Molekulares Profiling / Individualisierung von GI - GI

Molekulares Profiling / Individualisierung von GI Tumoren. Konsequenzen für
Standards, Studien und Therapien der Zukunft
Prof. Dr. med. Andrea Tannapfel
Ruhr-Universität Bochum, Institut für Pathologie
Das
Verständnis
der
molekularen
Veränderungen,
die
der
Entstehung
gastrointestinaler Tumoren zugrunde liegen, ist innerhalb der letzten Jahre stetig
gewachsen. Inzwischen sind eine ganze Reihe von zielgerichteten Therapien gegen
diese molekularen Mechanismen entwickelt worden. „Zielgerichtet“ sind diese
Therapien deshalb, weil sie nur diejenigen Tumorzellen zerstören sollen, die die
spezifischen molekularen Alterationen besitzen.
Um die in Frage kommenden molekularen Alterationen zu analysieren, wurden
Assays entwickelt, die einzelne Gene oder Proteine im Tumorgewebe nachweisen –
oder aber in einem experimentellen Ansatz multiple „Targets“ untersuchen. Dieses
„Molekulare
Profiling“
kann
spezifische
Genexpressionsmuster,
deregulierte
intrazelluläre Pathways oder aber Signaltransduktionskaskaden auf Gen-, mRNAund/oder Proteinebene untersuchen.
Für nahezu alle gastrointestinalen Tumoren (Magen, Kolon, Pankreas) sind
sogenannte „driver mutations“ identifiziert worden, Mutationen, die essentiell für die
maligne Transformation erscheinen, und die zielgerichtet „individualisiert“ therapiert
werden können.
Das molekulare Profiling der Pathologie zur individualisierten Tumortherapie umfasst
vier unterschiedliche Aspekte:
-
Akquisition und Prozessierung des Gewebes
-
Klassifizierung
der
Tumoren
unter
besonderer
Berücksichtigung
der
Tumorheterogenität
-
Entwicklung robuster spezifischer Assays
-
klinische Evaluation und parallele Entwicklung der molekularen Marker und
Medikamente (companion diagnostics).
Molekulares Profiling kann an Paraffingewebe, häufiger an fresh frozen-Biopsien
durchgeführt werden und auf unterschiedlichen Techniken, von der Sanger1
Sequenzierung, des Pyrosequencings, der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISHTesting) Multiplex-Genotyping bis hin zum sog. Next-generation-Sequencing
beruhen.
Um klinisch anwendbar zu sein, sollte die durchschnittliche Turn Around Time (TAT)
zwei bis vier Wochen nicht überschreiten. Erste Daten zeigen, dass in 50 bis 80%
der Patienten Alterationen gefunden werden, die zielgerichtet therapiert werden
können.
Tumorheterogenität
Die genetische Heterogenität eines Tumors spiegelt sich auch im Phänotyp wider. So
können beispielsweise in Magenkarzinomen unterschiedliche histologische Subtypen
innerhalb eines einzelnen Tumors vorkommen.
Es ist bekannt, dass Primärtumor und Metastasen durchaus genetisch heterogen
sein können. Darüber hinaus verändert sich ein individueller Tumor innerhalb der
unterschiedlichen Therapierichtlinien. Werden Tumorbiopsien untersucht, enthalten
sie
einen
„Zellmix“
aus
malignen
Zellen,
normalen
Zellen,
Stromazellen,
Entzündungszellen und Nekrose. Daher sind kleine Tumorbiopsien oder auch
Zytologien nicht notwendigerweise repräsentativ für den Gesamttumor.
Akquisition und Prozessierung des Gewebes
Allen zugrunde liegenden Techniken gleich ist die Notwendigkeit, adäquates
Tumorgewebe zu untersuchen, eine möglichst geringe Kontaminierung von normalen
bzw. nekrotischen Zellen ist ebenso wichtig wie die morphologische Bestätigung der
Tumordiagnose. In diesem Zusammenhang ist wichtig, die Problematik der
Tumorheterogenität zu diskutieren, darüber hinaus eine Festlegung zu treffen, ob
Primärtumor oder Metastasen analysiert werden sollen. Um biopsieassoziierte
Komplikationen bei z.B. metastasierten Patienten zu vermindern, wird mehr und
mehr auf minimal invasive Biopsien zurück gegriffen (Zytologien, zirkulierende
Tumorzellen), letztendlich basieren einzelne Studien auf serumfreier DNA. Obwohl
früher die Ergebnisse von Zytologie-basierten Verfahren eher enttäuschend waren,
konnte in letzter Zeit gezeigt werden, dass z.B. aus serumfreier DNA reproduzierbare
Ergebnisse gewonnen werden konnten. Eine weitere wichtige Überlegung ist die
Standardisierung
der
Methoden
der
Fixation
und
der
Gewebsverarbeitung
(„Präanalytik“). Insbesondere Untersuchungen, die an formalinfixiertem Gewebe
2
durchgeführt wurden, müssen auf qualitativ schlechte DNA (durch crosslinking,
Degradierung) zurückgreifen, was
zu artifiziellen Mutationsergebnissen führen
kann.
Entwicklung robuster spezifischer Assays
Die meisten Pathologen benutzen Methoden des direkten Gensequenzierens, um die
bisher relevanten Mutationen gastrointestinaler Tumoren nachzuweisen (z.B. K-ras)
oder analysieren eine Amplifikation von Her-2/neu mittels FISH-Testing. Generell gilt
jedoch, dass kapillarbasierte DNA-Sequenzierungsmethoden lediglich eine geringe
Zahl von genetischen Alterationen sichtbar machen können und zumeist eine
insuffizient niedrige Sensitivität besitzen, um niedrig frequente Mutationen in
Biopsien nachzuweisen. Zwischenzeitlich sind eine ganze Reihe von Methoden
(multiplexed panels) entwickelt worden, die einen höheren Durchsatz als
konventionelle Kapillar-Elektrophoresenplattformen ermöglichen. Zukünftig wird es
durch das Next Generation Sequencing (NGS) gelingen, simultane Genalterationen
nachzuweisen. Durch die unterschiedlichen bisher entwickelten NGS-Verfahren wird
es möglich sein, Target-Sequenzen von Nukleinsäuren, die von Interesse sind,
schnell zu detektieren und auch chromosomale Alterationen oder Amplifikationen in
einer hoch auflösenden Technik reproduzierbar nachzuweisen. Die routinemäßige
Anwendung des NGS wird aktuell noch durch die relativ hohen Kosten der
Datenspeicherung und -auswertung limitiert.
Klinische Evaluation der molekularen Marker und Therapieformen
Die meisten bisher gefundenen zielgerichteten Therapien sind lediglich bei einer
Untergruppe der Patienten wirksam, daher ist es wichtig, Phase 3-Studien
durchzuführen,
die
spezifisch
diese
Problematik
adressieren.
Moderne
Studiendesigns müssen entwickelt werden, um parallel multiple zielgerichtete
Therapien in selektionierten Patienten mit gastrointestinalen Tumoren durchzuführen.
3