Anti-EBV VCA IgM ELISA
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[DE] Anti-EBV VCA IgM ELISA Enzym-Immunoassay zum In-vitro-Nachweis von IgM Antikörpern gegen Virus Capsid Antigene (VCA) p23/p18 des Epstein-Barr-Virus (EBV) in Serum oder Plasma Handelsform [REF] 3 807 018 96 Tests [IVD] Komplette Testpackung Verwendungszweck Der Anti-EBV VCA IgM ELISA ist ein In Vitro Diagnostikum [IVD] zum Nachweis von IgM-Antikörpern gegen die VCA Antigene p23 und p18 von EBV. Die Anti-VCA-IgM Testergebnisse unterstützen die serologische Diagnose von EBV-Infektionen in Verbindung mit klinischen Befunden und weiteren Untersuchungen wie z. B. Anti-EA-IgG/IgM, Anti-EBNA-1-IgG oder VCA-IgG. Primäre Infektionen mit EBV können zu einer infektiösen Mononukleose (IM = Pfeiffer’sches Drüsenfieber) führen(1,2). Die Krankheit tritt vorwiegend bei Jugendlichen und jungen Erwachsenen auf. Die akute Erkrankung kann folgende Symptome aufweisen: Fieber, Pharyngitis, Tonsillitis, Lymphadenopathie, Unwohlsein, Kopfschmerzen, Myalgien, Spleno- und Hepatomegalie, Hautausschlag und Leukozytose (2). Ähnliche Symptome können auch durch andere Erreger, wie z. B. das Cytomegalievirus, Toxoplasma gondii, Rubellavirus, Hepatitisviren und HIV verursacht werden. Der Anti-EBV VCA IgM ELISA ist zur Identifizierung einer EBV Infektion geeignet. Testprinzip Der Anti-EBV VCA IgM ELISA ist ein hochempfindlicher µ-capture enzyme immuno sorbent assay (ELISA) zum Nachweis von EBV spezifischen IgM Antikörpern in Serum oder Plasma (4). IgM-Antikörper aus der Probe werden im ersten Schritt an die [MTP] gebunden. Andere Immunglobulinklassen werden durch waschen abgetrennt. In einem zweiten Inkubationsschritt werden gebundene IgM-Antikörper, die Antigen-spezifisch (Anti-VCA-p23p18) reagieren, nachgewiesen. Dies geschieht durch die Zugabe von rekombinantem (rec.) p23-p18 Fusionsantigen (4), welches mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) direkt markiert wurde. Ungebundenes Enzym-Konjugat wird durch einen weiteren Waschprozess entfernt. In einer anschließenden Enzymreaktion wird das Substrat (TMB, 3,3´5,5´-Tetramethylbenzidine) zugegeben. Diese Reaktion wird mit Schwefelsäure abgestoppt und die optische Dichte (OD) im Spektralphotometer bei 450 nm gegen eine Referenzwellenlänge von 615-690 nm gemessen. Bestandteile und Inhalte 1 Mikrotiterplatte [MTP] 12 Einzelstreifen mit jeweils 8 Näpfchen, beschichtet mit monoklonalem anti human IgM Antikörper (Konzentration > 0,5 µg/ml). 1,2 ml EBV VCA IgM Negativkontrolle (gebrauchsfertig, human) [NC] KVM: 0,005% Gentamycin, 0,05% Streptomycin, 0,05% Penicillin V. 1,2 ml EBV VCA IgM Positivkontrolle (gebrauchsfertig, human ) [PC] KVM: 0,005% Gentamycin, 0,05% Streptomycin, 0,05% Penicillin V. 45 ml Proben-Verdünnungspuffer (gebrauchsfertiger Puffer ) [DIL] KVM: 0,01% Neomycinsulfat, 0,03% Chloramphenicol [CONJ] 15 ml Antigenkonjugat mit rec. p23-p18 Fusionsprotein (gebrauchsfertig) Peroxidase markiert. KVM: 0,025% Penicillin V, 0,025% Streptomycinsulfat, 0,2% Proclin-300. 6 ml Waschlösung (500fach) [WB] KVM: 0,01% 2-Bromo-2-Nitro-1,3-Propanediol 13 ml Substrat-Lösung (gebrauchsfertig) [SUB] 3,3´,5,5´Tetramethylbenzidin (TMB)-Lösung < 0,05 % in H2O. Sicherheitshinweise beachten. [STOP] 15 ml Stopp-Lösung (gebrauchsfertig), Schwefelsäure < 1N H2SO4 1 Aufbewahrungsbeutel (Polyethylenbeutel zur Aufbewah[SB] rung der verbliebenen Mikroteststreifen). 3 Haftfolie (Selbstklebende, transparente Folie zum Abde [FOL] ken der Näpfchen bei der Inkubation.) 1 Gebrauchsinformation I Konservierungsmittel (KVM) : Gesamtkonzentration < 0,11% Erforderliche Materialien, die nicht im Kit enthalten sind: Mikropipetten, Spektralphotometer (450 nm, Referenzwellenlänge 615–690 nm), übliches ELISA-Waschgerät (mit Bodenwaschung) und Gerät zur Inkubation (37°C) der [MTP]. Sicherheitshinweise Reagenzien nicht einnehmen. Kontakt mit Augen, Haut und Schleimhaut vermeiden. Alle Proben, Kontrollen und für die Testdurchführung verwendeten Materialien müssen als potentiell infektiös angesehen werden. Die Kontrollen sind humanen Ursprungs und sind anti-HIV-1/-2, anti-HCV, HBSAG, anti-Lues und erhöhte Transaminase negativ. Nicht mit dem Mund pipettieren. Entsprechend guter Laborpraxis sind Schutzhandschuhe, Schutzbrille und Schutzkleidung zu tragen. Flüssigkeiten und nichtbrennbare Materialien sollten mit Natriumhypochlorit dekontaminiert werden (Endkonzentration: 3%, Einwirkzeit mindestens 30 Minuten). Flüssiger Abfall, der Säure enthält, muss vor der Beseitigung neutralisiert werden. Die gebrauchte [MTP] sowie alle Labormaterialien, die wiederverwendet werden sollen, müssen 1 Stunde bei 121°C autoklaviert werden. Die [SUB] ist lichtempfindlich und muss vor Licht geschützt werden. Der Test ist nur von geschultem und autorisiertem Fachpersonal durchzuführen. Auf keimarmes Arbeiten ist zu achten. Bei Beschädigung der Original Testpackung ist der Hersteller zu informieren. Haltbarkeit Die Reagenzien sind bis zum angegebenen Verfalldatum bei Lagerung zwischen 2-8°C verwendbar. Nach Öffnen sind die Komponenten 30 Tage haltbar. Zum mehrmaligen Gebrauch der Reagenzien diese unmittelbar nach Gebrauch wieder bei 2-8°C lagern. Die [MTP] ist mit einem Trockenmittel in einem Aluminiumbeutel versiegelt und vor dem Öffnen auf Raumtemperatur zu bringen. Ungebrauchte Streifen zusammen mit dem Trockenmittel in den Zip-Lock-Beutel zurückgeben und bei 2-8°C aufbewahren. Oberen Rand und Boden der Kavitäten nicht mit den Fingern berühren. Reagenzienvorbereitung Das Waschpufferkonzentrat mit entionisiertem oder destilliertem H2O verdünnen (1:501). Der angesetzte Waschpuffer ist bei Lagerung bei 2-8°C 1 Woche haltbar. Alle anderen Komponenten des Tests sind gebrauchsfertig. Alle Reagenzien sind chargenspezifisch und dürfen nicht mit denen anderer Chargen oder Tests ausgetauscht werden. Keine Reagenzien anderer Hersteller zusammen mit denen des vorliegenden Testkits verwenden. Probenmaterial Es sollten frische, nicht hämolytische Serum- oder Plasmaproben verwendet werden. Stark lipämische, ikterische oder mikrobiell kontaminierte Seren oder Plasmen sowie konzentrierte Immunglobulinpräparationen können zu unzuverlässigen Testergebnissen führen. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben ist zu vermeiden. Falls die Proben versandt werden sollen, müssen sie gemäß den gesetzlichen Bestimmungen über den Versand infektiöser Stoffe verpackt werden. Die Proben sollten nicht inaktiviert werden, da sonst unspezifische Reaktionen auftreten können. Testdurchführung Die Arbeitsvorschrift (siehe Pipettierschema) ist strikt zu befolgen. Beispiel Probenverdünnung 1:21 mit Vorverdünnung im Röhrchen: [PC], [NC] und Proben jeweils 1:21 vorverdünnen (z. B. 25 µl Kontrolle oder Probe +500 µl [DIL]). Gut mischen. Probenverdünnung 1:21 mit Verdünnung direkt in der Platte: Jeweils 200 µl [DIL] in alle Näpfchen vorlegen. Die direkte Verdünnung in der Platte ist besonders bei der Verwendung von automatischen Pipettiergeräten geeignet. Wird die Direktverdünnung von Hand pipettiert, ist zur Vermeidung von unspezifischen Proteinbindungen unbedingt darauf zu achten, dass zuerst 200 µl [DIL] in die Näpfchen vorgelegt und erst anschließend 10 µl Probe oder Kontrolle zugegeben werden. Bei der Zugabe der Probe/Kontrolle 5 bis 7 mal mischen. Pipettierschema qualitative Bestimmung (Vorverdünnung im Röhrchen) Vor Gebrauch alle Reagenzien und Proben auf Raumtemperatur bringen. Kontrollseren und Blank sollten am Schluss pipettiert werden. Nach dem Pipettieren der Kontrollen und Proben sofort mit der Inkubation beginnen. Schritt 1 Vertiefung [µl] A1/B1 C1/ D1 E1/ F1 G1... 200 [DIL] Blank [NC] Doppelansatz -- 200 [NC] -- -- [PC] Doppelansatz -- -- 200 [PC] -- Probe 1:21 -- -- -- 200 [MTP] mit Haftfolie abdecken (entfällt im Prozessor) Inkubation 60 ± 2 Min., 37 ± 1° C Prozessor*: 60 ± 2 Min., 37 ±1 °C 5x waschen (s. W1 ) [WB] 550 Schritt 2 [CONJ] 550 550 550 Vertiefung [µl] 100 100 100 100 [MTP] mit Haftfolie abdecken (entfällt im Prozessor) Inkubation 30 ± 1 Min., 37 ± 1° C Prozessor*: 30 ± 1 Min.,37± 1°C 5x waschen (s. W1) [WB] 550 Schritt 3 [SUB] Inkubation 30 ± 1 Min., bei Raumtemperatur im Dunkeln [STOP] 550 550 550 Vertiefung [µl] 100 100 100 100 Prozessor*: 15 ± 1 Min., bei Raumtemperatur im Dunkeln 100 100 100 100 Messung der Absorption bei 450 nm schnellstmöglichst oder innerhalb von 15 Min. nach Stoppen. Referenzwellenlänge: 615–690 nm. * Bei der Benutzung eines ELISA Prozessors ist die Validierung des Tests vom Anwender selbstständig und in eigener Verantwortung durchzuführen. | 187830/07 – 07/2010 Waschprozedur Die Waschprozedur ist kritisch. Unzureichendes Waschen führt zu schlechter Präzision und unspezifischen Reaktionen. W1: 5 mal mit Waschpuffer waschen. Dazu den Inhalt des Näpfchens absaugen mit 300 µl Waschpuffer dispensieren und mit mindestens 250 µl Waschpuffer befüllen (Gesamtvolumen 550µl). Diesen Vorgang 5 mal wiederholen. Nach dem Waschen die Platte kurz ausschlagen und sofort weiter bearbeiten. Die Platte nicht austrocknen lassen. Auswertung qualitative Bestimmung Nach Messung aller Extinktionen bei 450 nm (Referenzfilter: 615-690 nm) wird der Mittelwert der Blanks von den Extinktionen der Kontrollen und Proben abgezogen. Extinktionswert des Blank-Mittelwertes: ≦ 0,150 OD. Die Kontrollen müssen nach Abzug des Blank-Wertes folgende Bedingungen erfüllen: OD-Mittelwert der [NC]: ≦ 0,200; OD-Mittelwert der [PC]: ≧0,400 Berechnung des Cut-off-Wertes und der Grauzone Der Cut-off-Wert berechnet sich aus dem Mittelwert der optischen Dichte der Negativkontrolle (NK x ) plus 0,200. Cut-off-Wert = NK x + 0,200. Die Grauzone liegt im Bereich zwischen Cut-off-Wert und Cut-off-Wert - 10%. Interpretation der Ergebnisse Proben mit einer Extinktion unterhalb der Grauzone sind als negativ zu bewerten. Falls die Extinktion einer Probe größer oder gleich dem Cut-offWert ist, so ist die Probe positiv für EBV-spezifische IgM Antikörper. Liegt die Extinktion einer Probe nach erneuter Testung wieder im Grauzonenbereich, empfehlen wir die Nachtestung einer Folgeprobe (fragliches Ergebnis). Interpretation von Anti EBV VCA IgM positiven Ergebnissen Infektionstadium Seronegativ VCA IgM VCA IgG EBNA IgG Hinweise - - - 1 Frühe Phase + - - - Akute Phase + + - - Späte Phase - + - 2 Primärinfektion welche in der kürzeren Vergangenheit Bluttransfusionen oder Blutprodukte erhalten haben, können zu falsch positiven Ergebnissen führen. Der Anti-EBV VCA IgM ELISA wurde mit folgenden 45 potentiell kreuzreaktiven Proben evaluiert: Anti-Rheuma Faktoren (23), Anti-Hepatitis B Virus-positiv, akut (6), Anti-Hepatitis C Virus-positiv, akut (6), Anti-Varizella Virus-positiv, akut (3), Anti-Cytomegalievirus-positiv, akut (3) und Anti Toxoplasmose positiv, akut (4). Ein HCV positives Serum zeigte ein EBV VCA IgM positives Resultat. Leistungsdaten Die Anti-VCA IgM Testergebnisse unterstützen die serologische Diagnose von EBV-Infektionen in Verbindung mit weiteren Untersuchungen wie dem Anti-VCA IgG und Anti-EBNA IgG ELISA. Von 69 Seren von Patienten mit einer EBV primären Infektion wurden 67 (97.1%) mit dem VCA IgM ELISA als positiv bewertet (5). Von 46 seronegativen Proben waren alle Proben negativ (Spezifität 100%). Präzision Die Intraassay Variabilität des Anti-EBV VCA IgM ELISA wurde anhand von je einer negativen, schwach positiven und stark positiven Probe auf einer Mikrotestplatte in je 6 Replikaten untersucht. Folgende Variationskoeffizienten (VK) wurden respektive errechnet: 11,7%, 2,3% und 4,4%. Die Interassay Variabilität wurde anhand von je einer negativen, schwach positiven und stark positiven Proben in je 6 Replikaten in insgesamt drei Testläufen untersucht. Die VK waren respektive 7,4%, 3,5% und 4,8%. Literatur 1. Linde, A. (1992). Rev. Med. Microbiol. 3, 43-51. 2. Straus, S., Cohen, J.I., Tosato, G. and Meier, J. (1993). Ann. Int. Med. 118, 45-58. 3. DIN EN ISO 980 Graphic symbols for use in the labelling of medical devices. 4. Hinderer, W., Lang D., Rothe M., Vornhagen R., Sonneborn H-H., and Wolf H. (1999), J. of Clin. Microbiol., Vol. 37, No. 10, p3239-3244. 5. Färber, I., Hinderer, W., Rothe M., Lang D., and Wutzler, P. (2001). J. of Med. Virol. 63, 271-276. Tips zur Testdurchführung (Trouble Shooting) 1) Unerwartet hohe Rate von pos. Resultaten: Bei der Verdünnung wurden die Proben und Kontrollen vor dem [DIL] dazugegeben oder es wurde nicht ausreichend gemischt. 2) Abgelaufene Infektion Abgelaufene Infektion - Persistierendes IgM + + + 3 Reaktivierung - + + 4 Unplausibel - - + 5 Unplausibel + - + 5 + + - Nicht definiert 3) 1: In der sehr frühen Phase der Primärinfektion kann die Serologie noch negativ sein. Es wird empfohlen, für VCA IgM-Werte innerhalb der Grauzone, eine "mögliche frühe Phase der Primärinfektion" in Betracht zu ziehen und diese durch die Analyse einer Folgeprobe zu bestätigen oder auszuschließen. 2: Ausnahme: Bei immundefizienten oder immunsupprimierten Patienten kann dieses Muster durch EBNA IgG Verlust sekundär ausgebildet werden. Bei dieser Konstellation wird empfohlen, EBNA IgG Werte in der Grauzone positiv zu bewerten und eine "abgelaufene Infektion" zu befunden. 3: IgM Antikörper persisitieren in manchen Fällen länger als 6 Monate und kann dann mit schon positivem EBNA IgG zusammenfallen. Eine "späte Phase einer Primärinfektion" ist jedoch nur bei sehr schwachem EBNA (< OD 0,500) zu befunden. Ansonsten lautet der Befund "abgelaufene Infektion". 4: Eine Reaktivierung kann nicht mit der VCA-Serologie definiert werden. Eine Hilfestellung kann die Quantifizierung von VCA IgG bieten. Werte, die weit über den Normalbereich hinausgehen (> 2500 RU/ml) sind verdächtig. Der klassische Marker für die serologische Definition der EBV-Reaktivierung sind IgG-Antikörper gegen Early Antigen (EA) (z.B. Anti-EBV EA IgG ELISA, Art. Nr. 807016). Das Anti-EA IgG sollte bei einem Verdacht auf EBVReaktivierung zusätzlich bestimmt werden. 5: Die unplausiblen Reaktionsmuster sind extrem unwahrscheinliche Konstellationen, die in klinischen Studien nicht gefunden wurden. Werte in der Grauzone von VCA IgG sollten positiv bewertet werden. Die Interpretation ist in diesen Fällen "abgelaufene Infektion". Für VCA IgG unterhalb der Grauzone sollte die EBV Serologie komplett wiederholt werden um Testfehler auszuschließen. Sollten sich die unplausiblen Ergebnisse erneut bestätigen, wird empfohlen eine neue Probe anzufordern. Bei wiederholter Bestätigung muß "abgelaufene Infektion" befundet werden. 4) 5) Blank-Werte über Sollwert ≧ 0,150 OD: a) [SUB] hatte sich durch Oxidation/Kontamination bereits blau verfärbt. b) Waschfehler: Pro Waschschritt 5x waschen, bei Verwendung von Handwaschgeräten 7x waschen; Nur Bio-Rad-[WB] verwenden. c) Inkubationsfehler: Temperatur zu hoch, Inkubationszeit überschritten oder Platten wurden nach dem Einpipettieren der Proben nicht sofort inkubiert. d) Falsche Wellenlänge: Bei Messung ohne Referenzfilter liegen alle Werte ca. 0,120 OD höher. Gelbfärbung in allen Näpfen: (siehe 2a, 2b) a) [WB] Kontaminiert; [WB] neu ansetzen b) [DIL] oder [CONJ] kontaminiert; Wiederholen des Tests mit Reagenzien aus ungeöffneten Flaschen. Reagenzien unter möglichst keimarmen Bedingungen entnehmen. [PC] unter Sollwert ≦ 0,400 OD: a) Verfallsdatum der Kits überschritten. b) Temperatur zu niedrig oder Inkubationszeit unterschritten. c) Waschfehler: Zu starkes Waschen oder mechanischer Kontakt des Waschkamms mit dem Boden der Näpfe. d) [PC] kontaminiert oder 3b. [NC] über Sollwert ≧ 0,200 OD: (siehe 1, und 2 a-d) a) [NC] wurde nicht nach den Proben pipettiert; Erst alle Proben, dann Kontrollseren und Blank pipettieren. b) Kontamination durch die Verschlusskappe der [PC]. Grenzen des Verfahrens Ein negatives Ergebnis im Anti-EBV VCA IgM schließt nicht mit absoluter Sicherheit eine EBV-Infektion aus. Das Testergebnis sollte immer mit den klinischen Patientendaten oder anderen diagnostischen Methoden in Verbindung gebracht werden. Die Testergebnisse von Proben immunsupprimierter Patienten können schwierig zu interpretieren sein. Proben von Personen, MBio-Rad Medical Diagnostics GmbH Industriestr. 1, D-63303 Dreieich, Germany Tel.: +49-6103-801-95, Fax: +49-6103-801-724 www.bio-rad.com, [email protected] | 187830/07 – 07/2010
