05-Tangen.ppt [Schreibgeschützt]
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Mikroorganismen identifizieren: Wege zur Identifikation Isolat Morphologie Biochemie Genetik Informationen zusammenfassen Charakterisierung Identifzierung Neubeschreibung RiboPrinter Charakterisiert und identifiziert Bakterien durch die Analyse ihrer rRNA Gene Analyse der rRNA-Gene • universell vorhanden • funktionell homolog • Die Veränderungsrate der rRNA-Gene erlaubt es Bakterien hinsichtlich ihrer Zugehörigkeit zu einer Art und die Identität klonaler Linien einer Art zu charakterisieren Die rRNA-Gene enthalten konstante und variable Abschnitte Arbeiten mit dem RiboPrinter Probenvorbereitung “Ribotyping” Ergebnisanalyse Wie funktioniert der RiboPrinter? 1. Bakterien DNA wird isoliert 2. Restriktionsenzyme schneiden die DNA in Fragmente 3. Die Fragmente werden nach ihrer Größe getrennt 4. Die Fragmente, die für die rRNA codieren, werden dargestellt 5. Die sichtbaren Fragmentmuster werden mit bekannten Mustern verglichen 6. Dem Isolat wird ein Name/Bezeichnung zugeordnet Verbrauchsmaterialien bereitstellen Probenträger DNA-Präparatträger Membran MP-Basis e ett s as K lGe Restriktionsenzyme Restriktionsenzyme erkennen spezifische Basensequenzen und schneiden die dsDNA an diesen Stellen Separation und Transfer Elektrophorese + „Blotting“ „direct-blotelectrophorese“ Nachweis der rRNA-Gene 16S rRNA Isolat 1 23S rRNA 5S rRNA Sonde Gene X 16S rRNA 23S rRNA A B A 5S rRNA B Fragmentmuster nach Gelelektrophorese Isolat 1 Hybridisierung mit einer DNA-Sonde aus dem rrnB Operon von E. coli Nachweis der rRNA-Gene 16S rRNA Isolat 2 23S rRNA 5S rRNA Sonde Gene X 16S rRNA 23S rRNA A B A 5S rRNA B B A Fragmentmuster nach Gelelektrophorese Isolat 1 und Isolat 2 Hybridisierung mit einer DNA-Sonde aus dem rrnB Operon von E. coli Hybridisierung und Nachweis der Sonde 1. Bindung der DNA an die Membran 2. Denaturierung erzeugt ssDNA 3. Die Sonde bindet an homologen Sequenzen 4. Waschen 5. Blockieren freier Bindungsstellen 6. Konjugat zugeben 7. Substrat zugeben Darstellung der Fragmentmuster 1. Graustufen Riboprinter Muster 2. Grafische Darstellung 3. Kombinierte grafische und Graustufendarstellung Die rRNA-Gene enthalten konstante und variable Abschnitte Datenbanken des Riboprinters Wo kann der RiboPrinter eingesetzt werden? • Überall wo Bakterien identifiziert werden und • eine klonale Charakterisierung oberhalb des Speziesniveaus gewünscht ist Zum Beispiel • Nachweis von Kontaminationsquellen • Charakterisierung von Starterkulturen • Charakterisierung von Stammsammlungen • Epidemiologische Untersuchungen (MRSA, VRE, ESBL, .....) Vorteile RiboPrinter • • • • • • Automatisiert Standardisiert reproduzierbare Ergebnisse Schnell hoher Probendurchsatz Einfacher Datenaustausch durch Vernetzung Wege zur Identifikation Isolat Morphologie Biochemie Genetik Informationen zusammenfassen Charakterisierung Identifzierung Neubeschreibung Phänotypische Identifizierung anhand physiologischer Merkmale • Biochemische Reaktionen sind einfach zu bestimmen aber: • Sie können der Variabilität unterliegen • einzelne Reaktionen sind nicht besonders differenzierend Phänotypische Identifizierung anhand physiologischer Merkmale die Zuverlässigkeit der ID nimmt zu: • mit der Anzahl der getesteten Reaktionen • mit der Größe der Datenbanken Biolog MicroStation • 95 Reaktionen • > 1900 Spezies in den Datenbanken Biolog MicroStation Datenbanken im Vergleich 2000 1500 1000 500 0 Biolog API VITEK Spezies der Datenbanken Arbeitsschritte 1. Reinkulturen 2. Gramfärbung und Schnelltests 3. Inokulum und Inkubation 4. Auswertung Kohlenstoffverwertung und Tetrazoliumreduktion Testauswertung Intelligente Software: Automatische, testspezifische Kompensation von Hintergrundfärbungen Ergebnisbildschirm Reaktionen der Mikrotiterplatte •positive Reaktionen •fragliche Reaktionen •negative Reaktionen •abweichende Reaktionen Ergebnisfeld •Zuordnung der Spezies •Distanz und Ähnlichkeit Interpretation der Ergebnisse Distanz • Anzahl der abweichenden Reaktionen • Maß für die Separation: • Ù soll für ID Nr. 1 möglichst klein sein • Ù Die Diff. Dist ID1 - Dist ID2 soll möglichst groß sein Similarity • Maß für die Übereinstimmung zwischen Datenbank und Testplatte • Sim = 1.0 Ù vollständige Übereinstimmung • Sim = 0.0 Ù keine Übereinstimmung Ergebnisausdruck I Ergebnisausdruck II PID „Progressive ID“ Art Isolat Pos ges Pos alle Pos+1 A 1 10 10 A 2 12 10 +2 A 3 15 10 +2 Pos+2 +3 PID „Progressive ID“ • PID berücksichtigt die graduelle Substratverwertung von Mikroorganismen • PID verbessert die ID von stoffwechselvariablen Mikroorganismen Dendrogramme Mikrobiologische Ökosysteme PCA Schimmelpilze: oft nur mit großem Aufwand zu identifizieren Die MicroStation zur Identifizierung filamentöser Pilze Aspergillus flavus aus der Fotogalerie der FFDatenbank,( a+b) Morphologie auf MA und CYA Agar, (c-e) Konidiophore und Konidien Beimpfte MicroPlate mit positiven Farbreaktionen Biolog MicroStation FF-Datenbank 3 3 3 3 3 3 618 Arten, filamentöse Pilze und Hefen FF-MicroPlate mit 95 C-Quellen Iodonitrotetrazolium-Violett als Farbindikator Messung bei 2 Wellenlängen 490 nm und 750 nm. Berücksichtigung der Farbstoff- und der Trübungsreaktion. Auswertung von 2 x 95 Reaktionen Fotogalerie mit mikroskopischen und makroskopischen Abb. einzelner Pilzarten Identifikation von Mikroorganismen molekularbiologsiche und biochemische Verfahren anhand des RiboPrinters und des Identifizierungssystems BIOLOG
