MEDIZINISCHE GENOMIK
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1 1. MEDIZINISCHE GENOMIK Medizinische Genomik 1. Trends in der Medizinischen Genomik DIA 1 Seit Entschlüsselung des Geheimnis‘ des menschlichen Genoms sind über 10 Jahre vergangen, während diesen hat in der genomischen Technik, bzw. auf genomischen Methoden anwendende Wissenschaftsgebieten (z.B. Medizinwissenschaft) eine ausgesprochen schnelle Entwicklung stattgefunden. Die Menschheit ist um viel Informationen reicher geworden, was die Variabilität und Funktion des menschlichen Genoms betrifft. Viele sind der Meinung, dass wir kurz davor stehen, die Anfälligkeits-Faktoren komplexen Krankheiten gegenüber genauer kennenzulernen, und dadurch fähig sein werden die Patienten mit individuellen-Therapien zu behandeln. Die molekulare Genetik und Genomik bietet erst in der Therapie, dann in der Heilung neue Möglichkeiten. DIA 2 Drei große technische Gruppen führen miteinander einen Wettkampf, das sind die DNA Chips, Real-Time PCR und die „new generation“ Sequenatoren. Momentan führen die Sequenatoren, in diesem Jahr ist der 3. generation- Sequenator erschienen (Pacific Biosciences, auf SMRT Technologie basierende Einrichtung, kann inerhalb einer Stunde kostengünstig (unter 100 Dollar) ein menschliches Genom sequenzieren), dem folgen bald auf anderen Technologien basierende einrichtungen wie z.B. auf nanoporen-Prinzip basierender Sequenator. Diese Sequenatore sind nicht nur für das Kennenlernen der DNA-Struktur geeignet, sondern auch in der Lage sind RNA-Kopienzahlen (sequenziert wird immer die cDNA!) festzustellen DIA 3. Entwicklung ab Entschlüsselung des menschlichen Genoms bishin zum Krankenbett besteht aus folgenden Stationen: (1) Kennenlernen der Genomstruktur; (2) Kennenlernen der Funktion des Genoms; (3) Kennenlernen der Biologie der Krankheit; (4) Entwicklung der Medizin; (5) Verbesserung der Effektivität der Heilkunde. 2. Genomik und moderne Medizinwissenschaft FOGALMAK DIA 4-6 Evidenz basierende Heilung: Ziel ist die Anwendung der aus wissenschaftlichen Forschungen stammenden Ergebnissen, Tatsachen (Evidenzen) bei Treffen von Entscheidungen im Klinikum. Translationsmedizin: Hauptaufgabe dieser ist die Translation der aus den Grundforschungen der vergangenen Jahren stammenden Kenntnissen (molekulare Genetik und Genomik) in die medizinische Praxis. Viele sind der Meinung, dass die TM die Evidenz basierende Medizin des XXI. Jahrhunderts ist. Medizinische Genomik (genomische Medizin): Verwendet genomische Informationen und Techniken zur Foliegnostik und Prognose von genetischen Krankheiten und Neigungen. DIA 5 Individualisierte Heilkunde: Anwendung von molekular-genetischen und genomischen Kenntnissen in der Diagnose, Prognose und Therapie. Im Gegensatz zum früher (und auch gegenwärtig) typischen, aus „Aspekt der Menge/Mehrheit” gültigen Heilungs-Paradigmas behandelt die Grundanforderung 27. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 2 1. MEDIZINISCHE GENOMIK Personen-spezifische individualisierte Heilkunde die Patienten mit Verwendung des individuellen genetischen Profils. Personalisierte Heilkunde bedeutet zwei verschidene Therapien: (1) Individuelles Testen der klassischen Medikamente (2) Neue personenspezifisch hergestellte Medikamente: DNA, RNA, Proteine, Antikörper, Stammzellen. DIA 6 Prädiktive Medizin : Die prädiktive Medizin ist (in engerem Sinn) nicht für Kranke, sondern für gesunde Menschen gedacht. Ziel derer ist herauszufinden, ob der/die Untersuchte/r eine Anfälligkeit bestimmten Erkrankungen gegenüber besitzt. Ziel der prädiktiven Medizin ist das Vorhersagen von zukünftigen Krankheiten damit der/die Betroffene eine proaktive Lebensweise führen kann und wenn notwendig häufiger an Untersuchungen teilnehmen. Bemerkung: die Medizin von Heute ist reaktiv (reagierend); das heißt die anwesende Krankheit wird behandelt. In weiterem Sinn gehört auch das deutlich machen des Krankheitszustandes mit genetischen Test sind diese Gruppe. Untersuchung des ganzen genoms (mit Microchip, DNA Sequenierung) ermöglicht es Anfälligkeiten noch vor Erscheinung der Krankheit zu erkennen, so kann schon präventiv mit der medizinischen Behandlung begonnen werden. Es ist z.B. bekannt, dass das Brustkrebs-Risiko bei denen, die die Mutation des BRCA 1 Gens in sich tragen höher ist, oder dass bestimmte Allelvarianten des Faktor V Gens zur BlutgerinnselBildung beitragen. Die genetischen Tests werden früher im Handel erhältlich sein, als die Medikamente. Die prädiktive Medizin wird von Anwendung von reaktiven zur Anwendung von proaktiven Techniken führen. Beschrenkungen der prädiktiven Medizin: (1) ein Problem ist, dass eine in einem Gen stattfindende Mutation auch wenn sie mit Aminosäuren-Modifikation verbunden ist, die Funktion des Proteins nicht unbedingt ändern muss, das heißt, sie verursacht keine Krankheit. (2) Die häufig vorkommenden komplexen Krankheiten sind durch mehrere Gene geprägt, momentan kennen wir die Rolle der einzelnen Gene noch nicht. (3) Wir kennen die Wirkungen der in den genetisch regulierenden Elementen stattfindenden Mutationen nicht genau. Mutationen in der Region der Regulation kommen öfter vor, wie in der kodierenden Region. (4) Die Entwicklung einer komplexen Erkrankung verfügt auch über einen Umgebungs-, und Lebensweise-Faktor, diese sind manchmal von größerer Bedeutung, als der genetische. (5) Feststellung und Verbalisierung eines genetisch festgestellten Risikofaktors kann sich auf die Patienten belastend auswirken. Arten der genetischen Tests DIA 7 (1) Untersuchung der Neugeborenen(pl. PKU) : direct nach Geburt, um eventuelle genetische Fehler zu entdecken. In den USA wird auf PKU und Hypotirodismus untersucht. Gegen diese Krankheiten kann man nämlich mit effektiver Therapie antreten, und Entwicklung dieser Krankheiten so vorbeugen. (2) Pränatale Tests (Foliegnose vor Geburt=Foliegnose nach Empfängnis=Prekonzeptionelle Foliegnose) bedeutet das genetische Testen des Phötus’ oder Embryos. Diese Testart ist empfohlen, wenn die Elternteile Risikofaktore bestimmten chromosomalen Erkrankungen gegenüber in sich tragen. Es gibt invasive (z.B. Amnionzentese, CVS, Chordozentese) und nicht invasive Arten des Tests (Triple-Test). (3) Präimplantations Test wird im Fall einer assistierten Befruchtung (IVF) angewendet, es gibt zwei unterschiedliche Techniken. (1) präimplantations (genetische) Diagnostik (PID) wird (vor der Befruchtung) angewendet, wenn ein oder beide Elternteile über einen bekannten genetischen fehler verfügen (2) Präimlantations Geneischer Test (PGS) eine Methode, bei welcher von gesunden Eltern abstammende Embryos auf Aneuploidie getestet werden. Beide Techniken basieren darauf, dass die Zellen des 8 Zelligen Embryos Totipotente Zellen sind, so das Entfernen eines derer kein Problem in der Embryogenese verursacht, weil die anderen Zellen den Verlust ersetzen. Diese preimplantations Techniken bedeuten eine Alternative neben der nach der Befruchtung stattfindenden Techniken. Grundanforderung 27. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 3 1. MEDIZINISCHE GENOMIK (4) Untersuchung der Träger (Konduktor) hier können die, die genetische Krankheit in sich tragenden, aber nicht kranken (heterozygote) Betroffenen erkannt werden. Dies ist empfohlen, wenn in der Familie eine gegebene Krankheit vorkommt, oder wenn der Betroffene einer solchen ethnischen Gruppe angehört, bei welcher ein bestimmter genetischer Defekt häufig vorkommt. Wenn beide Elternteile untersucht werden, kann festgestellt werden, mit welcher Wahrscheinlichkeit gegebene Krankheit bei ihrem Kind vorkommen wird. 5. Test vor dem Empfängnis wird an beiden oder nur einem Elternteil durchgeführt. Hier werden nur Risikofaktoren auf seltenen und häufigen Krankheiten gesucht. Einige Firma verwenden schon diese Technik Spermabanken und Eizellbanken zu kontrollieren. Das Firma Existence Genetics beschäftigt sich mit bioinformatischen Testen, so können sie eine Prognose für die Anfälligkeit des Nachkommens auf verschiedenen Krankheiten aufstellen GENOMIKEN DIA 8 Molekulare Genetik: Erforschung der Struktur und Funktion der DNA, RNA auf molekularer Ebene Genomik: Erforschung der Struktur und Funktion der DNA, RNA und der Proteine mit molekularen Methoden, auf gesamt-Genom ebene, in einer Zelle, im Gewebe oder einem Exemplar. Zweige der Genomik sind: 1. Strukturelle Genomik – Untersucht die Struktur der DNA. 2. Funktionelle Genomik – untersucht die Funktion der DNA 2a. Transkriptomik: Gesamt-RNA einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus’ untersuchendes Fachgebiet. Aus Menge der RNA, und deren Verhältnis zueinander kann auf Funktion der Zelle geschlossen werden. 2b. Proteomik: Gesamt-Proteingehalt einer Zelle, eines Gewebes oder eines Organismus’ untersuchendes Fachgebiet. Aus Menge der RNA, und deren Verhältnis zueinander kann auf Funktion der Zelle geschlossen werden. 3. Integrative Genomik 3a. Komparatíve Genomik – sich mit der DNA und Proteinen von unterschiedlichen Rassen /Arten beschäftigendes Wissenschaftsgebiet. 3b. Metabolomik Erkundung des Netzes der Stoffwechselprodukte. Das Metabolom ist die Gesamtheit aller Stoffwechselprodukte einer Zelle oder eines Gewebes. 3c. In silico Genomik = Bioinformatik: Auswertung der genomischen Daten mit mathematischen und computertechnischen Mehtoden. 3d. Pharmakogenomik – Beschäftigt sich mit den Zusammenhängen einer genetischen Varianz und der Wirkung einer Droge. Wird oft mit der individualisierten Heilkunde identifizitert. 3e. Nutrigenomik – Wirkung der Ernährung auf Genomfunktion und so auf die Gesundheit. Rolle des genetischen Profils auf physiologische Wirkungen der Ernährung. 4. Epigenomik – Untersucht die Variabilität der DNA Methylation und der Chromatin Modifikationen auf gesamt-Genom-Ebene. DIA 9 Pharmakogenomik siehe in einem anderen File DIA 10-11 Ernährungswissenschaft - Nutrigenomik: siehe in einem anderen File DIA 12-17 Epigenomika: siehe in einem anderen File DIA X Filomedizin – evolúciós genomikai medicina: külön lapon Grundanforderung 27. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 4 1. MEDIZINISCHE GENOMIK DIA 18 Systemsbiologie Beschäftigt sich mit den komplexen Interaktionen in den biologischen Systemen. Die Systemsbiologie verwendet statt den - in der Wissenschaft üblichen - reduktionistischen Annäherungen holistische Methoden. (Reduktionistische Methode: Untersucht die Bildungselemente eines Systems, mit der Meinung, dass das ganze System durch die Klärung der Zusammenhänge zwischen den Gliedern vollständig erklärt werden kann – technisch leichter zu schaffen. Holistische Methode: das System verfügt über solche neue (emergente) Eigenschaften, welche nicht aus den Ereignissen zwischen den Gliedern folgen, mit anderen Worten, das Ganze kann durch die Regeln der Zusammenwirkungen der Gliedern vollständig nicht erklärt werden). HapMap DIA 19 Ziel des Internationalen HapMap Projekts ist die Kartierung des Haplotyps (HapMap; haplotype map) des menschlichen Genoms, wodurch die Häufigen Mustern der genetischen Variationen des Menschen katalogisiert werden können. HapMap wird als ein sehr wichtiges Inventar betrachtet, welches die genetische Variationen (SNP-s) enthält, welche für das Entstehen der komplexen Krankheiten zuständig sind oder als Faktore für die Anfälligkeit gegenüber verschiedenen komplexen Krankheiten stehen. Das HapMap Projekt erschaffte eine Datenbank der genetischen Variationen des Menschen auf genomiale Ebene, welche als Datenbank für die Assoziationsuntersuchungen (GWAS, genome-wide association studies) der häufigen Krankheiten verwendet wird. DIA 20 Assoziationsuntersuchungen auf genomialer Ebene (GWAS, genome-wide association studies) werden aber auch whole-genome association studies; WGAS oder WGA genannt, bedeutet die Untersuchung der genetischen Varianz des Genoms mit Verwendung von mehreren hunderttausenden SNP-DNA Chips. Ziel ist das Hybridisierungsmuster mit Phenotyp Merkmalen zu verbinden. Diese Untersuchungen sind vor allem bei Erkennung der genetischen Varianten wichtig, die in solchen komplexen Krankheiten eine Rolle spielen, wie Asthma, Krebs, Diabetes, Herz- Kreislaufstörungen und mentalen Störungen (Schizophrenie, Depression, Selbstmord, usw.). 3. Genetische Erkundung der mendelschen Merkmale Das Kennen der Basenzusammensetzung (Sequenz) des menschlichen Genoms reicht allein nicht um die genetischen Hintergründe einer phenotypischen Eigenschaft oder einer Krankheit zu definieren, deshalb dazu genetische Kartierung nötig ist, damit wir die bestimmte DNA Lokusse, Gene bestimmen können. DIA 21 3.1. Einleitung Die genetische Kartierung ist die Feststellung eines phenotypischen Merkmals oder Krankheit verursachenden DNA-Abschnittes mit Hilfe von genetischen Markern. Ziel ist es festzustellen, wie häufig sich zwei gegebene Locus’ während der meiotischen Rekombination voneinander trennen. Wenn zwei Locus’ an den zwei Enden des Chromosoms platziert sind, trennen sie sich mit größter Wahrscheinlichkeit (50 %) entlang an der Rekombination teilnehmenden ChromatidStränge (nur ein Chromatid rekombiniert), wenn zwei Locus’ jedoch sehr nah aneinander sind, werden diese mehrere Generationen lang gemeinsam, als ein Block vererbt. Das Schicksaal der Locusse können wir dann mitverfolgen, wenn sie eine phenotypisch erscheinende Eigenschaft kodieren oder leicht identifizierbare „Elemente” sind; diese nennen wir als Marker. Wenn wir den Locus einer unbekannten, auf mendelscher Weise vererbbaren Eigenschaft oder an einem Chromosom feststellen möchten, müssen wir untersuchen, wie die gegebene Eigenschaft im Vergleich zu dem bekannten Marker weiterverebt wird. Wenn die Eigenschaft normalerweise tritt mit dem Marker zusammen auf, oder die kosegregieren, legen sie nah zueinander, aber wenn die co-Segregation zufällig ist, legen sie weit voneinander entfernt oder auf zwei unterschiedlichen Chromosomen. Als Marker kann jedes Grundanforderung 27. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 5 1. MEDIZINISCHE GENOMIK Element dienen, welches eine Mendelsche Vererbung aufweisst (monogenische Erkrankung, Microsatellit-Marker, SNP, usw.). Die genaue Kartierung verwendet Markers mit grosser Anzahl, wie z.B. SNP-Stellen. Die genetischen und physikalischen Karten sind unterschiedlich. Die physikalischen Karten sind mit dem Abstand direkt proportional, deren Einheit ein Bp (Basenpaar, weil DNA doppelsträngig ist) ist. Herstellung der genetischen Karten beruht auf Rekombinationsfrequenz, liefert relative Abstände in centi Morgan (cM, die Einheit von genetischem Abstand), die sogar sexuell dimorphisch sein können, wann der Rekombinationswert unter der Geschlechte unterschiedlich ist: Im Männchen gibt es weniger Austausch als im Weibchen: Maus, Ratte, Mensch Im Weibchen gibt es weniger Austausch als im Männchen: Haustaube Im Weibchen gibt es gleich viel Austausch wie im Männchen: Erbse. Dementsprechend, z.B., derselbe Abstand zweier identischen Gene ist grösser wenn wir es in Männer messen. Der Rekombinationswert ist nicht unbedingt proportional mit dem Markerabstand, kann sich entlang des Chromosoms unterschiedlich sein (Rekombinationsheisspunkt vs. niedrigerer Rekombinationsstellen). Kartierung „Krankheitsgene“ bedeutet immer genetische Kartierung. Unter Versuchstiere (Maus, Taufliege) Rekombinationskartierung verwendet werden kann bei der Analyse der Nachkommenschaft in tausenden menge; unter Menschen muss man Familienstammbäume analysieren. Analyse der komplexen Merkmale (z.B. Körperhöhe, die durch mehrerer Gene beeinflusst sind) ist schwieriger, als einfacher mendelscher Merkmalen. DIA 22 2. Die genetische Rekombination (crossing over) findet im Pachitänstadium der Prophase I der Meiose statt und liefert neue Allelkombinationen durch basenparengenau Austausch zwischen der mütterlichen und väterlichen Chromosomen. Rekombination ein punkt-ähnlicher, reziproker (kein Chromosomverlust oder -gewinn erfolgt, der väterlichen Chromosomabschnitt bekommt gleiche DNA-Menge von dem mütterlichen Chromosom) und statistischer (die Rekombinationsfrequenz hängt von dem Abstand der Gene ab) Vorgang ist. A1B1XA2B2 Kreuzung ergibt die Neukombinationen als rekombinante Chromosomen A1B2 und A2B1in den Keimzellen. Genkonversion kann die Reziprozität der genetischen Rekombination virtuell beeinflussen bei Bildung das Tetrad A1B1 A1B1 A2B1 A2B2 und entsteht durch Mismatchreparatur bei Bildung 3 B1-Allele. Bei Crossing over, die rekombinante Individen geben den sogenannten Rekombinantfraktion, der die Zusammenheit von durch Rekombination entstehender Nachkommenschaft nach Pheno- und Genotypisierung sind. Der Vorteil der genetischen Rekombination: Mit der genetischen Rekombination nimmt die genetische Variabilität zu, und vertretet bestimmten evolutionären Vorteil. Die Kinder und Eltern weisen nur eine 50 %-ige genetische Identität, die Individuen der Nachkommenschaft wesentlich unterschiedlich sind, und vorteilhafte Allelkombinationen tragen können. Rekombination und Neokombination: früher wurde die reine Mischung der nicht homologen Chromosomen als Neokombination genannt. Das Begriff Neokombinantion ist nur selten verwendet, weil die Rekombination immer stattfindet (die elterliche Chromosomen so immer einen Mosaik zeigen). DIA 23 Die Rekombinantfraktion spiegelt den Abstand zwischen zwei Loci wieder. Liegen zwei Loci (A B Allele) auf getrennten Chromosomen, weisen sie unabhängige Vererbung auf (3. Mendelsches Gesetz), und bildet die Nachkommenschaft 50-50 % an Rekombinanten und Grundanforderung 27. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 6 1. MEDIZINISCHE GENOMIK Nichtrekombinanten (nach der Schema einer Test-Kreuzung). Sind zwei Gene syntenisch (syntenic), wenn sie im gleichen Chromosom auftreten. Ohne Crossover ändert sich die Allelkombination nicht. Neukombination kann doch durch Rekombination auftreten; das Beispiel stellt 1 Rekombinant unter 10 Nachkommenschaft dar, welches an 10 cM (genetischer Abstand), 10 %-ige Rekombination entspricht. Zueinander nah liegende Loci können sehr selten durch Rekombination getrennt werden, und werden sie als ein Block unverändert vererbt. Ein Haplotyp gleich mit einem unveränderten Allel-Block ist, mit anderen Wörter, ein nichtrekombinierender Abschnitt/Segment ist. Den Erbgang der Haplotyp-Blöcke kann identifiziert werden unter den Individuen einer Population. Ein Haplotyp wird am besten durch Reihen von SNP-Stellen identifiziert. Das Begriff Haplotyp bedeutet ein Chromosomsegment mit bestimmten SNPs 3. Kartierung eines „Krankheitsgens“ Das Ziel der menschlichen genetischen Kartierung ist das Locus eines „Krankheitsgens“ zu bestimmen. Klinische Fachleute identifizieren und mit 100 %-iger Sicherheit diagnostisieren Familien, wo die bestimmte Krankheit als Merkmal mit grosser Häufigkeit auftritt. Ausserdem brauchen wir zahlreiche Markers mit Mendelscher Vererbung auch. Es findet Kopplung zwischen der „Krankheitsgen“ und einem Marker statt, wenn sie syntenisch, unverändert vererbt werden als ein Block. Methodik der Kopplungsanalyse DIA 25 (1) Die erste auf DNA-gegründete Kopplungsanalyse nutzte RFLP (restriction fragment length polymorphism) aus, und technisch wurde auf die anstrengende Southern-Blot-Technik gegründet. (2) DIA 26 STR- (short tandem repeats, Microsatelliten) Markers Die Aufgabe bedeutet die Bestimmung des individuellen Längenpolymorphismus eines bestimmten Markers, welcher mit dem Zielgen gekoppelt ist. In einer multiplex PCR-Reaktion könen wir gleichzeitig mehrere Markers untersuchen. (3) Die Eigenschaften eines DNA-Chip/Array ermöglichen gleichzeitige Untersuchung hunderttausender SNP-Stellen und Erzeugung einer Feinkarte mit hoher Auflösungskraft. SNPStellen treten häufig, ~ einmal pro 1000 Bp im menschlichen Genom; im Vergleich, Microsatelliten-Markers vertreten sich viel seltener. Mit Chiptechnik kann man zirka 500.000 SNPs untersuchen. (4) Verbreitung der dritten-Generation-Sequenzierung ermöglicht die Untersuchung des ganzen DIA 27 Spermienkartierung Genetische Untersuchung der Spermien ermöglicht die Bestimmung der Rekombinanten in einem kurzen (~100-200 kBp) DNA-Abschnitt. Die Rekombinantfraktion gleich mit dem genetischen Abstand ist und liefert eine Feinkarte mit grosser Auflösungskratft. Kartierung der Prädisposition komplexer Krankheiten Grundanforderung 27. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 7 1. MEDIZINISCHE GENOMIK Erkrankungen sind haufig multifaktorial, die klinische Presentation hängt von genetischen- und Umweltfaktoren ab. Die genetischen Faktoren können durch Familien- und Zwillingsforschung, die Umweltfaktoren durch der Untersuchung der adoptierten Kinder bestimmt werden, obwohl Trennung der genetischen- und Umweltfaktoren schwer ist. Die traditionelle genetische Analyse ist hilflos, als die Parametern (Vererbungsmodus, Allelfrequenz, Prädisposition) können nicht einwandfrei bestimmt werden. Anstatt der parametrischen Methoden der Mendelschen Analyse (Kopplungsanalyse) man verwendet nichtparametrische Methoden ohne Modelbildung. Untersuchung der kranken Familien (nichtparametrische Kopplungsanalyse) Ein Art der nichtparametrischen Kopplungsanalyse untersucht Chromosomsegmente oder Markers (SNPs), die häufiger in Patienten als in der Gesamtpopulation auftreten. In der symptomlosen Verwandschaft dieselben Segmente können sich voneinender durch Rekombination trennen. Natürlich, die genetischen Faktoren komplexer Krankheiten werden unter mehreren Segmente und Chromosomen verteilt. Populationsuntersuchungen (Assoziationsstudien) Eine alternative nichtparametrische Methode identifiziert Prädispositionsgene durch statistische Zusammenhänge zwischen dem Genotyp und Krankheit. Die statistischen Verbindungen sind die genetischen Blöcke/Haplotypen, die durch Rekombination nicht getrennt wurden. Der Internationale Hapmap Project bestimmt und katalogisiert die uralten DNA-Abschnitte (SNPs). Die unveränderten Chromosom-Segmente sind sehr klein, durchschnittlich bloss ein paar Kb. Die Assoziationsstudien nutzen die Vermutung aus, dass die Prädispositionsfaktoren befinden sich auf uralte, unveränderte Chromosomsegmente und können als Haplotyp definiert werden (häufige Variant-Hypothese). Die seltene Variant-Hypothese vermutet, dass die genetischen Prädispositionsfaktoren sind sehr heterogen, und entstehen durch Neumutationen. Die Hypothese verwendet keine Markers, sondern schlägt Genomsequenzierung vor. DIA 30 Haplotypkartierung - Urhaplotyp Die Reihenfolge der Gene auf die homologen Chromosomen ist gleich, aber deren Sequenz weist durschnittlich Unterschiede in jeder tausendste Nucleotid (SNP) auf. Mithilfe SNPs ist es möglich, die mütterlichen und väterlichen Allelvarianten zu identifizieren. Die bekannte Eigenschaft der genetischen Rekombination ist dass sie häufiger zwischen entferten Markers auftritt; zueinander nah liegende Markers werden gemeinsam vererbt, weisen unausgeglichene Kopplung (linkage disequillibrium; LD) auf und können einen Haplotyp bilden. Zum Beispiel, der Urhaplotyp TATCAT kann eine Mutation erleiden: Der DNA-Abschnitt den urzeitlichen TAT Haplotyp enthält, entsteht eine Mutation (X-Allel) zwischen SNP-s 3. und 4. (dadurch wird eine Krankheit verursacht, oder das Risiko einer Krankheit wird erhöht; vor der Kartierung wissen wir nicht dass es zwischen 3. und 4. liegt). In vielen Generationen wird der Ur-Haplotyp-Profil wegen der Rekombination erodiert (Änderungen in rot gezeigt), z.B. in Gegenwart-Haplotyp 1 wird durch Rekombination T auf C getauscht. Allerdings enthält der kürzeste konservierte Haplotyp-Profil bei jedem Patienten die Mutation: TXC. Durch diese Technik kann die Krankheit auf ein 10.000 Bp langen Abschnitt lokalisiert werden (kürzer als ein Gen). linkage disequilibrium (LD): zwei oder mehr Allele sind nicht zufällig vorkommt, da diese auf dem Chromosom in der Nähe zueinander angeordnet sind, so die Rekombination kann diese voneinander nicht trennen, sie bleiben miteinander in einem langem Zeitraum gekoppelt. Diese Situation führt zu spezifischen Segmenten der DNAMarker, damit wir die Anfälligkeit für Krankheiten bestimmen können, ohne die gesamte Sequenzen der Gene zu wissen. Technisch wird ASA, oder Einzelnukleotidsequenzierung durchgeführt. . Grundanforderung 27. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 8 1. MEDIZINISCHE GENOMIK DIA 31 Häufige Krankheit / Häufige Variante Hypothese Theoretisch kann eine komplexe Erkrankung durch viele verschiedene Kombinationen von Genmutationen verursacht werden. Ausserdem kann ein Gen durch eine Reihe von verschiedenen Genmutationen inaktiviert werden. Nach der häufigen Variante- Hypothese wird jedoch eine häufige (komplexe) menschliche Krankheit durch eine relativ kleine Anzahl von Mutationen verursacht. Diese Annahme hat eine gewisse evolutionäre Logik (Flaschenhalseffekt). Während also theoretisch viele verschiedene Mutationen eine Krankheit verursachen können, ist eine relativ geringe genetische Variabilität für die Ausprägung von polygenetischen Krankheiten verantwortlich (in der Tat, es gibt eine sehr kleine genetische Unterschiede zwischen Individuen). Die Annahme ist, dass ein Allel, das in der Ausprägung einer komplexen Erkrankung eine Rolle spielt, mindestens in 5% der Population vorkommt. Für die Krankheit oder für die Existenz der Prädisposition müssen "kranke" genetische Varianten einiger (bis 10-12) anderer Gene in der DNA der gleichen Person vorhanden sein. Die Herausforderung besteht darin, die „kranke“ Genvarianten zu finden. Der einfachste Weg ist, nach SNPs zu suchen, die mit Krankheit assoziiert sind. Ein SNP kann kausales SNP sein, wenn es das Gen (falsche Protein hergestellt wird) oder die regulatorische Sequenzen (nicht optimal Genexpression) kaputtmacht. Ein SNP kann gekoppeltes SNP sein, was bedeutet, dass die Basis-Variante keine Krankheit verursacht, aber in den meisten Fällen befindet sich in der Nähe des Gens. Nach der häufigen Variante- Hypothese also können Erkrankungen mit verschiedenen SNP-Mustern gekennzeichnet werden. Diese Möglichkeit wäre der Eckstein der personalisierten Medizin.. DIA 32 Die häufige Erkrankung / Seltene Variante-Hypothese Trotz intensiver Forschung wurde nur selten eine schwache Korrelation zwischen einem Allel einiger Gene und der Anfälligkeit zu einer Krankheit gefunden. Für die Schizophrenie und bipolare Störung konnte praktisch keine genetische Korrelation mit der SNP-Methode identifiziert werden. Für den Typ-2-Diabetes wurden um 20 genetische Varianten entdeckt, aber sie machen nur 2-3% der Fälle aus. Die enttäuschenden Ergebnisse kann man erklären, wenn man annimmt, dass die natürliche Selektion viel effizienter ist, als es die Forscher gedacht haben und eliminiert die krankmachenden Allele aus der Population sehr schnell. Nach der häufige Erkrankung / seltene Variante-Hypothese werden die häufigen Krankheiten durch seltene genetische Varianten verursacht. So sind diese Varianten vor relativ kurzer Zeit entstanden, und die natürliche Selektion sorgt dafür, dass sie nicht häufig werden, zumindest das war der Fall vor der modernen Medizin. In anderen Worten, eine sehr komplexe Erkrankung kann durch eine Vielzahl von genetischen Hintergründen verursacht werden: Die gleiche Krankheit wird bei verschiedenen Personen durch verschiedene Mutationen in verschiedenen Genen oder durch verschiedene Mutationen an verschiedenen Stellen der gleichen Gene verursacht werden. Die neue Mutation, die die Krankheit oder die Anfälligkeit verursacht, ist nicht unbedingt im Genom des untersuchten Persons entstanden, er kann die neue Mutation geerbt haben. So sind also Genomprogramme die eine große Anzahl von individuellen Genomen untersuchen, um häufigen genetische Varianten zu finden, nutzlos. Zum Beispiel, die assoziierten SNPs sind völlig nutzlos, und der Nachweis von kausalen SNPs ist nur dann sinnvoll, wenn wir die vollständige Sequenz des Gens, nicht nur die An-oder Abwesenheit von SNPs untersuchen. Die meisten Genetiker sind mit dieser Ansicht nicht einverstanden. Sie meinen, dass weitere Forschungen die häufige Varianten-Theorie bestätigen werden, und schließlich die wichtigsten genetischen Marker von Massenkrankheiten gefunden werden können. Die Idee der personalisierten Medizin wird aber weiter bestehen, wenn festgestellt wird, dass die häufige Variante Hypothese tatsächlich nicht richtig ist. Statt der Erforschung von genetischen Markern wird man dann Gesamtgenomsequenzierungstechniken einsetzen Erklärung: die SNP-markers können nur in solchen Fällen verwendet werden, wenn Häufig Variante Hypothese richtig ist, so die Markers immer in den Patienten vorhanden sind. Die SNPs können wir nämlich im Erkentniss des begrenzten Regionen mit Hilfe PCR, Sequenzierung, microChip bestimmen. Diese Techniken brauchen immer bekannte Proben zur Detektierung. Grundanforderung 27. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 9 1. MEDIZINISCHE GENOMIK Zusammenfassung DIA 34 Die mit Erkrankungen gekoppelten DNA-Sequenzvariante können wir auf causative Mutationen und auf prädispositionauslösende Sequenzänderungen verteilen. Das Penetranz-Kontinuum versucht es zu erklären, auf welcher Position der Skala der Faktor liegt. Krankheitsauslösende Variante bilden die Gründe der Mendelschen vererbbaren Erkrankungen (insgesamt ~6000), und treten selten auf. Diese Krankheiten kann man durch parametrischer genetischen Kartierung – im glücklichen Fall – auf einem ~1 cM, ~eine million Bp DNA/Chromosom Abschnitt lokalisieren. Faktoren mit niedrigerem Penetranz können durch nicht-parametrischer Kartierung bestimmt werden, als kein genetisches Model vorhanden ist. Dieser statistische Vorgang beschrenkt erfolgreich ist, weil die Patientenanzahl der Verwandschaft zu niedrig ist. Erfolgreicher nichtparametrische Kartierung wird auf Genomsassozationsuntersuchungen gegründet (HapMapProject) mithilfe SNP-Microchip-Analyse. Prädispositionsfaktoren können häufig mit bestimmten Tag-SNP-Allele assoziieren, als Urhaplotypen. Die häufeige Variant-Hypothese besagt, dass solche Ur-Faktoren für die Prädisposition der komplexen Krankheiten verantwortlich sind. Die seltene Variant-Hypothese, im Gegenteil, besagt dass die Neumutationen für die Prädisposition bestimmter erkrankungen verantwortlich sind. Die Hypothese vorhersagt hohe Heterogenität der Assoziationsfaktoren, und die hohe Variabilität schliesst die Faktor-Identifizierung aus. Mit dritten Generation Genomsequenzierung fähig ist die seltene Variante zu detektieren, weil wir keine Marker detektieren müssen, wir sequenzieren das ganzen Genom. Wahrscheinlich die mehrhunderte jetzt bestimmte und kartierte Anfelligkeitsfaktoren verursachen keine Symptomen, sondern sie mit den wirklich Krankheit verursachenden Faktoren gekoppelt sind (LD. Die Aufgabe der folgenden Jahren ist die kausative Allelvariante zu bestimmen; deren Einführung in klinischer Forschung und Diagnose ist erwünscht. Ein Tag-SNP ist ein representatives SNP in einer Region des Genoms, das in einem hohen Linkage Disequilibrium (zu deutsch in etwa Kopplungs-Ungleichgewicht) hat. Also das Tag-SNP zeigt das Vorhandensein von anderen SNPs, die so nicht bestimmt werden sollen. Begriffe Das Ziel des International HapMap Projects ist die Kartographierung der Haplotypen des menschlichen Genoms. Diese HapMap soll die Muster genetischer Variation des Menschen beschreiben. HapMap wird als ein Inventar aufgebaut, das enthält die genetische Variationen (SNPs) der komplexen Krankheiten. http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/index.html.en Haplotyp: ein SNP Muster auf einem Chromosomsegment Häufige Krankheit/häufige Variante-Hypothese Die häufig vorkommenden multifaktorialen Krankheiten des Menschen werden durch einige Varianten einiger Gene verursacht, wessen Ursache ist, dass in der Zeit der Entstehung der menschlichen Art die Populationsgrösse sehr klein war und durch die plötzliche Expansion die seltenen genetische Varianten häufiger wurden. SNP-s: Markern an der DNA durch welche die Krankheiten, bzw. Prädispositionen/Neigungen für Krankheiten detektiert werden können. Causativer SNP kann direkt im codierenden/regulatorischen Bereich des Gens liegen; gekoppelter SNP verursacht keine Krankheit, aber liegt in der Nähe des „Krankheitsgens“. Zusätzlich, ist es ein Mittel in der Person-spezifischen Medizin: Anwesenheit eines bestimmten SNP-Musters kann mit Krankheitsprädisposition gekoppelt werden. Grundanforderung 27. Vorlesung Boldogkői Zsolt © 10 1. MEDIZINISCHE GENOMIK Seltene Variante-Hypothese Die öfter vorkommenden menschlichen Krankheiten werden nicht durch vor langer Zeit geerbten, sondern von relativ neuen Mutationen ausgelöst (sporadische Mutation). Die auf gemeinsame Markern (SNP) basierende Strategie ist nicht gut, da es solche Markern gibt nicht. Im hintergrund häufiger Krankheiten stecken sich seltene genetische Variante, die hochwahrscheinlich sporadische (neulich entsehende) Mutationen sind. Es kann bedeuten dass in nicht-verwandten Kranken unterschiedliche Mutationen desselben Gens ähnliche Krankheiten auslösen können. Die SNP-Markers haben begrenzte Nutzung wenn die häufige Variante Hypothese richtig ist, der bestimmte Marker immer vorhanden ist. Erst die neue Generation der Sequenatoren können dieses Problem lösen. Grundanforderung 27. Vorlesung Boldogkői Zsolt ©
