Peptidtransport

Peptidtransport
Versuch 1E
Glycosylierung
O-Glycosylierung: Ser, Thr
N-Glycosylierung: Asn
~ 50% eukaryotischer Proteine sind glycosyliert; 90% dieser enthalten N- verknüpfte
Glycane (Motiv: Asn-X-Ser/Thr)
“TAP-Peptid (NST-f)”: (RRYQNSTC(f)L)
Versuchsdurchführung
Membranen auf Eis auftauen
ATP oder Apyrase, MgCl2 und PBS zugeben
Transport durch Zugabe von NST-f Peptid starten
3 min @ 32°C
Abstoppen durch Zugabe von 1 ml eiskaltem Stop-Puffer, 8 min @ 14000 rpm
Pellet resuspendieren in 100 µl Lysepuffer, 800 µl Lysepuffer zugeben,
15 min @ RT inkubieren
8 min @ 14000 rpm zentrifugieren,
50 µl Concanavalin A beads zum Überstand geben, 1 h @ 4°C rotieren
ConA beads 2x mit 1 ml Lysepuffer waschen;
beads in 300 µl Elutionspuffer resuspendieren für 30 min @ 4°C rotieren
2 min @ 1000 rpm abzentrifugieren, 250 µl der Elution
in eine 96well plate überführen, im ELISA-Reader quantifizieren
Apyrase
Hintergrundbestimmung: ATP wird durch 1 unit Apyrase ersetzt.
Apyrase (Enzym) besitzt Adenosin 5’-triphosphatase- und Adenosin 5’diphosphataseaktivität.
Apyrase
ATP + H2O
AMP + 2 Pi
Concanavalin A
2 Concanavalin A (Con A) ist ein Metalloprptoein aus der Jackbohne
(Canavalia ensiformis) und gehört zur Gruppe der Lektine.
2 bindet α-D-Glucose und ähnliche Zucker, ohne eine enzymatische
Aktivität aufzuweisen.
2 Das Concanavalin Monomer besteht aus 237 AS und enthält
strukturbildendes Mangan und Calcium.
2 Die Anwesenheit dieser Metallionen bewirkt, dass Con A in der Lage ist
Kohlenhydrate zu binden. Bei einem neutralen pH-wert (um 7) lagert es
sich zu einem Tetramer zusammen, im sauren pH-Bereich zerfällt es zu
einem Dimer.
N-Glycosylierung von Asn-Resten
n
m
l
g
i
k
f
h
j
d
core
e
c
b
a
N-verknüpfte Glycoproteine enthalten einen
gemeinsamen Zuckerbaum besthend aus 3 Mannoseund 2 GlcNAc-Gruppen.
Ein pre-synthetisiertes Glycan (Glc3Man9GlcNac2)
wird an die Konsensus-Sequenz Asn-X-Ser/Thr
übertragen, wenn eine Polypeptidkette im ER
synthetisiert wird.