A. Fisseler-Eckhoff, HELIOS HSK
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Institut für Pathologie und Zytologie Helios Dr. Horst-Schmidt Kliniken (HSK) Koop. Gemeinschaftspraxis für Pathologie 65199 Wiesbaden [email protected] Molekulare Pathologie – Bedeutung für die Therapie Prof. Dr. med. A. Fisseler-Eckhoff Molekulare Pathologie – Chancen und Risiken • Genomische Profiling hat Verständnis hämatologischer Erkrankungen und solider Tumoren in den letzten Jahren revolutioniert. • Unbekannte Subgruppen konnten identifiziert und funktionell relevante „Driver-Alterationen“ aufgedeckt werden, • Neuartige patientenindividualisierte und zielgerichtete Therapien wurden entwickelt, die auf molekularpathologischen Befunden beruhen und teilweise zu beeindruckenden Therapieerfolgen geführt haben. Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 1 Beispiel Hämatologie • In der WHO 2008 wurde erstmalig bei hämatologischen Neoplasien (Leukämien und Lymphomen) das integrative Konzept einer morphologischen und molekulargenetischen Diagnostik in die Praxis umgesetzt. • Beispiel: CML wird durch Genfusion (BCR-ABL) pathogenetisch herbeigeführt, Blockierung der pathologischen ABL-Kinase durch TKI Imatinib stellt hocheffektive Therapie für diesen Krebstyp dar. Das Beispiel BCR-ABL-positiven Neoplasien zeigt paradigmatisch auf, dass das molekular-pathologische Ergebnis für die Therapie von entscheidender Bedeutung ist. Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 2 Klassifikation hämatologischer Neoplasien umfasst heute: Zytologie, Histologie, Immunhistochemischer Nachweis von Oberflächenantigenen, Zytogenetik und Nachweis ausgewählter molekulargenetischer Alterationen 3 Konzept der genetischen Vulnerabilität Molekular gerichtete Therapien sind kausal entlang des Pathomechanismus ausgerichtet, sie erweisen sich hinsichtlich •Effektivität •des therapeutischen Fensters und •des Nebenwirkungsprofils •in der Regel als sehr viel besser gegenüber der konventionellen nichtselektiven, toxischen Chemotherapie. •Pathologische Diagnostik heute Stufendiagnostik Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 4 Pathologie heute – Stufendiagnostik bestehend aus : Histologie, Immunhistologie und Molekularpathologie • Somatische Mutationen • Keimbahnmutationen Sanger-SQ ctDNA Pyro-SQ NGS 5 Molekularpathologie – Bedeutung für die Therapie • Tumorklassifikation • Molekulares Staging • Prognose und adjuvante Therapie • Prädiktion • Monitoring und Liquid Biopsy • Fazit Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 6 Neuropathologie – Klassifikation der Gliome anhand des molekularen Profils • Gliomen ~50% aller Neoplasien im zentralen Nervensystem • Klassifikation anhand der molekularen Expressionsprofile • inzwischen 5 klinisch relevante Marker identifiziert: • 1p19q-Co-Deletion • MGMT-Promotor-Methylierung • IDH1/2-Mutationsstatus • TERT-Mutationsstatus • H3F3A-Mutationsstatus Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 7 Neuropathologie – Klassifikation der Gliome anhand des molekularen Profils • 1p19q-Co-Deletion: • Untersuchung des Verlusts chromosomalen Materials auf dem kurzen Arm von Chromosom 1 (1p) und dem langen Arm von Chromosom 19 (19q) als Biomarker in oligodendroglialen Tumoren • 2/3 aller oligodendroglialen Tumore zeigen einen kombinierten Verlust der Allele (loss of heterozygosity, LOH) auf dem kurzen Arm von Chromosom 1 (1p) und dem langen Arm von Chromosom 19 (19q) • Anaplastische Oligodendrogliome bei denen solch ein kombinierter 1p/19q-Verlust vorliegt sprechen besser auf eine Chemotherapie an Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 8 Neuropathologie – Klassifikation der Gliome anhand des molekularen Profils • IDH1/2 Mutationsstatus (Sangersequenzierung) • • • • Isocitratdehydrogenase (IDH)-Gen Punktmutationen im IDH1-Gen (Arg132) und seltener im IDH2-Gen (Arg172) treten bei >70% der primären astrozytären, oligodendroglialen und oligoastrozytären Tumore sowie sekundären Glioblastome (GBM) auf Bei der Differentialdiagnose von niedriggradigen Gliomen hilfreich TERT Mutationsstatus (Sangersequenzierung) • Arbeitsgruppe von Felix Sahm entdeckte die erste Mutation im Erbgut der Meningeome • Mutationsstatus beeinflusst weiteren Verlauf der Erkrankung • Das Gen TERT (Telomerase reverse Transkriptase) enthält den Bauplan für ein Protein, das, überaktiviert, die Lebensdauer der Krebszellen extrem verlängert • Patienten mit einer solchen Mutation kann es nach der Operation innerhalb eines Jahres zu erneutem Tumorwachstum kommen • Bei unverändertem TERT-Gen liegt die tumorfreie Zeit bei durchschnittlich knapp 15 Jahren • Beschreibt eine neue Untergruppe von Patienten, die dringend bestrahlt werden muss und für die wir zusätzliche neue Therapien brauchen Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 9 Neuropathologie – Klassifikation der Gliome anhand des molekularen Profils • H3F3A-Mutationsstatus (Sangersequenzeriung) • Punktmutationen innerhalb des H3F3A-Gens (K27, G34) kodiert die Histon 3.3 Variante • Überwiegend bei Glioblastomen des Kindes- oder jungen Erwachsenenalters • Punktmutationen im Kodon 27 finden sich praktisch ausschließlich bei Glioblastomen, die in der Mittellinie liegen • Eine Wildtypsequenz im Kodon 27 und Punktmutationen im Kodon 34 können mit einer besseren Prognose bei Glioblastomen korrelieren Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 10 Neuropathologie – Klassifikation der Gliome anhand des molekularen Profils • MGMT-Promotormethylíerung • • • O6-Methylguanin-DNS-Methyltransferase (MGMT)-Gen codiert für ein gleichnamiges DNS-Reparaturprotein, welches Alkylgruppen von der Position O6 des Guanins der DNS entfernt Die Wirkung einiger Chemotherapeutika (wie z.B. Temozolomid) beruht auf Anfügen von Alkylgruppen an diese Position O6 Zytotoxität und Apoptose der Tumorzellen sind die Folge Eine erhöhte MGMT-Expression und somit erhöhte DNS-Reparaturaktivität könnte demnach der Wirkung alkylierender Chemotherapeutika entgegenwirken Nicht methyliert methyliert Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 11 Diagnostische Marker bei Gliomen Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 12 Molekulare Gruppen diffuser astrozytärer und oligodrendroglialer Gliome des Erwachsenen Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 13 Molekular stratifizierte Behandlungsstrategien bei diffusen Gliomen TM: Temozolamid Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 14 Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 15 Molekularpathologie – Bedeutung für die Therapie • Tumorklassifikation • Molekulares Staging • Prognose und adjuvante Therapie • Prädiktion • Monitoring und Liquid Biopsy • Fazit Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 16 Molekulares Staging bei Patienten mit multiplen Tumoren in verschiedenen Organen Therapeutisch relevante Frage: -Systemisch metastasiertes Tumorleiden ? -Multiple syn – oder metachrone kleine Primärtumoren ? -Therapeutisch unterschiedliche Konzepte : -2 kleine Karzinome pT1a – kurative Therapie durch Operation ? -Metastasen - Systemtherapie ? Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 17 Molekulares Staging Beispiel :Patient mit Tumormanifestation in S1 und S3 ein und Zt nach gastrointestinalem Karzinom in der Vorgeschichte EGFR Analyse Tu S1 : Wildtyp K-RAS AnalyseTu S1 : Mutation pG12V Codon 12 und 13 des Exons 2 EGFR Analyse Tu S3 : Wildtyp K-RAS Analyse Tu S3: Wildtyp 2 Tumoren unterschiedl.klonalen Ursprungs pTNM Tu S1: pT1a N3 (3/37),L1,V0,local R0,G1 fokal G2 - Differenzierung auch durch molekulare Bestimmung weniger polymorph mutierter Gene möglich wie : TP53 RAS PTEN PIK3CA pTNM Tu S3: pT1a,N0 (0/37),L0,V0,local R0, G2 18 Molekularpathologie – Bedeutung für die Therapie • Tumorklassifikation • Molekulares Staging • Prognose und adjuvante Therapie • Prädiktion • Monitoring und Liquid Biopsy • Fazit Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 19 Molekulare Diagnostik NSCLC SQC: 43.2% ADC: 54% 20 WHO Klassifikation von Lungenkarzinomen 2015: Traditionelle Einteilung von NSCLC und kleinzelligen Tumoren anhand der Morphologie verlassen Tumoren werden über onkogene Treiberläsionen molekular differenziert und in Adenokarzinome und Plattenepithelkarzinome klassifiziert. Histologische NOS Karzinome werden anhand der molekularen Signatur in Adenokarzinome, Plattenepithelkarzinome und großzellig neuroendokrine Karzinome eingeteilt. Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 21 Thoraxpathologie Molekularpathologie: Lunge 2015 2016 22 22 Molekulare Pathologie – Prognose und adjuvante Therapien NSCLC - Lungenkarzinome NSCLC- Adenokarzinom • EGFR-Analyse (Pyrosequenzierung) • 10-15% weisen eine Mutation in Exon 18, 19, 20 oder 21 auf • ALK-Analyse (FISH) • Gen liegt auf Chromon 2p23 • 2-4% weisen eine Mutation auf • ROS1-Analyse (FISH) • Gen liegt auf Chromosm 6q22 • ≤1% weisen eine Mutation auf Cao et al. 2015, DovePress 23 Thoraxpathologie Molekularpathologie: Lunge Entwicklung: Personalisierte Medizin EMA/FDA genehmigt: Gefitinib in 2009 (EGFR tyrosine kinase inhibitor), Erlotinib in 2011 (EGFR tyrosine kinase inhibitor), Crizotinib in 2012 (ALK/ROS1/cMET inhibitor) 2015 genehmigt als 2nd line therapy Afatinib in 2013 (EGFR tyrosine kinase inhibitor), 2016 genehmigt als Therapie des metast. SQCs nach Chemotherapie 24 24 Thoraxpathologie Molekularpathologie: Lunge Entwicklung: Personalisierte Medizin EMA/FDA genehmigt: •Alectinib in 2015 Ceritinib in 2015 (ALK/IGF inhibitor) Nivolumab in 2015 (PD1-Receptor inhibitor) • 2016 zugelassen für die Therapie des metast. SQCs/Non-SQCs •Osimertinib in 2016 (EGFR T790M inhibitor) •Ramucirumab (in Komb. mit Docetaxel) in 2016 ( VEGFR2 inhibitor) (Phase III-Studie REVEL) •Necitumab in 2016 (EGFR inhibitor) 25 25 Thoraxpathologie Molekularpathologie: Lunge Zulassung Necitumumab Plattenepitelkarzinom d. Lunge Anmerkung: ca 90% der Plattenepithelkarzinome zeigen immunhistochemisch eine EGFR Expression Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 26 Molekularpathologie – Bedeutung für die Therapie • Tumorklassifikation • Molekulares Staging • Prognose und adjuvante Therapie • Prädiktion • Monitoring und Liquid Biopsy • Fazit Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 27 15 Mikrosatelliten-Instabilität DNAReplikation Mikrosatellit: Repetetive Sequenz (1-5 Basenpaare, 15-30 mal) MLH1 MSH2 MSH6 PSM2 DNA-MissmatchReparaturproteine 28 16 Mikrosatelliten-Instabilität Analyse Tumor DNA Nicht-Tumor DNA PCR Gelelektrophorese Mikrosatelliten (BAT25, BAT26, D5S346, D2S123, D17S250) Dissektion von Karzinomzellen N Instabil T Stabil Instabilität Interpretation Kein Marker Keine Mikrosatelliten-Instabilität (MSS. 0/5) 1 Marker Geringgradige Mikrosatelliten-Instabilität (MSI-L, 1/5) ≥ 2 Marker Hochgradige Mikrosatelliten-Instabilität (MSI-H, 2/5) 29 12 Kolorektales Karzinom Histologie Tubuläres Muzinöses Adenokarzinom Siegelring-zelliges 30 Mismatchreparatur Proteine MSH2 MSH6 MLH1 PMS2 31 Molekulare Graduierung (MSI Status) Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 32 Gastroenteropathologie Molekularpathologie: Kolorektalkarzinom 33 Pathologie Wiesbaden Mikrosatelliten-instabile Karzinome sporadisch hereditär BRAF Hypermethylierung HNPCC (MSI-H) 34 Pathologie Wiesbaden Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 35 Kolonkarzinom 14 Histopathologische Befunde bei Mikrosatelliten-Instabilität Merkmal Lokalisation Hochgradige Keine Mikrosatelliten- MikrosatellitenInstabilität Instabilität proximal Muzinöser Anteil 22 % 5-7 % Wenig differenziert (G3) 34-57 % 13 % 60-70% 3% Zahlreiche Tumorinfiltrierende Lymphozyten (TIL) Kolonkarzinom mit hochgradiger MSI 36 B06.5381 18 Mikrosatelliten-Instabilität bei kolorektalem Karzinom Klinische Bedeutung Resistenz gegen adjuvante Chemotherapie mit 5-Fluorouracil (5-FU) Hochgradige MikrosatellitenInstabilität 15-20% der kolorektalen Karzinome, davon 10-15% sporadische Bessere Prognose Lynch-Syndrom Mechanismen: - MLH1-Verlust durch Promoterhypermethylation - Mutation von DNA-Missmatchreparaturgenen (hMLH1, hMSH2, hMSH6, hPMS2) 37 Checkpoint-Inhibitoren - zugelassen oder Zulassung erwartet Wirkprinzip Beispiel Ziel Beispiele Blockade inhibitorischer Rezeptoren auf T-Zellen („Bremse“) Ipilimumab (Yervyo®) CTLA 4 Melanom, Phase III Tremelimumab (CP-675,206) CTLA 4 Mesotheliom, Phase II Nivolumab (Opdivo®) PD-1 Melanom, Phase III; NSCLC, Phase III Pembrolizumab (Keytruda®) PD-1 Melanom, Phase III; NSCLC, Phase I Pidilizumab (CT-011) PD-1 Non Hodgkin-Lymphome, Phase II Atezolizumab (MPDL3280A) PD-L1 Blasen-Ca, Phase II Durvalumab (MEDI4736) PD-L1 NSCLC und Kopf-Hals-Tumoren, Phase II Avelumab (MSB0010718C) PD-L1 Ovarial-Ca, Phase Ib; Merkelzell-Ca (FDA 2015) Blockade der Liganden auf Zielzellen („Bremsfuß“) 38 Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 39 Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 40 Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 41 Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 42 Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 43 27 Prädiktive Faktoren einer EGFR-gerichteten Therapie bei kolorektalem Karzinom Faktor Nachweismethode IHC Häufigkeit Bis 80% Prädiktiver Wert# Nein 1 EGFR-Genamplifikation FISH 25-40% Ja 2 KRAS-Mutation PCR 30-54% Ja 3 BRAF-Mutation PCR 5-12 % Ja 4 EGFR-Proteinexpression # Behandlung mit Anti-EGFR-Antikörpern (Cetuximab, Panitumumab) Cunningham D et al. 2004, Chung KY et al. 2005; 2 Sartore-Bianchi A et al. 2007; 3 Amado RG et al. 2008, Karapetis CS et al. 2008, De Roock W et al. 2010; 4 De Roock W et al. 2010 1 44 Prädiktive Faktoren einer EGFR-gerichteten Therapie bei kolorektalem Karzinom • Mutationsstatus des KRAS-bzw NRAS-Gen (jeweils Exon 2,3 &4) • Behandlung des metastasierten Kolorektalkarzinoms mit dem Antikörper Cetuximab (Erbitux) und Panimutumab (Vectibix) • Ca. 60% mit mCRC sind Wildtyp und profitieren von einer Antikörpertherapie • Analyse kann am Primarius, Metastase oder Rezidiv erfolgen KRAS WT p.G12D Mutation 45 Gastroenteropathologie molekulare Diagnostik : GIST und IPMN • Gastrointestinale Stromatumoren Mutationsanalyse des CD 117 (Kit)-Rezeptor-Gens und PDGFR-alphaGens • Prädiktiv in der Behandlung mit Tyrosinkinaseinhibitoren (Imatinib, Gilvec, 2nd line Therapie: Sunitinib, Sutent) • 85% der Tumoren weisen eine Mutation in • cKit, Exon 9, 11, 13, 17 oder 18 • PDGFR alpha Exon 12, 14 oder 18 Intraduktale papilläre muzinöse• GNAS-Mutationsanalyse (SQ nach Sanger) • 60% der IPMN sind mutiert (meist Exon 8, selten Exon 9) Neoplasie des Pankreas (IPMN) • Als diagnostisches Hilfsmittel 46 Prädiktive Faktoren einer EGFR-gerichteten Therapie beim Magenkarzinom Schmiegel et al. 2015 47 Gastroenteropathologie Molekularpathologie: Magenkarzinom • Expression und/oder Amplifikation des HER2-Gens • Hintergrund: Therapie mit dem Antikörper Magenkarzinom Trastuzumab (Herceptin) • Expression wird zunächst immun-histologisch bestimmt + ggf. Amplifikation durch FISH Schmiegel et al. 2015 48 HER2 beim Magen mehrfach testen Park SR et al. Extra-gain of HER2-positive cases through HER2 reassessement in primary and metastatic sites in advanced gastric cancer with initially HER2-negative primary tumours: Results of GASTric cancer HER2 reassessment study 1 (GASTHER1). Eur J Cancer 2016; 53:42-50 Fazit: es ist empfehlenswert, den HER2-Status des Primärtumors und von Metastasen und Rezidiven erneut zu erheben, auch wenn die initiale Bestimmung negativ ausgefallen ist. Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 49 Gastroenteropathologie Molekularpathologie: Magenkarzinom Schmiegel et al. 2015 50 Molekulare Diagnostik : Ovarialkarzinom Übereinstimmend mit der WHO 2014 Timme et al., Freiburg, 2015 51 BRCA1/2 Mutationen Nur 3-4% der BRCA1/2 Mutationen sind rein somatisch, der Rest betrifft die Keimbahn. Das hat für Patienten selbst prädiktive Bedeutung, z:B für Zweitmalignome der Brust, und ist zusätzlich für Verwandte mit möglicherweise ebenfalls vorhandenen Mutationen von Relevanz. Nicht jede BRCA1/2 Mutation ist PARP-sensitiv. Nur wenn beide Allele des Suppressorgens durch Homozygotie abgeschaltet sind, sind die Tumorzellen hochsensibel. Daher sollte der Test im Blut und Gewebe durchgeführt werden. ASCO 2016: die Mehrzahl der BRCA1/2 –Träger weist in der Blutanalyse eine Fraktion des mutierten Allels von 40-50% auf und ist damit wahrscheinlich heterozygot. Im Tumor ist diese Fraktion wesentlich höher – Hinweis auf Second Hit. Bei somatischen Mutationen zeigt sich dagegen extrem hohe Varianz der Allelfraktion, ein Teil der Patienten wird ein Ansprechen des Tumors zeigen, ein Teil nicht. Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 52 Gynäko-und Mammapathologie Molekularpathologie: Ovarialkarzinom • BRCA1/2 Mutationsanalyse • beim rezidivierten Platin-sensitiven , high-grade serösen epithelialen Ovarialkarzinom, Eileiterkarzinom oder Peritonealkarzinom • bei Behandlung mit PARP-Inhibitor Olaparib (Lynparza) • wird am Tumorgewebe mittels NGS durchgeführt • • • • • BRCA1/BRCA2 Erkrankungrisiken bis zum 70. Lebensjahr MammaCa—BRCA1 60% MammaCa—BRCA2 55% OvarialCa—BRCA1 59% OvarialCa—BRCA2 16.5% Schmiegel et al. 2015 Frauenzentrum Universität Dresden, Kast et al. 2015 Wahrscheinlichkeit einer Spontanmutation: 10-15 pro Zelle 53 Gynäko-und Mammapathologie Molekularpathologie: Mammakarzinom • Erweitertes Spektrum der Keimbahnanalyse: BRCA1, BRCA2, CHEK2, RAD51C, RAD51D, TP53, CDH1. NBN, PALB2 und ATM Frauenzentrum Universität Dresden, Kast et al. 2015 54 Gynäko-und Mammapathologie Molekularpathologie: Mammakarzinom • Expression und/oder Amplifikation des HER2-Gens • Bei Behandlung mit Trastuzumab (Herceptin) • Mittels IHC und FISH http://www.molekularpatho-trier.de/content/her2neu-fish 55 Molekulare Pathologie – Chancen und Risiken • Interindividuelle als auch intratumorale Tumorheterogenität verschiedene Subklone schon bei der Diagnose im Tumor vorhanden. • Risiko der nicht repräsentativen Probennahme (Stichprobenfehler) • Risiko eines histologisch und molekularpathologisch heterogenen Tumors (Heterogenität im: Ki-67 Index, HER-2Status Magenkarzinom, KRAS-Status Kolonkarzinom, Mikrosatelitteninstabilitätsnachweis) • Heterogenität der Therapie-Targets (z.B TKI) übt Selektionsdruck auf Tumor aus – De novo Mutationen können entstehen, die zur Therapieresistenz und zum Tumorprogress führen können.(Hata et al 2016 Nat.Med Mar, 22(3):262-269 • Ein molekular heterogener Tumor kann sich gegen eine Therapie wehren. Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 56 Liquid Biopsy – Warum? Tumorheterogenität 38% der Proben heterogener EGFRMutationsStatus Änderung durch Chemotherapie (mut -> WT) Bai H, JCO 30:3077;2012 Liquid Biopdy, N. Frickhofen, 26.01.16 HSK Wiesbaden 58 Liquid Biopsy – Warum? (Re)Biopsie nicht immer einfach RNS Wiesbaden Liquid Biopdy, N. Frickhofen, 26.01.16 HSK Wiesbaden 59 Vorgehensempfehlung zum Resistenzmutationsnachweis Patient Lungenkarzinom – Resistenzmutation T790M Blut Gewebe Pathologie Gewebe Gewebe Blut/Plasma Ergebnis Prof. A. Fisseler-Eckhoff Modifiziert nach Jung,Krebskongress 2016 Zeitsparend HELIOS Wiesbaden 60 Liquid Biopsy – „Flüssigbiopsie“ • Die Liquid-biopsy-Diagnostik beschreibt die molekulare Analyse von Tumor DNA (freier und zellgebundener Nukleinsäuren DNA oder RNA) – zumeist aus Blut aber auch anderen Körperflüssigkeiten (Urin) zur • Früherkennung, • Diagnose, • Verlaufskontrolle, • oder eventuelle Therapiestratifizierung von Krebserkrankungen. • Bei onkologischen Erkrankungen wird Potential der „Liquid biopsy“ darin gesehen, die Tumorlast nichtinvasiv zu „verfolgen“ und entstehende Resistenzen gegen spezifische Therapien bei Patienten mit metastasierten Tumoren frühzeitig zu erkennen • (AG Molekularpathologie DGP Pathologe 2015) Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 61 Multiple Soucres of Tumor DNA in Blood Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 62 Liquid Biopsy Definitionen Zirkulierende Tumorzellen Zirkulierende (zell)freie DNA cfDNA cell free DNA ctDNA circulating tumor DNA Liquid Biopdy, N. Frickhofen, 26.01.16 HSK Wiesbaden 63 Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 64 Liquid Biopsy – Untersuchungsmaterial Zirkulierende freie Tumor-DNA lange bekannt ctDNA bei Diagnose - 100% der ALL-Patienten (auch ohne periphere Blasten) - 81% der nodalen Non Hodgkin-Lymphome Frickhofen N, Blood 90:4953;1997 Frickhofen Frickhofen N, Blood N, Blood 90:4953;1997 90:4953;1997 Liquid Biopdy, N. Frickhofen, 26.01.16 HSK Wiesbaden 65 Bestimmung von Resistenzmutationen im Blut cfDNA Clearance (Blut:30Min) Steady state DNA Freisetzung Menge an cfDNA Begrenzte Menge an DNA cfDNA im Blut :17ng/ml 6pgDNA/Zelle 10CTC/ml 6ngDNA 100ml 3ml Blut 1- 2ml Serum oder Plasma (ca 50ng DNA) Smalle Fragmente --160+- 40bp Unbekannte Menge an ctDNA in cfDNA Komplexe Alterationen Unterschiedliche Sensitivität Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 66 Liquid Biopsy – Untersuchungsmaterial DNA-Menge von Biopsien H. Weigand, RNS, HSK Wiesbaden A. Fisseler-Eckhoff, IPZ, HSK Wiesbaden Biopsie Histology >1µg DNA Liquid Biopdy, N. Frickhofen, 26.01.16 HSK Wiesbaden 67 Liquid Biopsy – Untersuchungsmaterial DNA-Menge von Biopsien ca 10ng Tumor-DNA Th. Fink, IPZ Wiesbaden Freie DNA in Plasma: Fine needle aspiration 1 – 100 ng/ml Gesamt-DNA davon ca 1‰ Tumor-DNA = 0,001-0,1 ng Tumor-DNA/ml Liquid Biopdy, N. Frickhofen, 26.01.16 (FNA) Zytologie/Histologie ca 0,1ng Tumor-DNA Th. Fink, IPZ Wiesbaden HSK Wiesbaden 68 Blutprobe Geringe Mengen von cfDNA im Blut: 17ng/ml Blutröhren absorbiert (cf)DNA Polymere (polypropylene, polyethylene...) Periphere Mononukleäre Zellen (PMNC) decay STRECK – Tubes –BCT (Zellfreie DNA Blutsammelröhrchen) Bor-Silicate-Gels - negativ geladen Stabilisator für Membranen/Zellen (Periphere mononukleäre Zellen im Blut) Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 69 Liquid Biopsy – Präanalytik Nukleasen im Blut bauen DNA ab EDTA-Plasma Plasma nicht Serum! DNA in Plasma relativ stabil. Trotzdem schnell zum Labor und schnell verarbeiten, 40C empfohlen. Frickhofen N, Blood 90:4953;1997 Liquid Biopdy, N. Frickhofen, 26.01.16 HSK Wiesbaden 70 ctDNA Workflow Blood sample taken in Cell Save preservative tubes Set up: Pyrosequencing Next-generation sequencing Quantative PCR BEAMing Digital PCR Sample arrives in lab and spun to isolate the plasma ctDNA is extracted from the plasma using the QIAamp Circulating Nucleic Acid on the QIAVac system Plasma is stored at -80ºc Sample is extracted on the same day as the downstream process set up due to ctDNA instability 71 Tumor-Tissue Analysis versus cfDNA Analysis Prof. A. Fisseler-Eckhoff HELIOS Wiesbaden 72 Liquid Biopsy – Zuverlässigkeit Sensitivität nicht 100% Prevalence of cfTumor-DNA in Plasma at Diagnosis und during Treatment Frickhofen N, Blood 90:4953;1997 Liquid Biopdy, N. Frickhofen, 26.01.16 HSK Wiesbaden 73 Liquid Biopsy – Zuverlässigkeit Sensitivität nicht 100% Plasma EGFR mut Plasma EGFR wt Tu-Biopsie EGFR mut 69 36 105 Tu-Biopsie EGFR wt 1 546 547 70 582 652 Sensitivität (richtig positiv): 66% Spezifität (richtig negativ): >99% Positiv prädiktiver Wert: 99% Negativ prädiktiver Wert: 94% (16%) (69/105) Response auf Gefitinib (546/547) - Biopsie EGFR mut 70% (69/70) - Plasma EGFR mut 77% (546/582) Douillard, JY, Br J Cancer 110: 55;2014 Liquid Biopdy, N. Frickhofen, 26.01.16 HSK Wiesbaden 74 cfDNA – interner Standard Blut – cfDNA Bekannte Resistenz Mutation im NSCLC – Mutation T790M Primäre EGFR WT Mutation nachgewiesen WT Primäre Mut nachgewiesen Ergebnis Prof. A. Fisseler-Eckhoff Ergebnis Modifiziert nach Jung,Krebskongress 2016 WT Primäre Mut nicht nachgewiesen Anderes Material erforderlich HELIOS Wiesbaden 75 Liquid Biopsy Schlussfolgerungen aus klinischer Sicht Nützlich wenn/für -Keine Biopsie möglich/zumutbar -Biopsie schwierig -Keine Biopsie zumutbar -Resistenz vermutet - Komorbidität, Dringlichkeit - Entzündung, Nekrose - Verlaufskontrollen - Progress, fokal/systemisch Vorsicht: Sensitivität <100% Potential -Früherkennung (?) -Monitoring Tumorbiologie Liquid Biopdy, N. Frickhofen, 26.01.16 - Sensitivität zu gering (?) - Resistenzentwickelung - Klonale Heterogenität - Neue Biomarker HSK Wiesbaden 76
