Grundlagen der virologischen Diagnostik
Werbung
Grundlagen der virologischen Diagnostik Dr. Eva Mikó Dr. Gabor Reuter 2015. AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Virologische diagnostische Methoden 1. 2. 3. 4. Methoden der Virusanzucht serologische Methoden molekularbiologische Verfahren sonstige Verfahren AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1. Methoden der Virusanzucht Viren können sich nur in lebendigen Zellen vermehren: ihre Anzucht basiert auf die Infektion von lebendigen Zellen mit Virus-enthaltendem Material Virusanzucht: das Material enthält bekannte(s) Virus/Viren Virusisolierung: das Material enthält unbekannte(s) Virus/Viren Die Virusanzucht kann sowohl für die Mitarbeiter im Labor, für die Tiere und auch für die Bevölkerung gefährlich sein. Deshalb gelten für diese Verfahren spezielle Massregeln der biologischen Sicherheit. – BioSafety (Laboratory) Level (BSL) 2,3,4 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1. Methoden der Virusanzucht Aufteilung der Anzuchtsmethoden: 1.1. Anzucht/Isolierung in Tieren 1.2. Anzucht/Isolierung in embryoniertem Ei 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen zurück zu virologischen diagnostischen Methoden AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.1 Anzucht/Isolierung in Tieren ‒ auch als in vivo Kultur bekannt ‒ dieses Verfahren wurde beinahe völlig durch andere Anzuchtsmethoden ersetzt (1.2, 1.3) ‒ das ist ein ethisch umstrittenes Feld – Tiere werden absichtlich gekränkt ‒ das Verfahren kann auch heute noch indiziert sein, wenn: – das Virus sich in Zellkulturen nicht oder schwer anzüchten lässt – Virulenz und Pathogenität des Virus unbekannt ist – das Ziel der Untersuchung das Testen der Verfügbarkeit und Effektivität der Vakzinen ist zurück zu Methoden der Virusanzucht AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.1 Anzucht/Isolierung in Tieren ‒ für die erfolgreiche Anzucht ist ein für das gefragte Virus empfängliches Tier erforderlich – meistens die natürlichen Wirte oder deren Verwandte ‒ Technik der Beimpfung: – respiratorische Viren intranasal; ZNS Viren: intrazerebral; andere Viren: intraperitoneal oder subkutan – enge Beobachtung nach der Beimpfung ‒ mögliche Zeichen der Infektion: Krämpfe, Lähmung, Koordinationsstörung, Absterben ‒ der Tod des Tieres innerhalb von 24 Stunden wird normalerweise nicht als virusinduziert betrachtet – wenn Symptome einer Virusinfektion sich melden, sollte das Tier abgetötet und präpariert werden, seine betroffenen Organe sollten für weitere Untersuchungen verarbeitet werden – eine Kontrollgruppe von Tieren ist erforderlich ‒ Zur Vergewisserung, dass die Symptome nicht aus der Reaktivierung eines endogenen Virus des beimpften Tieres resultieren – Der Beweis der erfolgreichen Beimpfung ist der Nachweis von spezifischen antiviralen Antikörpern im Blut des Tieres AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.1 Anzucht/Isolierung in Tieren Beispiele für die Praxis: ‒ Isolierung von neurotropen Flaviviren in neugeborenen Mäusen – – – – intrazerebrale Beimpfung 1-2 Tage alt, immunologisch naive Mäuse sie haben zahlreiche mitotische Zellen ihre Beobachtung benötigt große Erfahrung ‒ 2 Wochen lang ‒ signifikante Zeichen: ungewöhnliche Hautfarbe, kleine Körpermasse, ungewöhnliche Aktivität, Zittern, Seitenlegung AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.1 Anzucht/Isolierung in Tieren ‒ Isolierung von Hantaviren in Nagetieren – die meisten Ratten geben eine gute Antikörperantwort – die Apodemus Maus intrapulmonär beimpft ist die beste Methode zur Isolierung des Hantaan Virus ‒ Isolierung des Influenzavirus in Frettchen – intranasal – ausschließlich zur Herstellung von Immunsera für Forschungszwecke ‒ Coxsackie Virus – nicht jedes Enterovirus kann in Zellkulturen angezüchtet werden – Isolierung in neugeborenen Mäusen sollte aus Zellkulturen versucht werden die keine zytopathische Zeichen zeigen AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.2 Anzucht/Isolierung in embryoniertem Hühnerei Es ist immer noch eine gute Methode zur: ‒ Isolierung von bestimmten Viren ‒ Anzucht von Viren in großer Anzahl – für Vakzine Produktion: Influenzavakzine, Gelbfiebervakzine – Herstellung von Virusantigenen zurück zu Methoden der Virusanzucht AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.2 Anzucht/Isolierung in embryoniertem Hühnerei Schritte der Anzucht/Isolierung: ‒ Vorbrüten der Eier – zur Isolierung von verschiedenen Viren Eier in verschiedenen Entwicklungsphasen sind erforderlich ‒ Durchleuchtung der bebrüteten Eier – Viabilität und Luftkammer sollte getestet werden – Eier mit weißer Schale sind die besten wegen größter Transparenz AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.2 Anzucht/Isolierung in embryoniertem Hühnerei ‒ Beimpfung der Eier – verschiedene Beimpfungsstellen für unterschiedliche Virusspezien – Influenzavirus: Amnion, Allantois ‒ Inkubation (37 oC) ‒ Gewinnung der Amnion-/Allantoisflüssigkeit ‒ Virusidentifizierung – Mit serologischen Verfahren: z.B.: Haemagglutinationshemmtest – Molekularbiologische Untersuchungen: z.B.: Polymerasekettenreaktion (PCR) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.2 Anzucht/Isolierung in embryoniertem Hühnerei Schematisches Bild eines embryonierten Hühnereies. Verschiedene Beimpfungsstellen für unterschiedliche Virusspezien AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen Anwendbarkeit der Zellkulturen: ‒ die meist bewährte Methode zur Diagnose einer akuten Virusinfektion ‒ Herstellung von virologischen diagnostischen Materialien: Antigenproduktion ‒ Forschungszwecke ‒ Vakzineherstellung – Hühner–Embryo–Fibroblasten (HEF): Mumps-, Morbilli-, Frühsommer-Meningoenzephalitisvakzinen – Menschliche Lungenfibroblasten: Tollwut-, Rubeola-, VZV-, HAV-Vakzine – Nierenzellen von Grünen Meerkatzen (Vero): IPV-, H1N1- Vakzine zurück zu Methoden der Virusanzucht AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen Kryokonservierung von Zellkulturen in flüssigem Stickstoff (-195,8°C) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen Typen der Zellkulturen: ‒ Primärkultur – direkt aus einem Gewebe/Organ gewonnene Zellen: ‒ Organe von abgetöteten Tieren ‒ chirurgisch entferntes Gewebe/Organ ‒ embryonale Lunge, Plazenta von Aborten ‒ Hühnerembryogeweben – normalerweise wachsen diese Zellen adhärent und einschichtig (monolayer) – epithelialer/Fibroblast-/Mischtyp AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen Verwendung der Zellkulturen zur Virusisolierung ‒ konfluente oder semikonfluente Zellschichten sind geeignet ‒ Viren können in Monolayer auf Deckgläser von kleinen Röhrchen vermehrt werden. Nach der Inkubation wird das Deckglas fixiert und für die lichtmikroskopische Untersuchung gefärbt (shell vial culture) ‒ die beimpfte Zellkultur sollte mindestens täglich einmal mikroskopisch untersucht werden ‒ Virusvermehrung kann entweder aufgrund Zeichen von direkten zytopathologischen Effekten (CPE) oder durch indirekte Zeichen der Virusinfektion detektiert werden AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen Materialien (Nährmedium, Kulturflaschen) für die Zellkultur AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen ‒ Sekundärkulturen ‒ nach der ersten Passage der Primärkulturen ‒ diploide Zellen ‒ einige Sekundärkulturen überleben sogar 40-50 Passagen ‒ z.B.: humane embyronale Lungenfibroblastzellen (MRC5) ‒ kontinuierliche Zelllinien ‒ ‒ ‒ ‒ embryonale/erwachsene Herkunft aus gesundem/malignem Gewebe unbegrenzte Vermehrung heteroploide Zellen AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen Tägliche lichtmikroskopische Untersuchung der Zellkulturen. Virusvermehrung kann aufgrund Zeichen von direkten zytopathologischen Effekten detektiert werden AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen Zytopathologische Effekte (CPE) ‒ Morphologische Veränderungen der Zellkultur aufgrund viraler Einwirkung ‒ – – – – Zelldestruktion, Zelllyse Anschwellung der Zellen Veränderung der Refraktilität Entstehung von Riesenzellen Entstehung von Einschlusskörperchen ‒ nur in gefärbten Präparaten zu beobachten ‒ enthält virale Proteine und Zellbestandteile ‒ nukleäre/zytoplasmatische Lokalisierung, oder beide AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen Zytopathologische Effekte des humanen Herpesvirus 1 (HHV1, früher HSV1, Herpesviridae) (Destruktion, Lyse, Anschwellung der Zellen, veränderte Refraktilität) auf Nierenzellen von Grünen Meerkatzen (Vero) (rechte Seite). Die Aufnahme auf der linken Seite zeigt eine Kontroll-Zellkultur ohne Inokulation. AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen Zytopathologische Effekte des Morbillivirus (Paramyxoviridae) (Destruktion, Lyse, multinukleäre Riesenzellen, veränderte Refraktilität) auf Nierenzellen von Grünen Meerkatzen (Vero) (rechte Seite). Die Aufnahme auf der linken Seite zeigt eine Kontroll-Zellkultur ohne Inokulation. AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen Zytopathologische Effekte des Aichivirus (Picornaviridae) (Destruktion, Anschwellung der Zellen, veränderte Refraktilität) auf Nierenzellen von Grünen Meerkatzen (Vero) (rechte Seite). Die Aufnahme auf der linken Seite zeigt eine Kontroll-Zellkultur ohne Inokulation. AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen ‒ Nicht geeignet für Virusidentifizierung, viele Viren verursachen ähnliche CPE ‒ Identifizierung von Viren isoliert in Zellkulturen mit CPE: – (RT)-PCR aus den Zellen oder aus dem Nährmedium – Nachweis von Virusantigenen mit Immunfluoreszenz (IF) oder mit Immunoperoxidase Verfahren – die meist spezifische Methode ist der Virusneutralisierungstest (siehe Serologiefolien) AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 1.3 Anzucht/Isolierung in Zellkulturen Rotavirus (Reoviridae) infizierte embryonale Zellen der Rhesusaffen (MA-104) untersucht mit IF Technik. Das Zytoplasma der virusenthaltenden Zellen leuchtet olivegrün. Im Hintergrund sind nichtgefärbte Zellen zu sehen. AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 2. Serologische Methoden ugrás a Szerológiai reakciók c. fejezetre ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ Virusneutralisierung IF-basierte Methoden ELISA-Enzym-Linked Immunosorbent Assay Komplementbindungsreaktion Hämagglutinationshemmtest Western-blotting line immunoassay Immunochromatographie zurück zu virologischen diagnostischen Methoden AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 3. Molekularbiologische Verfahren ugrás a Molekuláris biológiai vizsgálatok c. fejezetre ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ ‒ Polymerasekettenreaktion (PCR) real-time PCR Southern blotting line probe assay in situ Hybridisierung Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLP) zurück zu virologischen diagnostischen Methoden AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 4. Sonstige Verfahren ‒ ‒ ‒ ‒ Elektronenmikroskopie DNA-Chip Proteinchip Massenspektrometrie zurück zu virologischen diagnostischen Methoden AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Elektronenmikroskopie Influenzavirus A/H3N2 AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Elektronenmikroskopie Ebolavirus AZ ÉLETTUDOMÁNYI- KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001
