letzten Jahren auch über mehrere Erkrankungen bei Schwangeren berichtet, die Fehlgeburten verursachten. Eine 32-jährige Schwangere wurde mit hohem Fieber in ein Krankenhaus eingewiesen. Laboruntersuchungen konnten keine Ursache dafür feststellen. Trotz Antibiotikagabe 5 verschlechterte sich ihr Zustand. Es kam zum Abort und die Verlegung auf die Intensivstation mit künstlicher Beatmung wegen einer progressiven Septikämie, Schock und beginnendem Multiorganversagen machte sich erforderlich. Bis zu diesem Zeitpunkt konnte keine mikrobiologische Ursache der Septikämie identifiziert werden. Blutkulturen blieben steril und Vaginalabstriche brachten keinen Hinweis auf eine Infektion mit Bakterien, Ureaplasmen oder Mykoplasmen. Auch serologische Tests auf Chlamydia trachomatis und C. psittaci blieben ohne Ergebnis. Positiv fiel der Chlamydiennachweis bei Verwendung von DNA-Extrakt aus dem Serum mittels real-time-PCR aus. Daraufhin wurde die Patientin mit Chlarithromycin behandelt. Der Zustand besserte sich und die künstliche Beatmung konnte nach 12 Tagen beendet werden. Nach 21 Tagen wurde sie gesund nach Hause entlassen. Die Patientin berichtete vom Kontakt mit Abortmaterial von Ziegen auf ihrem Bauernhof während ihrer Schwangerschaft. In der Ziegenherde von etwa 60 Tieren hatten mehrere Ziegen verlammt. Von den Ziegen wurden Vaginalabstriche genommen, ebenso wurden verschiedene Organe abortierter Ziegenfeten untersucht. Amplifiziert und sequenziert wurde ein ca. 400 bp langer Bereich des ompA-Gens von Chlamydien. Dabei stellte sich heraus, dass bei den Ziegen sowohl C. psittaci als auch C. abortus vorkamen. In den Organen wurde ausschließlich C. abortus festgestellt. Auch im Patientenserum und im Fetus wurde dieser Keim gefunden. Beim Vergleich der DNA-Sequenzen wurde vollständige Übereinstimmung der C.-abortusStämme unterschiedlicher Herkunft festgestellt. Als Ursprung der C.-abortus-Infektion wurde der Zukauf eines Bockes vermutet. Auch bei ihm sowie zwei männlichen Nachkommen konnte C. abortus gefunden werden. Durch natürliche Besamung wurde die Ziegenherde infiziert, was zu den vorher nicht vorkommenden Aborten führte. Die jungen Böcke wurden durch den Deckakt infiziert. Die Schwangere infizierte sich trotz Warnung des Tierarztes durch Kontakt mit dem Abortmaterial. Do we know the real impact of Chlamydophila psittaci infections in the turkey industry and is there hope for the future control of chlamydiosis? Daisy Vanrompay Ghent University, Department of Molecular Biotechnology, Faculty of Bioscience Engineering Since 1950, economical devastating chlamydiosis outbreaks in turkey farms have been reported in the USA, acknowledging Chlamydophila psittaci as an important respiratory pathogen. Yet, although infections are endemic in Belgium and Germany, the significance of this primary pathogen is still controversial in Europe. This is perhaps not surprising as diagnosis of infection with this obligate intracellular bacterium is difficult and handling of this zoonotic agent requires special biohazard laboratory conditions. Current vaccines and/or vaccination strategies are apparently unable to provide a definitive preventive solution for respiratory distress in commercial turkey farms. Management failures as well as possible pathogenic interplays between viral and bacterial pathogens are involved in this multi-factorial disease complex. This encouraged us to study the co-occurrence and possible pathogenic interactions of the avian pneumovirus (APV), Ornithobacterium rhinotracheale (ORT), M. gallisepticum, M. meleagridis and Cp. psittaci in the field. At slaughter, analyses of 200 turkey sera and pharyngeal swabs from 8 Belgian and 2 Northern-France farms, which experienced respiratory problems in the past, pinpointed Cp. psittaci (94%; all farms), APV (34%; 7 out of 10 farms) and ORT (6.5%; 5 out of 10 farms) as major respiratory pathogens on 6 Belgian turkey farms, whereas mycoplasma was absent. Results of the kinetics of APV, ORT and Cp. psittaci infections on Belgian farms from production onset until slaughter suggested a pathogenic interplay between all three pathogens and indicated the multi-factorial aetiology of respiratory infections in commercial turkeys. Therefore, APV, ORT, as well as Cp. psittaci should be taken into account when developing preventive strategies for respiratory disease. Furthermore, we clearly indicated that Cp. psittaci infections could occur at an early age notwithstanding the presence of maternal antibodies, without the need of predisposing pathogens. Moreover, Cp. psittaci infections on their own might act as a predisposing factor, for other bacterial or viral respiratory pathogens. To improve our understanding of the turkey respiratory disease complex, pathogenic interactions between Cp. psittaci and either E. coli or APV were further examined by means of dual infection experiments in specific pathogen free turkeys. E. coli is also believed to be an important respiratory pathogen in poultry. In the past, reports indicated that superimposed E. coli infections aggravate APV, ORT and Mycoplasma meleagridis infection. Until now, Cp. psittaci was always kept out of the picture during pathogenic interaction studies. Overall, experimental setups clearly demonstrate that Cp. psittaci infections contribute to the stress caused by the respiratory disease complex in turkeys, as the outcome of superimposed APV or E. coli infections was more pathogenic than in turkeys infected with either pathogen alone. As turkeys can become infected within the first week of age, active immunisation of young chicks is required and future Cp. psittaci vaccines should be able to overcome an immature immune system as well as maternal antibody inhibition. Hence, the influence of maternal antibodies on successful vaccination with the eukaryotic expression vector pcDNA1::MOMP and protection against a Cp. psittaci challenge was assessed. Early prime-boost MOMP-based DNA vaccination was capable of circumventing the influence of maternal antibodies and protected turkey chicks against Cp. psittaci infection. Although maternal antibodies affected the vaccineinduced antibody responses, neither the induction of vaccine-specific T cell responses nor protection in turkey chicks was affected. Results clearly indicated that priming with DNA is essential to obtain protective immunity. Yet, a significant protection was also observed in turkeys, primed with DNA and receiving recombinant MOMP as booster vaccine. In conclusion, we clearly demonstrate the multi-factorial aetiology of respiratory infections in turkeys, including APV, ORT and Cp. psittaci as important respiratory pathogens. Cp. psittaci infections contribute to the stress caused by the respiratory disease complex in turkeys, as the outcome of superimposed APV or E. coli infections was more pathogenic than infections with either pathogen alone. Next, the effectiveness of prime-boost DNA vaccination and DNA priming and rMOMP boosting to significantly reduce clinical signs, lesions and chlamydial excretion was demonstrated. Importantly, maternal antibodies did not reduce the protective potential of the DNA vaccines. Bericht über einen Ornithoseausbruch in Sachsen-Anhalt und Thüringen Wolfgang Gaede1, Barbara Dresenkamp1, Susanne Kenklies1, Ulrich Noack1, Oppermann2, Tilman Kühn3, Christine Ludwig3, Helmut Hotzel4 und Konrad Sachse4 Hanna 1 Landesamtes für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich Veterinärmedizin, Stendal Landesamtes für Verbraucherschutz Sachsen-Anhalt, Fachbereich Hygiene, Magdeburg 3 Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz, Abt. Veterinäruntersuchung, Bad Langensalza 4 Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Standort Jena 2 7 Prolog Am Nachmittag des 2. Juni 2005 (Donnerstag) wurden durch das Veterinäramt Mansfelder Land in Stendal telefonisch die Möglichkeit zur Mykoplasmosediagnostik bei Geflügel abgefragt und die Einsendung von zur Diagnostik getötetem Geflügel für denselben Tag vereinbart. Um 18.30 Uhr wurden durch einen Geflügelzüchter und -händler aus dem Landkreis Sangerhausen 4 Hühner und 2 Enten seines Bestandes sowie 10 Küken eines benachbarten Kontaktbestandes eingeliefert. Dabei teilte der Händler mit, dass bei 4 Kontaktpersonen dieser Bestände grippeähnliche Erkrankungen aufgetreten waren. Diese sollten eine schwere Pneumonie des Amtstierarztes einschließen, der kurz zuvor die Haltungsbedingungen des bis dahin nicht registrierten Bestandes kontrolliert hatte. Untersuchungen im Herkunftsbestand und im ersten Kontaktbestand Umgehend am Abend des 2. Juni 2005 wurde von 20-22 Uhr die Sektion der eingesandten Tier durchgeführt. Dabei erhärtete sich der Verdacht auf Mykoplasmeninfektion durch ausgeprägte Eulenköpfigkeit und Polyserositiden insbesondere bei den Küken aus dem Kontaktbestand. Um noch vor dem bevorstehenden Wochenende die Diagnose hinsichtlich des Zoonoseverdachts sowie der massiven Veränderungen bei den untersuchten Tieren klären zu können, erfolgte noch in der Nacht die Einleitung der molekularbiologischen Untersuchungen auf Influenza A, Chlamydien, Newcastle-Disease und Mykoplasmen. Im Ergebnis dieser Untersuchungen konnte für beide Bestände am Freitag um ca. 11Uhr das Vorliegen einer Chlamydieninfektion sowie einer massiven Infektion mit Mycoplasma gallisepticum nachgewiesen werden. Klassische und atypische Geflügelpest konnten ausgeschlossen werden. Die Meldung an die Veterinärbehörden erfolgte umgehend. Epidemiologische Untersuchungen und veterinärrechtliche Maßnahmen Noch während der Absicherung der Diagnose erfolgte am Freitag, dem 3. Juni 2005, die gemeinsame Inspektion beider Bestände durch den Tierseuchenbekämpfungsdienst des LAV und des Veterinäramtes. Dabei wurde für den Händlerbestand eine Größe von 400 Legehennen, 400 Enten und 70 Gänsen ermittelt. Der Kontaktbestand wies bei einer Größe von 400 Tieren eine erhebliche Belegungsdichte auf. Zahlreiche Tiere kümmerten und zeigten respiratorische Symptome. Die Besitzerin berichtete über erhebliche Verluste innerhalb der letzten 14 Tage. Durch den Tierseuchenbekämpfungsdienst wurden weitere 31 Proben (Tupfer) zur Diagnostik entnommen. Infolge des Fehlens jeglicher systematischer Bestandsdokumentation beim Händler waren weitere Kontaktbetriebe nicht zu ermitteln. Da sich durch mehrere erkrankte Personen die Gefahr des Vorliegens eines hoch humanpathogenen Chlamydienstammes andeutete, wurden über Presse und lokalen Rundfunk die Besitzer weiterer Kontaktbestände aufgefordert, sich bei den zuständigen Veterinärämtern zu melden. Bei den daraufhin einsetzenden Umfelduntersuchungen zeichneten sich hohe Nachweisraten für Chlamydien ab. Im Rahmen der Gefahrenabwehr/Zoonosebekämpfung wurde per Erlass des Landwirtschaftsministeriums Sachsen-Anhalt vom 15. Juni angeordnet, dass Kontaktbestände mit Konjunktival-/Rachenkombinationstupfer und Kloakentupfer bzw. Kotprobe zu untersuchen seien. Bei klinischem Ornithoseverdacht oder dem labordiagnostischen Nachweis von Chlamydien oder Ornithoseverdacht bei Kontaktpersonen sollte eine sofortige Bestandstötung durchgeführt werden. 8 Die Umfelduntersuchungen ergaben für Sachsen-Anhalt die in der Tabelle dargestellten Ergebnisse. 65 der positiven Bestände waren zum 22. Juni bereits getötet worden. Intervall Landkreis eingegangene Bestände davon positiv % positiv 128 77 60,1 untersuchte Proben davon positiv % positiv 303 120 39,6 1. Untersuchung 7 Landkreise 2. Untersuchung SGH 5 1 20 20 1 5 3. Untersuchung SGH 4 0 0 8 0 0 Epidemiologische Untersuchungen in thüringischen Abnehmerbetrieben Durch die epidemiologischen Erhebungen stellte sich heraus, dass Geflügel auch in Thüringen gehandelt worden war. Analog zur Vorgehensweise in Sachsen-Anhalt wurden mögliche Abnehmer über die Medien aufgefordert, sich bei den zuständigen Veterinär- und Lebensmittelüberwachungsämtern zu melden. Zu ermitteln waren 29 Kontaktbestände in 4 Landkreisen, alles Kleinstbestände mit nichtgewerblicher Nutzung. In 3 Kontaktbeständen waren klinische Symptome einer Ornithose zu erheben. Aus lediglich 2 Kontaktbeständen konnte kein Nachweis einer Chlamydieninfektion geführt werden, aus drei weiteren gelang zwar der molekularbiologische Nachweis der Infektion mit Chlamydia/Chlamydophila spp., eine Zuordnung zur Gattung Chlamydophila psittaci war aber nicht möglich. In allen anderen gelang entweder durch kulturelle und/oder molekulare Methoden der Nachweis der Infektion mit Chlamydophila psittaci. Die Tiere aller Bestände wurden getötet. Erkrankungen bei Kontaktpersonen Zum Zeitpunkt des Nachweises der Ornithose am 3. Juni 2005 befanden sich bereits 4 Personen in stationärer Behandlung, davon einer in intensivmedizinischer Behandlung. Am Nachmittag dieses Tages gab es einen ersten Kontakt zwischen dem Stendaler Untersuchungsamt und dem behandelnden Krankenhaus in Sangerhausen. Der Nachweis von Chlamydophila psittaci bei Geflügel war dabei die erste (indirekte) labordiagnostische Bestätigung für Ornithose als klinische Verdachtsdiagnose. Die Zahl hospitalisierter Patienten mit labordiagnostisch (serologisch) bestätigter Diagnose stieg in der Folgezeit auf 7 an. Die Hauptsymptome waren Erkältung, Schnupfen und Durchfall (1x). In weiteren 11 Fällen wurde Ornithose entsprechend der klinisch-epidemiologischen Falldefinition festgestellt. Erkrankungsherd in der Nordharzregion In der Nordharzregion kam es nahezu zeitgleich zu einer schweren Erkrankung eines Geflügelhalters mit serologischer Bestätigung der Chlamydieninfektion. Bei der Untersuchung von Hühnern dieses und eines weiteren Bestandes konnte Chlamydophila psittaci nachgewiesen werden, jedoch nicht in dem als Quelle vermuteten lokalen Händlerbestand. Ein Zusammenhang mit dem Geschehen südlich des Harzes war epidemiologisch nicht zu ermitteln. Chlamydientypisierung und deren epidemiologische Interpretation Das FLI Jena führte Chlamydientypisierungen mit Geflügelproben aus Sachsen-Anhalt und Thüringen sowie der Lungenspülprobe eines künstlich beatmeten Patienten durch. Die Chlamydienstämme wiesen insgesamt eine hohe Heterogenität auf. In einer Reihe von 9 Geflügelproben aus dem Sangerhäuser Geschehen wie auch in der humanen Spülprobe wurde an Hand der ompA-Sequenz der Stammtyp 6BC festgestellt. Obwohl ein epidemiologischer Zusammenhang zum Geschehen in der Nordharzregion nicht nachweisbar war, konnte in den Geflügelproben aus dieser Region ausschließlich 6BC nachgewiesen werden. Eine Probe zur Erregertypisierung bei dem intensivmedizinisch betreuten Tierhalter war leider nicht zu erhalten. Zusammenfassung Die von dem nicht registrierten Bestand eines Geflügelhändlers ausgehenden Ornithoseerkrankungen zeigen das hohe zoonotische Potenzial aviärer Chlamydien und die Möglichkeit zur schnellen Ausbreitung auf indirektem Wege. Der nachgewiesene Stamm 6BC scheint trotz geringer Pathogenität für Geflügel über eine hohe Humanpathogenität zu verfügen. Die Chlamydientypisierung hat sich als geeignete Methode zur Absicherung von Kausalketten erwiesen. Isolation von Chlamydophila psittaci aus einem Pekingentenbestand Brigitte M. Bönner1, Tom Geens2, Daisy Vanrompay2 und Erhard F. Kaleta1 1 Justus-Liebig-Universität Gießen, Klinik für Vögel, Reptilien, Amphibien und Fische Universität Gent (Belgien), Abteilung Molekulare Biotechnologie 2 Infektionen mit Chlamydophila psittaci verlaufen bei Enten in der Regel subklinisch. Da die Tiere den Erreger jedoch trotzdem ausscheiden können, besteht aufgrund des zoonotischen Potentials dieses Erregers eine Gefahr für die Personen, die im engen Kontakt mit intensiv gehaltenen Enten stehen. Zahlreiche Berichte über Chlamydiosen bei Farm- und Schlachtereipersonal bestätigen dies. Im untersuchten Entenbetrieb sollten Daten zum Infektionsstatus der Enten mit Chlamydien in allen Produktionsstufen erhoben werden. Besonderes Augenmerk lag dabei auf dem Alter und den Haltungsbedingungen der Tiere. Insgesamt wurden 1661 Einzelproben verteilt auf 34 Probenentnahmen unterschiedlicher Größe aus den verschiedenen Zuchtstufen von Pekingenten untersucht. Dabei handelt es sich um Rachentupfer und Organe von Mast- und Zuchtenten sowie um Organe von nicht geschlüpften Küken (so genannte „Steckenbleiber“). Zusätzlich wurden aus epidemiologischen Erwägungen 13 Milzen von im Bereich des Schlachthofes A „vergrämten“ Stadttauben in die Untersuchungen einbezogen. Als Untersuchungsmethode wurde die Erregeranzucht in Zellkulturen mit anschließender Färbung nach Giménez gewählt. Im Laufe der Versuche stellte sich heraus, dass HeLa-Zellen unter DMEM als Erhaltungsmedium deutlich bessere Isolierungsraten als BGM-Zellen unter BME hervorbringen. Der Einfluss des Erhaltungsmediums DMEM scheint dabei auf die Vermehrung ebenso wie die HeLa-Zelllinie eine Rolle zu spielen. Dies lässt den Schluss zu, dass die bei Enten vorkommenden Chlamydophila-psittaci-Serovare möglicherweise spezifische Ansprüche an die zu ihrer Anzucht notwendigen Vermehrungsbedingungen stellen. Insgesamt konnten 83 Proben aus 3 Probenentnahmen von Pekingenten und drei der Taubenmilzen als Chlamydien-positiv bewertet werden. Bei den Chlamydien-positiven Pekingenten handelt es sich zweimal um jeweils eine Herde Mastenten im Alter von sieben Wochen und einmal um eine Herde von Elterntieren im Alter von acht Wochen ohne jegliche klinische Symptome. Weder aus nicht geschlüpften Entenküken noch aus Organ- und 10 Tupfermaterial von erwachsenen Enten im Alter von 12 und mehr Wochen und solchen Proben von Entenküken im Alter bis 6 Wochen gelang eine Anzüchtung von Chlamydien. Die in HeLa-Zellkulturen gewonnen Chlamydienisolate wurden zur genaueren Identifikation mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) untersucht. Alle 83 Isolate von Pekingenten sowie die drei Taubenisolate erwiesen sich dabei als Chlamydia-psittaci-positiv (PCR nach KALTENBÖCK et al., 1991, 1992, 1997). Sechs der Entenisolate und die drei Taubenisolate wurden im Rahmen einer Studie an der Universität Gent (Belgien) sequenziert. Dabei konnten alle Isolate aus den Pekingenten als Chlamydophila psittaci identifiziert und der neu gebildeten Serogruppe E/B zugeordnet werden (GEENS et al., 2004). Die drei Taubenisolate gehören zur Serogruppe B und sind nicht identisch mit den Entenisolaten. La psittacose, si elle existe elle est partout Andreas Pospischil1, Patrick Späni1, Rudolf Thoma2, Roseline Weilenmann1, Dieter R. Zimmermann3, Enrico Brugnera1, Lloyd Vaughan1 und Nicole Borel1 1 Universität Zürich, Institut für Veterinärpathologie Amt für Lebensmittelsicherheit und Tiergesundheit, Chur 3 Institut für klinische Pathologie, Universitätsspital Zürich 2 Im Jahre 2002 konnte über folgenden Fall berichtet werden: Rinderabort auf einem Betrieb im Bündner Oberland (Tabelle 1). Folgende Betriebsanamnese konnte erhoben werden: 1995 bis 1998 jeweils ein Abortfall (Rind) pro Jahr, 1999 und 2000 waren keine Fälle zu verzeichnen. Die Fertilitätsrate der Rinder auf dem Betrieb war unauffällig. Die gleichzeitig gehaltenen Schafe wiesen keine Aborte auf. Tabelle 1: Lage des Betriebes, Tierbestand und Haltung Lage des Betriebes Tierbestand Haltung Bündner Oberland 1300 m. ü.M. 10 Kühe, 20 Rinder (1-2Jahre), 10 Kälber (teils Mast), ca. 30 Schafe, im gleichen Stall wie Rinder, jedoch kein direkter Kontakt Kühe in Anbindehaltung; Jungtiere in Laufstallung Durch die weiteren Untersuchungen mittels Immunhistochemie, PCR (16S rRNA, ompA) und Gensequenzierung konnte Chlamydophila abortus erstmals als Aborterreger beim Rind in der Schweiz (Kanton Graubünden) diagnostiziert werden. Die Zusammenhänge wurden im Auftrag des Bundesamtes für Veterinärwesen mit folgendem Ziel weiter untersucht: Inzidenz von Chlamydien-bedingten Aborten im Kanton Graubünden In den Jahren 2002 bis 2004 wurden 235 Fälle von Spätaborten in Zusammenarbeit mit dem Kantonalen Veterinärbakteriologischen Labor in Chur untersucht. Vor Ort wurde die Auswahl der Fälle getroffen, die Anamnese erhoben und die Betriebsdaten aufgezeichnet. Darüber hinaus erfolgten die gesetzlich vorgeschriebenen Untersuchungen auf Brucella abortus, Coxiella burnetti und IBR-IPV (serologisch). Am Institut für Veterinärpathologie der Universität Zürich (IVPZ) erfolgten weitere Abklärungen: pathologisch-anatomische & histopathologische Untersuchung sowie immunhistologischer Nachweis von Chlamydienantigen unter Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der spezifisch gegen LPS von Chlamydiaceae gerichtet ist. Aus den fixierten Plazentaproben wurde DNA mittels des DNeasy Tissue Kit (Fa. Quiagen) 11 extrahiert werden, die dann mittels PCR aufgearbeitet wurde. Folgende Primer fanden Verwendung: 16S rRNA PCR 298bp (Everett et al., 1999, modified) und InterGenicSpacerShort (IGS-S) rRNA PCR 352bp, (Primerpaar: 1f and 2r). Die PCR Produkte wurden anschliessend sequenziert. Bei der histopathologischen Untersuchung fand sich in 22/235 Fällen in der Plazenta eine ausgeprägte eitrig-nekrotisierende Plazentitis und Vaskulitis (Tabelle 2). Immunhistologisch konnte in 1/235 Fällen eindeutig Chlamydienantigen nachgewiesen werden, in 8/235 war der Nachweis fraglich (Tabelle 2). In der PCR ergab sich in 164/235 (16S) bzw. in 43/235 (IGS) Fällen eine Bande (Tabelle 2). Die Sequenzierung der 16S PCR Produkte gelang in 62/164 Fällen, davon ergab sich in 12 Fällen Cp. abortus/Cp. psittaci und in 40 Fällen „uncultured Chlamydiales“. Ein Teil der als Cp. abortus/Cp. psittaci identifizierten Fälle wiesen eine eitrignekrotisierende Plazentitis und Vaskulitis (n=7, 3%) auf. Tabelle 2: Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung, des immunhistologischen Nachweises von Chlamydienantigen und der genomischen Diagnose von Chlamydien (16S, IGS) bei Spätabort von Rindern in Graubünden. Histopathologie: Plazentitis & Vaskulitis IHC: + +/PCR: 16S IGS-S + Fälle (n = 235) % 22 9.3 1 0.4 8 3.4 164 69.8 43 18.3 Die Untersuchungen lassen folgende Schlüsse zu: • Die PCR-Untersuchung allein reicht nicht zur Diagnose eines Chlamydien-bedingten Abortes beim Rind aus; sie muss durch das Auftreten weiterer morphologischer Befunde abgesichert werden. • Chlamydien-bedingter Spätabort ist mit 3% der Fälle im untersuchten geografischen Raum (Kanton GR) selten, obwohl bei Schafen/Ziegen im gleichen Gebiet überdurchschnittlich hohe Prävalenzen an Cp. abortus Infektionen auftreten. • Die Bedeutung von „uncultured Chlamydiales“ beim Abort des Rindes bedarf weiterer Untersuchungen. Correlation between anti-Chlamydophila antibodies and fertility in heifers challenged with Chlamydophila abortus Junbae Jee, Prashanth K. Jayanna, Chengming Wang, Teayoun Kim, and Bernhard Kaltenboeck Auburn University, College of Veterinary Medicine, Department of Pathobiology (USA) In a previous study (DeGraves et al., 2004, Infect. Immun. 72, 2538) the effects of controlled reinfection with Cp. abortus on the fertility of 30 virgin heifers had been examined. Fifty-three percent of the 52 animals in the herd showed pre-challenge PCR evidence of vaginal Cp. 12 abortus and/or Cp. pecorum infection (DeGraves et al., 2003, J. Clin Microbiol. 41, 1726). All animals had high pre-challenge levels of IgM, IgG, IgG1, and IgG2 serum antibodies against lysed Cp. abortus purified elementary body (EB) antigen. After intrauterine and/or environmental (cohort) challenge with Cp. abortus, 18/30 (60%) heifers were pregnant as determined by rectal palpation 42 days after insemination. A logistic regression model predicted that the uterine Cp. abortus inoculum required to cause infertility is 17-fold higher for heifers with high IgM than for heifers with low pre-challenge anti Cp. abortus IgM. In the present study, we examined the functional correlation of 4 bovine antibody isotypes directed against 5 chlamydial antigens with the fertility outcome of these heifers. IgM, IgG, IgG1, and IgG2 antibody concentrations in pre- and post-challenge sera of the 30 heifers were analyzed in chemiluminescent ELISAs. The antigens tested were lysed Cp. abortus and Cp. pecorum EB antigens, Cp. abortus MOMP variable domain 2 (QLPNVGITQGIV) and 4 (ATALDTSNKFADFLQI) peptides, and Cp. pecorum MOMP variable domain 4 peptide (QATTVDGTNKFA). Lysed EB antigens were coated to microtiter plates by use of alkaline coating buffer, and peptide antigens were synthesized with N-terminal biotin followed by a serine-glycine-serine-glycine spacer and attached to streptavidin-coated plates. Antibodies against chlamydial antigens were detected with alkaline phosphates conjugates of polyclonal sheep anti-bovine Ig isotypes followed by incubation with chemiluminescent AP substrate, and luminescence emitted was read after 10 min with a microplate reader. The degree of cross-reactivity between antigens was determined as the squared correlation coefficient (covariance) by canonical analysis for each pair of antigens using all antibody data (all isotypes of pre-and post-challenge sera). This analysis determined virtual identity in reactivity of the Cp. abortus and Cp. pecorum MOMP VD 4 peptides, 83% cross-reactivity between Cp. abortus and Cp. pecorum EB antigens, less than 53% cross-reactivity between the Cp. abortus MOMP VD 2 peptide and the other antigens, and less than 66% cross-reactivity between any peptide and EB antigen. Covariance between antibody isotypes in antichlamydial antibody levels was determined by use of all antigen data. IgM antibody levels correlated highly with IgG antibodies (83%) and poorly with IgG1 or IgG2. IgG correlated highly with IgG1 (88%), less with IgG2 (51%), and IgG1 correlated poorly with IgG2 (39%). To assess the value of specific ELISA methods for prediction of the fertility outcome of chlamydial infections, dichotomous (high>median/low≤median) pre-challenge and postchallenge antibody data, and the trends of antibody concentrations (post-challenge/prechallenge) were evaluated in 2x2 tables for concordance with pregnancy outcome (yes/no). Of all antigens and antibody isotypes, only IgM antibodies detected by the Cp. abortus EB ELISA consistently and significantly correlated as pre-challenge (high), post-challenge (low), and trend (low) data with pregnancy outcome after the C. abortus challenge. Logistic regression analysis, with and without additional input of Cp. abortus challenge inocula, was used to analyze the predictive power of the linear antibody concentration data. Only Cp. abortus EB-IgM concentrations (pre-challenge, trend) significantly predicted the probability of pregnancy in combination with inoculum data. Data for trends of IgM, IgG, and IgG1 isotypes in the Cp. abortus and Cp. pecorum EB-ELISAs resulted in significant logistic regression models that predicted fertility after Cp. abortus challenge (Figure 1). In summary, these results demonstrate that bovine IgM antibody isotype concentrations against Cp. abortus elementary body antigen relative to the herd median are best suited to predict the fertility outcome before or after known challenge with Cp. abortus. Conversely, the anti-Cp. abortus or Cp. pecorum-EB IgM, IgG, or IgG1 antibody trend (ratio) of consecutive pre- and post-breeding serum samples correlates significantly with Cp. abortus-influenced fertility outcome in cattle. This may be used to study the influence of Cp. abortus infection on bovine herd fertility. 13 Figure 1. Probability of pregnancy (%) associated with trends (post-/pre-challenge) of antiChlamydophila abortus antibody isotypes. Challenge with Cp. abortus by different cervical inoculum doses and/or by cohort contact coincided with a single breeding by artificial insemination. Untersuchungen zur Verbreitung der Chlamydieninfektionen bei Wiederkäuern in Bayern Jens Böttcher, M. Afify, A. Vossen, M. Alex und A. Gangl Tiergesundheitsdienst Bayern e.V., Poing Für die Diagnostik der Chlamydieninfektionen der Rinder steht mittlerweile ein erfreulich breites Spektrum an Testverfahren zur Verfügung. Zu nennen sind auf der Seite des direkten Infektionsnachweises die direkte Anfärbungen, die Immunhistologie, die PCR, die Ei- bzw. Zellkultur und auf der Seite des indirekten Infektionsnachweises die KomplementBindungsreaktion (KBR) und der ELISA. Es war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit die Verbreitung der Chlamydien-Infektionen in bayerischen Rinderbeständen zu ermitteln. Für diese Untersuchung wurden in erster Linie serologische Verfahren herangezogen. Darüber hinaus wurden aber auch Erregernachweise im Rahmen der Sektionen durchgeführt, um diese mit den serologischen Resultaten zu vergleichen. Untersuchung 1: Es wurden 21683 Blutproben von Rindern aus 765 Beständen serologisch mit einem zugelassenen ELISA (CHEKIT-Chlamydia, Bommeli Diagnostics/Idexx) untersucht. Der ELISA wurde entsprechend der Vorgaben des Herstellers durchgeführt. Abweichend hiervon wurden im Sinne einer differenzierten Betrachtung folgende Bewertungen der ELISA-Daten verwendet: OD% ≤ 30% = negativ, 30< OD%≤40% = fraglich, 40<OD%≤75 = +; 75<OD%≤100 14 = ++; 100<OD%≤150 = +++; OD% > 150% = ++++. Die Blutproben verteilten sich entsprechend der jeweiligen Kuhzahlen pro Landkreis proportional auf die Landkreise. Tiere ab einem Alter von 18 Monaten wurden untersucht, es wurden jeweils alle verfügbaren Proben pro Bestand einbezogen. Tabelle 1: Prozentuale Verteilung der serologischen Ergebnisse für die Untersuchung 1 und 2. Proben der Untersuchung 2 wurden mit ELISA und KBR untersucht. ELISA Neg Gbw + ++ +++ ++++ Untersuchung 1 Probenzahl n= 21683 53 10 20 7 6 3 Probenzahl n = 1432 49 9 19 7 7 8 Untersuchung 2 KBR (Endpunkt 50% Hämolyse) neg 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 Probenzahl n = 1432 31 20 28 12 5 4 Für 691 Herden lagen mindestens 5 Blutproben vor. In 75,1% dieser Herden lag mindestens eine +++ oder ++++-Bewertung vor, während der Anteil an Herden mit negativen oder maximal fraglichen Reaktionen nur bei 2,9% lag! Schließlich wurden die Seroprävalenzen in Abhängigkeit der Einzelreaktionsstärke pro Herde analysiert. Die mittlere Herdenprävalenz für Reaktionen (OD%) von mehr als 40% (+ bis ++++) lag bei 39% bei einer Standardabweichung von 20%. Für Reaktionen von mehr als 100% (+++ und ++++) lagen Mittelwert und Standardabweichung bei 9% bzw. 10%. Regionale Unterschiede auf Landkreisebene wurden festgestellt und werden dargestellt. Untersuchung 2: In einer zweiten Untersuchung wurden 1432 Blutproben aus 48 Beständen vergleichend mit der KBR und dem ELISA untersucht. Für die KBR wurden Endpunkttiter bei einer 50%igen Hämolyse ermittelt. KBR und ELISA-Daten zeigten keine Korrelation (r=0,11). Die Verteilung der Einzelproben über die ELISA-Klassen und KBR-Verdünnungen ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Tabelle 2 zeigt darüber hinaus einen Vergleich der Resultate. Es wurden 51,5% der KBR-positiven Proben im ELISA negativ bewertet, während 25,5% der ELISApositiven Proben in der KBR negativ reagierten. Tabelle 2: Gegenüberstellung von KBR und ELISA ELISA negativ/gbw + ++ +++ ++++ Summe Negativ n (%) 332 (74%) 66 (22%) 25 (7%) 19 (10%) 4 (9%) 446 (100%) KBR-Titer 10-20 n (%) 357 (53%) 147 (22%) 48 (7%) 66 (10%) 62 (9%) 680 (100%) ≥ 40 n (%) 151 (49%) 59 (19%) 24 (8%) 21 (7%) 51 (7%) 306 (100%) Summe n 840 272 97 106 117 1432 Die Herdenprävalenzen, die mit dem ELISA als auch mit der KBR ermittelt wurden, zeigten keine Korrelation. Die mittleren Herdenprävalenzen lagen bei Berücksichtigung von +++- und ++++-Reaktionen im ELISA bei 16%, im Falle der KBR lagen sie, bei 21%, wenn Titer ab 40 bei 50%iger Hämolyse berücksichtigt wurden. Den ermittelten hohen Seroprävalenzen stehen Nachweisraten von Erregerantigen bzw. -genomsequenzen in 9% des vorselektierten Sektionsgutes des TGD gegenüber. Eine Differenzierung der Chlamydien mit der PCR steht allerdings noch aus. 15 Zusammenfassung: Chlamydien-Antikörper sind in der bayerischen Rinderpopulation weit verbreitet, diese weite Verbreitung von Antikörpern konnte sowohl mit einem ELISA als auch mit der KBR dargestellt werden. Die Aussagekraft der verwendeten Testsysteme ist kritisch zu hinterfragen, da beide Systeme ein Chlamydophila psittaci-Antigen verwenden, während Chlamydophila abortus beim Rind von Bedeutung ist. Weiterhin werden unterschiedliche Immunglobulinsubklassen mit den verwendeten Testsystemen nachgewiesen. Bisher wurde der ELISA im Vergleich zur KBR als sensitiver eingestuft, die vorliegenden Ergebnisse stehen hierzu im Widerspruch. Allerdings wurde der ELISA während der Untersuchung 1 vom Hersteller umgestellt. Die Untersuchung 2 wurde ausschließlich mit der neuen TMB-Version durchgeführt, Abweichungen zwischen KBR und ELISA, die im Gegensatz zu früheren Beobachtungen stehen, sind möglicherweise auf diese Umstellung zurückzuführen. Diese Arbeit wurde durch den Freistaat Bayern und die bayerische Tierseuchenkasse gefördert. Nachweis von Entzündungsmarkern in den Lungen von Kälbern mit klinisch inapparenten Chlamydien-Infektionen Claudia Schröder, Julia Jäger, Rüdiger Bachmann, Falk Melzer, Evelyn Schubert, M. Rothe* und Petra Reinhold Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Standort Jena * Forschungsinstitut für Lungen- und Thoraxdiagnostik (FILT), Berlin-Buch Aufgabenstellung: Ziel der Untersuchung war es, bei Kälbern mit klinisch inapparenten Chlamydien-Infektionen Entzündungsmarker im Atemkondensat (AKO), im Serum und der broncho-alveolären Lavageflüssigkeit (BALF) nachzuweisen. Studiendesign: Insgesamt wurden 25 klinisch unauffällige Kälber (Alter: 2.-7. Lebensmonat; Körpermasse: 40-158 kg) in die Studie einbezogen. Anhand des Erregernachweises (PCR in Nasentupfer- und Kottupferproben sowie post mortem in Organproben) und der serologischen Befunde (KBR) wurden die Tiere wie folgt eingeteilt: Gr. 1 (n = 12): PCR ausschließlich negativ (Chl-), KBR negativ Gr. 2 (n = 13): mindestens ein PCR-Nachweis pro Tier positiv (Chl+), KBR bei 7/13 Tieren (54 %) positiv. Die Tiere der Gruppe 2 stammten aus Beständen, in denen nach Aussage des Hoftierarztes diverse Chlamydien-assoziierte Tiergesundheitsprobleme auftraten. In Atemkondensat- und Serumproben sowie in der broncho-alveolären Lavageflüssigkeit aller 25 Kälber wurden die Konzentrationen folgender Entzündungsmarker analysiert: 8-Isoprostan, Nitrit, Harnstoff, Ammonium, Gesamtprotein, Metalloproteinasen (MMP-2, MMP-9). Außerdem wurde der pH-Wert des AKO bestimmt. Für statistische Vergleiche zwischen den Gruppen fand der Mann-Whitney-Wilcoxon-Test Anwendung. Ergebnisse 1. AKO: Bei den Kälbern mit positivem Chlamydien-Nachweis (Gruppe 2) war signifikant mehr Atemkondensat zu gewinnen als bei den Tieren der Gruppe 1 (p ≤ 0,001). Die Konzentration der Entzündungsmarker 8-Isoprostan, Nitrit, Harnstoff, Gesamtprotein und der pH-Wert des Atemkondensates zeigten zwischen der Chl- und der Chl+ Kälbergruppe keinen Unterschied (p > 0,05). Die Ammonium-Konzentration im AKO war hingegen bei den Chl+ Tieren signifikant niedriger als bei den Tieren ohne Chlamydien-Nachweis (p ≤ 0,05). 2. Serum: Im peripheren Blut der Tiere aus Gruppe 2 waren signifikant höhere Ammoniumsowie niedrigere Nitrit- und Harnstoff-Konzentrationen zu messen (p ≤ 0,001). 16 3. BALF: Die auffälligsten Unterschiede zwischen den beiden Kälbergruppen wurden in der broncho-alveolären Lavageflüssigkeit beobachtet. Statistisch gesichert wurden geringere Ammonium-, Nitrit- und Harnstoffgehalte (p ≤ 0,01) sowie höhere 8-Isoprostan- (p ≤ 0,05), Gesamtprotein- (p ≤ 0,01) und MMP-2-Konzentrationen (p ≤ 0,001) in der BALF der Tiere mit positivem Chlamydien-Nachweis (Gruppe 2). Schlussfolgerungen: Bei Kälbern, die aus vorberichtlich Chlamydien-positiven Herkunftsbeständen stammten, wurden mittels PCR und/oder KBR chlamydiale Infektionen nachgewiesen. Obwohl die Tiere ohne auffällige klinische Symptome einer respiratorischen Erkrankung waren, konnten noch im Alter von 6 bis 7 Lebensmonaten chronische Entzündungen innerhalb des respiratorischen Systems detektiert werden. Danksagung: Herrn Dr. H.-J. Zentis (praktischer Tierarzt, 52385 Nideggen) sei an dieser Stelle für die Anamnese und Vermittlung der Kälber aus Gruppe 2 gedankt. Therapeutic vaccination against Chlamydophila abortus/pecorum reduces subclinical mastitis in dairy cows Carolin Uhe1, Li, Yihang2, Konrad Sachse3, Hans-Robert Hehnen1, and Bernhard Kaltenboeck2 1 Bayer AG, Bayer AG - Animal Health - OP - BProd, Köln Auburn University, College of Veterinary Medicine Department of Pathobiology (USA) 3 Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Standort Jena 2 Bovine mastitis is the economically most important disease in animal agriculture. Infections with Chlamydophila abortus and Cp. pecorum are ubiquitous in cattle and have been associated with bovine mastitis. The present prospective cohort study examined the influence of Chlamydophila infection detected by PCR on subclinical inflammation of the bovine mammary gland as characterized by elevated somatic cell numbers in milk. Chlamydophila infection and low serum antibody levels against Chlamydophila spp. were significantly associated with bovine subclincal mastitis. Therapeutic immunization with an inactivated Alum-Quil-A-based vaccine of Cp. abortus/Cp. pecorum elementary bodies was used to further examine induction, and vaccinemediated reduction, of mastitis by Chlamydophila infection. Vaccination against Chlamydophila highly significantly reduced milk somatic cell numbers (Figure 1), thus reduced bovine mastitis, and increased antibody levels against Chlamydophila, but did not reduce shedding of Chlamydophila bacteria. Chlamydophila vaccination also resulted in improved relative body condition of dairy cows after 10 weeks. The disease-protective effect was maximal 10 weeks after infection, and lasted for additional 4 weeks. Vaccination with the Chlamydophila vaccine, the mock-vaccine, and an unrelated vaccine against Bovine Viral Diarrhea virus resulted in highly significant transient increase in Chlamydophila shedding in milk, presumably mediated by the vaccine adjuvant. While 53 cows showed highly significantly reduced milk somatic cell numbers, 4 out of 57 Chlamydophila vaccinated cows (7%) showed significantly increased milk somatic cells, demonstrating the potential for vaccine-mediated enhancement of subclinical disease. In summary, this study shows an etiological involvement of the ubiquitous Chlamydophila infections in bovine mastitis, a herd disease of critical importance for the dairy industry. Furthermore, this investigation shows the potential for temporary improvement of chlamydial disease by therapeutic vaccination. Economically highly desirable Chlamydophila vaccination of cattle might serve as testing ground for use of chlamydial vaccines in humans. 17 Figure 1. Effect of Chlamydophila vaccination on milk somatic cell counts (SCC). ● Chlamydophila vaccine, ○ mock vaccine, data were normalized for identical day-0 means of Chlamydophila- and mockvaccinated animals; means ± 95% confidence interval. Chlamydophila-vaccinated cows (vaccine on days 0 and 35) have significantly lower milk SCC than mock-vaccinated cows (p = 0.007 for all combined time points after day 0, repeated measures ANOVA). Erfahrungen mit dem Einsatz bestandsspezifischer Vakzinen gegen ChlamydienErkrankungen beim Rind Hans-Heinrich Zehle Landesamt für Verbraucherschutz Sachsen Anhalt, Fachbereich 4 Veterinärmedizin, Stendal In Deutschland steht derzeit kein kommerzieller, zugelassener Impfstoff gegen ChlamydienInfektionen beim Rind zur Verfügung. Mit einer Kombinations-Vakzine aus Chlamydien- und QFieber-Antigenen („Chlamyvax FQ“, Fa. Merial) konnten per Ausnahmegenehmigung in 3 größeren Rinderbeständen gute Ergebnisse 2002/03 erzielt werden, die auf der vorherigen Arbeitsberatung vorgestellt worden sind. Angeregt durch diese guten Erfahrungen und wegen der Notwendigkeit, gezielt Einfluss zu nehmen auf Chlamydien-Infektionen bei Rindern im Herdenmaßstab, konnten mit erheblichen organisatorischen Aufwand bestandsspezifische Vakzinen erstellt und in 3 Betreiben eingesetzt werden. Zielstellung des Einsatzes der Vakzinen war die Immunisierung in Rinderbeständen zur Vorbeuge und Schadensreduktion besonders in den Komplexen Herdenfruchtbarkeit, Augenund Lungenentzündung, subklinische Mastitiden und Gelenkserkrankungen bei gleichzeitigem Vorliegen von Chlamydien-Infektionen. Nicht vorgesehen war ein Bekämpfungsverfahren i. S. einer Erregereradikation. Material und Methodik Die Untersuchungen erfolgten in 3 spezialisierten Milchproduktionsbetrieben mit jeweils 300 bis 350 SB-Milchkühen. Eine vorherige klare, labordiagnostisch abgesicherte Indikationsstellung war vorausgegangen. Der Impfstoff wurde nach Herstellerangaben (Institut für Hygiene und Tierkrankheiten der Universität Gießen) bei Kälbern oder Kühen bzw. als komplette Bestandsimpfung eingesetzt. Der Grundimmunisierung, 2 x subkutan im Abstand von 3 Wochen, folgten Erinnerungsimpfungen nach 6 Monaten, bei Kälbern nach 4 Monaten. Labordiagnostische Untersuchungen von Blut- und Tupferproben an unserem Hause betrafen Erhebungen zur Impfindikationsstellung, Differential- und begleitenden Diagnostik. Berichtet wird über einen Zeitraum von 2002 bis 2005. Die klinische Bestandssituation sowie die wirtschaftlichen Ergebnisse der Rinderbestände vor und nach Durchführung des Impfstoffeinsatzes wurden miteinander verglichen. 18 Ergebnisse Die klinischen und epidemiologischen Erhebungen vor und nach der Bestandsvakzinierung weisen positive Effekte aus. Da die Haltungsbedingungen (Boxenlaufstall, TMR-Fütterung) konstant blieben, muss die deutliche und messbare Verbesserung der Herdengesundheit und leistung der Vakzinierung zugeschrieben werden. Dies dokumentiert sich besonders in den wichtigen Komplexen: Bestand Effekt Herdenfruchtbarkeit: Aborte Nachgeburtsverhaltungen je Monat Rastzeit, d KB-Index Puerperalstörungen, % Eutergesundheit Mastitis Melkdurchschnitt, kg Milchleistung, % weitere Komplexe Arthritiden Kalb/Monat Keratokonjunktivitis, % Pneumonien, % bei Kühen bei Kälbern Selektionsschlachtungen Kälber, % V. vor 15 21 95 2,4 30 32 22,7 7.400 10 12 8 63 7 R. B. nach vor nach -100 % -86 % 3 10 -20 % -10 % 76 4,4 35 +6 % -7 % -57 % -26 % -20 % -50 % -81 % +12 % +8,6 % -98 % -100 % -74 % -81 % -86 % 34 25 8.485 -6 % +9 % +2 % 8 1 1 40 17 -87 % -100 % -75 % -62 % -59 % vor nach 20 -92 % Zusammenfassend weisen die durchgeführten Untersuchungen darauf hin, dass in Rinderbeständen mit klinischen Erkrankungen und Beteiligung von Chlamydien die eingesetzten bestandsspezifischen Impfstoffe zur klinischen Besserung im Herdenmaßstab und günstigeren Betriebsergebnissen führten. Vorkommen von Chlamydien und anderen Infektionen als Abortursachen bei Schafen und Ziegen in Ungarn (1998-2005) Levente Szeredi Zentralinstitut für Veterinärgesundheitswesen, Budapest, Ungarn Über infektiöse Ursachen von Aborten in Schaf- und Ziegenherden in Ungarn gibt es bisher nur wenige Informationen. Das Ziel dieser retrospektiven Untersuchung war es, das Vorkommen infektiöser Abortursachen bei Schafen und Ziegen zu studieren. 246 Abortfälle bei Schafen und 75 Abortfälle bei Ziegen waren mit verschiedenen diagnostischen Methoden (Histologie, Bakteriologie, Serologie, Immunhistologie) im Zeitraum von Anfang 1998 bis Mitte 2005 untersucht worden. Die Proben stammten von 176 Schaf- bzw. 39 Ziegenherden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengefasst. 19 Schaf Ziege Zahl der Feten Zahl der Herden Zahl der Feten Zahl der Herden (%) (%) (%) (%) 1 (0,4) 1 (0,6) 0 0 Campylobacter jejuni 113 (46) 67 (38) 13 (17) 7 (18) Chlamydophila abortus 5 (2) 5 (3) 1 (1) 1 (2,6) Coxiella burnetii 0 0 2 (3) 1 (2,6) Escherichia coli 1 (0,4) 1 (0,6) 0 0 Leptospira 0 0 1 (1) 1 (2,6) Listeria monocytogenes 1 (0,4) 1 (0,6) 0 0 Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus spp. 2 (0,8) 1 (0,6) 0 0 Streptococcus spp. 1 (0,4) 1 (0,6) 2 (3) 2 (5) 2 (0,8) 2 (1) 0 0 Toxoplasma gondii Goitre 0 0 1 (1) 1 (2,6) Nicht geklärt 120 (48,8) 97 (55) 55 (74) 26 (66,6) Total 246 176 75 39 Bei Schafaborten waren 51% und bei Ziegenaborten 25% der Fälle durch irgendwelche Infektionen bedingt. Vorkommen und Häufigkeit infektiöser Schaf- und Ziegenaborte waren denen in anderen europäischen Ländern ähnlich. Die relativ hohe Zahl der nicht geklärten Abortfälle kann man zum Teil darauf zurückführen, dass in vielen Fällen Plazenta für Laboruntersuchungen nicht mitgeliefert wurde. C. abortus-Infektionen waren die weit häufigste Abortursache sowohl in Schaf- als auch in Ziegenherden. Die durch C. abortus verursachten Abortfälle kamen in den Herden immer in großer Zahl vor. Nekrotische Entzündungen in der Plazenta konnte man schon mit makroskopischen Untersuchungen feststellen. Chlamydien konnten entweder in Plazentaausstrichen mit StampFärbung oder in histologischen Schnitten der Plazenten mit Immunhistologie nachgewiesen werden. Alle anderen Infektionen kamen als Abortursache nur selten vor. Diese lassen sich in zwei Gruppen aufteilen. Zur ersten gehören die obligat pathogenen Erreger (C. jejuni, C. burnetii, Leptospiren, L. monocytogenes, T. gondii). Sie haben meistens eine Anhäufung der Abortfälle in der jeweiligen Herde verursacht. Zur zweiten Gruppe gehören fakultativ pathogene Bakterienarten (E. coli, P. aeruginosa, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), bei denen man meistens nur sporadische Abortfälle in den Herden beobachten konnte. Nach diesen Ergebnissen würde die Bekämpfung des Chlamydophila-Aborts die Einkommen bei Schaf- und Ziegenzucht in Ungarn erheblich vergrößern. Die Bedeutung von Chlamydien als Aborterreger in niedersächsischen Schafbeständen M. Runge1, A. Binder2, U. Schotte2, M. von Keyserlingk1, M. Andrzejewski3, A. HamannThölken4 und M. Ganter3 1 LAVES – Veterinärinstitut Hannover Zentrales Institut des Sanitätsdienstes der Bundeswehr Kiel – Außenstelle Munster 3 Klinik für kleine Klauentiere, Tierärztliche Hochschule Hannover 4 Landwirtschaftskammer Hannover – Schaf- und Ziegengesundheitsdienst 2 Chlamydophila abortus gilt in Deutschland als wichtigster Verursacher infektiöser Aborte bei Schafen. Über die Prävalenz der Chlamydien in niedersächsischen Schafbeständen liegen 20 jedoch keine Daten vor. Neben der Bedeutung als Aborterreger beim Schaf wird Chlamydophila abortus sporadisch auch als Ursache von Aborten und schweren puerperalen Erkrankungen des Menschen beschrieben. Insgesamt wurden 1732 Serumproben von 1714 Schafen aus 95 niedersächsischen Herden mittels Chekit-Chlamydia ELISA (Bommeli Diagnostics, Bern, Schweiz) auf Chlamydienantikörper überprüft. Zudem wurden von einer Wanderschafherde in Südniedersachsen 88 Plazentaproben mittels PCR (McElnea and Cross, 1999) auf Chlamydien-spezifische DNA-Sequenzen untersucht. 261 (15 %) Serumproben wiesen eine positive Antikörperreaktion, 73 (4,2 %) eine fragliche Reaktion auf. Positive und fragliche Antikörperreaktionen wurden in 52 (54 %) Beständen nachgewiesen. Von 23 Herden mit mehr als 300 Mutterschafen waren lediglich 2 frei von Chlamydienantikörpern. In den positiven Beständen betrug die durchschnittliche IntraHerdenprävalenz 0,22±0,14. Zwischen der Abortrate und der Intra-Herdenprävalenz ergab sich eine Korrelation von R2=0,4058 (y=0,9416x). In einer südniedersächsischen Wanderschafherde mit einer hohen Antikörperprävalenz von 33,9 % wurde in Plazentaproben mit der PCR eine Erregerprävalenz von 30,7 % festgestellt. Im Zusammenhang mit Untersuchungen zur Prävalenz von Coxiella burnetii und Toxoplasma gondii und Bewertung der klinischen Symptome war Chlamydophila abortus der bedeutendste Aborterreger in den untersuchten Schafbeständen. Nachweis von Chlamydophila spp. bei Pferden mit und ohne Recurrent Airway Obstruction Dirk Theegarten1, Olaf Anhenn1, Britta Mentrup1, Kerstin Fey2 , Helmut Hotzel3 und Konrad Sachse3 1 Ruhr Universität Bochum, Institut für Pathologie Justus-Liebig-Universität Gießen, Professur für Innere Krankheiten der Pferde 3 Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Standort Jena 2 Vorangehende Untersuchungen erbrachten Hinweise auf eine Chlamydien-Infektion bei der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung (COPD) des Menschen [1] und der Recurrent Airway Obstruction (RAO) beim Pferd [2]. Klinisch gesunde Pferde waren bisher noch nicht vergleichend untersucht worden. Aktuelle Untersuchungen bei Schweinen zeigten eine Präsenz von Chlamydiaceae auch beim Fehlen klinischer Krankheitssymptome [3]. Sechsundvierzig zur Schlachtung oder Euthanasie vorgesehene Pferde aus Westfalen mit bzw. ohne respiratorische Symptome wurden hinsichtlich ihrer Vorgeschichte und den klinischen Zeichen einer Recurrent Airway Obstruction (RAO) evaluiert. Von allen Tieren wurden postmortal Proben von 8 verschiedenen Regionen der Lunge entnommen und lichtmikroskopisch, immunhistochemisch (IHC) sowie mit der PCR auf Chlamydia spp. hin untersucht. Hierbei wurden die positiven Zellen von 3 Gesichtsfeldern, die Bronchioli enthielten, ausgezählt. Die Pferde wurden entsprechend den klinischen und histologischen Befunden in 5 Gruppen eingeteilt. Ergänzend wurden in 4 Fällen zur Spezifizierung der infizierten Zelltypen Immunfluoreszenzmarkierungen durchgeführt. Chlamydia (C.) psittaci (alte Klassifikation) konnte mit der IHC bei Pferden mit normalem Gesundheitszustand und unauffälliger Histologie (Gruppe I), normalem Gesundheitszustand und geringen histologischen Zeichen einer RAO (Gruppe II), einer klinisch diagnostizierten RAO und normaler Histologie oder geringgradiger Entzündung (Gruppe III), klinisch und 21 mikroskopisch nachgewiesener RAO (Gruppe IV) und auch einem Pferd mit einer parasitären Lungenerkrankung gefunden werden. Interessanterweise konnte die IHC aber steigende Zahlen Antigen-positiver Zellen in diesen Gruppen nachweisen, so betrug der Median der Zellen in Prozent der Gesamtzellzahl in der Gruppe I=0,36, in II=4,85, in III=6,08 und IV=21,02. Im Vergleich der Gruppen gegeneinander waren die Unterschiede bis auf die Paarung II vs. III jeweils signifikant (p<0,042). Die PCR war in 25 der 46 Fälle (54,3%) positiv für den genusspezifischen ompA Locus. Bei der partiellen DNA Sequenzierung der positiven Proben konnte in 10 Fällen Chlamydophila (Cp.) psittaci und in 13 Fällen Cp. abortus nachgewiesen werden. Cp. pneumoniae wurde nicht gefunden. Die Ergebnisse zeigen, dass Cp. psittaci und Cp. abortus in der Lunge von Pferden nachgewiesen werden können. Diese Erreger konnten auch im induzierten Sputum von Patienten mit humaner COPD gefunden werden [4]. Die Präsenz klinischer Symptome und die Ausprägung histologischer Alterationen variiert dabei erheblich, jedoch wird in der Gruppe mit klinisch und histologisch gesicherter RAO die höchste Zahl Antigen-positiver Zellen beobachtet. Die Gesamtergebnisse entsprechen in dieser Hinsicht denen beim Schwein. Literatur: 1. Theegarten D, Anhenn O, Hotzel H, Stamatis G, Wagner M, Marra A, Mogilevski G, Sachse K: A comparative ultrastructural and molecular biological study on Chlamydia psittaci infection in alpha-1 antitrypsin deficiency and non-alpha-1 antitrypsin deficiency emphysema versus lung tissue of patients with hamartochondroma. BMC Infectious Diseases 2004; 4: 38 2. Theegarten D, Mentrup B, Hotzel H, Mogilevski G, Sachse K, Anhenn O: Detection of Chlamydophila psittaci in horses with recurrent airway obstruction. In: Judith Deák (ed.): Proceedings Fifth Meeting of the European Society for Chlamydia Research. Pauker Nyomdaipari Kft., Budapest 2004, pp.306 3. Reinhold P, Jaeger J, Melzer F, Sachse K: Evaluation of lung function in pigs either experimentally or naturally infected with Chlamydiaceae. Vet Res Com 2005; 29(Suppl.1): 125-150 4. Anhenn O, Theegarten D, Hotzel H, Sachse K, Rohde H 2004. Detection of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila abortus in induced sputum of patients with exacerbated or stable chronic obstructive pulmonary disease. In: Judith Deák (ed.): Proceedings Fifth Meeting of the European Society for Chlamydia Research. Pauker Nyomdaipari Kft., Budapest pp.245 Nachweis und Identifizierung von Chlamydien mittels DNA-Mikroarraytechnik Konrad Sachse1, Helmut Hotzel1, Peter Slickers2, Ralf Ehricht2 1 Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Standort Jena Clondiag Chip Technologies, Jena 2 In der Literatur gibt es gegenwärtig lediglich eine PCR/RFLP-Methode, die in der Lage ist, alle 9 Arten der Gattungen Chlamydia und Chlamydophila zu differenzieren. Allerdings eignet sie sich nicht für die Routinediagnostik, da sie infolge der notwendigen Restriktaseverdauung des Amplifikats arbeitsaufwändig, nicht empfindlich genug und auch nicht durchgängig reproduzierbar ist. Angesichts der vergleichsweise geringen genetischen Unterschiede zwischen den Spezies, zumindest in den taxonomisch relevanten genomischen Regionen, bot sich die DNA-Mikroarray-Technik auf Grund ihres sehr hohen Auflösungsvermögens als Alternative an. Als Gerätesystem wählten wir die ArrayTubeTM-Plattform (Fa. Clondiag, Jena), deren hervorstechende Charakteristika die Tube-integrierten DNA-Chips und die Visualisierung der Hybridisierungssignale durch Enzym-katalysierte Präzipitation sind. Das System ist auf Grund seiner Handlichkeit, Flexibilität und Schnelligkeit wie auch seines Preises besser für wechselnde diagnostische Fragestellungen geeignet als andere Gerätesysteme. 22 Die Probenvorbereitung besteht in der DNA-Extraktion und anschließender Biotin-PCR (Konsensus-PCR für Chlamydiaceae), bei der je nach eingesetztem Primerpaar ein ca. 1 kbp langes Fragment oder ein Produkt von 176 bp gebildet wird. Zur Entwicklung eines universellen Differenzierungsassays für Chlamydien wurden zwei unterschiedliche Wege beschritten. A) Design eines synthetischen Mikroarrays: Hier wurde mittels einer speziellen Software der optimal diskriminierende genomische Abschnitt ("most variable window") ermittelt. Dieser befindet sich in der Domäne I des 23S rRNA-Gens. Davon ausgehend wurden insgesamt 512 kombinatorische Oligonukleotide, die sich durch gezielte Variation der 26 Nukleotide umfassenden Konsensussequenz ergaben, als Doppelsonden mittels Micro-Wet-Printing in situ auf dem Chip synthetisiert (1024 Spots à 80 µm). Die Hybridiserungsversuche mit PCR-Produkten chromosomaler Chlamydien-DNA zeigten, dass damit alle 9 Chlamydienarten zuverlässig differenziert werden können. Erstaunlich war, dass bereits ein einziger Basen-Mismatch das Ausbleiben des spezifischen Hybridisierungssignals zur Folge hatte. B) Entwicklung von gespotteten Mikroarrays: Ausgehend von den Erkenntnissen der synthetischen Arrays wurde mit dem Ziel der weiteren Flexibilisierung eine Serie von Mikroarrays hergestellt, bei der die Spezies-spezifischen Sonden als synthetische 26mer Oligonukleotide mittels Spotter aufgetragen wurden (144-289 Spots à 80 µm). Auch mit diesem, wesentlich billigeren Ansatz gelang es, alle Chlamydienspezies an Hand ihres Hybridisierungsmusters zu unterscheiden. Untersuchungen zur Sensitivität zeigten, dass sie bei optimaler Gestaltung der Biotin-PCR, der Hybridisierung sowie der Anfärbereaktion im Bereich der Sensitivität der Real-Time-PCR liegt, wodurch die Anwendung des Verfahrens für klinische Proben realistisch erschien. Inzwischen wurde bereits eine große Zahl klinischer Proben erfolgreich mit diesem DNA-Mikroarraytest untersucht. CHEKIT CHLAMYDIA – ein hervorragend geeignetes Diagnostikum zur Überwachung und Bekämpfung der Chlamydiose bei Ruminanten Christoph Goetz1, Christoph Egli2, Peter Mauderli2 und Christian Schelp2 1 IDEXX GmbH, Wörrstadt Dr. Bommeli AG – IDEXX Laboratories, Bern, Schweiz 2 Chlamydophila abortus-infizierte Tiere zeigen keine klinischen Symptome bevor sie abortieren. Die Pathogenese beginnt etwa um den Tag 90 der Trächtigkeit, wenn der Fötus stark zu wachsen beginnt und die Invasion der Keime in die Placentome eine progressive Infektion und Gewebsnekrose auslöst. Ziegen scheiden Chlamydien während mehr als zwei Wochen vor und nach dem Abort in der Vaginalflüssigkeit aus. Die Diagnose erfolgt bei endemisch auftretenden Aborten mittels Erreger- und/oder Antikörpernachweis. Die Komplementbindungsreaktion (KBR) wird als Goldstandard für die serologische Diagnose angesehen. Auf Herdenbasis und für Massenuntersuchungen werden heute kommerziell erhältliche indirekte Antikörper-ELISAs verwendet. Um die Sensitivität und Spezifität des CHEKIT Chlamydia (Dr. Bommeli AG – IDEXX Laboratories, Bern, Schweiz) zu ermitteln, wurden sowohl Serumproben aus dem Feld als auch Seren von experimentell infizierten Tieren analysiert und mit der KBR verglichen. Insgesamt wurden 149 Rinderseren und 81 Schafseren aus dem Feld mit dem CHEKIT Chlamydia nach Angaben des Herstellers untersucht. Ein Vergleich mit der KBR wurde parallel dazu gemacht. Weiter wurden sieben Serumproben von experimentell infizierten Schafen (fünf infiziert mit Chlamydophila abortus und zwei infiziert mit Chlamydophila pecorum) analysiert. Eine weitere Studie mit drei natürlich infizierten Herden, einer experimentell infizierten Herde und zwei bestätigt negativen Herden wurde am CNEVA Sophia Antipolis in Frankreich 23 durchgeführt. Es wurde eine diagnostische Spezifität von 100% und eine Sensitivität von 95% erhoben. Die Korrelation mit der KBR als Goldstandard war sehr gut. CHEKIT Chlamydia ist ein zuverlässiger, schneller und sicherer ELISA. Der Test eignet sich für Chlamydienüberwachungs- und -bekämpfungsprogramme. Die Resultate zeigen die gute Spezifität und Sensitivität sowohl bei natürlich infizierten als auch bei experimentell infizierten Tieren. Literatur: − Schalch L. et al., Combined testing of ruminant serum samples for Chlamydia Psittaci and Coxiella burnetii specific antibodies by ELISA. VIth Congress FeMeSPRum – May 14-16, 1998, Postojna, SLOVENIA − Cavirani S., Cabassi C.S., Donofrio G., De Iaco B., Taddei S., Association between Chlamydia psittaci seropositivity and abortion in Italian dairy cows. Preventive Veterinary Medicine 50 (2001),145-151. − Abd El-Rahim, I.H.A. Serological investigations for determination of the spreading of Chlamydia infection in cattle in northeast Germany. Praktischer Tierarzt 83 (2002), 268-273. Prävalenz häufiger Erreger von Atemwegserkrankungen von 0 bis 8 Wochen alten Kälbern in NRW Wolfgang Hollberg1, Jürgen Apel1, Wilfried Adams1, Peter Heimberg1, Konrad Sachse2, Helmut Hotzel2 und Johannes Winkelmann1 1 Tiergesundheitsdienst der Landwirtschaftskammer Nordrhein-Westfalen, Münster Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Standort Jena 2 Der Rindergesundheitsdienst der Landwirtschaftskammer Nordrhein-Westfalen konnte im Rahmen eines durch die Tierseuchenkasse geförderten Monitorings die Verbreitung und die klinische Bedeutung von pneumophilen bakteriellen Infektionserregern bei jungen, unbehandelten Kälbern flächendeckend im Land NRW untersuchen. Die Auswertung der Antibiogramme gab einen Überblick über die Resistenzsituation und ermöglichte ein zielgerichtetes Vorgehen bei klinischer Erkrankung. Für die Untersuchungen wurden bei 975 bis 8 Wochen alten Kälbern in 97 Betrieben Nasenund Konjunktivaltupfer entnommen. Vor der Probenentnahme erfolgte eine klinische Untersuchung, bei der die rektale Körpertemperatur gemessen und das Nasensekret sowie die Atmung beurteilt wurden. Die Untersuchung auf Mannheimia haemolytica und Pasteurella multocida erfolgte kulturell aus Tupfern in modifiziertem Amies-Transportmedium während für die Chlamydien- und Mykoplasmen-Diagnostik Trockentupfer entnommen wurden. Diese wurden mittels PCR untersucht. Die Untersuchungsergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Positive Erregernachweise erfolgten bei 504 Kälbern, wobei Pasteurella multocida bei 15,3 % (n =149) gefunden wurde. Bei 13 % (n =127) der Nasentupfer und 10,6 % (n =103) der Konjunktivaltupfer konnten bei den Untersuchungen Chlamydien nachgewiesen werden. Mannheimia haemolytica und Mycoplasma bovis zeigten Nachweisraten zwischen 3,7 % und 5,0 %. Bei den Untersuchungen war auffällig, dass trotz der hohen Zahl von Erregernachweisen nur bei 172 Kälbern klinische Symptome auftraten. So gingen die Infektionen nur bei 68 Kälbern mit einer Körpertemperaturerhöhung über 39,4 °C einher. Ebenso erstaunte, dass nur bei 90 von 172 respiratorisch erkrankten Kälbern bakterielle Erregernachweise gelangen, was eine virale Beteiligung am Krankheitsgeschehen vermuten lässt. Bakterielle Mischinfektionen traten selten auf, wobei der gleichzeitige Nachweis von P. multocida und Chlamydien mit 3,8 % (n =37) am häufigsten gelang. 24 Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass M.haemolytica-Nachweise bei klinisch erkrankten Kälbern statistisch hochsignifikant häufiger sind, als bei der Gesamtheit der Kälber. Durch den statistisch hochsignifikanten geringeren Nachweis der Chlamydien bei klinisch erkrankten Kälbern, muss diskutiert werden, welche Bedeutung dieser Erreger bei Wegberatung und Entstehung von Atemwegserkrankungen hat. Latente Infektionen mit bakteriellen Erregern ohne klinische Krankheitssymptome sind beim Kalb sehr häufig, was die Bedeutung optimaler Haltungs- und Aufstallungsbedingungen unterstreicht. Insbesondere Chlamydien (Nachweise in 60,8 % der Betriebe) und Pasteurellen (42,3 %) können nach den Untersuchungen als „ubiquitär vorkommend“ bezeichnet werden. Die Resistenzsituation für Problemkeime wie Mannheimia oder Pasteurella stellt sich gegenwärtig als nicht bedrohlich dar. Ein gezieltes therapeutisches Vorgehen ist somit möglich. Lediglich Erythromycin und Lincomycin sollte nicht, Oxytetracyclin nur nach vorheriger Prüfung eingesetzt werden. Tabelle 1: Lokalisation Untersuchungsergebnisse TSK-Versuch Kälber (97 Bestände) 19.07.05 Betriebe: 97 Kälber: 975 Erreger Reagenten insgesamt n Alle Kälber % Herdenprävalenz % Mittleres Alter der Kälber Wochen 975 Rektaltemp. Kälber mit gleich s. > respirator. 39,5 °C Symptomen n % n % der Reag 172 17,6 (1) 49 5,0 26,8 4,7 9 18,4 18 36,7* P. multocida (2) 149 15,3 42,3 4,8 22 14,8 27 18,1 Chlamydien (3) 127 13,0 60,8 4,8 25 19,7 7 5,5** Mykoplasmen (4) 40 4,1 28,9 4,8 6 15,0 5 12,5 1+2 10 1,0 2 20,0 2 20,0 1+3 2 0,2 0 1 50,0 1+4 1 0,1 2+3 37 3,8 2+4 6 0,6 0 3+4 12 1,2 2 Augentupfer Chlamydien 103 10,6 53,6 5,1 Mykoplasmen 36 3,7 20,6 4,9 Chlamydien + Mykoplasmen 12 Nasentupfer Mann. haem. 6 16,2 2 33,3 16,7 5 41,7 19 18,4 20 19,4 5 13,9 13 36,1*** 1,2 2 16,7 5 41,7 27 2,8 7 25,9 5 18,5 Mykoplasmen 6 0,6 1 16,7 2 33,3 Chlam.+ Mykopl. 0 Augen-+ NT Chlamydien * ** *** 0 4,7 7 18,9 0 Signifikanz gem. CHI2 Signifikanz gem. F-Test p=0,005 p=0,097 p<0,001 p=0,137 p=0,022 p=0,102 25 Bedeutung von Chlamydieninfektion beim Schwein Lothar H. Wieler und Marion Pollmann Freie Universität Berlin, FB Veterinärmedizin, Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen Bei Vertretern der Ordnung Chlamydiales handelt es sich um obligat intrazelluläre Bakterien, die nach heutigem Kenntnisstand mehr als 80% Sequenzidentität im 16S rRNA Gen und/oder 23 S rRNA Gen aufweisen. Chlamydien, die weltweit ubiquitär vorkommen, sind ätiologisch an der Entstehung vielfältiger, klinisch apparenter sowie inapparenter Infektionen bei Mensch und Tier beteiligt. Chlamydien werden beim Schwein mit einer Vielzahl unterschiedlicher Erkrankungen assoziiert. Sie können beim Schwein Aborte auslösen, die Geburt lebensschwacher Ferkel bedingen und können zu Orchitis, Epididymitis, Urethritis, Pericarditis, Polyarthritis, Konjunktivitis, Enteritis und Pneumonien führen. Die ersten Veröffentlichungen über Chlamydien beim Schwein stammen aus den 1960er Jahren und beschreiben die Isolierung von Chlamydien während Ausbrüchen enzootischer Pneumonien beim Schwein. Ende der 1960er Jahre wurden Chlamydien aus dem Darm klinisch gesunder Schweine isoliert. Die bis heute beim Schwein beschriebenen Spezies sind Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum, Chlamydophila psittaci, Chlamydia suis und „Chlamydia-like“-Organism. Diese Spezies sind in den Schweinebeständen weit verbreitet. Trotz der durch verschiedene Studien bewiesenen hohen Prävalenz der Chlamydien ist ihre Rolle und Wichtigkeit der einzelnen Spezies noch nicht eindeutig geklärt. Mit modernen molekularbiologischen Methoden werden wesentlich häufiger Chlamydien nachgewiesen als dies früher denkbar gewesen wäre. Nun kommt es durch diese sehr sensitiven diagnostischen Nachweisverfahren zu einer großen Diskrepanz zwischen Erregernachweis und klinischen Erkrankungsbild. Dadurch wird die Frage nach der tatsächlichen und kausalen Rolle der einzelnen Spezies in der Pathogenese bestimmter klinischen Erkrankungen immer wichtiger. Ebenso ist die zoonotische Gefahr die vom Chlamydia-infizierten Schwein ausgeht noch in nicht hinreichendem Maß abzuschätzen. Experimentell induzierte Infektion mit Chlamydia suis beim Schwein: Pathophysiologische Konsequenzen für die Sauerstoffversorgung des Organismus Petra Reinhold, Annelie Langenberg und Konrad Sachse Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Standort Jena Aufgabenstellung: An Schweinen, die infolge einer experimentell induzierten Infektion mit Chlamydia suis an akuten respiratorischen Krankheitssymptomen litten, sollten die dem klinischen Bild zugrunde liegenden Störungen der Lungenfunktion objektiviert und deren Konsequenzen für die Sauerstoffversorgung des Organismus eingeschätzt werden. Tiere & Studiendesign: In das Versuchsvorhaben wurden 12 konventionell aufgezogene Schweine im Alter zwischen 39-44 Tagen einbezogen, wobei 8 Tiere einer aerogenen Challenge mit Chlamydia (C.) suis unterzogen wurden und 4 Tiere als nicht-infizierte Kontrollen dienten (Sachse et al., 2004). Jedes Tier wurde 2-mal täglich klinisch untersucht. Mittels des ImpulsOszilloresistometrie-Systems (“MasterScreen-IOS”, Viasys Healthcare, Höchberg) erfolgten an 8 Tieren (4 Versuchstiere, 4 Kontrolltiere) Lungenfunktionstests, wobei Kenngrößen von Ventilation (Atmungsfrequenz, Atemzugvolumen, Atemminutenvolumen), Atmungsmechanik 26 (respiratorische Impedanz während der In- und Exspiration) sowie Strömungswiderstände der proximalen und distalen Atemwege separat erfasst und beurteilt wurden. Vor jedem Lungenfunktionstest wurde eine venöse Blutprobe zur Bestimmung des Säure-Basen-Status (ABL 605, Radiometer) entnommen. Des Weiteren wurden bei allen 8 Tieren sowohl ante als auch post infectionem Atemkondensatproben gewonnen und auf ihre Konzentration an Entzündungsmediatoren (LTB4, IL-6) untersucht. Der Untersuchungszeitraum reichte vom Tag 7 vor bis zum Tag 7 nach der Exposition mit C. suis. Ergebnisse: Während die Kontrolltiere keine Symptome einer respiratorischen Erkrankungen aufwiesen, litten die aerogen mit C. suis belasteten Tiere an Fieber, Appetitlosigkeit, Atemnot, trockenem Husten und serösem Nasenausfluss. Für eine lokale Entzündung innerhalb des respiratorischen Systems spricht, dass sowohl LTB4 als auch IL-6 im Atemkondensat der infizierten Tiere anstiegen. Die Lungenfunktionsstörungen manifestierten sich bei den Versuchstieren wie folgt: Verringerung des Atemzugvolumens auf etwa 50 % bei Anstieg der Atmungsfrequenz bis auf etwa 100 Atemzüge/min. Die Atmungsmechanik war durch das Vorhandensein von schweren Atemwegsobstruktionen charakterisiert. Zeitgleich stieg die Lactat-Konzentration im peripheren Blut signifikant an (anaerober Metabolismus infolge von peripheren Durchblutungsstörungen und eines Sauerstoffdefizits im Organismus). Das drastische Absinken des pH-Werts im Blut widerspiegelte das Vorhandensein einer respiratorisch-metabolischen Azidose. Der Höhepunkt aller pathophysiologischen Veränderungen wurde 3-5 Tage post infectionem beobachtet. Schlussfolgerung: Die aerogene Belastung von Schweinen mit dem Erreger Chlamydia suis induzierte schwere respiratorische Dysfunktionen und Kreislaufzentralisation (Schock). Daraus resultierten Gasaustauschstörungen (O2-Mangel, CO2-Überschuss) in der Lunge und in der Körperperipherie, die signifikante Störungen des Säure-Basen-Status nach sich zogen. Literatur: Sachse, K.; Grossmann, E.; Berndt, A.; Schütt, Ch.; Henning, K.; Theegarten, D.; Anhenn, O.; Reinhold, P.: Respiratory chlamydial infection based on experimental aerosol challenge of pigs with Chlamydia suis. Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 27 (2004) 7-23 Prävalenz von Chlamydien in männlichen Geschlechtsapparaten und Ejakulaten von Schweinen und Wiederkäuern Komkrich Teankum1, Andreas Pospischil1, Fredi Janett2, Lloyd Vaughan1, Enrico Brugnera1, Esther Bürgi3, Louis Corboz4, Roseline Weilenmann1, Carmen Kaiser1, Dieter Zimmermann5 und Nicole Borel1 Vetsuisse Fakultät der Universität Zürich: 1Institut für Veterinärpathologie, Departement für Nutztiere; 2Klinik für Fortpflanzungsmedizin; 3Abteilung für Schweinemedizin; 4Institut für Veterinärbakteriologie 5 Universitätsspital Zürich, Institut für klinische Pathologie Chlamydieninfektionen führen bei Wiederkäuern und Schweinen zu Aborten und verursachen dadurch grosse wirtschaftliche Verluste. In der Schweiz spielt vor allem der Chlamydienabort beim Schaf eine grosse Rolle: in Bergkantonen liegt die Seroprävalenz bei 29% (Kanton Tessin) bis 43% (Kanton Graubünden). Bei männlichen Tieren kann Chlamydophila (Cp.) abortus eine Orchitis, Epididymitis und Samenblasenentzündung mit Erregerausscheidung über das Ejakulat verursachen. Die epidemiologische Bedeutung der venerischen Übertragung ist jedoch noch weitgehend unklar. Persistente Infektionen vergleichbar mit der Chlamydia (C.) trachomatis-Infektion in männlichen und weiblichen Geschlechtsorganen des Menschen sind ebenfalls denkbar. Ziel der vorliegenden Studie war es deshalb die Prävalenz und Verteilung 27 von Chlamydieninfektionen in männlichen Geschlechtsapparaten und Ejakulaten von Schweinen und Wiederkäuern mit Infertilitätsproblemen zu untersuchen. Hoden, Nebenhoden, akzessorische Geschlechtsdrüsen und Urethra von 40 Ebern, 10 Stieren und 14 Schaf- und Ziegenböcken mit Infertilitätsproblemen wurden nach der Tötung entnommen. Nach der makroskopischen Beurteilung wurden die Organe histopathologisch und bakteriologisch untersucht, sowie eine Immunhistochemie auf Chlamydien (Chlamydiaceaespezifischer, monoklonaler Antikörper gegen LPS gerichtet) durchgeführt. Spermaproben von 63 Ebern, 72 Stieren und 42 Schaf- und Ziegenböcken wurden anlässlich einer andrologischen Untersuchung gewonnen und bakteriologisch untersucht. Die PCR-Untersuchung der Ejakulate folgte anschließend unter Verwendung von 2 verschiedenen Primerpaaren: (i) Chlamydialessequenzspezifisches Primerpaar, welches ein 278 langes Basenpaarprodukt aus der 16SRegion amplifiziert und (ii) Chlamydiaceae-familienspezifisches Primerpaar, welches ein 350 langes Basenpaarprodukt aus der Intergenic Spacer (IGS)-Region amplifiziert. Die Organproben wurden ebenfalls mit den IGS-Primern untersucht. Die Sensitivität der beiden PCR-Primerpaare und der Einfluss von allfälligen im Ejakulat vorhandenen inhibitorischen Faktoren wurde vorgängig bestimmt. Dazu wurden Ejakulatproben von Eber, Stier sowie Schafund Ziegenbock mit Verdünnungreihen (10'000 bis 1 template/µl) von Cp. abortus-DNA versetzt und anschließend mit den 2 genannten Primerpaaren untersucht. Histopathologisch wurden am häufigsten Hodendegenerationen (22 Eber, 4 Stiere, 6 Böcke) und Spermagranulome (7 Eber, 2 Stiere, 4 Böcke) gefunden, oft traten diese beiden Veränderungen gemeinsam auf. Des weiteren waren multiple skrotale Hämangiome (9 Eber), testikuläre Hämangiome (3 Eber), Nebenhodenaplasien (1 Eber) und Hodenhypoplasien (2 Eber, 1 Stier), Spermatozoelen (2 Stiere, 2 Schafböcke), Hodenparenchymverkalkungen (1 Stier, 4 Böcke) und chronische Nebenhodenentzündungen (1 Eber) zu finden. Bei 2 Schafböcken wurde eine Orchitis hervorgerufen durch Staphylococcus aureus bzw. E. coli diagnostiziert. Die bakteriologische Untersuchung aller anderen Organproben verlief negativ. Chlamydien konnten weder mit Immunhistochemie noch mit PCR (IGS-Primerpaare) nachgewiesen werden. Die Nachweisgrenze der beiden Primerpaare (16S und IGS) im Ejakulat lag bei 10 Templates bei Eber und Stier und bei 100 Templates bei Schaf- und Ziegenbock. Mit den 16S-Primerpaaren konnte bei den Ebern C. suis (10), Cp. psittaci (1) und uncultured Chlamydiales (3) gefunden werden. Mit dem gleichen Primerpaar ergab sich bei den Stieren Cp. abortus/Cp. psittaci (2) und uncultured Chlamydiales (3). Die Ejakulatproben aller Böcke waren negativ mit beiden Primerpaaren. Ebenfalls negativ verlief die Untersuchung der Eberund Stierejakulate mit den IGS-Primern. Infertilitätsprobleme bei Schweinen und Wiederkäuern werden durch verschiedene angeborene und erworbene Pathologien verursacht, wobei die degenerativen Prozesse gegenüber den entzündlichen überwiegen. In den Organproben konnte weder mit Immunhistochemie noch mit PCR Chlamydien nachgewiesen werden. Bei der PCR-Untersuchung von Ejakulaten scheinen vor allem die Spermatozoenzahlen einen inhibitorischen Effekt zu bewirken (Schaf- und Ziegenbock). In Spermaproben der untersuchten Tierarten wurde lediglich einmal beim Eber und zweimal beim Stier Cp. abortus bzw. Cp. psittaci nachgewiesen. Es scheint also, dass zumindest in der Schweiz die venerische Übertragung von Chlamydien nur eine untergeordnete Rolle spielt. Experimentelle Chlamydieninfektion humaner Lungenschnitte zur Validierung des zoonotischen Potentials Olaf Anhenn, Matthias Sczesny, Ilka Monaca und Dirk Theegarten Ruhr Universität Bochum, Institut für Pathologie 28 Infektionen mit Chlamydien sind weit verbreitet, eine Übertragung vom Tier auf den Menschen ist in vielen Fällen möglich. Daher besteht ein Bedarf, anhand einfacher Testverfahren verschiedene Spezies und Stämme vergleichend zu untersuchen. Hier bieten sich Organkulturen an, die standardisiert gewonnen werden können. Eine Möglichkeit ist die Gewinnung von lebenden Lungenschnitten (LLS) mit dem Krumdieck-Gewebemikrotom [1]. Erste Untersuchungen zeigten die Brauchbarkeit derartiger Schnittpräparate [2]. Chlamydophila pneumoniae (CPPN) ist ein Erreger mit sowohl humanem als auch animalem Vorkommen. Vergleichend untersucht wurden der humane Stamm MUL 250 (zur Verfügung gestellt von M. Maass, MU Lübeck) und das Frosch-Isolat DC9 [3]. Humane tumorfreie Lungenschnitte wurden aus mit Agarose aufgefüllten frischen Operationspräparaten von Patienten mit einem Bronchialkarzinom gewonnen. Die infizierten Schnitte wurden vergleichend morphologisch mit der Licht(LM), Immunfluoreszenz(IFM) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht. Weiterhin erfolgte eine Bestimmung der Konzentration an IL-8 in den Kulturüberständen im ELISA. Morphologisch konnten zwischen den verwendeten Isolaten keine Unterschiede hinsichlich der Infektion an sich gefunden werden, die Infektion konnte mittels IFM und TEM belegt werden. Im ELISA waren die Konzentrationen von IL-8 bei den MUL 250 infizierten LLS höher als bei den mit DC9 infizierten. Hierbei konnte eine eindeutige Dosisabhängigkeit der IL-8 Sekretion nur für den humanen CPPN Stamm nachgewiesen werden. Lungenschnitte können von verschiedenen Tierspezies gewonnen werden und experimentell mit verschiedenen Chlamydien-Stämmen bzw. Isolaten vergleichend infiziert werden. Die hier gewonnenen Erkenntnisse erlauben Hinweise auf das zoonotische Potential der Erreger. Literatur: 1. Krumdieck CL, dos Santos JE, Ho KJ. A new instrument for the rapid preparation of tissue slices. Anal Biochem 1980; 104: 118-123 2. Ebsen M, Theegarten D, Wohlsen A, Mogilevski G, Anhenn O, Kothe H, Uhlig S. Über die Einsatzmöglichkeiten des Krumdieck Tissue Slicers in der experimentellen pulmonalen Infektionspathologie. Atemw Lungenkrkht 2001; 27: 358-359 3. Hotzel H, Grossmann E, Mutschmann F, Sachse K. Genetic characterization of a Chlamydophila pneumoniae isolate from an african frog and comparison to currently accepted biovars. System Appl Microbiol 2001; 24: 63-66 Konsequenzen einer klinisch inapparenten Chlamydien-Infektion auf die Lungenfunktion von Schweinen und Kälbern Julia Jäger, Rüdiger Bachmann, Falk Melzer, Evelyn Schubert, Konrad Sachse und Petra Reinhold Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit, Standort Jena Hintergrund: Untersuchungen klinisch gesunder Kälber und Schweine zeigten, dass bei einem Teil der Tiere regelmäßig eine spontane Besiedlung des respiratorischen Systems mit Chlamydien nachgewiesen wird. Unklar ist, (a) ob es sich hierbei um ein KolonisationsPhänomen oder um eine klinisch inapparente Infektion handelt und (b) in welchem Ausmaß die Lungenfunktion betroffener Tiere beeinflusst wird. Ziel dieser Studie war daher die Evaluierung des Einflusses von Chlamydien auf die Lungenfunktion von Kalb und Schwein. Studiendesign: An 25 klinisch unauffälligen Kälbern (Alter: 2-7 Monate; Körpermasse: 40-158 kg) und 16 klinisch unauffälligen Schweinen (Alter: 5-27 Wochen; Körpermasse: 7-100 kg) 29 wurden mittels „Masterscreen-IOS“ (VIASYS Healthcare) lungenfunktionsdiagnostische Tests durchgeführt. Jedes Tier wurde über einen Untersuchungszeitraum von sechs Monaten (2.-7. Lebensmonat) kontrolliert. Der Erregernachweis wurde mittels PCR in Nasentupfer- und Kottupferproben sowie post mortem in Organproben durchgeführt. Für serologische Untersuchungen wurde beim Kalb eine KBR und beim Schwein ein ELISA angewandt. Ergebnisse: Bei 6 von 16 untersuchten Schweinen wurden folgende chlamydiale Spezies im Lungengewebe nachgewiesen: C. psittaci, C. trachomatis, C. pecorum. Bei 13 von 25 Kälbern gelang im Zusammenhang mit einer spontanen Besiedlung des respiratorischen Systems der Nachweis folgender Spezies: C. psittaci, C. pecorum. Die Tiere wurden in Gruppen [Chlamydiennachweis positiv (Chl+); Chlamydiennachweis negativ (Chl-)] klassifiziert und verglichen. Schweine: • signifikant erhöhte Rektaltemperatur bei Tieren mit positivem Chlamydiennachweis (PCR) • alle 16 Tiere serologisch negativ (ELISA) • keine respiratorische Symptomatik (Fieber, Husten, Nasen- o. Augenausfluss) • keine signifikanten Unterschiede in der Atmungsfrequenz • keine Beeinträchtigung der Lungenfunktion Kälber: • signifikant erhöhte Rektaltemperatur bei Tieren mit positivem Chlamydiennachweis (PCR) • 7 von 13 Tieren mit positivem Chlamydiennachweis (PCR) serologisch positiv (KBR) • keine klinisch manifesten respiratorischen Symptome • signifikant höhere Atmungsfrequenz bei Tieren mit positivem Chlamydiennachweis • signifikant höhere Strömungswiderstände in den peripheren und zentralen Atemwegen bei Tieren mit positivem Chlamydiennachweis Fazit: Die Untersuchungsergebnisse weisen darauf hin, dass eine klinisch inapparente Besiedlung des respiratorischen Systems mit Chlamydien sowohl zu chronisch-obstruktiven Veränderungen in den Atemwegen führen als auch ohne Beeinflussung der Lungenfunktion bleiben kann. 30
