E-Test

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Sterilisation, Desinfektion und
antimikrobielle Mittel
Zusammengestellt von:
Dr. Béla Kocsis
2015
AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS
HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI
VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
Einführung
Im diesem praktischen Zyklus werden wir uns mit Methoden beschäftigen,
die zur Abtötung von Bakterien dienen, seien diese in unserer Umgebung,
auf Geräten, auf der Haut-, Schleimhautoberfläche oder im Körper der
Patienten.
Ziel: Vorbeugung der Infektion oder Heilen der infizierten Person.
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Sterilisation mit trockener Luft in
einem Heißluftsterilisator
Tötet Mikroben durch Austrocknung ab
160 – 180 C° 60 Minuten
Glas- und Metallwaren können auf
diese Weise sterilisiert werden.
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Dampfsterilisation in einem Autoklav
Dampf führt zur Hydratation und
schneller Koagulation der Proteine
121 C°1 atm Überdruck 15 Minuten
Dopplewändiges, robustes Gerät
gegen Überdruck.
Nährböden, Textilien können im
Autoklav sterilisiert werden.
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Kontrolle der Effektivität
Effektivitätskontrolle der Sterilisation durch: Druckmessung, Thermometer,
hitzeempfindliche Farbstoffe oder Sporen von Bacillus stearothermophilus.
Autoklav
Indikator: blau
rosa
Strahlung (Gamma oder E-beam–
Indikator: gelb rot
ETO (Ethilenoxid–
Indikator: rot - grün
vor Sterilisation
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nach Sterilisation
Möglichkeiten der Membranfiltration
die Bakterien werden aus der Probe durch Adsorption oder Siebeffekt entfernt
die klassischen Asbest- oder Glasfilter sind veraltet
Membranfilter mit Porengröße: 0.1 - 0.8 µm, Siebeffekt
hitzelabile z.B. zuckerhaltige Lösungen können damit sterilisiert werden
Volumenbereich von einigen µl bis mehrere Liter: leicht montierbar auf eine
Spritze
für die Luftfiltration von Operationssälen, Sterilbänken werden HEPA Filter
benutzt.
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Filtersterilisation
SEITZ-Filter
NITROZELLULOSE MEMBRAN
HEPA-Filter
HIGH EFFICIENCY
PARTICULATE ADSORBANCE
LAMINAR AIR FLOW
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Desinfektion
Durch die Anwendung von Desinfektionsmitteln können Mikroben
aus unserer Umgebung, von Haut-, Schleimhautoberflächen komplett
enfernt oder in ihrer Anzahl stark reduziert werden. Dadurch können wir
die Verbreitung von pathogenen Mikroorganismen in der Umgebung
vorbeugen, oder z.B. die Häufigkeit von postoperativen Infektionen
reduzieren.
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Aufgabe der klinischen Mikrobiologie
Isolierung und Identifikation von Krankheitserregern,
und Bestimmung deren
Empfindlichkeit gegenüber antimikrobielle Mittel.
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Kvantitative
Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung
MAKRODILUTIONSVERFAHREN
Das zu testende Antibiotikum (AB) wird in jeweils 1 ml Bouillon Nährboden in Teströhren
verdünnt und jede Röhre – auch die ohne AB - mit dem zu testenden Stamm bebrütet. Nach
eintägiger Inkubation bestimmen wir die geringste Konzentration des Antibiotikums wo noch
keine Trübung zu sehen ist: das ist die minimale Hemmkonzentration (MHK). Aus jeder Röhre
machen wir eine Überimpfung auf feste Nährböden: aus den getrübten Teströhren zur
Kontrolle ob das Testbakterium angewachsen ist, aus den nicht getrübten ob sie lebende
Bakterien enthalten – MBK: minimale bakterizide Konzentration. Bei bakteriziden
Antibiotika liegen die beiden werte nahe zueinander, bei bakteriostatischen Mitteln sind sie
unterschiedlicher.
MBK
MHK
Kontroll
Antibiotikum
µg/ml
Nährboden
Aussaat
Keimzahl
KBE/ml
MHK minimale Hemmkonzentration
MBK minimale bakterizide Konzentration
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MHK Bestimmung durch Mikrodilution
Bei Mikrodilution wird das antimikrobielle Mittel in jeweil 0.1 ml Nährboden
verdünnt, braucht somit 10x weniger Material, mit Mehrspitzenpipette geht die
Verdünnung auch schneller, nach Einimpfen und Inkubation kann man das
Ergebnis mit bloßem Auge oder Plate-Reader automatisch auswerten und den
MHK-Wert bestimmen. Technisch und personalmäßig aufwendig.
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MHK-Bestimmung durch E-Test
Beim E-Test wird ein Antibiotikagradienten enthaltener Filterpaperstreifen auf
einen Bakterienrasen gelegt und nach eintägiger Inkubation entsteht ein
ellipsenförmiger Hemmhof: die an der Stelle wo dieser Hemmhof den Streifen
trifft befindlicher Zahl entspricht dem MHK-Wert. Eine elegante, genaue aber
teure Methode.
Nährboden
Papierstreifen mit
Antibiotikum
Ellipsenförmiger
Hemmhof
A fungisztatikus
fluconazol elmosódott és a
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ÉS
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fungicid amphotericin B éles határú E tesztje
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Untersuchung problematischer
Bakterien
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MRSA getestet mit Plättchentest
Penicillin-G resistent
Oxacillin resistent
Vancomycin empfindlich
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ESBL-produzierende K. pneumoniae
E-Test einer ESBL-produzierenden Klebsiella pneumoniae
TZ – Ceftazidim – TZL – Ceftazidim + Clavulansäure
D – TEST: Untersuchung der
ERYTHROMYCIN > CLINDAMYCIN
Wechselwirkung mit Double Disc Diffusion
Test.
Das erm Gen von Staphylococcus aureus
wurde von Erythromycin aktiviert und das
führt zur Resistenz gegen Clindamycin
rezisztens
a törzsKLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS
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Hodge-Test
Nachweiss von Carbanapenemase mit
Hodge-Test
und
E
ERTAPENEM (E) Behandlung von Carbapenemase
produzierenden KPC, VIM-1 (A,C) und
nichtproduzierenden (B,D) E. coli Stämmen
Burckhardt JCM.2011.49(9): 3321-3324.
44860 - 45041
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MALDI-TOF
Agardiffusionstest
Bestimmung des Serum- und Gewebespiegels von Antibiotika mit
Agardiffusionstest (Demonstration)
Durchmesser des
Hemmhofs
Ziel: personalisierte antibiotische Therapie, Vermeidung toxischer
Nebenwirkungen. Ein für das Antibiotikum empfindlicher Bakteriumstamm ins
Agar mischen in dem 5 Löcher gemacht werden. In 3 davon bekannte
Konzentrationen des Testantibiotikums in andere die zu untersuchende Probe
füllen. Nach eintägiger Inkubation Hemmhofdurchmesser der Probe mit
Standard vergleichen (siehe Kurve).
Konzentration
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Antibiotikum
Regeln der AB-Benutzung
in der Klinik
Antimikrobille Mittel werden in der Klinik therapeutisch oder profilaktisch
gegeben. Profilaktisch z.B. vor Operationen, um die Häufigkeit der
postoperativen Wundinfektionen zu reduzieren oder Rifampicingabe zur
Vorbeugung der Meningokokkusinfektion. Die therapeutische Gabe kann
empirisch erfolgen, wie Z.B in der Intensivtherapie, wo wegen einer
lebensgefährlichen Infektion sofort nach Probenentnahme mit der AB-Therapie
begonnen werden soll. Erst nach Erstellung des Antibiogramms kann eine
gezielte antibiotische Therapie angewendet werden.
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Regeln der AB-Benutzung
in der Klinik
Der Erreger muß für das ausgewählte Antibiotikum empfindlich sein; dieses
Mittel soll an der Infektionsstelle eine wirksame Konzentration erreichen;
Patienteneigenschaften – Nieren-, Leberfunktion, Schwangerschaft, allergische
Reaktionen - müssen berücksichtigt werden. Dosierung: ausreichende Dosis
über einen notwendigen Zeitraum. Wichtig ist die Beobeachtung der toxischen
Nebenwirkungen, allergischen Reaktionen, Effektivität, Zustand des Patienten.
CRP und Procalcitonin Werte helfen bei der Nachfolge der Heilung.
Auch Aspekte der Infektionskontrolle sind von Bedeutung: Nachfolge von
mikrobiologischen
Dateien
eines
Krankenhauses,
oder
einer
Abteilung;
Erscheinung resistenter Keime; Kontrolle der Hygieneverhältnisse; Möglichkeit
für regelmäßiges Händewaschen sichern.
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Das Praktikum
STERILISATION – DEMONSTRATION – SPAZIERGANG IM
INSTITUT
Steril sind Gegenstände oder Flüssigkeiten usw. von welchem
keine lebenden Mikroben (nicht einmal Sporen) nachweissbar
sind.
Zur
Erreichung
dieses
Zieles
dienen
die
Sterilisationsverfahren.
Es gibt mehrere Möglichkeiten dafür: trockene Hitze, Dampf,
Filtration usw.
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Händeschütteln
SEINE ROLLE BEI DER VERBREITUNG DER INFEKTIONEN
Sind Erreger von Mensch zu Mensch durch Händeschütteln übertragbar?
PRAKTIKUM
Zubehöre und Ausführung:
6 Studenten, 6 EMB Nährböden, 1 Tupfer und za. 2 ml flüssiges Medium
mit Escherichia coli Stamm 25922
Der Praktikumsleiter schmiert mit dem Tupfer ein wenig des E. coli
Lösunges auf die innere Handfläche eines Studenten. Diese schüttelt den
Hand des zweiten Studentes und der erste macht einen Abdruck des
Handes auf einem EMB Medium. Der zweite Student macht das gleiche
mit dem dritten usw. bis alle 6 Studenten fertig sind. Die Nährböden
werden im Thermostat übernacht kultiviert.
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Ergebnis des Händeschüttelns
Auswertung am nächsten Tag: E. coli bildet auf EMB blaue Kolonien und ist damit
leicht nachweissbar; man kann das Bakterium auf den Händen von 4 – 5 Teilnehmern
nachweisen.
Also: Erreger können mit Händeschütteln übertragen werden.
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Händewaschen
mit Seife und Desinfektionsmittel.
PRAKTIKUM FÜR ALLE
Ausführung:
-
alle Studenten bekommen einen Blutagar Nährboden
die Aussenseite mit einem Marker in drei Sektoren teilen
drei Fingerspitzen auf den ersten Sektor daraufdrücken
das wird auf dem 2. und 3. Sektor wiederholt jeweils nach
Händewaschen mit Seife und Isopropylalkohol
- Nährböden im Thermostat übernacht kultivieren
- Auswärtung am nächsten Tag
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Zubehöre zum Händewaschen
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Experiment mit normaler Hautflora
1. Vor Händewaschen
2. Nach Händewaschen mit Seife
3. Nach Händewaschen mit Desinfektionsmittel
(5 % Isopropylalkohol 3 Minuten)
Hautflora:
1. Transiente Flora aus der Umgebung
2. Standortflora der Haut in der Lipidschicht
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Auswertung des Experimentes
Im Abdruck vor Händewaschen (1) sind Mitglieder der transienten Hautflora
angezüchtet, die unterschiedliche Koloniemorphologie aufweisen. Hier können auch
enterale Krankheitserreger vorkommen. Händewaschen mit Seife entfernt diese
Bakterien, gleichzeitig wird aber die in der Lipidschicht der Haut befindlichen
Standortflora mobilisiert: die vielen Weißen Kolonien in diesem Sektor (2) sind
Staphylococcus epidermidis Stämme. Obwohl es kein invasives Bakterium ist kann
durch z.B. Kanüle in den Körper gelangen; wenn es auf den Händen von Chirurgen
vorkommt zu postoperativen Wundinfektionen führen; das kann mit
Desinfektionsmittel eliminiert werden – in diesem Sektor (3) sieht man in idealem
Fall keine Kolonien. Wenn doch, das ist entweder eine Kontamination (im Blutagar,
oder aus der Umwelt) oder die Händedesinfektion war nicht richtig durchgeführt
(z.B. wurde die Einwirkzeit nicht eingehalten).
Händewaschen mit chlorhaltigem Wasser wurde von Ignác Semmelweis in
1847 eingeführt, als Bakterien noch nicht bekannt waren. Händewaschen als
Desinfektionsverfahren ist weiterhin wichtige Komponente der Infektionskontrolle:
die Eliminierung der normalen Hautflora des Patienten und Personal ist vor
Injektionen, Blutabnahmen oder Operationen von großer Bedeutung.
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Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung
der Bakterien
AGARDIFFUSIONSTEST (KIRBY-BAUER TEST, PLÄTTCHENTEST)
PRAKTIKUM FÜR ALLE
DURCHFÜHRUNG
jeder Student kriegt einen Agar Nährboden,
das Testbakterium auf die ganze Oberfläche per Hand mit Öse ausstreichen,
mit einer Nadel 6 Antibiotikum enthaltene Filterpapierscheiben auf den Agar
legen,
im Thermostat übernacht inkubieren
Einige weiteren Studenten kriegen einen zweiten Nährboden,
Das Testbakterium mit Glastange unter maschineller Drehung ausstreichen,
die Filterpapierscheiben mit Dispenser auflegen,
im Thermostat übernacht inkubieren
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Auflegen der Plättchen per Hand
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Ausstreichen der Bakterien durch
Drehen der Agarplatte
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Auflegen der Plättchen mit Dispenser
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Auswertung
ANTIMIKROBIELLE EMPFINDLICHKEIT DES TESTBAKTERIUMS AUSWERTUNG
KVALITATIVE Antibiotika Empfindlichkeitsprüfung mit PLÄTTCHENTEST
Das klassische manuelle Ausstreichen und Auflegen der Plättchen ist aufwendig;
maschinelles Ausstreichen und Dispenserbenutzung ist schneller und genauer;
Durch Scanning wird die Auswertung kvantitativ.
Das aus den Plättchen ausdiffundierende antimikrobielle Mittel hemmt das
Testbakterium in Abhängigkeit dessen Empfindlichkeit, es bildet sich ein
Hemmhof um die Plättchen herum wenn das Bakterium empfindlich ist. Das
Verfahren soll für vergleichbare und klinisch brauchbare Ergebnisse standardisiert
werden: Durchmesser des Hemmhofes gibt den Grand der Empfindlichkeit an. Das
kann mit klassischen (Linear) und modernen Methoden (komputertechnisch nach
Scanning) gemessen werden und zu einem kvantitativen Ergebnis führen.
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