(KSP) mit border disease (BD)

Aus dem Institut für Virologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Serologische Differentialdiagnostik der Klassischen
Schweinepest (KSP) mit Border Disease (BD)
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Tuba Cigdem Oguzoglu
aus Ankara/Türkei
Hannover 2002
Wissenschaftliche Betreuung:
1.Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Volker Moennig
2.Gutachter: Priv.-Doz. Dr. Martin Groschup
Tag der mündlichen Prüfung: 28. Mai. 2002
Meinen Eltern
4
Inhaltsverzeichnis
Seite
Abkürzungen
8
1. Einleitung
11
2. Literaturübersicht
13
2.1. Ätiologie
13
2.1.1. Taxonomie
13
2.1.2. Morphologie, Genomstruktur und Eigenschaften
13
2.2. Klinische Erscheinungen nach Pestivirusinfektionen und das
Wirtsspektrum von Pestiviren
16
2.2.1. Klassische Schweinepest
17
2.2.2. Border Disease
19
2.2.3. Bovine Virusdiarrhoe - Mucosal Disease
21
2.3. Monoklonale Antikörper gegen Pestiviren
22
2.4. Kreuzneutralisation von Pestiviren
23
2.5. Serologische Überwachung
25
2.6. Serologische KSP-Diagnostik
25
3. Eigene Untersuchungen
27
3.1. Material
27
3.1.1. Zellkulturen
27
3.1.1.1. Fetale Kälbernieren-Zellkulturen
27
3.1.1.2. Porzine Nierenzelllinie
27
3.1.1.3. Fetale Schaf-Thymus-Zellkulturen
27
3.1.2. Herkunft der verwendeten Pestiviren
28
3.1.2.1. Ovine Pestiviren
28
3.1.2.2. Porzine Pestiviren
29
3.1.2.3. Weitere Pestiviren
29
3.1.3. Leukozytenproben von Schweinen
30
3.1.4. Organproben von Schweinen
30
3.1.5. Eingesetzte Seren
30
Seite
3.1.5.1. Referenz- und Versuchsseren
30
3.1.5.2. Serumproben aus dem Feld
32
3.1.6. Monoklonale Antikörper
35
3.2. Methoden
36
3.2.1. Anzucht und Passage von Zellkulturen
36
3.2.1.1. FKN-Zellen
36
3.2.1.2. PK(15) und SFTR Zellen
37
3.2.2. Virusvermehrung
37
3.2.3. Kulturelle Virusisolierung
37
3.2.4. Virustitration
39
3.2.5. Direkte Immunfärbung - „Peroxidase-Linked Antibody“-Test
39
3.2.6. Virusneutralisationstest
40
3.2.7. Indirekte Immunfärbung „Peroxidase-Linked Antibody“-Test
41
4. Ergebnisse
43
4.1. Bestimmung des optimalen Zellkultur-Systems
43
4.2. Charakterisierung der Pestiviren
43
4.2.1. Charakterisierung der Pestiviren mit mAk
43
4.2.2. Charakterisierung der Pestiviren mit Referenzseren
45
4.3. Ergebnisse der Neutralisationstests
45
4.3.1. Versuchsseren
45
4.3.1.1. Seren aus dem Versuch 1990/25
45
4.3.1.2. Seren aus dem Versuch 2001/1
46
4.3.2. Aus Deutschland stammende Schweineseren
47
4.3.3. Aus anderen europäischen Ländern stammenden Schweineseren
48
4.3.4. Aus Deutschland stammende Rinderseren
48
4.3.5. Proben aus einen KSP-Verdachtsfall
48
5. Diskussion
51
6. Zusammenfassung – Summary – Özet
59
7. Literaturverzeichnis
65
8. Anhang
80
Seite
8.1. Tabellen und Abbildungen
80
8.2. Medien, Puffer, Lösungen und Chemikalien
103
8.3. Fußnote
106
Veröffentlichungen
107
Danksagung
108
Abkürzungen
Abb. – Abbildung
AEC – Aminoethylcarbazol
BD – Border Disease
BDV – Border Disease Virus
BFAV – Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere
BVD – Bovine Virusdiarrhoe
BVDV – Bovines Virusdiarrhoe Virus
CVL - Central Veterinary Laboratories Agency (England)
DMSO – Dimethlysulfoxid
dpi – Tage post infectionem
EURL – EU Referenz Labor für KSP an der Tierärztliche Hochschule Hannover
Eut. – Euthanasie
FKN – Primäre fetale Kälbernieren Zellkulturen
FKS – Fetales Kälber-Serum
IPLA – Indirekte Immunfärbung „Peroxidase-Linked Antibody“-Test
kb – kilobase
k.s. – kein Serum
KSP – Klassische Schweinepest
KSPV – Virus der Klassischen Schweinepest
LVUA – Landes-Veterinär-Untersuchungsamt
mAk – monoklonale Antikörper
MD – Mucosal Disease
nAk – neutralisierende Antikörper
NT – Neutralisationstest
NPLA - Neutralisations Peroxidase Linked Antibody Assays
nzp – nicht zytopathogen
ORF – Open Reading Frame
PBSM – Phosphat-gepufferte Salzlösung-Minus
p.i. – post infektionen
PLA - Direkte Immunfärbung - „Peroxidase-Linked Antibody“-Test
PK(15) - Permanente Porzine Nieren Zellkulturen (pig kidney)
Serumgew. – Serumgewinnung
SFTR - Fetale Schaf Thymus Zellkulturen
STABW – Standart Abweichung
tox. – toxisch
VNT – Virus Neutralisationstest
w. – Woche
wb – weiblich
wpi – Woche post infectionem
ZK – Zellkultur
zp - zytopathogen
ZPE – zytopathischer Effekt
11
1.Einleitung
Eine der wirtschaftlich bedeutsamsten Infektionskrankheiten der Schweine wird durch das
Virus der Klassischen Schweinepest (KSPV) verursacht. Es gehört zum Genus Pestivirus
innerhalb der Familie Flaviviridae. Dieses Genus umfaßt vier Spezies: das Bovine
Virusdiarrhoe-Virus vom Genotyp 1 (BVDV 1), das Bovine Virusdiarrhoe-Virus vom
Genotyp 2 (BVDV 2), das KSPV und das Virus der Border Disease der Schafe (BDV). Diese
Viren sind antigenisch und genetisch miteinander verwandt, so dass serologische
Kreuzreaktionen vorkommen. Außer ihren spezifischen Wirten können diese Pestiviren auch
andere Tierarten infizieren, wobei die Infektion in diesem Fall u.a. die Bildung
neutralisierender Antikörper (nAk) hervorruft. So können die ruminanten Pestiviren unter
natürlichen Bedingungen auch das Schwein infizieren und spielen damit eine wichtige Rolle
bei der Differentialdiagnose der Klassischen Schweinepest (KSP).
Bedingt durch die weite Verbreitung von BVD-Virusinfektionen bei Rindern konnten in
Ferkel erzeugenden Betrieben Niedersachsens im Jahre 1980 bei etwa 10 % der Schweine
nAk gegen BVD-Viren nachgewiesen werden.
Laut Schweinepestverordnung ist bei der serologischen Untersuchung von KSP-verdächtigen
Schweinebetrieben die differentialdiagnostische Abklärung auf nAk gegen das Virus der
Bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) durchzuführen. Dieses wird bisher für nAk gegen Border
Disease (BD) nicht gefordert.
In den letzten Jahren wurden bei Routineuntersuchungen mehrfach niedrige nAk-Titer gegen
KSPV in Schweineseren festgestellt. Dies führte zu einem KSP-Verdacht, mit allen daraus
resultierenden Konsequenzen. In umfangreicher serologischer und epidemiologischer
Differentialdiagnostik wurde schließlich eine BD-Infektion dieser Schweine ermittelt.
Die Bedeutung des Vorkommens von BDV beim Schwein liegt weniger in der Auslösung von
klinischen Erkrankungen, sondern vielmehr im Auftreten von nAk, deren rasche und
zuverlässige Abklärung als „nicht KSPV-bedingt“ von tierseuchenrechtlicher Relevanz ist.
Deswegen bedarf es einer zusätzlichen BDV-Differentialdiagnostik.
Um eine einheitliche Differentialdiagnostik KSP/BD aufzubauen, wurden in dieser Arbeit
verschiedene BD-Virusstämme von Schafen, Pestivirusisolate von Schweinen, BD-
12
antikörperhaltige Referenzseren und Feldseren untersucht. Diese Seren wurden von dem
Europäischen Referenz-Labor (EURL) für Klassische Schweinepest an der Tierärztlichen
Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
Gegenstand dieser Arbeit waren:
1- Ermittlung des optimalen Zellkultur-Systems für die BDV-Differentialdiagnostik.
2- Vergleichende
serologische
Untersuchungen
bei
experimentell
BDV-infizierten
Schweinen unter Verwendung von homologen und heterologen Pestiviren.
3- Vergleich von nAk-Titern gegen Pestiviren (BDV, KSPV, BVDV) in Feldseren von
Schweinen.
4- Das Ziel dieser Arbeit war es eine Empfehlung für eine einheitliche KSPV/BDV
Differentialdiagnostik zu geben.
13
2. Literaturübersicht
2.1. Ätiologie
2.1.1. Taxonomie
Das Genus Pestivirus gehört mit den Genera Flavivirus und dem Hepatitis C - Virus zur
Familie der Flaviviridae (WENGLER et al., 1995; PRINGLE, 1999). Das BVDV 1 und das
BVDV 2 bilden zusammen mit dem Virus der Border Disease und dem Virus der Klassischen
Schweinepest das Genus Pestivirus (BECHER et al., 1995, 1998; RIDPATH u. BOLIN,
1997; WENTRIK u. TERPSTRA, 1999; HEINZ et al., 2000).
Weitere Vertreter des Genus Flavivirus sind das Gelbfiebervirus und das FrühsommerMeningoenzephalitis-Virus des Menschen, das Louping-ill-Virus und das WesselsbronDisease-Virus der Schafe sowie das Meningoenzephalitis-Virus der Pute.
2.1.2. Morphologie, Genomstruktur und Eigenschaften
Pestiviren sind behüllte Viren mit einem Durchmesser von ca. 40-60 nm und aufgrund ihrer
Hüllstruktur sind sie leicht durch Chloroform, Äther und Detergentien inaktivierbar. Bei
niedrigen pH-Werten (pH 3 bis 4) und UV-Bestrahlung wird das Virus schnell inaktiviert
(HAFEZ u. LIESS, 1972a). Die lipidhaltige Hülle umgibt ein ikosaedrisches Nukleokapsid.
Auf der Oberfläche der Virionen wurden unregelmäßig gestaltete Projektionen von 6 – 8 nm
Länge identifiziert (RITCHIE u. FERNELIUS, 1968). Als Bausteine der Virushülle führen
die Hüllglykoproteine zur Bildung nAk, denen eine wichtige Rolle in der Frühphase der
Infektionsabwehr zukommt.
Das virale Genom liegt in Form einer einzelsträngigen, linearen Ribonukleinsäure (RNS) mit
positiver Polarität vor. (DIDERHOLM u. DINTER, 1966). Es weist eine Länge von 12,3-12,7
Kilobasen (kb) auf und kodiert für einen einzigen offenen Leserahmen („open reading
frame“-ORF) (COLLET et al., 1988a; MEYERS u. THIEL, 1996). Dieser ORF wird von
zwei nicht-kodierenden Regionen flankiert. Der Leserahmen kodiert für ein Polyprotein von
14
etwa 4000 Aminosäuren (COLLET et al., 1988b). Sowohl während als auch nach der
Translation wird es prozessiert (RÜMENAPF et al., 1993), so dass über Spaltungen und
Bildung von verschiedenen Vorläuferproteinen die Struktur- und Nichtstrukturproteine (NS)
des Pestivirus entstehen (COLLET et al., 1991).
Das Verständnis der Molekularbiologie von Pestiviren hat in den letzten Jahren erhebliche
Fortschritte gemacht. So wurde u.a. die Genomorganisation der Pestiviren aufgeklärt. Das
Genom der Pestiviren kodiert vom 5′- zum 3′-Ende für die Proteine Npro, C, Erns, E1, E2, p7,
NS2-3, (NS2), (NS3), NS4A, NS4B, NS5A, NS5B (BECHER et al., 1998) (Abb. 1).
Das
Npro
ist
ein
NS-Protein
mit
kotranslationell
autoproteolytischer
Aktivität
(WISKERCHEN et al., 1991).
Pestiviren besitzen drei Hüllglykoproteine, die im 5′ terminalen Bereich des Genoms kodiert
werden. Diese Glykoproteine sind Erns (BVDV gp48, KSPV gp44/48), E1 (BVDV gp25,
KSPV gp33) und E2 (BVDV gp53, KSPV gp55), die über Disulfidbrücken Komplexe bilden,
welche in die Virushülle integriert sind (THIEL et al., 1991). Die drei Glykoproteine und das
Kapsidprotein C stellen die Virusstrukturproteine dar.
Das Erns-Protein (E steht für „envelope“) ist stark glykolisiert (RÜMENAPF et al., 1993). Es
hat keine hydrophobe Region, die als Membrananker dienen könnte und wird deswegen von
infizierten Kulturzellen in den Überstand sezerniert (WEILAND et al., 1992). Das Erns besitzt
eine Ribonuklease- (RNase)-Aktivität und spielt eine Rolle bei der Virusreplikation. Es
induziert die Bildung nAk (WINDISCH et al., 1996).
Gegen das E1 gerichtete nAk wurden bisher nicht beschrieben.
Das immundominante Protein ist das E2-Glykoprotein. Die nach einer Infektion gebildeten
nAk sind vorzugsweise gegen das E2-Glykoprotein gerichtet (BOLIN et al., 1988;
WEILAND et al., 1990)
Für p7 ist bisher keine Funktion bekannt.
Das NS-Protein 2-3 besitzt Protease-(P) und Helikaseaktivität (H). Ruminante Pestiviren
werden aufgrund ihres Verhaltens in permissiven Zellkulturen in zwei Biotypen unterteilt.
Das Virus des nicht-zytopathogenen (nzp) Biotyps läßt sich in Zellkulturen vermehren, ohne
dass die Zellkulturen makroskopisch oder mikroskopisch sichtbar geschädigt werden
(BAKER et al., 1954). Das Virus des zytopathogenen (zp) Biotyps führt dagegen nach
einigen Tagen zu einem zytopathischen Effekt (ZPE). KSPV und BDV Isolate gehören
15
überwiegend dem nzp Biotyp an. Das nichtstrukturelle Gen NS2-3 wird von beiden Biotypen
in der infizierten Zelle gebildet. Bei den zp Viren findet sich jedoch zusätzlich ein
Spaltprodukt des NS2-3, das NS3. Dieses wird für die Ausprägung der Zytopathogenität
verantwortlich gemacht. Nach Infektion mit zp Pestivirus ist zusätzlich zum NS-protein NS23 stets NS3 nachweisbar, das nach Infektion mit nzp Pestivirus nicht auftritt (MEYERS u.
TIEHL, 1996). Beim Krankheitsbild der Mucosal Disease (MD) (siehe 2.2.3) lassen sich
immer beide Biotypen isolieren.
Anhand von Sequenzanalysen der nichttranslatierten Region des 5′-Endes von BVDV lassen
sich zwei Genotypen unterscheiden. Die meisten bisher in Deutschland untersuchten BVDVIsolate gehören danach dem Genotyp 1 an (TAJIMA et al., 2001). Beide Genotypen können
u.a. respiratorische Symptome, persistierende Virämie und MD hervorrufen (LIEBLER et al.,
1995). Die Viren, die aus einigen mit ausgeprägten Hämorrhagien verendeten Tieren isoliert
wurden, gehörten dem Genotyp 2 an. Die Homologie der Nukleinsäure-Sequenzen zwischen
dem BVDV des Genotyps 1 im Vergleich zu Sequenzen von KSP-Viren ist deutlich größer
als zu den Sequenzen des BVDV des Genotyps 2. Dieser Genotyp zeigt Ähnlichkeiten von
nahezu 90 % mit BDV-Isolaten (RIDPATH et al., 1994).
Npro C
Erns
E1
E2
P7
NS2-3
NS2
5′
Strukturproteine
NS4a
NS4b
NS5a NS5b
RPol
NS3
P
Hel
3′
Nicht-Strukturproteine
Spezies
Wirtsspektrum
KSPV
Schwein
BDV
Schaf, Schwein, Rind
BVDV 1
Rind, Schaf, Schwein, Ziege, Hirsch, Reh, Büffel
BVDV 2
Rind, Schaf, Schwein
Atypische Pestiviren
Giraffe, Rentier (eine nähere Verwandtschaft mit BDV)
Abb. 1: Genomorganisation von Pestiviren (Hel – Helikase/NTPase; RPol – RNS-abhängige RNS-Polymerase)
(MEYERS u. THIEL, 1996; BECHER et al., 2001) und Wirtsspektrum von Pestiviren (SCHIRRMEIER et al.,
2000)
16
2.2. Klinische Erscheinungen nach Pestivirusinfektionen und das Wirtsspektrum von
Pestiviren
Die Pestiviren verursachen Allgemeinerkrankungen unterschiedlicher Ausprägung von
subklinisch bis schwer. Postnatale akute Infektionen verlaufen i.d.R. inapparent mit Virämie,
Leukopenie und Immunsuppression. Nach akuter Infektion immunkompetenter seronegativer
Tiere können aber auch Fieber, Depression, Anorexie, respiratorische Erkrankungen und/oder
ein hämorrhagisches Syndrom, das durch Thrombozytopenie und Blutungen im Bereich der
Schleimhäute und inneren Organen gekennzeichnet ist, beobachtet werden.
Alle Pestiviren können transplazentar die Föten trächtiger Tiere infizieren. Sobald sich ein
seronegatives Muttertier während der Gravidität infiziert, treten nAk auf, die jedoch auf den
Fötus nicht übertragen werden können. Das Immunsystem des Fetus erlangt am Anfang des
zweiten Trimesters der Trächtigkeit seine Immunkompetenz und transplazentare Infektionen
danach führen zur Bildung nAk durch den Fetus und zur Eliminierung des Pestivirus. Diese
Tiere werden mit präkolostralen Ak geboren. Vor der Ausreifungsphase des Immunsystems
ist der Fetus immuntolerant und kann daher eine Infektion mit dem Pestivirus nicht
eliminieren.
Die
klinisch-pathologischen
Veränderungen
des
Fetus
hängen
vom
Trächtigkeitsstadium des Muttertieres bzw. vom Entwicklungsstadium des Immunsystems des
Fetus und somit vom Entwicklungszustand der fetalen Organe zum Zeitpunkt der Infektion ab
(SCHULTZ, 1973).
Erfolgt die Infektion des Fetus vor der Ausbildung der Immunkompetenz, entwickelt er eine
spezifische Immuntoleranz gegenüber dem Virus, welches danach im Fetus persistiert
(BAKER, 1987). Als persistierende Virämiker geborene Jungtiere können eine verzögerte
oder
unzureichende
Körperentwicklung,
Myelinisierungsstörungen
im
zentralen
Nervensystem oder Thymushypoplasie mit nachfolgender Immunsuppression zeigen (ROTH
et al., 1986; LIESS et al., 1987). Im sehr frühen Stadium, kurz nach der Nidationsphase, kann
durch eine transplazentare Infektion der Embryo abgetötet und resorbiert werden. Etwas
später kann es zum Abort oder Mumifikation der Frucht kommen.
Außer bei Rindern, Schafen und Schweinen kann auch bei Ziegen (TAYLOR et al., 1977;
LOKEN et al., 1991; DEPNER et al., 1991), Wildwiederkäuern (DOYLE u. HEUSCHELE,
17
1983; KOCAN et al., 1986; NETTLETON, 1987) und Wildschweinen (LEFORBAN u.
CARIOLET, 1992) eine Pestivirusinfektion vorkommen (Abb. 1).
Experimentelle Infektionen von Schweinen mit BD-Viren porzinen und ovinen Ursprungs
sind möglich (EDWARDS et al., 1995). Bei einer experimentellen Infektion von Schweinen
mit den BD-Virusstämmen 137/4 und Chemnitz konnten keine Virämie und keine klinischen
Symptome festgestellt werden. Dagegen wurde nach Infektion tragender Sauen mit BDV eine
transplazentare Übertragung nachgewiesen, die sowohl zum Fruchttod als auch zu
virämischen Ferkeln führte (SCHIRRMEIER et al., 2000).
Während eine Infektion von Schweinen mit ruminanten und ovinen Pestiviren auch in der
Natur auftritt (SNOWDON u. FRENCH, 1968; CHARBREY et al., 1976; ROEHE et al.,
1992; OGUZOGLU et al., 2001), sind KSP-Infektionen der Ziege (JACOTOT, 1939), beim
Schaf (ZICHIS, 1939) und beim Rind (DAHLE et al., 1987) nur experimentell durchgeführt
worden. Infektionen mit BVDV oder ovinen Pestiviren führen bei Schweinen zur
Serokonversion und können Fruchtbarkeitsstörungen (SNOWDON u. FRENCH, 1968) oder
klinische Erscheinungen hervorrufen (FRENCH u. SNOWDON, 1977).
Serologische Untersuchungen zeigten, dass erstere anscheinend in der Schweinepopulation
weit verbreitet sind (TERPSTRA u. WENSVOORT, 1988) und auch bei Wildschweinen
vorkommen (DAHLE et al. 1993).
2.2.1. Klassische Schweinepest
Erstmals wurde die KSP im Jahre 1833 im Staat Ohio in den USA beschrieben. Bereits 1862
trat die Seuche in Großbritannien auf und breitete sich über Skandinavien ins restliche Europa
aus. Im Jahre 1903 wurde die Virusätiologie der KSP von DE SCHWEINITZ und DORSET
aufgeklärt.
Die klassische Schweinepest verläuft als zyklische Allgemeininfektion. In Abhängigkeit von
der Virulenz des Erregers sowie Alter und Kondition des Wirtes kann die Erkrankung
perakut, akut, chronisch oder klinisch inapparent verlaufen (VAN OIRSCHOT, 1988).
Klinisch milde oder inapparente Verläufe werden vor allem bei erwachsenen Tieren (Sauen
und Ebern) beobachtet. Erholen sich die Tiere nach der Infektion, werden nAk gebildet.
Normalerweise sind junge Tiere anfälliger (DEPNER et al., 1998).
18
Zu den vom Virus abhängigen Faktoren für den Krankheitsverlauf zählen die Virulenz eines
Virusstammes oder –isolates , die Virusdosis des Infektionsmodus sowie der Ursprung und
die Reinheit des Virusisolates (DAHLE u. LIESS, 1995).
Die KSPV-Feldisolate der 90er Jahre zeigen unter experimentellen Bedingungen eher mäßige
Virulenz, wobei sowohl akute als auch chronische Verlaufsformen beobachtet werden
(FLÖGEL-NIESMANN, pers. Mitteilung). Die perakute Verlaufsform wird selten beobachtet.
Die Einteilung der KSPV-Isolate nach ihrer Virulenz ist schwierig (MITTELHOLZER et al.
2000). Bei der perakuten Verlaufsform der Erkrankung, die durch hochvirulente Erreger
ausgelöst wird, kommt es zwei bis fünf Tage p.i. zum plötzlichen Tod der Tiere ohne
deutliche klinische Symptome (DUNNE, 1973).
Bei der akut verlaufenden Schweinepest sind die ersten klinischen Symptome eine
zunehmende Depression der Tiere und ein Anstieg der Körpertemperatur innerhalb von sechs
bis sieben Tagen p.i. auf Werte um 41°C. In der Folge werden häufig zunehmende
Inappetenz, Augen- und Nasenausfluß, Konjunktivitis, Durchfall oder Verstopfungen sowie
Erbrechen beobachtet. Im Endstadium treten ein typisches Schwanken der Hinterhand und
Krämpfe auf. Häufig werden eine Zyanose der Haut besonders an den Ohren und Blutungen
in der Unterhaut auf den Serosen des Darmes und in den Lymphknoten beobachtet. Der
Ausprägungsgrad dieser klinischen und pathologisch-anatomischen Symptome bilden die
Basis
bei
der
Klassifizierung
der
KSPV-Stämme
hinsichtlich
ihrer
Virulenz
(MITTELHOLZER et al. 2000). Bei letal verlaufender akuter KSP sind meistens nur geringe
Mengen nAk kurz vor Eintritt des Todes nachweisbar. Bei Rekonvaleszenten sind nAk ab der
zweiten bis dritten Woche vorhanden (DEPNER et al., 1994). Die Mortalität bei der akuten
Schweinepest liegt zwischen 30% und 100% (VAN OIRSCHOT, 1988).
Eine chronische Verlaufsform tritt bevorzugt nach Infektion mit mäßig virulenten Isolaten
auf. Bei der chronischen Verlaufsform zeigen die Tiere bis zu 3 Monaten unspezifische
Krankheitserscheinungen wie intermittierendes Fieber, Kümmern oder chronischen Durchfall.
Die Tiere scheiden während der gesamten Krankheitsdauer kontinuierlich Virus aus und
sterben schließlich. Aufgrund der untypischen klinischen und pathologischen Erscheinungen
ist die Diagnose oft schwierig. Die nAk sind erst nachweisbar, wenn ihre Konzentration höher
als die Viruskonzentration im Blut ist, was kurzfristig in der Phase der klinischen Besserung
19
zwischen der dritten und sechsten Woche nach der Infektion geschehen kann (DEPNER et al.,
1996).
Die subklinische Form ist gefährlich, da die Symptome uncharakteristisch sind und ein
Erkennen der Schweinepest erschweren (BÜTTNER u. AHL, 1998).
Weiterhin wurden diaplazentare Infektionen beschrieben, die zu Aborten, Mumifikation oder
Mißbildungen der Föten und der Geburt persistierend virämischer Ferkel führen (FREY et al.,
1980).
2.2.2. Border Disease
BD wurde erstmalig in Großbritannien im Jahre 1959 beschrieben (HUGHES et al., 1959).
BDV kann horizontal oder vertikal übertragen werden. Es können prä- und postnatale
Infektionen unterschieden werden.
Postnatale Infektionen:
Akute Infektionen beim immunkompetenten Lamm und beim adulten Schaf führen i.d.R. zu
klinischen Erscheinungen. Es können, hauptsächlich
Leistungsdepressionen,
Fieber
und
eine
beim
leichte
Lamm,
vorübergehend
Leukopenie
auftreten.
Krankheitserscheinungen, die der MD gleichen, wurden beim Schaf bisher nur experimentell
erzeugt (BARLOW et al., 1983). MD-ähnliche Erkrankung beim Schaf kann als
persistierende Diarrhoe oder nur als Apathie mit Bewegungsinkoordination oder Festliegen
klinisch evident werden. Als pathologisch- anatomische Befunde beim Schaf konnten
Oesophagitis und katarrhalische Abomasoenteritis beobachtet werden. (NETTLETON u.
ENTRICAN, 1995)
Die meisten bisher beschriebenen BD-Virusstämme waren nzp. Nur für die BD-Virusstämme
Moredun und Cumnock konnten nzp- und zp-Biotypen nach natürlicher Infektion
nachgewiesen werden. Zwischen diesen Viruspaaren wurde bei der Nukleotidsequenzierung
mittels RT-PCR eine 99%ige Homologie festgestellt. Aufgrund dieser großen Homologie
wurden diese zp-Viren als Mutanten der nzp-Viren angenommen (BECHER et al., 1996).
Pränatale Infektionen:
Während der akuten BD-Virusinfektion bei tragenden Tieren ist, ebenso wie bei den übrigen
Pestivirusinfektionen, eine transplazentare Infektion und der Virustransfer auf den Fetus
20
möglich. Vor dem 16. Tag der Trächtigkeit ist die Zygote bzw. der Embryo nicht
empfänglich. Die kritische Phase der intrauterinen Infektion ist mit ca. 60 Tagen anzugeben.
Nach dem 80. Tag der Trächtigkeit reicht die Immunkompetenz des Fetus i.d.R. aus, um die
Infektion zu eliminieren (BARLOW u. PATTERSON, 1982). Bei einer Infektion in frühen
Trächtigkeitsstadien können Resorption der Frucht, Mumifikation, Abort, Totgeburt, Geburt
lebensschwacher Lämmer und teratogene Effekte am Gehirn beobachtet werden (SAWYER,
1992) (Abb. 2).
Der bekannteste Symptomenkomplex ist das sogenannte „Hairy Shaker Syndrome“,
gekennzeichnet durch geringe Geburtsgewichte, Wachstumsprobleme, Vliesveränderungen
und tonisch-klonischen Tremor sowie Ataxie. Die epidemiologische Problematik von
persistent-infizierten Schafen mit und ohne BD-Symptomik wurde beschrieben (LIESS et
al.,1982). Solche Schafe bilden ein permanentes Virusreservoir und sind für die Streuung des
Erregers in den Herden verantwortlich.
Früher
Embryonaltod
Abort
Totgeburt
Teratogene
Effekte
Keine klinischen Erscheinungen
→
Persistent- Virämisches Tier
Immunkompetenz
des Fetus
0
25
50
Alters des Fetus in Tagen
60
75
→
100
Abb. 2: Mögliche Ereignisse nach Infektion des Schaffetus mit dem BDV (SAWYER, 1992)
125
150
Geburt
21
2.2.3. Bovine Virusdiarrhoe - Mucosal Disease
Die Krankheitsbilder der BVD (OLAFSON et al., 1946) und der MD (RAMSEY u.
CHIVERS, 1953) wurden zum ersten Mal in den USA beschrieben. Eine postnatale Infektion
von Wiederkäuern mit dem BVDV verläuft in den meisten Fällen inapparent (PRITCHARD,
1963).
Eine unter besonderen Bedingungen auftretende schwere Verlaufsform der Infektion mit dem
BVDV ist die MD. Das vorherrschende Symptom ist eine Gastroenteritis, die mit
hochgradigen Durchfällen einhergeht. An pathologischen Befunden sind Ulzera und
Erosionen des Gastrointestinaltrakts sowie gelegentlich Hämorrhagien in verschiedenen
Organen zu finden. Das Krankheitsbild ist charakterisiert durch Leukopenie, Fieber,
Speicheln,
Nasenausfluß,
Depression,
Anorexie,
Dehydratation,
Aborte
und
Fruchtbarkeitsstörungen. Neben der MD als Früh- oder Spätausbruch (FRITZEMEIER, 1996)
wurden noch das hämorrhagische Syndrom, Mißbildungen des Zentralen Nervensystems bei
Kälbern sowie in jüngster Zeit perakute Todesfälle beschrieben (TRAUTWEIN et al., 1986;
DONIS et al., 1991; BROWNLIE et al., 1991; LIEBLER et al., 1995; GROOMS et al.,
1998). Viele persistent infizierte Kälber bleiben häufig im Wachstum zurück und sind ein
ständiges Virusreservoir.
Die MD äußert sich zunächst durch unspezifische Symptome wie Fieber, Inappetenz,
Erhöhung der Puls- und Atemfrequenz. Es folgen eine vermehrte Salivation, seromuköser bis
mukopurulenter Nasenfluß, Ulzerationen, Erosionen und Petechien an Flotzmaul, Nase und in
der Maulhöhle (RAMSEY u. CHIVERS, 1953).
Zur Aufklärung der Pathogenese der MD trugen Untersuchungen von BOLIN et al. (1987)
und BRONWLIE et al.(1991) bei. Aufgrund der intrauterinen Infektion mit einem nzp BVDVirus zu einem frühen Zeitpunkt der Gradivität wird infolge der „Immuntoleranz“ ein
persistent virämisches Kalb geboren. BVDV vom zytopathogenen Biotyp, die im Vergleich
mit dem nzp-persistenten Virus antigenisch ähnlich reagierten, wurden für geeignet befunden,
experimentell MD zu induzieren (MOENNIG et al., 1990). Neben der Möglichkeit der
Mutation eines endogenen nzp Virus ist hierbei auch die (exogene) Überinfektion mit einem
homologen zp Virus durch direkten oder indirekten Kontakt des persistent infizierten Tieres
22
mit anderen Rindern oder auch durch Vakzinierung in Betracht zu ziehen. Wurden nun
persistent virämische Tiere mit einem zuvor als homolog charakterisierten zp Virus
überinfiziert, gelang in vielen Fällen die Reproduktion der MD. Es gibt zwei Verlaufsformen
der MD. Zum einem den Frühausbruch der MD (early onset MD) ausgelöst durch zp BVDViren, die dem persistierenden Virus antigenisch homolog sind. Hierbei stirbt das Tier
innerhalb von etwa zwei bis drei Wochen nach der Infektion mit den typischen Symptomen.
Beim Spätausbruch (late onset MD) kann es nach längerer Zeit (Wochen bis Monate) durch
partiell homologes zp BVDV zum Ausbruch der typischen Krankheitssymptome kommen
(FRITZEMEIER, 1996; LÖHR et al., 1998).
2.3. Monoklonale Antikörper gegen Pestiviren
Bevor monoklonale Ak (mAk) zur Charakterisierung von Pestiviren verfügbar waren, konnte
die Unterscheidung des BVD-Virus (GUTEKUNST u. MALMQUIST, 1964; HAFEZ u.
LIESS, 1972b) vom KSP-Virus (PIRTLE u. MENGELING, 1971) nicht vollständig
durchgeführt werden.
Zum ersten Mal wurden gegen BVDV gerichtete mAk von PETERS et al. (1986) und
MOENNIG et al. (1987) beschrieben und zur differenzierten Epitopanalyse verschiedener
Virusisolate bzw. zur Charakterisierung eines Virusisolates genutzt. Es existieren BVDV-,
BDV-, KSPV- und Pestivirus-spezifische mAk (EDWARDS et al., 1988; CAY et al., 1989;
PATON et al., 1994). Die mAk richten sich gegen die Strukturproteine Erns und E2 sowie
gegen das NS2-3 (p125/80) (CORAPI et al., 1990; WEILAND et al.1990, 1992).
Neutralisierende mAk, die gegen das Erns Glykoprotein gerichtet sind (BOULANGER et al.,
1991; WEILAND et al., 1992), wiesen eine vergleichsweise geringe neutralisierende Aktivität
auf. Nur beim Schwein induziert das Erns eine protektive Immunität gegen das KSP-Virus
durch die Bildung nAk (KÖNIG et al., 1995).
Die mAk gegen E2 neutralisieren das KSP-Virus. Mit Hilfe E2 spezifischer mAk wurden für
die Virusneutralisation wichtige Epitope beim KSPV und BVDV charakterisiert. Im
Gegensatz zu polyklonalen Seren vermitteln mAk keine Kreuzneutralisation zwischen KSPV
und BVDV (WEILAND et al., 1990; MOENNIG u. PLAGEMANN, 1992), so dass beide
Viren mit solchen mAk differenziert werden können.
23
EDWARDS u. SANDS (1990) zeigten durch die Anwendung mAk, dass isolierte ältere
KSPV-Isolate einige Epitope nicht mehr exprimierten.
Durch genetische Vergleiche konnten KSPV-Isolate ebenfalls unterschieden werden. Die
meisten ruminanten Pestiviren konnten nicht ausschließlich in BVDV oder BDV unterteilt
werden, obwohl unterschiedliche Untergruppen durch die antigenischen und genetischen
Analysen ermittelt wurden (PATON et al., 1994). Mittels Bindungstests mit mAk, die gegen
den BD-Virusstamm 87/6 hergestellt worden waren, wurden die antigenen Ähnlichkeiten
zwischen den BD-Virusstämmen 137/4 (Schaf) und 87/6 (Schwein) nachgewiesen. Des
weiteren konnte die antigene Ähnlichkeit von 87/6 und dem BD-Virusstamm Moredun belegt
werden. Diese Beobachtungen decken sich mit anderen Kreuzneutralisationsstudien (PATON
et al., 1994).
2.4. Kreuzneutralisation von Pestiviren
Antikörper sind Glykoproteine, die von Plasmazellen gebildet werden. Diese Bildung wird
durch die Bindung eines fremden Moleküls an ihren Antigenrezeptor stimuliert. Die Ak
besitzen dieselbe Bindungsspezifität wie der Antigenrezeptor der Plasmazelle. Bei den
immunogenen Proteinen von Pestiviren existieren teilweise so ähnliche Antigenstrukturen,
dass gegen bestimmte Epitope gerichtete Ak kreuzneutralisieren können.
DARBYSHIRE
(1960)
konnte
mit
Hilfe
der
Agargelimmunodiffusionsmethode
Präzipitationsreaktionen zwischen KSPV-Antigen bzw. BVDV-Antigen mit Antiserum gegen
KSPV bzw. BVDV aufzeigen und damit die Verwandtschaft beider Viren nachweisen. Auch
zwischen
BDV
und
BVDV
wurde
eine
antigene
Verwandtschaft
mittels
Virusneutralisationstests (VNT) nachgewiesen (ACLAND et al., 1972).
Die Serologie stellt eine wertvolle Methode der Virusunterscheidung dar, aber definierte
Serotypen sind bei Pestiviren nicht vorhanden. Zum Beispiel gehören alle KSP-Virusstämme
zum selben Serotyp, darüber hinaus besteht auch Kreuzneutralisation zwischen manchen
KSP-Virusstämmen mit anderen Pestiviren. Dieselben Schwierigkeiten treten auf, wenn
andere BVD- und BD-Viren verglichen werden. Hinzu kommt, dass das Ausmaß der
Kreuzneutralisation stark von individuellen Unterschieden der Tiere und dem Grad der
Stimulation des Immunsystems abhängig ist (PATON, 1995).
24
Serologie
ist
eine
häufig
genutzte
Methode
zur
Differentialdiagnostik.
Die
Kreuzneutralisationstests sind allgemein dazu verwendet worden, um sowohl Ähnlichkeiten
als auch Unterschiede zwischen Pestiviren darzustellen. Die Unterscheidung von KSPV und
BVDV war bald offensichtlich, da die nAk-Titer von polyklonalen Seren i.d.R. viel höher
gegen das homologe als gegen heterologe Virustypen gefunden werden (KUMAGAI et al.,
1962).
LIESS u. PRAGER (1976) beobachteten, dass nach intranasaler KSPV-Inokulation zunächst
nAk gegen KSPV und danach mit Zeit- und Titerdifferenzen stammabhängig auch nAk gegen
BVD-Virusstämme
Virusinfektion
gebildet
wurden.
Sie
konnten
nach
vorausgegangener
BVD-
als Folge einer KSP-Infektion höhere BVD- als KSP-Ak-Titer messen,
abhängig vom Grad der Verwandtschaft zwischen dem zur Infektion verwendeten BVDVirusstamm und dem BVD-Virusstamm, der bei der Messung nAk Anwendung fand. Bei
diesen Infektionsversuchen wurde der schwachvirulente KSP-Virusstamm Glentorf benutzt,
als Testvirusstämme bei den serologischen Untersuchungen auf nAk der KSP-Virusstamm
Alfort/187 und die BVD-Virusstämme A 1138/69 und NADL. Wegen der für diese Stämme
ermittelten Serumtiterdifferenzen wurde auf eine nähere Verwandtschaft zwischen dem KSPVirusstamm Alfort/187 mit dem BVD-Virusstamm NADL als mit dem BVD-Virusstamm A
1138/69 geschlossen.
Spätere Untersuchungen über BDV erbrachten widersprüchliche Aussagen. Unter
Verwendung von wenigen Virusstämmen berichteten LAUDE u. GELFI (1979), dass BDV
nicht eindeutig von BVDV abgegrenzt werden kann, dass allerdings die Ähnlichkeit zwischen
BDV und KSPV weniger auffallend war. Die Arbeit von VANTSIS (1980), der eine geringe
Kreuzneutralisation zwischen verschiedenen BD-Virusstämmen nachwies, ließ vermuten,
dass diese ovinen Pestivirusstämme eine heterogene Gruppe darstellen und zeigte die Gefahr
von allgemeinen Aussagen über antigene Verwandtschaften auf, die allein auf
Untersuchungen von einer zu kleinen Anzahl schlecht charakterisierter Viren beruhen.
Zur Differenzierung von Pestiviren eignen sich letztlich spezifische mAk besser, weil mit
polyklonalen Seren keine definitiven Ergebnisse erzielt werden können. So zum Beispiel
wurde
von
WENSVOORT
et
al.
(1986)
anti-KSPV-mAk
Differentialdiagnostik für KSPV und BVDV benutzt.
produziert
und
zur
25
2.5. Serologische Überwachung
Die KSP gehört zu den anzeigepflichtigen Tierseuchen (EDWARDS et al., 2000; MOENNIG,
2000). Die gesetzliche Grundlage für die Bekämpfung der KSP wurde in der SchweinepestVerordnung beschrieben (EU-Richtlinie 80/217/EWG).
Zum Nachweis, dass eine Schweinepopulation frei von KSPV ist, werden von den
Veterinärbehörden des jeweiligen Landes Schweinebestände stichprobenartig auf das
Vorhandensein nAk gegen KSPV untersucht. Ergeben diese ein negatives Ergebnis, ist die
Schweinepopulation KSP-frei.
Zum Nachweis von Ak gegen KSPV werden routinemäßig kommerziell erhältliche Testkits
(ELISA) benutzt. Aufgrund unterschiedlicher Spezifitäten müssen im ELISA ermittelte
fragliche und positive Seren grundsätzlich differentialdiagnostisch im Neutralisationstest
(NT) abgeklärt werden.
2.6. Serologische KSP-Diagnostik
Da bei Schweinen BVDV-nAk-Titer nachgewiesen werden können, müssen Fehlinterpretationen bei der serologisch-diagnostischen Untersuchung vermieden werden.
Die Induktion von nAk gegen KSPV durch BVDV und umgekehrt wurde auch bei
Felduntersuchungen mehrfach bestätigt. BVDV Ak wurden in den 70er Jahren häufig in
Schweineseren gefunden (OHNACKER, 1980; HYERA et al., 1987; DAHLE et al., 1991).
Diese Kreuzreaktionen sind in der KSP-Diagnostik besonders störend.
Daher wurde eine einheitliche serologische Differentialdiagnostik zwischen KSPV und
BVDV etabliert und ein BVDV Referenzstamm zur Abklärung von Kreuzreaktionen
empfohlen (MÜLLER et al., 1997). Durch die differentialdiagnostische Untersuchung muß
gemäß der Schweinepestverordnung abgeklärt werden, ob die nachgewiesenen nAk Folge
einer Infektion mit KSPV oder mit BVDV waren. Für die KSP Diagnostik wurde Alfort/187
festgelegt (DAHLE u. LIESS, 1995).
Seit dem Frühjahr 1998 wurden in deutschen Schweinebeständen vermehrt Ak gegen BDV
festgestellt (SCHIRRMEIER et al., 1999), deren Abklärung sich wegen der fehlenden
26
Kreuzreaktion zu BVDV zunächst problematisch gestaltete. Dies wurde zum Anlaß für
systematische Untersuchungen zur Etablierung einer Differentialdiagnostik für BDV
genommen, da für die BDV-Differentialdiagnose ein Referenzstamm bisher nicht festgelegt
wurde.
27
3. Eigene Untersuchungen
3.1. Material
3.1.1. Zellkulturen
3.1.1.1 Fetale Kälbernieren Zellen
Fetale Kälbernieren (FKN)-Zellen wurden im Institut für Virologie der Tierärztlichen
Hochschule Hannover aus drei bis fünf Monate alten Kälberfeten gewonnen. Das Alter des
Fetus wurde anhand der folgenden Formel (NOAKES 1986) bestimmt:
Alter der Frucht in Tagen = 2,5 x (Nacken-Steißlänge in cm + 21)
Aus der Organsuspension wurden die Zellen gewonnen und eine Subkultur durchgeführt. Die
Zellen wurden nach ihrer Gewinnung bei –80°C eingefroren (siehe unter 3.2.1.1), bei Bedarf
aufgetaut und bis zur 5. Passage verwendet.
3.1.1.2. Porzine Nierenzelllinie
Bei diesen Zellen (Porcine Kidney - PK(15)A) handelt es sich um eine permanente
epitheloide Zelllinie. Die im Institut für Virologie verwendete Linie (Sus scrofa, Porcine
Kidney (15) Amsterdam Zellen) wurde im Jahre 1974 durch Einzelzellklonierung erhalten
(LIESS, pers. Mitteilung). Der Klon wird als Standardzelllinie für die KSP-Diagnostik im
EURL verwendet und bis zur ca. 60. Passage benutzt (genaue Zusammensetzung unter
3.2.1.2.).
3.1.1.3. Fetale Schaf Thymus – Zellkulturen
Die permanente Zelllinie Schaf-Thymus (SFT-R) stammte von der Bundesforschungsanstalt
für Viruskrankheiten der Tiere (BFAV), Insel Riems (Katalog Nummer: 43). Diese Zellen
28
wurden für die Vermehrung von Testviren (siehe unter 3.1.2) benutzt und bis zur ca. 350.
Passage verwendet.
3.1.2. Herkunft der verwendeten Pestiviren
Alle verwendeten Pestiviren wurden im indirect peroxidase linked antibody assay (IPLA)
zunächst mit Hilfe von mAk charakterisiert. Zur Ermittlung der für die Vermehrung
optimalen Zellkultur wurden sie in den verschiedenen Zellkulturen vermehrt und
anschließend titriert. Für den Einsatz im NT wurde der Virustiter bestimmt und die
Gebrauchsverdünnung für 100 KID50/ 50µl errechnet.
In dieser Arbeit wurden insgesamt 16 Pestivirusstämme bzw. Isolate verwendet. Es wurde mit
BDV-Isolaten vom Schaf, nicht-KSP-Pestivirusisolaten vom Schwein, dem KSPVReferenzstamm Alfort/187 und dem BVDV Referenzstamm NADL sowie drei BVDV 2
Stämmen gearbeitet. Die Herkunftsangaben sind den Tabellen 1 bis 3 zu entnehmen.
3.1.2.1. Ovine Pestiviren
Vier verschiedene BD-Virusstämme ovinen Ursprungs (Tabelle 1) wurden verwendet.
Tabelle 1: Verwendete Ovine Pestiviren
Virus-Bezeichnung
Herkunft
Tierart und Virus-Typ
Referenz
Aveyron*
Merieux, Frankreich
Schaf, BDV
Chappuis et al.(1986)
Moredun*
CVL, Großbritannien
Schaf, BDV, zp
Vantsis et al.(1976)
137/4*
CVL, Großbritannien
Schaf, BDV
Vilcek et al (1997)
D 27/99 Chemnitz
Deutschland
Schaf, BDV
Scharrschmidt et
al.(2000)
* Diese Stämme werden von verschiedenen Labors als BDV Referenzstämme verwendet.
29
3.1.2.2. Porzine Pestiviren
Fünf Pestivirusisolate (nicht-Schweinepest) porzinen Ursprungs wurden benutzt. (Tabelle 2)
Tabelle 2: Verwendete Porzine Pestiviren
Virus-Bezeichnung
Herkunft
Tierart und Virus-Typ
Referenz
Frijters**
Niederlande
Schwein, BDV
Vilcek et al.(1996)
SF 6/87**
Großbritannien
Schwein, BDV
Roehe et al.(1992)
10754/Han 00
Deutschland
Schwein, BDV
Oguzoglu et al.(2001)
10421/94
Deutschland
Schwein, BVDV 1
Frey et al. (1995)
1726/98 Salza
Deutschland
Schwein, BVDV 1
Schirrmeier et al. (1999)
D 15/99 Arnsberg
Deutschland
Schwein, BVDV 1
Schirrmeier et al. (1999)
3.1.2.3. Weitere Pestiviren
Zum Vergleich der Versuchs- bzw. Testseren wurde der KSPV - Referenzstamm Alfort/187,
der BVDV Referenzstamm NADL und zwei BVDV 2 Stämme benutzt. (Tabelle 3)
Die beiden BVDV 2 Isolate wurden nur für die Seren aus Versuch 2001/1 eingesetzt.
Ein BVDV 2 Isolat (CS8644) wurde nur für die aus den Niederlanden erhaltenen Seren der
Firma Intervet benutzt.
Ein BVDV Isolat (1138/69) wurde nur für die Schafseren eingesetzt.
Tabelle 3: Weitere zu Testzwecken verwendete Pestiviren
Virus-Bezeichnung
Herkunft
Tierart und Virus-Typ
Referenz
Alfort/187***
Frankreich
Schwein, KSPV
Aynaud (1968), Dahle u. Liess (1995)
NADL***
USA
Rind, BVDV
Gutekunst u. Malmquist (1963)
Gießen 1
Deutschland
Rind, BVDV 2
Becher et al., (1999)
104/98
Deutschland
Rind, BVDV 2
Tajima et al., (2001)
CS8644
Deutschland
Rind, BVDV 2
Wolfmeyer et al., (1997)
1138/69
Deutschland
Rind, BVDV
Frey u. Liess (1971)
** Diese Stämme werden von verschiedenen Labors als BDV Referenzstämme verwendet.
*** Referenzstamm
30
3.1.3. Leukozytenproben von Schweinen
Die Leukozyten, die von insgesamt 23 Schweinen aus dem EURL für KSP - Versuch 2001/1
– stammten, wurden am dritten, fünften und siebten Tag nach der Infektion entnommen und
auf BDV mittels Virusisolierung getestet. Der Versuchsplan ist in Tabelle 4 beschrieben.
3.1.4. Organproben von Schweinen
Ende August 2000 wurde in einem schweine- und schafhaltenden Betrieb in Niedersachsen
ein KSP Verdachtsfall beschrieben. Bei Ferkeln traten milde KSP-ähnliche klinische
Symptome auf. Da der Betrieb in einem Gebiet lag, in dem kürzlich Wildschweinepest
aufgetreten war, führte dieser epidemiologische Zusammenhang zum KSP-Verdacht. Die
kulturellen Untersuchungen von Organproben aus Ferkeln (Milz, Niere, Tonsille) wurden wie
unter 3.2.3. beschrieben durchgeführt. In dem gleichen Betrieb wurden von 35 Schafen
Serumproben entnommen. Die Schafe zeigten keine klinischen Symptome. Da die Schweine
aufgrund des KSP-Verdachts gemäß Schweinepestverordnung sofort getötet wurden, standen
für nachfolgende Untersuchungen keine Schweineseren sondern nur noch Schafseren zur
Verfügung.
3.1.5. Eingesetzte Seren
3.1.5.1. Referenz- und Versuchsseren
Referenzseren aus dem EURL für KSP
Pestivirusantikörperhaltige
Referenzseren
von
Schweinen
wurden
ebenfalls
zur
Charakterisierung des Pestiviren im Neutralisation Peroxidase Linked Antibody Assays
(NPLA) verwendet. Diese Seren stammen aus der Serumbank der EURL für KSP und waren
experimentell mit porzinen Pestiviren (BD-Frijters, ‚Salza‘ und ‚10421/Han94‘) hergestellt
worden (FLÖGEL-NIESMANN, pers. Mitteilung). (Tabelle 5)
31
Seren aus dem Versuch 1990/25 des EURL für KSP
Diese Seren stammten aus dem EURL für KSP und waren im Jahre 1990 experimentell von
mit dem BD-Virusstamm Aveyron infizierten 20 Schweinen produziert worden (DAHLE,
unveröffentlicht). Die Seren wurden wöchentlich ab der Inokulation bis zur 18. Woche post
infektionem (wpi) gewonnen. In dieser Arbeit wurden Seren aus den Wochen 0, 2, 4, 6, 8, 12
und 18. post infectionem untersucht. (Tabelle 5)
Seren aus dem Versuch 2001/1 des EURL für KSP
Für diesen Versuch standen insgesamt 23 Läuferschweine der Deutschen Landrasse (ca.
20 kg) zur Verfügung. Verschiedene Pestivirusantikörperhaltige Schweineseren (nicht-KSP)
wurden zur Verwendung als Referenzseren für Ak-ELISAs und/oder im Ringtest im EURL
für KSP produziert (FLÖGEL-NIESMANN, unveröffentlicht). Das Versuchsprogramm und
die für die Infektion verwendeten Pestiviren sind in Tabelle 4 beschrieben. Alle Tiere wurden
intranasal infiziert. Zur Darstellung der Antikörperkinetik wurden Blutproben in
wöchentlichem Abstand gewonnen und titriert. (Tabelle 5)
32
Tabelle 4: Versuchsprogramm für Versuch 2001/1
Eut. und Serumgew. Versuchsablauf und RT* KID50/in 5 ml pro Tier
17 dpi (2.Woche)
Erste Inokulation, intranasal, 106,7
Schwein Nr.
Tier 1- 56
Virus
Moredun
Tier 2- 57
Moredun
85 dpi (11.Woche)
(3 wpi) Booster, 104,95
Tier 3- 58
Moredun
85 dpi (11.Woche)
(6 wpi) Booster, 106,2
Tier 4- 59
Moredun
85 dpi (11.Woche)
(9 wpi) Booster, 3x106 /250 ml oral
Tier 5- 60
Isolat 10754/Han 00
64 dpi (9.Woche)
Erste Inokulation, intranasal, 106,45
Tier 6- 61
Isolat 10754/Han 00
70 dpi (10.Woche)
(3 wpi) Booster, 104,95
Tier 7- 62
Isolat 10754/Han 00
70 dpi (10.Woche)
(6 wpi) Booster, 104,45
Tier 8- 63
Isolat 10754/Han 00
70 dpi (10.Woche)
Tier 9- 64
Arnsberg
64 dpi (9.Woche)
Erste Inokulation, intranasal, 106,2
Tier 10-65
Arnsberg
69 dpi (10.Woche)
(3 wpi)Booster, 103,95
Tier 11- 66
Arnsberg
69 dpi (10.Woche)
(6 wpi) Booster, 105,2
Tier 12- 67
Arnsberg
69 dpi (10.Woche)
Tier 13- 68
Tier 14- 69
BVDV 2
BVDV 2
72 dpi (10.Woche)
64 dpi (9.Woche)
Erste Inokulation, intranasal (Giessen 1), 104,7
Tier 15- 70
BVDV 2
72 dpi (10.Woche)
(3 wpi) intranasal (104/98), 105,2
Tier 16- 71
BVDV 2
84 dpi (11.Woche)
(6 wpi) Booster (Giessen 1 + 104/98), 104,95
Tier 17- 72
Tier 18- 73
Tier 19- 74
BVDV 2
BVDV 2
BVDV 2
84 dpi (11.Woche)
84 dpi (11.Woche)
64 dpi (9.Woche)
9 wpi vor Serumgew. Booster mit CSF 123
Tier 20,23-75,78
Negativkontrollen
04.04 - 05.04.2001
* RT - Rücktitration des Inokulums
3.1.5.2. Serumproben aus dem Feld
Die Seren aus Deutschland stammten von verschiedenen Herden. Aus der Serum-Sammlung
der BFAV/Insel Riems standen insgesamt 13 Serumproben zur Verfügung. Bei diesen Proben
handelte es sich um BD-Ak positive Feldseren. (Tabelle 6 )
Aus einer Herde in Sachsen-Anhalt kamen insgesamt 22 Seren. Dieser Bestand fiel 1999 bei
serologischen Überwachungsuntersuchungen mit niedrigen Titern gegen KSPV auf.
Epidemiologische Verbindungen zu einem bekannten Betrieb in Schottland (siehe
Großbritannien) oder zu Schafen konnten nicht gefunden werden. (Tabelle 6)
33
Bei den Seren aus Schleswig-Holstein handelt es sich um Feldseren von infizierten
Schweinen (Tabelle 6), die aus Großbritannien importiert wurden (siehe dort).
Die Seren aus Thüringen stammten von Sauen, in deren Bestand 1998 das Pestivirusisolat
„Salza“ aus Schweinefeten isoliert wurde. Im Betrieb waren klinische Erscheinungen (erhöhte
Abortrate) aufgetreten. Es handelte sich um einen gemischten Bestand mit Schafen und
Rindern. (Tabelle 6)
Frankreich
Diese Seren wurden experimentell mit BDV (genaues Isolat nicht bekannt) im Schwein
produziert. (Tabelle 7)
Großbritannien
Die Seren stammten von einem Schweinezuchtbetrieb in Schottland, bei dem enger Kontakt
der Schweine zu einer Schafherde möglich war. Somit haben sich diese Schweine
wahrscheinlich mit einem BDV-Isolat infiziert und Ak gebildet. Ein Pestivirusisolat konnte
weder in den Schweinen noch in den Schafen gefunden werden.
Pestivirusantikörper positive Schweine sind nach Deutschland exportiert worden, wo sie bei
serologischen Überwachungsuntersuchungen im KSP-Ak-ELISA auffielen und (siehe Seren
aus Schleswig-Holstein) einen KSP-Verdacht auslösten. (Tabelle 7)
Niederlande – 1
Diese Seren wurden von der Firma Intervet experimentell mit BVDV 2 „Gießen“ im Schwein
produziert. (Tabelle 7)
Niederlande – 2
Es handelt sich um Feldseren aus dem Niederlanden. In den Niederlanden ist der
Pestivirusstamm Frijters als Lokalstamm in der Schweinepopulation vorhanden. Folglich
findet man häufig Kreuzreaktionen mit KSP und diesen Virus in Schweineseren. (Tabelle 7)
34
Portugal
Zeitgleich mit der KSP-Epidemie 1997 in Spanien wurden im benachbarten Portugal
Schweineseren entdeckt, die im KSP-Ak-ELISA positiv reagierten. Diese Seren wurden zur
Abklärung an das EURL für KSP geschickt. Ak konnten weder gegen KSPV noch gegen
BVDV gefunden werden. (Tabelle 7)
Es wurden insgesamt 517 Rinder-, Schaf- und Schweineseren untersucht. (Tabelle 5 bis 8)
Tabelle 5: Referenz- und Versuchsseren aus dem EURL für KSP
Herkunft
Referenzseren vom EURL für KSP
Versuch 1990/25 (0,2,4,6,8,12,18.Woche)
Versuch 2001/1 (von 0.Woche bis 11.Woche)
Insgesamt
Anzahl
3
126
184
313
Tabelle 6: Aus Deutschland stammende Schweineseren
Herkunft
Seren Deutschland (BFAV Insel Riems)
Sachsen-Anhalt (LVUA)
Schleswig-Holstein (LVUA)
Thüringen (LVUA)
Insgesamt
Anzahl
13
22
14
30
79
Tabelle 7: Aus anderen europäischen Ländern stammende Schweineseren
Land (Labor)
Frankreich (AFSSA-Ploufragan)
Großbritannien – Schottland (VLA, Weybridge)
Niederlande – 1 (Intervet)
Niederlande – 2 (ID-Lelystad)
Portugal (LNIV)
Insgesamt
Anzahl
5
12
5
36
28
86
Tabelle 8: Aus Deutschland stammende Rind- und Schafseren
Herkunft und Tierart
Rind, Tierärztl. Fakultät, Universität München
Schaf, Niedersachsen (SVUA,Hannover)
Insgesamt
Anzahl
4
35
39
35
3.1.6. Monoklonale Antikörper
Es wurden neben den am hiesigen Institut vorhandenen auch die vom Central Veterinary
Laboratories Agency (CVL) (England) zur Verfügung gestellten mAk eingesetzt. Diese mAk
sind in Tabelle 9 bezüglich ihrer Spezifität aufgeführt.
Tabelle 9: Verwendete monoklonale Antikörper
Bezeichnung des mAk Homologe Virusstämme Proteinspezifität
Referenz
HC/34
Alfort/187 (KSPV)
E2
Hess et al. (1988)
WS 363
87/6 (BDV)
Erns
Paton et al. (1994)
WS 368
87/6 (BDV)
Erns
Paton et al. (1994)
WS 371
87/6 (BDV)
Erns
Paton et al. (1994)
WS 381
87/6 (BDV)
E2
Paton et al. (1994)
WS 384
87/6 (BDV)
E2
Paton et al. (1994)
BVD/CA 3
NADL (BVDV)
E2
Moennig et al. (1987)
BVD/CA 34
7443 (BVDV)
E2
Bolin et al. (1988)
BVD/C 16
NADL (BVDV)
NS 2-3
Peters et al. (1986)
36
3.2. Methoden
3.2.1. Anzucht und Passage von Zellkulturen
Um festzustellen, in welchen Zellkulturen die verschiedenen Virusstämme optimal
replizieren, wurden mit drei verschiedenen Zellkulturen gearbeitet. Zur Kultivierung der
Zellen wurden „ EAGLE`S Minimum Essential Medium (EMEM)1“ und die Modifikation
dieses Mediums nach DULBECCO und FREEMAN (1959) (Edulb)2 mit Antibiotika
(100 I.E./ml Penicillin3 und 0,05 mg/ml Streptomycin4) verwendet. FKN-Zellen und SFT-R
Zellen erhielten als Erhaltungsmedium zur Vermehrung Edulb mit 5% fetalem Kälberserum
(FKS)5 und porzine Nierenzellen als Erhaltungsmedium EMEM mit 5% FKS. Für die
einzelnen Untersuchungen selbst wurden alle Zellen in Mikro- und Makrotiterplatten mit
Edulb mit 5% Rinderserum6 kultiviert. Sowohl das verwendete FKS als auch das
Rinderserum wurden zuvor auf Freisein von Pestiviren und BVDV-nAk untersucht.
3.2.1.1. FKN- Zellen
FKN-Zellen aus bei – 80 °C eingefrorenen Primärkulturen wurden bei Bedarf in einem 37°CWasserbad aufgetaut, zum Entfernen des Dimethylsufloxids22 (DMSO) in EMEM verdünnt
und anschließend für 10 min bei 200 x g zentrifugiert. Die Zellen wurden in 50 ml
Anzuchtmedium resuspendiert und in 162 cm2 große Plastik-Zellkulturflaschen7 überführt.
Nach drei - bis viertägiger Inkubation war der Zellrasen konfluent. Für eine Zellkulturpassage
wurde unter Einwirkung von 0,125 % iger Versen-Trypsin-Lösung29,
30
der Zellrasen vom
Flaschenboden abgelöst. Die Zellen wurden einmal mit PBSM gewaschen und dann zunächst
für 10 min bei 200 x g zentrifugiert, das Zellpellet in Erhaltungsmedium resuspendiert und
eine Zellzählung mit Hilfe einer Zählkammer nach Thoma8 vorgenommen. Die Zelldichte
wurde für Plastik-Zellkulturflaschen auf 50.000 Zellen/ml, für Kulturröhrchen auf 80.000100.000 Zellen/ml, für Makrotiterplatten9 auf 100.000 Zellen/ml und für Mikrotiterplatten10
1 bis 10, 22, 29, 30 siehe Anhang
37
auf 150.000 Zellen/ml eingestellt. Zur Kontrolle auf Kontamination mit Pestiviren wurden die
Zellen in einer Makrotiterplatte eingesät.
Die nicht benötigte Menge Zellsuspension wurde nach Zusatz von 10% DMSO in Portionen
von 1 ml (2x106/ml) bei –80°C wieder eingefroren.
3.2.1.2. PK(15) und SFTR-Zellen
Zur Vermehrung wurden die PK(15)-Zellen und SFT-R Zellen mit dem jeweiligen
Erhaltungsmedium in 75 cm2 große Zellkultur-Plastikflaschen11 gehalten. Die Passage der
Zellen wurde durchgeführt wie für FKN-Zellen beschrieben.
3.2.2. Virusvermehrung
Zur Virusvermehrung wurden die Zellen mit dem Anzuchtmedium in 25 cm2 oder in 75 cm2
große Zellkultur-Plastikflaschen12 eingesät. Nach der 24-stündigen stationären Bebrütung bei
37°C wurde der Zellkulturüberstand abgesaugt, die Zellen einmal mit PBSM gewaschen und
1,0 ml pestivirushaltiger Kulturüberstand mit ca. 106/ml KID50 (0,5 MOI) auf die Zellen
gegeben. Die mit den verschiedenen Pestiviren infizierten Zellen wurden für 1 Stunde bei
37°C weiter inkubiert. Anschließend wurde jede Kulturflasche entsprechend ihrer Größe mit
Virusanzuchtmedium aufgefüllt, 3-4 Tage bei 37°C im Brutschrank inkubiert und danach
einem einmaligen Gefrier-Tauzyklus unterworfen. Das gewonnene virushaltige Medium
wurde bei 1500 x g für 10 min bei +4°C zentrifugiert und der Überstand zu 0,5ml portioniert
und bei –80°C eingefroren.
3.2.3. Kulturelle Virusisolierung
Zum Virusnachweis wurden Leukozyten aus Blutproben mit Zusatz von Gerinnungshemmern, wie z.B. EDTA oder Heparin verwendet.
11 siehe Anhang
12 siehe Anhang
38
Die Virusisolierung aus Leukozyten wurde wie folgt durchgeführt: Durch den Zusatz von
EDTA-Dextran Lösung (5% Dextran Sulfat13) zu der Blutprobe vom Schwein wurden rote
und weiße Blutkörperchen voneinander getrennt. Die Erythrozyten sedimentieren, durch
„Geldrollenbildung“ und die Leukozyten verbleiben im Überstand.
Für ca.10 ml EDTA- oder Heparin-Blut vom Schwein waren 0,5 ml einer 5%igen DextranLösung erforderlich. Die Blutröhrchen wurden nach der Zugabe von Dextran-Lösung
vorsichtig geschwenkt und 2-3 h bei der Raumtemperatur inkubiert, solange bis sich die obere
weiße Phase deutlich von den sedimentierten Erythrozyten absetzte. Der weiße
leukozytenhaltige Überstand wurde abgenommen und für 10 min bei 200 x g zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wurde das Leukozytenpellet in 3-5 ml PBSM resuspendiert und
erneut zentrifugiert. Nach dem zweiten Waschvorgang wurde das Zellsediment in 2 ml PBSM
aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C eingefroren.
Zur kulturellen Virusisolierung wurden die Organproben im Verhältnis 1/10 in EMEM im
Ribolyser14 homogenisiert und anschließend für 10 min bei 1500 x g zentrifugiert. Der
Überstand wurde portioniert und bei –20°C eingefroren.
Für die kulturelle Virusisolierung aus Probenmaterial wurden die Zellkulturröhrchen mit je
80.000-100.000 Zellen pro ml Kulturmedium angesetzt. Nach einer stationären Inkubation der
Zellen bei 37°C für einen Tag wurden 100 µl der aufgetauten Leukozytensuspension oder der
im Ribolyser hergestellten Organhomogenate auf die Zellen gegeben und für 1-2 h bei 37°C
inkubiert.
Anschließend wurde jedes Kulturröhrchen ein- bis zweimal mit jeweils 1,5 ml PBSM
gewaschen, mit 1 ml Kulturmedium aufgefüllt und 3-4 Tage bei 37°C im Brutschrank
inkubiert und danach einem Gefrier-Tauzyklus unterzogen, um zellassoziiertes Pestivirus
freizusetzen. Die daraus gewonnenen Suspensionen wurden zur Klärung niedrigtourig
zentrifugiert. Zur Untersuchung auf Pestiviren wurden 100µl der Überstände auf EinschichtZellkulturen in Makrotiterplatten inokuliert.
Nach einer 48-stündigen Inkubation in einer 5% CO2-Atmosphäre wurden die Überstände
abgesaugt, die Platten einmal mit 1/3 PBS-Tween20 gewaschen und danach für 4 Stunden bei
80° C hitzefixiert.
13 siehe Anhang
14 siehe Anhang
39
Der Nachweis des Virusantigens in den Zellen der inokulierten Zellkultur erfolgte auf der
Makrotiterplatte mittels direkter Immunperoxidase Färbung.
3.2.4. Virustitration
Die Virustitration wurde nach der Endpunkt-Verdünnungsmethode in der Mikrotiterplatte
durchgeführt. Bei dieser Methode wurde eine Virussuspension in log10 -Stufen von 10-1 bis
10-8 verdünnt und pro Verdünnungsstufe vier Aliquots getestet. In die Kavitäten einer
Mikrotiterplatte wurden 100 µl der jeweiligen Virusverdünnung einpipettiert. Danach wurden
50 µl einer auf 150.000 Zellen pro ml eingestellten Zellsuspension hinzugegeben. Virus und
Zellen inkubierten für 48 Stunden bei 37°C in einer 5 % igen CO2-Atmosphäre. Nach der
Inkubation wurde der Überstand abgesaugt und das Virusantigen mittels Peroxidase-LinkedAntibody Test (PLA) mikroskopisch nachgewiesen. Die Kalkulation des Titers als
KID50/0,1 ml erfolgte nach KAERBER (1931). Jede Titration wurde pro Pestivirus mit drei
verschiedenen Zellkulturen dreimal wiederholt.
3.2.5. Direkte Immunfärbung – Peroxidase – Linked Antibody – Test
Für die Auswertung der Virustitration und Virusisolierung im geeigneten Zellkultur-System
wurde der PLA-Test verwendet. (SAUNDERS, 1977).
Von den Zellen, die in den Mikrotiterplatten und Makrotiterplatten mit Virus infiziert worden
waren, wurden nach zweitägiger Inkubation bei 37°C und 5% CO2-Atmosphäre die
Überstände abgesaugt. Die Platten wurden einmal kurz mit 1/3 PBS gespült, ausgeklopft und
für vier Stunden bei 80°C fixiert.
Es folgte pro Vertiefung die Zugabe von 50 µl polyklonalem Schwein-anti-BVDVMeerrettich-Peroxidase Konjugat- oder einem monoklonalen Konjugat, bestehend aus
BVD/C16. Nach einer Stunde Inkubation bei Zimmertemperatur wurden die Platten dreimal
mit 1/3 PBS-Tween20 gespült und mit 50 µl Substrat pro Vertiefung versehen. Als frisch
angesetztes Substrat der Peroxidase diente pro Platte 2,0 mg AEC/0,3 ml Dimethylformamid,
unmittelbar vor Gebrauch mit je 5,0 ml Natriumacetat-Puffer (pH 5,0) und 25µl H2O2 3%
versetzt. Nach 15 bis 20-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde das Substrat
40
abgesaugt, die Platten einmal mit VE-Wasser gespült und anschließend mit 50 µl Aqua bidest
pro Vertiefung beschickt. Die Umsetzung des Substrates führte zu einem rot-braunen
Niederschlag im Bereich des Zytoplasmas der infizierten Zellen. Ablesung und Auswertung
erfolgten mit dem Umkehr-Lichtmikroskop.
Überall dort, wo der PO-markierte Ak an die Zelle binden konnte, kam es bei der Reaktion
zwischen Peroxidase und Substrat zum Farbumschlag, d.h. sobald das Zytoplasma einer Zelle
rot-braun gefärbt war, wobei der Zellkern jedoch ungefärbt sein mußte, galt die Kavität als
mit KSPV, bzw. BVDV oder BDV infiziert und damit als „positiv“.
3.2.6. Virusneutralisationstest
Für den qualitativen und quantitativen Nachweis nAk gegen Pestiviren wurde ein VNT
durchgeführt. Mit Hilfe des NPLA wurden die von den feldinfizierten- bzw. experimentell
infizierten Schweinen gewonnenen polyklonalen Seren auf ihre nAk gegenüber verschiedenen
Pestiviren untersucht.
Der Nachweis gegen Pestiviren gerichtete nAk im NT erfolgte durch Verimpfung von VirusSerum-Gemisches auf empfängliche Zellkulturen.
80µl Erhaltungsmedium und 20µl des zu untersuchenden Serums (beginnend mit der
Verdünnung 1:5) wurden in jeweils zwei Vertiefungen der ersten Reihe einer Mikrotiterplatte
eingegeben. In alle anderen Vertiefungen wurden 50 µl Medium vorgelegt. Danach wurden
die Seren mit Hilfe einer Zwölfkanalpipette im log2-Verdünnungsstufen bis zur Verdünnung
1:640 weiter verdünnt. Anschließend wurden in jede Kavität 50 µl einer Virussuspension, die
auf 100 KID50 eingestellt worden war, hinzugefügt. Die Mischung der Serumverdünnung mit
der Virussuspension wurde für 1 h bei 37°C in 5% CO2 Atmosphäre inkubiert. Danach
wurden 50 µl einer auf 150.000 Zellen/ml eingestellten Zellsuspension mit Hilfe einer
Zwölfkanalpipette in jede Vertiefung einpipettiert. Pro Testansatz wurde eine Rücktitration
von 100 bis 104 der eingesetzten Virusverdünnung durchgeführt, um die tatsächlich
eingesetzte Virusdosis zu kontrollieren. Die Platten wurden für 48 h bei 37°C und 5% CO2
Atmosphäre weiter inkubiert, danach für 4 h bei 80°C fixiert und das Virusantigen gefärbt,
wie unter 3.2.5 beschrieben.
41
Die Auswertung erfolgte lichtmikroskopisch. Eine Serumverdünnung galt als neutralisierend
gegenüber dem eingesetzten Virus, wenn in der jeweiligen Kavität keine Zelle
pestivirusspezifisch gefärbt war. Die Berechnung der Neutralisationstiter (ND50) wurde nach
der von KAERBER (1931) beschriebenen Methode vorgenommen. Werte <5 ND50 wurden
als frei antikörperhaltig bezeichnet. Anhand der Rücktitration wurde die tatsächlich
eingesetzte Virusdosis zur Kontrolle berechnet.
3.2.7. Indirekte Immunfärbung - Peroxidase - Linked Antibody - Test
Prinzip:
Fixierte, mit einem unbekannten Pestivirusisolat infizierte Zellkulturen, wurden mit
pestivirusspezifischen KSPV-, BVDV- und/oder BDV-spezifischen mAk inkubiert. Dafür
wurden zuvor in Mikrotiterplatten gewachsene Zellen mit dem zu charakterisierenden Virus
infiziert. Der gebundene mAk wurde mit einem zweiten Antispezies-Ak („Ziege-anti-Maus“Ak) nachgewiesen. Hat der Antispezies-Ak gebunden, entstehen Ak-Ak-Antigen-Komplexe.
Diese können nun mit Hilfe der im Komplex befindlichen Peroxidase durch Zugabe eines
geeigneten Substrats mit einer Farbreaktion (rot-braun) sichtbar gemacht werden.
Durchführung:
Die Zellen für die Makrotiter- oder Mikrotiterplatten wurden mit 80.000 bis 150.000 Zellen
pro ml Anzuchtmedium in jede Vertiefung gegeben und die Platte für 24 h bei 37°C in einer
5% CO2 Atmosphäre inkubiert. Mit dem gewonnenen Virus wurden die Zellen in den
Vertiefungen der Platten infiziert, zwei Tage bei 37°C und 5% CO2 Atmosphäre inkubiert und
anschließend hitzefixiert. Mit den nicht infizierten Vertiefungen als negative Kontrollen
konnten unspezifische Reaktionen an den Zellen ausgeschlossen werden. Die mAk, die als
Hybridoma-Zellkulturüberstände zur Verfügung standen, wurden 1:2 mit PBS-Tween20
verdünnt.
Kommerzielle
mAk
wurden
in
der
vom
Hersteller1
angegebenen
Gebrauchsverdünnung benutzt. Die antikörperhaltige PBS-Tween20-Lösung wurde in die
42
Vertiefungen der Zellkulturplatte gegeben. Nach einer Inkubation von 90 min bei 37°C
wurden die Platten jeweils dreimal mit 1/3-PBS-Tween20 gewaschen und ausgeschlagen. Für
den Peroxidase markierten C16-Ak, der nur einen Inkubationsschritt benötigte, wurden die
jeweiligen dafür vorgesehenen Vertiefungen nur mit PBS-Tween20 benetzt. Danach folgte
eine Stunde Inkubation mit dem ersten Konjugat (Anti-Maus-IgG-Biotin-Lösung1) pro
Vertiefung. Die Vertiefungen für Peroxidase-markierte Ak wurden erneut nur mit PBSTween20 benetzt. Im Anschluss daran wurde die Platte nochmals dreimal mit 1/3 PBSTween20 gewaschen und ausgeschlagen. Die Kavitäten wurden mit dem zweiten Konjugat
(Strepavidin biotinylated horseradish peroxidase) beschickt und im gleichen Schritt wurden
50µl des verdünnten PO-Antikörpers (in der jeweiligen Gebrauchsverdünnung) in die dafür
vorgesehenen Vertiefungen pipettiert. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C schloß sich ein
dreimaliges Waschen mit 1/3 PBS-Tween20 für alle Vertiefungen an. Die Peroxidasefärbung
erfolgte, wie bei der direkten Immunperoxidasefärbung bereits beschrieben. Die Auswertung
erfolgte im Umkehr-Lichtmikroskop.
1 Amersham Buchler, Braunschweig
43
4. Ergebnisse
4.1. Bestimmung des optimalen Zellkultur-Systems
Zur Ermittlung eines geeigneten Zellkultur-Systems für die Vermehrung der in dieser Arbeit
untersuchten Pestivirusstämme (siehe 3.1.2.1) wurden vergleichende Virustitrationen auf drei
verschiedenen Zellen durchgeführt. Bis auf die Isolate „Aveyron“ und „Arnsberg“ erreichten
alle Pestiviren die höchsten Titer in SFT-R Zellen. Die Ergebnisse sind der Tabelle 10 zu
entnehmen.
Tabelle 10: Virustiter der ovinen und porzinen Pestiviren in drei verschiedenen Zellkulturen
Virustiter (KID50/0,1 ml)
Virus Bezeichnung
FKN
PK(15)
SFT-R
Aveyron
105,0
105,0
102,5
Moredun
104,2
104,2
106,2
137/4
negativ
104,0
105,7
D 27/99 Chemnitz
103,0
104,5
106,0
Frijters
104,7
103,7
105,5
SF 6/87
104,7
102,2
105,5
D 15/99 Arnsberg
105,7
negativ
105,5
10421/94
negativ
104,0
106,0
1726/98 Salza
106,0
negativ
105,5
negativ: Keine Virusvermehrung nachweisbar.
44
4.2. Charakterisierung der Pestiviren
4.2.1. Charakterisierung der Pestiviren mit mAk
Verschiedene Testvirusstämme (3.1.6) wurden durch IPLA mittels mAk getestet, deren
Proteinspezifität aus Tabelle 11 zu ersehen ist. Alle verwendeten Pestiviren reagierten mit den
pestivirusspezifischen mAk BVD/C16 und WS384, keines mit dem schweinepestspezifischen
mAk HC34. Das Isolat 10421 konnte durch die Reaktion mit den BVDV spezifischen mAk
CA3 und CA34 als BVDV klassifiziert werden. Die Isolate Arnsberg, 10421 und Salza
reagierten nicht mit den mAk WS363, WS368, WS371 und WS381 und konnten somit nicht
eindeutig als BDV identifiziert werden.
Tabelle 11: Ergebnisse der Indirekten Immunfärbung für ausgewählte Pestiviren mit BDVBVDV- und pestivirusspezifischen mAk
Viren
WS 363 WS 368 WS 371 WS 381 WS 384 C16 HC34
CA3
CA34
Aveyron
+
+
+
+
+
+
-
-
+
Moredun
+
+
+
+
+
+
-
-
+
137/4
+
+
+
+
+
+
-
-
+
Chemnitz
+
+
+
+
+
+
-
-
+
Frijters
+
+
+
+
+
+
-
-
+
SF 6/87
+
+
+
+
+
+
-
-
+
Arnsberg
-
-
-
-
+
+
-
-
-
10421/94
-
-
-
-
+
+
-
+
+
Salza
-
-
-
-
+
+
-
+ : Färbung (positive Reaktion)
- : Keine Färbung (negative Reaktion)
45
4.2.2. Charakterisierung der Pestiviren mit Referenzseren
Gegen das jeweils homologe Virus waren die nAk-Titer höher als gegen die verwendeten
heterologen Pestiviren. Das mit dem Virusisolat „Salza“ hergestellte Referenzserum hatte
auch gegen das homologe Virus nur niedrige nAk-Titer. Die Ergebnisse der serologischen
Untersuchungen mit den Referenzseren sind der Tabelle 12 zu entnehmen. Der BDVirusstamm 137/4 zeigte keine serologische Reaktion mit den Referenzseren, die BDVirusstämme Moredun und Chemnitz nur eine sehr schwache.
Tabelle 12: nAk-Titer der Referenzseren aus dem EURL für KSP gegen verschiedene
Pestiviren
Referenzseren
V-99/1
(10421/94)
V-98/2
(Frijters)
V-98/3
(Salza)
Aveyron Moredun 137/4 Chemnitz Arnsberg 10421/94 Salza Frijters SF 6/87 NADL Alfort/187
80
<5
<5
<5
120
160
7,5
10
7,5
80
7,5
60
5
<5
7,5
<5
7,5
<5
120
7,5
7,5
7,5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
15
<5
<5
<5
<5
<5 = nAk negativ
≥5 = nAk positiv
Homologe Titer unterstrichen
4.3. Ergebnisse der Neutralisationstests
4.3.1. Versuchsseren
4.3.1.1. Seren aus dem Versuch 1990/25
Die Ergebnisse der serologischen Untersuchungen von mit dem BD-Virustamm Aveyron“
infizierten Schweinen bis zur 18. wpi sind den Tabellen 13 bis 19 (siehe Anhang) zu
entnehmen. Die Mittelwerte der nAk-Titer aller Schweine eines Zeitpunktes sind graphisch in
Abbildung 3 dargestellt. Zwischen der 8. und 12. wpi steigen die nAk-Titer gegen KSPV
Alfort/187 stark an, während die von BD-Virusstamm Moredun in der 12. wpi ihren
Höhepunkt erreicht hatten. Die nAk-Titer gegen den homologen BD-Virusstamm Aveyron
46
waren etwa 2-3 log2-Titerstufen höher als gegen die heterologen Pestiviren. Gegen den BDVirusstamm Moredun wurden ab der 4. wpi deutliche nAk-Titer gefunden. In der 18.Woche
waren die nAk-Titer der Virusstämme Arnsberg und Frijters fast ebenso hoch, wie gegen BDVirusstamm Moredun. Die nAk-Titer gegen das Isolat SF 6/87 sowie gegen BVDV NADL
und KSPV Alfort/187 fielen deutlich geringer aus.
4.3.1.2. Seren aus dem Versuch 2001/1
Die Ergebnisse der Virusisolierung sind in der Tabelle 20 dargestellt. Die Ergebnisse des
NPLA wurden in den Tabellen 21 bis 30 (siehe Anhang) dargestellt. Ein Neutralisationstiter
ließ sich ab der 4. wpi nachweisen. Die homologen nAk-Titer gegen BD-Virustamm Moredun
waren die niedrigsten. Die nAk-Titer gegen BVDV NADL und KSPV Alfort/187 waren
gering. In den Seren von den mit den Isolaten 10754/Han 00, Arnsberg oder einem BVDV 2Isolat infizierten Tieren wurden hohe nAk-Titer gegen das jeweils homologe Virus
festgestellt. In den mit BVDV 2 infizierten Schweinen traten nAk-Titer gegen das Isolat
Arnsberg erst ab der 8.wpi auf. Seren mit dem BD-Virusstamm Moredun infizierter Tiere
zeigten eine Kreuzreaktion mit dem Isolat 10754/Han 00 ab der 3. wpi. Kreuzreaktionen mit
allen anderen Pestiviren traten nur sporadisch auf. Seren von mit dem Isolat 10754/Han 00
infizierten Tieren zeigten eine Kreuzneutralisation mit allen verwendeten Pestiviren. Die mit
den beiden BVDV 2 Isolaten erzeugten Seren wiesen eine Neutralisation mit dem jeweils
anderen Isolat auf. Mit BVDV NADL reagierten nur die Seren von mit den Isolaten Arnsberg
oder 10754/Han 00 infizierten Schweinen. Mit KSPV Alfort/1871 reagierten nur die Seren
der mit dem Isolat 10754/Han 00 infizierten Schweine, dies bereits ab der 3. wpi.
47
Tabelle 20: Ergebnisse der Virusisolierung bei mit unterschiedlichen ovinen und porzinen
Pestivirusstämmen infizierten Schweinen
Virus Isolierung (PLA)
Tiernummer
1-56
2-57
3-58
4-59
5-60
6-61
7-62
8-63
9-64
10-65
11-66
12-67
13-68
14-69
15-70
16-71
17-72
18-73
19-74
20-75
23-78
Infiziert mit dem Pestivirus
Moredun
Moredun
Moredun
Moredun
10754
10754
10754
10754
Arnsberg
Arnsberg
Arnsberg
Arnsberg
BVDV 2
BVDV 2
BVDV 2
BVDV 2
BVDV 2
BVDV 2
BVDV 2
Neg.Kontrolle
Neg.Kontrolle
5.dpi
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Negativ
Negativ
Positiv
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
7.dpi
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Positiv
Negativ
Negativ
Positiv
Negativ
Positiv
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
9.dpi
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Positiv
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Positiv
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
Negativ
4.3.2. Aus Deutschland stammende Feldseren von Schweinen
Da von den Feldseren nur eine begrenzte Menge zur Verfügung stand, konnten
Neutralisationstiter nicht gegen
alle Pestiviren bestimmt
werden.
Wiederholungs-
untersuchungen waren ebenfalls nicht möglich.
Die nAk-Titerergebnisse sind in den Abbildungen 4 und 5 und in den Tabellen 31 bis 34
(siehe Anhang) dargestellt.
48
4.3.3. Aus anderen europäischen Ländern stammende Schweineseren
Die Ergebnisse der Ak-Titrationen (ND50) bei Feldseren von Schweinen aus verschiedenen
europäischen Ländern sind der Abbildung 6 und den Tabellen 35 bis 39 (siehe Anhang) zu
entnehmen. Die nAk-Titer dieser Seren wurden gegen die verschiedenen Pestiviren ovinen
und porzinen Ursprungs bestimmt. Hierbei wurden deutliche Unterschiede festgestellt. Die
aus Großbritannien stammenden Seren wiesen gegen den BD-Virusstamm Aveyron die
höchsten nAk-Titer auf. Die Serumproben aus Frankreich wiesen die höchsten nAk-Titer
gegen Isolat Arnsberg auf. In den Serumproben aus den Niederlanden wurden die höchsten
nAk-Titer gegen den Stamm Aveyron und gegen den dort vorkommenden BD-Virusstamm
Frijters festgestellt. Die Serumproben aus Portugal zeigten gegen die BD-Virusstämme
Aveyron, Moredun, 137/4 und SF6/87 nAk-Titer. Der nAk-Titer gegen den BD-Virusstamm
Moredun war in den Seren aller Länder deutlich höher als gegen andere Testviren.
4.3.4. Aus Deutschland stammende Rinderseren
Diese Seren wurden experimentell mit dem BVDV 2-Isolat CS8644 in Rindern hergestellt.
Die höchsten nAk-Titer wurden hier gegen den porzinen BVD-Virusstamm Arnsberg
festgestellt. Die weiteren ND50-Ergebnisse sind der Tabelle 40 zu entnehmen.
4.3.5. Proben aus einen KSP-Verdachtsfall
Aus den Organproben von Ferkeln aus einem KSP-verdächtigen Bestand wurde nach jeweils
einer Passage auf PK-(15) Zellen und FKN-Zellen ein Pestivirus isoliert und dieses Isolat
danach weiter auf SFT-R Zellen vermehrt. Dieses als 10754/Han 00 bezeichnete Isolat ließ
sich zu mittleren Titern (KID50 105,5/0,1 ml) auf SFT-R Zellen vermehren.
Eine
differentialdiagnostische
Färbung
mit
mAk
gegen
verschiedene
Pestiviren
charakterisierte das Virusisolat 10754/ Han 00 als BDV-ähnlich und schloß damit eine KSPVInfektion aus (Tabelle 41).
49
Tabelle 41: Differentialdiagnostik für das Pestivirusisolat (10754/Han 00) mittels
unterschiedlichen mAk
MAk
Spezifität
Ergebnisse der Immunperoxidasefärbung
WS 363
rns
BDV, E
Schwach positiv
WS 368
BDV, Erns
Schwach positiv
WS 371
BDV, Erns
Schwach positiv
WS 381
BDV, E 2
Stark positiv
WS 384
BDV, E 2
Stark positiv
HC 34
KSPV, E 2
Negativ
CA 34
BVDV, E 2
Positiv
CA 3
BVDV, E 2
Negativ
C 16
Pestivirus, NS2-3
Positiv
Das Isolat 10754/ Han 00 wurde gegen Referenzseren im NPLA getestet (Tabelle 42). Die
antikörperhaltigen Seren neutralisierten das Isolat 10754/Han 00 nicht.
Tabelle 42: Serologische Ergebnisse für das Isolat 10754/Han 00 mittels NPLA mit
verschiedenen Referenzseren
Pestivirus-Ak-haltige
Das homologe Virus und
NPLA-Test-Ergebnisse gegen
Referenzseren
Referenztiter (ND50)
Pestivirusisolat 10754/Hann 00
V-99/1
Isolat 10421/Han 94 (160)
<5 (Negativ)
V-98/2
Frijters (120)
<5 (Negativ)
V-98/3
Salza (15)
<5 (Negativ)
Die aus dem gleichen Bestand entnommenen Schafseren wurden gegen das aus diesem
Betrieb stammende Isolat 10754/ Han 00 sowie gegen fünf BD-Virusstämme und andere
Pestiviren mittels NPLA auf nAk-Titer (ND50) untersucht. Die durchschnittlichen nAk-Titer
sind in der Abbildung 7 und die Einzelwerte in der Tabelle 43 (siehe Anhang) dargestellt. Die
höchsten nAk-Titer mit nicht-homologen Pestiviren wurden mit den BD-Virusstämme
Moredun und Frijters erreicht. Die Kreuzreaktionen mit BVDV NADL und KSPV Alfort/187
waren gering.
50
500
nAk-Titer (ND 50)
400
300
200
100
Testviren
Abb 7: Durchschnittliche nAk-Titer der Schafseren gegen verschiedene Pestiviren
A
lfo
rt
C
S8
64
4
11
38
N
A
D
L
A
rn
sb
er
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Fr
ijt
er
s
SF
6/
87
13
7/
4
M
or
ed
un
A
ve
yr
on
10
75
4/
H
an
00
0
51
5. Diskussion
Labordiagnostische Untersuchungen, die der amtlichen Feststellung von anzeigepflichtigen
Tierseuchen dienen, stellen eine verantwortungsvolle Aufgabe dar, die mit großer Sorgfalt
angegangen werden muß, um die Ausbreitung von Seuchen zu verhindern und wirtschaftliche
Schäden abzuwenden. Dazu werden zuverlässige Laboruntersuchungen benötigt. Die
serologische Diagnose der KSP wird dadurch erschwert, dass das KSPV mit Ak gegen BVDV
und
BDV
kreuzreagiert.
Somit
können
unter
Umständen
KSP-nAk
„positive“
Untersuchungsergebnisse zustande kommen, die tatsächlich nicht auf eine Infektion mit
KSPV sondern auf BVDV- oder BD-Virusinfektionen zurückzuführen sind. „Falsch KSPpositive“ Ergebnisse können im schlimmsten Falle zur unnötigen Tötung von Tierbeständen
und zu Sperrmaßnahmen führen und somit größere wirtschaftliche Schäden verursachen
(MÜLLER et al. 1997).
Die
serologische
Differentialdiagnose
zur
Abgrenzung
der
KSP
von
anderen
Pestivirusinfektionen des Schweines beruht auf Paralleluntersuchungen der fraglichen Seren
mit KSP- und BVD/BD-Virusstämmen im NT unter Anwendung möglichst vergleichbarer
Verfahren. Dies ist augenblicklich noch im Annex 1 der EU-Richtlinie 80/217 EEC
(Anonymous, 1980) festgelegt.
Die in den letzten Jahren in Europa und auf nationaler Ebene durchgeführten Ringtests zur
KSP-Serologie und zur serologischen Differentialdiagnose belegen nachdrücklich den
dringenden Handlungsbedarf im Hinblick auf eine Standardisierung und Harmonisierung der
Testsysteme. Während beim KSP-NT die Ergebnisse ein weitgehend einheitliches Niveau
aufweisen, waren die Ergebnisse der serologischen BVD-Differentialdiagnose in hohem
Maße unbefriedigend. Die wesentlichen Ursachen für diese Probleme waren die beim NT
verwendeten verschiedenartigen BVD-Virusstämme sowie die unterschiedlichen Zelllinien.
Daraufhin wurde der BVD-Virusstamm NADL als Referenzstamm zur einheitlichen
Differentialdiagnose festgelegt (MÜLLER et al., 1997). Mittlerweile ist der BVD-NT ein
essentieller Bestandteil der differentialdiagnostischen Neutralisationstests. Wenn aber
ausschließlich BVDV und KSPV verwendet wurden, erschienen immer noch Proben häufig
KSP-nAk „positiv“, d.h. der KSPV-Titer war deutlich höher, als der BVDV-Titer. Erst ein
52
Neutralisationstest mit einem BD-Virusstamm brachte mehr oder weniger zufällig ein
eindeutig positives Ergebnis (SCHIRRMEIER et al., 1999). Allerdings wurde für die BDVDifferentialdiagnose bisher weder ein Referenzvirusstamm noch eine Zellkultur empfohlen.
In der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe von Seren aus experimentell und/oder Feldvirusinfizierten Schweinen serologische nAk-Titer mit verschiedenen Pestiviren vergleichend
untersucht.
Es wurden insgesamt 16 Pestiviren auf ihre Verwendbarkeit im NT für die serologische
Differentialdiagnose der KSP untersucht. Feldseren standen mengenmäßig nur in sehr
geringer Menge zur Verfügung, da sie oft schon in mehreren Diagnostik-Laboratorien getestet
wurden, bevor sie das EURL für KSP erreichten. Daher war es oft nicht möglich, sie mit allen
hier aufgeführten Pestiviren zu testen; für Wiederholungsuntersuchungen reichte die
Serummenge oft nicht.
Bei den experimentell erzeugten Referenzseren wurde auf Wiederholungen der NT verzichtet,
da alle erzielten Ergebnisse plausibel waren, d.h. ansteigende nAk-Titer im Infektionsverlauf,
wobei der homologe nAk-Titer jeweils größer war als der heterologe nAk-Titer.
Ziel der Untersuchungen war es, einen geeigneten BD-Virusstamm für eine möglichst sichere
Unterscheidung von KSPV- und BDV-induzierten nAk unter Verwendung einer permanenten
Zelllinie zu finden.
Außerdem sollte ein Pestivirus Isolat von Ferkeln, das aus einem schaf- und
schweinehaltenden Betrieb isoliert wurde,charakterisiert werden.
Als erster Schritt mußte eine geeignete Zelllinie gefunden werden.
Die meisten Pestiviren bovinen Ursprungs replizieren sowohl in bovinen als auch in ovinen
Zellen, während manche sich ausschließlich in bovinen Zellen vermehren. Sehr wenige
BVDV-Isolate konnten in PK(15) Zellen zu geringen Titern vermehrt werden. (LIESS u.
MOENNIG, 1990)
Die Empfänglichkeit von Zelllinien für Pestiviren ist abhängig, sowohl von der Herkunft der
Zellen, als auch der des Pestivirus (ROEHE u. EDWARDS, 1994). Dabei entspricht
(aufgrund möglicher Rezeptorunterschiede) die in vitro Permissivität von Zellen porzinen,
bovinen und ovinen Ursprungs nicht zwingend dem in vivo Wirtsspektrum dieser Pestiviren.
53
Der Nachteil primärer Zellkulturen liegt darin, dass sie immer aus einem Gemisch
verschiedener Zellen bestehen und damit eine Reproduzierbarkeit der Ergebnisse erschweren
(McGARRITY, 1979). Eine Vereinheitlichung der Methoden in den verschiedenen Labors ist
wichtig und eine Harmonisierung für zuverlässige Untersuchungen dringend notwendig.
Für die Labordiagnostik ist eine permanente Zelllinie grundsätzlich besser geeignet, da
Chargen primärer Zellkulturen größeren Schwankungen unterliegen, sowohl innerhalb eines
Labors, als auch zwischen verschiedenen Laboratorien. Aufgrund homogener Qualität und
nahezu unbegrenzter Subkultivierbarkeit haben permanente Zelllinien Vorteile für die
Virusanzucht.
Europaweit wird im NT zum Nachweis von KSP-nAk die Zelllinie PK(15) eingesetzt (OIE
Manual of Standards), die entweder von Referenzlaboratorien verteilt wird oder käuflich zu
erwerben ist. Im Gegensatz dazu sind für den NT zum Nachweis von BVD-nAk größtenteils
primäre Zelllinien (FKN-Zellen) in verschiedenen nationalen und europäischen Labors üblich,
da sie die höchste Sensitivität für BVDV besitzen (FREY, pers.Mitteilung).
Alle BDV- und anderen Pestivirusisolate, die in dieser Arbeit eingesetzt worden sind, wurden
vergleichend auf drei Zelllinien angezüchtet.
Die
hier
verwendeten
SFTR-Zellen
sind
eine
permanente
Zelllinie
mit
guten
Wachstumseigenschaften. Mit der SFTR-Zelllinie konnte bei der Vermehrung der meisten
Testviren ein höherer Virustiter als mit den bovinen und porzinen Zellen erreicht werden. Aus
diesem Grund eignet sich die permanente SFTR-Zelllinie für die Verwendung im NT für
BDV.
Die hier verwendeten Pestiviren wurden zunächst mit einer einheitlichen Auswahl von mAk
charakterisiert. Die Benennung von Pestiviren nach Tierspezies und Krankheitsbild (BVDV
für Isolate vom Rind bzw. BDV für ovine Isolate) entspricht zwar der noch gültigen
Nomenklatur, berücksichtigt aber nicht, dass BVDV und BDV bei verschiedenen Tierarten
Erkrankungen auslösen können. Pestiviren werden auf Grund ihres Reaktionsprofils mit mAk
und ihrer Nukleotidsequenz in die Gruppen BVDV 1, BVDV 2, BDV, KSPV und atypische
Pestiviren eingeteilt (BECHER et al., 1997,1999).
54
Das Reaktionsspektrum eines Isolates mit den eingesetzten mAk spricht aufgrund der
Reaktion mit den BDV-spezifischen mAk WS363 und WS368 für die Zugehörigkeit zu den
BDV. Die Pestivirusstämme Aveyron, Moredun, 137/4, Chemnitz, Frijters und SF 6/87 sind
somit mittels IPLA eindeutig als BDV charakterisiert worden. Pestivirusisolat 10421/Han 94
wurde als BVDV identifiziert und daher nicht weiter verwendet. Die Pestivirusisolate
Arnsberg und Salza konnten mittels der verwendeten mAk nicht eindeutig klassifiziert
werden.
Pestivirusspezifische Referenzseren von Schweinen wurden ebenfalls zur Charakterisierung
der eingesetzten Pestiviren verwendet. Bei der Charakterisierung der verwendeten Pestiviren
mit Referenzseren zeigten sich große Unterschiede zwischen den homologen und heterologen
nAk-Titern. Da das mit Virusisolat Salza hergestellte Referenzserum keine serologische
Kreuzreaktion mit den anderen Pestiviren zeigte und auch mit mAk nicht eindeutig
charakterisiert werden konnte, wurde es in dieser Arbeit nicht weiter berücksichtigt. Weitere
pestivirusantikörperhaltige Referenzseren, insbesondere solche, die mit den hier verwendeten
Pestiviren im Schwein produziert wurden, standen nicht zur Verfügung.
Die ausgewählten Pestiviren wurden anschließend mit experimentell in Tierversuchen
produzierten Schweineseren getestet. Beim NT mit Seren aus Versuch 1990/25 konnte wieder
gezeigt werden, dass sich die homologen und heterologen nAk-Titer der hier verwendeten
Pestivirusisolate sehr stark voneinander unterscheiden. Bei Feldseren, wo das homologe Virus
nicht bekannt ist, kann folglich mit heterologen BDV meist kein sehr hoher Titer gefunden
werden.
SF 6/87 hatte die geringste Kreuzreaktivität aller eingesetzten Pestiviren mit den Seren aus
Versuch 1990/25 und wurde deshalb nicht weiter verwendet.
Erst ab 12. Wpi nähern sich die nAk-Titer von BD-Virusstamm Moredun und KSPV
Alfort/187 an. Dies kann unter Praxisbedingungen die Interpretation erschweren, da bei
Feldseren der Infektionszeitpunkt nicht bekannt ist.
55
Eng zusammenliegende nAk-Titer gegen KSPV und BDV wurden auch im Ringversuch der
nationalen KSP-Referenzlabors festgestellt, wenn beide NT mit heterologen Viren
durchgeführt wurden (FLOEGEL-NIESMANN, 2000). Somit können die Schwierigkeiten bei
der Interpretation von differentialdiagnostischen NT erklärt werden. In der Routinediagnostik
bei Feldseren ist das homologe Virus nicht bekannt. Folglich sucht man mit verschiedenen
heterologen Viren nach nAk. Liegen die nAk-Titer gegen KSPV und BDV eng beieinander,
bedeutet dies, dass keines der im NT eingesetzten Pestiviren das homologe Virus war. Es
muss sich daher bei beiden Pestiviren um Kreuzreaktionen handeln. Es bedeutet aber auch,
dass nAk gegen KSPV nicht eindeutig nachzuweisen sind. Die Interpretation solcher
Ergebnisse ist bereits in das Diagnose Handbuch (Anonymous, 2002) der Neufassung der EURichtlinie zur Bekämpfung der KSP (Anonymous, 2001) eingearbeitet worden.
Im Versuch 2001/1 ließen sich die Schweine mit allen verwendeten Pestivirusisolaten
infizieren und bildeten nAk, auch mit BVDV 2, was hier erstmals nachgewiesen werden
konnte. Mit Ausnahme von Moredun konnte mit allen hier verwendeten Pestiviren sporadisch
eine Virämie im Schwein zwischen 5 und 9 dpi festgestellt werden. Somit wurde eindeutig
nachgewiesen, dass sich die verschiedenen Pestiviren im Schwein vermehren können.
BVDV 2 konnte hier zwar Schweine infizieren, aber die Kreuzreaktionen der nAk fielen sehr
gering aus, so dass ein Problem in der Diagnostik eher nicht zu erwarten ist. Diese Tiere
zeigten keine Kreuzreaktion gegen BVDV NADL und KSPV Alfort/187 bis zur 10.Woche
p.i..
BD-Virusstamm Moredun erkannte nAk in Seren von Pestivirusisolat 10754/Han 00
infizierten Schweinen besonders gut, die nAk in Seren von Pestivirusisolat Arnsberg
infizierten Schweinen dagegen kaum. Unter Feldbedingung wären letztere aber deutlich von
BVDV NADL erkannt worden, da hier deutlich höhere nAk gefunden wurden.
Die Schweineseren aus Deutschland (Sammlung der BFAV/Insel Riems und einer Herde aus
Schleswig-Holstein) verfügten allgemein über die höchsten nAk-Titer gegen BD-Virusstamm
137/4, der wahrscheinlich das homologe Virus oder diesem sehr ähnlich ist.
56
Für Deutschland wurde daraufhin die Verwendung des BD-Virusstammes 137/4 in
Verbindung mit der Schaf Zelllinie (SFT-R) empfohlen (SCHIRRMEIER et al., 1999). BDVirusstamm Moredun erkannte aber ebenfalls nAk in diesen Seren, wenn auch mit einem
etwas niedrigeren Titer.
Die Seren aus einer Herde aus Sachsen-Anhalt wiesen kaum nAk-Titer mit den hier
verwendeten Pestiviren auf. Es handelt sich daher in Sachsen-Anhalt möglicherweise um ein
bisher unbekanntes Pestivirus, welches keine enge Verwandtschaft zu den bisher bekannten
hat.
Obwohl das Pestivirusisolat Salza zu den aus Thüringen stammenden Seren das vermeintlich
homologe Virus war, konnten gegen dieses Pestivirusisolat keine nAk-Titer gemessen
werden. Die Proben waren eine Stichprobe und wahrscheinlich waren gerade diese Tiere der
Herde nicht infiziert. Nur ein Serum zeigte Kreuzneutralisation mit anderen Testviren, aber
ausgerechnet nicht gegen Pestivirusisolat Salza. Möglicherweise gab es in diesem gemischten
Betrieb noch weitere Pestivirusinfektionen.
Die in Deutschland aufgefallenen Seren scheinen daher individuelle Ereignisse zu sein, die
untereinander nicht in Verbindung standen und nicht auf ein bestimmtes Pestivirus
zurückzuführen waren.
In den Seren, die aus verschiedenen EU-Ländern stammten, erkannte BD-Virusstamm
Moredun nAk in allen Fällen, wenn auch die mit ihm gemessenen Titer nicht immer die
höchsten waren. BD-Virusstämme Aveyron und Frijters kamen den unbekannten homologen
nAk-Titern meist näher, aber mit unterschiedlichen maximalen Titerhöhen in verschiedenen
Ländern. BD-Virusstamm 137/4 zeigte ebenfalls deutliche nAk-Titer in allen Seren, aber
niedrigere nAk als bei den deutschen Seren. Somit stehen auch diese Ereignisse weder
untereinander noch mit den Ereignissen in Deutschland in Verbindung.
Chemnitz, SF 6/87 und Arnsberg zeigten immer geringere nAk-Titer als die oben erwähnten
Pestiviren und sind daher zur Differentialdiagnostik nicht geeignet.
57
Die BVDV 2 antikörperhaltigen Rinderseren zeigten gegen die Pestivirusisolate Arnsberg und
BVD-Virusstamm NADL die höchsten kreuzreagierenden nAk-Titer. Pestivirusisolat
Arnsberg gehört offenbar eher zur Gruppe der BVDV. Die Seren waren auch mit allen
anderen Testviren kreuzreaktiv, aber mit deutlich geringeren nAk-Titern. Serologische
Kreuzreaktionen mit BVDV 2 müßten daher durch die Differentialdiagnostik mit BVDV 1
leicht erkannt und von KSPV nAk abgegrenzt werden können.
Anhand des aktuellen KSP-Verdachtsfalles (OGUZOGLU et al., 2001) konnten die SFT-R
Zellen und der vorläufig als BDV Referenzstamm ausgewählte BD-Virusstamm Moredun an
einem praktischen Beispiel angewendet und auf ihre Eignung überprüft werden.
Das Pestivirusisolat 10754/Han 00 wurde mittels mAk charakterisiert und als eindeutig BDV
und ‚nicht-KSP‘ eingeordnet. Mit dem neuen Pestivirusisolat konnte ebenfalls kein nAk-Titer
in den Referenzseren ermittelt werden. Beides deutet daraufhin, dass keine enge
Verwandtschaft des neuen Isolates mit anderen porzinen Pestivirus Feldisolaten besteht.
Beim vergleichenden NPLA des Pestivirusisolates 10754/Han 00 gegen die 35 Schafseren aus
dem gleichen Betrieb wurde festgestellt, dass die nAk-Titer gegen das Isolat 10754/Han 00
bedeutend höher waren als nAk-Titer gegen alle anderen getesteten Pestiviren. Der BDVReferenzstamm Moredun erkannte die nAk in den Schafseren ebenfalls deutlich, während
BVDV- und KSPV-Referenzstämme nur geringe Kreuzreaktionen der nAk zeigten. Da die
Schafe Ak aufwiesen, welche das Pestivirusisolat 10754/Han 00 mit den höchsten nAk-Titern
neutralisierten konnten, liegt der Schluß nahe, dass Schafe wie Schweine in dem Bestand mit
dem gleichen Virus infiziert waren.
Die höchsten nAk-Titer wurden mit BD-Viren 137/4, Frijters und Aveyron in den
unterschiedlichen Proben der Feldseren gefunden. Aufgrund der großen Unterschiede in den
nAk-Titern, ist es schwierig, ein BDV als Referenzstamm festzulegen. Je nach
geographischem Vorkommen eignen sich aber ebenfalls einer der bekannten BDVirusstämme 137/4, Frijters oder Aveyron zur Differentialdiagnostik, so dass das jeweilige
nationale Referenzlabor entscheiden sollte, welches Virus eingesetzt wird.
58
Zusammenfassend ist festzustellen, dass die neueren Pestivirus-Feldisolate von Schweinen
nicht für die KSP-Differentialdiagnostik geeignet sind, da sie individuelle Ereignisse
darstellen.
Der BD-Virusstamm Moredun erkannte das breiteste Spektrum an Pestivirus-nAk sowohl in
experimentellen Seren wie auch in Feldseren aus Deutschland und anderen EU-Ländern. Für
die serologische Differentialdiagnostik kann somit der BD-Virusstamm Moredun als
Referenzstamm „Moredun“ zusammen mit der Zelllinie „SFT-R“ empfohlen werden.
Der BD-Virusstamm Aveyron wäre prinzipiell auch geeignet, ist aber momentan
ausrechtlichen Gründen nicht frei verfügbar.
Aufgrund weiträumiger geographischer Vorkommen eignen sich für die Niederlande
besonders BD-Virusstamm Frijters und für Deutschland BD-Virusstamm 137/4. Beide
Pestiviren erkannten in diesen Versuchen auch andere heterologe nAk zufriedenstellend.
Für den Fall, dass weitere geographische Ausnahmen definiert werden können, könnte auch
dort – nach Absprache mit dem EURL – der Referenzstamm „Moredun“ abgelöst werden.
59
6.Zusammenfassung
Pestiviren haben ein breites Wirtsspektrum und können neben ihren spezifischen Wirten auch
die jeweils anderen Tierarten infizieren. In diesem Fall kommt es eher selten zu einer
klinischen Erkrankung, es werden aber neutralisierende (nAk) und andere virusspezifische
Antikörper (Ak) gebildet. Diese zeigen mehr oder weniger starke Kreuzreaktionen mit den
anderen Pestiviren. Die Klassische Schweinepest (KSP) ist die wirtschaftlich bedeutsamste
Erkrankung des Schweines, die durch ein Pestivirus verursacht wird. Bei der serologischen
Untersuchung von Schweinen auf nAk gegen das Virus der Klassischen Schweinepest
(KSPV) muß daher differentialdiagnostisch auch auf nAk gegen das Virus der Bovinen
Virusdiarrhoe (BVDV) untersucht werden, damit ‚falsch KSP-positive‘ Ergebnisse
ausgeschlossen werden können. Durch den quantitativen Vergleich der nAk-Titer gegen beide
Pestiviren kann eine Abgrenzung zwischen KSPV und BVDV induzierten nAk vorgenommen
werden. Referenzviren für diese Untersuchungen sind sowohl für KSPV als auch für BVDV
bereits empfohlen worden.
In den letzten Jahren sind in Deutschland und anderen EU Ländern wiederholt nAk gegen
Border Disease Virus (BDV) in Schweineseren festgestellt worden, was zu größeren
Problemen in der serologischen KSP Diagnostik führte. Daraus ergab sich die Notwendigkeit,
auch eine einheitliche serologische Differentialdiagnostik KSPV/BDV zu etablieren.
Dazu wurden in dieser Arbeit 16 verschiedene Pestiviren von Schafen und Schweinen auf
verschiedenen Zellkultursystemen getestet. Anschließend wurden in Neutralisationstests
Schweineseren vergleichend gegen die oben ausgewählten Pestiviren untersucht. Die
Mehrzahl der Seren stammte aus Experimenten mit BDV oder BVDV infizierten Schweinen
des EU Referenzlabors für KSP. Hier konnte ein Vergleich der nAk-Titer zwischen dem
homologen Virus und den heterologen Pestiviren durchgeführt werden.
Außerdem wurden Feldseren aus Schweineherden in verschiedenen Ländern verwendet, die
bei der serologischen KSP Diagnostik aufgefallen waren und nAk gegen andere Pestiviren
vermuten
ließen.
Das
jeweilige
homologe
Pestivirus
war
hier
unbekannt.
Als
60
Beurteilungskriterien dienten die Höhe der nAk-Titer und bei den experimentellen Seren die
Differenz zum homologen nAk-Titer.
Abschließend konnten die erzielten Ergebnisse noch anhand einer aktuellen BDVirusinfektion in einem gemischten Betrieb in Deutschland verifiziert werden.
Für die serologische Differentialdiagnostik kann die Zelllinie SFT-R zusammen mit dem
BDV Referenzstamm Moredun empfohlen werden. Der BD-Virusstamm Moredun erkennt
das breiteste Spektrum an neutralisierenden Pestivirusantikörpern sowohl in experimentellen
Seren, wie auch in Feldseren aus Deutschland und anderen EU-Ländern.
Aufgrund der großen Unterschiede in den Ak-Titern, ist es aber schwierig, ein einziges BDV
als Referenzstamm festzulegen. Je nach geographischem Vorkommen eignen sich daher
ebenfalls die BD-Virusstämme 137/4, Frijters oder Aveyron zur Differentialdiagnostik, so
dass das jeweilige nationale Referenzlabor entscheiden sollte, welches dieser Viren eingesetzt
wird.
Nicht geeignet sind die von uns untersuchten neueren Pestivirus-Feldisolate von Schweinen,
da diese nur sporadisch auftraten und Einzelereignisse darstellen.
61
Summary
T.C.OGUZOGLU: Serological differentialdiagnosis of classical swine fever with border
disease
Pestiviruses have a broad host spectrum and can also infect other species besides their specific
hosts. In these cases clinical signs are rare but production of neutralising and other virusspecific antibodies usually occur. These antibodies show variable cross reaction with other
pestiviruses. Classical Swine Fever (CSF) is the economically most important pestivirus
infection of pigs. Serological investigation of pigs for antibodies against Classical Swine
Fever Virus (CSFV) consequently requires a differential diagnosis for antibodies against
Bovine Viral Diarrhoea Virus (BVDV) in order to avoid ‘false CSF positive’ results.
Comparison of the CSFV and BVDV antibody titres do allow conclusious concerning the
origin of the antibodies. Reference viruses to perform the appropriate neutralisations test have
been recommended for CSFV and BVDV, respectively.
During recent years antibodies against Border Disease Virus (BDV) have been detected in
several pig herds in Germany and other EU member states. This caused considerable
problems for the serological diagnosis of CSF because the cross reaction of these antibodies
with CSFV was more pronounced than with BVDV. The need of an additional differential
diagnosis for BDV antibodies was obvious and became the objective of this study.
For this purpose 16 pestiviruses from sheep and pigs were tested on different cell culture
systems, in order to select the most suitable one. Neutralisation tests of porcine sera were
performed with the pestiviruses chosen above. The majority of these sera were produced
experimentally with BDV and BVDV in pigs at the EU reference laboratory for CSF. A
comparison between homologous and heterologous pestivirus antibody titres could be
performed.
Furthermore, field sera from pig herds in different countries were also investigated for
pestivirus antibodies. These sera yielded doubtful results during routine serological CSF
diagnosis and antibodies to other pestiviruses were suspected. The results were evaluated
62
taking into account the value of the antibody titres and the differences between homologous
and heterologous titres of the experimental sera.
The preliminary results could be tested for suitability in a recent BDV infection of pigs in
Germany.
For the serological differential diagnosis of CSFV and BDV the permanent sheep cell line
SFT-R and the BDV strain Moredun were recommended. BDV strain Moredun does detect
the majority of pestivirus antibodies in experimental sera as well as in field sera.
However, due to the wide range of antibody titres it is difficult to determine one BDV as
reference strain only. Due to geographical localisation one of the remaining BDV strains
137/4, Frijters or Aveyron might be used as well. The decision should be taken by the
respective national reference laboratory for CSF. Recent pestivirus field isolates from pigs are
not suitable for the differential diagnosis because they occurred sporadical and are individual
events.
63
Özet
Pestiviruslar genis bir konak spektrumuna sahiptirler ve kendi spesifik konakçilarinin yaninda
duyarli diger hayvan türlerini de enfekte edebilirler. Böyle bir durumda, daha çok ender bir
klinik hastalik tablosu gelisir; bu durum nötralizan (nAk) ve diger virus spesifik antikorlarin
(Ak) olusumuna neden olur. Bu antikorlar, diger pestiviruslarla az ya da çok kuvvette çapraz
reaksiyon gösterirler. Bir pestivirus vasitasiyla meydana gelen Klasik Domuz Vebasi (KSP)
ekonomik öneme sahip bir hastaliga sebep olur. Domuzlarda Klasik Domuz Vebasi Virusuna
(KSPV) karsi olusan antikorlarin arastirilmasinda, Bovine Viraldiarrhoea Virusuna (BVDV)
karsi olusan antikorlarin da kontrolü „ yanlis KSP pozitif „ sonuclarin elenebilmesi için
ayirici teshis (differensiyal diagnosis) yönünden zorunludur.
Her iki pestivirusa karsi olusan antikorlarin kantitatif karsilastirilmasi yardimiyla indüklenen
antikorlarca KSPV ve BVDV arasindaki sinir belirlenebilir. Bu arastirmalar için referenz
viruslar hem KSPV hem de BVDV icin önceden önerilmistir.
Son yillarda Almanyada ve diger Avrupa Birligi ülkelerinde domuz serumlarinda Border
Disease Virusuna (BDV) karsi serolojik KSP teshisinde büyük problemlere yol açan tekrar
eden antikor varligi tespit edilmistir. KSPV/BDV için de bir örnek serolojik differensiyal
diagnozun yerlestirilmesinin gerekliligi anlasilmistir.
Bununla baglantili olarak; bu çalismada 16 farkli koyun ve domuz kökenli pestivirus çesitli
hücre kültür sistemlerinde test edildi. Bunu takiben yukarida seçilen pestiviruslara karsi
domuz serumlari nötralizasyon testinde arastirildi. Serumlarin çogunlugu Avrupa Domuz
Vebasi EU-Referenz Laboratuvarindan BDV veya BVDV ile deneysel enfekte domuzlardan
saglandi.
Burada homolog virusla heterolog pestiviruslar arasindaki antikor titrelerinin karsilastirilmasi
ile calisma gerçeklestirildi. Bunun disinda; çesitli ülkelerdeki domuz sürülerinden elde edilen,
serolojik KSP teshisinde göze çarpan ve diger pestiviruslara karsi nötralizan antikorlar
içerdigi sanilan saha serumlari kullanildi. Ilgili homolog pestivirus burada bilinmemekteydi.
Hüküm kriterleri olarak; antikor titresinin yüksekligi ve deneysel enfekte serumlardaki
homolog antikor titrelerinin ayrimi hizmet etmektedir.
64
Calismada hedeflenen sonuclar Almanya`da karma bir isletmedeki aktuel BDV enfeksiyonu
ile de test edilme imkani buldu.
Serolojik differensiyal diagnoz için BDV-Referenz susu Moredun, SFT-R hücreleriyle beraber
önerilmistir. BDV susu Moredun; hem deneysel enfeksiyonla elde edilen serumlarda hem de
Almanya ve diger Avrupa Birliginden gelen saha serumlarindaki pestivirus antikorlarini en
genis spekturumda tanimaktadir.
Antikor titrelerindeki büyük farkliliklar nedeniyle Referenz sus olarak bir tek BDV tespit
etmek güçtür. Cografik konuma göre BDV suslarindan 137/4, Frijters veya Aveyron
differensiyal diagnosis için uygundur. Bu viruslardan hangisinin kullanilmasi gerektigi, herbir
Ulusal Referenz Laboratuvar tarafindan karar verilmelidir.
Domuzlardan yeni izole edilen saha suslarinin, yalnizca isolat nitelikli olmalari ve sporadik
ortaya cikmalari nedeniyle kullanimi uygun degildir.
65
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80
8. ANHANG:
8.1. Tabellen und Abbildungen
Tabelle 13 : Seren aus Versuch 1990/25. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
BDV-Aveyron infizierten Schweinen, in der 0.Woche post infection gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
0.Woche
Aveyron Moredun 137/4 Arnsberg Frijters SF6/87 NADL Alfort/187
Tabelle 14 : Seren aus Versuch 1990/25. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
BDV-Aveyron infizierten Schweinen, in der 2.Woche post infection gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
2.Woche
Aveyron
1-381
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
1-381
<5
Moredun 137/4 Arnsberg Frijters SF6/87 NADL Alfort/187
<5
<5
<5
<5
<5
<5
5
2-382
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
2-382
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
3-383
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
3-383
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
4-384
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
4-384
15
<5
<5
<5
<5
<5
<5
10
5-385
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
5-385
60
<5
<5
5
<5
<5
<5
<5
6-386
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
6-386
60
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
7-387
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
7-387
40
<5
<5
<5
<5
<5
<5
5
8-388
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
8-388
30
<5
<5
5
<5
7,5
<5
<5
9-389
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
9-389
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
10-390
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
10-390
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
11-391
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
11-391
40
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
12-392
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
12-392
80
10
<5
<5
<5
10
<5
7,5
13-393
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
13-393
60
15
<5
20
<5
7,5
<5
15
14-394
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
14-394
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
15-395
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
15-395
7,5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
7,5
16-396
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
16-396
7,5
5
<5
<5
<5
<5
<5
5
17-397
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
17-397
15
<5
<5
<5
<5
<5
<5
7,5
18-398
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
18-398
15
7,5
<5
<5
5
7,5
<5
7,5
19-399
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
19-399
15
7,5
<5
<5
7,5
<5
<5
10
20-400
nAkMittelwert
STABW
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
34
9
<5
10
6
8
<5
8
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
20-400
nAkMittelwert
STABW
24
4
<5
9
2
1
<5
3
81
Tabelle 15 : Seren aus Versuch 1990/25. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
Tabelle 16 : Seren aus Versuch 1990/25. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
BDV-Aveyron infizierten Schweinen, in der 4.Woche post infection gegen verschiedene
BDV-Aveyron infizierten Schweinen, in der 6.Woche post infection gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
bovine, ovine und porzine Pestiviren
4.Woche
Aveyron Moredun 137/4 Arnsberg Frijters SF6/87 NADL Alfort/187
6.Woche
Aveyron Moredun 137/4 Arnsberg Frijters SF6/87 NADL Alfort/187
1-381
80
<5
<5
<5
10
60
<5
7,5
1-381
480
30
20
10
30
30
7,5
40
2-382
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
2-382
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
3-383
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
3-383
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
4-384
240
10
10
<5
30
15
<5
40
4-384
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
5-385
1280
40
10
60
30
80
<5
<5
5-385
1280
40
30
240
60
80
5
5
6-386
2560
120
5
40
30
120
<5
<5
6-386
3840
240
60
240
60
160
5
10
7-387
960
240
30
7,5
10
30
<5
<5
7-387
1280
120
80
80
30
30
5
30
8-388
640
60
10
10
15
80
<5
<5
8-388
640
60
7,5
40
<5
10
<5
<5
9-389
960
30
30
7,5
40
60
<5
40
9-389
2560
80
40
80
20
40
10
15
10-390
640
60
30
160
120
60
<5
20
10-390
1920
80
80
80
80
80
10
15
11-391
320
10
7,5
120
20
60
<5
5
11-391
640
30
15
80
30
20
10
20
12-392
480
640
30
160
30
40
5
30
12-392
2560
320
40
160
40
120
20
15
13-393
2560
160
20
160
15
60
7,5
10
13-393
960
80
80
60
60
160
20
10
14-394
80
20
5
<5
<5
<5
<5
80
14-394
1280
15
20
7,5
15
15
<5
10
15-395
240
30
15
<5
15
30
<5
30
15-395
960
30
40
10
30
40
5
160
16-396
240
160
30
60
10
240
5
7,5
16-396
1920
160
80
40
80
120
40
30
17-397
40
60
5
<5
7,5
30
<5
10
17-397
480
120
40
40
120
40
10
5
18-398
640
80
5
60
20
40
7,5
10
18-398
3840
240
120
320
120
60
10
40
19-399
480
80
15
30
10
120
<5
7,5
19-399
2560
40
40
15
60
240
5
15
20-400
640
320
40
10
40
60
<5
30
20-400
960
240
160
480
120
120
7,5
<5
nAkMittelwert
STABW
727
125
18
68
27
70
6
23
1657
113
56
117
60
80
11
28
747
158
12
61
26
53
1
21
nAkMittelwert
STABW
1085
94
40
132
36
64
9
38
82
Tabelle 17 : Seren aus Versuch 1990/25. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit Tabelle 18 : Seren aus Versuch 1990/25. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
BDV-Aveyron infizierten Schweinen, in der 8.Woche post infection gegen verschiedene BDV-Aveyron infizierten Schweinen, in der 12.Woche post infection gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
bovine, ovine und porzine Pestiviren
8.Woche Aveyron Moredun 137/4 Arnsberg Frijters SF6/87 NADL Alfort/187
1-381
960
120
60
160
120
120
10
60
2-382
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
3-383
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
4-384
480
320
80
40
40
160
<5
160
5-385
1280
240
120
320
30
320
15
20
6-386
3840
480
240
320
40
80
60
60
7-387
640
320
160
80
20
160
40
60
8-388
1280
160
40
120
10
160
15
20
9-389
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
10-390
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
11-391
960
60
60
240
20
160
10
7,5
12-392
2560
320
320
240
120
480
20
5
13-393
2560
480
320
320
80
240
60
20
14-394
2560
60
20
80
10
240
<5
20
15-395
320
120
120
40
30
80
10
20
16-396
960
320
240
240
20
480
60
10
17-397
640
480
160
80
40
160
40
15
18-398
1920
320
480
120
60
160
30
15
19-399
960
320
240
240
40
160
20
15
20-400
240
160
120
10
120
160
<5
30
nAkMittelwert
STABW
1385
268
174
166
50
208
30
34
1019
143
125
108
39
122
20
38
12.Woche
1-381
2-382
3-383
4-384
5-385
6-386
7-387
8-388
9-389
10-390
11-391
12-392
13-393
14-394
15-395
16-396
17-397
18-398
19-399
20-400
nAkMittelwert
STABW
Aveyron Moredun 137/4 Arnsberg Frijters SF6/87 NADL Alfort/187
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
1920
480
240
30
160
40
10
120
480
120
160
160
960
40
60
<5
n.u.
240
120
n.u.
60
n.u.
n.u.
n.u.
960
240
240
80
120
80
240
480
1280
240
120
120
240
20
60
5
3840
480
240
40
160
120
40
20
1920
480
240
320
240
120
60
20
2560
80
120
40
80
60
40
<5
1920
960
120
320
320
40
60
5
320
240
480
640
240
60
60
240
960
120
60
40
80
40
10
960
640
120
40
20
40
20
5
120
960
240
240
120
160
120
120
7,5
960
240
120
40
120
80
30
480
640
480
240
240
240
120
40
240
1280
960
120
60
160
40
30
240
1920
1920
120
160
320
80
40
<5
1410
449
178
152
218
68
57
226
907
462
103
163
209
36
56
277
83
Tabelle 19 : Seren aus Versuch 1990/25. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
BDV-Aveyron infizierten Schweinen, in der 18.Woche post infection gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
18.Woche
1-381
2-382
3-383
4-384
5-385
6-386
7-387
8-388
9-389
10-390
11-391
12-392
13-393
14-394
15-395
16-396
17-397
18-398
19-399
20-400
nAkMittelwert
STABW
Aveyron Moredun 137/4 Arnsberg Frijters SF6/87 NADL Alfort/187
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
3840
480
240
320
320
240
120
15
3840
960
640
320
960
240
640
960
960
120
320
320
960
320
640
960
960
120
60
160
80
120
20
<5
3840
320
240
120
320
120
80
120
1920
480
320
320
320
240
60
480
640
120
80
20
80
30
30
60
1920
480
480
960
320
240
120
<5
1920
960
640
960
320
480
60
20
640
240
80
40
80
20
30
60
1920
240
60
80
80
120
60
7,5
960
120
320
960
480
240
640
120
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
n.u.
1947
387
290
382
360
201
208
280
1247
304
210
366
310
128
262
384
n.u.: nicht untersucht (kein serum)
<5: serologisch negativ
≥5: serologisch positiv
84
Tabelle 21: Seren aus Versuch 2001/1. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
verschiedenen Pestiviren infizierten Schweinen, in der 0.Woche pi gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
0.Woche
Moredun 10754 Arnsberg Gießen-1 104/98 NADL Alfort/187
Tier 1-56
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier 2-57
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier 3-58
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier 4-59
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier 5-60
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier 6-61
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier 7-62
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier 8-63
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier 9-64
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier10-65
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier11-66
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier12-67
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier13-68
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier14-69
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier15-70
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier16-71
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier17-72
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier18-73
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier19-74
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier20-75
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier21-76
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier22-77
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tier23-78
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
nAk-Mittelwert
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
STABW
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Tabelle 22: Seren aus Versuch 2001/1 Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
verschiedenen Pestiviren infizierten Schweinen, in der 3.Woche pi gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
3.Woche
Moredun 10754
Tier 1-56
n.u.
n.u.
Tier 2-57
15
30
Tier 3-58
5
7,5
Tier 4-59
<5
<5
Tier 5-60
20
60
Tier 6-61
60
60
Tier 7-62
20
60
Tier 8-63
7,5
60
Tier 9-64
<5
7,5
Tier10-65
<5
5
Tier11-66
<5
20
Tier12-67
<5
7,5
Tier13-68
<5
<5
Tier14-69
<5
<5
Tier15-70
<5
<5
Tier16-71
<5
<5
Tier17-72
<5
<5
Tier18-73
<5
<5
Tier19-74
<5
<5
Tier20-75
<5
<5
Tier23-78
<5
<5
nAk-Mittelwert
21
32
STABW
20
25
Arnsberg
n.u.
7,5
5
<5
15
10
5
<5
60
60
60
60
<5
5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
29
27
Gießen-1
n.u.
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
60
60
20
40
60
<5
10
<5
<5
42
22
104/98 NADL Alfort/187
n.u.
n.u.
n.u.
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
5
7,5
<5
7,5
15
<5
5
5
<5
<5
30
<5
<5
<5
<5
5
<5
<5
<5
7,5
<5
<5
<5
80
<5
<5
10
<5
<5
7,5
<5
<5
20
<5
<5
20
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
28
6
13
30
1
10
85
Tabelle 23 : Seren aus Versuch 2001/1. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit Tabelle 24 : Seren aus Versuch 2001/1. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
verschiedenen Pestivirusstämmen infizierten Schweinen, in der 4.Woche pi gegen verschiedene verschiedenen Pestivirusstämmen infizierten Schweinen, in der 5.Woche pi gegen
bovine, ovine und porzine Pestivirusstämme
verschiedene bovine, ovine und porzine Pestivirusstämme
4.Woche
Tier 2-57
Tier 3-58
Tier 4-59
Tier 5-60
Tier 6-61
Tier 7-62
Tier 8-63
Tier 9-64
Tier10-65
Tier11-66
Tier12-67
Tier13-68
Tier14-69
Tier15-70
Tier16-71
Tier17-72
Tier18-73
Tier19-74
Tier20-75
Tier23-78
nAk-Mittelwert
STABW
Moredun 10754
30
10
40
60
5
30
30
960
40
960
60
640
30
960
<5
15
<5
7,5
<5
20
<5
15
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
34
17
334
442
Arnsberg
5
10
<5
10
60
160
5
80
960
960
640
7,5
5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Gießen-1
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
480
160
160
120
240
<5
30
<5
<5
104/98
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
320
40
120
80
80
<5
<5
<5
<5
242
380
198
154
128
111
NADL Alfort/187
5
<5
60
<5
<5
<5
7,5
5
40
7,5
80
<5
<5
5
<5
<5
80
<5
5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
40
34
6
1
5.Woche
Tier 2-57
Tier 3-58
Tier 4-59
Tier 5-60
Tier 6-61
Tier 7-62
Tier 8-63
Tier 9-64
Tier10-65
Tier11-66
Tier12-67
Tier13-68
Tier14-69
Tier15-70
Tier16-71
Tier17-72
Tier18-73
Tier19-74
Tier20-75
Tier23-78
nAk-Mittelwert
STABW
Moredun 10754 Arnsberg Gießen-1 104/98 NADL Alfort/187
60
30
<5
<5
<5
7,5
<5
480
120
10
<5
<5
20
<5
30
5
<5
<5
<5
<5
<5
160
960
15
<5
<5
20
7,5
120
960
80
31
15
20
5
60
640
120
15
<5
160
7,5
120
960
15
<5
<5
20
<5
5
10
120
<5
<5
5
<5
<5
<5
960
<5
<5
160
<5
5
30
960
<5
<5
120
<5
<5
120
240
<5
<5
60
<5
<5
<5
10
379
160
<5
<5
<5
5
<5
758
120
<5
<5
5
<5
5
1517
120
5
<5
<5
<5
<5
1517
80
<5
<5
<5
<5
<5
2023
160
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
379
10
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
105
143
349
432
231
368
827
764
95
63
54
62
7
1
86
Tabelle 25: Seren aus Versuch 2001/1. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
verschiedenen Pestiviren infizierten Schweinen, in der 6.Woche pi gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
6.Woche
Tier 2-57
Tier 3-58
Tier 4-59
Tier 5-60
Tier 6-61
Tier 7-62
Tier 8-63
Tier 9-64
Tier10-65
Tier11-66
Tier12-67
Tier13-68
Tier14-69
Tier15-70
Tier16-71
Tier17-72
Tier18-73
Tier19-74
Tier20-75
Tier23-78
nAk-Mittelwert
STABW
Moredun 10754
120
15
160
30
80
<5
240
960
240
480
480
960
120
960
<5
10
<5
7,5
<5
15
<5
7,5
<5
<5
5
7,5
7,5
7,5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
161
147
288
426
Arnsberg
<5
7,5
<5
20
480
480
240
480
480
960
480
15
7,5
7,5
<5
7,5
<5
<5
<5
<5
Gießen-1
<5
<5
<5
<5
10
7,5
<5
<5
<5
15
<5
640
480
320
240
320
<5
160
<5
<5
282
303
244
222
104/98 NADL Alfort/187
<5
<5
<5
<5
20
<5
<5
7,5
<5
5
40
15
20
80
5
10
80
7,5
<5
15
5
<5
15
<5
<5
80
<5
7,5
40
<5
<5
30
<5
240
<5
<5
240
<5
<5
320
<5
<5
480
<5
<5
160
<5
<5
5
<5
<5
120
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
146
159
41
29
8
5
Tabelle 26: Seren aus Versuch 2001/1. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
verschiedenen Pestiviren infizierten Schweinen, in der 7.Woche pi gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
7.Woche
Tier 2-57
Tier 3-58
Tier 4-59
Tier 5-60
Tier 6-61
Tier 7-62
Tier 8-63
Tier 9-64
Tier10-65
Tier11-66
Tier12-67
Tier13-68
Tier14-69
Tier15-70
Tier16-71
Tier17-72
Tier18-73
Tier19-74
Tier20-75
Tier23-78
nAk-Mittelwert
STABW
Moredun 10754 Arnsberg Gießen-1 104/98 NADL Alfort/187
240
15
<5
<5
<5
<5
<5
240
40
7,5
<5
<5
20
<5
40
7,5
<5
<5
<5
<5
<5
240
160
10
<5
<5
60
40
120
960
120
7,5
7,5
240
30
160
640
120
7,5
7,5
320
7,5
7,5
480
60
<5
<5
30
7,5
5
7,5
240
<5
<5
40
<5
<5
<5
960
<5
<5
120
<5
7,5
10
480
<5
<5
320
<5
<5
5
320
<5
<5
40
<5
<5
<5
<5
240
320
<5
<5
<5
<5
<5
480
240
<5
<5
7,5
<5
7,5
480
120
5
<5
<5
<5
<5
240
240
<5
<5
<5
<5
7,5
240
120
<5
<5
<5
<5
<5
10
15
<5
<5
<5
<5
<5
160
120
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
107
106
233
341
212
292
207
185
132
114
120
126
21
16
87
Tabelle 27: Seren aus Versuch 2001/1 Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
verschiedenen Pestiviren infizierten Schweinen, in der 8.Woche pi gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
8.Woche
Tier 2-57
Tier 3-58
Tier 4-59
Tier 5-60
Tier 6-61
Tier 7-62
Tier 8-63
Tier 9-64
Tier10-65
Tier11-66
Tier12-67
Tier13-68
Tier14-69
Tier15-70
Tier16-71
Tier17-72
Tier18-73
Tier19-74
Tier20-75
Tier23-78
nAk-Mittelwert
STABW
Moredun 10754 Arnsberg
40
15
<5
160
80
30
40
15
<5
20
240
80
40
960
320
40
480
240
40
960
160
<5
15
640
<5
7,5
1280
<5
20
320
<5
5
640
<5
7,5
40
5
10
60
5
5
30
<5
<5
7,5
<5
<5
30
<5
<5
<5
<5
<5
15
<5
<5
<5
<5
<5
<5
43
46
201
348
260
354
Gießen-1
<5
<5
<5
10
40
15
5
15
7,5
20
7,5
1280
1920
1920
960
1920
640
960
<5
<5
648
786
104/98 NADL Alfort/187
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
120
10
<5
240
20
<5
160
20
<5
30
7,5
<5
15
<5
<5
120
<5
<5
80
5
<5
20
<5
960
5
<5
320
<5
<5
320
<5
<5
240
<5
<5
480
<5
<5
120
<5
<5
80
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
360
297
88
80
13
7
Tabelle 28: Seren aus Versuch 2001/1. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
verschiedenen Pestiviren infizierten Schweinen, in der 9.Woche pi gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
9.Woche
Tier 2-57
Tier 3-58
Tier 4-59
Tier 5-60
Tier 6-61
Tier 7-62
Tier 8-63
Tier 9-64
Tier10-65
Tier11-66
Tier12-67
Tier13-68
Tier14-69
Tier15-70
Tier16-71
Tier17-72
Tier18-73
Tier19-74
Tier20-75
Tier23-78
nAk-Mittelwert
STABW
Moredun 10754 Arnsberg Gießen-1 104/98 NADL Alfort/187
240
7,5
<5
<5
<5
<5
<5
160
30
5
<5
<5
<5
<5
120
5
<5
<5
<5
<5
<5
240
60
40
<5
10
40
60
240
80
60
10
15
240
60
160
60
240
<5
7,5
160
30
240
80
60
<5
7,5
15
10
7,5
7,5
240
<5
<5
60
<5
7,5
<5
1280
<5
7,5
120
<5
10
10
640
30
10
80
5
<5
<5
480
<5
<5
20
<5
7,5
<5
60
1280
960
15
<5
<5
<5
15
480
320
<5
<5
10
<5
15
1280
480
5
<5
<5
<5
5
320
160
<5
<5
<5
<5
10
640
240
<5
<5
<5
<5
<5
160
160
<5
<5
<5
<5
<5
240
80
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
120
106
38
32
225
361
493
489
189
275
76
77
33
26
88
Tabelle 29: Seren aus Versuch 2001/1. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
verschiedenen Pestiviren infizierten Schweinen, in der 10.Woche pi gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
10.Woche
Tier 2-57
Tier 3-58
Tier 4-59
Tier 6-61
Tier 7-62
Tier 8-63
Tier10-65
Tier11-66
Tier12-67
Tier13-68
Tier15-70
Tier20-75
Tier23-78
nAk-Mittelwert
STABW
Moredun 10754 Arnsberg Gießen-1
120
15
5
<5
120
20
15
<5
120
7,5
<5
<5
120
240
160
40
120
320
240
7,5
60
480
40
10
5
<5
1280
<5
15
30
1280
40
<5
20
480
<5
480
40
1280
7680
480
120
960
10240
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
164
173
129
164
574
564
3003
4685
n.u.: nicht untersucht (Dieses Tier ist.17.dpi getötet worden)
<5: serologisch negativ
≥5: serologisch positiv
104/98
<5
<5
<5
20
7,5
7,5
7,5
10
5
3840
10240
<5
<5
1767
3677
NADL Alfort/187
<5
<5
5
5
<5
5
240
240
120
30
30
20
60
<5
60
10
30
<5
480
960
960
960
<5
<5
<5
<5
221
315
279
423
Tabelle 30: Seren aus Versuch 2001/1. Serologische Untersuchungsergebnisse bei mit
verschiedenen Pestiviren infizierten Schweinen, in der 11.Woche pi gegen verschiedene
bovine, ovine und porzine Pestiviren
11.Woche
Tier 2-57
Tier 3-58
Tier 4-59
Tier16-71
Tier17-72
Tier18-73
Tier20-75
Tier23-78
Moredun
120
80
60
<5
480
<5
<5
<5
10754
30
40
40
10
120
7,5
<5
<5
nAk-Mittelwert
STABW
185
198
41
41
Arnsberg Gießen-1 104/98 NADL Alfort/187
<5
<5
<5
<5
<5
7,5
<5
30
5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
10
3840
160
<5
<5
640
7680
7680
480
960
5
320
320
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
166
316
3947
3681
2048
3757
243
336
960
0
89
Tabelle 31: nAk-Titer bei Serumproben aus Deutschland (BD Ak positive Feldseren - BFAV/Insel Riems)
Serum / Virus Aveyron
709
120
696
320
1131
<5
1332
60
286
320
1331
10
1129
<5
14328
5
470
40
20283
640
716
<5
20319
640
W-98
7,5
Positiv (n)
10
nAk-Mittelwert
216
STABW
253
Moredun
40
10
<5
<5
160
<5
<5
80
40
640
<5
640
20
8
203
273
137/4
160
30
<5
<5
640
<5
<5
320
160
640
<5
960
<5
7
415
338
Chemnitz
20
<5
<5
<5
160
<5
<5
160
15
160
<5
160
40
7
102
73
Arnsberg
10
<5
20
160
15
80
15
160
5
80
<5
60
<5
10
61
60
10421/94
<5
<5
7,5
60
15
<5
<5
120
<5
7,5
<5
<5
<5
5
42
49
Salza
5
<5
<5
15
5
<5
<5
7,5
<5
15
<5
20
<5
6
11
6
Frijters
<5
<5
<5
7,5
15
<5
<5
120
7,5
480
<5
240
<5
6
145
188
SF 6/87
80
10
<5
20
240
<5
<5
160
40
240
<5
160
7,5
9
106
96
NADL
10
<5
5
5
20
5
5
10
<5
30
<5
<5
<5
8
11
9
Alfort/187
7,5
<5
<5
<5
40
<5
<5
20
15
480
<5
480
<5
6
174
238
90
Tabelle 32: nAk-Titer (ND50) gegen Pestiviren bovinen, ovinen und porzinen Ursprungs in Feldseren von Schweinen aus verschiedenen Beständen in Sachsen-Anhalt
Serum / Virus
Aveyron
Moredun
137/4
Chemnitz
Salza
SF 6 /87
Frijters
NADL
Alfort/187
15406/1
15406/2
15406/3
15413/3
15413/10
15413/14
<5
n.u.1
<5
5
<5
<5
<5
n.u.1
<5
<5
<5
<5
7,5
n.u.1
<5
<5
<5
<5
15
n.u.1
15
<5
<5
<5
<5
n.u.1
<5
<5
<5
<5
5
n.u.1
<5
<5
5
<5
<5
<5
<5
<5
5
<5
<40
<5
<5
<10
<5
<5
<5
<5
<5
<5
20
20
15413/20
15413/21
15413/22
15413/57
9375 – 1
8514 – 2
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
15
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
5
5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
5
15
<5
<5
10
40
8438 – 3
8501 – 4
9382 – 5
9462 – 6
9405 – 7
6784-26-8472
<5
7,5
7,5
<5
<5
10
5
5
<5
10
<5
7,5
<5
<5
<5
30
<5
<5
15
10
<5
60
7,5
30
<5
<5
<5
5
<5
<5
15
10
<5
15
10
10
10
15
5
30
40
20
<5
<5
<5
7,5
<5
<5
60
15
15
20
15
10
6784-57-8473
6666-88-8874
6666-93-8875
6664-290-8476
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
5
<5
<5
7,5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
7,5
<5
10
5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
7,5
15
nAk-Mittelwert
9
8
15
21
10
10
13
8
19
STABW
2
2
14
18
7
4
11
-
14
91
Tabelle 33: nAk-Titer (ND50) gegen Pestiviren bovinen, ovinen und porzinen Ursprungs in gesammelte Feldseren von Schweinen aus Schleswig-Holstein
Serum / Virus
1)1
2)4
3)9
4)10
5)24
6)15
7)26
8)11
9)20
10)23
11)4116-1
12)4116-2
13)1
14)33
nAk-Mittelwert
STABW
Aveyron
7680
480
960
960
480
7680
960
480
1920
1920
<5
<5
60
480
2005
2710
n.u.1: nicht untersucht (toxisch)
n.u.2: nicht untersucht (kein serum)
<5 :serologisch negativ
≥5 :serologisch positiv
Moredun
1920
160
960
2400
480
1200
1280
480
2400
1920
<5
<5
120
480
1150
840
137/4
10240
480
960
4800
480
4800
1920
960
4800
3840
<5
<5
240
480
2833
2995
Chemnitz
960
80
n.u.2
n.u.2
30
600
1920
80
800
320
<5
<5
5
160
496
605
Arnsberg
2560
20
n.u.2
n.u.2
20
1200
n.u.2
30
400
320
<5
<5
7,5
40
511
860
SF 6/87
1920
60
120
1200
120
800
480
60
600
160
<5
<5
60
40
468
587
Frijters
640
80
30
1280
60
1280
960
40
320
240
<5
<5
40
120
424
490
NADL
640
7,5
60
240
7,5
640
480
20
240
120
<5
<5
<5
10
224
251
Alfort/187
480
5
60
240
7,5
480
480
20
320
120
<5
<5
30
30
189
200
92
Tabelle 34: nAk-Titer (ND50) gegen Pestiviren bovinen, ovinen und porzinen Ursprungs in Feldseren von Schweinen aus einem Bestand in Thüringen
Serum / Virus
1)2
2)5
3)13
4)21
5)36
6)38
7)42
8)54
9)57
10)67
11)70
12)71
13)89
14)98
15)206
16)212
17)225
18)236
19)241
20)246
21)249
22)258
23)263
24)270
25)274
26)280
27)284
28)288
29)292
30)300
Aveyron
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
240
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Moredun
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
120
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
137/4
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
20
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Chemnitz
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
120
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Arnsberg
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
10
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
10421/94
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Salza
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Frijters
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
60
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
SF 6/87
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
20
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
NADL
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
7,5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
Alfort/187
5
<5
<5
<5
<5
<5
5
<5
5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
7,5
<5
<5
7,5
<5
5
<5
<5
93
Tabelle 35: nAk-Titer (ND50) gegen Pestiviren bovinen, ovinen und porzinen Ursprungs in Experimentelle Seren von Schweinen aus Frankreich
Serum / Virus
V97-S-BVD 1
V98-S-BD 01
V98-S-03
V98-S-04
V98-S-05
nAk-Mittelwert
STABW
Aveyron
20
240
60
480
120
184
185
Moredun
160
320
960
1280
640
672
458
137/4
80
60
160
160
160
136
50
Chemnitz
60
30
120
240
320
154
123
Arnsberg
7680
160
480
120
160
1720
3335
10421/94
320
15
20
20
7,5
77
136
Salza
60
<5
<5
5
<5
24
39
Frijters
160
240
480
3840
960
1135
1543
SF6/87
120
480
960
480
640
536
304
Tabelle 36: nAk-Titer (ND50) gegen Pestiviren ovinen und porzinen Ursprungs in Feldseren von Schweinen aus Großbritannien
Serum / Virus
1) 27486
2) 27489
3) 27492
4) 27495
5) 27496
6) 27500
7) 16558
8) 16559
9) 16562
10) 16566
11) 16568
12) 16570
nAk-Mittelwert
STABW
Aveyron
960
960
960
160
480
640
320
960
240
640
60
960
612
351
Moredun
1920
240
240
120
60
20
30
240
5
240
30
1920
422
706
137/4
640
240
240
60
120
30
20
240
15
240
30
160
170
176
Chemnitz
60
15
15
<5
7,5
15
10
15
10
120
60
15
31
35
Frijters
60
30
60
15
5
<5
7,5
30
15
30
15
240
46
67
NADL
480
40
80
20
160
156
189
Alfort/187
60
<5
7,5
10
60
35
30
94
Tabelle 37: . nAk-Titer (ND50) gegen Pestiviren bovinen, ovinen und porzinen Ursprungs in Experimentelle Seren von Schweinen aus den Niederlanden-I (Intervet)
Serum / Virus Aveyron Moredun 137/4 Chemnitz Salza Frijters SF6/87 NADL Alfort/187 CS8644
1
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
15
2
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
15
3
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
5
<5
60
4
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
30
5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
60
nAk-Mittelwert
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
5
<5
36
95
Tabelle 38. nAk-Titer (ND50) gegen Pestiviren ovinen und porzinen Ursprungs in Feldseren von Schweinen aus den Niederlanden(II)
Serum / Virus
Aveyron
Moredun
137/4
Arnsberg
Frijters
SF 6/87
NADL
Alfort/187
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
nAk-Mittelwert
STABW
240
1280
160
480
320
480
2560
1280
240
480
320
1280
2560
1280
320
160
640
2560
480
640
120
320
1280
1280
640
960
1280
640
1280
960
320
480
160
640
480
1280
830
668
240
40
15
80
320
120
240
60
160
120
120
960
240
480
160
40
480
80
20
640
240
960
960
480
480
960
480
960
960
640
640
960
480
480
240
960
430
340
80
240
15
5
10
120
240
30
120
20
10
320
30
80
120
30
30
15
15
15
60
30
60
80
20
30
320
480
240
20
240
240
80
40
40
120
101
114
120
80
10
40
240
320
40
80
15
40
80
320
7,5
40
40
40
10
7,5
80
120
80
15
320
40
15
30
40
40
160
160
60
120
60
80
20
320
92
96
1920
1920
160
640
960
640
960
480
640
640
1280
320
480
1920
480
80
960
640
960
960
480
960
1920
640
960
480
960
1280
1280
640
640
960
160
80
240
960
824
509
30
40
<5
20
15
15
20
20
20
10
5
7,5
7,5
15
15
10
<5
<5
5
15
10
<5
10
20
15
7,5
30
20
120
15
30
60
15
10
15
20
21
21
30
40
<5
10
15
10
15
15
5
7,5
<5
40
<5
20
10
7,5
5
<5
<5
7,5
10
5
15
20
<5
15
40
40
80
80
30
20
7,5
10
<5
5
22
20
40
80
20
<5
<5
<5
7,5
10
10
<5
30
40
7,5
20
7,5
<5
15
<5
<5
40
<5
10
40
15
10
20
20
30
30
60
10
320
<5
10
7,5
120
39
62
96
Tabelle 39: nAk-Titer (ND50) gegen Pestiviren ovinen und porzinen Ursprungs in Feldseren von Schweinen aus Portugal
Serum / Virus
1) 525-1
2) 525-2
3) 525-3
4) 525-4
5) 525-5
6) 525-6
7) 373P
8) 576P
9) 9776-1
10) 9776-2
11) 9776-3
12) 9529-1
13) 9529-2
14) 9700-3
15) 9700-4
16) 6350-5
17) 7761
18) 6277-1
19) 6277-2
20) 6277-3
21) 6277-4
22) 6277-6
23) 4702-1
24) 4913-1
25) 5802-1
26) 5802-2
27) 5802-3
28) 5802-4
nAk-Mittelwert
STABW
n.u.1: nicht untersucht (toxisch)
n.u.2: nicht untersucht (kein serum)
Aveyron
<5
<5
<5
<5
<5
<5
5
10
n.u.1
<5
5
10
<5
5
5
40
640
160
640
320
240
n.u.2
40
30
640
120
640
640
233
274
Moredun
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
n.u.1
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
640
240
60
80
40
<5
<5
<5
40
10
60
240
157
200
137/4
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
n.u.1
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
960
60
30
15
7,5
n.u.2
n.u.2
n.u.2
5
5
n.u.1
n.u.1
155
356
Chemnitz
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
n.u.1
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
30
5
40
60
34
23
Arnsberg
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
n.u.1
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
10
10
30
30
20
12
Frijters
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
n.u.1
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
5
<5
30
7,5
14
14
SF 6/87
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
n.u.1
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
960
15
20
80
80
n.u.2
30
n.u.2
20
<5
30
80
146
307
NADL
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
n.u.1
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
60
<20
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
Alfort/187
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<10
<5
<5
<5
<5
<5
<5
<5
40
<20
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
n.u.2
97
Tabelle 40: nAk-Titer (ND50) gegen Pestiviren bovinen, ovinen und porzinen Ursprungs in Rinderseren von der Universität München
Serum / Virus
Rd-355
Rd-135
Rd-1
ohne nummer
Aveyron
320
640
480
640
Moredun
30
160
120
160
137/4
15
60
20
10
Chemnitz
120
80
40
160
Arnsberg
640
1920
480
1920
10421/94
30
60
20
60
Salza
15
60
30
15
Frijters
120
60
120
60
SF6/87
60
120
240
80
NADL
120
480
120
240
Alfort/187
80
480
40
60
nAk-Mittelwert
STABW
520
160
118
61
26
23
100
52
1240
788
43
21
30
21
90
35
125
81
240
170
165
211
98
Tabelle 43: Vergleichende Untersuchung an Serumproben von 35 Schafen gegen Isolat 10754/Han 00 und heterologe bovine, ovine und porzine Pestiviren im NPLA
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Serum / Virus
WS-142-1
WS-145-4
WS-146-5
WS-151-10
WS-154-13
WS-155-14
WS-156-15
WS-157-16
WS-158-17
WS-159-18
WS-161-20
WS-164-23
WS-165-24
WS-166-25
WS-167-26
WS-168-27
WS-169-28
WS-170-29
WS-171-30
WS-172-31
WS-173-32
WS-174-33
WS-176-35
WS-179-38
WS-180-39
WS-181-40
WS-182-41
WS-183-42
WS-184-43
WS-185-44
WS-186-45
WS-188-47
WS-189-48
WS-190-49
WS-191-50
nAk Mittelwert
10754/Han00
480
960
240
480
60
480
480
30
160
240
120
240
40
160
640
480
1920
480
960
480
120
10
20
320
960
480
160
480
30
960
60
480
640
240
1920
457
Aveyron
120
960
60
480
80
160
240
10
120
120
30
80
60
60
60
10
40
15
80
240
30
20
7,5
40
60
20
30
5
20
160
15
160
160
80
80
112
Moredun
240
960
240
320
240
640
480
5
320
160
240
480
480
60
320
320
320
480
640
960
320
160
120
240
240
120
80
15
<5
960
160
960
960
640
320
388
n.u.2: nicht untersucht (kein serum), <5: serologisch negativ, ≥5: serologisch positiv
137/4
240
480
30
60
15
480
960
10
640
40
30
480
120
7,5
160
30
320
240
480
240
240
60
15
80
60
60
40
7,5
<5
480
40
480
60
60
120
202
Arnsberg
60
960
20
30
<5
240
n.u.2
n.u.2
160
80
20
n.u.2
160
10
240
10
320
640
20
240
15
30
10
160
20
<5
n.u.2
<5
<5
640
7,5
160
60
120
320
176
Frijters
120
1920
80
80
60
960
960
n.u.2
320
160
60
120
160
10
240
60
240
60
120
320
120
80
30
160
60
120
n.u.2
10
7,5
960
20
160
960
320
320
284
SF6/87
60
120
30
80
30
160
120
7,5
120
80
40
120
60
15
60
20
40
40
80
120
80
40
20
80
60
10
n.u.2
<5
<5
240
15
80
60
240
60
75
NADL
30
60
20
60
5
120
120
<5
240
20
80
15
40
7,5
30
15
480
60
240
480
20
5
5
120
7,5
30
n.u.2
10
<5
480
15
60
160
240
60
104
Alfort/187
<5
640
20
10
5
20
<5
<5
20
<5
7,5
<5
7,5
<5
5
<5
30
<5
<5
<5
<5
7,5
<5
7,5
5
<5
<5
5
<5
60
<5
15
15
10
7,5
47
99
3500
3000
Aveyron
2500
Moredun
137/4
ND50
2000
Arnsberg
1500
Frijters
SF 6/87
1000
NADL
Alfort/187
500
0
0.W
-500
2.W
4.W
6.W
8.W
12.W
18.W
Abb. 3 : nAk-Titer (ND50) gegen verschiedene bovine, ovine und porzine Pestivirusstämme bei mit BDVAveyron infizierten Schweinen
100
7000
Aveyron
6000
Moredun
137/4
5000
Chemnitz
4000
Arnsberg
10421/94
ND50
3000
Salza
2000
Frijters
1000
SF6/87
NADL
0
BFAV/ Insel Riems
Sachsen Anhalt
Schleswig Holstein
Thüringen
-1000
-2000
Abb. 4: nAk-Titer Vergleiche gegen unterschiedliche bovine, ovine und porcine Pestivirusstämme bei Feldseren
Beständen aus beschriebenen Bundesländern
Alfort/187
101
800
700
600
500
ND50
400
300
200
100
0
-1 0 0
-2 0 0
A ve yro n
M o re d u n
1 3 7 /4
C h e m n itz
A rn sb e rg
1 0 4 2 1 /9 4
S a lza
F rijte rs
S F 6 /8 7
NADL
A b b . 5 : n A k -T ite r E rg e b n is se v o n S ch w e in e se re n a u s d e r B u n d e sfo rs ch u n g s a n sta lt fü r V iru sk ra n kh e izte n d e r T ie re
A lfo rt/1 8 7
102
6000
5000
Aveyron
4000
Moredun
ND50
3000
137/4
2000
Arnsberg
1000
Frijters
0
SF6/87
-1000 Großbritannien
Frankreich
Niederlande
Portugal
-2000
Abb.6 : nAk-Titer Ergebnisse von Feldseren von Schweinen aus anderen EUMitgliedsstaaten
103
8.2. Medien, Puffer, Lösungen und Chemikalien
Antibiotikasuspension:
Benzylpenicillin-Natrium15
Streptomycinsulfat16
PBS
107
10
ad 100
I.E.
g
ml
Die Antibiotikasuspension wurde den Medien in einer Konzentration von 1 ml/l zugesetzt.
AEC-Lösung:
3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC)17
20
mg
18
3
ml
Natriumazetat-Puffer
ad 50
ml
Dimethylformamid
H2O2 (3%)19
0,4
ml
Dextran sulfate Puffer:
NaCl20
75
g
EDTA21
15
g
Streptomycin
300
g
Penicillin
200
g
100 ml 5g Dextran sulfate
DMSO22:
Dimethylsulfoxid wurde benutzt, um die Zellen einzufrieren.
15 bis 22 siehe Anhang
104
Edulb (Eagle`s Minimum Essential Medium - EMEM - , modifiziert nach DULBECCO u.
FREEMAN, 1959):
EMEM-Pulver23
13,53
g
NaHCO324
2,2
g
Antibiotikasuspension
1
ml
1000
ml
Aqua bidest. Ster.
ad
Der pH-Wert wurde durch CO2-Begasung auf 6,9 eingestellt.
EMEM (Eagle`s Minimum Essential Medium):
EMEM-Fertigpulver25
9,6
g
NaHCO3
2,2
g
Aqua bidest. Ster.
ad
1000
ml
Der pH-Wert wurde durch CO2-Begasung auf 7,0 eingestellt.
Erhaltungsmedium:
Edulb oder EMEM
475
ml
FKS
25
ml
Antibiotikasuspension
1
ml
6,804
g
Natriumazetat-Puffer (0,05M, pH 5,0):
Natriumazetat-Trihydrat26
Aqua bidest.
23 bis 26 siehe Anhang
ad 1000
ml
105
PBS (Phosphatpuffer pH7,0-7,2 DULBECCO u. VOGT, 1954):
NaCl
8,0
g/l
Kl
0,2
g/l
Na2HPO4 x 12 H2O
2,37
g/l
KH2PO4
0,2
g/l
CaCl2 x 2 H2O
0,132
g/l
MgCl2 x 6 H2O
0,1
g/l
Aqua bidest. Ster.
ad 1000
ml
1000
ml
PBS/Tween:
PBS
Tween®2027
100
µl
Streptoavidin-Peroxidase-Lösung (1:200):
Streptavidin, biotinyliert,
peroxidasegekoppelt28
PBS/Tween
0,5
ml
100
ml
Versen-Trypsin-Lösung (0,125%) pH 7,0:
NaCl
8,0
g/l
Kl
0,2
g/l
Na2HPO4 x 12 H2O
2,31
g/l
KH2PO4
0,2
g/l
CaCl2 x H2O
0,132
g/l
0,1
g/l
1,25
g/l
EDTA (Versen)30
1,25
g/l
Streptomycinsulfat
50
mg
Benzylpenicillin-Natrium
60
MgSO4 x 7 H2O
Trypsin (3U/mg)
29
PH-Wert mit 1 N NaOH einstellen
23 bis 30 siehe Anhang
mg
106
8.3. Fußnote
1. Fa.GIBCO BRL, Eggenstein
2. Fa.Serva, Heidelberg
3. Hoechst AG, Frankfurt am Main
4. Heyl, Chem.-pharm. Fabrik, Berlin
5. Fa.Biochrom KG seromed, Berlin
6. Im Institut für Virologie geprüftes Pestivirus Ag und Ak negatives Rinderserum
7. costar ®, Bodenheim, Kat.No. 3150
8. H.Jürgens, Hannover
9. Greiner Labortechnik Gmbh, TC-Plate 24 Well, no.662160, Frickenhausen
10. costar ®, Bodenheim, Kat. No. 3598
11. Greiner Labortechnik GmbH, Frickenhausen
12. Greiner Labortechnik GmbH, Frickenhausen
13. Fa.Fluka, Buchs/ Schweiz
14. Fa. Hybaid, Ashfort/England
15. Hoechst AG, Frankfurt am Main
16. Heyl, Chem.-pharm. Fabrik, Berlin
17. Fa. Sigma-Aldric Chemie GmbH, Deisenhofen
18. Fa. Merck, Darmstadt
19. Fa. Merck, Darmstadt
20. Fa. Roth, Karlsruhe
21. Fa. Merck, Darmstadt
22. Fa. Merck, Darmstadt
23. Fa. Serva, Heidelberg
24. Fa. Merck, Darmstadt
25. Fa. GIBCO BRL, Eggenstein
26. Fa. Merck, Darmstadt
27. Fa. Merck, Darmstadt
28. Amersham Buchler, Braunschweig
29. Fa. Serva, Heidelberg
30. Fa. Merck, Darmstadt
107
Veröffentlichungen
Ein Teil von dieser Arbeit wurde vorab veröffentlicht.
FLOEGEL-NIESMANN,G., T.C.OGUZOGLU, H.-R.FREY u. GRUMMER,B. (2000):
Search for Border Disease virus strains suitable for differential diagnosis of CSF.
Annual meeting of National Swine Fever Laboratories 2000, SANCO/2589/2000,
EU Commission, Brussels, Belgium, 53-54 (Druck in Greifswald, Germany)
OGUZOGLU,T.C., G.FLÖGEL-NIESMANN, B.GRUMMER, I.GREISER-WILKE, H.R.FREY u. V.MOENNIG (2000):
Auswahl von Border Disease Virusstämmen für die serologische Differentialdiagnose der
klassischen Schweinepest.
Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft e.V. 19.AVID-Tagung in Kloster Banz, 46.10.2000
OGUZOGLU,T.C., G.FLOEGEL-NIESMANN, H.-R.FREY u. V.MOENNIG (2001):
Zur Differentialdiagnostik Klassische Schweinepest / Border Disease: Seroepidemiologische
Untersuchung einer Pestivirusinfektion auf einem schaf- und schweinehaltenden Betrieb.
Dtsch. tierärztl. Wschr. 108, 5, 210-213
FLOEGEL-NIESMANN,G., T.C.OGUZOGLU u. H.-R.FREY (2001):
Serological differential diagnosis of CSF.
Annual meeting of National Swine Fever Laboratories 2001, SANCO/3948/2001,
EU Commission, Lindholm, Dänmark, 83-84 (17-18. May.2001)
108
Danksagungen
Herrn Prof. Dr. V. Moennig bedanke ich mich ganz herzlich für die wissenschaftliche
Betreuung und die freundliche Aufnahme im Institut für Virologie.
Herrn Dr. H. -R. Frey möchte ich besonders für die fachlichen und fundierten Diskussionen
und seine großzügige und vielfältige Mithilfe danken.
Frau Dr. G. Floegel-Niesmann danke ich für die engagierte wissenschaftliche Unterstützung
während der Durchführung der Arbeit und ihre unvergleichliche Hilfe.
Herrn Prof. Dr. I. Burgu gilt mein verbindlicher Dank für wertvolle Ratschläge und die
unermüdliche Unterstützung in der Türkei.
Frau Prof. Dr. F.Alkan bin ich besonders für die freundschaftliche Hilfe und
wissenschaftliche Förderung dankbar.
Bei Frau Dr. S. A. Kenklies möchte ich mich ganz herzlich für ihre jederzeit gewährte
vielfältige Unterstützung und ihre beispiellosen Lösungsvorschläge bedanken.
Frau Dr. B.Grummer danke ich für ihre motivierende Unterstützung und ihre jederzeit
ausgezeichnete Hilfsbereitschaft.
Frau PD Dr. I. Greiser-Wilke danke ich für ihre Hilfestellung bei der Korrektur der Arbeit
und ihre konstruktive Kritik.
Bei Frau G.Müller bedanke ich mich für ihre Hilfe während der Laborarbeit und ihre
Freundschaft.
Mein Dank gilt auch Frau J.Pipereit, Frau R.Neth, Frau M.Kaps und allen Mitarbeitern
für ihre Hilfsbereitschaft und die angenehme Arbeitsatmosphäre.
Meinen Mitdoktoranden möchte ich für die freundlichen Diskussionen und die gute
Zusammenarbeit danken.
Bei Frau M.Ledwoch bedanke ich mich für ihre aufopferungsvolle Betreuung.
Bei dem Türkischen Hochschul-Gremium bedanke ich mich für das Stipendium, um meine
Doktorarbeit zu finanzieren.
Nicht zuletzt, danke ich meiner Mutter, meinem Vater und meiner Familie für ihre
vielfältige und liebevolle Unterstützung.