legionella-mycoplasma-diagnostik

Diagnostik
respiratorischer
Infektionen durch
Legionella spp. und
Mycoplasma pneumoniae
mittels molekularer
Techniken
Christian Lück, Enno Jacobs, TU Dresden
Teilprojekt B3
Teilprojekt B3: Ziele
¾Entwicklung und Evaluierung von Nachweisverfahren für
¾ Legionella Spezies
¾ Mycoplasma pneumoniae
¾ mittels molekularer Techniken (quantitative PCR) und
¾Nachweis von Antikörpern gegen Legionella spp. und
Mycoplasma pneumoniae
¾Einsatz dieser neuen molekularen Diagnostikverfahren in
retro- und prospektiven Studien
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Diagnostische Verfahren zum
Nachweis einer Legionella Infektion
¾
PCR im respiratorischen Material
¾ TaqMan-PCR: Primer/ Sonde Legionella-spezifisch (16S-rRNA Gen)
Nachweisgrenze: 10-20 DNA-Kopien/Ansatz
¾ In-house nested-PCR: Primer Legionella-spezifisch (16S-rRNA
Gen) Nachweisgrenze: 5-10 DNA-Kopien/Ansatz, Bestätigung durch
Sequenzierung
¾ PCR im Serum / Urin
¾ TaqMan-PCR
¾ Antigennachweis im Urin
¾ ELISA (Firma Biotest) Legionella pneumophila (Serogruppe 1)
¾ Antikörpernachweis im Serum
¾ Indirekter Immunfluoreszenztest
- L. pneumophila Serogruppen 1 – 15
- L. micdadei, L. bozemanii, L. dumoffii,L. jordanis, L. longbeachae
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Falldefinition für
Legionella Infektionen
¾ Bestätigte Infektion
¾ Erregerisolierung aus BAL, Trachealsekret, Sputum,
Lungengewebe, Pleuraflüssigkeit
¾ PCR in klinischen Proben
¾ L.-pneumophila-Antigen-Nachweis im Urin
¾ Verdacht auf Infektion
¾ Legionella-Antikörpernachweis
gegen
monovalente
Antigene mittels validiertem IFT
¾ Kein Hinweis auf Infektion
¾ Fehlende
Antikörper
und
/oder
negativer
DNA
Nachweis oder Antigennachweis
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Legionella Diagnostik bei
2656 Erwachsenen mit Pneumonie
Parameter
Anzahl der getesteten
Patienten
Positiv
PCR respiratorischen
Proben
904
68 (2,6%)
Antigen im Urin
2232
49 (2,2%)
Serum Antikörper im
IFAT
2495
34 (1,4%)
Bestätigte Infektion
2656
112 (4,2%)
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Verteilung der Spezies bei
112 bestätigten LegionellaPneumonien
L. pneumophila
(Urin-Antigen)
17
6
44
45
L. pneumophila resp
PCR+Seq
L. non-pneumophila
Resp PCR+Seq
Legionella ( Spezies
nicht best)
L. non-pneumophila:
2x L. anisa, 2x L. bozemanii, 1x L. longbeachae, 1x L. erythra
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Wertigkeit der Legionella
Diagnostik bei 112 bestätigten
Legionella-Pneumonien
Parameter
Anzahl der
Proben
Auswertbarer
Test
Positiv
PCR resp.
Proben
77
77
68 (88%)
PCR Serum
56
55 (1x inhibiert)
43 (77%)
PCR Urin
65
65
8 (12%)
Antigen im Urin 106
106
49 (46%)
Serum
Antikörper
104
2* (2%)
104
*1x Titer 128 gegen L. pneumophila Serogruppe 1
1x Titer 128 gegen L bozemanii
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Wertigkeit der Legionella
Diagnostik bei 112 bestätigten
Legionella-Pneumonien
100%
9
90%
13
80%
negativ
57positiv
70%
60%
57
102
50%
68
40%
43
30%
49
20%
10%
8
2
0%
PCR resp.
Proben
Hannover, 26.09.2005
PCR Serum
PCR Urin
Antigen im
Urin
Serum
Antikörper
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Positivität der Legionella PCR in
verschiedenen respiratorischen
Materialien
100%
90%
80%
negativ
70%
positiv
60%
55
50%
669
103
50
14
Sputum
andere
40%
30%
20%
10%
13
0%
BAL
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Schlussfolgerungen
Legionella Diagnostik I
¾ Legionella-Spezies sind bei 4,2% (112 von 2656) der
ambulant erworbener Pneumonien Ursache
¾ 80% der Infektionen waren durch Legionella pneumophila
bedingt, 5% durch andere Legionella Spezies
¾ Der Nachweis spezifischer DNA in respiratorischen Proben
und im Serum besitzt eine gute Sensitivität
¾ Die Empfindlichkeit der PCR im Urin ist nur gering
¾ Der Nachweis spezifischer DNA in respiratorischen Proben
war in BAL höher als im Sputum
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Schlussfolgerungen
Legionella Diagnostik II
¾ Mit dem Urin ausgeschiedenes Legionella- Antigen konnte
nur bei 48% der als Legionella Pneumonie bestätigten
Patienten gefunden werden
¾ Ursache „leichte Infektionen“ ??
¾ 34 Patienten Antikörper in Serum
¾ Nur bei zwei dieser Patienten konnte die Infektion durch
einen weiteren Test bestätigt werden
¾ Der Nachweis spezifischer Antikörper im Serum besitzt in
der akuten Krankheitsphase keine diagnostische Relevanz
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Diagnostische Verfahren zum
Nachweis einer Mycoplasma
pneumoniae Infektion
¾
TaqMan-PCR:
Gen für P1-Adhäsin
Primer/ Sonde Mycoplasma pneumoniae-spezifisch
Nachweisgrenze: 5-10 DNA-Kopien/Ansatz
¾
Antikörpernachweis im Serum
¾ Suchtest IgM/ IgA ELISA
¾ Wenn im ELISA positiv, Bestätigung im Immunoblot
¾ Positiv, bei Vorhandensein von Antikörpern gegen P1
(160 kDa Adhäsin) im Immunoblot
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Falldefinition für
Mycoplasma pneumoniae
Infektion
¾Bestätigte Infektion durch M. pneumoniae
¾ Nachweis von spezifischer DNA (PCR) und/oder
¾ Nachweis
von
spezifischen
IgM-Antikörpern
im
Westernblot (P1 = 160 kDa Ahhäsin)
¾Verdacht auf Infektion durch M. pneumoniae
¾ Nachweis
von
spezifischen
IgA-Antikörpern
im
Westernblot (P1 = 160 kDa Ahhäsin)
¾Kein Hinweis auf Infektion durch M. pneumoniae
¾ Fehlende
Antikörper
und
/oder
negativer
DNA
Nachweis
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Sensitivität und Spezifität des
Antikörpernachweises bei
M. pneumoniae Infektionen
Wert IgM Blot
IgM Blot positiv
IgM Blot negativ
IgM Blot alle
PCR positiv PCR negativ
6
4
18
532
24
536
PCR alle
10
550
560
Sensitivität
Spezifität
pos VW
neg VW
0,25
0,99
0,6
0,97
Wert IgA Blot
IgA Blot positiv
IgA Blot negativ
IgA Blot alle
PCR positiv PCR negativ
12
78
12
458
24
536
PCR alle
90
470
560
Sensitivität
Spezifität
pos VW
neg VW
0,50
0,85
0,13
0,97
Der Einsatz von IgA und IgM- Antikörperbestimmungen erhöht
diagnostische Aussage (Spezifität) nicht
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Prävalenz von
M. pneumoniae Infektionen
100%
¾Prävalenz von IgA-
90%
80%
Antikörpern im Westenblot bei
IgA neg
IgA po s
70%
Patienten/ Blutspendern
60%
(n=200) ohne respiratorische
50%
Symptome aus dem Jahr 2003
40%
¾8,5%
30%
20%
10%
10
54
18
31
1
2
18-29
30-39
0%
28
2
2
40-49
50-59
Hannover, 26.09.2005
42
7
60-69
183
3
17
70-100
alle
¾keine IgM-Antikörper
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
M. pneumoniae Diagnostik bei
1668 erwachsenen PneumoniePatienten
Parameter
Anzahl der
Proben
PCR resp.
Proben
626
Auswertbarer
Test
Positiv
620
(6x inhibiert)
PCR Serum
18 (PCR im resp. 18
Material positiv)
PCR Urin
22 (PCR im resp. 22
Material positiv)
Serum IgA-Blot 1599
1599
Serum IgM-Blot 1599
Serum IgA/IgM
1599
Bestätigte
Infektion
1662
Hannover, 26.09.2005
34 (5,5%)
0
0
1596
(3x nicht auswertb)
1596
272
(17,0%)
33 (2,1%)
279
(17,5%)
61 (3,7%)
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Jahresverteilung der bestätigten
M. pneumoniae Infektionen
Untersuchung von 1668 Patienten
620 PCR-getesteten Patienten
32%
32%
Mp
Mp
Mp
Mp
30%
28%
26%
24%
no
IgA pos
IgM pos
conf
28%
24%
22%
20%
20%
18%
16%
14%
12%
2
112
114
241
8%
15
78
37
10%
37
6%
Hannover, 26.09.2005
14
2%
all 2003
0%
4
5
34
2002-2004
34
4%
all 2002
all 2002
0%
27
14
5
2002-2004
11
14
2%
4
0
all 2004
15
all 2004
4%
12%
8%
all 2003
6%
0
18%
15
14%
10%
4
26%
22%
16%
Mp no
Mp IgA pos
Mp IgM pos
Mp conf
30%
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Verteilung nach LCC von
M. pneumoniae Infektionen
100%
90%
80%
Mp k ein A
Mp Verd
70%
Mp bes t
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Altersabhängige Prävalenz von
M. pneumoniae Infektionen
40%
400
350
35%
Mp no
Mp IgA pos
300
Mp no
Mp IgA pos
30%
Mp IgM pos
Mp IgM pos
Mp confirmed
250
Mp confirmed
25%
200
20%
150
15%
11
18
33
9
10%
100
7
30
45
50
5%
0
0%
18-29
30-39
40-49
50-59 60-69
70-79
>80
6
16
54
50
2
1
0
>80
4
9
3
1
2
1
18-29 30-39 40-49 50-59 60-69 70-79
¾Mp confirmed = PCR+IgM-Blot, Wertigkeit des IgA Nachweises ??
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
M. pneumoniae Infektionen
Parameter
Mp bestätigt
PCR
PCR+IgM
n=34
n=61
Mp Verdacht
n=268
Mp kein Hinweis
n=1357
Altersdurchschnitt
37
38,6
60,5
62,7
CRP
112,2
104
127,9
143,3
Leukozyten
9,62
10,2
12,4
13,1
Ambulante
Behandlung
47%
50%
27,6%
27,1%
männlich
41%
36%
61,9%
55,6%
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Ätiologie CAP in CAPNETZ
Bestätigte Legionella Infektion:
112/2656 (4,2%)
Bestätigte Mycoplasma pneumoniae Infektion:
61/1662 (3,7%)
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Ätiologie CAP in CAPNETZ
Bestätigte Legionella Infektion: 112/2656 (4,2%)
• Legionella-PCR (resp. Material): 68/904 (2,6%)
• L. pneumophila Sg1 Ag Urin: 49/2232 (2,2%)
• Legionella Antikörper: 34/2495 (1,4%)
Bestätigte Mycoplasma pneumoniae Infektion: 61/1662 (3,7%)
• M. pneumoniae PCR: 34/620 (5,5%)
• M. pneumoniae IgA positiv:272/1599 (17%)
• M. pneumoniae IgM positiv:33/1596 (2,1%)
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
DANKE
Caroline Dix
Jutta Paasche
Kerstin Seeliger
Silke Rachlitz
Kerstin Riedel
Dr. Markus Schuppler
Hannover, 26.09.2005
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Prospective studies in patients with
CAP admitted to hospital
Organism
No. of No. of
Studies cases
Streptococcus pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae
Chlamydia pneumoniae
Gram-negative bacilli
Haemophilus influenzae
Legionella pneumophila
Staphylococcus aureus
Chlamydia psittaci
Coxiella burnetii
Influenza A
Parainfluenza
Influenza B
Respiratory syncytial virus
Adenovirus
9
7
1
9
8
5
9
6
7
8
7
6
6
7
Hannover, 26.09.2005
1,844
1,446
301
1,844
1,575
1,171
1,844
1,056
1,357
1,532
1,405
1,061
1,366
1,231
Relative frequenzy
(mean value; in%)
29
9
6
6
5
4
4
2
1
8
2
1
1
0,7
Range
(%)
8,6-76
0-18
0,8-21
0-12
1-15
1- 9
0- 6
0,8- 3
5-15
0-12
0,8- 4
0,6- 2
0,2- 3
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de
Prospective studies in patients with
CAP admitted to hospital
Organism
No. of No. of
Studies cases
Streptococcus pneumoniae
Mycoplasma pneumoniae
Chlamydia pneumoniae
Gram-negative bacilli
Haemophilus influenzae
Legionella pneumophila
Staphylococcus aureus
Chlamydia psittaci
Coxiella burnetii
Influenza A
Parainfluenza
Influenza B
Respiratory syncytial virus
Adenovirus
9
7
1
9
8
5
9
6
7
8
7
6
6
7
Hannover, 26.09.2005
1,844
1,446
301
1,844
1,575
1,171
1,844
1,056
1,357
1,532
1,405
1,061
1,366
1,231
Relative frequenzy
(mean value; in%)
29
9
6
6
5
4
4
2
1
8
2
1
1
0,7
Range
(%)
8,6-76
0-18
0,8-21
0-12
1-15
1- 9
0- 6
0,8- 3
5-15
0-12
0,8- 4
0,6- 2
0,2- 3
http://www.capnetz.de
http://www.capnetz.de