Bitte Laborkittel mitbringen !!! und ! leeren USB Stick

Skript zum biomedizinischen Praktikum
„Modellorganismus Maus“
Institut für Klinische Neurobiologie
21. bis 25. Oktober 2013
!!! Bitte Laborkittel mitbringen !!!
und
! leeren USB Stick !
Treffpunkt am 21.10.2013, 8:50 Uhr Haus E4, Versbacherstr. 5
INHALTSVERZEICHNIS
Zusammenfassungen der Vorträge
Kursprogramm
Zellkultur Teil
Immunhistochemischer Teil
Ionenkanäle bei der Arbeit
Deckblatt
Neurotrophe Faktoren (Prof. Sendtner)
Neurotrophe Faktoren wurden ursprünglich als Überlebensfaktoren für embryonale Nervenzellen
entdeckt. Viktor Hamburger und Rita Levi-Montalcini, die für die Entdeckung von Nerve Growth Factor
(NGF) den Nobel-Preis erhalten hat, konnten zeigen, dass Proteine, die in sehr geringen Mengen im
Innovationsgebiet von sensorischen, sympathischen und motorischen Nervenzellen produziert werden,
für deren Überleben während der Embryonalentwicklung notwendig sind. Während der
Embryonalentwicklung werden bei höheren Wirbeltieren verschiedene Populationen von Nervenzellen,
darunter spinale Motoneurone, die sensorischen und sympathischen Nervenzellen der Hinterwurzel
bzw. Paravertebralganglien, im Überschuss gebildet. Ca. 50% der postmitotischen Neurone, nachdem
sie Kontakt mit dem Zielgewebe gemacht haben, gehen dann wieder zugrunde. Viktor Hamburger
konnte in einer Reihe detaillierter Untersuchungen zeigen, dass dieser „physiologische“ Zelltod nicht
endogen programmiert ist, sondern durch Signalmoleküle aus dem Innervationsgebiet der jeweiligen
Nervenzelltypen gesteuert wird. Diese Befunde waren Ausgangspunkt für Rita Levi-Montalcini für die
Identifikation und Reinigung (zusammen mit J. Cohen) eines ersten neurotrophen Faktors, Nerve
growth factor (NGF).
Abb.1: Assay mit explantierten sympathischen Ganglien (R. Levi-Montalcini) nach Zugabe von
Gewebeextrakten, die NGF enthielten
NGF ist prototypisches Mitglied einer großen Familie von Neurotrophinen, der neben NGF auch BDNF,
NT-3 sowie NT-4/5 bei Säugern angehören. Bei Fischen wurden weitere Mitglieder der NeurotrophinFamilie gefunden, NT-6 und NT-7. Diese neurotrophen Faktoren vermitteln ihre Wirkung auf das
Überleben von Nervenzellen über hochaffine Rezeptoren, die ihre Liganden mit einer Affinitätskonstante
(KD) von 10-12 M binden. Wesentlicher Bestandteil dieser hochaffinen Rezeptoren sind
Transmembranproteine der Tropomyosin-Rezeptorkinase (Trk)-Familie, von denen Trk-A spezifisch
NGF bindet, Trk-B sowohl BDNF als auch NT-4/5 erkennt, und Trk-C bevorzugt NT-3 bindet.
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Abb.2: Schematische Darstellugn der Bindung von Mitgliedern der Neurotrophinfamilie an Trk
Rezeptoren und den p75NTR Rezeptor.
Neben diesen Transmembrantyrosinkinaserezeptoren existiert ein niederaffiner Neurotrophin-Rezeptor
(p75NTR), der alle bekannten Neurotrophine mit ähnlicher Affinität (KD 10-9 M) bindet. Aufgrund der
hohen Bindungsaffinität von Neurotrophinen an hochaffine Rezeptoren (KD von 10-12M) ist verständlich,
dass nur sehr geringe Mengen dieser Neurotrophine (weniger als 1ng/g Gewebe) ausreichen, um ca.
die Hälfte der während der frühen Embryonalentwicklung generierten Neurone am Leben zu halten.
Typisch für Mitglieder der Neurotrophinfamilie ist die hohe Spezifität für bestimmte Zellpopulationen:
NGF wirkt nur auf sympathische Neurone der paravertebralen Ganglien sowie eine Subpopulation
sensorischer Neurone, jedoch nicht auf motorische Nervenzellen sowie propriozeptive sensorische
Neurone. NT-3 wirkt insbesondere auf -Motoneurone sowie schnell leitende Subgruppen von
sensorischen Nervenzellen, BDNF auf motorische Nervenzellen sowie Subgruppen sensorischer
Neurone.
Die Elimination des NGF-Gens führt zu einem fast vollständigen Absterben sympathischer Nervenzellen
in den Paravertebralganglien, die Mäuse sind so nicht überlebensfähig und sterben spätestens in der 3.
postnatalen Woche. Ähnliche Beobachtungen wurden auch bei BDNF- und NT-3-defizienten Mäusen
gemacht, bei denen die jeweiligen Neuronengruppen, die von diesen Faktoren abhängig sind, selektiv
zugrunde gehen.
Die Injektion bzw. transgene Überexpression von Neurotrophinen bewirkt nicht nur erhöhtes Überleben,
sondern auch erhöhte neuronale Aktivität sowie Faseraussprossen. So führt z.B. die Injektion von NGF
bei neugeborenen Mäusen und Ratten zu einem Aussprossen von Schmerz-leitenden Fasern und einer
erhöhten Sensibilität.
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Abb3: Wirkung einer Injektion von NGF bei neugeborenen Ratten auf Überleben und Faseraussprossen
bei langsamleitenden sensorischen Neuronen
Die Funktion des Nervensystems wird nicht nur durch die neurotrophen Faktoren der NeurotrophinFamilie, sondern auch durch andere Familien von neurotrophen Faktoren beeinflusst und reguliert. Zu
diesen Faktoren gehören die Mitglieder der Glia-derived-neurotrophic-factor (GDNF-)Familie sowie die
neurotrophen Zytokine der Ciliary neurotrophic factor (CNTF)/Leukemia-inhibitory factor
(LIF)/Cardiotrophin-1 (CT-1)-Familie. Besonders die Mitglieder der letzten Familie werden erst relativ
spät während der Entwicklung exprimiert, einzelne Faktoren, insbesondere CNTF erst postnatal, dann
aber in sehr hohen Mengen. CNTF wird nicht im Zielgewebe von responsiven sensorischen und
motorischen Nervenzellen exprimiert, sondern in myelinisierenden Schwannzellen. Nach Nervläsion
steht dieser Faktor so direkt zur Verfügung und kann so das Überleben von axotomierten Nervenzellen
verbessern.
So ergibt sich ein komplexes Bild über die Wirkung von neurotrophen Faktoren: neben der klassischen
Wirkung auf das Überleben spezifischer Gruppen von Nervenzellen während der Embryonalentwicklung
sind sie notwendig für die Regulation synaptischer Aktivität, für die Aufrechterhaltung von
Nervenzellverbindungen und Axonen sowie für die Regeneration nach Läsion.
Literatur:
Alberts: Molecular Biology of the Cell:
Kapitel 21: Cellular mechanisms of development
Kandel (4. Auflage)
Part VIII: Develoment of the Nervous System.
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Axonaler Transport I und Tiermodelle für Motoneuronerkrankung (Dr. Jablonka)
Die Fortsätze von Nervenzellen können beim erwachsenen Menschen oft Längen von ca. 1 Meter
erreichen. Jede Nervenzelle muss ständig Proteine und andere Strukturelemente transportieren um die
Funktion auch in vom Zellkörper entfernten Kompartimenten aufrecht zu erhalten. Verschiedene
Proteine aber auch mRNAs werden im Zellkörper synthetisiert und in Axonen und Dendriten
transportiert. Dieser Vorgang wurde bereits 1948 beschrieben und wird als axonaler bzw. dendritischer
Transport bezeichnet. Erst in den vergangenen Jahren wurden die molekularen Mechanismen dieses
Transports entlang von Mikrotubuli detailliert aufgeklärt.
Bei Untersuchungen über den axonalen Transport stellte sich heraus, dass in beiden Richtungen
Substanzen transportiert werden. Der anterograde Transport erfolgt vom Zellkörper zur Synapse hin
und dient vor allem dem axonalen Wachstum. Beim gegenläufigen retrograden Transport werden
Substanzen durch das Axon zum Zellkörper befördert. Hierbei handelt es sich zum Teil auch um
Signalproteine und Komplexe, die zum Zellkörper transportiert werden. Nach der Geschwindigkeit kann
man langsamen von schnellen axonalen Transport unterscheiden.
Die Mikrotubuli bilden die Grundlage für zahlreiche zelluläre Bewegungsformen wie beispielsweise der
intrazelluläre Transport von Membranvesikeln in den Axonen der Nervenzellen. Diese Bewegungen
beruhen entweder auf der Polymerisation und Depolymerisation von Mikrotubuli oder auf der Aktivität
der Mikrotubulus-Motorproteine Dynein und Kinesin.
Abbildung 1: Dyneinkomplex sowie Kinesine sind Motorproteine für den anterograden sowie den
retrograden Transport.
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Ist der axonale Transport sowohl beim Menschen sowie bei der Maus gestört, kann es so einer
sogenannten Motoneuronerkrankung kommen. Motoneuronerkrankungen sind degenerative
Erkrankungen der -Motoneurone im Rückenmark, die zu Muskelschwäche und -atrophie führen. Die
Motoneuronerkrankungen können verschiedenen Ursprungs sein. Die mit am weitesten verbreitete
Motoneuronerkrankung ist die sogenannte amyotrophe Lateralsklerose (ALS). Sporadische Formen der
ALS beginnen im Erwachsenenalter und betreffen kortikospinale sowie spinale Motoneurone. Das
Mausmodel für die sporadische Form der ALS ist die progressive motoneuronopathy mouse (pmn).
Abbildung 2: Pmn-Mutante rechts, gesundes Geschwistertier links
Das Krankheitsgen der pmn Mutante wurde durch positionelle Klonierung identifiziert und kodiert für ein
sogenanntes Tubulinspezifisches Chaperon E (Tbc E), einen Cofaktor, der die Heterodimerisierung von
 und  Tubulin unterstützt. Isolierte embryonale Tbc E-defiziente Motoneurone zeigen Störungen im
Axonwachstum und weisen überdurchschnittlich viele axonale Schwellungen auf. In diesen axonalen
Schwellungen liegt eine gestörte Kolokalisation von Tubulin und seinem assziierten Protein p-Tau vor.
Wildtyp
Mutante
p-Tau
Tubulin
Overlay
Abbildung: Verteilung von p-Tau und Tubulin in Kontroll- und Tbc E-defizienten Motoraxonen von
isolierten Motoneuronen.
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Aber nicht nur Komponenten für die Bildung der Mikrotubuli, auch die Motorproteine können bei
Dysfunktion zu Motorneuronerkrankungen führen (z.B. Loa und Cra Mäuse).
Letzten Endes ist jedoch das Ziel der Untersuchung der pathomechanistischen Ereignisse, die zu
Motoneuronerkrankungen führen, eine mögliche Therapie dagegen zu entwickeln. Erste
Therapieansätze wurden bei der pmn Mutante entwickelt. Durch CNTF Gabe ist es gelungen, den pmnPhänotyp zu mildern.
+ CNTF
Kontroll
Pmn Maus ohne CNTF
Literatur:
Fundamental Neuroscience, second edition
Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition
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Axonaler Transport II und Tiermodelle für Motoneuronerkrankungen (Dr. Jablonka)
Während der Entwicklung brauchen Neurone sogenannte Meilensteine um ihr Zielgewebe oder die
Zielzelle zu finden. Wie unterschiedlich diese "Wegfindungsmechanismen" sein können, ist sehr
anschaulich an retinalen Ganglienzellen des Krallenfroschs gezeigt. Die Ganglienzellen wachsen
entlang der Basallamina und Gliafortsetzen bis zum Eintrittspunkt in den Sehnerv. Innerhalb des
Sehnervs finden sie den Weg mit Hilfe von Pionier-Neuronen; dann wandern sie entlang des optischen
Trakts und treten schließlich ins optische Tektum ein.
Abbildung 1: Die retinalen Axone auf ihrem Weg ins optische Tektum
Ihr Ziel innerhalb des optischen Tektums wird durch sogenannte Wegfindungsmoleküle bestimmt. Es
sind vier Klassen dieser Wegfindungsmoleküle bekannt: Semaphorine, Ephrine, Slit und Netrine. Diese
Wegfindungsmoleküle können eine sowohl abstoßende wie auch anziehende Wirkung auf die
Nervefortsätze haben.
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Abbildung 2: Wegfindungsmoleküle können eine sowohl anziehende wie abstoßende Wirkung haben.
Damit jedoch ein sich entwickelndes Neuron diese Signalmoleküle überhaupt erkennen kann, muss der
Wachstumskegel eines Neurons mit den entsprechenden Rezeptoren ausgestattet sein.
Wachstumskegel eines Neurons sind die Bereiche, die sich, wenn sie ihr Zielgewebe oder ihre Zielzelle
gefunden haben, zu einer Präsynapse ausbilden. Während der Entwicklung dient der Wachstumskegel
allerdings dazu die Wege und Ziele der Axone zu finden. Die Wegfindung ist ein sehr dynamischer
Prozess und daher immer mit der Polymerisation und Depolymerization des Zytoskelttproteins ß-Aktin
verbunden. Daher bildet ß-Aktin den Hauptbestandteil der Zyoskelettproteine im Wachstumskegel (im
Gegensatz zum Tubulin in den Axonen).
Abbildung 3: Der Wachstumskegel
Um jedoch schnell auf externe Signale reagieren zu können, muss es dem Wachstumskegel möglich
sein, den Rezeptortyp innerhalb von Minuten zu wechseln. Da selbst der schnelle anterograde
Transport für membrangebundene Proteine oder Vesikel nur 200-400 mm pro Tag beträgt, müssen die
Rezeptoren bereits im Kegel vorliegen, damit ein schneller Austausch erfolgen kann. Hier kommt das
Prinzip von lokaler Proteinsynthese zum Tragen.
Abbildung 4: Es konnten bereits freie Ribosome im Wachstumskegelbereich von Neuronen identifiziert
werden.
mRNAs werden entlang der Axone, nach dem Prinzip des axonalen Transport bis zum Wachstumskegel
transportiert. Je nach ankommendem Signal werden dann die entsprechenden Rezeptoren translatiert
und präsentiert. Genauer Ablauf und Mechanismus der lokalen Translation sind allerdings noch nicht
vollständig geklärt.
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Die Rezeptorausstattung von Neuronen hängt jedoch in erster Linie von ihrer Genetik ab. Friedrich
Bonhöffer konnte sehr eindrücklich an seinem Membrane-Stripe-Assay zeigen, dass retinale
Ganglienzellen aus unterschiedlichen Bereichen der Retina, unterschiedlich (mehr oder weniger
sensitiv) auf Signalmoleküle regieren.
Abbildung 5: Membrane-Stripe-Assay von Friedrich Bonhöffer; Axone von retinalen Ganglienzellen aus
unterschiedlichen Bereichen der Retina reagieren unterschiedlich sensitiv auf Ephrin 2A.
Die unterschiedliche Rezeptorausstattung von Neuronen ist typ- sowie entwicklungsspezifisch und die
Grundvoraussetzung für die Ausbildung von topographischen Karten im Nervensystem.
Ein Beispiel einer Motorneuronerkrankung bei der ein möglicher defekter axonaler mRNA Transport
vorliegt, ist die klassische Form der spinalen Muskelatrophie (SMA). Die spinale Muskelatrophie ist eine
der häufigsten Formen von Motorneuronenerkrankungen bei Kindern. Sie ist charakterisiert durch den
Verlust von spinalen und bulbären Motoneuronen, was zu Muskelschwäche und Atrophie führt.
SMA wird autosomal rezessiv vererbt. Positionelle Klonierungsexperimente führten 1995 zur
Identifizierung des sogenannten SMN Gens, das seither als Krankheitsgen gilt. Der Mensch besitzt zwei
Kopien des SMN Gens, die sich in ihrer Expression unterscheiden. Nur die telomere Kopie ist in der
Lage ein voll funktionstüchtiges Protein zu bilden. Mutationen innerhalb oder der Verlust der telomeren
Kopie können demnach nicht vollständig durch die zentromere Kopie ersetzt werden.
Es konnte gezeigt werden, dass isolierte primäre Motoneurone eines SMA Mausmodells einen ß-AktinmRNA Defizit im Wachstumskegel haben, was wiederum zum einem reduzierten ß-Aktin-Proteingehalt
führt. Dieser ß-Aktin-Mangel bedingt ein Defizit an membranständigen Kalzium-Kanälen und endet
letzten Endes in Erregbarkeitsproblemen im Wachstumskegelbereich des Motorneurons. Es wird davon
ausgegangen, dass der ß-Aktin mRNA Transport entlang der Axone gestört ist.
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Axon
Soma
ß-Actin
SM
hnRNP
Abbildung 6: Der SMN-hnRNP R Komplex transportiert spezifisch ß-Aktin mRNA entlang der Axone bis
in den präsynaptischen Bereich eines Motorneurons.
Literatur:
Fundamental Neuroscience, second edition
Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition
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Neurale Stammzellen (Dr. Götz)
Die überwiegende Zahl von Zellen im Nervensystem wird in der embryonalen Entwicklung und in der
frühen postnatalen Entwicklung gebildet. Aber es gibt auch Regionen im adulten Gehirn der Säuger in
denen kontinuierlich neue Neuronen gebildet werden. Diese Neuronen stammen von neuralen
Vorläuferzellen ab, die sogar in Kultur genommen und vermehrt werden können. Ependymale Zellen
werden zu sich stark vermehrenden Zellen, die Neuronen generieren, die wiederum in das olfaktorische
Epithel einwandern. Neurale Stammzellen können von den Ventrikelwänden und vom Hippocampus
isoliert werden und haben die Kapazität zur Selbsterneuerung und Vermehrung in vivo wie auch in vitro.
Stammzellen, die im Bereich der lateralen Ventrikel lokalisiert sind, werden zu immaturen Neuronen, die
entlang des rostralen Migrationsweges in das olfaktorische Epithel einwandern und dort zu Neuronen
werden. Durch die Forschung an Stammzellen in den letzten Jahren sind die Faktoren identifiziert
worden, die einen Einfluß auf Stammzellen ausüben können. Diese Faktoren steuern die
Selbsterneuerungskapazität (self-renewal) und die Differenzierung. Das Umfeld (Zellen und Faktoren)
von Stammzellen bezeichnet man als Stammzellnische. Faktoren, die einen Einfluß auf Stammzellen
ausüben sind zum einen diffundierbare Faktoren, wie z.B. Hormone und Wachstumsfaktoren, zum
anderen Membranständige Proteine und ihre Liganden, wie etwa Eph/Ephrin und Notch/Jagged.
Signale können aber auch von umliegenden Axonterminalen freigesetzt werden, hierbei werden
Neurotransmitter freigesetzt (GABA, Glutamat, Ach). Auch können Signale von Komponenten der
Extrazellulären Matrix erfolgen.
Abb. 1: Komponenten und Signale der Stammzellnische.
Zwei andere wichtige Begriffe sind die Stammzellplastizität und die Transdifferenzierung. Man hat
herausgefunden, dass man durch die Zugabe von geeigneten Faktoren die Differenzierung von
Stammzellen beeinflussen kann. So kann man z.B. Stammzellen, die man aus dem Knochenmark
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isoliert hat, in Leber oder Muskelzellen transdifferenzieren. Hierbei versucht man Faktoren zu finden, die
der endogenen Stammzellnische der jeweiligen Stammzelle entsprechen und versucht diese in vitro
nachzustellen. Dieser Ansatz nährt die Hoffnung bislang nur schwer bis gar nicht therapierbare
Erkrankungen zu behandeln. Erste Erfolge konnten auch in dem Feld der Neurodegenerativen
Erkrankungen kürzlich erzielt werden.
Literatur:
Alberts: Molecular Biology of the Cell
Principles of Neural Science (Kandel), fourth edition
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Neuronale Schaltkreise des Hippocampus und des Kleinhirns (Dr. Blum)
„When an axon of cell A is near enough to excite a cell B and repeatedly or
persistently takes part in firing it, some growth process or metabolic change takes
place in one or both cells such that A’s efficiency, as one of the cells firing B, is
increased“ (Donald Hebb, 1949)
Die Signalübertragung zwischen Nervenzellen findet vorwiegend an Synapsen statt.
Adaptive Prozesse an Synapsen (synaptische Plastizität), als Folge eines zeitlich und
räumlich synchronisierten Informationsflusses über Synapsen, spielen eine
bedeutende Rolle für die verschiedenen Formen von Lernen und Gedächtnis.
Im Jahr 1973 beschrieben zwei Studien durch T.V.P Bliss, T. Lømo, und GardnerMedwin erstmals das Phänomen der Langzeitpotenzierung (LTP, long-term
potentiation). In ihren Experimenten konnten die Autoren zeigen, dass wiederholte,
zeitlich koordinierte Reize von hippocampalen Eingangsstrukturen eine signifikante
und langanhaltende Verstärkung von Synapsen im hippocampalen Schaltkreis
hervorrufen.
Erstbeschreibung der LTP.
In Folge einer kurzen, aber intensiven
synaptischen Reizung werden die
aktivierten
Synapsen
zwischen
Neuronen langanhaltend verstärkt. In
dem gezeigten Experiment wurde
durch
das
Auslösen
von
Aktionspotenzialserien
auf
den
Axonen des Tractus perforans (PP)
die glutamaterge Synapse der
Körnerzellen im Gyrus dentatus (AD)
so stark gereizt, dass die Effizienz der
synaptischen
Transmission
im
dendritischen
Bereich
der
Körnerzellen,
als
auch
die
Erregbarkeit
der
Körnerzellen
langfristig gesteigert war.
Der definierte „starke Gebrauch“ von Synapsen kann folglich schnelle, molekulare
Änderungen hervorrufen, die dieselben Synapsen mit stark erhöhten Erregenden
PostSynaptischen Potentialen (EPSPs) auf Einzelreize reagieren lässt. In Anlehnung
an das Hebb’sche Postulat aus dem Jahr 1949 werden aktivitätsabhängig
modifizierbare synaptische Verbindungen zwischen zwei Neuronen auch Hebb’sche
Synapsen genannt. Heute wird das Phänomen der LTP als geeignetes Modell zur
Erforschung der molekularen Grundlagen des Lernens erachtet, da es viele Kriterien
eines neuronalen Korrelats des Gedächtnisses erfüllt.
Die bedeutendsten neuronalen Schaltkreise zur Erforschung der synaptischen
Plastizität sind die des Hippocampus und des Kleinhirns. Beide Modellsysteme sind
strukturell einfach aufgebaut und verschaltet, bieten experimentellen Zugang unter in
situ und in vitro Bedingungen und erlauben zumindest punktuell eine
Kausalbeziehung zwischen Vorgängen synaptischer Plastizität auf zellulärer Ebene
und der Gedächtnisbildung auf Verhaltensebene.
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Hippocampus
Funktionell ist der Hippocampus die zentrale Struktur des deklarativen
Gedächtnisses (Fakten, Ereignisse, räumliche Zusammenhänge) und vermittelt auch
Kontext-abhängige Elemente des Lernens.
Die hippocampale Formation Hippocampus besteht aus dem Rindenband (Cornu
ammonis; CA) und in dem Zellband (Gyrus dentatus, AD). Synaptische Plastizität
kann im Hippocampus auf zwei Ebenen untersucht werden: (1) ausgehend von der
Betrachtung des trisynaptischen, erregenden Schaltkreises des Hippocampus; (2)
ausgehend von der Integration neugenerierter Körnerzellen in den bestehenden
hippocampalen Schaltkreis im Rahmen der adulten Neurogenese.
Der trisynaptische Schaltkreis: 1. Synapse: Input von Neuronen des entorhinalen
Cortex, die ihre Axone über den Tractus perforans mit vielen Synapsen im
Dendritenbaum der Körnerzelle des Gyrus dentatus verbinden. 2. Synapse: Die
Axone der Körnerzellen (sog. Moosfasern) verbinden sich mit Pyramidenzellen in der
CA3 Region. 3. Synapse: Eine Axonkollaterale der CA3 Pyramidenzelle (sog.
Schafferkollaterale) projiziert zu Pyramidenzellen der CA1 Region.
Die generalisierte Betrachtungsweise vieler Lehrbücher suggeriert einen einheitlichen
molekularen Mechanismus synaptischer Lernvorgänge, wie sie an der Synapse CA3CA1 (Schafferkollaterale-CA1) beobachtet wurden. Hier braucht die LTP einen
postsynaptischen
ionotropen
Glutamatrezeptor
(Typ
NMDA)
und
ein
2+
postsynaptisches Ca Signal. Zwar wird an allen Synapsen des trisynaptischen
Schaltkreises LTP unter glutamaterger Übertragung beobachtet, doch gilt es als erwiesen,
dass synaptische Plastizität an der Moosfasersynapse NMDA-Rezeptor-unabhängig ist, ein
präsynaptisches Ca2+ Signal braucht und somit eine bevorzugt präsynaptische Komponente
trägt. Die Kommunikation der Postsynapse mit der Präsynapse bei der synaptischen
Plastizität ist weitgehend ungeklärt. Dennoch häufen sich Hinweise, dass das Neurotrophin
BDNF (siehe Beitrag Prof. M. Sendtner) hier eine wesentliche Rolle spielt. Seit 1995 ist
bekannt, dass die Freisetzung von BDNF im Rahmen der Induktion von LTP eine funktionelle
Rolle spielt und sich über die Rezeptortyrosinkinase TrkB vermitteln kann. Die molekularen
Signalübertragungsmechanismen, sowie Modelle, die die schnelle Sekretion des Proteins
BDNF erklären können, sind jedoch umstritten.
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Adulte Neurogenese im Hippocampus
Jüngste Forschungen konnten in der Zone unterhalb des Körnerzellbands des Gyrus
dentatus (subgranular zone) funktionelle, adulte Neurogenese nachweisen. Hier
entstehen aus teilungsfähigen Vorläuferzellen mit Eigenschaften astrozytärer
Gliazellen lebenslang glutamaterge Körnerzellen. Erst im Jahr 2008 konnte
nachgewiesen werden, dass neugenerierte Körnerzellen sich in das bestehende
neuronale Netzwerk des Hippocampus funktionell und synaptisch integrieren.
Körnerzellen, die sich
im adulten Gyrus
dentatus neu gebildet
haben.
Die
Zellen
wurden mit einem Virus
markiert, der nur in
teilungsfähigen Zellen
zum Ausdruck kommt
und so die Entwicklungslinie der hippocampalen
Stammzellen darstellen
kann. Bild aus: Toni et al.
2008
Kleinhirn
Die physiologische Aufgabe des Kleinhirns ist Kontrolle –Kontrolle der Halte- und
Stützmotorik, der Bewegungskoordination, der Zielmotorik und ihrer Kurskorrektur,
sowie ballistischer Bewegungen. Menschen mit Kleinhirndefekten sind in ihrem
motorischen Lernen stark beeinträchtigt und zeigen einen gewissen Verlust
bewegungsbezogener
kognitiver
Funktionen.
Eine
Besonderheit
der
Kleinhirnphysiologie ist die eindeutige Zuordnung der zellulären Grundlage des
afferenten und efferenten Informationsflusses. Zentrale Schaltstelle ist die
Purkinjezelle, die über die Moosfaser- und Kletterfasereingänge eine Efferenzkopie
des motorischen Vorhabens erhält und optimierend in die Bewegung eingreift. Die
Purkinjezelle besitzt im Vergleich zu anderen principal neurons des ZNS einige
ungewöhnliche Eigenschaften. Sie besitzt (1) eine hohe, basale Aktivitätsrate, (2)
kein klassisches Ruhemembranpotential, und (3) kommuniziert inhibitorisch über den
Transmitter GABA. Die Projektion der Purkinjezelle zu den Kleinhirnkernen ist die
einzige Efferenz aus dem cerebellären Kortex, einer zentralen Struktur des
motorischen Lernens. Interessanterweise können synaptische Lernvorgänge an
Purkinjezellsynapsen mit einer reziproken Form der synaptischen Plastizität, der LTD
(Langzeitdepression, long term depression) korreliert werden. Hierbei wird durch
koordinierte Stimulation der Kletterfaser- und Moosfasereingänge die Synapse der
Parallelfaser zur Purkinjezelle in ihrer synaptischen Stärke langzeitig geschwächt und
somit das Feintuning des cerebellären outputs bestimmt. Tiermodelle, bei denen
diese
spezifische
synaptische
Übertragung
gestört
ist,
zeigen
in
Verhaltensversuchen eine starke Beeinflussung der motorischen Fähigkeiten und
des motorischen Lernens, bis hin zu einer ausgeprägten Ataxie.
Wird eine Parallelfaser repetitiv gereizt, so können in PF-Purkinjezellsynapsen zwei
Typen von Ca2+ Signalen beobachtet werden. (1.) Ein schnelles Ereignis wird durch
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Glutamatrezeptoren vom AMPA-Typ initiiert (postsynaptische Depolarisierung) und
öffnet unmittelbar spannungsabhängige, dendritische Ca2+ Kanäle. (2.) Ein
langsameres Ereignis vermittelt über metabotrope Glutamatrezeptoren (mGluR1) die
Freisetzung von Ca2+ aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER). Die Freisetzung
von Ca2+ aus dem ER führt wiederum zur Aktivierung von Ionenkanälen in der
Plasmamembran, die erneut eine lokale Depolarisierung des Dendriten bewirken.
Verantwortlich für dieses Signal sind sogenannte Trp-Ionenkanäle (Trp, transient
receptor potential channels). Aus der riesigen Familie der Trp-Kanäle, die man häufig
auch als sensorische Kanäle des Nervensystems bezeichnet, wurde der Kanal TrpC3
als maßgeblich für die synaptische Transmission an der PF-Purkinjezelle ermittelt.
Mausmodelle denen dieser Kanal fehlt, zeigen starke Defekte der motorischen
Koordination (Hartmann et al. 2008). Ein natürlich vorkommendes Mausmodell mit
motorischen Defekten (moonwalker) zeigt eine Mutation im Gen, das für den Kanal
TrpC3 kodiert.
Diese Befunde belegen eindringlich die Nützlichkeit einer detaillierten anatomischen,
physiologischen und molekularen Beschreibung synaptischer Systeme. Dieses
Wissen erlaubt ein besseres Verständnis klinischer Phänomene und hilft bei der
Entwicklung neuartiger Therapien.
Neuronaler Schaltkreis im cerebellären Kortex und
Orte synaptischer Plastizität (1-5). Der cerebelläre
Schaltkreis bietet innerhalb eines definierten
Informationsflusses (Pfeile) die Möglichkeit Formen
der synaptischen Plastizität zu untersuchen. An
Purkinjezellsynapsen wird LTD durch Koinzidenz von
zwei Signalen hervorgerufen, die über Kletterfasern
(CF) und Parallelfasern (PF) vermittelt werden (CF-PF
pairing).
Signale, die zur Vermittlung der Purkinjezell-LTD
führen, sind gut beschrieben und bieten eine
experimentelle Grundlage zur Untersuchung der
molekularen Mechanismen synaptischer Plastizität.
Eine Purkinjezelle der Ratte unterhält bis zu 175.000
Synapsen zu Parallelfasern und bis zu 26.000 zu
Kletterfasern. Es konnte gezeigt werden, dass
postsynaptische Ca2+ Signale in einzelnen
Purkinjezellsynapsen ursächliche Mediatoren der
Purkinjezell-LTD darstellen können. Jüngere
Forschungen haben einen Mechanismus der
synaptischen Plastizität offengelegt, der unabhängig
von NMDA-Typ Glutamatrezeptor ist.
Literatur:
*Fundamental Neuroscience; *Principles of Neural Science, *Physiologie des Menschen.
Milner, Squire & Kandel (1998) Cognitive Neuroscience and the study of memory. Neuron 20: 445 ff.
Ito M. (2002) The molecular organization of cerebellar long-term depression. Nature Rev Neurosci 3:
896-902.
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Dysfunktion von Ionenkanälen der Nerven-Muskel-Synapse (Prof. Villmann)
Geschwindigkeiten, mit denen elektrische Impulse im Gehirn weitergeleitet werden, sprengen unser
menschliches Vorstellungsvermögen: So rasen die Impulse mit Höchstgeschwindigkeit eines Formel-1Rennwagens – rund 350 Kilometer pro Stunde – von Zelle zu Zelle. Dazu müssen innerhalb einer
tausendstel Sekunde viele tausend Ionen durch einen Ionenkanal geleitet werden. Wenn wir eine
Buchseite umgeschlagen haben, dann haben sich nur um diese einfache Bewegung der Armmuskeln
auszuführen im Gehirn gerade rund zwei Milliarden Ionenkanäle geöffnet und wieder geschlossen.
Ionenkanäle sind membrangebundene Proteine, die den Ionenfluss über die Membran gewährleisten.
Dieser ist entscheidend für viele physiologische Prozesse im Organismus wie Muskelkontraktion,
Elektrolyt-Sekretion, und synaptische Transmission zwischen Nervenzellen. Die meisten Signalwege
der schnellen synaptische Transmission werden durch die Superfamilie der Cys-Loop Rezeptoren
gewährleistet, wozu die nikotinischen Acetylcholinrezeptoren, die GABAA/C Rezeptoren, der 5HT3
Rezeptor, Glutamat-aktivierte Chloridkanäle und die Glycinrezeptoren zählen. Einige Mitglieder dieser
Familie wie z.B. der nikotinische Acetylcholinrezeptor oder GABAA Rezeptoren sind Angriffspunkt für
Pharmaka mit entscheidender klinischer Bedeutung. Obwohl bekannt ist, dass muskelentspannende,
sedative und anxiolytische Pharmaka sowie Anti-Epileptika und Anästhetika über die Bindung an
GABAA Rezeptoren wirken, gibt es dennoch einen erheblichen Anwendungsbereich für die Entwicklung
neuer Therapeutika mit verbesserten Eigenschaften, reduzierter Abhängigkeit und weniger
Nebenwirkungen. Eine andere wichtige Familie der inhibitorischen Cys-loop Rezeptoren sind die
Glycinrezeptoren, die ebenfalls ein geeignetes therapeutisches Target für chronischen Schmerz,
Tinnitus, Temporallappen Epilepsy und Spastizität darstellen. Obwohl die Bindung per se von
Alkoholen, Taurin, -Alanin oder Anästhetika wie Propofol an Glycinrezeptoren bekannt ist, existieren
aufgrund der fehlenden Kristallstruktur keine genauen Erkenntnisse über die Bindungsdomänen und
Konformationsänderungen, die nach der Bindung stattfinden. Diese aufzuklären wird das Feld
entscheidend beeinflussen und für die Entwicklung neuer Therapeutika für verschiedene Erkrankungen
des zentralen Nervensystems maßgeblich sein.
Wo im zentralen Nervensystem sind diese Rezeptoren präsent und welche Bedeutung für die
Physiologie besitzen sie? Dies soll am Beispiel der Nerven-Muskel Synapse verdeutlicht werden.
Zunächst wird durch die Erregung sensorischer Neurone, die sich in dorsalen Wurzelganglienzellen
(DRGs) befinden, Glutamat als exzitatorischer Neurotransmitter ausgeschüttet. DRGs befinden sich in
der Nähe zum Rückenmark. Folge der Glutamatausschüttung ist die Aktivierung von
Glutamatrezeptoren, die sich in der Membran von Motoneuronen befinden. Die Membran wird
depolarisiert, ein exzitatorisches postsynaptisches Potential entsteht (EPSP). Motoneurone feuern
Aktionspotentiale zur neuromuskulären Endplatte, wo das Signal wieder über einen exzitatorischen
Neurotansmitter, in diesem Fall Acetylcholin, weitergeleitet wird. Dieses System funktioniert mit größter
Präzision, denn ein Aktionspotential im Motoneuron führt zu genau einen Aktionspotential an der
Muskelfaser. Diese Kontrolle obliegt inhibitorischen Interneuronen im Rückenmark (Renshaw Zellen),
die durch kollaterale Axone der Motoneurone erregt werden, selbst aber inhibitorische Synapsen mit der
Motoneuronenmembran ausbilden. Diese Interneurone schütten Glycin aus, der dann an
Glycinrezeptoren bindet. Dadurch wird ein inhibitorisches postsynaptisches Potential (IPSP) generiert,
die Membran wird hyperpolarisiert. Durch diese Feedback Kontrolle, wird das Motoneuron in seiner
Feuerrate kontrolliert, so dass letztlich nur soviel Acetylcholin ausgeschüttet wird, wie zur Erreichung
des Schwellenwerts für ein Aktionspotential notwendig ist, dieses breitet sich entlang der Muskelfaser
aus. Als Folge kann sich der menschliche Organismus kontrolliert bewegen (Abb.1).
18
A
Abb. 1 (A) Nerven-Muskel
Synapse. Kontrolle durch
inhibitorische Interneurone
(Renshaw Zellen. (B) GABAerge
Neurotransmission bedeutend in
höheren Hirnarealen wie z.B.
dem Hippocampus (C)
Inhibitorische Synapse stark
schematisiert. Beteiligung
verschiedener
Glycinrezeptorpopulationen.
Rechts: Homologie Modell des
pentameren Ionenkanals.
B
C
Mutationen in humanen sowie auch in murinen Genen, die für Glycinrezeptoruntereinheiten kodieren,
sind mit motorischen Bewegungsstörungen assoziiert. Beim Menschen heißt diese Erkrankung
Hyperekplexie (Stiff Baby Syndrome) und äußert sich bereits in der ersten Lebenswoche durch
Krampfanfälle als Folge sensorischer oder taktiler Reize. Im Patienten wird durch Clonazepam-Gabe
die GABAerge Neurotransmission hochreguliert und dadurch die fehlende glycinerge Inhibition
kompensiert. Bei Mutationen in GABAA Rezeptoruntereinheiten wird eine Assoziation mit bestimmten
Formen von Epilepsy diskutiert. Um die Pathomechanismen dieser Erkrankungen besser zu verstehen,
nutzt man Mausmodelle die spontane Mutationen in Glycinrezeptorgenen tragen bzw. generiert
transgene Tiere, die gezielt im Pateinten identifizierte Mutationen tragen.
19
Der Phänotyp der Tiere zeichnet sich durch massiven Tremor und Zusammenpressen der hinteren
Extremitäten aus (Abb.2).
Mausmutante oscillator
GlyR1 Mutante
Wildtyp
elektrophysiologische
Ganzzellableitungen
Wildtyp
Mutanten
Mit Hilfe elektrophysiologischer Untersuchungen in vitro an transfizierten Zellen oder in Hirnschnitten
aus dem Tier lassen sich die unterschiedlichen Kanaleigenschaften bis auf Einzelkanalniveau
spezifizieren.
Einzelkanalmessungen: Vergleich Wildtyp und spasmodic Mausmutante mit GlyR1 Defekt (aus Graham et al., 2011, J.
Physiol.)
Die Patch-Clamp-Technik wurde ursprünglich zur Messung kleinster Ströme entwickelt und führte zur
Vergabe des Nobelpreises für Medizin 1991 an Bert Sakmann und Erwin Neher. Mittlerweile ist sie
Standardtechnik bei elektrophysiologischen Ganzzellableitungen von Neuronen und erlaubt eine
detaillierte Untersuchung der unterschiedlich regulierten Ionenkanäle mit ihren charakteristischen
Eigenschaften.
Die Erkenntnisse aus den elektrophysiologischen Untersuchungen tragen zum besseren Verständnis
der Signalwege bei und sind daher bedeutsam für die Entwicklung neuartiger Therapiemöglichkeiten.
20
Neurobiologie Kursprogramm
Uhrzeit
GRUPPE 1
08.30
Montag 21.10.13
09.00
Neurotrophe
Faktoren,
Zellkulturmodelle
für neurodegenerative
Erkrankungen
Neurotrophe
Faktoren,
Zellkulturmodelle
für neurodegenerative
Erkrankungen
DRG-Präparation,
Tier-OP
09.30
10.00
Dienstag 22.10.13
Mittwoch 23.10.13
Donnerstag 24.10.13
Freitag 25.10.13
Mausmodelle für
Motoneuronerkrankungen und
Axonaler Transport
Mausmodelle für
Motoneuronerkrankungen und
Axonaler Transport
Kleinhirn und
Hippokampus
Ionenkanäle
Neuronale
Stammzellen
Kleinhirn und
Hippokampus
Ionenkanäle
Neuronale
Stammzellen
Hippocampus
Präparation
Mausperfusion
Waschen der Schnitte
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbespr
echung
Hippocampus
Präparation
Mausperfusion
Waschen der Schnitte
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
Projekt Samira
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
Projekt Samira
Waschen und
Eindeckeln
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbespr
echung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbespr
echung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbespr
echung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbespr
echung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbespr
echung
10.30
DRG-Präparation,
Tier-OP
Hippocampus
Präparation
Mausperfusion
11.00
DRG-Präparation,
Tier-OP
Hippocampus
Präparation
Gewebe einbetten,
11.30
Zellkultur DRGs
Hippocampus
Präparation
Pause
12.00
Vorführung
Blastozysteninjekti
on
Hippocampus
Präparation
Pause
Waschen und
Eindeckeln
12.30
Vorführung
Blastozysteninjekti
on
Zellkultur DRGs,
PC12
Pause
Gewebe schneiden
Waschen und
Eindeckeln
cLabs/Ionenkanäle
bei der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle
bei der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle
bei der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle
bei der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle
bei der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle
bei der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle
bei der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle
bei der Arbeit/Patch
Clamp
Gewebe schneiden
Projekt Patrick
Gewebe schneiden
Projekt Patrick
Blocken,
Histovorlesung
SP5, konfokale
Mikroskopie
Blocken, 1. Antikörper
auf Cereb., Hippoc.
und RM Schnitte
Blocken, 1. Antikörper
auf Cereb., Hippoc.
und RM Schnitte
Blocken, 1. Antikörper
auf Cereb., Hippoc.
und RM Schnitte
Blocken, 1. Antikörper
auf Cereb., Hippoc.
und RM Schnitte
Blocken, 1. Antikörper
auf Cereb., Hippoc.
und RM Schnitte
SP5, konfokale
Mikroskopie
13.00
13.30
Zellkultur DRGs,
PC12
14.00
Zellkultur DRGs,
PC12
14.30
Zellkultur DRGs,
PC12
15.00
Zellkultur DRGs,
PC12
15.30
Zellkultur DRGs,
PC12
16.00
Biomed-Vorlesung
Hörsaal MSZ
16.30-17.30
21
SP5, konfokale
Mikroskopie
SP5, konfokale
Mikroskopie
SP5, konfokale
Mikroskopie
SP5, konfokale
Mikroskopie
Uhrzeit
Gruppe 2
08.30
Montag 21.10.13
Dienstag 22.10.13
Mittwoch 23.10.13
Donnerstag 24.10.13
Freitag 25.10.13
Mausmodelle für
Motoneuronerkrankungen und
Axonaler Transport
Mausmodelle für
Motoneuronerkrankungen und
Axonaler Transport
Kleinhirn und
Hippokampus
Ionenkanäle
Neuronale
Stammzellen
09.00
10.00
Neurotrophe
Faktoren,
Zellkulturmodelle für
neuro-degenerative
Erkrankungen
Neurotrophe
Faktoren,
Zellkulturmodelle für
neuro-degenerative
Erkrankungen
Mausperfusion
Kleinhirn und
Hippokampus
Ionenkanäle
Neuronale
Stammzellen
Waschen der
Schnitte
DRG-Präparation,
Tier-OP
Hippocampus
Präparation
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbesprec
hung
Waschen der
Schnitte
DRG-Präparation,
Tier-OP
Hippocampus
Präparation
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
Projekt Samira
2. Antikörper auf
Cerebellum und
Hippo. Schnitte
Projekt Samira
Waschen und
Eindeckeln
DRG-Präparation,
Tier-OP
Hippocampus
Präparation
Zellkultur DRGs
Hippocampus
Präparation
Vorführung
Blastozysteninjekti
on
Hippocampus
Präparation
Gewebe einbetten,
Waschen und
Eindeckeln
Vorführung
Blastozysteninjekti
on
Hippocampus
Präparation
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbesprec
hung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbesprec
hung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbesprec
hung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbesprec
hung
Auswertung der
Bilder,
Abschlussbesprec
hung
10.30
Mausperfusion
11.00
Mausperfusion
11.30
Gewebe einbetten,
12.00
12.30
Pause,
Pause
Pause
13.00
Gewebe schneiden
Waschen und
Eindeckeln
Projekt Patrick
Zellkultur DRGs,
PC12
13.30
Gewebe schneiden
Projekt Patrick
Zellkultur DRGs,
PC12
14.00
Gewebe schneiden
SP5, konfokale
Mikroskopie
Zellkultur DRGs,
PC12
14.30
Blocken,
Histovorlesung
SP5, konfokale
Mikroskopie
Zellkultur DRGs,
PC12
15.00
Blocken, 1.
Antikörper auf
Cereb., Hippoc. und
RM Schnitte
Blocken, 1.
Antikörper auf
Cereb., Hippoc. und
RM Schnitte
Biomed-Vorlesung
Hörsaal MSZ
SP5, konfokale
Mikroskopie
Zellkultur DRGs,
PC12
cLabs/Ionenkanäle bei
der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle bei
der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle bei
der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle bei
der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle bei
der Arbeit/Patch
Clamp
SP5, konfokale
Mikroskopie
Zellkultur DRGs,
PC12
cLabs/Ionenkanäle bei
der Arbeit/Patch
Clamp
SP5, konfokale
Mikroskopie
Zellkultur DRGs,
PC12
cLabs/Ionenkanäle bei
der Arbeit/Patch
Clamp
cLabs/Ionenkanäle bei
der Arbeit/Patch
Clamp
09.30
15.30
16.00
16.3017.30
SP5, konfokale
Mikroskopie
22
Seminarvorträge: Mo. 9:00-10:00 Uhr und Di. - Fr. jeweils von 8:30-9:30 Uhr zu den angekündigten
Themen. Die angegebenen Zeiten für die Vorlesungen können sich auch verschieben. Die Vorlesungen
finden im MSZ Hörsaal statt.
Treffpunkt am 21.10.13
8:50 Uhr Haus E4, Versbacherstr. 5
Montag, 21.10.13
9:00 Uhr:
Neurotrophe Faktoren, Zellkulturmodelle für neurodegenerative Erkrankungen, Prof. M.
Sendtner
Dienstag, 22.10.13
8:30 Uhr:
Mausmodelle für Motoneuronerkrankungen, Axonaler Transport, Dr. S. Jablonka
Mittwoch, 23.10.13
8:30 Uhr
Kleinhirn und Hippokampus, Dr. R. Blum
Donnerstag, 24.10.13
8:30 Uhr
Ionenkanäle, Prof. C. Villmann
Freitag, 25.10.13
8:30 Uhr
Neuronale Stammzellen, Dr. R. Götz
23
ZELLKULTUR TEIL
Neuronale Zellen brauchen zum Überleben und zur Differenzierung unter anderem neurotrophe
Faktoren und extrazelluläre Matrixproteine (siehe Vorlesung Prof. Sendtner).
Um das Überleben und das Wachstumsverhalten von primären Neuronen in Gegenwart bzw.
Abwesenheit von neurotrophen Faktoren sowie Matrixprotein zu untersuchen, werden primäre
sensorische Neurone aus Hinterwurzelganglien (DRGs) von 14 Tage alten Mausembryonen isoliert und
unter den unten genannten Bedingungen kultiviert.
Präparation von Maus-Hinterwurzelganglien (DRGs)
I. Vorbereitung
1. Lösungen

F14-Medium + 10% Horse Serum (HS): 1Dose F14 Pulver (Life Tech/INVITROGEN) in 900ml
Wasser lösen, 10ml Penicillin/Streptomycin-Lsg. (1:100 verd., EK: 100mg/l Streptomycin Sulfat,
60,6mg/l Penicillin G) zugeben, mit 1M NaOH auf pH 7,3 einstellen (=> rote Farbe!), 1,97g
NaHCO3 zufügen und auf 1l auffüllen; CO2 einleiten bis die Lösung lachsfarben ist, 10% HS
zugeben, steril filtrieren

Phosphate buffered saline; PBS

1% Trypsin (in Hanks balanced salt solution, HBSS; Life Tech/INVITROGEN)
2. Kulturschalen
a) Am Vortag:
Kulturschalen mit Poly-D,L-Ornithin (Sigma; 0,5mg PORN/ml 0,15M Boratpuffer pH 8,35) über Nacht bei
4°C beschichten
b) Vor der Präparation:
- 3x mit HBSS waschen
- Beschichtung mit Laminin-111 Lösung (1:400 aus 1mg/ml-Maus-Laminin-Stammlösung in
HBSS/HEPES verdünnen, EK: 2,5µg/ml)
3. Im Labor vorbereiten
Eisbad, Präparierbesteck, 10cm-Petrischale zum Präparieren, 6cm-Petrischale mit PBS zum Sammeln
und Versäubern, Pasteurpipette, Eppendorfgefäß mit 1ml PBS
II. Präparation
-
14 Tage alte Mausembryonen werden aus den Muttertieren präpariert und in einer Petrischale
gesammelt
24
-
Köpfe der Embryonen abschneiden, Körper in Petrischale legen
Zum Präparieren wird der Embryo auf den Bauch gelegt. Die Haut wird entfernt und das
Rückenmark vorsichtig herausgelöst.
Das Rückenmark wird in eine Petrischale mit HBSS gesammelt.
Dann werden die Hinterwurzelganglien (DRGs), die seitlich entlang des präparierten Rückenmarks
laufen, abgetrennt.
DRGs in 3 cm Petrischale mit PBS sammeln
Die Ganglien von überschüssigem Gewebe befreien und in 3 cm Petrischale mit frischem PBS
überführen.
III. Aufarbeitung in der Zellkultur (Gewinnen und Kultivieren der sensorischen Neurone)
-
-
DRGs in 5 cm Petrischale „versäubern“, dabei leicht schwenken (damit nichts hängen bleibt) und in
15 ml Röhrchen sammeln.
Falkon leicht schütteln (damit DRGs nach unten wandern) und Volumen mit Pipette auf ca. 1 ml
reduzieren.
50 µl 1 % Trypsin in jedes Röhrchen dazugeben und leicht schwenken.
30 min bei 37°C im Brutschrank inkubieren.
Überstand mit Pasteurpipette vorsichtig abnehmen bis auf ca. 300 ml.
Ca. 10 mal mit 200 µl - Pipette triturieren (Auflösen des Zellverbands, Vereinzeln der sensorischen
Neurone). Zellsuspension in einem 15 ml Röhrchen sammeln.
15 ml Röhrchen mit 9.5 ml Kulturmedium füllen.
Zellsuspension auf NUNC-Petrischale (10 cm) zum Pre-Plating geben.
1 h bei 37°C in Brutschrank stellen.
Petrischale vorsichtig 2 mal schwenken und Inhalt in 15 ml Röhrchen überführen.
8 min bei 400 g zentrifugieren.
Absaugen bis auf 500 µl, resuspendieren
Neubaur-Zählkammer mit 10 µl Zellsuspension befüllen und Zellen zählen (4 Eckquadrate
auszählen; Mittelwert bilden; Mittelwert x 10 = Zellen pro 1 µl Zellsuspension)
Auf PORN bzw. PORN und Laminin-111 beschichtete 24-Wells ausplattieren, dazu Laminin-111
absaugen und gleichzeitig 500 µl Kulturmedium mit bzw. ohne NGF (10 ng/ml Endkonzentration)
zugeben.
Errechnete Zellmenge an Zellsuspension in jede Vertiefung zugeben.
IV. Kultur
Kulturmedium: F14 + 10% HS, Inkubation bei 37°C und 5% CO2
Faktoren: NGF (Endkonz.: 10ng/ml) und eine Kontrolle ohne neurotrophen Faktor.
Die Zellen werden auf Poly-Ornithin (PORN) oder PORN + Laminin-111 beschichteten Schalen
ausplattiert.
25
Präparation von Hippocampus Neuronen
- E18 Rattenembryonen (Wistar) aus getöteter Ratte entnehmen und in Schale mit kaltem
Neurobasalmedium überführen.
- Embryonen aus Fruchtblase herausnehmen, von Plazenta trennen und in neue Schale
überführen.
- Mit der Schere Embryo durch Genickschnitt töten, Haut am Schädel entfernen und
Schädeldecke einschneiden von hinten nach vorn zur Nase.
- Mit gebogener Pinzette das Gehirn herausnehmen und in Petrischale mit kaltem NeurobasalMedium überführen.
- Unter dem Binokular OB (bulbus olfactorius) entfernen, mit Skalpell zwischen den beiden
Hemispheren einschneiden und beide Hemispheren vorsichtig abklappen und abtrennen.
- Auf der Innenseite wird der Hippocampus als ’helle Mondstruktur’ sichtbar.
- Meningen mit Pinzetten entfernen !
- Hippocampus mit dem Skalpell herauspräparieren und in einer mit Neurobasal Medium (NB)
gefüllten Petrischale auf Eis sammeln.
- Die Hippocampi werden mit der Schere zerkleinert, in ein 15 ml Falcon-Gefäß überführt und der
Überstand wird vorsichtig abgenommen.
- Zugabe von 10 ml Trypsin/EDTA (1mg/ml) (hier 1ml) und 100 µl DNAse I (Endkonzentration
0,1 mg/ml; stock 10 mg/ml) (hier 10 µl). Ansatz 30 min bei 37 ºC im Wasserbad inkubieren.
- Zugabe von 1 ml FCS (fötales Kälberserum) (hier 100 µl) zur Inaktivierung des Trypsins
(Endkonzentration 10%).
- Pasteurpipette zum Triturieren vorbereiten; scharfe Kanten in der Flamme eines
Bunsenbrenners abrunden dabei Pipette zwischen Daumen, Zeige- und Mittelfinger in der
Flamme drehen (KEINE Hakennasen produzieren!)
- Mit einer Glaspipette (10 ml, dann 5 ml, dann Pasteurpipette) wird der Ansatz trituriert. Nach
dem Absetzen von nicht lösbaren Zellbestandteilen (3 min), wird die Hälfte des Überstandes in
ein neues Falcon überführt und der Rest erneut mit der Pasteurpipette trituriert. Erneut 3min
stehen lassen.
- Überstände werden vereint und 10 min bei 800 rpm zentrifugiert.
- Zellpellet in 10 ml NB/B27 Medium (hier 1 ml) (37 ºC) aufnehmen und Triturierungsschritte
(unter Punkt 13.) wiederholen, wieder zentrifugieren. Bei vielen Zelltrümmern, kann ein weiterer
Waschschritt die Anzahl an Zelltrümmern vermindern.
- Zellpellet in 10 ml NB/B27 Medium (hier 1 ml) aufnehmen und in Neugebauer Zählkammer
zählen. Die Zellen werden auf mit Polylysin beschichteten Platten ausplattiert.
- Nach 8 Tagen wird einmal pro Woche 50 % des Mediums ausgetauscht.
26
Aussaatdichten:
96 well Platte: pro well
Deckgläschen in 3 cm Schale
Deckgläschen in 24 well Platte :
pro well
3 cm Schale
6 cm Schale
10 cm Schale
Hippocampus
35.000 Zellen /100 µl
150.000 Zellen /2.5ml
46.000 Zellen / 500 µl
100.000 Zellen / 2.5 ml
400.000 Zellen / 6 ml
2.5-4 x 106 Zellen / 10 ml
NB Medium: Neurobasal Medium 500 ml (Invitrogen) + 5 ml L-Glutamin (Endkonz. 2mM) + B27
Supplement (Gibco)
Ionenkanäle bei der Arbeit
Patch-Clamp-Setup
gepatchtes Neuron
In diesem Kursteil erhalten Sie eine Einführung in die Patch-Clamp Technik und dabei Möglichkeiten die
Module dieser Ableittechnik kennenzulernen. Das ganze soll zunächst durch das Programm cLabsNeuron unterstützt werden, wo virtuelles Patchen möglich ist.
Anschließend werden wir Ihnen an transfizierten Zellen (HEK293) und Hippocampus-Neuronen diese
Technik nahe bringen und Ganzzellableitungen demonstrieren.
Sie bekommen aber auch die Gelegenheit , selber Patch-Clamp-Ableitungen im Ganzzellmodus
durchzuführen. Da die zur Verfügung stehende Zeit und die vorhandenen Meßplätze sehr begrenzt
sind, werden wir uns auf wenige robuste Messungen beschränken und in 2er Gruppen an den
jeweiligen Nachmittagen abwechseln. PATCHEN erfordert VIEL GEDULD!
27
IMMUNHISTOCHEMISCHER TEIL
Die Antikörperfärbungen an hippokampalen und cerebellären Gewebeschnitten von jungen und adulten
Mäusen, veranschaulichen den Aufbau und die Komplexität dieser Hirnregionen (siehe Vorlesung Prof.
Sendtner, Dr. Jablonka, Dr. Blum).
Es sollen anhand von Antikörperfärbungen die unterschiedlichen neuronalen Schichten und Zelltypen in
der Kleinhirnrinde einer adulten und einer postnatalen Maus (Tag 5-8) untersucht und dokumentiert
werden, um die Entwicklung des Cerebellums deutlich zu machen. Außerdem werden Schnitte des
Hippokampus und Rückenmarks einer adulten Maus angefertigt und mit konfokaler Mikroskopie
ausgewertet.
Für die mikroskopische Untersuchung der Zellen in einem Gewebe wird das Gewebe zunächst
präpariert, fixiert, eingebettet und geschnitten (siehe: Herstellung von Vibratom-Schnitten). Die meisten
Gewebe bestehen aus einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen, und die Immunhistochemie macht es
möglich, einzelne Zelltypen im Gewebe bzw. auch von Strukturen innerhalb der Zellen darzustellen.
Dieser Vorgang wird hier am Beispiel des Cerebellums beschrieben.
Purkinjezellen und Interneurone des Cerebellums sollen mit Antikörpern gegen Parvalbumin identifiziert
werden. Die Axone der Korbzellen, die Afferenten der Moosfasern und Kletterfasern sowie die
Efferenten der Purkinje-Zellen sollen mit Anti-Phospho-Neurofilament detektiert werden.
Herstellung von „free floating sections„ mit dem Vibratom
Mäuse werden mit 4% Paraformaldehyd in Phosphatpuffer (PFA) perfundiert und das Gehirn wird
freipräpariert. Nach einer kurzen Postfixation wird das Gewebe in Agarose eingebettet und mit einem
Vibratom in 50-80 µm dicke Scheiben geschnitten.
Chemische Fixierung: Das Gewebe wird in Paraformaldehyd (4 % in der Pufferlösung PBS, pH 7.4,
PFA) eingelegt. Durch Quervernetzung von Proteinen bleibt die Gewebsstruktur erhalten, Enzyme
werden inaktiviert, das Gewebe wird härter und kann gelagert werden.
Einbetten: Fixiertes Gewebe wird in 6%-iger Agarose eingegossen. Beim Abkühlen des Polymers
entsteht ein hartes Präparat, das bei Raumtemperatur geschnitten werden kann.
Trimmen: Das Präparat wird auf einem Probenhalter befestigt und mit einem Skalpell oder einer
Rasierklinge vorgeschnitten, so dass die interessante Gewebeseite exponiert wird (siehe Vorlesung).
Schneiden: Der getrimmte Gewebeblock wird entsprechend dem
Klingenverlauf des Vibratoms auf einem Probenhalter mit
Sekundenkleber festgeklebt. Der Probenhalter wird im Vibratom
befestigt. Die vibrierende Rasierklinge wird in der Wanne (gefüllt mit
PBS) an der Schnittfläche entlanggeführt. Die Schnitte werden mit
einem Pinsel abgefischt und in einer 24-well Platte, gefüllt mit PBS
pH 7.4, gesammelt. Die Dicke der Schnitte wird durch den Vorschub
des Probenhalters reguliert.
28
Indirekte Fluoreszenzfärbung von bestimmten Proteinen und Antigenen mit Antikörpern
Zellen werden zunächst mit einem Detergenz (z.B. Triton X100, Tween 20) während des Blockings
permeabilisiert, um den Antikörpern den Zugang zum Zytoplasma zu ermöglichen. Dann werden die
Erstantikörper auf den Schnitt gegeben. Dabei ist wichtig, dass die beiden Antikörper in Tieren
unterschiedlicher Gattungen produziert worden sind, z.B anti-Parvalbumin im Kaninchen (polyklonal)
und anti-SMI-31 (monoklonal) in der Maus. Nach einem Waschgang bleiben nur dort Antikörper zurück,
wo sie an ihr jeweiliges Antigen gebunden sind - also die einen an den Purkinje-Zellen und
Interneuronen, die anderen an den Axonen. Nun werden die Zweitantikörper zugegeben, die gegen
Antikörper der Tiere gerichtet sind, von denen die Erstantikörper stammen. Die anti-KaninchenZweitantikörper sind mit einem roten Fluorochrom konjugiert (z.B. Cy3, Dylight 549, Alexa 549), die antiMaus-Zweitantikörper tragen ein grünes Fluorochrom (Alexa 488, Dylight 488). Diese
Sekundärantikörper werden fast immer durch Immunisierungen von Ziegen (goat) oder Esel (donkey)
mit IgG-Fraktionen der Erstantikörperspezies induziert und aus deren Serum gereinigt. Nach
Abwaschen der nicht-gebundenen Antikörper kann nun mit dem Fluoreszenzmikroskop oder einem
konfokalen Laserscanning-Mikroskop die Verteilung der Immunfärbung im Gewebeschnitt untersucht
werden. Dabei muss das optische System so eingerichtet sein, dass Anregungs- und Emissionslicht der
beiden Fluorochrome gut voneinander getrennt sind. Nur dann ist eine getrennte Darstellung der beiden
Signale möglich.
Blockierung: Mit PBS + BSA 10 % + Triton X-100 0,1 % werden unspezifische Bindungsstellen im
Gewebe abgeblockt und Fette + Eiweiße aus Zellmembranen herausgelöst. Dadurch wird das Gewebe
eingängiger für den Antikörper und somit eine bessere Färbung erzielt. 45 minbis 1 h bei RT sollten bei
dieser Schnittdicke ausreichen.
In der gesamten Prozedur kann BSA auch durch Serum ersetzt werden. Hier wird bevorzugt Serum
verwendet, welches der Spezies der Sekundärantikörper entspricht.
1. Antikörper: Der Erstantikörper, welcher spezifische Proteine erkennt, wird in PBS + BSA + Triton X100 verdünnt und 4 h bei RT oder über Nacht bei 4° C mit dem Gewebe inkubiert. Nach der
Inkubationszeit wird 3-4x 10 min mit PBS gewaschen, um den überschüssigen, nicht gebundenen
Antikörper zu entfernen. Achtung: ungebundener Antikörperüberschuß führt zu hohem Background.
2. Antikörper: der unspezifische Zweitantikörper, welcher den Erstantikörper erkennt und an diesen
bindet, ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt. Dieser wird ebenso in PBS + BSA + Triton X-100
verdünnt, zupipettiert und für 1 1/2 h bei RT inkubiert. Anschließend wird wieder 3x mit PBS gewaschen
und das Gewebe auf ein Objektträger gezogen. Fluorezenzgefärbte Schnitte werden in einem
Einbettmedium (hier Aquafluomount) eingedeckelt und mit Nagellack umrandet. Die Färbungen können
im Dunkeln bei 4 ° C gelagert werden.
Warum welcher Puffer:
Phosphat oder Tris-Puffer um einen für Antikörper-Antigen günstigen pH-Wert zu erhalten.
BSA oder Serum zum Blockieren unspezifischer Interaktionen.
29
Tween 20, Triton X-100 oder andere Detergenzien um die Diffusion zu verbessern, unerwünschte
unspezifische, insbesondere hydrophobe Bindungen abzuschwächen, und um das Eindringen der
Antikörper in die Zellen zu erleichtern.
Um ein rasches Ausbleichen der Fluorochrome durch freie Radikale zu vermindern, werden „anti-fade„
oder „anti-bleaching„ Reagentien im Einbettmedium eingesetzt. Das Einbettmedium muss in seinem
Brechungsindex an den der Deckgläser angepasst sein..
Fluorophore
Absorptionsmax. (nm)
Emissionsmax. (nm)
Cyanine, Cy2
492
510
Fluorescein, FITC
492
520
Alexa 488 / Dylight 488
495
510
Indocarbocyanine, Cy3
550
570
Alexa 549 / Dylight 549
550
570
Aminomethylcoumarin, AMCA
350
450
Texas Red, TR
596
620
Indodicarbocyanine, Cy5
650
670
30
Calbindin is a calcium-binding protein belonging to the troponin C superfamily. Calbindin
immunoreactivity was detected by immunohistochemistry in the kidney, pancreatic islets, and brain. Two
different proteins presenting calbindin immunoreactivity, one of molecular mass 28 kD and the other of
29 kD, were identified in the central nervous system. Both molecular species are present in the brain of
all vertebrates except fish.
Parvalbumin, a high affinity calcium-ion binding protein, is expressed in high levels only in fastcontracting muscles and at lower levels in brain and several endocrine tissues. In the hippocampus it is
an excellent marker for interneurons, the so called PV+ fast spiking basket cell and it labels dendrites,
the soma and the axonal projections.
SMI 31 stains phosphorylated neurofilament. It reacts broadly with thick and thin axons and some
dendrites, but not Purkinje cell dendrites! Nerve cell bodies and other cells and tissues are unreactive
except for peripheral axons.
NF: Cytoplasmic intermediate filaments (IF) can be divided into 5 subclasses based on their biochemical
properties, immunologic specificity and tissue distribution: keratin, filaments in epithelial cells, vimentin
filaments in cells of mesenchymal origin, desmin in muscle cells, glial filaments in astrocytes, and
neurofilaments in neurons. The different types of intermediate filament proteins share common
structural features. Neurofilaments are composed of 3 neuron-specific proteins with apparent molecular
weights of 68,000 (called NF-L for light), 125,000 (NF-M for medium), and 200,000 (NF-H for heavy) on
SDS-gel electrophoresis. The different sequence data show that the intermediate filament proteins
contain a similar alpha-helical domain of conserved length capable of forming coiled-coils.
GFAP: Glial fibrillary acidic protein is an intermediate-filament (IF) protein that is highly specific for cells
of astroglial lineage. The predicted amino acid sequence indicated that GFAP shares structural
similarities with other IF proteins found in nonepithelial cell types. Considerable sequence divergence in
the amino-terminal region of GFAP suggested that the tissue-specific functions of this IF protein may be
mediated through this region of the molecule. GFAP is a useful marker of astroglia, but is not a general
marker for astroglia in the CNS.
NeuN reacts with most neuronal cell types including granule cells of the cerebellum and the
hippocampus but not with precursors in proliferative zones. Staining is strongest in nuclei. No staining of
Purkinje cells!
Doublecortin is a marker of immature neurons. In the adult, it is preferentially expressed in neurogenic
niches of the lateral ventricle or the subgranular zone of the hippocampus (hilus).
Map2 (Microtubule-associated protein 2) serves as a marker for neuronal dendrites and somata.
31
1st antibody
Cerebellum
Maus
Monoclonal
Polyclonal
adult
Parvalbumin 1:1000
Neurofilament 1:200
P8-10
Parvalbumin 1:1000
Neurofilament 1:200
adult
Neu N 1:400
Calbindin 1:1000
P8-10
Neu N 1:400
Calbindin 1:1000
adult
Calbindin 1:1000
GFAP 1:50
P8-10
Calbindin 1:1000
GFAP 1:50
adult
Neu N 1:400
Doublecortin 1:400
adult
Map2 1:400
Parvalbumin
adult
Neu N 1:400
Neurofilament 1.200
adult
Map2 1:400
GFAP 1/10 (1/200)
Hippocampus
1:1000
Spinal Cord
2nd antibody
Anti-mouse: Donkey-anti-mouse IgG Dylight 549 1:600
Anti-rabbit: Donkey anti-rabbit IgG Dylight 488
1:600
32
Immunohistochemistry of the vibratome sections
•
After vibratome sectioning, slices are stored in 1x PBS, pH 7.4
•
blocking: PBS / horse serum 10% / Triton X-100 0,3 % / 0.1 % Tween 20 -> 45 min. / RT /
shaker (alternative: BSA 10%)
•
1st antibody: PBS / 10% horse serum / 0,1 % Triton X-100 / 0,1% Tween 20 -> overnight /
+4°C / shaker
•
washing: PBS, 0.1 % Triton X-100, 0,1 % Tween 20 -> 3 x 10-15 min / RT / shaker
•
2nd antibody: PBS / 10% horse serum / 0,1 % Triton X-100 / 0,1% Tween 20 -> 60 - 90 min.
/ RT / shaker / dark
•
washing: 1x PBS, 0.1 % Triton X-100, 0,1 % Tween 20 -> 3 x 15 min. / RT / shaker / dark
(DAPI during last washing step in PBS (2mg/ml Stock solution, 1/5000, 5 min)
•
washing: 1x PBS, 1 x 5 min. / RT / shaker / dark
•
mounting: Aqua-Fluomount -> +4°C
33
Struktur und Klassifizierung von Antikörpern
Antikörper werden als Antwort auf die Präsenz fremder Moleküle produziert. Vor allem werden sie von
Plasmazellen produziert und zirkulieren durch Blut und Lymphe. Antigen-Antikörper Komplexe werden
durch Phagozytose durch Makrophagen entfernt. Antikörper bilden eine große Familie von
Glykoproteinen, mit gemeinsamen strukturellen und funktionellen Eigenschaften: Funktionell werden sie
durch ihre Eigenschaft definiert, gleichzeitig Antigene und spezialisierte Zellen oder Proteine des
Immunsystems zu binden. Strukturell gesehen, bestehen sie aus einer oder mehr Kopien einer Yförmigen Einheit, welche aus 4 Polypeptiden besteht: 2 „light chain„ und 2 „heavy chain„ Molekülen.
Es gibt 5 Klassen: IgG, IgM, IgA, IgE und IgD unterschieden durch die Zahl der Untereinheiten und des
Typs des „heavy chain„ Polypeptids:
IgG
IgM
IgA
IgE
IgD
Heavy Chain





Light Chain
 oder
 oder
 oder
 oder
 oder
Valenz
2
10
2, 4 oder 6
2
2
Konzentration
im Serum
Funktion
8-16 mg/ml
0,5-2 mg/ml
1-4 mg/ml
Struktur
10-400
0-0,4 mg/ml
ng/ml
Sekundäre
Primäre
Schutz der Schleimhäute Schutz
?
Immunantwort
Immunantwort
gegen
Parasiten
Der IgG-Typ ist am häufigsten (siehe Tabelle) und soll daher näher beschrieben werden: IgG Moleküle
besitzen 3 Protein-Domänen. 2 davon sind identisch und bilden die Arme des Ys. Jeder dieser Arme
enthält eine Antigen-Bindungsstelle. Die 3 Domänen können durch Proteasen-Verdau mit Papain
getrennt werden. Die beiden Antigen-bindenden Domänen heißen auch Fab Fragmente (fragment
34
having the antigen binding site) während die Domäne an der Basis in die Immun-Regulation involviert
ist als Fc-Domäne bekannt ist (fragment that crystallizes). Die heavy chains haben ein
Molekulargewicht von etwa 55.000 Dalton, die light chains ca. 25.000 Dalton. Die IgG-Moleküle werden
nach ihrere Sequenz wiederum in verschiedene Unterklassen geteilt. Bei der Maus z.B. in IgG1, IgG2a,
IgG2b und IgG3.
Die Region eines Antigens, welches durch einen Antikörper gebunden wird, ist ein „Epitop„. Diese
Epitope sind Oberflächenstrukturen aus direkt benachbarten Aminosäuren (mindestens 6) oder aus
getrennten Sequenzen, die nur im gefalteten Polypeptid beisammen liegen. Die Antigen-Antikörper
Interaktion ist nicht-kovalent und reversibel. Die Affinität ist ein Maß für die Stärke der Interaktion und
beschreibt die Menge an Antikörper-Antigen Komplexen im Equilibrium. Entscheidend für dieses
Equilibrium ist die Diffusionsrate (abhängig von Gewebe, Dicke und Einbettung) und die Affinität
(abhängig vom Antikörper).
35
Herstellung von Antikörpern: Als Antigene werden entweder gereinigte Proteine oder synthetisch
hergestellte Peptide verwendet.
Polyklonale Antikörper: Das Antigen wird in ein geeignetes Tier injiziert (Kaninchen, Maus, Ratte,
Ziege, Hamster, Meerschweinchen, Huhn). Durch wiederholte Injektionen („boost“) wird die
Immunreaktion verstärkt. Aus dem entnommenen Blut wird Serum gewonnen. Dieses Serum oder
daraus gereinigte Antikörper werden verwendet (Vor allem IgGs). Bis zu 1mg/ml (=10% der IgGs)
Antigen-spezifische Antikörper sind möglich.
Monoklonale Antikörper: Aus immunisierten Mäusen werden Antikörper-sekretierende Zellen mit
Myelomzellen fusioniert. Die entstehenden Hybridomyzellen werden als einzelne Klone gezüchtet und
die Qualität und Spezifität der monoklonalen Antikörper getestet.
Vorteile: Spezifisch, homogen und unbegrenzte Produktions-Menge.
Nachteil: Aufwendige Herstellung der Hybridomazelllinien.
36
Deckblattvorgabe für das Erstellen des Protokolls
Vorname Name
Matrikelnummer
Straße
Ort
Tel.
Fax
Email
Datum
Protokoll
zum biomedizinischen Praktikum
„Modellorganismus Maus“
Institut für Klinische Neurobiologie
21.10.13 bis 25.10.13
Betreuer:
Die Protokollabgabe ist spätestens am 20. Dezember 2013
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