Identifizierung und Phänotypisierung - nbn

Aus der Klinik und Poliklinik für Dermatologie und Venerologie
der Universität zu Köln
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg
Identifizierung und Phänotypisierung autoantigenspezifischer
Plasmazellen bei Patienten mit Bullösem Pemphigoid
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung der Würde eines doctor rerum medicinalium
der Hohen Medizinischen Fakultät der
Universität zu Köln
vorgelegt von
Susanne László
aus Halle/Saale
Promoviert am 22. September 2010
Aus der Klinik und Poliklinik für Dermatologie und Venerologie
der Universität zu Köln
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg
Identifizierung und Phänotypisierung autoantigenspezifischer
Plasmazellen bei Patienten mit Bullösem Pemphigoid
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung der Würde eines doctor rerum medicinalium
der Hohen Medizinischen Fakultät der
Universität zu Köln
vorgelegt von
Susanne László
aus Halle/Saale
Promoviert am 22. September 2010
Gedruckt in Köln 2010
von
M&S Copy Druckhaus GbR
Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln
Dekan
: Universitätsprofessor Dr. med. J. Klosterkötter
1. Berichterstatter : Professor Dr. med. N. Hunzelmann
2. Berichterstatter : Universitätsprofessor Dr. med. M. Paulsson
Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige
Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt
habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind
als solche kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des
Manuskriptes habe ich keine Unterstützungsleistungen erhalten.
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht
beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/ eines
Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar
noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit
dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen.
Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in
gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Köln, den 22. September 2010
-----------------------------------------(Unterschrift der Doktorandin)
Die in dieser Arbeit angegebenen Experimente sind nach entsprechender Anleitung
durch Herrn Professor. Dr. med. N. Hunzelmann von mir selbst ausgeführt worden.
Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente sind von mir mit Unterstützung
der biologisch-technischen Assistentin Frau Susanne Neumann durchgeführt
worden.
Danksagung
Danksagung
Danke
Herrn Prof. Dr. Dr. Thomas Krieg danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes an der
Klinik und Poliklinik für Dermatologie und Venerologie der Universität zu Köln.
Herrn Prof. Dr. Nico Hunzelmann für die Überlassung des Themas, für das stetige Interesse
am Fortgang der Arbeit und für die freundliche Unterstützung, diese Doktorarbeit zu
realisieren. Ebenso Herrn Prof. Dr. Mats Paulsson für die freundliche Bereitschaft, das
Zweitgutachten dieser Arbeit zu erstellen.
Einen besonderen Dank gilt meinen Mädels aus der Arbeitsgruppe: Susanne Neumann und
Vicky Schlossberg dafür, dass sie mich stets fachlich sowie menschlich in vielerlei Hinsicht
unterstützt und viel zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Meinen engsten Arbeitskollegen/innen (Yvonne, Anna, Tina, Dan, Kristina, Doreen, Micha,
Stefan und den ganzen Rest): danke für die vielen wunderbaren Stunden, die wir
miteinander verbracht haben und für die zahlreichen guten und immer lieb gemeinten sowohl
wissenschaftlichen als auch privaten Ratschläge!
Meiner Familie, die ich während der Doktorarbeit leider viel zu selten gesehen habe. Papa,
an dieser Stelle ein ganz großes Dankeschön für deine Unterstützung, dein Vertrauen und
deine Liebe in all den Jahren!
Meinem Freund Jörg, für seine liebevolle Unterstützung und enorme Geduld, die er Tag und
Nacht aufbringen musste, um meine Launen zu ertragen. ILD!
Und zu guter Letzt möchte ich dir, liebste Astrid, für unsere zwar kurze, aber dafür umso
intensivere Zeit im Labor, für deine stets fachlich kompetente Beratung und für deine
immerwährende freundliche und hilfsbereite Art danken! Danke, dass ich dich kennen lernen
durfte!
Oh happy day.
Edward
Hawkins
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Einleitung
1.1
Das Immunsystem
1
1.1.1
Das humorale Immunsystem
2
1.1.2
Die humorale Autoimmunität
9
1.2
Blasenbildende Autoimmunerkrankungen
12
1.2.1 Das Bullöse Pemphigoid (BP)
13
1.3
14
Kollagen XVII (BP180)
1.3.1 Struktur und Funktion des Kollagen XVII (BP180)
14
1.3.2 Kollagen XVII als Autoantigen
17
1.4
18
Ziel dieser Arbeit
Materialien
2.1
Verwendete Bakterienstämme
19
2.2
Zelllinie
19
2.3
Bakterienmedien
20
2.4
Expressions- und Klonierungsvektoren
20
2.5
Antikörper
23
2.6
Enzyme
24
2.7
Oligonukleotide
25
2.8
Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
25
2.9
Allgemeine Puffer
27
2.10 Geräte
28
2.11 DNA- und Proteinmarker
29
2.12 Patientendaten und Kontrollpersonendaten
30
Inhaltsverzeichnis
Methoden
3.1
Molekularbiologische Methoden
31
3.1.1 Agarosegelelektrophorese
31
3.1.2 Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe des PCR-Verfahrens
32
3.1.3 Restriktionsverdau
33
3.1.4 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
35
3.1.5 Ligation von DNA-Fragmenten
35
3.1.6 Transformation in E.coli TOP10F’ und BL21(DE3) Zellen
36
3.1.7 Identifizierung rekombinanter Klone
36
3.1.8 Isolierung von Plasmid-DNA
37
3.1.9 Sequenzierung von DNA
37
3.1.10 Konzentrationsbestimmung von DNA
37
3.2
38
Proteinbiochemische Methoden
3.2.1 Proteinexpression
38
3.2.2 Proteinaufreinigung mittels Affinitätschromatographie
38
3.2.3 Dialyse
39
3.2.4 TCA-Fällung
40
3.2.5 SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
40
3.2.6 Immuno-Blot
41
3.2.7 Proteinquantifizierung
42
3.2.8 Trocknen von Gelen
43
3.2.9 PMF-Analyse (Peptide mass fingerprinting)
44
3.2.10 Fluorchrom-Markierung der rekombinant hergestellten NC16a-Domäne mit
Alexa Fluor 647
44
3.2.11 Statistik: T-Test
44
3.3
45
Blutzellen
3.3.1 Peripheres Blut
45
3.3.2 Präparation von mononuklearen Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC)
+
+
45
3.3.3 Anreicherung von CD19 - und CD138 Zellen und Färbungen
45
3.4
46
Durchflusszytometrie
3.4.1 Durchflußzytometrische Bestimmung der Zellzahl in einer Probe
47
3.5
48
Zellkultur
3.5.1 Arbeiten in der Zellkultur
48
Inhaltsverzeichnis
3.5.2 Auftauen von Zellen
48
3.5.3 Passagieren von Zellen
48
3.5.4 Transfektion von EBNA-293 Zellen
49
Ergebnisse
4.1
Rekombinante Herstellung der NC16a-Domäne des Kollagen XVII
51
4.1.1
Expressionsansatz in einem eukaryotischen Expressionssystem
53
4.1.2
Prokaryotische Expression: Klonierungsstrategie
54
4.1.2.1 Amplifikation der NC16a-Domäne
57
4.1.3
57
Klonierung der NC16a-Domäne in den Klonierungsvektor pDrive
4.1.3.1 Transformation von E.coli TOP10F’ Zellen
58
4.1.4
Klonierung der NC16a-Domäne in den Expressionsvektor pRSET A
59
4.1.5
Transformation von BL21(DE3) Zellen und rekombinante Expression der
4.1.6
NC16a-Domäne
60
Aufreinigung der NC16a-Domäne mittels Affinitätschromatographie
63
4.1.6.1 PMF-Analyse der NC16a-Domäne
64
4.1.6.2 Überprüfung der Antigenität der NC16a-Domäne
66
4.1.7
Fluorchrom-Markierung der NC16a-Domäne mit Alexa Fluor 647
68
4.2
Nachweis NC16a-spezifischer Gedächtnis-B-Zellen bei Patienten
mit Bullösem Pemphigoid
70
4.2.1
Detektion IgM+ B-Zellen spezifisch für NC16a
72
4.3
Anreicherung und Analyse zirkulierender CD138+ Plasmazellen
bei Patienten mit Bullösem Pemphigoid
73
4.3.1
Magnetische Anreicherung von CD138+ Zellen
73
4.3.2
Intrazelluläre Kontrollfärbung von CD138+ Zellen
4.3.3
75
+
Identifizierung und Phänotypisierung der angereicherten CD138 B-Zellen
76
+
4.3.3.1 Korrelation zwischen der Frequenz von HLA-DR Zellen und der Krankheits-
4.3.4
aktivität bei Patienten mit Bullösem Pemphigoid
83
Identifizierung NC16a-spezifischer Plasmablasten
84
Diskussion
5.1
Rekombinante Expression der NC16a-Domäne des Kollagen XVII
88
5.1.1
Expressionsansatz in einem eukaryotischen Expressionssystem
91
5.1.2
Prokaryotische Expression der NC16a-Domäne
93
Inhaltsverzeichnis
5.2
Detektion NC16a-spezifischer Gedächtnis-B-Zellen
5.3
Anreicherung und Analyse zirkulierender CD138+ B-Zellen bei
95
Patienten mit Bullösem Pemphigoid
98
+
5.3.1 Identifizierung der CD138 Zellen aus dem peripheren Blut
99
+
5.3.2 Detektion von autoantigenspezifischen IgG-sekretierenden CD138 Zellen
100
5.3.3 Identifizierung autoantigenspezifischer HLA-DR++ Plasmablasten
103
6
Zusammenfassung
115
7
Summary
117
8
Literaturverzeichnis
119
9
Abbildungsverzeichnis
132
10
Tabellenverzeichnis
134
11
Lebenslauf
135
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
Amp
Ampicillin
AS
Aminosäure
ASC
antibody secreting cell
APC
Allophycocyanin
APS
Ammoniumpersulfat
BSA
bovine serum albumin
BP
Bullöses Pemphigoid
BP180
Bullöses Pemphigoid 180 kDa, andere Bezeichnung für BPAG-2
BP230
Bullöses Pemphigoid 230 kDa, andere Bezeichnung für BPAG-1
BPAG-1
Bullöses Pemphigoid Antigen-1
BPAG-2
Bullöses Pemphigoid Antigen-2
BCA
bicinchoninic acid
bp
Basenpaar
bp-L
Basenpaar-Leiter
bzw.
beziehungsweise
CD
cluster of differentiation
CXCR
chemokine receptor
DF
Durchfluss
d.h.
das heißt
DMEM
Dulbecco’s Mod Eagle Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
desoxyribonucleic acid
E
Elution
EBNA
Epstein-Barr nuclear antigen
ECL
Enhanced Chemoluminescence Reaction
E.coli
Escherichia coli
EDTA
Ethyldiamintetraessigsäure
FACS
fluorescence activated cell sorting
FCS
fetal calf serum
FITC
Fluorescein isothiocyanate
FSC
forward scatter
g
Gramm
Abkürzungsverzeichnis
GST
Glutathion-S-Transferase
h
Stunde
His
Histidin
HLA
Human leukocyte antigen
HRP
horseradish peroxidase
ic
intracellular
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IMAC
Metallchelat-Affinitätschromatographie
IPTG
Isopropyl--D-thiogalactopyranosid
IZD
intrazelluläre Domäne
K
Patienten aus Köln
kb
Kilobasen
kb-L
Kilobasen-Leiter
KCl
Kaliumchlorid
kDa
Kilodalton
Ko
Kontrolle
l
Liter
LB-Medium
Luria-Bertani Medium
MACS
magnetic cell sorting
M
Molar
mA
Milliampère
MCS
multiple cloning site
mg
Milligramm
MgCl 2
Magnesiumchlorid
MHC
major histocompatibilty complex
min
Minute
ml
Milliliter
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
n
Anzahl
NaCl
Natriumchlorid
NaOH
Natronlauge
n.b.
nicht bestimmt
NC
nicht-kollagenös
NEB
New England Biolabs®
ng
Nanogramm
Abkürzungsverzeichnis
nm
Nanometer
n.s.
nicht signifikant
OD
Optische Dichte
Pa
Patient
PBMC
mononuclear cells of the peripheral blood
PBS
phosphate buffered saline
PBST
PBS + Tween 20
PCR
Polymerase Chain Reaction
PE
Phycoerythrin
PMF
Peptide mass fingerprinting
PMSF
Phenylmethansulfonylfluorid
R
gate
rpm
rounds per minute
RT
Raumtemperatur
SDS
Sodium dodecyl sulfate
sec
Sekunde
SLE
systemic lupus erythematosus
SSC
sideward scatter
Tab.
Tabelle
TBE
tris buffered EDTA
TCA
trichloroacetic acid
TE
Tris-EDTA
TEMED
N,N,N`,N`,-Tetramethylethylendiamin
TM
Transmembran
Tris
Tris-(hydroxymethyl)methylamine
U
Units
Ü/N
über Nacht
ÜS
Überstand
UV
Ultraviolett
V
Volt
(v/v)
volume per volume
(w/v)
weight per volume
WB
Western Blot
vgl.
vergleiche
WF
Waschfraktion
z.B.
zum Beispiel
ZMMK
Zentrum für molekulare Medizin Köln
Einleitung
Kapitel 1
Einleitung
1.1
Das Immunsystem
Das Immunsystem des menschlichen Körpers ist ein komplexes System von Organen,
Geweben und Zellen. Es ermöglicht dem Organismus eindringende, pathogene Erreger
viraler, bakterieller oder anderer Herkunft abzuwehren und veränderte, körpereigene
Strukturen zu eliminieren [Munk, 2002; Goldsby et al., 2000]. Das Immunsystem lässt sich in
eine spezifische und eine unspezifische Abwehr unterteilen. Bei der unspezifischen
Immunantwort greifen zuerst die Mechanismen der natürlichen oder angeborenen Immunität,
die sofort zur Verfügung stehen, somit nicht induziert werden müssen. Im Verlauf dieser
ersten Phase der Immunantwort werden Mediatoren freigesetzt, die die frühe induzierte
Immunantwort einleiten. Können auch die Effektormechanismen der frühen induzierten
Immunantwort die Infektion nicht beseitigen, wird die adaptive (erworbene) oder spezifische
Immunantwort initiiert [Munk, 2002].
Die
spezifische
Abwehrleistung
des
menschlichen
Organismus
beruht
im
Wesentlichen auf den Funktionen der Zellen des lymphatischen Systems, der Lymphozyten
(etwa 15-50% der peripheren Blutzellen). Sie entwickeln sich ab der Fetalzeit als unreife
Lymphozytenvorläuferzellen aus pluripotenten Stammzellen in Leber und Knochenmark.
Später wandern die Lymphozyten in die primären lymphatischen Organe (Knochenmark,
Thymus) ein. Dort vermehren und entwickeln sie sich, indem sie verschiedene Zellstadien
durchlaufen und ihre arttypischen Eigenschaften ausbilden. Diesen Prozess bezeichnet man
als
Lymphozytenprägung.
Die
noch
unreifen
Zellen wandern
aus
den primären
Lymphorganen auf dem Blutweg zu den sekundären lymphatischen Organen, den
Lymphknoten und der Milz. Dort kommt es zu einem ersten Antigenkontakt. Die Bindung von
Antigenen an die hochspezifischen Antigen-Rezeptoren der verschiedenen Lymphozyten
führt zur Proliferation, das heißt zur klonalen Vermehrung der antigenspezifischen
Lymphozyten und ihrer anschließenden Differenzierung zu Effektorzellen. Die differenzierten
Lymphozyten setzen verschiedene Effektormechanismen in Gang, die in der Regel zur
Eliminierung der Infektion führen (Effektorphase) [Goldsby et al., 2000; Munk, 2002].
1
Einleitung
Lymphozyten verfügen über zwei verschiedene Systeme, welche auf die Erkennung von
extra- und intrazellulären Krankheitserregern spezialisiert sind. T-Lymphozyten oder T-Zellen
(T für Thymus-abhängig) stellen eines der zwei Systeme an Blutzellen dar, die eine
entscheidende Rolle in der Immunabwehr spielen. Sie verfügen über spezielle Rezeptoren
auf ihrer Zelloberfläche, die T-Zell-Rezeptoren, die z.B. Peptidfragmente intrazellulärer
Krankheitserreger erkennen. Solche Fragmente gelangen mithilfe der Glykoproteine des
Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) an die Zelloberfläche [Moss et al, 1992; Rojo et
al, 2008]. Als primäres lymphatisches Organ erlaubt der Thymus die gezielte Ausbildung von
zwei verschiedenen T-Zelltypen mit unterschiedlichen Effektorfunktionen, welche die
Peptidfragmente erkennen, die ihnen von zwei Klassen der MHC-Moleküle präsentiert
werden. Die zytotoxischen T-Zellen (CD8+) erkennen Zielzellen und töten sie ab, die T H 1und T-Helferzellen (CD4+) aktivieren Makrophagen und vor allem B-Zellen [van de Berg et al,
2008]. Sie stimulieren die humorale Antwort gegen komplexe Antigene beziehungsweise
induzieren über die Stimulation von B-Zellen eine zelluläre Immunabwehr. Deshalb sind die
T-Lymphozyten sowohl für die humorale als auch für die zellvermittelte adaptive
Immunantwort von entscheidender Bedeutung.
Das zweite und für diese Arbeit grundlegendere System an Blutzellen sind die BLymphozyten oder B-Zellen (ursprünglich für Bursa Fabricii). Sie sind die eigentlichen
Effektorzellen der humoralen Immunantwort. Im Folgenden soll daher vor allem näher auf die
Entwicklung der B-Zellen, auf ihre Funktion und ihren Beitrag zur adaptiven Immunität
eingegangen werden.
1.1.1
Das humorale Immunsystem
Die B-Zell-Entwicklung tritt sowohl im Knochenmark als auch in peripheren lymphatischen
Organen wie z.B. der Leber auf. Die entscheidenden Signale für die Entwicklung erhalten die
sich entwickelnden Lymphozyten von so genannten Stromazellen [Welch et al, 1990]. Bei
der B-Zellentwicklung ist die Bildung eines B-Zell-Rezeptors (BCR; die membrangebundene
Form des Antikörpers) von großer Wichtigkeit. Denn nur mit diesem Antigenrezeptor sind
reife B-Zellen später in der Lage, fremde Antigene zu erkennen und durch die Bildung von
entsprechenden Antikörpern feindliche Strukturen zu bekämpfen. Die Antigenspezifität des
Rezeptors wird durch die Verknüpfung der V-, D- und J-Gensegmente bestimmt, weshalb
2
Einleitung
der Prozess als VDJ-Rekombination bezeichnet wird. Die Segmente, die den Antigen
bindenden Teil des B-Zell-Rezeptors bilden, werden dabei neu geordnet. Der gesamte
Rezeptor besteht aus zwei identischen leichten Proteinketten mit einer Größe von jeweils
25 kDa und zwei identischen schweren Proteinketten (jeweils 50 kDa), die über
Disulfidbindungen verknüpft sind. Die Umordnung der Gensegemente erfolgt zuerst bei der
schweren Kette des B-Zell-Rezeptors, danach folgt die Verknüpfung der V- und JGensegmente der leichten Kette [Ollila und Vihinen, 2005].
Im Knochenmark durchlaufen die B-Zellen verschiedene B-Zell-Stadien, wobei das
erste Stadium durch die Pro-B-Zellen dargestellt wird. Hier erfolgt die GensegmentUmlagerung der schweren Kette. Die Bildung einer schweren µ-Kette führt zum Eintritt in das
Prä-B-Zell-Stadium. In diesem Entwicklungsstadium wird die µ-Kette als Teil des B-ZellRezeptors auf der Oberfläche der Zelle exprimiert. Diese Zellen teilen sich und beginnen mit
der V-J-Umordnung der leichten Kette. Nach Umlagerung dieser Gensegmente geht die
Zelle ins Stadium einer unreifen B-Zelle über. Die unreifen B-Zellen exprimieren auf ihrer
Zelloberfläche den B-Zell-Rezeptor der Klasse M (IgM) und sind bereits in der Lage,
Antigene zu binden. Nach diesem Kontrollpunkt verlassen die Zellen das Knochenmark als
transitionale B-Zellen und reifen zu Follikel-B-Zellen oder B-Zellen der Marginalzone heran
[Carsetti, 2004; Carsetti et al, 2004; Hardy und Hayakawa; 2001]. Die finalen,
antigenabhängigen Stadien der B-Zell-Entwicklung führen zur Bildung der Antikörper
produzierenden Plasmablasten (Vorläuferzellen) und Plasmazellen, die Effektorzellen der
humoralen
Immunität
[Cambier
et
al,
2007].
Während
die
noch
teilungsfähigen
Plasmablasten vor allem in der Peripherie zirkulieren, sind die enddifferenzierten
Plasmazellen im Knochenmark lokalisiert. In Abbildung 1.1 ist ein schematischer Überblick
über die B-Zell-Entwicklung dargestellt.
3
Einleitung
Abb. 1.1: Schematische Darstellung der B-Zell-Entwicklung.
Die B-Zell-Entwicklung wird typischerweise als ein linearer Prozess durch verschiedene Differenzierungsstadien
dargestellt: die verschiedenen Prozesse sind assoziiert mit der Anordnung des B-Zell-Rezeptors und der
Expression zahlreicher Oberflächenmoleküle. Die verschiedenen Schritte der VDJ-Rekombination und das
Expressionsmuster dieser Oberflächenmoleküle dienen der Charakterisierung des B-Zell-Entwicklungsstadiums.
Nach Antigenkontakt können sich die Plasmazellen sowohl aus den naiven B-Zellen der
Marginalzone, den Follikel-B-Zellen, den aktivierten B-Zellen des Keimzentrums sowie aus
den Gedächtnis-B-Zellen heraus entwickeln (vgl. Abb. 1.2). Welche B-Zell-Untereinheiten
sich nun endgültig differenzieren, ist abhängig von der Natur des Antigens, von dessen
Menge und Form, und dem Ort des Antigenkontakts [Shapiro-Shelef und Calame, 2005]. Die
ersten B-Zellen, die auf ein Antigen durch die Differenzierung in Plasmazellen antworten,
stammen von der Marginalzone ab [Pillai et al, 2004]. Ähnlich schnell können auch die
zirkulierenden, reifen Follikel-B-Zellen antworten. Nach Antigenkontakt und Unterstützung
von T-Helferzellen durchlaufen die Follikel-B-Zellen Proliferation und plasmazytische
Differenzierung und bilden extrafollikuläre Bereiche, in denen sie sich zu den Plasmablasten
und später dann zu den Plasmazellen differenzieren. Zwei Tage nach Immunisierung mit
einem T-Zell-abhängigen Antigen, können entlang der Peripherie des Lymphknotens diese
extrafollikulären Bereiche beobachtet werden. Diese expandieren bis Tag 8 nach
Immunisierung und verkleinern sich dann wieder [Jacob et al, 1991]. Plasmazellen, die
sowohl durch B-Zellen der Marginalzone als auch durch Follikel-B-Zellen gebildet werden,
besitzen keine somatisch mutierten Immunglobulingene, sind kurzlebig und durchlaufen die
Apoptose. Sie liefern lediglich eine schnelle, initiale Antwort auf Pathogene [Smith et al,
1996].
4
Einleitung
Wenn Follikel-B-Zellen in Kontakt mit einem Antigen treten und durch T-Helferzellen
unterstützt werden, bietet die Etablierung eines Keimzentrums für diese B-Zell-Untereinheit
eine zweite Entwicklungsmöglichkeit [McHeyzer-Williams et al, 2001, 2003]. Keimzentren
stellen im Inneren von Lymphfollikeln spezialisierte Areale dar, in denen die B-Zellen
mehrere Proliferationsrunden durchlaufen (Keimzentrumsreaktion). Diese Follikel-B-Zellen
differenzieren zu langlebigen Gedächtnis-B-Zellen und noch teilungsfähigen Plasmablasten.
Letztere besitzen die Fähigkeit, im Knochenmark langlebige Plasmazellen zu werden. Die
Gedächtnis-B-Zellen und Plasmazellen haben somatisch mutierte, hoch affine B-ZellRezeptoren und exprimieren klassengewechselte Immunglobulinisotypen [Shapiro-Shelef
und Calame, 2005; Radbruch et al, 2006].
Abb. 1.2: Die Bildung der Plasmazellen.
Eine Woche nach Antigenkontakt differenzieren B-Zellen der Marginalzone in Plasmazellen. Anschließend
differenzieren naive Follikel-B-Zellen ebenfalls in Plasmazellen. Die meisten der extrafollikularen Plasmazellen,
die in dieser frühen Immunantwort gebildet werden, sind kurzlebig. Einige aktivierte Follikel-B-Zellen bilden ein
Keimzentrum. Plasmazellen, die aus B-Zellen des Keimzentrums entstanden sind, stammen entweder von
Gedächtnis-B-Zellen ab oder entwickeln sich direkt aus dem Keimzentrum heraus. Plasmazellen, die aus einer
solchen Keimzentrumsreaktion heraus entstehen, besitzen die Fähigkeit, langlebig zu werden, falls sie eine
geeignete Überlebensnische im Knochenmark finden.
5
Einleitung
Die B-Zell-Entwicklung ist ferner assoziiert mit der Expression einer Reihe von
Oberflächenproteinen. Jedes dieser Oberflächenmoleküle spielt eine entscheidende Rolle für
das weitere Schicksal der Zelle. CD34 (CD = cluster of differentiation) ist ein Typ I
Transmembranglykoprotein, das an CD62L (L-Selectin) und CD62E (E-Selectin) bindet und
aufgrund dessen am zellulären Transport beteiligt ist. CD34 wird von einer kleinen
Zellpopulation
des
Knochenmarks
exprimiert
(1-4%),
einschließlich
von
den
hematopoetischen Stammzellen. CD10, ebenfalls bekannt als Neprilysin, ist eine Typ II
Membranglykoproteinmetalloprotease. Aufgrund seiner Proteaseaktivität reguliert CD10
zelluläre Antworten auf Peptide, Hormone und Zytokine. Die Inhibition der CD10-Aktivität
verstärkt die B-Zell-Reifung. CD19 ist ein Zelloberflächenglykoprotein der ImmunglobulinSuperfamilie, das als einziges Molekül durch die gesamte B-Zell-Entwicklung hinweg - vom
Pro-B-Zell- bis hin zum Prä-Plasmazell-Stadium - exprimiert wird [Haas und Tedder, 2005;
vgl. Abb. 1.2]. CD19 existiert in einem Komplex mit CD21 (CR2), CD81 (TAPA-1) und
Leu13. Mit Hilfe von CD21 kann CD19 das C3-Komplement-Spaltprodukt C3d binden: die
simultane Bindung von IgM und CD19 an einen C3d-Antigen-Komplex befähigt CD19 und
den B-Zell-Rezeptor (BCR) zur Interaktion und stellt so eine Verbindung zwischen
angeborenen und adaptiven Immunantworten her. CD19-BCR-Interaktionen erlauben der
Zelle, die Anzahl an Antigenrezeptoren zu reduzieren, die alle stimuliert werden müssten, um
eine Aktivierung der Zelle hervorzurufen. Eine Co-Aktivierung reduziert zudem den
Schwellenwert, der normalerweise für die B-Zell-Proliferation als Antwort auf ein Antigen
benötigt wird. CD20 gilt als Mitglied der CD20/FcRI-Superfamilie. Das Oberflächenmolekül
wirkt als Untereinheit des B-Zell-Ca2+-Kanals und reguliert somit den Zell-Zyklus-Ablauf.
CD20 kann direkt mit den Klasse I- und II-Molekülen des Haupthistokompatibilitätskomplexes
(MHC) interagieren und ist neben der B-Zell-Entwicklung an der Gewebelokalisation,
Proliferation, Affinitätsreifung und an den T-Zell-abhängigen Antikörperantworten beteiligt.
CD24 ist ein Glycophosphatidylinositol-gekoppeltes Sialoprotein, das als Ligand für PSelectin (CD62P) dient. Dieses Molekül wird auf der Oberfläche von Vorläufer-, unreifen und
reifen B-Zellen exprimiert. Diese Expression nimmt in aktivierten B-Zellen ab und geht in
Plasmazellen vollständig verloren. CD24 spielt eine wichtige Rolle bei der humanen B-ZellDifferenzierung in Plasmazellen. CD27 ist ein Tumornekrosefaktor(TNF)-Rezeptor und
gehört somit zur TNF-Rezeptor-Superfamilie. Dieses Oberflächenprotein bindet an seinen
Liganden CD70 und ist entscheidend für die Regulation der B-Zell-Aktivierung und
Immunglobulin-Synthese. CD38 als ein bifunktionales Enzym wird auf Prä-B-Zellen,
aktivierten B-Zellen und Plasmazellen exprimiert, jedoch nicht auf unreifen (transitionalen)
6
Einleitung
und reifen B-Zellen. Antikörper, die gegen CD38 gerichtet sind, induzieren B-ZellProliferation und schützen die B-Zellen vor Apoptose [Berek et al]. CD138, ebenfalls bekannt
als Syndecan-1, gehört zur Familie der Heparan-Sulfat-Proteoglykane und ist als
extrazelluläres Matrixprotein an vielen zellulären Funktionen wie Zell-Zell- und Zell-MatrixAdhäsion beteiligt. Innerhalb des hematopoetischen Systems wird CD138 ausschließlich von
Plasmazellen und deren Vorläuferzellen, den Plasmablasten, exprimiert und ist somit für
diese Arbeit von besonderem Interesse [Elenius et al, 1990; Bernfield et al, 1992; Vainio et
al, 1989, 1992; Wijdenes et al; 1996]. Abbildung 1.3 zeigt die phänotypische Veränderung
dieser Oberflächenmarker während der B-Zell-Entwicklung, Tabelle 1.1 fasst gesondert die
unterschiedlichen Merkmale der Plasmablasten und Plasmazellen zusammen.
Knochenmark (BM)
OberflächenMarker
Stammzelle
Pro-B-Zelle
Prä-B-Zelle Transitionale
B-Zelle
Peripherie
Reife naive
B-Zelle
Aktivierte
B-Zelle
BM
Gedächtnis
B-Zelle
Plasmablast
Plasmazelle
CD10
CD19
CD20
CD21
CD24
CD27
CD34
CD38
CD138
MHCII
sIgM
sIgD
sIgG
icIgG
Abb. 1.3: Phänotypische Veränderung während der B-Zell-Entwicklung (nach Mei et al, 2007).
Das jeweilige B-Zell-Differenzierungsstadium ist definiert durch die Expression bestimmter Oberflächenproteine.
Die repräsentativen Stadien der B-Zell-Entwicklung, ihre morphologischen Merkmale und ihre Gewebelokalisation
sind aufgeführt. Um zwischen den einzelnen B-Zell-Untereinheiten unterscheiden zu können, werden Zeitrahmen
für die Expression der unterschiedlichen Marker mittels eines Balkens dargestellt. Die Intensität der Schattierung
korreliert mit dem Expressionslevel. Hellgraue, gestrichelte Balken: sehr geringes Expressionslevel.
7
Einleitung
Tab. 1.1: Charakterisierung von (Auto)antikörper-sezernierenden Zellen (nach Hiepe und Dörner, 2005).
Antikörpersekretion
Proliferationsfähigkeit
Expression von Oberflächen-Ig
Nachweis von intrazellulärem Ig
CD138-Expression
CD38-Expression
CD20-Expression
CD19-Expression
CD27-Expression
MHC Klasse II-Expression
Ansprechbarkeit auf Immunsuppressiva
Lokalisation
Plasmablast
Plasmazelle
ja
ja
wenig
+++
+++
++/+++
++
+++
+++
ja
ja
nein
nicht nachweisbar
+++
+++
+++
+
+++
+
nein
Knochenmark
sek. lymph. Organe
peripheres Blut
entzündetes Gewebe
sek. lymph. Organe
entzündetes Gewebe
Die humorale Immunität wird von spezifischen Glykoproteinen, den Antikörpern (spezifischer
Anteil des humoralen Immunsystems), vermittelt. Diese werden in großen Mengen von den
Plasmazellen synthetisiert und ausgeschüttet. Antikörper können native Antigene erkennen
und direkt an Pathogene binden. Dadurch werden Pathogene markiert (opsonisiert) und der
Lyse durch das Komplementsystem (unspezifischer Anteil des humoralen Immunsystems)
oder der Erkennung und Phagozytose durch phagozytierende Leukozyten zugänglich
gemacht [Munk, 2002]. Für die Induktion der Produktion von Antikörpern sind T-Helferzellen
erforderlich, die spezifisch für ein Peptidfragment des Antigens sind, das von der B-Zelle
erkannt wird [MacLennan et al, 1997].
T-Helferzellen stellen eine heterogene Gruppe der T-Lymphozyten dar und werden
anhand der von ihnen ausgeschütteten Zytokine in zwei wichtige Subpopulationen eingeteilt,
die verschiedene Funktionen aufweisen: die Typ1-T-Helferzellen sind an der zellulären
Immunantwort beteiligt, während die Typ2-T-Helferzellen eine entscheidende Rolle bei der
humoralen Immunität spielen. Als Typ1-T-Zellen werden CD4+ und CD8+ Lymphozyten
bestimmt, die typischerweise Interferon- (IFN-), IL-2 und TNF-α ausschütten. Entsprechend
werden CD4+ oder CD8+ Lymphozyten, die als typische Zelleigenschaft die Ausschüttung der
Zytokine IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 haben, als Typ2-T-Zellen bezeichnet. Die wichtigste
Funktion der Typ2-polarisierten CD4+ T-Zellen ist die Interaktion mit B-Lymphozyten. Diese
Interaktion findet über die Zytokine und über zellständige Moleküle statt, und führt bei den B-
8
Einleitung
Zellen nicht nur zur Aktivierung, Proliferation und Differenzierung, sondern letztendlich auch
zur Produktion und Ausschüttung von Immunglobulinen. Im Rahmen der Aktivierung und
Differenzierung der B-Zellen hat das Zytokin IL-4 eine besondere Funktion: es induziert den
Klassen- oder Isotypenwechsel zu den neutralisierenden Antikörperklassen [Mosmann et al,
1986; Stavnezer, 1996].
Das in einer frühen Phase der humoralen Immunantwort gebildete IgM spielt bei dem
Schutz vor Infektionen im Blut eine wesentliche Rolle. Später gebildete Isotypen wie IgG
diffundieren hingegen in die Gewebe. Bestimmte Pathogene besitzen hochrepetitive Antigendeterminanten und exprimieren zudem Mitogene, die stets B-Zellen stimulieren. Dadurch
können die Pathogene auch ohne Hilfe von T-Zellen die Bildung von IgM und geringer
Mengen an IgG auslösen (TI-Antigene, thymus independent). Multimeres IgA wird in der
Lamina Propria gebildet und durch epitheliale Oberflächen geschleust, während das in
kleinen Mengen synthetisierte IgE stark an die Oberfläche von Mastzellen bindet. Antikörper,
die mit hoher Affinität an definierten Stellen von Bakterien, Viren oder Toxinen binden,
können diese neutralisieren [Robbins, 1986; Roost et al, 1995]. Meistens werden Erreger
und ihre Produkte jedoch von Phagozyten aufgenommen, abgebaut, auf diese Weise
zerstört und aus dem Körper entfernt. Antikörper, die ein Pathogen umhüllen, binden an FcRezeptoren auf Phagozyten und führen so zur Aufnahme und Zerstörung des Pathogens.
Sie können aber auch durch Aktivierung des Komplementsystems die Zerstörung von
krankhaften Erregern auslösen. Komplementfaktoren können Pathogene für die Aufnahme
durch Phagozytose opsonisieren, Phagozyten zu Infektionsherden locken und Pathogene
direkt zerstören, indem sie in deren Oberfläche Poren bilden. Häufig sorgen Rezeptoren für
Komplementfaktoren und Fc-Rezeptoren gemeinsam dafür, dass Krankheitserreger und
Immunkomplexe aufgenommen und zerstört werden [Ravetch, 1997; Cooper, 1985]. Die
humorale Immunantwort bekämpft somit infizierende Erreger durch die Bildung spezifischer
Antikörper, deren Effektorwirkungen vom jeweiligen Isotyp abhängen und für alle Pathogene
gleich sind, die von Antikörpern mit einem bestimmten Isotyp gebunden werden.
1.1.2 Die humorale Autoimmunität
Autoimmunität ist definiert als eine zelluläre und/oder spezifische, adaptive humorale
Immunantwort gegen körpereigene Antigene (Autoantigene) [Rose, 1992]. Bei einer
Autoimmunantwort werden, ebenso wie bei einer gewöhnlichen protektiven, adaptiven
9
Einleitung
Immunantwort gegen ein Fremdantigen, Antigen-spezifische B- und T-Lymphozyten
rekrutiert und expandiert. Die Besonderheit einer Autoimmunantwort liegt darin, dass die
meisten Autoantigene kontinuierlich und in nahezu unbegrenzter Menge vorliegen. Sie
stimulieren das Immunsystem, können aber nicht komplett eliminiert werden. Die Folge ist,
dass die Immunreaktion chronische, entzündliche Gewebeschädigungen hervorruft, die
tödlich enden können [Peter et al, 1999]. Die Mechanismen, die bei Autoimmunkrankheiten
die Gewebeschäden verursachen, sind im Wesentlichen dieselben wie bei der schützenden
Immunität. Eine adaptive Immunantwort wird normalerweise durch die Aktivierung von
Antigen-spezifischen T-Zellen eingeleitet. Man vermutet, dass dies bei der Autoimmunität in
gleicher Weise geschieht. T-Zell-Reaktionen gegen körpereigene Antigene können
Gewebeschäden entweder direkt oder indirekt hervorrufen. Zytotoxische T-Zellen und eine
unangemessene Aktivierung von Makrophagen durch T-Helferzellen können ausgeprägte
Gewebeschäden verursachen. Gleichzeitig kann die Unterstützung von autoreaktiven BZellen und T-Zellen schädliche Antikörperreaktionen auslösen. Autoimmunreaktionen, unter
anderem ausgelöst durch Autoantikörper, sind letztendlich eine Folge des offenen
Repertoires an B- und T-Zell-Rezeptoren. Dieses Repertoire erlaubt den Zellen, jedes
beliebige Pathogen zu erkennen. Obwohl aus diesem Repertoire die meisten Rezeptoren,
die in der Entwicklungsphase körpereigene Antigene mit hoher Affinität binden, beseitigt
werden, sind immer noch Rezeptoren vorhanden, die einige Autoantigene mit niedriger
Affinität binden [Goodnow, 1997]. Oftmals handelt es sich hierbei um Antigene, die aus
Bruchstücken von abgestorbenen oder nicht mehr funktionstüchtigen Zellen stammen, vom
Immunsystem für gewöhnlich toleriert werden und eigentlich aus dem Blutkreislauf entfernt
werden sollen.
Wodurch die Autoimmunität nun tatsächlich ausgelöst wird, ist bisher noch
unbekannt. Man vermutet jedoch, dass an der Anfälligkeit für Autoimmunerkrankungen
sowohl Umwelt- als auch Erbfaktoren beteiligt sind. Bei den genetischen Faktoren richtet
man das Augenmerk besonders auf die MHC-Gene (major histocompatibility complex). Viele
der Autoimmunerkrankungen hängen mit dem HLA-Typ (human leukocyte antigen)
zusammen. Bei den meisten Krankheiten ist die Anfälligkeit am häufigsten mit MHCKlasse II-Allelen gekoppelt. Ein Zusammenhang zwischen dem MHC-Genotyp und
Autoimmunerkrankungen erscheint verständlich, da an allen Autoimmunreaktionen T-Zellen
beteiligt sind und die Fähigkeit der T-Zellen, auf ein bestimmtes Antigen zu reagieren, stets
vom MHC-Genotyp abhängt [McDevitt, 2000]. Mit Hilfe eines einfachen Modells lässt sich
10
Einleitung
diese Korrelation recht gut erklären: die Anfälligkeit gegenüber einer Autoimmunkrankheit
hängt demnach davon ab, mit welcher Effizienz die verschiedenen Allelvarianten der MHCMoleküle den autoreaktiven T-Zellen Autoantigen-Peptide präsentieren. Dies würde mit der
bisher bekannten Beteiligung von T-Zellen bei bestimmten Krankheiten übereinstimmen.
Zudem wird die Autoimmunreaktion von CD8- und CD4-T-Zellen vermittelt. Diese reagieren
jeweils auf Antigene, die von Klasse I- respektive von Klasse II-Molekülen präsentiert
werden. Eine zweite Hypothese, die den Zusammenhang zwischen dem MHC-Genotyp und
der Anfälligkeit für Autoimmunerkrankungen zu erklären versucht, hebt die Rolle der MHCAllele bei der Ausbildung des Repertoires der T-Zell-Rezeptoren hervor. Demzufolge fördern
körpereigene Peptide, die mit bestimmten MHC-Molekülen assoziiert sind, die positive
Selektion von heranreifenden Thymozyten, die für bestimmte Autoantigene spezifisch sind.
Solche körpereigenen Antigene werden möglicherweise in zu geringen Mengen exprimiert
oder binden zu schwach an körpereigene MHC-Moleküle, als dass im Thymus eine negative
Selektion ausgelöst wird. Sie sind jedoch in ausreichender Menge vorhanden oder binden
stark genug, um die positive Selektion zu fördern [Schmidt et al, 1997]. Der MHC-Genotyp
entscheidet jedoch nicht alleine darüber, ob bei einem Individuum eine Autoimmunkrankheit
ausbricht. Zusätzlich zu den MHC-Genen gibt es noch weitere, unabhängig segregierende
Loci für die Krankheitsanfälligkeit.
Ein weiteres, charakteristisches Merkmal der humoralen Autoimmunität ist die Synthese
von autoreaktiven Antikörpern (Autoantikörper), die gegen jede beliebige, körpereigene
Struktur gerichtet sein können. Autoantikörper, die sowohl als zellmembrangebundene als
auch lösliche Form vorkommen, erkennen die native Form des Autoantigens und tragen
direkt oder indirekt zur Pathogenese von Autoimmunerkrankungen bei [Tan, 1991]. Sie sind
bei vielen systemischen und organspezifischen Autoimmunkrankheiten von großer
diagnostischer Bedeutung. Bei jenen Zellen, die für die Produktion der Autoantikörper
verantwortlich sind, handelt es sich um enddifferenzierte, autoreaktive Plasmazellen. Diese
entwickeln sich ebenso wie pathogen-spezifische Plasmazellen nach Antigenkontakt aus BLymphozyten heraus, wobei auch hier verschiedene Ligand-Rezeptor-Interaktionen massiv
zur Ausbildung der autoreaktiven Plasmazellen beisteuern. So scheint es, dass zunächst der
Kontakt zwischen CD40 und CD40L nötig ist, um die B-Zellen zur Proliferation anzuregen.
Eine anschließende Interaktion zwischen CD27 und CD70 induziert die Entwicklung zur
Plasmazelle und die Bindung von CD134L an CD134 verstärkt die Antikörper-Produktion
[Jacquot et al., 1997]. Die entstandenen Plasmazellen wandern über die Blutbahn in
11
Einleitung
verschiedene Gewebe wie z.B. Knochenmark, Milz, Haut oder Schleimhäute und sind da für
die Sezernierung von Immunglobulinen unterschiedlichster Klassen (IgG, IgA oder IgE)
zuständig. Lange Zeit wurde vermutet, dass Plasmazellen eine relativ kurze Lebensdauer
von nur wenigen Wochen besitzen, und dass lang anhaltende Antikörpertiter im Serum nur
durch kontinuierliche Neubildung von Plasmazellen aus dem Gedächtnis-B-Zell-Repertoire
aufrechtzuerhalten sind. Dies setzt allerdings persistierende Antigene voraus, mit denen die
Gedächtnis-B-Zellen restimuliert werden [Ahmed und Gray, 1996]. Es konnte jedoch gezeigt
werden, dass Plasmazellen durchaus in der Lage sind in bestimmten Nischen (z.B. im
Knochenmark) und entzündlichen Geweben über Monate oder sogar Jahre hinweg zu
überleben. Diese langlebigen Plasmazellen reagieren nicht mehr mit Antigenen oder
Antigen-Antikörper-Komplexen und sezernieren auch unabhängig von der weiteren Präsenz
eines Antigens Antikörper [Manz et al, 1997, 1998]. In Abhängigkeit davon, ob protektive
oder autoreaktive Antikörper sezerniert werden, ist dieses Plasmazell-Gedächtnis bei der
Aufrechterhaltung der protektiven humoralen Immunität oder in der Pathogenese von
Autoimmunprozessen wie beispielsweise an der Entstehung bullöser Autoimmundermatosen
beteiligt und demzufolge ein möglicher Angriffspunkt für therapeutische Ansätze bei
Autoimmunerkrankungen [Hiepe und Dörner, 2005].
1.2 Blasenbildende Autoimmunerkrankungen
Blasenbildende
verlaufende
Autoimmunerkrankungen
und
teilweise
auch
sind
seltene,
lebensbedrohliche
meist
schwere,
Erkrankungen
von
chronisch
Haut
und
Schleimhäuten. Immunologisch sind diese Erkrankungen durch zirkulierende Autoantikörper
gegen
spezifische
Adhäsionsmoleküle
der
Epidermis
und
der
dermo-epidermalen
Junktionszone charakterisiert [Hertl, 2000]. Durch die Bindung der Autoantikörper an
Adhäsionsstrukturen der Haut, kommt es zu einem massiven Funktionsverlust der
Zielstruktur. Zu den bullösen Autoimmundermatosen gehören unter anderem die Pemphigusund Pemphigoiderkrankungen, die Epidermolysis bullosa und die Dermatitis herpetiformis
Duhring. Das Bullöse Pemphigoid (BP) ist die wichtigste und häufigste Erkrankung der
Pemphigoid-Gruppe. Hierbei handelt es sich um eine heterogene Gruppe von Erkrankungen
(dazu gehören auch: Pemphigoid gestationis, Lineare IgA-Dermatose), deren Mitgliedern
eine subepidermale Spaltbildung gemeinsam ist [Effendy et al, 2005].
12
Einleitung
1.2.1 Das Bullöse Pemphigoid (BP)
Bei dem Bullösen Pemphigoid (BP) handelt es sich um eine organspezifische
Autoimmunerkrankung, die mit subepidermaler Blasenbildung der Haut einhergeht. Vor
allem ältere Personen, selten Kinder, sind von dieser chronischen, teilweise schwer
verlaufenden Krankheit betroffen [Schmidt et al., 2000; Rassner, 1997]. Erstmals
beschrieben wurde diese Erkrankung von Lever im Jahre 1953, der aufgrund verschiedener
klinischer und histologischer Merkmale das BP von einem Pemphigus unterschied. Jordon
und seine Mitarbeiter konnten etwa 15 Jahre später durch Immunfluoreszenzanalysen
erstmals
zeigen,
dass
Patienten
mit
bullösem
Pemphigoid
in
der
kutanen
Basalmembranzone gebundene Antikörper aufweisen [Jordon et al, 1967].
In der direkten Immunfluoreszenz periläsionaler Haut zeigen sich deutliche
Ablagerungen von Immunglobulin G (IgG) und C3 (Protein des Komplementsystems) an der
dermo-epidermalen Junktionszone. Mittels indirekter Immunfluoreszenz an Affen-Ösophagus
oder an humaner Haut können bei etwa 80 % der BP-Patienten zirkulierende Autoantikörper
nachgewiesen werden. Diese gehören vor allem der IgG-Subklasse 4 an, gefolgt von den
Subklassen IgG1 und IgG3 [Kelly et al, 1989]. Ebenso konnten IgE-Autoantikörper im Blut
von BP-Patienten nachgewiesen werden [Ghohestani et al, 1998; Döpp et al, 2000; Fairley
et al, 2005; 2007; Ishiura et al, 2008; Dresow et al, 2009]. Die hoch affinen Autoantikörper
sind
vor
allem
gegen
zwei
hemidesmosomale
Strukturproteine
innerhalb
der
Keratinozytenmembran gerichtet: ein 230 kDa großes, intrazelluläres Protein (BP230,
BPAG-1), das zu der Plakin-Familie gezählt wird, und ein 180 kDa großes, transmembranes
Glykoprotein (BP180, BPAG-2), welches auch als Kollagen Typ XVII bekannt ist [Zillikens et
al, 1999]. Vor allem die Autoantikörper gegen das BP180 spielen eine bedeutende Rolle bei
dem Verlust der Adhäsion der basalen Keratinozyten an Komponenten der Basalmembran,
in dem sie an die Junktionszone binden und dadurch das Komplementsystem aktivieren.
Eingewanderte neutrophile und eosinophile Leukozyten schädigen durch das Freisetzen von
Proteasen und Mediatoren die hemidesmosomale Struktur und beeinträchtigen dadurch die
dermo-epidermale Haftung [Fritsch, 1998].
13
Einleitung
1.3
Kollagen XVII (BP180)
Als wichtigste Komponenten der extrazellulären Matrix sind die Kollagene im Organismus
weit verbreitet. Sie bilden die größte Proteinfamilie und werden je nach Struktur und Funktion
in verschiedene Subklassen unterteilt, die dann entweder zur Gruppe der Fibrillen bildenden
oder nicht-fibrillären Kollagene gezählt werden. Die erste Gruppe ist durch die Bildung
starrer, kollagener Mikrofibrillen gekennzeichnet. Hierbei lagern sich je fünf ununterbrochene
Triplehelices versetzt zusammen und bilden dadurch lange Ketten aus. Diese Gruppe
beinhaltet ca. 90 % aller Körperkollagene, dazu gehören Kollagen I, II und III.
Die heterogene Gruppe der nicht-fibrillären Kollagene stellt nur einen sehr geringen
Anteil der Körperkollagene dar. Sie befinden sich in sehr spezifischen Geweben,
beispielsweise in der Basalmembran (Kollagen Typ IV) oder haben ihre Funktion in der
Interaktion mit anderen Kollagenen oder Matrixproteinen (Kollagen VI), [Löffler, 1999]. Eine
besondere Klasse sind die zellständigen Kollagentypen XIII und XVII. Sie sind mit einer
transmembranen
Region
in
der
Zellmembran
verankert
und
scheinen
als
Oberflächenproteine den Kontakt der Zellen zu Bestandteilen der extrazellulären Matrix zu
vermitteln. Ein typisches Merkmal dieser Kollagene liegt in der Flexibilität, die durch die
nicht-kollagenen Unterbrechungen der Triplehelix zu begründen ist. Die fibrillären Domänen
sind wesentlich kürzer oder gar nicht vorhanden.
Kollagen Typ XVII wurde im Zusammenhang mit der Erforschung der Pathogenese
des Bullösen Pemphigoids (BP) entdeckt und erstmals im Jahre 1986 beschrieben. Aufgrund
seines Molekulargewichtes von 180 kDa wurde es auch als BP180 bezeichnet [Labib et al,
1986]. Abnormalitäten des Kollagen XVII-Moleküls durch Mutationen gehen bei einer Reihe
von angeborenen Erkrankungen mit subepidermaler Blasenbildung der Haut einher. Ebenso
können Kollagen XVII-Autoantikörper ursächlich für die subepidermale Blasenbildung sein
[Franzke et al, 2003].
1.3.1 Struktur und Funktion des Kollagen XVII (BP180)
Das Kollagen XVII ist ein Homotrimer, bestehend aus drei identischen (XVII)-Ketten
[Hirako et al, 1998], die jeweils 1497 Aminosäuren lang und 180 kDa schwer sind [Giudice et
14
Einleitung
al, 1992; Franzke et al, 2003]. Es weist als transmembranes Glykoprotein eine für die
Kollagene eher ungewöhnliche Typ-II-Orientierung auf, das bedeutet, der N-Terminus des
Proteins befindet sich intra-, der C-Terminus extrazellulär [Zillikens et al, 1999].
Die globuläre, intrazelluläre Domäne von etwa 60 kDa interagiert mit 4-Integrin,
Plektin und BP230 [Hopkinson et al, 1998, 2000] und ist für die stabile Anhaftung der
Hemidesmosomen an die intermediären Keratinfilamente essentiell. Dieser Domäne folgt ein
kurzer Transmembranabschnitt von 14 Aminosäuren, der dann wiederum mit der großen,
membranproximal gestreckten und zum C-terminalen Ende hin sehr flexiblen Ektodomäne
verknüpft ist. Die Ektodomäne, welche die Lamina lucida bis hin zur Lamina densa
durchzieht und so über die Basalmembranzone die Epidermis mit der Dermis verbindet,
besitzt eine molekulare Masse von etwa 120 kDa und besteht aus 15 kollagenen
Subdomänen. Diese werden durch 16 kurze, nicht-kollagene (NC) Abschnitte flankiert
[Schacke et al, 1998; Areida et al, 2001]. Der membranproximale Abschnitt der Ektodomäne
ist verantwortlich für die Bindung an das 6-Integrin. Diese Bindung scheint wichtig für die
Kollagen XVII-Integration in die Hemidesmosomen zu sein.
Modifiziert nach Franzke et al, 2003
Abb. 1.4: Schematische Darstellung von Kollagen XVII.
Das epitheliale Kollagen XVII ist ein Typ-II Integraltransmembranprotein mit einem Molekulargewicht von 180 kDa
und einer Länge von 1497 Aminosäuren. Durch proteolytische Enzyme, die unter anderem zur Familie der
ADAM’s gehören, kann die 120 kDa schwere Ektodomäne vom Rest des Proteins abgeschnitten werden und als
lösliche Form existieren (Shedding). Schwarze Balken: kollagene Domänen; graue Balken: nicht-kollagene
Domänen; senkrechte, graue Linie: Plasmazellmembran; als unmittelbar an die Membran angrenzende Domäne:
NC16a, immundominante Region.
15
Einleitung
Das epitheliale Protein der Haut und Schleimhäute (Kollagen XVII) spielt eine entscheidende
Rolle bei der Aufrechterhaltung der Verbindung zwischen den intrazellulären und
extrazellulären Strukturelementen, die an der epidermalen Adhäsion beteiligt sind [Franzke
et al, 2005]. Als Transmembranprotein besitzt das Kollagen XVII zwei entscheidende
Funktionen: es wirkt zum einen als Rezeptor und ist somit an der Signaltransduktion
beteiligt, zum anderen ist es ein Bestandteil der extrazellulären Matrix und dient als
Strukturprotein der Stabilität und Aufrechterhaltung von Hemidesmosomen [Franzke et al,
2003; Powell et al, 2005].
nach Tasanen et al, University of Oulu
Abb. 1.5: Modell der epidermalen Basalmembran im Bereich eines Hemidesmosoms.
Die Bildung der Hemidesmosomen schließt die Clusterbildung des 64-Integrin an der basalen Seite der Zelle
mit ein, welche abhängig von der Interaktion mit den Liganden der extrazellulären Matrix – wie beispielsweise
Laminin-5 – ist. Die Fähigkeit von 64-Integrin und Plektin miteinander zu assoziieren und selber zu
polymerisieren, erleichtert die Bildung eines Kerns, der als Anhaftungsstelle für BP180 und BP230 dient. Die
Stabilisierung
der
Hemidesmosomen
wird
dann
durch
eine
Multiprotein-Interaktion
erreicht.
Die
zytoplasmische4-Domäne ist in der Lage, zusätzlich neben Plektin, mit BP180 und BP230 zu interagieren.
Andersherum assoziiert BP180 mit Plektin und BP230, beide in die Anhaftung des Keratinnetzwerkes an die
Plasmamembran mit einbezogen.
16
Einleitung
1.3.2 Kollagen XVII als Autoantigen
Die im Zusammenhang mit dem Bullösen Pemphigoid auftretenden, im peripheren Blut
zirkulierenden IgG-Antikörper gegen Kollagen XVII sind bei 90 % der BP-Patienten [Zillikens
et al, 1997] gegen eine Domäne gerichtet, die, membranproximal gelegen, im 16. nichtkollagenen (NC) Abschnitt des BP180-Proteins lokalisiert ist. Diese immundominante Region
wird als NC16a-Domäne bezeichnet und enthält mindestens fünf verschiedene Epitope, die
von den Autoantikörpern in den Seren der BP-Patienten erkannt und gebunden werden
[Giudice et al, 1993], und dementsprechend als antigene Areale des BP180 identifiziert
wurden [Zillikens et al, 1997]. Weitere Autoantikörper sind gegen antigene Regionen
innerhalb des COOH-Terminus der BP180-Ektodomäne bzw. gegen das BP230-Antigen
gerichtet [Hofmann et al, 2002; Ishiura et al, 2008]. Die NC16a-spezifischen Antikörper
gehören vor allem der IgG-Subklasse 4 an [Döpp et al, 2000]. Allerdings führt die alleinige
Bindung der Autoantikörper an die antigenen Epitope nicht automatisch zur Blasenbildung.
Das zusätzliche Einwandern von Entzündungszellen in die geschädigte Haut und die
Freisetzung
unterschiedlicher
Entzündungsmediatoren,
einschließlich
Zytokinen
und
Proteasen, sind eine notwendige Voraussetzung, um die Blasenbildung hervorzurufen [Zone
et al, 1990].
Weitere Arbeiten zeigten, dass die Krankheitsaktivität der Patienten mit den
Serumspiegeln der Autoantikörper gegen BP180 NC16A korreliert, nicht jedoch mit dem
Autoantikörpertiter der indirekten Immunfluoreszenz auf NaCl-separierter Spalthaut [Schmidt
et al, 2000b]. Diese Beobachtung könnte dadurch erklärt werden, dass beim Bullösen
Pemphigoid die Immunfluoreszenz-Reaktivität in erster Linie durch Antikörper gegen BP230
und nur zu einem geringeren Teil durch Antikörper gegen BP180 vermittelt wird [Pas et al,
1995].
17
Einleitung
1.4
Ziel dieser Arbeit
Es ist schon lange bekannt, dass die für die Entstehung eines Serumspiegels notwendigen
Antikörpermengen
durch
Plasmazellen
synthetisiert
werden.
Plasmazellen
sind
enddifferenzierte B-Lymphozyten. Deren Hauptfunktion besteht darin, spezifische Antikörper
zu produzieren, die den Organismus über einen längeren Zeitraum vor Pathogenen schützen
und damit eine zentrale Rolle für die humorale Immunität spielen. Bisher war die
Untersuchung der Plasmazellen durch die Seltenheit ihres Auftretens im peripheren Blut und
fehlender Verfahren zum Nachweis der Antigenspezifität dieser Zellen ausgesprochen
schwierig.
Das Bullöse Pemphigoid (BP) ist eine autoantikörpervermittelte Erkrankung der Haut,
dessen Hauptantigen, das Transmembrankollagen XVII, von über 90 % der BP-Patienten
erkannt wird. Die wesentliche antigene Domäne des Typ XVII Kollagen ist die NC16aDomäne, eine extrazelluläre, der Membran nah gelegene 72 Aminosäuren lange Sequenz.
Ziel dieser Arbeit sollte es sein, autoreaktive Plasmazellen spezifisch für die NC16aDomäne des Hauptantigens Kollagen XVII bei Patienten mit BP nachzuweisen und
phänotypisch zu charakterisieren. Zur detaillierten Analyse dieser seltenen Zellen sollte das
Autoantigen, die NC16a-Domäne, in einem geeigneten Expressionssystem rekombinant
exprimiert und anschließend mit einem Fluorchrom markiert werden. Mit dem rekombinanten
Protein
sollte
dann
versucht
werden,
mittels
intrazellulärer
Färbung
die
autoantigenspezifischen Plasmazellen durchflusszytometrisch zu identifizieren und zu
charakterisieren. Durch die Untersuchung entsprechender Aktivierungsmarker sollte dann
geklärt werden, ob nachweisbare antigenspezifische Plasmazellen eher einer kurzlebigen
Plasmablasten- oder einer langlebigen Plasmazellpopulation zugeordnet werden können.
18
Materialien
Kapitel 2
Materialien
Alle in dieser Arbeit benötigten Chemikalien entsprachen dem Qualitätsstandard pro analysis
und wurden, falls nicht anders angegeben, von den Firmen Roth (Karlsruhe), Merck
(Darmstadt), Sigma (Taufkirchen), Invitrogen (Karlsruhe), Serva (Heidelberg), New England
Biolabs (Schwalbach) oder Roche (Mannheim) bezogen. Für die Herstellung aller
verwendeten Lösungen wurde entionisiertes Wasser aus einer Reinstwasseranlage benutzt.
Die Versuche wurden, wenn nicht anders vermerkt, bei Raumtemperatur durchgeführt.
2.1
Verwendete Bakterienstämme
Zur Transformation von Plasmiden wurden die folgenden E.coli Bakterienstämme mit dem
entsprechenden Genotyp verwendet:
TOP10F’: E.coli F’ {laclq, Tn108TetR} mrcA ∆(mrr-hdsRMS-mcrBC) φ80 laclZ∆M15 ∆lacX74
deoR recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (Str®) endA1 nupG
[Invitrogen, San Diego]
BL21(DE3): E.coli B F- ompT hsdS(r B -m B -) dcm+ Tetr gal (DE3) endA The [argU proL Camr]
[Stratagene, USA]
2.2
Zelllinie
Zur rekombinanten Proteinexpression wurde folgende Zelllinie verwendet:
EBNA-293-Zellen: Humane embryonale Nierenzelllinie. In das Genom wurde das EBNA-1
Gen integriert. Zusätzlich tragen die Zellen auf ihrem Genom eine Geneticin (G418)Resistenz als Selektionsmarker.
19
Materialien
Zellkulturmedium:
D’MEM / F12 1:1
10 %
FCS
2 mM Glutamat
100 U/ 100 µg/ml Penicillin/Streptomycin
0,5 g Vitamin C
Selektionsmedium:
Zellkulturmedium
350 µg/ml G418
30 µg/ml Hygromycin
2.3
Bakterienmedien
LB-Medium:
0,5 % (w/v) NaCl
0,5 % (w/v) Hefe-Extrakt
1 % (w/v) Pepton
LB-Agar:
LB-Medium
1,25 % (w/v) Agar
2YT-Medium:
0,5 % (w/v) NaCl
1 % (w/v) Hefe-Extrakt
2 % (w/v) Pepton
LB amp -Platten:
LB-Medium
1,25 % (w/v) Agar
Ampicillin einer 100 mg/ml-Stocklösung 1:1000 einsetzen
2.4
Expressions- und Klonierungsvektoren
Zur Herstellung rekombinanter Proteine in eukaryotischen Systemen werden zur
Transfektion geeignete Plasmid-Vektoren benötigt, die sowohl die cDNA-Sequenz des zu
exprimierenden Proteins als auch die notwendigen Sequenzen für eine erfolgreiche
Expression tragen. Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Expressionsvektor handelte es sich
um den eukaryotischen, episomalen Expressionsvektor pCEP4 von Invitrogen. Dieser Vektor
besitzt innerhalb der multiplen Klonierungsstelle (MCS) zahlreiche Restriktionsschnittstellen,
20
Materialien
unter anderem eine Nhe I- und eine BamH I-Erkennungssequenz. Zwischen diesen beiden
Erkennungssequenzen wurde bereits das Insert (Konstrukt F) sowie ein His 6 -Motiv kloniert
[Prof. Brinkmann, Universität Lübeck]. Das His 6 -Motiv befindet sich am C-Terminus des
exprimierten Proteins und dient unter anderem der Aufreinigung des Proteins über eine
Affinitätssäule.
Abb. 2.1: Vektorkarte des Expressionsvektors pCEP4.
Der Vektor besitzt eine Ampicillin-Resistenzkassette, ein SV40 Polyadenylierungssignal, einen SV40-Promotor,
das Ebstein-Barr Nuclear Antigen-1 (EBNA-1)-Gen, einen bakteriellen Replikationsursprung (ori) und einen CMV
(Cytomegalovirus)-Promotor. Der Vektor lag für diese Arbeit bereits als modifizierter Vektor mit dem Insert
„Konstrukt F“ vor, welches die NC16a-Domäne mit einschloss.
Als Klonierungsvektor wurde der pDrive Klomierungsvektor von QIAGEN verwendet. Dieser
Vektor besitzt eine große multiple Klonierungsstelle (MCS) mit einer Vielzahl an
Restriktionsschnittstellen. Zu Beginn der Arbeit lag der Vektor mit dem Konstrukt F als Insert
vor. Dieses Insert wurde während der Arbeit in den Expressionsvektor pRSET A zur
rekombinanten Expression des Proteins umkloniert.
21
Materialien
Abb. 2.2: Vektorkarte des Klonierungsvektors pDrive von QIAGEN.
Der Vektor liegt linearisiert vor und besitzt eine Kanamycin- und Ampicillin-Resistenzkassette zur Selektion, ein
LacZ-Gen für eine Blau/Weiß-Selektion, einen Replikationsursprung (origin) und eine multiple Klonierungsstelle
mit einer Vielzahl Restriktionsschnittstellen.
Der für die Transfektion verwendete Expressionsvektor pRSET A enthält die Sequenz des
T7-Promotors. Durch dessen Gegenwart ist es möglich, große Mengen an zuvor in den
Vektor klonierte DNA-Sequenzen zu exprimieren und somit die Expression des Gens von
Interesse zu kontrollieren. Erkannt wird der Promotor ganz spezifisch von der T7 RNAPolymerase, welche von dem E.coli Stamm BL21(DE3) geliefert wird. Dieser Stamm trägt
das notwendige DE3 Bakteriophage-Lambda-Lysogen, welches unter anderem das T7 RNAPolymerase-Gen enthält. Das Gen wird nach Zugabe des Induktors Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid (IPTG), ein Galaktose-Derivat, exprimiert und auf diesem Wege die T7
RNA-Polymerase hergestellt. Diese kann anschließend an den T7-Promotor binden, um das
gewünschte Gen, in diesem Fall die für die NC16a-Domäne kodierende cDNA, zu
exprimieren.
22
Materialien
Abb. 2.3: Vektorkarte des Expressionsvektors pRSET A von Invitrogen.
Der Vektor besitzt eine Ampicillin-Resistenzkassette zur Selektion, einen Replikationsursprung (pUC ori) für eine
möglichst hohe Plasmidreplikation, einen T7-Promotor zur Regulation der heterologen Gen-Expression und eine
multiple Klonierungsstelle mit einer Vielzahl Restriktionsschnittstellen. N-terminal ist ein Hexa-Histidin-Motiv
gelegen, welches der Aufreinigung dient.
2.5
Antikörper
Tab. 2.1: Auflistung der verwendeten Antikörper.
monoklonal
Antigen
Spezies/Klon
Konjugat
Hersteller
anti-human IgA
Maus
Phycoerythrin
Miltenyi
Fluorescein
BD
isothiocyanate
Bioscience
Fluorescein
Miltenyi
Klon IS11-8E10
monoklonal
anti-human IgM
Maus
Klon G20-127
monoklonal
anti-human IgG
Maus
Klon IS11-3B2.2.3
monoklonal
anti-human CD19
isothiocyanate
Maus
Phycoerythrin
Klon LT19
Allophycocyanin
23
Miltenyi
Materialien
monoklonal
anti-Human CD27
Maus
Phycoerythrin
Bioscience
Klon L128
monoklonal
anti-Human CD38
Maus
Klon IB6
monoklonal
anti-Human CD138
Maus
BD
Fluorescein
Miltenyi
isothiocyanate
Allophycocyanin
Miltenyi
Phycoerythrin
Exbio
Fluorescein
BD
isothiocyanate
Bioschience
Klon B-B4
monoklonal
anti-Human HLA-DR
Maus
Klon MEM-12
monoklonal
anti-Maus CD117
Ratte
Klon 2B8
polyklonal
anti-Human IgG
Kaninchen
HRP
Dako
monoklonal
anti-Human CD19
Maus
Mikropartikel
Miltenyi
monoklonal
anti-Human CD138
Maus
Mikropartikel
Miltenyi
2.6
Enzyme
Alle Enzyme wurden, sofern nicht anders erwähnt, gemäß den Herstellerangaben eingesetzt
und bei -20°C gelagert.
T4 DNA-Ligase
New England Biolabs® Inc., (Schwalbach)
BamH I
New England Biolabs® Inc., (Schwalbach)
Hind III
New England Biolabs® Inc., (Schwalbach)
24
Materialien
2.7
Oligonukleotide
Bezeichnung:
BamH I - NC16a forward
Sequenz (5’ 3’):
GCT TAT GGA TCC GAG GTG AGG AAG
Bezeichnung:
Hind III - NC16a reverse
Sequenz (5’ 3’):
GCG CAA GCT TCG TCA ATT TTC CTG
2.8
Chemikalien und Verbrauchsmaterialien
Chemikalien
2-Mercaptoethanol
Roth, Karlsruhe
2-Propanol
Roth, Karlsruhe
Aceton
Roth, Karlsruhe
Ammoniumpersulfat (APS)
Sigma, Taufkirchen
Bis-Acrylamid Protogel (Ratiphorese)
Roth, Karlsruhe
BCA Protein Assay Reagent A + B
Pierce, Rockford, USA
Borsäure
Roth, Karlsruhe
Bromphenolblau
Serva, Heidelberg
BSA
Serva, Heildeberg
Coomassie
®
Serva, Heidelberg
di-Natriumhydrogenphosphat
Merck, Darmstadt
DMSO
Sigma, Taufkirchen
EDTA
Merck, Darmstadt
epsilon-aminocaproic-acid
Serva, Heidelberg
Essigsäure
Roth, Karlsruhe
Ethanol
Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid
Merck, Darmstadt
FCS
Biochrom
TM
Ficoll-Paque
Plus
Biotech, Uppsala, Sweden
FuGene6
Roche, Mannheim
Glycerin
Roth, Karlsruhe
Glycin
Roth, Karlsruhe
Hefeextrakt
Sigma, Taufkirchen
Imidazol
Quiagen, Hilden
25
Materialien
IPTG
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Isopropanol
Roth, Karlsruhe
Kaliumchlorid
Roth, Karlsruhe
Kaliumdihydrogenphosphat
Merck, Darmstadt
Magnesiumchlorid
Roth, Karlsruhe
Methanol
Roth, Karlsruhe
Milchpulver
Roth, Karlsruhe
Natriumchlorid
Roth, Karlsruhe
Natriumdihydrogenphosphat
Merck, Darmstadt
Natriumlaurylphosphat (SDS)
Serva, Heidelberg
Natronlauge
Merck, Darmstadt
PMSF
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Ponceau S Solution
Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Salzsäure
Merck, Darmstadt
Select Agar
Invitrogen, Karlsruhe
Select Peptone 140
Gibco, Gaithersburg, USA
TCA
Merck, Darmstadt
TEMED
Sigma, Taufkirchen
Tris
Sigma, Taufkirchen
Triton X-100
Roth, Karlsruhe
Trypsin
Invitrogen, Karlsruhe
Tween 20
Serva, Heidelberg
Universal Agarose
Bio-Budget, Krefeld
Verbrauchsmaterialien
FACS-Röhrchen
Beckton Dickinson
Handschuhe
Hartmann
MS-Säulen
Miltenyi, B.-Gladbach
Nitrocellulose-Membran
Amersham Biosciences
Petrischalen
Falcon
Reagiergefäße
Sarstedt, Nümbrecht
Röntgenfilm
GE Healthcare
Skalpell
Feather
Whatman-Paper
Whatman
Zentrifugenröhrchen 15 ml
Beckton Dickinson
Zentrifugenröhrchen 50 ml
Beckton Dickinson
26
Materialien
2.9
Allgemeine Puffer
Anodenpuffer I:
0,3 M Tris
20 % Methanol
H2O
pH 10.4
Anodenpuffer II:
25 mM Tris
20 % Methanol
H2O
pH 10.4
Kathodenpuffer:
40 mM 6-Aminohexansäure
20 % Methanol
H2O
pH 7.6
FACS-Puffer:
1x PBS
5 % FCS
0.02 % Azide
10x PBS:
80 g NaCl
2 g KCl
14,4 g di-Natriumhydrogenphosphat
2,4 g Kaliumdihydrogenphosphat
H 2 O auf 1000 ml
pH 7.4
10x Laufpuffer:
30 g Tris-Base
144 g Glycin
20 g SDS
H 2 O auf 1000 ml
pH 8.3
27
Materialien
10x TBE:
108 g Tris-Base
55 g Borsäure
40 ml 0,5 M EDTA
H 2 O auf 1000 ml
pH 8.0
1x TE:
10 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.4 – 8.0)
2 ml 0,5 M di-Natrium-EDTA (pH 8.0)
H 2 O auf 1000 ml
autoklavieren
5x Probenpuffer + ß:
0,6 ml 1 M Tris-HCl pH 6.8
2,5 ml 100 % Glycerol
2 ml 10 % SDS
0,5 ml ß-Mercaptoethanol
0,1 ml 10 % Bromphenolblau
4, 3 ml H 2 O
Lagerung bei -20°C
0,5 M EDTA:
146 g EDTA
60 g NaOH
H 2 O auf 800 ml
pH 8.0
H 2 O auf 1000 ml
Alle weiteren Puffer und Lösungen werden bei den entsprechenden Methoden beschrieben.
2.10 Geräte
Brutschrank
Heraeus
Brutschrank/Schüttler
Biotron
ELISA-Reader NJ-2000
NUNC
Entwickler Curix 60
AGFA
FACS Calibur
Becton Dickinson
Feinwaage AdventurerTM Pro
Ohaus®
Kühlzentrifuge 5415 R
Eppendorf
28
Materialien
Kühlzentrifuge Multifuge 1S-R
Heraeus
Labcycler
SensoQuest
Magnet zur Zellseparation
Miltenyi
Magnetrührer
IKAMAG®REO
Mikroskop
Nikon
Mikrowelle
Home Electronics
pH-Meter CG710
Schott
Photometer
Eppendorf
Power Supply E835
Consort
®
Ultrazentrifuge Sorvall Evolution RC
ThermoScientific
Thermomixer compact
Eppendorf
Ultrazentrifuge
Beckman
UV-Lampe 7410
Bachhofer
Vortexer Vortex Genie2
Scientific Industries
Wasserbad SW-20C
Julabo
2.11 DNA-und Proteinmarker
DNA-Marker:
100 bp DNA-Leiter
Fermentas
Protein-Marker:
Prestained Protein-Leiter
Fermentas
(PageRulerTM)
29
Materialien
2.12 Patientendaten und Kontrollpersonendaten
Alle Patienten und Kontrollpersonen wurden über Sinn und Zweck der Versuche informiert
und erklärten sich mit einer Blutspende einverstanden.
Tab. 2.2: Auflistung der Patientendaten.
Spender
K51
Alter
90
Geschlecht
ind. IF
Western
(ELISA)
Blot
>1:160
+
♀
Therapie
Krankheitsaktivität
Decortin,
++
Imurek
K54
69
♀
>1:160
+
Cellcept
+
K56
84
♀
>1:160
+
Cellcept,
++
Dermoxin
K57
78
♂
>1:640
-
Cellcept
+
K58
72
♀
>1:640
+
Decortin
++
K62
89
♀
>1:640
++
Decortin
++
K65
96
♀
>1:640
++
Decortin
++
++ frische Blasen, juckender Ausschlag; + Rötungen, Krusten, Erosionen
Tab. 2.3: Auflistung der Kontrollpersonendaten.
Spender
Alter
Geschlecht
ind. IF
Western
(ELISA)
Blot
Klinischer Status
KO5
26
♀
n.b.
-
gesund
KO10
45
♀
n.b.
-
gesund
KO11
28
♂
n.b.
-
gesund
KO14
31
♂
n.b.
-
gesund
KO16
26
♀
n.b.
-
gesund
KO18
39
♀
n.b.
-
gesund
KO19
44
♀
n.b.
-
gesund
30
Methoden
Kapitel 3
Methoden
3.1
Molekularbiologische Methoden
3.1.1
Agarosegelelektrophorese
Um DNA-Produkte nach einem Restriktionsverdau auf ihre Größe hin untersuchen zu
können, wurden horizontale Agarosegele verwendet. Der Prozentgehalt an Agarose ist
abhängig von der Größe der aufzutrennenden Fragmente. Während der Arbeit wurden
dementsprechend Agarose-Gele von 0,7 % (w/v) (für große Fragmente), bis 1,7 % (w/v) (für
kleine Fragmente) gegossen. Die Agarose wurde in 1 x TBE-Puffer durch Aufkochen in einer
Mikrowelle gelöst und mit 6 µl Ethidiumbromid (pro 100 ml) versetzt. Ethidiumbromid ist ein
fluoreszierender Stoff, der zwischen die Basen interkaliert, mit Licht im UV-Bereich (254366 nm) angeregt wird und Licht im orange-roten Bereich (590 nm) emittiert. Somit ist es
möglich, die DNA-Fragmente unter UV-Licht sichtbar zu machen. Die Auftrennung erfolgte in
1 x TBE-Puffer bei einer Spannung von 110 V (bzw. 13,5 V/cm).
Die zu untersuchenden Proben wurden mit Probenpuffer versetzt. Um die Größe der
Fragmente bestimmen zu können, wurden parallel 8 µl von einer 100 bp DNA-Leiter (für
kleinere Fragmente) und 1 kb DNA-Leiter (für größere Fragmente) aufgetrennt, die ebenfalls
mit Probenpuffer versetzt wurde. Bei analytischen Agarosegelen wurden jeweils 2-5 µl Probe
pro Tasche eingesetzt, wohingegen bei präparativen Gelen bis zu 50 µl Probe pro Tasche
aufgetragen wurde. Aufgetrennte DNA-Fragmente, die für weitere Analysen benötigt wurden,
wurden unter UV-Licht mit einem Skalpell ausgeschnitten. Wichtig dabei ist, die UVExposition gering zu halten, da es sonst zu DNA-Schäden kommen kann.
10 x Probenpuffer:
10 mM Tris/HCl pH 8.0
50 mM EDTA
80 % (w/v) Glycerin
0,1 % (w/v) Bromphenolblau
1 x TBE (1l):
90 mM Tris Base
89 mM Borsäure
0,5 M EDTA pH 8.0
31
Methoden
0,7 % (1,7 %) Agarosegel:
0,7 g (1,7 g) Agarose
100 ml 1 x TBE
3.1.2
Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe des PCR-Verfahrens
Die DNA-Neusynthese erfolgt für gewöhnlich in Gegenwart einer Matrize und spezifischen
Oligonukleotiden in vitro. Mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion wird durch wiederholte
Synthesezyklen eine exponentielle Vermehrung eines bestimmten Sequenzabschnitts
erreicht. Hierzu werden eine DNA-Matrize, zwei passende sequenzspezifische Primer,
dNTP-Substrate (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) sowie eine thermostabile DNA-Polymerase
(z.B. die Taq-Polymerase) in einem geeigneten Puffer (Mg2+-haltig) benötigt. Durch
periodisch aufeinander folgenden Temperaturänderungen kommt es zur Denaturierung der
DNA-Vorlage (95°C), Primeranlagerung (56°C) und Primerverlängerung (72°C), so dass das
Produkt des Zyklus n im Zyklus n+1 selbst als Matrize dienen kann. Die dabei erhaltene DNA
kann für analytische Zwecke oder präparative Ziele genutzt werden.
Als DNA-Vorlage zur Amplifikation der spezifischen Sequenz diente der episomale
Expressionsvektor pCEP4. Der hier verwendete pCEP4-Vektor trägt neben den typischen
Plasmideigenschaften zusätzlich ein Konstrukt, welches nachträglich in den Vektor eingefügt
wurde und die cDNA der NC16a-Domäne des Kollagen XVII enthält (AG Brinkmann,
Universität Lübeck). Die Sequenz, die für die NC16a-Domäne kodiert, sollte mit Hilfe
definierter Primer gezielt amplifiziert werden.
Für einen 25 µl Ansatz wurden folgende Komponenten eingesetzt:
12,5 µl
2x RED Taq® Ready MixTM
1 µl
forward primer (10 µM pCEP4-BamH I)
1 µl
reverse primer (10µM pCEP4-Hind III)
1 µl
Plasmid-DNA (pCEP4 + Konstrukt F)
9,5 µl
PCR-H 2 O
Der Ansatz wurde nach dem Ende der PCR auf ein 1,7 %iges Agarosegel aufgetragen. Das
entstandene Fragment weist durch die definierten Oligonukleotide eine spezifische Größe
auf, die im Gel durch den Vergleich mit einem Längenstandard überprüft werden kann.
32
Methoden
3.1.3 Restriktionsverdau
Mit Hilfe von Restriktionsenzymen ist es möglich, DNA an definierten Positionen zu spalten.
Die Spaltprodukte dienen im Falle eines analytischen Restriktionsverdaus zur Überprüfung
der eingesetzten DNA (Kontrollverdau). Bei einem präparativen Restriktionsverdau hingegen
werden die Spaltprodukte für Klonierungsarbeiten eingesetzt.
Bei den in den biotechnologischen Verfahren verwendeten Restriktionsenzymen
handelt es sich überwiegend um Typ II-Restriktionendosnukleasen, die DNA-Stränge an
genau definierten Stellen schneiden. Dabei erkennen sie eine spezifische Basensequenz
von 4 bis 6 Basen, so genannte Palindrome. Diese Erkennungssequenz wird abhängig vom
Enzym so geschnitten, dass entweder glatte („blunt ends“) oder überhängende Enden
(„sticky ends“) entstehen. Während dieser Arbeit wurden Restriktionsenzyme des Typs II
verwendet, die innerhalb der Erkennungssequenz geschnitten haben und überhängende
Enden erzeugten.
Für einen 100 µl Ansatz einer Restriktionsspaltung des Konstrukts pDrive-NC16a wurden
folgende Komponenten eingesetzt:
20 µl Plasmid-DNA (340 ng/µl pDrive-NC16a)
10 µl 10 x Restriktionspuffer 2 (NEB)
2 µl Hind III (10 U/µl)
68 µl ddH 2 O
Dieser
Ansatz
wurde
über
Nacht
bei
37°C
inkubiert.
Nach
einer
20-minütigen
Hitzeinaktivierung des Restriktionsenzyms Hind III bei 65°C wurden folgende Komponenten
hinzugefügt:
1 µl 100 x BSA
1 µl BamH I (10 U/µl)
4,1 µl 1M Tris-HCl
5,1 µl 1M NaCl
Der Ansatz wurde erneut für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Das zweite Restriktionsenzym
gewährleistet eine vollständige Fragmentierung der DNA. Da BamH I für eine optimale
Aktivität ein anderes Puffermilieu benötigt als Hind III, musste der zuvor verwendete Puffer
mit Zusatz von Tris-HCl und NaCl den Pufferbedingungen des Enzyms entsprechend
33
Methoden
angepasst werden (vgl. Restriktionspuffer 3, NEB). Nach Restriktion wurden die Fragmente
auf ein 1,2 %iges Agarosegel aufgetragen. Die entstandenen Fragmente weisen durch die
definierte Lage der Schnittstellen eine spezifische Größe auf, die im Gel durch den Vergleich
mit einem Längenstandard überprüft werden kann.
Da der Expressionsvektor pRSET A als zirkuläres Plasmid vorlag, musste auch dieser
zunächst geschnitten werden. Für einen 100 µl Ansatz der Restriktionsspaltung wurden
folgende Komponenten eingesetzt:
32 µl Plasmid-DNA (156 ng/µl)
10 µl 10 x Restriktionspuffer 2 (NEB)
1 µl Hind III (10 U/µl)
57 µl ddH 2 O
Der Ansatz wurde für 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Nach einer 20-minütigen
Hitzeinaktivierung des Restriktionsenzyms Hind III bei 65°C wurden folgenden Komponenten
zu dem Verdau hinzugefügt:
1 µl 100 x BSA
1 µl BamH I (10 U/µl)
4,1 µl 1 M Tris-HCl
5,1 µl 1 M Nacl
Der Ansatz wurde erneut für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. 10 Minuten vor Ablauf der
Inkubationszeit wurde 1 µl (1 U/µl) der alkalischen Phosphatase CIAP (Calf Intestine Alkaline
Phosphatase) beigefügt. Dieses Enzym katalysiert die Hydrolyse freier Phosphatgruppen
unter anderem von DNA und verhindert somit ein erneutes Schließen von Plasmiden.
Anschließend wurde das Enzym 20 Minuten bei 85°C inaktiviert. Bevor der geschnittene
Vektor auf ein 1 %iges Testgel aufgetragen wurde, sollten zunächst überschüssige Primer,
Nukleotide und Salze entfernt werden. Die DNA wird dazu an eine Membran gebunden,
gewaschen und anschließend wieder eluiert.
Restriktionspuffer 2 (NEB):
50 mM NaCl
10 mM Tris-HCl
10 mM MgCl 2
1 mM Dithiothreitol
34
Methoden
Restriktionspuffer 3 (NEB):
100 mM NaCl
50 mM Tris-HCl
10 mM MgCl 2
1 mM Dithiothreithol
3.1.4 Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Um DNA aus Agarosegelen zu extrahieren, wurde dafür das „QIAquick Gel Extraction Kit“
von der Firma QIAGEN verwendet. Dabei wurde nach dem Protokoll des Herstellers
gearbeitet, nachdem die aufgetrennten DNA-Fragmente unter UV-Licht mit einem Skalpell
ausgeschnitten wurden.
Prinzip dieses Verfahrens ist die Bindung der DNA an eine Silica-Matrix in
Anwesenheit hoher Konzentrationen chaotroper Salze. Die so wiedererlangte DNA konnte
anschließend für weitere molekularbiologische Methoden benutzt werden, oder wurde zur
Aufbewahrung bei -20°C gelagert.
3.1.5
Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Ligation wurde das Enzym T4-DNA-Ligase aus dem Bakteriophagen T4 verwendet.
Dieses
Enzym
katalysiert
unter
ATP-Verbrauch
die
entsprechenden
Phosphodiesterbindungen zwischen dem 5’-Phosphat-Ende und dem 3’-OH-Ende eines
doppelsträngigen DNA-Fragments. Voraussetzung einer erfolgreichen Ligation ist die
Existenz zueinander passender, kohäsiver oder glatter Enden auf beiden Seiten der zu
ligierenden DNA.
In diesem Ansatz wurden folgende Komponenten zur kovalenten Verknüpfung eines
Restriktionsfragments der Fremd-DNA in linearisierte Vektor-DNA verwendet (20 µl Ansatz):
3 µl Plasmid (pRSET 86 ng/µl)
12 µl Insert (NC16a 35 ng/µl)
1 µl T4-Ligase
2 µl 10 x Ligationspuffer
2 µl ddH 2 O
35
Methoden
Nach Zugabe der Reagenzien wurde der Ansatz sorgfältig gemischt und über Nacht bei
16°C inkubiert.
3.1.6
Transformation in E.coli TOP10F’ und BL21(DE3) Zellen
Zur Transformation chemisch kompetenter Bakterienzellen (E.coli) der Stämme TOP10F’
und BL21(DE3) wurden jeweils 100 µl Bakteriensuspension auf Eis aufgetaut, anschließend
mit 1 µl Plasmid-DNA (bzw. 10 µl nach Ligation) versetzt und vorsichtig gemischt. Es folgte
eine Inkubation der Zellen für 30 Minuten auf Eis, wobei alle 5 Minuten erneut leicht
geschüttelt wurde. In diesem Zeitraum lagert sich die DNA an der Bakterienoberfläche an.
Durch anschließenden Hitzeschock für 45 (BL21) bzw. 60 (TOP10) Sekunden bei 42°C
werden die Bakterienwände porös, wodurch Plasmid-DNA in die Bakterien eindringen kann.
Unmittelbar danach wurden die Zellen erneut für 2 Minuten auf Eis gestellt und in 800 µl LBMedium aufgenommen. Zur Regenerierung wurden die transfizierten Bakterienzellen für eine
Stunde bei 37°C auf einem Schüttler inkubiert. Zeitgleich wurden ampicillinhaltige
Agarplatten
(LB amp )
in
einem
Brutschrank
bei
37°C
aufgewärmt.
Nach
der
Regenerationsphase wurden die Zellen vorsichtig für 1 Minute bei 8000 rpm zentrifugiert und
der Überstand anschließend bis auf 100 µl verworfen. Die Bakterien wurden in den restlichen
100 µl resuspendiert. Danach wurden 20 µl bzw. 80 µl der Suspension auf die vorgewärmten
Agarplatten ausplattiert. Die Inkubation der Platten erfolgte über Nacht (mindestens 16
Stunden) bei 37°C. Die Platten dienen zum einen zur Selektion, zum anderen zur
Vermehrung jener Bakterien, die den gewünschten Vektor eingebaut und aufgrund des im
Plasmid enthaltenen Resistenzgens gegen das entsprechende Antibiotikum überlebt haben.
3.1.7 Identifizierung rekombinanter Klone
Die LB amp -Platten wurden am nächsten Tag aus dem Inkubator genommen und bis zur
Verwendung bei 4°C gelagert.
Um die von den Antibiotika-resistenten Bakterienzellen aufgenommene Plasmid-DNA
untersuchen zu können, mussten zunächst mehrere Einzelkolonien mit einer gelben, sterilen
Pipettenspitze gepickt und über Nacht in jeweils 3 ml ampicillinhaltigem (TOP10F’; Ampicillin
1:1000) bzw. ampicillin- und chloramphenicolhaltigem LB-Medium (BL21(DE3); Ampicillin
200 mg/ml, Chloramphenicol 34 mg/ml) bei 37°C schüttelnd kultiviert werden.
36
Methoden
Zur Kontrolle wurde am nächsten Tag die Plasmid-DNA isoliert (3.1.9), mit geeigneten
Restriktionsenzymen geschnitten (3.1.3) und auf einem Agarosegel aufgetrennt (3.1.1). Nach
der gelelektrophoretischen Auftrennung konnten positive (d.h., das Insert enthaltene) und
negative Klone voneinander unterschieden werden.
3.1.8 Isolierung von Plasmid-DNA
Die Plasmid-Isolation erfolgte mit Hilfe des „FastPlasmid Mini“ -Aufreinigungskit von
Eppendorf. Die Isolation wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
3.1.9 Sequenzierung von DNA
Die Sequenzierungen wurden von dem Eurofins MWG Operon Servicelabor (Martinsried)
durchgeführt. Dazu wurden 50-100 ng DNA pro µl benötigt, die entsprechend mit ddH 2 O auf
15µl aufgefüllt wurden. Die Primer für die jeweiligen Plasmide wurde von dem MWG
Servicelabor zur Verfügung gestellt wurden.
3.1.10 Konzentrationsbestimmung von DNA
Große und kleine Mengen an DNA wurden durch photometrische Messungen der optischen
Dichte (OD) bei 260 nm (Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren) und 280 nm
(Absorptionsmaximum von Proteinen) ermittelt. Verantwortlich für die Absorption des UVLichts sind die Aromaten der Basen.
Bei einer Wellenlänge von 260 nm und einer Quarzküvettenschichtdicke von 1 cm entspricht
die Absorption einem Wert von 1, wenn die Lösung 50 µg/ml doppelsträngige DNA, 40 µg/ml
einzelsträngige DNA und 33 µg/ml einzelsträngiges Oligonukleotid enthält.
Mit dem OD-Wert und der nachfolgenden Formel kann die Konzentration (c) der DNALösung bestimmt werden.
(OD 260nm – OD 280nm ) x 2 x 50 x Verdünnungsfaktor = c [µg/ml]
Bildet man den Quotienten aus der OD 260nm und OD 280nm , erhält man eine Aussage über den
Reinheitsgrad der DNA-Lösung. Doppelsträngige DNA ohne Verunreinigungen besitzt einen
37
Methoden
Quotienten von > 1,8. Kleinere Werte deuten auf eine Verunreinigung durch Protein hin,
größere Werte durch RNA oder Alkohol.
3.2
Proteinbiochemische Methoden
3.2.1
Proteinexpression
Für die Expression der NC16a-Domäne wurde eine Über-Nacht-Kultur eines positiven Klons
(BL21 + pRSET A-NC16a) angesetzt und solange bei 37°C kultiviert (ca. 16 Stunden), bis
die Bakterienkultur eine optimale optische Dichte von OD 600 ~ 0,5 (frühe log-Phase) erreicht
hat. Das Wachstum der Kultur wurde stetig durch photometrische Messungen bei 600 nm
kontrolliert. Nach einer 3-stündigen Stimulation mit 0,2 mM IPTG und anschließender
Zugabe eines bakteriellen Protease-Inhibitor-Cocktails, wurden die Zellen durch dreimaliges
Sonifizieren (Behandlung mit Ultraschall) aufgeschlossen und das Protein freigesetzt. Um
sicherzustellen, dass die Bakteriellenkultur nach IPTG-Stimulation das gewünschte Protein
exprimierte und auch in den Überstand abgegeben hat, wurde aus der Über-Nacht-Kultur
(Ü/N), nach der Stimulation (+IPTG) und aus dem Überstand (ÜS) jeweils ein Aliquot
entnommen. Die Proben wurden mit einem Denaturierungspuffer versetzt, auf einem
15 %igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Mittels der
Coomassie-Färbelösung sollte die gewünschte NC16a-Domäne angefärbt und besonders
nach IPTG-Stimulation und im Überstand sichtbar werden.
3.2.2 Proteinaufreinigung mittels Affinitätschromatographie
Die Aufreinigung der NC16a-Domäne erfolgte über das Hexa-Histidin-Motiv, welches bereits
im Expressionvektor pRSET A vorlag und N-terminal des Proteins gelegen ist. Die
Reinigungsmethode basiert auf einer Interaktion (Komplexbildung) zwischen elektropositiven
Metallen der Übergangsgruppen, wie z.B. Cu2+ oder Co2+, die sehr fest an ein Harz
gebunden sind, und den Histidinresten. Durch die extrem stabile Bindung Histidin-haltiger
Proteine an die Metall-Ionen können unspezifische Proteine leicht ausgewaschen werden.
Die Elution der Proteine erfolgte durch einen Imidazolgradienten. Bei der Elution mit Imidazol
findet eine Verdrängung der His-Tag-Proteine statt, da aufgrund der Ähnlichkeit des
Imidazols zu Histidin eine Verdrängung des Histidins von den Metallionen stattfindet. Diese
Art
der
Proteinaufreinigung
wird
auch
chromatographie (IMAC) bezeichnet.
38
als
immobilisierte
Metallchelat-Affinitäts-
Methoden
Zur Aufreinigung der Proteine wurde eine Talon-Säule (TALON™ Metal Affinity Resins IMAC
System; Clontech) verwendet. Das Talon-IMAC-Harz ist sehr beständig. Talon selber enthält
einen speziellen Polydentat-Metall-Chelator, der das elektropositive Metallion (Co2+) über
vier Koordinationsstellen bindet. Dadurch wird ein Auswaschen der Metallionen verhindert.
Zwei weitere Koordinationsstellen sind frei zugänglich, so dass die His-konjugierten Proteine
bzw. das Imidazol binden kann.
Bevor der Überstand auf die Aufreinigungssäule gegeben werden konnte, wurde
diese mit 200 - 300 µl TALON-IMAC-Harz befüllt und zur Äquilibrierung zunächst mit Puffer A
(mindestens das 5-fache des Säulenvolumens) durchgespült. Der Überstand konnte
anschließend auf die Säule gegeben werden und wurde in einem neuen Gefäß wieder
aufgefangen (Durchfluss). Danach wurde die Säule erneut mit Puffer A gewaschen und
dieser Puffer ebenfalls in einem neuen Becherglas aufgefangen (Waschfraktion). Vom
Überstand, dem Durchfluss und der Waschfraktion wurde jeweils ein Aliquot entnommen, um
später auf einem SDS-Polyacrylamidgel die Bindung der Proteine an die Säule kontrollieren
zu können. Anschließend erfolgte die Elution der Proteine mittels Puffer B. Puffer B enthielt
Imidazol, welches die His 6 -Fusionsproteine von den Metallionen und somit von der Säule
verdrängte. Da sich für weitere Experimente das Imidazol als störend auswirken würde,
musste dieses durch Dialyse in einem geeigneten Puffer aus der Proteinlösung wieder
entfernt werden.
Puffer A:
300 mM NaCl
50 mM Na 2 HPO 4 pH 8,0
Puffer B:
300 mM NaCl
50 mM Na 2 HPO 4 pH 8,0
150 mM Imidazol
3.2.3 Dialyse
Bei der Dialyse wird ein Puffer durch einen zweiten ersetzt, um ungewollte Bestandteile
innerhalb einer Lösung schnell und effektiv zu entfernen. Dazu wurde die Proteinlösung in
eine Dialysekassette (Pierce) gefüllt, die zuvor in dem gewünschten Puffer äquilibriert wurde.
In dieser Arbeit wurde die Proteinlösung gegen PBS-Puffer dialysiert, damit das Protein für
weitere Experimente in einem geeigneten Puffersystem vorliegt. Das Volumen des Puffers
sollte möglichst hoch sein im Vergleich zum Volumen des zu ersetzenden Puffers. Der
Austausch findet durch Diffusion statt. Die Dialyse wurde zunächst für 2x 2 Stunden tagsüber
39
Methoden
und dann noch einmal über Nacht bei 4°C durchgeführt. Dabei wurde der gewünschte Puffer
zweimal gegen einen frischen ersetzt. Nach Konzentrationsbestimmung der Proteinlösungen
wurde diese bis zur nächsten Verwendung bei -20°C aufbewahrt.
3.2.4 TCA-Fällung
Proteine können mittels Säuren ausgefällt werden, um z.B. Ionen oder Agenzien zu
entfernen, die die Gelelektrophorese oder Proteinbestimmung stören würden, und/oder um
das Protein zu konzentrieren. Durch die pH-Verschiebung nach Zugabe einer Säure wird die
Löslichkeit der Proteine beeinflusst. Für die Arbeit wurde Trichloressigsäure (TCA) als
Fällungsmittel für Proteine aus einem Zellhomogenisat oder aus dem Kulturmedium
verwendet. Dazu wurde die Proteinlösung mit ¼ Volumen 55 %-TCA- und 1/ 8 Volumen 1 %
Triton-Lösung nach mehrmaligem Mischen für 10 Minuten auf Eis inkubiert, die gefällten
Proteine 10 Minuten bei 13000 rpm und 4°C zentrifugiert und das Pellet anschließend mit
800 µl 100% Aceton gewaschen. Danach wurde ein weiteres Mal unter den gleichen
Bedingungen zentrifugiert, das Pellet anschließend an der Luft getrocknet und in SDSProbenpuffer gelöst.
3.2.5 SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)
Die SDS-PAGE nach Laemmli (1970) ist eine Methode zur Trennung von Proteinen
entsprechend ihrer molaren Masse in einem elektrischen Feld. Hierbei handelt es sich um
eine spezielle Variante der Polyacrylamid-Gelelelektrophorese, bei der das anionische
Detergenz (SDS) die Eigenladung von Proteinen überdeckt. Pro 1 g Protein binden ca. 1,4 g
SDS-Moleküle, wodurch negativ geladene SDS-Protein-Komplexe entstehen. Die Proteine
weisen somit eine konstante Ladungsverteilung auf und wandern dadurch alle zum Pluspol.
10 % SDS wurde zumeist bei der Probenvorbereitung im Überschuss zu den
Proteinen hinzugegeben. Bevor die Proben auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen wurden,
mussten diese zusätzlich in einem Probenpuffer aufgenommen werden. Zum Probenpuffer
wurde hier üblicherweise die reduzierende Thiolverbindung -Mercaptoethanol zugesetzt, die
bestehende Disulfidbrücken aufbricht. Die Proben wurden anschließend bei 95°C für 5
Minuten aufgekocht und auf einem 15 %igen Gel entsprechend ihrer Größe aufgetrennt.
Parallel zu den Proben wurde immer ein Größenstandard (Prestained) auf das Gel
aufgetragen, der aus verschiedenen Proteinen bekannter Größen besteht.
40
Methoden
3.2.6 Immuno-Blot
Hierbei handelt es sich um den Nachweis spezifischer Proteine, die nach elektrophoretischer
Auftrennung gemäß der SDS-PAGE (3.2.4) auf eine Membran transferiert und nach
Absättigung freier Bindungsstellen mit Hilfe eines geeigneten Primärantikörpers markiert
werden können. Die Detektion selber erfolgte mit einem Sekundärantikörper, der mit einem
Enzym gekoppelt ist und spezifisch den Fc-Teil des Erstantikörpers erkennt. Während dieser
Arbeit wurden ausschließlich Zweitantikörper verwendet, die mit einer Meerrettichperoxidase
(HRP) gekoppelt waren. Der Nachweis der so markierten Proteine erfolgte mit Hilfe der ECLReaktion (Enhanced Chemoluminescence Reaction). Diese Reaktion beruht auf der
Detektion von Lichtstrahlen, die bei der enzymatischen Umwandlung des Substrates Luminol
in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid durch die an den Zweitantikörper gekoppelte
Peroxidase freigesetzt werden. Die hierbei emittierte Strahlung wurde anschließend auf
einem Röntgenfilm nachgewiesen.
Western Blot
Bei einem Western Blot werden gelelektrophoretisch aufgetrennte Proteine mittels
Elektrotransfer
auf
eine
Trägermembran
überführt
und
für
eine
anschließende
Immundetektion immobilisiert. Nach der SDS-PAGE (3.2.5) wurde das Gel für den
Proteintransfer luftblasenfrei auf eine angefeuchtete Membran gelegt. Gel und Membran
wurden zwischen Puffer-getränktem Whatman-Papier in die Blotkammer gegeben. Der
Transfer erfolgte bei Raumtemperatur eine Stunde bei 52 mA.
Immunologischer Nachweis
Nachdem die Proteine auf eine Membran transferiert wurden, erfolgte eine reversible
Färbung der Membran mit Ponceau S-Lösung. Zur Dokumentation und für eine spätere
Auswertung wurden die Banden des Größenstandards markiert und nach Anfertigung einer
Kopie der gefärbten Membran mit 1 x PBS wieder vollständig entfärbt.
Zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen und damit zur Reduzierung von
Hintergrundsignalen auf der Membran wurde diese wahlweise für 90 min bei RT oder über
Nacht bei 4°C in Blockierungslösung (5 % Milchpulver in PBST) auf einem Schüttler
inkubiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation der Membran mit einem entsprechenden
41
Methoden
Primärantikörper, verdünnt in Blockierungslösung, für 1 ½ Stunden bei RT, ebenfalls auf
einem Schüttler. Als Primärantikörper dienten die Seren der BP-Patienten, die zuvor für 10
Minuten mit Kaninchenserum inkubiert wurden. Reste ungebundenen Erstantikörpers
wurden durch wiederholtes, gründliches Waschen in PBST entfernt. Anschließend erfolgte
eine weitere Inkubation der Membran mit einem Sekundärantikörper, der ebenfalls in der
Blockierungslösung entsprechend verdünnt wurde. Nach erneutem Waschen unter den
bereits oben beschriebenen Bedingungen wurde die Membran anschließend mit Wasser
gespült, um Reste des Detergenz zu entfernen. Mit Hilfe einer frisch angesetzten enhanced
chemoluminescence (ECL)-Lösung, wurde die Lichtreaktion ausgelöst. Der endgültige
Nachweis erfolgte durch Autoradiographie mit einem Röntgenfilm. Die Dauer der Belichtung
des Films betrug in Abhängigkeit von der Signalintensität zwischen 1 sec und 30 min.
PBST:
1 x PBS + 0,05 % Tween 20
3.2.7 Proteinquantifizierung
Photometrische Konzentrationsbestimmung
Durch die photometrische Messung der UV-Spektren über einen Wellenlängenbereich von
240 nm bis 340 nm ist eine Konzentrationsbestimmung von Proteinen möglich. Ein wichtiges
Kriterium für die Anwendbarkeit dieser Methode sind klare Lösungen, da Trübungen zu
falschen Extinktionswerten führen können. Die Detektion von Proteinen ist aufgrund einer
Absorption des UV-Lichts bei 280 nm durch die aromatischen Aminosäuren Tryptophan und
Tyrosin möglich. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode besteht darin, dass die zu
messenden Proteinlösungen stark verdünnt vorliegen können.
Unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten (l/mol x cm) bei 280 nm, korrigiert um den
Wert bei 320 nm, lässt sich die Proteinkonzentration mit folgender Formel berechnen:
C [µg/µl] = (OD 280 nm – OD 340 nm) / 
 = spezifischer Extinktionskoeffizient [l/mol x cm]
Bicinchoninsäure (BCA) - Assay
Die Bicinchoninsäure ist eine chemische Verbindung, die mit einwertigen Kupferionen zu
einer Komplexverbindung mit violetter Farbe reagieren kann. Die BCA-Reaktion wird zur
42
Methoden
quantitativen, photometrischen Bestimmung von Proteinen verwendet. In dieser Reaktion
bilden Proteine mit zweiwertigen Kupferionen in alkalischer Lösung einen Komplex (BiuretReaktion), wobei die zweiwertigen Kupferionen durch die Komplexbildung zu einwertigen
Kupferionen reduziert werden. Diese bilden mit der Bicinchoninsäure einen violetten
Farbstoff.
Die
Intensität
der
Verfärbung
kann
dazu
verwendet
werden,
die
Proteinkonzentration zu bestimmen. Dabei wird die Absorption des violetten Farbstoffs bei
einer Wellenlänge von 562 nm mit Hilfe eines ELISA-Readers photometrisch ausgewertet.
Die Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Durch das Messen eines
BSA-Standards und anschließender linearer Regression konnte eine Eichgerade erstellt
werden, die dann als Referenz verwendet wurde.
Coomassie-Blue-Färbung
Diese
Methode
diente
zum
Nachweis
und
zur
Quantifizierung
elektrophoretisch
aufgetrennter Proteine (SDS-PAGE; 3.2.4). Die Nachweisgrenze liegt hier je nach
Farbstoffbindevermögen der Proteine bei etwa 0,1 µg.
Nach der elektrophoretischen Trennung wurden die Polyacrylamidgele für 30-60
Minuten bei RT in Coomassie-Färbelösung gegeben. Diese enthielt neben 50 % (v/v)
Methanol (zur Lösung des Coomassie-Farbstoffs) zusätzlich 10 % (v/v) Essigsäure (zur
Fixierung der Proteine im Gel). Als Farbstoff diente 0,2 % (w/v) Coomassie Brillant Blue R250. Dieser lagert sich an basische und aromatische Seitenketten von Aminosäuren, und
färbt so alle Proteine unspezifisch an. Der überschüssige Farbstoff wurde anschließend mit
Entfärbelösung (40 % (v/v) Methanol, 7 % (v/v) Essigsäure) entfernt, bis die gewünschte
Farbintensität erreicht und die angefärbten Proteine als blaue Banden im Gel sichtbar
wurden. Nachdem die Gele bis auf die Banden vollständig entfärbt waren, wurde die
Entfärbelösung entfernt und anschließend die Gele getrocknet (3.2.8).
3.2.8
Trocknen von Gelen
Um Gele für eine Dokumentation längere Zeit aufbewahren zu können, ist es sinnvoll, diese
zu trocknen. Dafür wurden die Gele in einer Gel-Trocknungslösung für mindestens 10
Minuten gewaschen und anschließend zwischen zwei Zellophan-Folien (Dry Ease Mini
Cellophane), die ebenfalls in diesem Puffer für 2 Minuten äquilibriert wurden, luftblasenfrei
gelegt. Die Gele wurden anschließend 12 bis 48 Stunden getrocknet.
43
Methoden
3.2.9 PMF-Analyse (Peptide mass fingerprinting)
Bei der PMF-Analyse handelt es sich um eine analytische Methode, um Proteine eindeutig
zu bestimmen. Zur Identifikation der NC16a-Domäne wurden ca. 3 mm der Bande aus der
Elutionsfraktion, welche im Coomassie-Gel bei einer Größe von ca. 12,6 kDa angefärbt
wurde, ausgestanzt und zur weiteren Analyse in das Servicelabor der Zentralen Bioanalytik
(ZMMK; Köln) gegeben. Bevor das gewünschte Protein mit der bekannten Sequenz aus der
Datenbank verglichen werden konnte, musste es zunächst in mehrere, kleinere Fragmente
geschnitten werden. Der Verdau fand mit Hilfe proteolytischer Enzyme wie zum Beispiel
Trypsin oder Chymotrypsin statt. Die Peptidfragmente wurden anschließend extrahiert und
mittels Massenspektroskopie (MALDI-TOF) analysiert.
3.2.10 Fluorchrom-Markierung der rekombinant hergestellten NC16a-Domäne mit
Alexa Fluor 647
Der Alexa Fluor 647-Reaktionsfarbstoff besitz einen Succinimidyl-Ester-Rest, der effizient mit
primären Aminen von Proteinen reagiert und stabile Protein-Farbstoff-Konjugate bildet. Die
mit dem Alexa Fluor 647-Farbstoff markierten Proteine haben Anregungs- und FluoreszenzEmissions-Maxima von ungefähr 650 bzw. 668 nm. Das Alexa Fluor 647 Microscale Protein
Labeling-Kit wurde von Invitrogen bezogen. Die Durchführung erfolgte nach Angaben des
Herstellers.
3.2.11 Statistik: T-Test
Bei einem T-Test handelt es sich um einen statistischen Hypothesentest, anhand dessen
sich eine signifikante Differenz zwischen den empirisch gefundenen Mittelwerten zweier
unabhängiger Stichproben näher analysieren lässt. Dadurch lässt sich entscheiden, ob der
ermittelte Mittelwertunterschied rein zufällig entstanden ist, oder ob es wirklich bedeutsame
Unterschiede zwischen den zwei untersuchten Gruppen gibt. Der in dieser Arbeit
beschriebene T-Test wurde mit Hilfe des Programms GraphPad Prism® durchgeführt.
44
Methoden
3.3
Blutzellen
3.3.1
Peripheres Blut
Zur Analyse von autoaggressiven B-Zellen im Vergleich zu normalen B-Zellen wurde als
Kontrollblut
entweder
serumarmes,
leukozytenreiches
Blut
(Buffy
coat)
von
der
Blutspendezentrale der Universitätsklinik Köln bezogen oder das Vollblut normaler
Blutspender (Labore der Dermatologie, Universitätsklinik Köln) verwendet. Vollblut von
Patienten mit bullösen Pemphigoid wurde von der Abteilung Dermatologie (Universitätsklinik
Köln) zur Verfügung gestellt. Sowohl Patienten (Abteilung Dermatologie) als auch normale
Blutspender (Labore der Dermatologie) wurden über Sinn und Zweck der Versuche
informiert und erklärten sich mit einer Blutspende einverstanden.
3.3.2 Präparation von mononuklearen Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC)
60 ml Buffy-Coat von gesunden Spendern oder 40 ml Vollblut von normalen Blutspendern
bzw. Patienten wurde mit PBS/EDTA verdünnt, auf Ficoll-Paque geschichtet (sorgt für einen
Dichtegradienten) und 40 Minuten bei 400xg ohne Bremse zentrifugiert. Durch die
Dichtezentrifugation entstanden verschiedene Zellschichten, wobei die dünne, weiße
Zellschicht in der Interphase, oberhalb der Erythrozyten, als PBMC-Schicht identifiziert
werden konnte. Die Interphase wurde vorsichtig abgenommen, in PBS/EDTA aufgenommen
und mindestens zweimal für 10 Minuten bei 300xg zentrifugiert. Die beiden Waschschritte
sind notwendig, um restliches Ficoll-Hypaque, Erythrozyten und Thrombozyten zu entfernen.
Die Zellzahl der isolierten PBMC aller Blutspender wurde anschließend mit Hilfe einer
Zellzählkammer bestimmt. Aus dem Vollblut konnten im Durchschnitt zwischen 2,5x107
(Patienten) und 5x107 (gesunde Spender) gewonnen werden.
3.3.3 Anreicherung von CD19+- und CD138+ Zellen und Färbungen
Zur Anreicherung von Zellen aus humanem, peripherem Blut wurde das magnetische
Zellseparationssystem (MACS, Miltenyi) verwendet. Hierbei werden Zellen direkt mit
superparamagnetischen Mikropartikeln, die an Antikörper gebunden sind, markiert und auf
einer Stahlkugelmatrix-Säule in einem Hochgradienten-Magnetfeld zurückgehalten. Die nicht
markierten Zellen können ungehindert die Säule passieren. Anschließend werden die
markierten Zellen außerhalb des Magnetfeldes von der Säule eluiert.
45
Methoden
Zur magnetischen Anreicherung der CD19+ - bzw. CD138+ wurden die zuvor per
Dichtegradientenzentrifugation isolierten PBMC mit den jeweiligen Mikropartikel-markierten
Antikörpern (90 µl / 1 x 107 bzw. 90 µl / 5 x 106 Zellen) für 15 Minuten bei 4°C inkubiert,
anschließend mit 1 x PBS/ 2,5 mM EDTA (Puffer) gewaschen und für 10 Minuten bei 300 xg
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Zellpellet in 500 µl Puffer resuspendiert
und die Zellen dann auf die zuvor mit dem Puffer äquilibrierten MS-Säulen gegeben. Der
Durchfluss wurde in einem separaten FACS-Röhrchen aufgefangen und stand für weitere
Zellanalysen zur Verfügung. Die auf der Säule verbliebenen, mit den Mikropartikeln
markierten Zellen wurden 3 x mit jeweils 500 µl Puffer gewaschen, um weitere unspezifische
Zellreste bzw. Verunreinigungen zu entfernen. Anschließend erfolgte die Elution der Zellen
mit 500 µl Puffer. Die angereicherten Zellen wurden dann mit entsprechenden Antikörpern
Oberflächen- bzw. intrazellulär gefärbt. Die Färbeschritte erfolgten für die CD19+ Zellen
jeweils 15 Minuten bei 4°C, für die CD138+ Zellen direkt auf der Anreicherungssäule jeweils
10 Minuten bei Raumtemperatur.
Neben den Oberflächenfärbungen wurden die CD138+ Zellen zusätzlich intrazellulär
gefärbt. Hierfür mussten die Zellen zunächst fixiert (Inside Fix, Miltenyi) und anschließend
permeabilisiert (Inside Perm, Miltenyi) werden. Für die intrazelluläre Färbung mussten die
Antikörper im Permeabilisierungspuffer vorliegen und die Zellen mit diesem Puffer
gewaschen werden, um zu gewährleisten, dass der Antikörper in die Zellen eindringen kann
und ungebundene Antikörper, Zellreste und Verunreinigungen wieder entfernt werden
können. Die gefärbten Zellen konnten anschließend durchflusszytometrisch analysiert
werden.
3.4
Durchflusszytometrie
Für die durchflusszytometrische Analyse wurde ein FACScalibur (Becton Dickinson) mit
luftgekühltem Argonlaser verwendet. Die Prinzipien dieser Methode wurden bereits
ausführlich beschrieben [Radbruch, 1992]. Bei der Durchflusszytometrie werden gleichzeitig
Streulicht- und Fluoreszenzsignale einzelner Zellen gemessen. Die gefärbten Zellen
passieren in einem Flüssigkeitsstrom nacheinander einen Laserstrahl. Dabei streuen die
Zellen das auftreffende Licht. Das in einem spitzen Winkel (3 - 10°) gestreute Licht wird als
Vorwärtsstreulicht bezeichnet und korreliert mit der Zellgröße. Das um 90° reflektierte Licht
wird als Seitwärtsstreulicht bezeichnet und korreliert mit der Granularität der Zelle. Kennt
man also die Größe und Granularität der zu untersuchenden Zellen, kann man diese relativ
leicht anhand der Streulichteigenschaften identifizieren. Die Anregung der an die Zellen
46
Methoden
gebundenen
Antikörper-Fluorochrom-Konjugate
bei
unterschiedlicher
Wellenlänge
ermöglicht eine weitere Analyse der Zellen. Hierbei werden die Zellen also durch das
Fluorchrom sichtbar gemacht. Die Messdaten der einzelnen Proben wurden mit der
CellQuest Research Software (Becton Dickinson) analysiert. Für die Auswertung wurden sie
entweder als eindimensionale Histogramme oder als zweidimensionale Punktediagramme
dargestellt.
Abb. 3.1: Schematische Darstellung des Strahlenganges eines FACScan-Gerätes.
3.4.1 Durchflußzytometrische Bestimmung der Zellzahl in einer Probe
Um die Frequenz Antigen-spezifischer B-Zellen in PBMC zu bestimmen, wurde die Anzahl
der Zellen in jeder Probe durchflusszytometrisch ermittelt. Aufgrund der konstanten
Durchflußraten (µl/s) des Durchflusszytometers konnten die absoluten Zellzahlen einer
Probe bestimmt werden. Die Zellzahl errechnet sich aus dem Probenvolumen (µl), der
Durchflussrate (µl/s) und der durchschnittlichen Zellrate (n/s) wie folgt: Zellzahl =
Probenvolumen (µl) x (Zellrate (n/s) / Durchflussrate (µl/s)). Die Durchflussraten des
Zytometers wurden mit Proben, die definierte Zellkonzentrationen enthielten, nach folgender
Formel bestimmt: Durchflussrate (µl/s) = Zellrate (n/s) / Zellkonzentration (n/µl). Durch die
Ermittlung der Zellzahl in jeder Probe konnte anschließend die Frequenz der Antigenspezifischen B-Zellen in der Ausgangsprobe berechnet werden.
47
Methoden
3.5
Zellkultur
3.5.1 Arbeiten in der Zellkultur
Bei den in der Zellkultur verwendeten Geräten handelte es sich ausschließlich um
autoklavierte Glasgeräte oder sterile Kunststoffgegenstände. Die Arbeit selber erfolgte
aseptisch unter einer sterilen Werkbank. Die verwendeten Lösungen wurden entweder
autoklaviert oder durch einen Sterilfilter filtriert und damit sterilisiert. Die Kultivierung der in
dieser
Arbeit
verwendeten
Zellen
wurde
in
Brutschränken
bei
37°C
in
einer
wassergesättigten Atmosphäre mit einem CO 2 -Gehalt von 5 % durchgeführt.
3.5.2
Auftauen von Zellen
Zellen, die gerade nicht kultiviert wurden, lagerten in Stickstofftanks bei -196°C. Sollten neue
Zellen in Kultur genommen werden, musste das Auftauen der Zellen schnellstmöglich in
einem 37°C warmen Wasserbad durchgeführt werden. Anschließend wurden die Zellen in
10 ml Medium aufgenommen und vorsichtig 5 min bei 1000 rpm zentrifugiert, um das im
Einfriermedium enthaltene DMSO zu entfernen. Der Überstand wurde abgenommen und
verworfen. Das Zellpellet wurde dann in 10 ml frischem Medium aufgenommen und
resuspendiert. Anschließend konnten die Zellen auf eine Petrischale ausplattiert werden.
3.5.3
Passieren von Zellen
Um adhärente Zellen vom Boden der Kulturschale zu lösen, mussten den Zellen zunächst
die dafür benötigten zweiwertigen Kationen entzogen werden. Für gewöhnlich verwendet
man dafür EDTA. EDTA ist in der Lage, mit den zweiwertigen Ionen einen stabilen Komplex
zu bilden. Durch Zugabe von Trypsin wurden für die Anheftung verantwortliche Rezeptoren
zusätzlich inaktiviert. Da das im Medium vorhandene FCS Trypsininhibitoren enthält, musste
das alte Medium zunächst abgesaugt und die Zellen mit PBS gründlich gewaschen werden.
Anschließend wurde ca. 1 ml von der Trypsin/EDTA (TE)-Lösung auf die Zellen gegeben und
für einige Minuten in einem Brutschrank bei 37°C inkubiert. Das Ablösen wurde regelmäßig
unter einem Mikroskop kontrolliert. Nachdem sich die Zellen deutlich vom Untergrund gelöst
hatten, wurde frisches, serumhaltiges Medium zu den Zellen gegeben, um das Trypsin zu
inaktivieren. Die Zellen wurden anschließend auf mehrere Petrischalen verteilt, in
zusätzliches, frisches Medium aufgenommen und in diesem (10 ml) kultiviert. Das Wachstum
48
Methoden
der Zellen wurde regelmäßig kontrolliert und ggf. das Medium gewechselt. Waren die Zellen
konfluent genug (d.h., war die Petrischale ca. 80 % mit Zellen belegt), mussten diese nach
den oben beschriebenen Bedingungen verdünnt und neu ausplattiert werden.
Zellkulturmedium:
D’MEM + 10 % FCS
10 U/100 µg/ml Penicillin/Streptomycin
350 µg/ml Geneticin 418 sulphate
(transfiziert: + 1 µg/ml Hygromycin)
TE-Lösung:
0,25 % Trypsin
2 mM EDTA
3.5.4
Transfektion von EBNA 293-Zellen
Die Transfektion ist eine Methode zur Einführung fremder DNA in eukaryotische Zellen. Ein
weit verbreitetes Verfahren ist die Lipofektion, da sie unkompliziert und sehr effektiv ist.
Negativ geladene DNA-Moleküle binden durch elektrostatische Wechselwirkungen an
kationische Lipide, wodurch sich ein DNA-Liposomen-Komplex bildet. Dieser Komplex
fusioniert mit der ähnlich aufgebauten Zellmembran. Dadurch gelangt die DNA so ins
Zellinnere und schließlich in den Zellkern, wo sie exprimiert wird. Bei der DNA handelt es
sich meist um einen Vektor, in den eine definierte cDNA kloniert wurde. Diese cDNA soll von
den transfizierten Zellen exprimiert werden. Vektor-DNA, die nicht ins Genom integriert
wurde, geht bei der anschließenden Zellteilung verloren bzw. wird schnell abgebaut. Diese
Transfektion bezeichnet man auch als transiente Transfektion. Um eine stabile Transfektion
und damit eine effektive Proteinexpression über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten,
verwendet man einen episomalen Vektor. Der pCEP-PU Vektor besitzt das Ebstein-Barr
Nuclear Antigen, welches in den Wirtszellen abgelesen und der Vektor aufgrund dessen
stets amplifiziert wird. Durch Zugabe des entsprechenden Antibiotikums in das für die Zellen
vorgesehene Medium (sog. Selektionsmedium) werden Zellen, die den gewünschten Vektor
mit der Ziel-DNA integriert haben, selektioniert. Nach einiger Zeit sollten demnach nur noch
Zellen auf der Platte vorhanden sein, die den Vektor und damit die cDNA stabil in ihr Genom
integriert haben.
Die Transfektion von EBNA 293-Zellen mit dem Expressionsvektor pCEP4 inklusive
„Konstrukt F“ mit der cDNA für die NC16a-Domäne plus His 6 -Motivsequenz wurde mit
FuGene6 (Roche, Mannheim) durchgeführt. Dazu wurden in ein Reagiergefäß 6 µl FuGene6
49
Methoden
zu 94 µl serumfreies Medium tropfenweise hinzu gegeben, ohne dabei die Innenwand des
sterilen Gefäßes zu berühren. Die Mischung wurde vorsichtig gemixt und anschließend für 5
min bei RT inkubiert. In ein zweites Gefäß wurden 2 µg Plasmid-DNA vorgelegt und die
Medium-FuGene6-Mischung in dieses zweite Gefäß tropfenweise überführt. Nach leichtem
Mischen folgte eine 15-minütige Inkubation bei RT. Zuvor wurden die Zellen mit frischem
Medium versorgt und auf eine 6-well-Platte aufgeteilt. Die Zellen, die sich in den oberen drei
Vertiefungen befanden, sollten transfiziert werden. Die untere Reihe diente als Kontrolle.
Nach der Inkubation des Gemischs wurde dieses zu den 50 - 70 % konfluent bewachsenen
Vertiefungen getropft. Nach 24 Stunden begann die Selektion mit Antibiotika-haltigem
Medium der transgenen Zellen und wurde beendet, als nach 3 Tagen in den KontrollLöchern die nicht transfizierten Zellen komplett gestorben waren. Dementsprechend haben
nur die Zellen überlebt, die den Vektor und damit die Resistenz erfolgreich aufgenommen
hatten.
Um die Proteinexpression und die Selektion in dem Zellkulturüberstand zu
überprüfen, wurden die Zellen zunächst auf Triple Flasks verteilt und mit Medium ohne FCSZusatz behandelt, sobald sie konfluent waren. Die Triple Flasks bieten den Zellen eine
größere Ausbreitungsfläche. Durch das größere Volumen wird eine höhere Ausbeute des
Proteins in dem Überstand gewährleistet. Dazu wurden sie mit PBS gewaschen und 72 h bis
zur ersten Ernte in serumfreiem Medium kultiviert. Die Überstände wurden regelmäßig
abgenommen, mit Proteaseinhibitor (PMSF) versetzt und 15 Minuten bei 8000 rpm
zentrifugiert, um Schwebstoffe und tote Zellen zu pelletieren. Anschließend wurde der
Überstand vorsichtig filtriert und zur pH-Wert-Stabilisierung mit 50 ml 0,5 M Na 2 HPO 4 pH 8.0
versetzt. Der Überstand wurde bis zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert.
Selektionsmedium:
500 ml DMEM / F12 1:1 (Medium)
10 % FCS
350 µg / ml G-418
20- 30 µg / ml Hygromycin
50
Ergebnisse
Kapitel 4
Ergebnisse
4.1
Rekombinante Herstellung der NC16a-Domäne des Kollagen XVII
Das bullöse Pemphigoid (BP) ist geprägt durch das Auftreten von Autoantikörpern, die gegen
die NC16a-Domäne des epidermalen Transmembranproteins Kollagen XVII gerichtet sind.
Diese Autoantikörper sind zum einen auf der Zelloberfläche von Gedächtnis-B-Zellen
lokalisiert,
zum
anderen
werden
sie
von
Antikörper-sezernierenden
Zellen,
den
Plasmazellen, produziert und zirkulieren anschließend im Blut. Für den Nachweis und die
Phänotypisierung solcher autoreaktiver NC16a-spezifischer B-Zellen im Blut von Patienten
mit BP mittels durchflusszytometrischer Analysen, wurde der Arbeitsgruppe ein bakteriell
hergestelltes, 35 kDa großes Fusionsprotein (GST-NC16a-Biotin) zur Verfügung gestellt [Dr.
Heike Leyendeckers; Miltenyi Biotech GmbH, Bergisch Gladbach].
Plasmazellen
sind
dadurch
charakterisiert, dass sie intrazellulär
Antikörper
aufweisen. Um insbesondere die mit Hilfe von Mikropartikeln angereicherten CD138+
Plasmazellen spezifisch für NC16a detektieren zu können, musste das biotinylierte Antigen
zunächst an intrazellulär vorhandenes, für NC16a positives Immunglobulin G binden. Durch
die Wechselwirkung von Biotin mit Streptavidin als Sekundärantikörper (Streptavidin-PE)
bzw. mittels eines alternativen Zweitantikörpers (anti-Biotin-APC), sollten anschließend die
Plasmazellen spezifisch für die NC16a-Domäne im Durchflusszytometer dargestellt werden.
Um die Durchführbarkeit dieses Ansatzes zu überprüfen, wurden zunächst PBMC eines
gesunden Spenders untersucht. Hier sollten mit dem Reagens (GST-NC16a-Biotin) in der
aufgereinigten CD138+ Zellpopulation keine NC16a-spezifischen Zellen nachweisbar sein.
Allerdings erwies sich die intrazelluläre Färbung mit diesem Reagens als problematisch, da
aufgrund der starken, unspezifischen Hintergrundfärbung (vgl. Abb. 4.1), die bei den
Kontrollpersonen beobachtet werden konnte, eine Detektion der nur wenigen NC16aspezifischen Plasmazellen in BP-Patienten nicht möglich gewesen wäre.
In Abbildung 4.1 sind zwei Punktediagramme dargestellt, die eine Zweifarbenanalyse
für anti-Biotin-APC und CD38 (A) bzw. eine Einfarbenanalyse für Strepatividin-PE von
51
Ergebnisse
Plasmazellen
eines
gesunden
zeigen.
Spenders
Die
mit
CD138-Magnetpartikeln
angereicherten Plasmazellen konnten durch den Plasmazell-Marker CD38 (A) bzw. im
Vorwärtsstreulicht aufgrund ihrer Streulichteigenschaften (B) identifiziert werden. In beiden
Punktediagrammen ist deutlich erkennbar, dass die Plasmazellen positiv für GST-NC16aBiotin sind. Durch Sekundärantikörperkontrollen, d.h., die Zellen wurden nur mit den
Zweitantikörpern anti-Biotin-APC und Streptavidin-PE gefärbt, konnte ausgeschlossen
werden, dass der hohe Hintergrund auf eine unspezifische Bindung der Zweitantikörper
zurückzuführen ist (Daten nicht gezeigt). Auch durch Verwendung von geringeren Mengen
des Antigens konnte die Hintergrundfärbung nur bedingt verringert werden.
B
GST-NC16a-Biotin/anti-Biotin-APC
GST-NC16a-Biotin/Streptavidin-PE
A
FSC
CD38
Abb. 4.1: Intrazelluläre Kontrollfärbung von CD138+ Plasmazellen eines gesunden Spenders.
Mononukleare Zellen aus dem peripheren Blut wurden mit CD138-Mikropartikeln inkubiert, über eine MS-Säule
angereichert und anschließend auf der Säule intrazellulär mit GST-NC16a-Biotin/anti-Biotin-APC (A) und GST+
NC16a-Biotin/Streptavidin-PE (B) gefärbt. In Punktediagramm (A) wurden die CD138 Plasmazellen mittels CD38
und in Punktediagramm (B) mittels Streulichteigenschaften (Vorwärtsstreulicht, FSC) identifiziert (X-Achse). In
beiden Darstellungen sind die Zellen positiv für NC16a und deuten auf eine hohe, unspezifische Färbung hin.
Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die unspezifische Färbung wesentlich auf die
Glutathion-S-Transferase zurückzuführen ist. Daher sollte das NC16a-Antigen mit einem
alternativen
Aufreinigungsmotiv
versehen
werden,
unerwünschter Kreuzreaktionen reduzieren würde.
52
welches
die
Wahrscheinlichkeit
Ergebnisse
4.1.1 Expressionsansatz in einem eukaryotischen Expressionssystem
Bei dem NC16a-Protein handelt es sich um eine Domäne des BP180-Proteins, ebenfalls
bezeichnet als Kollagen XVII, einem Transmembranprotein des Typs II, welches mit
Hemidesmosomen assoziiert ist. Der Grund für die Namensgebung der 72 Aminosäuren
großen Domäne liegt in ihrer Lokalisation innerhalb des Volllängeproteins. Als 16. nichtkollagene Domäne grenzt es unmittelbar an der Membran und gilt als die wesentlichste,
immundominante Stelle, gegen welche die Autoantikörper gerichtet sind. Um autoreaktive BZellen detektieren zu können, die zur Produktion dieser Autoantikörper beisteuern, sollte die
NC16a-Domäne zunächst in einem eukaryotischen Expressionssystem (EBNA-293, humane
Nierenzellen) rekombinant hergestellt werden. Die cDNA für NC16a lag bereits als „Konstrukt
F“ (zusätzlich mit dem Transmembranabschnitt und dem intrazellulären Teil des BP180Proteins; vgl. Abb. 4.2) in dem episomalen pCEP4 Expressionsvektor vor. Dieser verfügte
zudem über ein Hexa-Histidin-Motiv, welches C-terminal lokalisiert war und zur Aufreinigung
des Proteins über eine Affinitätssäule dienen sollte. Der Vektor wurde von der Arbeitsgruppe
Brinkmann [Universität Lübeck] zur Verfügung gestellt.
His-Tag
NH 2
IZD
TM
COOH
NC16A
Abb. 4.2: Schematische Darstellung des F-Konstrukts.
Das Konstrukt F besteht aus 148 Aminosäuren (AS) und setzt sich aus der intrazellulären Domäne (IZD, 43 AS),
der Transmembrandomäne (TM, 22 AS) und der NC16a-Domäne (NC16A, 72 AS) des Kollagen XVII zusammen.
C-terminal wurde das Konstrukt mit einem Hexa-Histidin-Motiv fusioniert, über das das rekombinant hergestellte
F-Konstrukt mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt werden kann. Die für das Konstrukt F kodierende cDNA
wurde in den episomalen Expressionsvektor pCEP4 kloniert [AG Brinkmann, Universität Lübeck], der in einem
eukaryotischen Expressionssystem verwendet wird.
Nach Transfektion des pCEP4-Vektors in die EBNA 293-Zellen, konnten wenige Tage später
die transgenen Zellen mittels Selektionsmethode (Medium plus Antibiotikum) identifiziert
werden. Analog wurden die nicht-transfizierten Zellen unter den gleichen Bedingungen
behandelt. Um sicherzustellen, dass die transfizierten Zellen das gewünschte Protein
exprimierten und dieses auch in den Überstand abgegeben haben, wurden nach 3 Tagen
53
Ergebnisse
Zellen zur Kontrolle in serumfreiem Medium kultiviert und der Überstand abgenommen. Nach
einer TCA-Fällung wurde die Kontrollprobe unter reduzierenden Bedingungen auf einem
15 %igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Da das
rekombinante Protein am C-terminalen Ende mit einem His 6 -Motiv fusioniert war, sollte es
möglich sein, die NC16a-Domäne bei einer Größe von etwa 12,5 kDa mit einem anti-HisAntikörper und einem entsprechenden Sekundärantikörper zu detektieren. Allerdings war es
selbst nach mehreren Versuchsansätzen und veränderten Bedingungen wie z.B. die
Zusammensetzung des Mediums und unterschiedliche Konzentrationen der einzusetzenden
DNA nicht möglich, das Protein aus dem Überstand zu isolieren (Daten nicht gezeigt).
Alternativ
sollte
die
NC16a-Domäne
nun
mit
Hilfe
eines
prokaryotischen
Expressionssystem (BL21-Zellen) rekombinant hergestellt werden. Da in prokaryotischen
Expressionssystemen keine post-translationalen Modifikationen stattfinden, bei der NC16aDomäne jedoch in vivo eine Protein-Prozessierung vorkommt, muss das bakteriell
rekombinante hergestellte Protein anschließend auf seine Antigenität hin überprüft werden.
Nur so kann sichergestellt werden, dass die NC16a-Domäne in einem aktiven Zustand
vorliegt.
4.1.2 Prokaryotische Expression: Klonierungsstrategie
Da der eukaryotische Expressionsvektor pCEP4 mit dem „Konstrukt F“ für eine Expression in
einem prokaryotischen System nicht geeignet ist, war es erforderlich, die cDNA der NC16aDomäne in einen für das bakterielle Expressionssystem konformen Vektor umzuklonieren.
Abbildung 4.3 zeigt einen kurzen Abschnitt der Nukleotidsequenz des pCEP4-Vektors
(bp 601-1060). In diesem Abschnitt ist die Sequenz des gesamten Konstrukts F (grau/grün;
bp 636-1091) dargestellt. Ebenso wurde die Nukleotidsequenz der NC16a-Domäne als ein
Teil des Konstrukts gesondert hervorgehoben (grün; bp 842-1058) und sowohl Beginn als
auch Ende der Sequenz markiert.
54
Ergebnisse
 Start F-Konstrukt
601
651
701
751
801
851
901
951
1001
1051
GTCAGATCTC
TACAGCAGCA
CGCTGGCGGC
CCTGCTGCAG
CTACTCCTGG
GAAGCTGAAG
TGCCCTATGG
ATGGCACCCG
CAGCCAGGAG
Ende NC16a 
AGGAAAATGG
TAGAAGCTGG
GTGGTGGTGG
GGCCCTTGGG
CTGGTGGAAG
GGCTGCTCTT
GCGCGTGTGG
GGACAGCATG
CGGCGGGAGC
GAGCTCTGGA
AAATCTCCGA
GTACCAGCTG
TGGCAGTGGA
GACCAGCGCC
TGGCTGCTGG
CGGCCTCATT
ATGAGCTGGA
GATAGAATAG
AGACCTGGAC
TGTTCGTGAG
CATCACCATC
CTAGCATGGA TATCCACAGC
GGAGGTGGCG GTGTTGGTGG
AGCCTGGTGC CCCTGCGGCT
GCCTGCTGCT CACCTGGCTG
 Start NC16a
GCTCTGGCGG AGGAGGTGAG
GAGGATCAGG AGGAGCATAC
AAAAGGACCG CCTCCAGGGC
AAAATTGGGC TGCACAGTGA
GAAGAAGCTA ATGATGGAAC
Ende F-Konstrukt 
ACCATCACTG AGTCGAGGCC
Hexa-Histidin-Motiv
Stopp
Abb. 4.3: Ausschnitt der Nukleotidsequenz des pCEP4-Vektors mit F-Konstrukt.
Die für das F-Konstrukt kodierende cDNA (grau/grün) wurde in den pCEP4-Vektor über eine Nhe I- und eine
BamH I- Schnittstelle eingefügt. Das Konstrukt besteht aus der Intrazellulär-, der Transmembran- und der NC16aDomäne des Kollagen XVII und einem Hexa-Histidin-Motiv. Die aus 72 AS bestehende NC16a-Domäne wurde
besonders hervorgehoben (grün) und der Start (Glu) bzw. das Ende (Asn) der Domäne gesondert markiert.
Für die geplanten Experimente war lediglich die NC16a-Domäne und nicht das gesamte FKonstrukt bedeutend, deshalb sollte ausschließlich der kurze Sequenzabschnitt der Domäne
(grün) in den neuen Expressionsvektor kloniert werden. Allerdings flankierten keine zum
Zielvektor äquivalenten Erkennungsstellen für definierte Restriktionsenzyme die Sequenz der
NC16a-Domäne.
Somit
war
es
nicht
möglich,
die
gewünschte
Sequenz
mittels
Restriktionsverdau herauszuschneiden und in den Zielvektor einzufügen. Daher war es
notwendig, die Nukleotidsequenz der NC16a-Domäne unter Verwendung von geeigneten
Oligonukleotiden (Abb. 4.4) durch das PCR-Verfahren zu amplifizieren. Um ein amplifiziertes
Fragment anschließend in den gewünschten Zielvektor klonieren zu können, müssen
zusätzlich passende Restriktionsschnittstellen vorhanden sein. Aus diesem Grund wurde
über
die
Oligonukleotide
sowohl
N-terminal
Erkennungsstelle eingebaut.
55
als
auch
C-terminal
jeweils
eine
Ergebnisse
Start NC16a
5’GAG GTG AGG AAG CTG AAG
3’CTC CAC TCC TTC GAC TTC
BamH I
5’GCT TAT GGA TCC GAG GTG AGG AAG 3’
forward primer
reverse primer
3’GTC CTT TTA ACT GCT TCG AAC GCG 5’
5’ATG GAA CAG GAA AAT
3’TAC CTT GTC CTT TTA
Stopp
Hind III
Ende NC16a
Abb. 4.4: Sequenz der entworfenen Oligonukleotide zur Amplifikation der NC16a-Domäne.
Zur Amplifikation der für die NC16a-Domäne kodierenden cDNA wurden zwei Oligonukleotide gewählt, die jeweils
am 5’- (GCTTATGGATCCGAGGTGAGGAAG) bzw. am 3’-Ende (GTCCTTTTAACTGCTTCGAACGCG) der
Sequenz binden können. Um die cDNA in einen entsprechenden Vektor klonieren zu können, wurden zusätzlich
zwei Erkennungssequenzen für die Restriktionsenzyme BamH I (5’-Ende) und Hind III (3’-Ende) eingefügt. Der 3’Primer verfügt zusätzlich über ein Stopp-Codon (ACT), welches unmittelbar hinter der letzten Aminosäure der
NC16a-Domäne angefügt wurde und das Ende des Proteins bei der Transkription signalisiert.
In der Abbildung 4.4 werden die Oligonukleotide zur Amplifikation der NC16a-Domäne
dargestellt. Das Primer-Paar wurde so gewählt, dass jeweils 9 (forward, N-terminal) bzw. 12
(reverse, C-terminal) Basen zur NC16a-Sequenz komplementär sind und unmittelbar am
Anfang
respektive
am
Ende
der
Nukleotidsequenz
binden.
Ein
GC-Gehalt
der
Oligonukleotide von mindestens 50 % sollte zudem eine stabilere Bindung an die
Nukleotidsequenz gewährleisten. Diese Stabilität wird unter anderem durch die Ausbildung
von drei Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Basen Guanin und Cytosin erzeugt.
Zusätzlich wurde im forward primer N-terminal liegend die Erkennungssequenz für das
Restriktionsenzym BamH I eingeführt. Dementsprechend findet man die zweite Erkennungssequenz für Hind III C-terminal einem Stopp-Codon folgend im reverse primer. Über diese
Schnittstellen sollte dann zu einem späteren Zeitpunkt das Fragment in den gewünschten
Expressionsvektor eingefügt werden.
56
Ergebnisse
4.1.2.1
Amplifikation der NC16a-Domäne
Als Matrize für die PCR zur Amplifikation der NC16a-Domäne wurden 2 µg der kompletten
cDNA des pCEP4-Vektors eingesetzt. Mit den zuvor entworfenen Oligonukleotiden (vgl.
Abschnitt 4.1.2) wurde dann ausschließlich der cDNA-Abschnitt amplifiziert, der für die
NC16a-Domäne codiert. Abbildung 4.5 zeigt das amplifizierte PCR-Produkt auf einem
1,7 %igem Agarosegel. Die Größe der NC16a-Sequenz liegt bei 230 bp.
bp-L
1
2
500
400
300
PCR-Produkt*
200
100
Abb. 4.5: Amplifizierung der NC16a-Domäne.
Mit Hilfe der entworfenen Oligonukleotide wurde die cDNA der NC16a-Domäne amplifiziert. Als Matrize zur
Amplifikation der Domäne diente das F-Konstrukt, welches im pCEP4-Vektor vorlag. Das PCR-Produkt (* NC16aDomäne) wurde auf ein 1,7 %iges Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Die Domäne hat
eine Größe von 230 Basenpaaren (1). Die PCR-Kontrolle (H 2 O, 2) war negativ. Die Bande wurde aus dem Gel
extrahiert und bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert. * NC16a-Domäne. bp = Basenpaar; bp-L = 100
bp-Leiter.
4.1.3 Klonierung der NC16a-Domäne in den Klonierungsvektor pDrive
Da
die
NC16a-Domäne
als
noch
ungeschnittenes
PCR-Produkt
nicht
in
den
Expressionsvektor kloniert werden konnte, wurde diese nach Extraktion aus dem Gel über
glatte Enden zunächst in den Klonierungsvektor pDrive ligiert. Das PCR-Produkt besaß an
beiden Enden einen A-Überhang, der für gewöhnlich durch die verwendete Taq-Polymerase
generiert wird. Der pDrive-Vektor lag mit jeweils einem U-Überhang an beiden Enden in
linearisierter Form vor. Dadurch und mit Hilfe einer T4-DNA-Ligase konnten das PCRProdukt und der Vektor mit einer hohen Spezifität hybridisieren.
57
Ergebnisse
Transformation von E.coli TOP10F’ Zellen
4.1.3.1
Um zu testen, ob die Ligation des pDrive-Plasmids und der NC16a-Domäne als PCRProdukt erfolgreich war, wurde der chemisch kompetente Bakterienstamm E.coli TOP10F’
mit dem neuen Konstrukt pDrive-NC16a transformiert. Nach erfolgreicher Transformation
war es möglich, Bakterienklone zu isolieren und von diesen Plasmidpräparationen
anzufertigen. Durch einen diagnostischen Restriktionsverdau mit den Enzymen BamH I und
Hind III konnte anschließend gezeigt werden, dass das neue Konstrukt die für die NC16aDomäne kodierende cDNA enthielt (vgl. Abb. 4.6).
A
[bp]
pDrive
bp-L
*
kb-L
[kb]
4,0
3,0
B
1,0
[bp]
bp-L
Klone 1-6
pDrive
500
400
0,5
300
200
NC16a
300
100
200
Abb. 4.6: Restriktionsanalyse der NC16a-Domäne des Kollagen XVII im Klonierungsvektor pDrive.
Nachdem die NC16a-Domäne über glatte Enden in den Klonierungsvektor pDrive eingefügt wurde, musste die
Ligation mittels Restriktionsverdau unter der Verwendung der Enzyme BamH I und Hind III überprüft werden. Zur
Analyse wurden 50 µl (A; präparatives Gel) bzw. 10 µl (B; analytisches Gel) einer Plasmidpräparation auf ein
1,7 %iges Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Somit konnte bestätigt werden, dass der
3,85 kb große Klonierungsvektor pDrive das 230 bp kleine Insert, die NC16a-Domäne, enthielt. kb = Kilobase;
bp = Basenpaar; kb-L = 100 bp-Leiter; 1-6 = positive pDrive-NC16a-Klone; * pDrive/NC16a.
Die beiden für den pDrive-Vektor und die NC16a-Domäne charakteristischen Banden bei
einer Größe von 3,85 kb bzw. 230 bp (vgl. Abb. 4.6) bestätigten die erfolgreiche Ligation.
Eine anschließende Sequenzierung sollte zudem klären, ob das PCR-Produkt in richtiger
Orientierung (5’3’) in das Plasmid eingefügt wurde und ob bei der Klonierung der NC16aDomäne mögliche Mutationen aufgetreten sind. Um dies zu analysieren, wurde bei 6
positiven Klonen eine Sequenzanalyse durchgeführt (Servicelabor Eurofins MWG Operon,
58
NC16a
Ergebnisse
Martinsried). Die Sequenzanalyse ergab, dass alle 6 Klone keine Mutationen enthielten.
Somit standen diese Klone für nachfolgende Versuche zur Verfügung.
4.1.4 Klonierung der NC16a-Domäne in den Expressionsvektor pRSET A
Da es sich bei dem pDrive-Vektor ausschließlich um einen Klonierungsvektor handelte,
musste
in
einem
nachfolgenden
Schritt
die
cDNA
der
NC16a-Domäne
in
den
Expressionsvektor pRSET A überführt werden. Bei diesem Vektor handelte es sich um ein
pUC-Derivat, das dafür hergestellt wurde, um große Mengen an Protein zu exprimieren.
Zudem verfügte dieser Vektor neben den gewünschten Erkennungsstellen für die
Restriktionsenzyme BamH I und Hind III zusätzlich über eine DNA-Sequenz, die für ein
Polyhistidin-Motiv kodiert, welches als Metall-Bindungsdomäne in dem translatierten Protein
diente. Somit wurden alle Kriterien für eine erfolgreiche Proteinexpression erfüllt. Zur
Überführung der NC16a-Domäne in den pRSET A-Vektor wurde dieser, da zirkulär
vorliegend, ebenso wie bereits zuvor der pDrive-Vektor + Insert mit den Restriktionsenzymen
BamH I und Hind III inkubiert.
Die Ansätze wurden anschließend auf 1 %ige bzw. 1,7 %ige Agarose-Gele
aufgetragen, analysiert und die entsprechenden DNA-Fragmente (linearer pRSET A-Vektor
und NC16a-Domäne) nach einer Gelextraktion ligiert. Das neue Konstrukt pRSET A-NC16a
wurde erneut in Zellen des E.coli Stammes TOP10F’ transformiert. Nach erfolgreicher
Transformation konnten Klone isoliert werden, von denen Plasmidpräparationen angefertigt
wurden. Durch einen diagnostischen Restriktionsverdau mit den entsprechenden Enzymen
wurde anschließend gezeigt, dass das Konstrukt die für die NC16a-Domäne kodierende
cDNA enthielt (vgl. Abb. 4.7).
59
Ergebnisse
[bp]
bp-L
Klone 1-10
kb-L
pREST A
3000
500
300
200
NC16a
100
Abb. 4.7: Restriktionsanalyse der NC16a-Domäne des Kollagen XVII im Expressionsvektor pRSET A.
Nachdem die NC16a-Domäne aus dem Klonierungsvektor pDrive in den Expressionsvektor pRSET A umkloniert
wurde, musste anschließend mittels eines Restriktionsverdaus überprüft werden, ob die Ligation der beiden
Fragmente gelungen ist. Für den Verdau wurden die Enzyme BamH I und Hind III verwendet. Zur Analyse
wurden 15 µl einer Plasmidpräparation eingesetzt und auf einem 1,7 %igen Agarose-Gel elektrophoretisch
aufgetrennt. Der 2,9 kb große Expressionsvektor enthielt das 230 bp kleine Insert, die NC16a-Domäne. kb-L= kbLeiter; kb= Kilobase; bp= Basenpaar; bp-L = 100 bp-Leiter; 1-10 = positive pRSET A-NC16a-Klone.
Die für den pRSET-Vektor charakteristische Bande konnte bei 2,9 kb eindeutig identifiziert
werden, ebenso die Bande für die NC16a-Domäne bei 230 bp. Eine zweite Sequenzanalyse
sollte erneut zufällige Mutationen während der Umklonierung ausschließen. Auch hier konnte
in keinem der 10 Klone eine Mutation festgestellt werden. Somit standen diese Klone für eine
Transfektion des E.coli Stammes BL21(DE3) zur Verfügung.
4.1.5
Transformation von BL21(DE3) Zellen und rekombinante Expression der
NC16a-Domäne
Da der E.coli TOP10F’-Stamm für eine Proteinexpression nicht geeignet ist, musste der
pRSET-Vektor mit der NC16a-cDNA als Insert in den E.coli-Bakterienstamm BL21(DE3)
überführt werden. Dieser Stamm trägt das notwendige T7 RNA-Polymerase-Gen, welches
nach Zugabe des Induktors Isopropyl--D-thiogalactopyranosid (IPTG) exprimiert und auf
diesem Wege die T7 RNA-Polymerase hergestellt wird. Diese kann anschließend an den T7
Promotor binden, um das gewünschte Gen, in diesem Fall die für die NC16a-Domäne
kodierende cDNA, zu exprimieren.
60
Ergebnisse
Nach erfolgreicher Transformation war es möglich, Bakterienklone zu isolieren und diese für
die Expression des Proteins einzusetzen. Um sicherzustellen, dass die Bakteriellenkultur
nach IPTG-Stimulation das gewünschte Protein exprimierte und auch in den Überstand
abgegeben hat, wurde aus der Über-Nacht-Kultur (Ü/N), nach der Stimulation (+IPTG) und
aus dem Überstand (ÜS) jeweils ein Aliquot entnommen. Die Proben wurden mit einem
Denaturierungspuffer versetzt, auf einem 15 %igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und
elektrophoretisch aufgetrennt. Mittels der Coomassie-Färbelösung sollte die gewünschte
NC16a-Domäne angefärbt und besonders nach IPTG-Stimulation und im Überstand sichtbar
werden.
[kDa] Ü/N +IPTG ÜS
27
15
NC16a
10
Abb. 4.8: Expressionsanalyse der rekombinanten NC16a-Domäne.
Der E.coli-Bakterienstamm BL21(DE3) wurde mit dem Expressionsvektor pRSET A transformiert. Dieser Vektor
enthielt als Insert die NC16a-Domäne des humanen Kollagen XVII. Der Bakterienstamm wurde mit dem Konstrukt
über Nacht (Ü/N) kultiviert und anschließend mit IPTG stimuliert (+IPTG), wodurch die Expression des
gewünschten Proteins induziert wurde. Das rekombinante Protein sollte dann in den Überstand (ÜS) abgegeben
werden. Jeweils 20 µl eines Aliquots wurden unter reduzierenden Bedingungen auf einem 15 %igen SDSPolyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Danach wurde das Gel mit Coomassie Blue gefärbt und die
rekombinant hergestellte NC16a-Domäne bei einer Größe von 12,6 kDa nachgewiesen. kDa = Kilodalton; Ü/N =
Über-Nacht-Kultur; +ITPG = Stimulation mit IPTG; ÜS = Überstand.
Da sich der Coomassie-Farbstoff sowohl an basische als auch an aromatische Seitenketten
von Aminosäuren lagert, werden alle in einer Probe vorhandenen Proteine unspezifisch
detektiert. Bei den in Abbildung 4.8 gezeigten Proben (Ü/N, +IPTG, ÜS) wurden daher
zahlreiche bakterielle Proteine, die die BL21-Zellen exprimierten, angefärbt und sichtbar
gemacht. Entscheidend war jedoch die Bande bei etwa 12,6 kDa, die vor allem in der Probe
„+IPTG“ und teilweise auch im Überstand zu erkennen ist. Hierbei handelte es sich um die
gewünschte, rekombinant hergestellte NC16a-Domäne. Dieses Protein konnte in der ÜberNacht-Kultur-Probe nicht angefärbt werden, weil es von den Bakterienzellen auf natürliche
61
Ergebnisse
Weise nicht hergestellt wird. Auffällig war jedoch, dass das Protein nur sehr schwach im
Überstand zu sehen war, obwohl in dieser Probe erwartungsgemäß die Proteinmenge am
größten sein sollte. Daher wurde vermutet, dass der größte Teil des rekombinant
hergestellten Proteins in Einschlusskörperchen (inclusion bodies) vorhanden sein musste.
Um den Verdacht zu bestätigen, wurde das Bakterienpellet nach der Proteinexpression für 6
Stunden (U 6 ) mit 6 M Harnstoff behandelt. Anschließend wurde ein Aliquot entnommen, die
Probe nochmals über Nacht (U Ü/N ) mit Harnstoff inkubiert und auf diese Weise das
gewünschte Protein vollständig aus den Einschlusskörperchen extrahiert. Wie in Abbildung
4.9 gezeigt, konnte die Annahme, dass sich der größte Teil des Proteins in den
Einschlusskörperchen befindet, bestätigt werden (Proben U 6 und U Ü/N ).
[kDa]
U 6 U Ü/N
Ü/N +IPTG
27
15
NC16a
10
Abb. 4.9: Expressionsanalyse der rekombinanten NC16a-Domäne.
Der mit dem Konstrukt pRSET A-NC16a transformierte BL(21)-Stamm wurde über Nacht kultiviert (Ü/N) und
anschließend mit IPTG stimuliert. Nach der Proteinexpression wurde das Bakterienpellet für 6 Stunden (U 6 ) bzw.
über Nacht (U Ü/N ) mit 6 M Harnstoff behandelt, um so das Protein aus den inclusion bodies zu extrahieren.
Jeweils 20 µl eines Aliquots wurden unter reduzierenden Bedingungen auf einem 15 %igen SDSPolyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Danach wurde das Gel mit Coomassie Blue gefärbt und die
rekombinant hergestellte NC16a-Domäne bei einer Größe von 12,6 kDa nachgewiesen. kDa = Kilodalton; U =
Urea (Harnstoff); U Ü/N = Harnstoffbehandlung über Nacht; U 6 = Harnstoffbehandlung für 6 Stunden; Ü/N = ÜberNacht-Kultur; +IPTG = Stimulation mit IPTG.
Daraufhin sollten große Proteinmengen der NC16a-Domäne aus den Einschlusskörperchen
gewonnen werden. Nachteil dieser Prozedur war jedoch, dass das Protein in dem 6 M
Harnstoff-haltigem Puffer in einem ungefaltetem Zustand vorlag, somit inaktiv war und nicht
für nachfolgende Experimente verwendet werden konnte. Durch eine schrittweise Dialyse
sollte der Harnstoff nach und nach reduziert und dieser Puffer gegen einen Phosphatpuffer
ausgetauscht werden. Hierbei sollte sich das Protein langsam falten. Allerdings führte das
schrittweise Zurückfalten zu einer Aggregatbildung, wodurch das Protein jedes Mal ausfiel.
62
Ergebnisse
Aus diesem Grund wurde die NC16a-Domäne aus mehreren Überständen isoliert und
gesammelt, solange bis genügend Protein zur Verfügung stand. Anschließend wurde die
NC16a-Domäne über eine Affinitätssäule (vgl. 4.1.6) aufgereinigt.
4.1.6 Aufreinigung der NC16a-Domäne mittels Affinitätschromatographie
Da das von den BL21(DE3)-Zellen produzierte Protein mit einem His 6 -Motiv fusioniert wurde,
war es möglich, die NC16a-Domäne über eine Affinitätssäule aufzureinigen. Dazu wurde ein
TALON®- Metall-Affinitätsharz verwendet, in dessen Matrix sich Co2+-Ionen befanden, an die
die Histidin-Reste mit einer hohen Affinität binden konnten. Dazu wurden die gesammelten
Überstände (ÜS) auf eine das Harz enthaltende Säule gegeben, der Durchfluss (DF)
aufgefangen und die Säule mehrmals gewaschen (WF). Anschließend wurde das mit dem
His-Motiv fusionierte Protein mittels eines 250 mM Imidazol-haltigen Puffers vom
Säulenmaterial eluiert (E). Von allen Fraktionen (ÜS, DF, WF und E) wurden Aliquots
entnommen
und
diese
zur
Analyse
auf
einem
15 %igen
SDS-Polyacrylamidgel
elektrophoretisch aufgetrennt.
.
[kDa] +IPTG ÜS
DF
WF
E1
E2
27
15
NC16a
10
Abb. 4.10: Affinitätsaufreinigung der NC16a-Domäne aus Kulturüberständen.
Das von den BL21-Zellen rekombinant hergestellte Protein wurde über eine TALON®-Säule mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt in zwei Elutionsfraktionen (E1, E2) gesammelt und anschließend auf einem
15 %igen SDS-Polyacrylamidgel unter reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt. Zusätzlich
wurden je 20 µl der IPTG-Fraktion (+IPTG), des Überstandes (ÜS), des Durchflusses (DF) und der Waschfraktion
auf das Gel aufgetragen. Die Expression der NC16a-Domäne wurde mittels Coomassie Blue-Farbstoff bei einer
Größe von 12,6 kDa nachgewiesen. kDa = Kilodalton; +IPTG = Stimulation mit IPTG; ÜS = Überstand; DF =
Durchfluss; WF = Waschfraktion; E1 und E2 = Elutionsfraktionen.
63
Ergebnisse
Auf dem mit Coomassie Blue gefärbten Gel konnten in der IPTG-Fraktion (+IPTG), im
Überstand (ÜS), im Durchfluss (DF) und geringfügig auch in der Waschfraktion (WF)
mehrere, höher- und niedermolekulare Banden detektiert werden. Diese Banden waren
darauf zurückzuführen, dass neben dem gewünschten, rekombinant hergestellten Protein
weitere, zelleigene Proteine exprimiert und in den Überstand sekretiert wurden, die nicht an
die Säule banden
Bei diesem Gel fiel jedoch erneut auf, dass die NC16a-Domäne bei etwa 12,6 kDa
zwar in der IPTG-Fraktion, kaum aber im Überstand detektiert werden konnte. In der
Durchfluss- und Waschfraktion hingegen wurde erwartungsgemäß keine Bande dieser
Größe detektiert, da das Protein über sein His 6 -Motiv an das Säulenmaterial gebunden hat.
In den beiden Elutionsfraktionen konnte die NC16a-Domäne bei 12,6 kDa eindeutig
detektiert werden. Um zu bestätigen, dass es sich bei dieser Bande auch tatsächlich um die
NC16a-Domäne
handelte,
wurde
eine
PMF
(Peptide
mass
fingerprinting)-Analyse
durchgeführt.
4. 1. 6. 1
PMF-Analyse der NC16a-Domäne
Bei der PMF-Analyse handelt es sich um eine analytische Methode, um Proteine eindeutig
zu bestimmen. Zur Identifikation der NC16a-Domäne wurden ca. 3 mm der Bande aus der
Elutionsfraktion, welche im Coomassie-Gel bei einer Größe von ca. 12,6 kDa angefärbt
wurde, ausgestanzt und zur weiteren Analyse in das Servicelabor der Zentralen Bioanalytik
(ZMMK) gegeben. Bevor das gewünschte Protein mit der bekannten Sequenz aus der
Datenbank verglichen werden konnte, musste es zunächst in mehrere, kleinere Fragmente
geschnitten werden. Der Verdau fand mit Hilfe proteolytischer Enzyme wie zum Beispiel
Trypsin oder Chymotrypsin statt. Die Peptidfragmente wurden anschließend extrahiert und
mittels Massenspektroskopie (MALDI-TOF) analysiert.
64
Ergebnisse
Abb. 4.11: Massenspektrum der NC16a-Domäne nach einer PMF-Analyse.
Für eine PMF-Analyse wurden aus dem Coomassie Blue gefärbten Gel etwa 3 mm der NC16a-Bande
ausgestanzt und das darin enthaltene Protein mittels proteolytischer Enzyme verdaut. Das verdaute Protein
wurde anschließend per MALDI-TOF massenspektrometrisch analysiert. Das Massenspektrum zeigt eine Reihe
von Peaks, wobei jeder Peak ein Peptidfragment mit einer definierten Größe (Masse) darstellt. m/z =
Masse/Ladung (tatsächliche Masse; kDa).
Durch die massenspektrometrische Analyse der NC16a-Domäne erhielt man ein Spektrum,
welches eine Reihe von Peaks aufwies, wobei jeder Peak eine bestimmte Masse (m/z)
angab. Die Masse der einzelnen Peptide wurden mit Proteinsequenzen großer Datenbanken
(Swissprot, Genbank) verglichen. Mit Hilfe von Softwareprogrammen wurden die ganzen
Proteine aus der Datenbank in kleine Peptide geschnitten, wobei man hier die gleichen
Enzyme verwendete, wie sie auch für den Verdau des gewünschten Proteins benutzt
wurden. Die absolute Masse aller Peptidfragmente wurde dann theoretisch berechnet und
mit den angegebenen Peptidmassen des Proteins von Interesse verglichen. Die Ergebnisse
wurden statistisch analysiert und positive Übereinstimmungen gesondert hervorgehoben
(vgl. Abb. 4.11). Mit einer prozentualen Übereinstimmung von 65,3% konnte das
rekombinant hergestellte Protein eindeutig als NC16a-Domäne identifiziert werden.
65
Ergebnisse
4. 1. 6. 2
Überprüfung der Antigenität der NC16a-Domäne
Nachdem nun bestätigt wurde, dass es sich bei der im Coomassie-Gel detektierten Bande
bei 12,6 kDa um die gewünschte NC16a-Domäne handelte, sollte zudem überprüft werden,
ob das Protein in einem aktiven Zustand vorliegt, also von NC16a-spezifischen
Immunglobulinen erkannt wird. Durch eine Expression in einem prokaryotischen System
kann neben fehlenden, post-translationalen Modifikationen eine optimale Faltung des
Proteins nicht gewährleistet werden. Inaktiv wäre die NC16a-Domäne für weitere
Experimente jedoch unbrauchbar gewesen. Zur Untersuchung wurden daher Western BlotAnalysen durchgeführt, die die Antigenität, das heißt, sowohl die Aktivität als auch die
Spezifität des Proteins, überprüfen sollten. Dazu wurden die beiden Elutionsfraktionen E1
und E2 (His-NC16a) auf SDS-Polyacrylamidgele aufgetragen (vgl. auch Abb. 4.10) und
elektrophoretisch aufgetrennt. Als Primärantikörper wurden Seren eines Patienten mit
bullösem Pemphigoid und eines gesunden Spenders verwendet. Da im Serum eines
Patienten für gewöhnlich Antikörper vorliegen, die gegen die NC16a-Domäne gerichtet sind,
sollte das Protein auf dem Western Blot nachweisbar sein. Als Kontrollprotein wurde das
rekombinant hergestellte, bereits positiv getestete GST-NC16a-Protein [AG Hunzelmann]
verwendet. Als Sekundärantikörper wurde ein HRP-konjugierter Antikörper eingesetzt, der
gegen das humane Immunglobulin G gerichtet war.
Ebenso wie in den Coomassie-Gelen konnte in der Western Blot-Analyse eine
distinkte Bande bei 12,6 kDa detektiert werden, jedoch nur im Falle des Patientenserums
(Abb. 4.12). Das Kontrollserum hingegen konnte weder das GST-NC16a-Protein bei 35 kDa
(Positivkontrolle) noch His-NC16a erkennen. Somit wurde bestätigt, dass das rekombinant
hergestellte His-NC16a-Protein in einem aktiven Zustand vorliegt und ganz spezifisch von im
Patientenserum vorhandenen, autoreaktiven Antikörpern erkannt wird.
66
Ergebnisse
A [kDa]
*
GST-NC16a
E1 E2
B
E1 E2
*
38
15
His-NC16a
10
Patient
Kontrolle
Abb. 4.12: Immunologischer Nachweis des rekombinant hergestellten His-NC16a-Proteins.
20 µl beider Elutionsfraktionen (E1, E2) mit der rekombinant hergestellten His-NC16a-Domäne wurden auf ein
15 %iges SDS-Polyacrylamidgel aufgetragen und unter reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch
aufgetrennt. Als Kontrolle diente das rekombinante GST-NC16a-Protein (*), das bereits in Vorversuchen auf
Patientenseren positiv getestet wurde. Zur Detektion der NC16a-Domäne auf der Nitrozellulosemembran diente
das Serum eines BP-Patienten (A), in dem sich die autoreaktiven Antikörper (Primärantikörper, 1:200) befanden,
die gegen NC16a gerichtet waren. Um zu testen, ob das Protein spezifisch ist, wurde eine zweite Membran mit
NC16a (E1, E2) mit Serum eines gesunden Spenders inkubiert (B). Die spezifischen Antikörper wurden
anschließend mit einem HRP-gekoppelten Sekundärantikörper (rabbit anti human IgG, 1:1000) detektiert und die
NC16a-Domäne nachgewiesen (A). kDa = Kilodalton; * = GST-NC16a; E1 und E2 = Elutionsfraktionen mit HisNC16a.
Für weitere Experimente sollte die Proteinkonzentration der aufgereinigten NC16a-Domäne
bestimmt werden. Die beiden Fraktionen (E1, E2), die das Protein enthielten, wurden
zunächst gegen einen Phosphatpuffer (1x PBS) dialysiert und anschließend gemessen. Da
die Proteinmenge mit einem BCA-Test nicht ermittelt werden konnte, wurde die
Standardreihe als Vergleichswert für die beiden Elutionsfraktionen auf ein SDSPolyacrylamidgel aufgetragen und zur Quantifizierung des Proteingehaltes mit Coomassie
Blue gefärbt. Anders als im BCA-Test wurde jedoch nicht BSA (bovine albumin serum) als
Standardprotein verwendet, sondern das Protein Lysozym gewählt. Im Gegensatz zu BSA ist
Lysozym wesentlich kleiner und mit 14 kDa als Vergleichsprotein für His-NC16a (12,6 kDa)
geeignet. Da sich der Triphenylmethanfarbstoff an basische Seitenketten der Aminosäuren
anlagert, würde ein größeres Protein bestehend aus einer höheren Anzahl an Aminosäuren wie
beispielsweise
BSA
-
intensiver
angefärbt
werden
und
dadurch
ungenaue
Vergleichswerte liefern. Die Nachweisgrenze für den Farbstoff liegt bei etwa 0,1 µg Protein
pro Bande in einem Gel. Daher wurde eine Standardreihe beginnend mit 0,1 µg Protein/10µl
67
Ergebnisse
Lösung aufgestellt. Die höchste Lysozymkonzentration, die auf das Gel aufgetragen wurde,
lag bei 2 µg/10 µl.
[kDa]
Lysozym
E1 E2
38
15
NC16a
10
0,1 0,5 0,75 1
1,5
2
[µg/10µl]
Abb. 4.13: Konzentrationsbestimmung der rekombinant hergestellten NC16a-Domäne.
Zur Bestimmung der Konzentration des rekombinant hergestellten Proteins wurden jeweils 10 µl der
Elutionsfraktionen (E1, E2) eingesetzt. Als Standardprotein diente Lysozym, das in unterschiedlichen
Konzentrationen (0,1 µg/10 µl – 2 µg/10 µl) zusammen mit den beiden Elutionsfraktionen auf ein 15 %iges SDSPolyacrylamidgel aufgetragen und unter reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt wurde.
Anhand des Coomassie-Farbstoffs wurde das Gel anschließend angefärbt und die jeweiligen Banden mit
unterschiedlicher Farbintensität bei entsprechender Größe (Lysozym 14 kDa, His-NC16a 12,6 kDa) sichtbar
gemacht. Durch einen Vergleich der Farbintensitäten des Standardproteins und der Elutionsfraktionen konnte
dann die ungefähre Konzentration der NC16a-Domäne geschätzt werden. kDa = Kilodalton; E1 und E2 =
Elutionsfraktionen mit His-NC16a.
In der Abbildung 4.13 sind die verschiedenen Konzentrationen von Lysozym und die beiden
Elutionsfraktionen E1 und E2 nach Färbung mit dem Coomassie-Farbstoff dargestellt.
Verglich man nun die Farbintensität der bekannten Lysozymkonzentrationen mit den beiden
Elutionsfraktionen, so ließ sich grob die Konzentration der NC16a-Domäne bestimmen. Da
von den Elutionsfraktionen ebenfalls jeweils 10 µl Proteinlösung auf das Gel aufgetragen
wurden, wurde ein Proteingehalt von etwa 2 µg geschätzt. Das entsprach auf einem Milliliter
ca. 200 µg Protein. Diese Menge war ausreichend, um damit weitere Untersuchungen
durchführen zu können.
4.1.7 Fluorchrom-Markierung der NC16a-Domäne mit Alexa Fluor 647
Zur Detektion der Antigen-spezifischen B-Zellen mittels durchflusszytometrischer Analysen,
sollte die rekombinant hergestellte NC16a-Domäne mit einem geeigneten Fluorchrom
68
Ergebnisse
markiert werden. Zur Markierung wurde das Fluorchrom Alexa Fluor 647 gewählt. Der
reaktive Farbstoff besitzt einen Succinimidylester-Teil, der mit den primären Aminen eines
Proteins reagiert und so stabile Farbstoff-Protein-Konjugate bildet. Zur Fluorchrom-Kopplung
wurden 20 µg des zu markierenden Proteins eingesetzt. Nach Zugabe von 10 µl einer 1 M
Natrium-Bicarbonate-Lösung zur Neutralisation der Proteinlösung und zur Stabilisation des
pH-Wertes, und nach Zugabe des Alexa 647-Farbstoffs wurde das Gemisch auf eine mit
einem Harzgel befüllte Säule gegeben und der Durchfluss mit dem gekoppelten Protein
aufgefangen. Die Effizienz der Fluorchrom-Markierung wurde anschließend an einem
Absorption
Spektralphotometer (NanoDropTM) gemessen (vgl. Abb. 4.14).
280
650 675
Wellenlänge [nm]
Abb. 4.14: Absorptionsspektrum von His-NC16a-Alexa Fluor 647.
Für die spektralphotometrische Analyse wurden 2 µl der NC16a-Proteinlösung mit einer Konzentration von
180 µg/ml eingesetzt. Das Spektrum zeigt zum einen die Absorption des Proteins His-NC16a bei einer
Wellenlänge von 280 nm, zum anderen die Absorption des Fluorchroms Alexa Fluor 647 bei 650 nm.
In Abbildung 14.4 ist das Absorptionsspektrum nach der Messung des His-NC16a-Alexa
647-Proteins dargestellt. Deutlich zu erkennen war jeweils ein Peak bei einer Wellenlänge
von 280 nm und 650 nm. Bei einer Absorption von 280 nm wird für gewöhnlich die
Konzentration des Proteins gemessen, welche in diesem Versuchsansatz für das NC16aProtein bei 0,18 mg/ml lag. Der Peak bei 650 nm zeigte die Absorption für den Farbstoff
69
Ergebnisse
Alexa Fluor 647. Beide Messwerte deuteten darauf hin, dass der Farbstoff effizient an das
Protein gekoppelt wurde.
In nachfolgenden Experimenten wurden 100 µg/ml des rekombinant hergestellten und mit
dem Farbstoff Alexa Fluor 647 gekoppelten His-NC16a-Proteins zur Untersuchung
Autoantigen-spezifischer B-Zellen eingesetzt.
4.2
Nachweis NC16a-spezifischer Gedächtnis-B-Zellen bei Patienten mit
Bullösem Pemphigoid
Mit Hilfe des nun vorliegenden Fluorchrom-gekoppelten NC16a-Proteins sollte nun versucht
werden, NC16a-spezifische Gedächtnis-B-Zellen nach nur einem Anreicherungsschritt aus
dem Blut von Patienten mit bullösem Pemphigoid zu isolieren und zu detektieren. Hierfür
wurden die PBMC von Patienten und Kontrollen zunächst mit paramagnetischen CD19Mikropartikeln inkubiert. Die auf der magnetischen Säule angereicherten Zellen wurden
anschließend mit den entsprechenden Antikörpern (CD19-PE, IgG-FITC) und dem NC16aAlexa 647-Antigen zur Darstellung der Antigen-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen gefärbt.
Die durchschnittliche Reinheit der CD19+ B-Zellen lag in 12 Experimenten, in denen
die B-Zellen aus PBMC angereichert wurden, bei 97.11 % (+/- 2.36 %). Um naive B-Zellen
von Gedächtnis-B-Zellen unterscheiden zu können, wurden die Zellen mit einem FITCkonjugierten IgG-Antikörper inkubiert. In Abbildung 4.15 ist eine durchflusszytometrische
Analyse von NC16a-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen dargestellt. Als Kontrolle wurden
angereicherte CD19+ B-Zellen aus PBMC eines gesunden Spenders mit NC16a-Alexa 647
inkubiert. Wie in der Abbildung gezeigt, konnten von den angereicherten CD19+ B-Zellen
aus PBMC eines BP-Patienten spezifisch NC16a-positive IgG+ Gedächtnis-B-Zellen
detektiert werden. In Tabelle 1 sind die Daten der einzelnen Patienten zusammengefasst. Im
Median wurden 151,7 +/- 33 (119,4 – 218,2 Zellen) NC16a-bindende Zellen pro eine Million
CD19+ B-Zellen im Blut von Patienten (n = 7) detektiert, wohingegen keine NC16aspezifischen CD19+ Zellen im Blut von gesunden Spendern beobachtet werden konnten.
Ferner konnte bei Patienten mit bullösem Pemphigoid eine zweite NC16a-positive B-ZellPopulation beobachtet werden, die für den Gedächtnis-B-Zell-Marker IgG negativ war
(CD19+IgG-NC16a+).
70
Ergebnisse
B
D
0.00 %
A
NC16a
NC16a
97.11 %
Zellzahl
FCS
IgG
C
E
0.59 %
NC16a
NC16a
CD19
IgG
FCS
Abb. 4.15: Detektion NC16a-spezifischer IgG+ Gedächtnis-B-Zellen in BP-Patienten.
+
CD19 B-Zellen wurden aus PBMC eines Patienten mit bullösem Pemphigoid angereichert und die NC16aspezifischen Gedächtnis-B-Zellen anschließend mit NC16a-Alexa 647 detektiert (C, E). Als Kontrolle dienten
+
PBMC eines gesunden Spenders (B, D). Histogramm A zeigt die Analyse von CD19 B-Zellen, die mit einem
monoklonalen, mit Mikropartikeln markierten CD19-Antikörper aus PBMC angereichert wurden. In den
Punktediagrammen B und C ist eine Einfarbenanalyse für NC16a-Alexa 647 nach CD19-Anreicherung aus PBMC
dargestellt. Punktediagramme D und E zeigen eine Zweifarbenanalyse für NC16a-Alexa 647 und anti-IgG-FITC.
+
Von den insgesamt 10.000 gezählten Zellen wurden nur lebende CD19 B-Zellen aufgrund ihrer
Streulichteigenschaften in die Analyse mit einbezogen.
+
Tab. 4.1: NC16a-spezifische IgG B-Zellen im Blut von Patienten mit bullösem Pemphigoid.
BP-Patient
+
Anzahl der NC16a-spezifischen IgG
+
B-Zellen pro 1 Mio. CD19 Zellen
Anzahl der NC16a-spezifischen IgG+
B-Zellen pro 1 Mio. CD19 Zellen
K60
119,4
n.b.
K57
126
n.b.
K62
138,7
46,3
K56
140,9
114,5
K51
158,4
n.b.
K58
160,1
91,6
K54
218,2
63,4
71
Ergebnisse
Um zu testen, ob es sich bei der CD19+IgG-NC16a+ Population um Zellen handelte, die das
Immunglobulin M auf ihrer Oberfläche exprimierten, wurden die angereicherten CD19+ Zellen
in einem zweiten Ansatz mit einem monoklonalen Antikörper gegen IgM gefärbt.
4.2.1 Detektion IgM+ B-Zellen spezifisch für NC16a
Zur Detektion IgM+ B-Zellen spezifisch für NC16a wurden CD19+ B-Zellen mit Hilfe von
CD19-Mikropartikeln aus PBMC eines BP-Patienten auf einer Säule angereichert und
anschließend mit den entsprechenden Antikörpern (CD19-PE, IgM-FITC) und dem NC16aAlexa 647-Antigen gefärbt. Die naiven, für das Antigen NC16a positiven B-Zellen wurden in
einem Punktediagramm dargestellt, wobei hier die Antigen-spezifischen Zellen gegen die
IgM+ B-Zellen aufgetragen wurden (vgl. Abb. 4.16).
NC16a
0.23 %
IgM
Abb. 4.16: Detektion NC16a-spezifischer IgM+ B-Zellen in BP-Patienten.
+
CD19 B-Zellen wurden aus PBMC eines Patienten mit bullösem Pemphigoid angereichert und die NC16a+
spezifischen IgM B-Zellen anschließend mit NC16a-Alexa 647 detektiert. Das Punktediagramm zeigt eine
+
Zweifarbenanalyse für NC16a-Alexa 647 und anti-IgM-FITC. Nur lebende CD19 B-Zellen wurden aufgrund ihrer
Streulichteigenschaften in die Analyse mit einbezogen.
Wie im Punktediagramm 4.16 dargestellt wurde, konnten nach Anreicherung der CD19
positiven Zellen IgM+ B-Zellen mit einer Spezifität für NC16a detektiert werden. In Tabelle 1
sind die Daten der einzelnen Patienten zusammengefasst. Im Median wurden 79 +/- 26,1
(46,3 - 114,5 Zellen) NC16a-bindende Zellen pro eine Million CD19+ B-Zellen im Blut von
Patienten (n = 4) detektiert.
72
Ergebnisse
4.2 Anreicherung und Analyse zirkulierender CD138+ Plasmazellen bei
Patienten mit Bullösem Pemphigoid
CD138+ Plasmazellen sind enddifferenzierte, Antikörper-sezernierende B-Lymphozyten, die
nur in sehr geringen Mengen im Blut zirkulieren und dadurch schwer detektierbar sind. Mit
Hilfe einer magnetischen Zellseparation ist es jedoch möglich, die Antikörper-sezernierenden
Zellen aus dem Blut anzureichern und durchflusszytometrisch darzustellen.
4.3.1 Magnetische Anreicherung von CD138+ Plasmazellen
Zur Anreicherung der CD138+ Plasmazellen aus dem peripheren Blut wurde ein Antikörper
gegen den universellen Differenzierungsmarker CD138 (Syndekan-1) verwendet, der an
superparamagnetische Mikropartikel gekoppelt war. Mittels magnetischer Zellseparation
konnten so die CD138+ Zellen aus den mononuklearen Zellen des peripheren Blutes (PBMC)
von Patienten und gesunden Spendern isoliert, auf der zweiten Anreicherungssäule gefärbt,
durchflusszytometrisch analysiert und anschließend phänotypisch charakterisiert werden.
Eine charakteristische Anreicherung von CD138+ Zellen ist in Abbildung 4.17
dargestellt. Punktediagramm (A) zeigt ein für PBMC bezüglich der Streulichteigenschaften
typisches heterogenes Bild. Eindeutig zu sehen sind sowohl die Lymphozyten als auch
Monozyten. Das zu Diagramm (A) entsprechende Punktediagramm (B) zeigt eine
Einfarbenanalyse für CD138-APC von einer Gruppe mononuklearer Zellen, die zuvor im
Punktediagramm (A) aufgrund ihrer Streulichteigenschaften ausgewählt wurde (R1). Einige
wenige Zellen sind als CD138+ Plasmazellen zu erkennen. Im Punktediagramm (C) hingegen
können
die
mit
CD138-Magnetpartikeln
Streulichteigenschaften
eindeutig
identifiziert
angereicherten
werden.
angereicherten Zellen größtenteils CD138+ Plasmazellen.
73
Im
Zellen
Diagramm
aufgrund
(D)
sind
ihrer
die
Ergebnisse
vor Anreicherung
A
B
Monozyten
CD138
SSC
Lymphozyten
+
CD138 Zellen
FSC
FSC
nach Anreicherung
C
D
+
CD138
SSC
CD138 Zellen
FSC
FSC
+
Abb. 4.17: Magnetische Anreicherung CD138 Zellen aus dem peripheren Blut.
Mononukleare Zellen aus dem peripheren Blut wurden mit CD138-Mikropartikeln inkubiert, über eine MS-Säule
angereichert und anschließend auf der Säule mit CD138-APC gefärbt. Die Darstellungen (A) und (C) wurden
mittels Streulichteigenschaften auf Plasmazellen eingegrenzt (R1 und R3). Für die durchflusszytometrische
Analyse wurden 10.000 Events aufgenommen. Die Punktediagramme (A) und (B) zeigen nur wenige CD138
+
Zellen, während Diagramm (C) und (D) die angereicherten Plasmazellen darstellen.
Da das Vorwärtsstreulicht bekanntlich als Maß für die Größe der Zellen gilt, und CD138+
Zellen eindeutig größer sind als z.B. normale B-Zellen (Teil der Lymphozyten), kann man
davon ausgehen, dass es sich bei den hier angereicherten CD138+ Zellen tatsächlich um
Plasmazellen bzw. um Plasmablasten, die Plasmazellvorläufer, handelt. Ein Indiz dafür, dass
beide Populationen angereichert wurden, zeigt die relativ heterogene Verteilung der CD138+
Zellen (vgl. Abb. 4.17 C). Während Plasmablasten zwar bereits größer als reife oder aktive
B-Zellen sind, erreichen jedoch erst die enddifferenzierten Plasmazellen im Knochenmark
die vollständige Größe.
74
Ergebnisse
Intrazelluläre Kontrollfärbung von CD138+ Plasmazellen
4.3.2
Da es sich bei den NC16a-spezifischen Plasmazellen um sehr seltene Zellen handeln muss,
war für eine Detektion dieser Population eine spezifische Färbung von großer Bedeutung.
Die autoantigenspezifischen IgG-Antikörper liegen, bevor sie sezerniert werden, innerhalb
der Zellen im Zytoplasma vor. Daher mussten die CD138+ Plasmazellen für die Analyse vor
der Färbung zunächst fixiert und anschließend noch permeabilisiert werden. Zudem sollte
gewährleistet sein, dass nicht gebundene Antikörper oder Antigene nach der Färbung aus
der Zelle wieder heraus gewaschen werden, um so ein falsch-positives Signal zu vermeiden.
Eine Kontrollfärbung sollte zeigen, dass das hier verwendete Färbeprotokoll für die
intrazellulären Färbungen geeignet ist. Hierfür wurden CD138+ Plasmazellen aus dem Blut
eines gesunden Spenders isoliert und anschließend mit einem FITC-markierten Antikörper
gegen humanes Immunglobulin G bzw. gegen ein irrelevantes Antigen, murines CD117, auf
der Anreicherungssäule intrazellulär gefärbt. Diese Kontrollfärbung ist in Abbildung 4.18
dargestellt.
B
icIgG
CD117
A
FSC
FSC
Abb. 4.18: Intrazelluläre Kontrollfärbung von CD138+ Zellen.
Nach Anreicherung mononuklearer Zellen aus dem peripheren Blut (PBMC) mit CD138-Mikropartikeln, wurden
diese Zellen intrazellulär mit einem IgG-Antikörper (A) oder einem Antikörper gegen ein irrelevantes Antigen
gleichen Isotyps (CD117; B), gefärbt. Das Punktediagramm (A) zeigt eine Einfarbenanalyse für IgG-FITC, wobei
+
hier etwa 13 % der laut der Streulichteigenschaften als CD138 identifizierten Plasmazellen positiv für IgG sind.
Im Gegensatz dazu zeigt die Einfarbenanalyse für das Kontrollantigen CD117-FITC im Punktediagramm (B)
+
einzelne CD117 Zellen als Ausdruck der unspezifischen Hintergrundfärbung. icIgG = intrazelluläres IgG.
75
Ergebnisse
Das Punktediagramm (A) zeigt anhand einer Einfarbenanalyse angereicherte CD138+
Plasmazellen, die sich zu einem Teil intrazellulär für Immunglobulin G anfärben lassen. Der
Anteil dieser IgG+ Zellen liegt bei diesem Spender bei rund 13 %. Im Gegensatz dazu
werden im Punktediagramm (B) so gut wie keine CD138+ Plasmazellen detektiert, die für das
irrelevante Antigen CD117 positiv sind. CD117 oder auch c-Kit genannt, ist eine
Rezeptortyrosinkinase, die für gewöhnlich auf der Zelloberfläche von Melanozyten,
Mastzellen und hematopoetischen Stammzellen exprimiert wird. Da intrazellulär in humanen
Plasmazellen kein murines CD117 vorkommt, deuten die 0,2 % CD117+ Zellen lediglich auf
eine minimale Hintergrundfärbung hin, die jedoch für die Spezifität der intrazellulären
Färbung unbedeutend ist.
4.3.3 Identifizierung und Phänotypisierung der angereicherten CD138+ Zellen
Bei der Differenzierung von reifen B-Zellen zu Plasmablasten oder Plasmazellen ändert sich
das Expressionsmuster einer Vielzahl verschiedener Moleküle mit unterschiedlicher Kinetik
(vgl. Abb. 1.3 und Tab. 1.1). Um unterscheiden zu können, ob es sich bei den
angereicherten CD138+ Zellen um neu generierte Plasmablasten oder um bereits ausgereifte
Plasmazellen handelte, wurden die Zellen im Rahmen der Phänotypisierung mit zusätzlichen
Oberflächenmarkern gefärbt. Aufgrund bestehender Untersuchungen konnten anhand der
Expressionsstärke verschiedener Aktivierungsmarker auf der Zelloberfläche Rückschlüsse
auf das Reifestadium der CD138+ Zellen zugelassen werden. Hierfür wurden zunächst die
CD138+ Zellen aus PBMC gesunder Spender und BP-Patienten immunmagnetisch
angereichert und anschließend mit den Markern CD19, CD27, CD38, CD138, IgG und HLADR gefärbt.
76
relative Zellzahl
Ergebnisse
CD138
E
CD19
F
CD27
G
CD38
CD138
A
D
CD19
CD138
B
CD27
CD138
C
CD38
Abb. 4.19: Phänotypisierung CD138 positiver Zellen aus dem peripheren Blut.
+
CD138 Zellen wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern und BP-Patienten immunmagnetisch
angereichert und auf der Säule gegen die Moleküle CD19 (A), CD27 (B) und CD38 (C) gefärbt und gegen CD138
+
aufgetragen. Nur CD138 Zellen wurden sowohl bei der Punktediagramm- (A-C)- als auch bei der Histogramm-
Darstellungen (D-G) in die Bewertung miteinbezogen. Insgesamt wurden 10.000 Zellen gezählt.
77
Ergebnisse
In Abbildung 4.19 ist die Expression der verschiedenen Marker dargestellt. Da das
Oberflächenmolekül CD138 ausschließlich von Plasmablasten und Plasmazellen exprimiert
wird, wurden alle weiteren, in die phänotypische Charakterisierung mit einbezogenen Marker
gegen die CD138+ Zellen aufgetragen. Die hohe Expression von CD138 ließ darauf
schließen, dass die zuvor durchgeführte Anreicherung mit CD138-Mikropartikeln erfolgreich
war. Sowohl die Zweifarbenanalysen der Punktediagramme (A) – (C) als auch die
Histogramme (D) – (G) zeigten für die verschiedenen Oberflächenmarker ein heterogenes
Expressionsmuster. Der Haupt-B-Zellmarker CD19 (A) wurde von den CD138+ Zellen noch
relativ stark exprimiert (wenn auch im Vergleich zu den anderen Oberflächenmolekülen
verhältnismäßig schwächer). Die beiden typischen Plasmablasten- und Plasmazellmarker
CD27
(B)
und
CD38
(C)
hingegen
wurden
von
den
CD138
positiven
Zellen
erwartungsgemäß sehr stark exprimiert. Anhand dieser Daten konnte man zunächst davon
ausgehen, dass diese Zellpopulation dem Phänotyp kurzlebiger Plasmablasten stark ähnelte
[Odendahl et al, 2005].
Bezüglich des Expressionslevels der Oberflächenmoleküle CD19, CD27 und CD38
konnte bei den untersuchten Proben (gesunde Spender und BP-Patienten) kein Unterschied
festgestellt werden. In einem weiteren Färbeansatz sollte darum die intrazelluläre Expression
des Immunglobulins G und die Expression des Oberflächenmoleküls HLA-DR bei
Kontrollpersonen und BP-Patienten untersucht werden.
Das Immunglobulin G (IgG) ist die am häufigsten vorkommende Klasse von
Immunglobulinen im Serum. Vergleicht man die Frequenzen der Immunglobulin G
produzierenden Zellen bei gesunden Spendern und BP-Patienten miteinander, so zeigte
sich, dass in Patienten mit bullösem Pemphigoid die Häufigkeit der IgG+ Zellen deutlich
höher war. Während der prozentuale Anteil von IgG+CD138+ Zellen in gesunden Spendern
bei durchschnittlich 24 % (10,18 - 33,33 %) lag, verdoppelte sich die Frequenz der IgG
positiven Zellen bei den BP-Patienten auf etwa 50 % (38,74 – 64,37 %), (vgl. Graphik 4.22).
In Abbildung 4.20 ist die unterschiedliche Frequenz von IgG+ Zellen zwischen Spendern und
Patienten in den Punktediagrammen (A) und (C) sowie in den entsprechenden
Histogrammen (B) und (D) dargestellt. Auch hier ist ein deutlicher Anstieg der Frequenz
dieser Population erkennbar.
78
Ergebnisse
Kontrolle
BP-Patient
CD138
C
CD138
A
B
icIgG
icIgG
relative Zellzahl
relative Zellzahl
icIgG
D
icIgG
Abb. 4.20: Detektion IgG+CD138+ Zellen bei BP-Patienten und gesunden Spendern.
CD138+ Zellen wurden mittels CD138-Magnetpartikeln aus PBMC von gesunden Spendern (A, B) und Patienten
(C, D) mit bullösem Pemphigoid angereichert und intrazellulär auf der Säule mit IgG-FITC gefärbt. Die
Punktediagramme (A) und (C) zeigen eine Zweifarbenanalyse für CD138-APC und IgG-FITC, in den
entsprechenden Histrogrammen (B) und (D) ist die Expressionsstärke des Immunglobulins G dargestellt. In die
Bewertung wurden ausschließlich die für CD138 positive Zellen miteinbezogen. Es wurden jeweils 10.000 Zellen
analysiert.
In einem nächsten Schritt wurde die Expression des Zelloberflächenrezeptors HLA-DR als
Ausdruck des Aktivierungszustandes dieser Zellen bei BP-Patienten und gesunden
Spendern untersucht.
79
Ergebnisse
Kontrolle
BP-Patient
A
CD138
CD138
C
HLA-DR
HLA-DR
B
relative Zellzahl
relative Zellzahl
HLA-DR
HLA-DR
D
+
high
Zellen bei BP-Patienten und gesunden Spendern.
Abb. 4.21: Detektion CD138 HLA-DR
+
CD138 Zellen wurden mittels CD138-Magnetpartikeln aus PBMC von gesunden Spendern (A, B) und Patienten
(C, D) mit bullösem Pemphigoid angereichert und auf der Säule mit HLA-DR-PE und CD138-APC
oberflächengefärbt. Die Punktediagramme (A) und (C) zeigen eine Zweifarbenanalyse für CD138-APC und HLADR-PE, in den entsprechenden Histrogrammen (B) und (D) ist die Expressionsstärke des Oberflächenmoleküls
HLA-DR dargestellt. In die Bewertung wurden ausschließlich die für CD138 positive Zellen miteinbezogen. Es
wurden jeweils 10.000 Zellen analysiert.
Betrachtet man das Expressionsverhalten von HLA-DR bei BP-Patienten und gesunden
Spendern, so fällt auf, dass die CD138+-Zellpopulation bei Normalpersonen eine eher
heterogene
+
Expression
CD138 HLA-DR
high
des
Oberflächenmoleküls
aufweist
(CD138+HLA-DRlow
und
; vgl. auch Jacobi et al, 2005), wohingegen bei BP-Patienten vor allem
eine CD138+HLA-DRhigh-Zellpopulation beobachtet werden konnte. In Abbildung 4.21 wird
die unterschiedliche Frequenz der HLA-DRlow/high exprimierenden Zellen unter der CD138
positiven Zellpopulation in den Punktediagrammen und Histogrammen von Kontrollpersonen
(A, B) und Patienten (C, D) dargestellt. Während sich bei den Normalpersonen demnach die
80
Ergebnisse
CD138+HLA-DR+ Zellen in den oberen rechten und linken Quadranten gleichermaßen
verteilen, so sind die CD138+HLA-DR+ Zellen überwiegend auf den oberen rechten
Quadranten konzentriert. So liegt der prozentuale Anteil der CD138+HLA-DRhigh Zellen in
gesunden Spendern bei 50 % (41,5 % - 68,16 %), bei den Patienten hingegen erhöht sich
die Frequenz der HLA-DR++ Zellen um fast ein Drittel auf 72 % (59,25 % - 82,98 %; vgl.
Graphik 4.22).
Zellen [%]
CD138+ B-Zellen
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Kontrollen
Patienten
CD138+IgG+ in %
CD138+HLA-DR++ in %
Abb. 4.22: Expressionsmuster von IgG und HLA-DR unter CD138+ Zellen bei Donoren und BP-Patienten.
Das Säulendiagramm zeigt das unterschiedliche Expressionsverhalten von CD138 positiven Zellen für das
Oberflächenmolekül HLA-DR und für den intrazellulären Marker IgG bei gesunden Spendern (für IgG und HLADR n = 11) und Patienten (für IgG n = 9, für HLA-DR n = 11) mit bullösem Pemphigoid. Die prozentualen
+
Angaben beziehen sich lediglich auf die mit Magnetpartikeln angereicherten CD138 Zellen, die für das jeweilige
Molekül (IgG bzw. HLA-DR) positiv waren. Blaue Säule: Kontrollpersonen; Rote Säule: Patienten.
Zudem sollte untersucht werden, unter welcher der beiden HLA-DR-Subpopulationen sich
die IgG-exprimierenden Zellen befinden. Dazu wurden die zuvor angereicherten CD138+
Zellen von BP-Patienten und Kontrollpersonen sowohl mit dem HLA-DR-Antikörper
oberflächen- als auch intrazellulär mit dem IgG-Antikörper gefärbt und anschließend
durchflusszytometrisch analysiert.
81
Ergebnisse
Kontrolle
BP-Patient
HLA-DR
B
HLA-DR
A
icIgG
icIgG
Abb. 4.23: Detektion IgG+ Zellen unter den HLA-DRlow/high Subpopulationen bei Patienten und Spendern.
CD138+ B-Zellen wurden mittels CD138-Magnetpartikeln aus PBMC von gesunden Spendern (A) und Patienten
(B) mit bullösem Pemphigoid angereichert und auf der Säule mit IgG-FITC und HLA-DR-PE intrazellulär und
oberflächengefärbt. Die Punktediagramme (A) und (B) zeigen eine Zweifarbenanalyse für HLA-DR-PE und IgGFITC. In die Bewertung wurden ausschließlich die für CD138 positive Zellen miteinbezogen. Insgesamt wurden
10.000 Zellen analysiert.
Vergleicht man die Verteilung der IgG produzierenden Zellen unter der gesamten HLA-DR
positiven Zellpopulation (HLA-DRlow und HLA-DRhigh) zwischen gesunden Spendern und BPPatienten, so zeigt sich, dass die IgG+ Zellen von Patienten beinahe zu 100 % der HLADRhigh Population zuzuordnen sind. Im Gegensatz dazu lässt sich bei den Kontrollpersonen
eine eher heterogene Verteilung der IgG-Population unter den HLA-DR-Zellen beobachten
(Abb. 4.23, A und B).
Zusätzlich sollte mit dem in dieser Arbeit durchgeführten T-Test (GraphPad Prism®)
ein signifikanter Unterschied in der (A) Immunglobulin G (IgG)– und (B) HLA-DRExpressionsstärke unter der CD138+ Zellpopulation zwischen Kontrollpersonen (für HLA-DR
und IgG n = 11) und Patienten (für HLA-DR n = 11, für IgG n = 9) dargestellt werden (vgl.
Abb. 4.24, A und B). Beim Vergleich der beiden Gruppen zeigten sich sowohl für die IgG- als
auch für die HLA-DR-Expressionsstärke hochsignifikante p-Werte (p < 0.0001).
82
Ergebnisse
A
B
***
***
Abb. 4.24: T-Test der IgG- und HLA-DR-Expression im Vergleich zwischen Patienten und Kontrollen.
Dargestellt ist der signifikante Unterschied in der IgG (A)- und HLA-DR (B)-Expressionsstärke unter den CD138
positiven Zellen zwischen BP-Patienten und gesunden Spendern. Der p-Wert, der in beiden T-Tests bei < 0.0001
lag, bezeichnet das Signifikanzniveau.
Anhand der bisher untersuchten Oberflächenmoleküle (CD19, CD27, CD38, CD138, HLADR) und des intrazellulären Markers (IgG) konnte eine erste Aussage über das
Expressionsmuster
CD138
positiver
Zellen
von
BP-Patienten
im
Vergleich
zu
Kontrollpersonen getroffen werden. Die Beobachtungen zeigten deutlich, dass sich die
Frequenz der HLA-DR++- und IgG+-exprimierenden CD138+ Zellen von BP-Patienten im
Vergleich zu den Kontrollpersonen stark erhöhte.
Die hier als CD138+CD19+CD27++CD38++HLA-DR++IgG+ beschriebene Zellpopulation
deutet somit auf einen Phänotyp hin, der sie als kurzlebige Plasmablasten identifiziert
[Odendahl et al, 2005; Mei et al, 2007].
4.3.3.1
Korrelation zwischen der Frequenz von HLA-DR++ Zellen und der Krankheitsaktivität bei Patienten mit Bullösem Pemphigoid
Nachdem nun signifikant mehr HLA-DR++ Zellen in BP-Patienten identifiziert werden konnten
(p < 0.0001), sollte in einer nächsten Frage geklärt werden, ob ein Zusammenhang zwischen
der erhöhten Frequenz der IgG-sekretierenden CD138+HLA-DR++ Plasmazellen spezifisch
für NC16a und der Krankheitsaktivität besteht. Als Maß des Aktivitätsgrades der Erkrankung
wurde die Stärke der Ausprägung frischer Blasen, Erosionen, Krusten, Rötungen und
83
Ergebnisse
juckender Ausschlag auf der Haut in die Auswertung miteinbezogen und mit „nicht aktiv“ (-),
„aktiv“ (+) sowie „sehr aktiv“ (++) bewertet. Vergleicht man die Frequenz der HLA-DR++
Plasmablasten von Patienten, die als aktiv (+) eingestuft wurden, mit der Frequenz der HLADR++ Zellen von Kontrollpersonen, so zeigt sich keine signifikante Korrelation mit der
Krankheitsaktivität. Im Gegensatz dazu kann man eine hochsignifikante Korrelation zwischen
der Frequenz HLA-DR++ Zellen von Patienten, die einen sehr aktiven Zustand aufweisen,
und der Krankheitsaktivität beobachten (p < 0.0001; Abb. 4.25). Diese Daten unterstützen
deutlich, dass die HLA-DR++ Plasmablasten das unmittelbare Produkt der Immunaktivierung
im Bullösen Pemphigoid sind und dass diese Zellpopulation mit der Krankheitsaktivität
assoziiert ist.
Frequenz der HLA-DR++ Plasmablasten in [%]
***
n. s .
-
+
[Krankheitsaktivität]
++
++
Abb. 4.25: Korrelationsanalyse zwischen der Häufigkeit HLA-DR
Zellen und der Krankheitsaktivität.
Dreiecke: Daten der gesunden Spender. Kreise: Daten der BP-Patienten. - = nicht aktiv; + = aktiv; ++ = sehr aktiv;
*** = p < 0.0001; n.s. = nicht signifikant.
4.3.4 Identifizierung NC16a-spezifischer Plasmablasten
Des Weiteren sollte untersucht werden, ob sich Autoantigen(NC16a)-spezifische Zellen in
der identifizierten Population aktivierter Plasmablasten nachweisen lassen. Zur Detektion
84
Ergebnisse
NC16a-spezifischer Plasmablasten wurden ebenfalls CD138 positive Zellen mittels CD138Mikropartikeln aus dem Blut von Patienten und Kontrollpersonen angereichert und
anschließend mit den Oberflächenmolekülen CD138, HLA-DR und dem intrazellulären
Marker IgG (icIgG) gefärbt. Zusätzlich wurden die angereicherten CD138+ Zellen intrazellulär
mit
dem
rekombinanten
gefärbt.
NC16a-Antigen
Anhand
der
verschiedenen
Punktediagramme, die jeweils eine Zweifarbenanalyse für CD138-APC (A, B), HLA-DR-PE
(C, D), IgG-FITC (E, F) und NC16a-Alexa 647 zeigen, wird deutlich, dass sich NC16aspezifische Plasmablasten im Blut von BP-Patienten detektiert lassen. Im Gegensatz dazu
können im Blut von gesunden Spendern oder Patienten mit einer nicht verwandten bullösen
Erkrankung (Pemphigus vulgaris; Daten nicht gezeigt) keine NC16a-spezifischen Zellen
nachgewiesen werden.
A
Kontrolle
B
BP-Patient
CD138
CD138
0.67 %
0.22 %
NC16a
NC16a
C
D
icIgG
icIgG
0.71 %
0.35 %
NC16a
NC16a
85
Ergebnisse
E
F
HLA-DR
HLA-DR
1.08 %
NC16a
0.26 %
NC16a
Abb. 4.26: Detektion und Identifizierung NC16a-spezifischer Plasmablasten bei BP-Patienten.
+
CD138 Zellen wurden aus dem peripheren Blut von Patienten und Kontrollpersonen isoliert. Die angereicherten
Zellen wurden dann auf der Säule mit verschiedenen Oberflächenmolekülen und einem intrazellulären Marker
gefärbt. Punktediagramme (A, Kontrolle) und (B, Patient) zeigen eine Zweifarbenanalyse für CD138-PE und
NC16a-Alexa 647, Diagramme (C, Kontrolle) und (D, Patient) zeigen eine Zweifarbenanalyse für IgG-FITC und
NC16a-Alexa 647 und (E, Kontrolle) und (F, Patient) für HLA-DR-PE und NC16a-Alexa 647. In diesen
Darstellungen sind nur CD138 positive Zellen gezeigt und der angegebene Prozentsatz gibt die Zahl der NC16a+
+
++
spezifischen unter der CD138 Zellpopulation an, unter der sich jeweils noch die IgG - und HLA-DR Zellen
befinden. Insgesamt wurden 10.000 gezählte Zellen in die Analyse mit einbezogen.
Wie in Abbildung 4.26 (B) gezeigt, besitzen bei diesem BP-Patienten 0.67 % der CD138+
Zellen eine Spezifität für NC16a. Vier weitere Patienten konnten ebenfalls auf NC16aspezifische CD138 positive Zellen getestet werden. Durchschnittlich wurden 1.26 % (0.67 %
- 1.92 %) NC16a-spezifische CD138+ Zellen von 10.000 gezählten Events im Blut von
Patienten nachgewiesen. Ebenso ließen sich unter der CD138 positiven Zellpopulation IgG+
Zellen spezifisch für NC16a detektieren. Der prozentuale Anteil der NC16a positiven Zellen
unter der CD138+IgG+ Zellpopulation lag bei 1.36 % (0.71 % - 2.20 %), Abb. 4.26 (D).
Interessanterweise konnten bei einigen BP-Patienten auch IgG-NC16a-spezifische Zellen
detektiert werden. Hier lag der durchschnittliche Anteil bei 0.39 % (0.35 % - 0.44 %).
Patienten, bei denen zusätzlich die HLA-DRhigh Zellpopulation mit dem Autoantigen gefärbt
wurde, wiesen ebenfalls eine Spezifität für NC16a auf. Im Durchschnitt waren 0.99 %
(0.24 % - 1.85 %) der HLA-DR++ Zellen spezifisch für NC16a (Abb. 4.26 (F)). Auffällig ist,
dass sich die NC16a-spezifischen Zellen überwiegend im oberen (rechten) Quadranten
befinden und somit zu jener Zellpopulation gezählt werden können, die sowohl IgG als auch
86
Ergebnisse
HLA-DR stark exprimieren (CD138+icIgG+HLA-DR++). Nur ein geringer Anteil der NC16apostiven Zellen konnte der HLA-DRlow Subpopulation zugeordnet werden. Diese Daten
deuteten darauf hin, dass es sich bei den für die Erkrankung relevanten, pathogenen
autoantigenspezifischen Zellen überwiegend um Plasmablasten handelte, eine VorläuferZellpopulation der Plasmazellen.
87
Diskussion
Kapitel 5
Diskussion
Das Bullöse Pemphigoid (BP) ist eine schwere Blasen bildende Autoimmunerkrankung der
Haut,
deren
Pathogenese
durch
Autoantikörper
gegen
die
hemidesmosomalen
Adhäsionsmoleküle BP180 und BP230 vermittelt wird. Die humorale Antwort im Bullösen
Pemphigoid ist grundsätzlich polyklonal und gegen zahlreiche Epitope des BP-Antigens
Kollagen XVII gerichtet. Die meisten von dieser schweren Erkrankung betroffenen Patienten
weisen in ihrem Blut zirkulierende Autoantikörper auf, die an die immundominante Region
von BP180 – die NC16a-Domäne – binden [Giudice et al, 1993; Zillikens et al, 1997a, b;
Schumann et al, 2000]. Neuere Studien haben die Existenz von NC16a-spezifischen
Gedächtnis-B-Zellen, die in vitro zur Synthese von Autoantikörpern induziert werden können,
identifiziert [Leyendeckers et al, 2003]. Die BP180-NC16a-spezifischen Autoantikörper
gehören vornehmlich zu den IgG 1 und IgG 4 Subklassen [Dopp et al, 2000; Bernard et al,
1990; Laffitte et al, 2001]. Allerdings ist die in vivo-Regulation der Autoantikörpersynthese
bei antikörpervermittelten Erkrankungen wie im Falle des Bullösen Pemphigoids bisher nur
unzureichend
verstanden.
Dies
gilt
insbesondere
für
die
autoantigenspezifischen
Plasmazellen, die letztendlich für die Synthese der pathogenen Antikörper verantwortlich
sind.
5.1
Rekombinante Expression der NC16a-Domäne des Kollagen XVII
In der vorliegenden Arbeit sollte daher untersucht werden, ob sich Autoantigen(NC16a)spezifische Plasmazellen in der peripheren Zirkulation von BP-Patienten nachweisen lassen
und, falls das der Fall sein sollte, welchen Phänotyp diese Population aufweist. Zur
detaillierten Analyse dieser seltenen, autoreaktiven Zellen musste zunächst das Autoantigen,
die NC16a-Domäne, in einem prokaryotischen Expressionssystem rekombinant hergestellt
und anschließend mit dem Fluorchrom Alexa Fluor 647 markiert werden. Alexa Fluor 647 ist
ein wasserlöslicher, Amin-reaktiver N-Hydroxysuccinimidylester und gehört zur Gruppe der
langwelligen Farbstoffe. Langwellige Farbstoffe werden durch Lichtquellen, die typisch für
Fluoreszenzmikroskope oder Durchflusszytometer sind, optimal angeregt [Sowell et al,
88
Diskussion
2002]. Die Hintergrundfluoreszenz der Alexa-Farbstoffe ist wesentlich schwächer als die
anderer Farbstoffe (z.B. Cy) [Cullander 1994; Flanagan et al, 1997; Sowell et al, 2002].
Vergleicht man den Alexa Fluor-Farbstoff mit langwelligen Farbstoffen wie den CyFarbstoffen, so sind die Alexa Fluor-Farbstoffe gegenüber der Fluoreszenzlöschung
(Quenching) um einiges resistenter [Berlier et al, 2003]. Sie sind stabiler, leuchten heller und
sind pH-unempfindlicher (pH 4 bis pH 10) als gewöhnliche Farbstoffe wie beispielsweise
Fluoresceine oder Rhodamine mit vergleichbarer Anregung und Emission [PanchukVoloshina et al, 1999]. Vor allem das Alexa Fluor 647 gehört zu den sehr photostabilen
Farbstoffen, d.h., der Farbstoff bleicht weniger aus, das Fluorophor wird nicht irreversibel
zerstört und somit bleibt wesentlich mehr Zeit, um Alexa Fluor-markierte Proben zu
untersuchen bzw. bildlich zu erfassen [Berlier et al, 2003]. Der Alexa Fluor 647-Farbstoff hat
seine Anregungs- und Emissionsmaxima bei ungefähr 650 nm bzw. 668 nm und aufgrund
seines weiten Spektrums ist dieser Farbstoff ideal für Mehrfarbenanwendungen.
In Anlehnung an die Arbeiten von Leyendeckers et al [1999; 2003] sollte das Blut von
Patienten mit bullösem Pemphigoid auf die Anwesenheit von Gedächtnis-B-Zellen mit
Spezifität gegen die rekombinant hergestellte BP180-Domäne NC16a untersucht und die
Antigenität des neu generierten Proteins bestätigt werden. Die von Leyendeckers und ihren
Kollegen etablierte Methode zur Isolation und Anreicherung antigenspezifischer B-Zellen
beruhte dabei auf einer zweistufigen, immunmagnetischen Anreicherung unter Verwendung
von superparamagnetischen Mikropartikeln, die an entsprechende B-ZelloberflächenAntikörper wie CD19 bzw. an das Autoantigen selbst gekoppelt waren. Hintergrund der
Etablierung dieser Methode lag darin, dass eine Analyse von antigenspezifischen B-Zellen in
humanem, peripherem Blut durch die niedrige Frequenz dieser Zellen sehr erschwert wird.
Zwar konnten bis dato bereits ex vitro Analysen durchgeführt werden, allerdings
beschränkten sich diese Untersuchungen vielmehr auf die spezifischen Autoantikörper in
diversen Kultursystemen [Lanzavecchia et al, 1983; Simonsson-Lagerkvist, 1995]. Erst eine
Anreicherung dieser Zellen machte eine quantitative Analyse und somit eine detaillierte
Phänotypisierung
der antigenspezifischen Gedächtnis-B-Zellen möglich. Dazu wurde
zusätzlich eine Methode der Multiparameter-Durchflusszytometrie entwickelt, um die
angereicherten
antigenspezifischen
B-Zellen
hinsichtlich
der
Ausprägung
diverser
Oberflächenmoleküle hinreichend charakterisieren zu können [Leyendeckers et al, 2003].
Die etablierte Methode zur Anreicherung seltener antigenspezifischer B-Zellen nutzt darüber
hinaus die Tatsache, dass naive und Gedächtnis-B-Zellen native Antigene durch ihren BZell-Rezeptor erkennen. Dieser Rezeptor ist die membrangebundene Form des Antikörpers.
89
Diskussion
Im Laufe der Differenzierung zur Plasmazelle verliert die Gedächtnis-B-Zelle diesen
Oberflächenmarker, beginnt aber mit der Synthese großer Mengen des spezifischen
Antikörpers [Reth, 1992], Abb. 1.1 und 1.3.
Das zur Detektion der antigenspezifischen Gedächtnis-B-Zellen von Leyendeckers
rekombinant hergestellte Autoantigen NC16a besaß neben einer Biotinylierung ein
Glutathion-S-Transferase(GST)-Motiv, welches ursprünglich der Aufreinigung des Proteins
diente [Leyendeckers et al, 1999]. Mit diesem biotinylierten Autoantigen ließen sich sehr gut
antigenspezifische Gedächtnis-B-Zellen durch die Bindung an den membranständigen
Antikörpern nachweisen. Im Gegensatz zur Oberflächenfärbung der antigenspezifischen
Gedächtnis-B-Zellen, stellte sich mit diesem Reagenz eine intrazelluläre Färbung von
Plasmazellen
zum
Nachweis
der
antigenspezifischen
IgG-Antikörper
jedoch
als
problematisch heraus, da eine hohe unspezifische Hintergrundfärbung (vgl. Abb. 4.1) eine
Detektion
der
seltenen
NC16a-spezifischen
Plasmazellen
sehr
erschwerte.
Diese
unspezifische Hintergrundfärbung war möglicherweise bedingt durch das sehr „klebrige“
GST-Motiv des rekombinant hergestellten Proteins.
Bei den Glutathion-S-Transferasen handelt es sich um eine multifunktionelle
Enzymfamilie, die aus vielen zytosolischen, mitochondrialen und mikrosomalen Proteinen
besteht. GSTs katalysieren intrazellulär zahlreiche Reaktionen von endogenen und
xenobiotischen Verbindungen [Boyer, 1989]. Wie in einer Studie gezeigt werden konnte,
spielen die 25 kDa-schweren GSTs zudem eine wichtige Rolle als passive Bindungsproteine
für den intrazellulären Transport von einigen Steroid- und Thyroidhormonen, von endogenen
Metaboliten und exogenen Verbindungen [Listowski et al, 1993]. Aufgrund dieser
ausgeprägten, intrazellulären Eigenschaften der Transferasen in nahezu jedem Zelltyp
wurde die unspezifische Färbung wesentlich auf die GSTs zurückgeführt. Vorstellbar ist hier,
dass sich die GSTs, die mit dem rekombinant hergestellten Protein NC16a fusioniert waren,
bei der intrazellulären Färbung durch zahlreiche Verbindungen innerhalb der Zelle
verankerten, dadurch im Zytoplasma der Zelle zurückblieben und so falsch-positive
Resultate lieferten. Um auszuschließen, dass der unspezifische Hintergrund auf eine andere
potentielle Fehlerquelle wie beispielsweise den Sekundärantikörpern zurückgeführt werden
kann,
wurden
zusätzlich
Färbungen
ausschließlich
mit
den
hier
verwendeten
Zweitantikörpern anti-Biotin-APC und Strepatividin-PE durchgeführt, die jedoch keine
auffälligen
Hintergrundfärbungen
zeigten.
Des
Weiteren
wurde
überprüft,
ob
die
eingesetzten Lösungen wie Fixierungs-, Permeabilisierungs- und Waschpuffer zu dem
90
Diskussion
unspezifischen
Hintergrund
beigetragen
haben.
Dazu
wurden
intrazelluläre
Kontrollfärbungen von CD138+ Plasmazellen mit jeweils einem Antikörper gegen humanes
Immunglobulin G bzw. gegen murines CD117 durchgeführt. Der Oberflächenmarker CD117
wird auch als c-Kit bezeichnen und funktioniert sowohl auf Melanozyten und Mastzellen als
auch auf hematopoetischen Stammzellen als Rezeptortyrosinkinase. c-Kit spielt eine
wichtige Rolle bei der Signaltransduktion und übermittelt durch die Rezeptorfunktion
Wachstums- und Überlebenssignale [Geissler et al, 1988; Roskosi et al, 2005]. Murines
CD117 stellte für das Kontrollexperiment ein irrelevantes Antigen dar, ebenso wie GST für
unsere Untersuchungen irrelevant war. Daher sollte der Antikörper gegen murines CD117 im Gegensatz zum humanen IgG-Antikörper - intrazellulär nicht binden und somit auch keine
positiven Signale liefern. Während in der Positivfraktion für intrazelluläres IgG spezifische
CD138+ Plasmazellen nachgewiesen werden konnten, wurden im Gegensatz dazu so gut
wie keine CD138+ Plasmazellen detektiert, die für das irrelevante Antigen CD117 positiv
waren. Da der hier verwendete Antikörper gegen das murine CD117 gerichtet war, sollte
dieser intrazellulär in humanen Plasmazellen nicht binden. Zwar konnte eine sehr geringe
Hintergrundfärbung beobachtet werden, diese war für die Durchführung der spezifischen
intrazellulären Färbung jedoch nicht relevant.
5.1.1 Expressionsansatz in einem eukaryotischen Expressionssystem
Um das Ausmaß der unspezifischen intrazellulären Bindung zu reduzieren, musste für diese
Arbeit daher zunächst die NC16a-Domäne neu rekombinant exprimiert und mit dem
alternativen Histidin 6 -Motiv versehen werden. Das Histidin 6 -Motiv wurde gewählt, da
Histidine als Metall-Komplexbildende Peptide mit einem Molekulargewicht von etwa 155
Dalton pro Aminosäure wesentlich kleiner als GSTs sind, aber ebenso wie GST in Form von
Fusionsproteinen der affinitätschromatographischen Aufreinigung dienen [Smith et al, 1988].
Zur rekombinanten Expression der NC16a-Domäne des Kollagen Typ XVII wurde zunächst
ein
eukaryotisches,
heterologes
Expressionssystem
verwendet.
Dazu
wurde
das
entsprechende Plasmid-Konstrukt - “pCEP4-Konstrukt F“ [freundlicherweise zur Verfügung
gestellt von Prof. Brinkmann, Universität Lübeck] - in humane embryonale Nierenzellen
(EBNA-293) transfiziert. EBNA-Zellen eignen sich besonders gut für eine Transfektion
[Numberger et al., 1996], da diese leicht zu handhaben und unter geeigneten Bedingungen
relativ robust sind. Der für die Transfektion verwendete Expressionsvektor pCEP4 enthielt
die Sequenz für das Ebstein-Barr Nuclear Antigen. Dieses Antigen sollte gewährleisten, dass
91
Diskussion
der Vektor in dieser Zelllinie episomal erhalten bleibt und nicht in die chromosomale DNA der
Zellen eingebaut wird [Reisman and Sugden, 1986; Yates et al, 1985]. Die humane
Nierenzelllinie hat zusätzlich den Vorteil, dass sie die gewünschten Proteine in großen
Mengen produziert. Eukaryotische Zellen sind im Gegensatz zum prokaryotischen
Expressionssystem in der Lage, Disulfidbindungen auszuführen, Proteine richtig zu falten
und Glykosylierungen oder andere post-translationale Modifikationen vorzunehmen [Gomord
und Fayel, 2004]. Des Weiteren zeichnet sich der Vektor durch eine Signalpeptidsequenz
aus, deren Vorhandensein die Sekretion des exprimierten Proteins in den Überstand sichern
sollte. Das Hexa-Histidin-Motiv lag im exprimierten Fusionsprotein am C-Terminus und sollte
der anschließenden Aufreinigung über eine Talon-Säule dienen. Um zu zeigen, dass die
humanen Nierenzellen die NC16a-Domäne rekombinant exprimieren, wurden TCAFällungen der serumfreien Überstände mit anschließendem, immunologischem Nachweis
durchgeführt. Die theoretische Größe des Fusionsproteins lag bei ca. 12,6 kDa. Entgegen
den Erwartungen konnte in den Western Blot-Analysen jedoch weder durch den anti-HisAntikörper noch durch die Seren von BP-Patienten, die die Autoantikörper gegen NC16a
enthalten, eine Bande mit entsprechender Größe nachgewiesen werden.
Das Wichtigste für eine erfolgreiche Proteinexpression ist die Aufrechterhaltung von
stabilen, transfizierten Zellen. Werden beispielsweise die transfizierten EBNA-Zellen nicht
ständig unter optimalen Bedingungen gehalten, können sie das pCEP4-Plasmid verlieren
und folglich eine Expression des gewünschten Proteins nicht initiieren. Ursächlich für eine
unzureichende
Proteinexpression
könnte
hier
eine
vom
Optimum
abweichende
Zusammensetzung des Selektionsmediums gewesen sein. Vor allem das Antibiotikum,
welches zur Selektion eingesetzt wird, muss - je nach verwendetem Antibiotikum - in einer
bestimmten Konzentration im Medium vorliegen. Neben Ampicillin wies der pCEP4-Vektor
zusätzlich eine Resistenzkassette auf, die für eine Kinase kodiert, welche die Funktion des
Aminocyclitol Hygromycin B durch Phosphorylierung inaktiviert. Hygromycin B inhibiert für
gewöhnlich die Protein-Synthese, in dem es die ribosomale Translokation unterbricht und
eine fehlerhafte Translation fördert [Cabanas et al, 1978]. Die empfohlene Konzentration des
Hygromycins lag bei 50 µg/ml [pCEP4-Handbuch, Invitrogen], wobei eine zu hohe
Konzentration des Antibiotikums vor allem bei schon länger kultivierten Zellen tödlich wirken
kann. Die hier verwendeten Konzentrationen für Hygromycin B lagen eindeutig unterhalb des
angegebenen Referenzbereiches (20 µg/ml – 30 µg/ml). Dies führte zum vollständigen
Absterben der nicht transfizierten Kontrollzellen, nicht jedoch der transfizierten. Dennoch
könnte die hier verwendete Konzentration auf Dauer zu hoch für die transfizierten Zellen
92
Diskussion
gewesen sein, was ihr stetiges Absterben erklären würde. Verschiedene Parallelansätze mit
unterschiedlichen
Konzentrationen
des
Antibiotikums
hätten
möglicherweise
einen
Aufschluss über die optimale Zusammensetzung des Mediums für die hier verwendeten
EBNA-Zellen erbringen können. Weitere potentielle Störfaktoren hätte man dadurch in
Betracht ziehen und entsprechend beheben können.
Eine mangelnde Proteinexpression könnte auch auf die Konstruktion des pCEP4Plasmids mit dem Konstrukt F zurückgeführt werden. So sollte das Insert (hier: Konstrukt F)
innerhalb des Promotors eine so genannte Kozak-Sequenz aufweisen, die mitentscheidend
für die Initiation der Translation ist. Teil dieser Sequenz ist der transkriptionale Start, der
durch das Initiationstriplett ATG codiert wird. Entscheidend für die optimale Funktion der
Kozak-Sequenz ist ein G oder A an der Position -3 und ein G an der Position +4:
(G/A)NNATGG (wobei N jede beliebige Base sein kann) [Kozak 1987]. Diese Voraussetzung
war in dem pCEP4-F-Konstrukt nicht hundertprozentig gegeben (CAAATGG), so dass hier
eine optimale Expression des gewünschten Proteins möglicherweise erschwert wurde.
5.1.2 Prokaryotische Expression der NC16a-Domäne
Alternativ sollte nun die NC16a-Domäne mit Hilfe eines prokaryotischen Expressionssystems
(E.coli-Stamm
BL21(DE3))
rekombinant
hergestellt
werden.
Nachteil
dieses
Expressionssystems ist die fehlende Protein-Prozessierung durch post-translationale
Modifikationen und die falsche bzw. fehlende Faltung der Proteine in die native Form durch
Hilfsproteine wie z.B. den Chaperonen. Für den nicht-kollagenen (NC) Abschnitt 16a des
Kollagen XVII sind nach der RNA-Prozessierung keine post-translationalen Modifikationen
wie die typischen N- bzw. O-Glykosylierungen oder Methylierungen bekannt. Jedoch konnte
kürzlich in einer Studie gezeigt werden, dass die NC16a-Domäne durch die Ekto-CaseinKinase 2 (CK2) am Serin544-Rest phosphoryliert wird [Zimina et al, 2007]. Ebenso war bereits
bekannt, dass post-translationale Proteinmodifikationen wie beispielsweise Phosphorylierung
die Antigenerkennung durch Autoantikörper in anderen Autoimmunerkrankungen wie
Multiple Sklerose oder dem systemischen Lupus beeinflussen [Doyle and Mamula, 2001;
Anderton, 2004]. Entsprechend konnte auch im Falle des Kollagen XVII gezeigt werden,
dass die Autoantikörper des Bullösen Pemphigoids bevorzugt an antigene Regionen binden,
wenn diese phosphoryliert sind [Zimina et al, 2008]. Allerdings gibt es zahlreiche Studien, die
belegen, dass die Protein-Phosphorylierung kein ausschließlich eukaryotisches Phänomen
93
Diskussion
ist, sondern genauso häufig in Bakterien vorkommt [Manai und Cozzone, 1979; Rafter, 1964;
Wang und Koshland, 1978] und daher nur bedingt als post-translationale Modifikation
bezeichnet werden kann. Aus diesem Grund wurde davon ausgegangen, dass die NC16aDomäne des Kollagen XVII trotz prokaryotischer Expression post-translational in einem
phosphorylierten Zustand vorliegt. Zudem ist bekannt, dass sich kleine Proteine - wie
beispielsweise die NC16a-Domäne eines ist - bei nur geringen Einflussfaktoren selber in die
native Form falten [Anfinsen, 1973]. Daher war auch diesbezüglich zu erwarten, dass das 72
Aminosäuren lange, rekombinante Protein nach der Expression in einem prokaryotischen
System aktiv ist. Die Vorteile eines prokaryotischen Expressionssystems bestehen zum
einen in der Leichtigkeit, mit der prokaryotische Zellen genetisch manipuliert werden können,
zum anderen in dem schnellen Wachstum der Zellen und dem hohen Expressionsniveau
rekombinanter Proteine [Gomord und Faye, 2004].
Aufgrund seiner spezifischen, eukaryotischen Vektorelemente (CMV-Promoter, oriP,
EBNA-1-Gen) war der vorhandene Expressionsvektor pCEP4 mit dem Konstrukt F als Insert
nicht für ein prokaryotisches Expressionssystem geeignet [pCEP4-Handbuch, Invitrogen]. So
musste zunächst die cDNA, welche für die NC16a-Domäne kodiert, mit entsprechenden
Oligonukleotiden durch das PCR-Verfahren amplifiziert und das PCR-Produkt anschließend
in einen geeigneten Vektor umkloniert werden. Der pDrive-Vektor ist ein gängiges
Klonierungsplasmid, um beispielsweise PCR-Produkte einzufügen. Über diesen Vektor war
es dann möglich, das Insert in das gewünschte Zielplasmid, den pRSET A –
Expressionsvektor,
umzuklonieren. Mit
Hilfe
des
pRSET-Vektors
und
des
E.coli-
Bakterienstammes BL21(DE3) konnte durch Stimulation mit IPTG die NC16a-Domäne
exprimiert werden. Jedoch stellte sich heraus, dass nur geringe Mengen des Proteins im
Überstand vorhanden waren. Daher wurde vermutet, dass der größte Teil des rekombinant
hergestellten Proteins in Einschlusskörperchen (inclusion bodies) vorhanden sein musste.
Die Bildung dieser Körperchen bzw. Proteinaggregate ist eine natürliche Reaktion
bakterieller Zellen, oftmals bedingt durch fehlerhafte oder nicht gefaltete Proteine
(Fremdproteine), die durch eine exzessive Synthese im Zellkern oder Zytoplasma entstehen
[London et al, 1974; Wetzel, 1994; Haase-Pettingell und King, 1988]. Mit Hilfe eines
bestimmten Verfahrens ist es möglich, die Proteine aus den Einschlusskörperchen zu
isolieren. Bei diesem Verfahren wird eine 6-molare Harnstoffkonzentration verwendet,
welche die Einschlusskörperchen zerstört und so die Proteine freisetzt. Mittels dieser
Methode sollte demnach versucht werden, das rekombinante NC16a-Protein aus den
Einschlusskörperchen zu isolieren. Durch die Behandlung des Bakterienpellets mit 6 M
94
Diskussion
Harnstoff konnte der Verdacht bestätigt werden, dass sich die Domäne in den
Einschlusskörperchen befindet (vgl. Abb. 4.9). Die Behandlung mit 6 M Harnstoff-haltigem
Puffer birgt neben der Isolation des Proteins jedoch auch Nachteile: so liegt das isolierte
Protein in einem ungefalteten Zustand vor und ist somit, daraus resultierend, nicht aktiv. Um
den dafür verantwortlichen Harnstoff aus der Lösung zu entfernen, gibt es die Möglichkeit
der Dialyse. Hierbei wird der Harnstoff-haltige Puffer gegen einen gängigen Phosphatpuffer
wie PBS ausgetauscht. Das Dialyseverfahren erfolgt für gewöhnlich schrittweise, damit sich
das Protein langsam in seine native Form zurückfalten kann. Allerdings kann es passieren,
dass das Protein durch das schrittweise Zurückfalten irgendwann einen kritischen Punkt
erreicht (für gewöhnlich bei der Hälfte der Ausgangsmolarität), in dem es nur partiell gefaltet
vorliegt und es dadurch zur Aggregatbildung des Proteins kommt [Wetzel, 1994; Fink, 1998].
Dieser intermediäre Zustand führt dann dazu, dass das Protein ausfällt und somit
unbrauchbar wird. Dieser Zustand wurde bei mehreren Dialyseansätzen der NC16a-Domäne
beobachtet. Aufgrund dessen konnte das Protein für nachfolgende Experimente nicht
verwendet werden. Daher erfolgte die Isolation von NC16a aus mehreren gesammelten
Überständen, bis letztendlich genügend Protein zur Verfügung stand. Die NC16a-Domäne
wurde über eine Affinitätssäule aufgereinigt und mit dem Fluorchrom Alexa 674 markiert.
Um zu zeigen, dass die rekombinante NC16a-Domäne tatsächlich in einem aktiven
Zustand vorliegt, sollte das Protein auf seine Antigenität hin untersucht werden. Die meisten
Patienten (> 90 %) mit Bullösem Pemphigoid weisen in ihrem Blut zirkulierende
Autoantikörper auf, die an die immundominante Region von BP180 – der NC16a-Domäne –
binden [Giudice et al, 1993; Zillikens et al, 1997a, b; Schumann et al, 2000]. Mit Hilfe eines
Immunblots und den Seren der BP-Patienten konnte daher die Aktivität des Proteins am
besten und einfachsten überprüft werden. Im Gegensatz zu den gesunden Kontrollpersonen,
deren Seren keine Autoantikörper gegen die NC16a-Domäne aufweisen, konnte im Fall der
Patienten eine eindeutige Bande bei einer Größe von 12,6 kDa detektiert werden. Dies
deutete darauf hin, dass das rekombinant hergestellte Protein in einem aktiven Zustand
vorlag und von den Autoantikörpern erkannt wurde. Die Antigenität der NC16a-Domäne
sollte dann in einem weiteren Schritt auch auf zellulärer Ebene getestet werden.
95
Diskussion
5.2
Detektion NC16a-spezifischer Gedächtnis-B-Zellen
Wie bereits in einer Studie von Leyendeckers et al beschrieben, sollten in der vorliegenden
Arbeit ebenfalls die NC16a-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen im Blut von BP-Patienten
detektiert werden. Die Arbeitsgruppe von Leyendeckers verwendete zur Isolation der
antigenspezifischen B-Zellen das 2-Schritt-immunmagnetische Anreicherungsverfahren.
Unter Verwendung von ablösbaren, paramagnetischen Mikropartikeln, die an monoklonale
CD19-Antikörper gekoppelt waren, wurden in einer ersten magnetischen Trennung BLymphozyten aus Vollblut oder peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC) angereichert.
CD19 ist der wichtigste Oberflächenmarker, um B-Lymphozyten eindeutig zu identifizieren.
Die NC16a-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen wurden, nach enzymatischer Abspaltung der
paramagnetischen CD19-Mikropartikel, aus den vorangereicherten CD19+-Zellen mittels
Antigen(GST-NC16a)-gekoppelter Mikropartikel in einem zweiten Anreicherungsschritt
isoliert
und
durchflusszytometrisch
quantifiziert.
Erst
durch
diesen
zweiten
Anreicherungsschritt und der zusätzlichen Oberflächenfärbung mit monoklonalen IgGAntikörpern zur Detektion IgG-exprimierender B-Zellen ist es der Arbeitsgruppe gelungen,
die NC16a-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen anzureichern und eine NC16a+IgG+-Population
zu detektieren. Die Frequenz der NC16a-spezifischen IgG+ Gedächtnis-B-Zellen reichte
dabei von 10.1 bis 414.6 Zellen pro 1 Million CD19+ B-Zellen [Leyendeckers et al, 1999].
Im Gegensatz zu der 2-Schritt-Anreicherungsmethode wurde in dieser Studie eine 1Schritt-Strategie verfolgt, die es ermöglichen sollte, nach nur einem Anreicherungsschritt
NC16a-spezifische IgG+ B-Zellen zu detektieren. Ebenso wie bei der Methode nach
Leyendeckers wurden im ersten Schritt B-Lymphozyten aus peripherem, mononuklearem
Blut mittels CD19-Mikropartikeln über magnetische Säulen angereichert. Die CD19+ B-Zellen
wurden im Anschluss mit den monoklonalen Antikörpern CD19 und IgG gefärbt, um die IgGexprimierenden Gedächtnis-B-Zellen zu identifizieren. Für die durchflusszytometrische
Detektion NC16a-spezifischer B-Zellen in der immunmagnetisch angereicherten Zellfraktion,
wurden die Zellen ohne einen weiteren Anreicherungsschritt direkt mit dem Alexa 647
konjugierten, rekombinant hergestellten NC16a-Reagenz gefärbt. Die Frequenz der NC16apositiven IgG+ B-Zellen reichte von 119.4 Zellen bis 218.2 pro 1 Million CD19+ B-Zellen
(2.2x10-4 bis 1.2x10-4), und war somit durchschnittlich um etwa die Hälfte geringer als die
Frequenz der NC16a-spezifischen IgG positiven Gedächtnis B-Zellen, die mit der 2-SchrittMethode nach Leyendeckers et al erzielt wurde (4.2x10-4 bis 1x10-5). Um eine unspezifische
Hintergrundfärbung ausschließen zu können, wurden parallel CD19+ Zellen aus dem
96
Diskussion
peripheren Blut von Kontrollpersonen mit dem gleichen Verfahren gefärbt. Da keine
spezifischen Zellen detektiert wurden, konnte man davon ausgehen, dass die aus dem Blut
der BP-Patienten detektierten CD19+IgG+ Zellen tatsächlich spezifisch für NC16a waren (vgl.
Abb. 4.15 B-E). Allerdings war es überraschend, dass trotz nur eines Anreicherungsschritts
dennoch halb so viele NC16a-spezifische Gedächtnis-B-Zellen detektiert werden konnten
wie nach der zuvor beschriebenen 2-Schritt-Anreicherungsstrategie. Da bei Leyendeckers et
al der zweite Anreicherungsschritt mit Hilfe von NC16a-Mikropartikeln erfolgte, lässt sich
diese Tatsache damit erklären, dass die NC16a-Mikropartikel mit dem verwendeten GSTNC16a-PE-Reagenz um die Bindungsstellen der spezifischen Zellen konkurrierten. Laut
Leyendeckers wurden die CD19+ B-Zellen in den durchgeführten Experimenten nach
enzymatischer Abspaltung der CD19-Mikropartikel und vor der NC16a-PE-Färbung zunächst
mit den NC16a-Mikropartikeln inkubiert. Dadurch war bereits vor der eigentlichen Färbung
ein Teil der spezifischen Bindungsstellen belegt, was sich letztendlich auf die Helligkeit der
Färbung auswirkte. NC16a-positive Zellen, die ohnehin nicht besonders hell waren, konnten
zudem möglicherweise nicht mehr von den negativen Zellen unterschieden werden. Somit
hatten die NC16a-Mikropartikel nicht nur einen negativen Einfluss auf die Helligkeit, sondern
womöglich auch auf die Frequenz der NC16a-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen.
Entsprechend der Daten von Leyendeckers, waren alle BP-Patienten, die für die
vorliegende Studie untersucht wurden, bereits immunsuppressiv behandelt. Leyendeckers et
al konnten nicht ausschließen, dass die immunsuppressive Behandlung die Anzahl der
antigenspezifischen B-Zellen beeinflusste, wobei hier von einer Verringerung der Zellzahl
aufgrund der Therapie ausgegangen wurde. Die BP-Patienten, die sich für diese Studie zur
Verfügung
stellten,
waren
ebenfalls
zum
Zeitpunkt
der
Blutabnahme
bereits
immunsuppressiv behandelt. Ebenso ist es möglich, dass auch hier die immunsuppressive
Behandlung Einfluss auf die Zellzahl der NC16a-spezifischen Gedächtnis-Zellen ausübte
und somit die tatsächliche Anzahl der antigenspezifischen IgG+ Zellen nicht bestimmt werden
konnte. Übereinstimmend mit den Ergebnissen von Leyendeckers et al zeigte die Mehrheit
der untersuchten Patienten zum Zeitpunkt der Blutabnahme eine Krankheitsaktivität
[Leyendeckers er al, 1999]. Vergleicht man die Zellfrequenz der detektierten NC16a+ BZellen in der hier vorliegenden Arbeit mit Frequenzen anderer antigenspezifischer
Gedächtnis-B-Zellen, beispielsweise mit den Tetanus-Toxin-spezifischen B-Zellen, so ist die
in dieser Studie erreichte Frequenz der NC16a-spezifischen IgG+ B-Zellen höher als die der
rTTC.-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen in vergleichbaren Arbeiten [Lanzavecchia et al,
1983; Leyendeckers et al, 1999]. So lag die Frequenz der IgG+ rTT.C-spezifischen B-Zellen
97
Diskussion
unter
den
CD19+
B-Zellen
von
Normalpersonen
zwischen
6.5x10-6
bis
7.8x10-5
[Leyendeckers et al, 1999], übereinstimmend mit Daten aus früheren Arbeiten [Lanzavecchia
et al, 1983]. Auch Odendahl et al gelang es in einer Studie, bei 50 % der untersuchten
Personen an Tag 8 bis 11 nach Impfung rTT.C-spezifische Gedächtnis-B-Zellen, die nach
Immunisierung mit dem Tetanus-Toxin generiert wurden, nachzuweisen. Die Frequenz
dieser rTT.C-spezifischen Gedächtnis-B-Zellen reichte von 6x10-5 bis 1x10-5 unter 10-5
PBMC und bestätigte damit die früheren Arbeiten von Leyendeckers et al [Odendahl et al,
2005]. Die Frequenz der NC16a-spezifischen IgG+ B-Zellen unter CD19+ B-Zellen hingegen
lag zwischen 2.2x10-4 und 1.2x10-4 (n = 4). Dieses Ergebnis war so nicht unbedingt zu
erwarten, da Autoantigene wie beispielsweise die NC16a-Domäne als permanent
stimulierende Antigene im Körper der Patienten stets gegenwärtig sind, Pathogenspezifische Antigene wie das Vakzin Tetanus Toxoid hingegen nur innerhalb eines
bestimmten Zeitraumes im Blut persistieren.
Naive B-Zellen, die spezifisch auf ein Antigen reagieren, werden aktiviert und
proliferieren im Keimzentrum entweder zu Gedächtnis-B-Zellen oder zu Plasmazellen.
Letztere sorgen für die Synthese protektiver, Immunogen-spezifischer Antikörper im
peripheren Blut [Jego et al, 1999]. Es folgt die Opsonierung des Antigens und bereits kurze
Zeit später verringert sich die Anzahl der Gedächtnis-B-Zellen. Dennoch bleibt die Immunität
für gewöhnlich über Jahre hinweg bestehen. Diese Tatsache wird dadurch erklärt, dass der
Antikörpertiter nicht durch die stetige Differenzierung von Gedächtnis-B-Zellen zu
kurzlebigen IgG-exprimierenden Plasmazellen aufrechterhalten wird, sondern vielmehr durch
langlebige Plasmazellen [Manz et al, 1997, 1998, 2002].
Ebenso wie das Plasmazell-Gedächtnis bei der Aufrechterhaltung der protektiven
humoralen Immunität beteiligt ist, hat das Plasmazell-Gedächtnis in der Pathogenese von
Autoimmunprozessen
eine
große
Bedeutung.
Aufgrund
der
zentralen
Rolle
von
Autoantikörpern bei Autoimmunerkrankungen liegt es nahe, jene autoreaktive Zellen näher
zu untersuchen, die für die Produktion der autoaggressiven Antikörper verantwortlich sind.
98
Diskussion
5.3
Anreicherung und Analyse zirkulierender CD138+ B-Zellen bei Patienten
mit Bullösem Pemphigoid
Obwohl Plasmazellen als Antikörper-sezernierende Zellen einen zentralen Part in den
verschiedensten Immunantworten einnehmen, gibt es bisher nur wenige Arbeiten, die sich
mit dieser Zellpopulation auseinandergesetzt haben. Das mag unter anderem daran liegen,
dass die Häufigkeit der Plasmazellen im peripheren Blut sehr gering ist und nur bei 0.01 %
bis 0.1 % der Blutzellen liegt. Vor allem aber existieren bisher noch keine Arbeiten, die sich
mit autoantigenspezifischen Plasmazellen auseinander gesetzt haben und die den Phänotyp
dieser autoreaktiven Zellen untersuchen. Mit Hilfe spezifischer Oberflächenmarker sollten in
dieser Arbeit daher die autoantigenspezifischen Plasmazellen aus dem Blut von Patienten
mit Bullösem Pemphigoid angereichert, identifiziert und hinsichtlich ihres Phänotyps
analysiert werden.
Die zahlreichen Oberflächenmoleküle, die eine Charakterisierung der verschiedenen
Differenzierungsstufen und –linien der B-Zellen möglich machen wie z.B. CD19, CD20,
CD27 und CD38, werden im Laufe des Reifeprozesses zur Plasmazelle stärker bzw.
schwächer oder aber gar nicht mehr exprimiert [Banchereau & Rousset, 1992], vgl. auch
Abb. 1.3. Die Expression nur weniger Marker, dazu gehören CD27 und CD38, wird auf der
Zelloberfläche
der
Plasmazellen
verstärkt
und
erlaubt
eine
Identifikation
dieser
Zellpopulation. Allerdings werden diese Moleküle auch auf anderen Zellen im peripheren Blut
(z.B. Gedächtnis-B-Zellen) exprimiert, wodurch eine einfache und direkte Isolation der
Plasmazellen erschwert wird. Im Gegensatz zu CD27 und CD38 kann eine eindeutige
Anreicherung
von
Plasmazellen
über
den
hier
verwendeten,
universellen
Differenzierungsmarker CD138 (Syndekan-1) gewährleistet werden. CD138 ist ein Mitglied
der transmembranen Heparan-Sulfat-Proteoglykan-Familie und wirkt als ein extrazelluläres
Matrixprotein [Elenius et al, 1990; Mali et al, 1990]. Syndekan-1 ist in zahlreichen zellulären
Funktionen involviert, einschließlich der Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsion, Zellproliferation
und
Zellmigration.
Zelloberfläche
von
Die
Expression
reifen
dieses
Epithelzellen
Moleküls
beobachtet,
wird
typischerweise
insbesondere
auf
auf
der
Zellen
des
Plattenepithels. Ebenso wurde die Expression von Syndekan-1 auf mesenchymalen
Gewebezellen gezeigt [Vainio et al, 1989; 1992]. Innerhalb des hematopoetischen Systems
ist CD138 allerdings ausschließlich auf Plasmazellen vorhanden [Pellat-Deceunynck, 1994;
99
Diskussion
Wijdenes et al, 1996; Carey, 1997; Chilosi et al, 1999; Mei et al, 2007]. Als exklusiver
Marker ermöglicht CD138 somit eine detaillierte Charakterisierung dieser Zellen.
Bei den CD138+ B-Zellen handelt es sich um differenzierte, Antikörper-sezernierende
B-Lymphozyten, welche im Laufe ihres Reifungsprozesses aus aktivierten B-Zellen, den
Gedächtnis-B-Zellen, hervorgehen [Arpin et al, 1997]. Sie lassen sich in Plasmablasten und
Plasmazellen unterteilen, wobei die Plasmablasten bereits 5 bis 7 Tage nach AntigenKontakt im Blut detektiert werden können [Medina et al, 2002]. Während diese im peripheren
Blut zirkulierende, noch teilungsfähige Population eine Vorläufergruppe der Plasmazellen
darstellt, handelt es sich bei den überwiegend im Knochenmark residierenden Plasmazellen
um eine endgültig ausgereifte Zellpopulation [Shapiro-Shelef et al, 2005; Radbruch et al,
2006]. Sie sind die wichtigsten Antikörper-bildenden Zellen des Körpers und stellen daher als
Effektorzellen eine essentielle Komponente der humoralen Immunantwort dar [Slifka und
Ahmed, 1998]. Allerdings wird eine detaillierte, phänotypische Analyse der beiden
Zellpopulationen durch ihre geringe Häufigkeit im peripheren Blut von nur 0.01-0.1 % sehr
erschwert [Klein et al, 1995].
Zur Anreicherung der CD138+ Zellen aus dem Blut wurde ein Antikörper gegen
CD138 verwendet, der an superparamagnetische Mikropartikel gekoppelt war. Mittels
magnetischer Zellseparation konnten so mit hoher Reinheit die CD138+ Zellen aus den
mononuklearen Zellen des peripheren Blutes von Patienten und gesunden Spendern isoliert,
durchflusszytometrisch analysiert und anschließend phänotypisch charakterisiert werden.
Die detaillierte Phänotypisierung wurde durch eine neuartige Färbemethode ermöglicht, die
erstmals von Horst et al für die Isolation und Charakterisierung von IgE+-Plasmazellen bei
Atopikern etabliert wurde [Horst et al, 2002]. Hierbei wurden die Zellen gefärbt, während sie
sich noch auf der Anreicherungssäule befanden. So konnten Zellverluste durch eine
geringere Anzahl an Waschschritten verringert werden.
5.3.1 Identifizierung der CD138+ Zellen aus dem peripheren Blut
Ob es sich bei den aus dem peripheren Blut von BP-Patienten angereicherten CD138+ Zellen
um neu generierte Plasmablasten oder um bereits enddifferenzierte Plasmazellen handelte,
sollte im Rahmen der Phänotypisierung mit zusätzlichen Oberflächenmarkern untersucht
werden (vgl. auch Abb. 1.3 und Tab. 1.1). Von großem Nutzen hierbei war, dass sich bei der
100
Diskussion
Differenzierung
von
reifen
B-Zellen
zu
Plasmablasten
oder
Plasmazellen
das
Expressionsmuster einer Vielzahl verschiedener Moleküle mit unterschiedlicher Kinetik
ändert und sich so eine bestimmte Zellpopulation relativ gut identifizieren lässt [Mei et al,
2007; Odendahl et al, 2005].
Für die Untersuchungen wurden zunächst die CD138+ Zellen aus PBMC von
gesunden Spendern und BP-Patienten immunmagnetisch angereichert und mit den Markern
CD19, CD27, CD38 und CD138 gefärbt. CD19 ist ein Oberflächenmarker, der während der
gesamten B-Zell-Entwicklung stark exprimiert ist und erst bei der Differenzierung zum
Plasmablasten
bzw.
zur
Plasmazelle
zunehmend
herunterreguliert
wird.
Während
Plasmazellen nur noch sehr geringe Mengen an CD19 exprimieren oder die Expression
sogar vollständig einstellen können [Odendahl et al, 2000; Harada et al, 1993], exprimieren
Plasmablasten, die für gewöhnlich im peripheren Blut zirkulieren, dieses Oberflächenmolekül
noch etwas stärker [Medina et al, 2002; Mei et al, 2007]. Sowohl Plasmablasten als auch
Plasmazellen zeichnen sich durch eine sehr starke CD27 Expression aus [Medina et al,
2002; Arce et al, 2004, Odendahl et al, 2005]. Während der Differenzierung von B-Zellen zu
Plasmazellen innerhalb des Keimzentrums wird CD27 heraufreguliert und kann daher als
spezifischer Marker angesehen werden [Jung et al, 2000]. Da sich die Expressionsstärke
von CD27 bei beiden Zellpopulationen kaum unterscheidet, lässt sich daran jedoch nicht
eindeutig feststellen, ob die hier detektierten CD138+ Zellen neu generierte Plasmablasten
oder
reife
Plasmazellen
waren.
Ein
weiterer,
für
die
Zellpopulationen
typischer
Oberflächenmarker ist CD38. Über dieses Molekül ist bekannt, dass je weiter die
differenzierte B-Zelle gereift ist, desto stärker CD38 exprimiert wird und auf reifen
Plasmazellen aus dem Knochenmark die maximale Expression erreicht [Terstappen et al,
1990]. Um daher aussagen zu können, ob es sich bei den untersuchten CD138+ Zellen um
Plasmablasten oder bereits um Plasmazellen handelte, müsste man das Expressionsmuster
von CD38 zwischen den CD138+ Zellen aus dem Knochenmark (=Plasmazellen) und den
CD138+ aus dem peripheren Blut (Plasmablasten) vergleichen. Dies könnte einen
eindeutigeren Aufschluss über den Reifegrad der Zellen im Blut geben.
5.3.2 Detektion von autoantigenspezifischen IgG-sekretierenden CD138+ Zellen
In dieser Studie konnte eine Zellpopulation identifiziert werden, die bezüglich ihrer
Oberflächenmarker CD138++CD19dimCD27highCD38high war. Vergleicht man die bisherigen
101
Diskussion
Daten mit anderen Studien, so handelt es sich bei den Plasmazellen im peripheren Blut um
noch unreife, neu generierte, kurzlebige Plasmablasten, die sich von reifen Plasmazellen
aus dem Knochenmark und den Tonsillen unterscheiden [Cepok et al, 2005; Arce et al,
2004; Medina et al, 2002; Brieva et al, 1991; Odendahl et al, 2005]. Da dieser
Plasmazellphänotyp jedoch keinen signifikanten Unterschied zwischen gesunden Spendern
und BP-Patienten aufzeigte, sollte das Expressionsverhalten zweier weiterer Marker unter
den CD138+ Zellen untersucht werden. Bei dem einen Marker handelte es sich um das in
Plasmablasten
und
Plasmazellen
in
großem
Ausmaß
intrazellulär
vorhandene
Immunglobulin G. In Abhängigkeit von der Immunantwort werden unterschiedliche
Antikörper-Isotypen von den Antikörper-sezernierenden Zellen exprimiert, wobei IgG die
häufigste Klasse der Immunglobulinen darstellt und IgE die seltenste. Während das
überwiegend in der Haut, der Lunge und im Verdauungstrakt vorkommende Immunglobulin E
(IgE) in erster Linie Parasiten abwehren soll und an allergischen Reaktionen beteiligt ist [Erb,
2007; Gould et al, 2003], sorgt das IgA vor allem in lymphatischen Geweben und
Schleimhäuten für die Abwehr von Krankheitserregern [Fagarasan und Honjo, 2003]. Das
Immunglobulin G (IgG) hingegen ist die am häufigsten vorkommende Klasse von
Immunglobulinen
im
Blutplasma
und
soll
dort
neben
der
Aktivierung
des
Komplementsystems vor allem Pathogene wie Bakterien und Viren binden [Golenhofen,
2006].
In der vorliegenden Arbeit konnten unter den PBMC von BP-Patienten im Vergleich
zu den gesunden Spendern deutlich erhöhte Frequenzen der IgG+CD138+ Zellen beobachtet
werden. Nach Anreicherung der CD138+ Zellen auf einer Magnetsäule, wurden die Zellen auf
der Säule sowohl mit einem CD138-Antikörper Oberflächen- als auch mit einem IgGAntikörper intrazellulär gefärbt und anschließend durchflusszytometrisch analysiert. Während
bei den Kontrollpersonen durchschnittlich etwa 24 % (10.18 – 33.33 %) der angereicherten
CD138+ Zellen IgG exprimierten, so verdoppelte sich die Frequenz der IgG positiven Zellen
bei den Patienten auf ca. 50 % (38.74 – 64.37 %). Übereinstimmend mit den erworbenen
Daten von Horst et al liegt die Häufigkeit der IgG-produzierenden Zellen in Normalpersonen
bei ca. 25 % [Horst et al, 2002]. Daher ist die erhöhte Frequenz der IgG-sezernierenden
Zellen in BP-Patienten sehr wahrscheinlich auf die Autoimmunerkrankung zurückzuführen.
Diese Vermutung deckt sich mit der Tatsache, dass auch bei Patienten mit aktivem
Pemphigus vulgaris eine erhöhte Frequenz der IgG-sezernierenden Zellen beobachtet
werden konnte (eigene Arbeiten, Daten nicht gezeigt).
102
Diskussion
Zu klären wäre nun die Frage, wodurch genau der hohe Prozentsatz der IgG+CD138+
Plasmablasten in BP-Patienten bedingt ist. Ein größerer Anteil könnte sich auf die
kurzlebigen, für das Hauptantigen NC16a spezifischen IgG-sezernierenden CD138+
Plasmablasten zurückführen lassen, die durch die permanente Präsenz des Autoantigens
und der Aktivierung naiver B-Zellen und Gedächtnis-B-Zellen kontinuierlich neu generiert
werden [Ahmed und Gray, 1996]. Durch die stetige Synthese autoreaktiver Antikörper tragen
diese Zellen letztendlich zur Pathogenese des Bullösen Pemphigoids bei. Dass die erhöhte
Frequenz der IgG-produzierenden Zellen wahrscheinlich eher auf die Neubildung
spezifischer Plasmablasten und weniger auf Plasmazellen zurückzuführen ist, lässt sich mit
der Tatsache erklären, dass im Gegensatz zu den Plasmablasten die langlebigen IgGsezernierenden Plasmazellen so gut wie nicht im peripheren Blut zirkulieren, sondern nach
der Enddifferenzierung aus den Vorläuferzellen überwiegend im Knochenmark lokalisiert
sind [Manz et al, 1997; Slifka et al, 1998; Radbruch et al, 2006]. Somit lassen sich diese
Zellen zwar im peripheren Blut nur schwer nachweisen, tragen als langlebige Plasmazellen
aber dennoch zur Aufrechterhaltung des humoralen Gedächtnisses bei, in dem sie weiter
Antikörper sezernieren und ins Blut abgeben [Manz et al, 1997, 1998, 2002; Slifka et al,
1998]. Des Weiteren ist es denkbar, dass die erhöhte Frequenz der IgG-sezernierenden
Zellen zu einem geringen Prozentsatz auf die Generierung CD138+ Plasmablasten spezifisch
für andere Epitope des Kollagen XVII zurückgeführt werden kann. Dieser Punkt wird in
einem späteren Abschnitt näher diskutiert.
In diesem Zusammenhang stellte sich nun die Frage, ob sich unter den vermehrt
nachweisbaren IgG Plasmablasten in der Tat autoantigenspezifische Zellen nachweisen
lassen. Tatsächlich ist es in dieser Arbeit gelungen, unter den IgG-produzierenden CD138+
Zellen Autoantigen(NC16a)-spezifische Plasmablasten zu detektieren. Der prozentuale
Anteil der NC16a positiven Zellen unter der CD138+IgG+ Zellpopulation lag bei
durchschnittlich 1.36 % (0.71 % - 2.20 %). Eine intrazelluläre Färbung mit Antikörpern, die
gegen die verschiedenen Haupt-IgG-Unterklassen wie IgG 1 und IgG 4 gerichtet sind, würden
Aufschluss darüber geben, ob die NC16a-spezifischen Immunglobuline einen IsotypKlassenwechsel vollzogen haben und somit der im Serum vorherrschenden IgGUnterklasse 4 angehören. Interessanterweise konnten auch einige wenige CD138+ Zellen
detektiert werden, die zwar für NC16a spezifisch, für IgG jedoch negativ waren (CD138+IgGNC16a+, Ø 0.39 %). Einige Publikationen haben darüber berichtet, dass es neben IgG
weitere Antikörperklassen wie IgA und IgE gibt, die ebenfalls gegen BP180, vorzugsweise
gegen die Ektodomäne, bzw. gegen BP230 gerichtet sind [Christophoridis et al, 2000;
103
Diskussion
Fairley et al, 2005; 2007; Ishiura et al, 2008; Dresow et al, 2009; Messingham et al; 2009].
Aufgrund dieser serologischen Daten ist es zu vermuten, dass sich unter den IgG negativen
NC16a-spezifischen CD138+ Plasmablasten somit auch IgA- und IgE-sekretierende Zellen
befinden.
Obwohl unter den CD138+ Zellen von BP-Patienten im Vergleich zu Kontrollpersonen
vermehrt IgG+ Plasmablasten gebildet werden, gibt es nur einen relativ geringen Prozentsatz
der IgG+CD138+ Zellen, die eine Spezifität für das Hauptantigen NC16a aufweisen. Das wirft
die Frage auf, gegen welche Epitope der restliche Anteil gerichtet ist und ob es sich hier
ebenfalls um autoantigenspezifische Plasmablasten handelt. Da die NC16a-Domäne des
BP180 nicht die einzige antigene Region ist, gegen die die Autoantikörper im Bullösen
Pemphigoid gerichtet sind [Perriard et al., 1999], könnte es durchaus sein, dass ein Teil der
in BP-Patienten gehäuft vorkommenden IgG+CD138+ Plasmablasten spezifisch für andere
Abschnitte innerhalb des Kollagen XVII ist. Ein weiteres Ziel der Autoantikörper ist das
BP230, welches ca. 90 % der BP-Patientenseren als Antigen erkennen, obwohl es sich
hierbei wohl nur um einen Begleiteffekt handelt. Antikörper gegen dieses Protein sind nicht in
der Lage, die Erkrankung zu initiieren. Sie werden wahrscheinlich erst nach Ausbruch der
Krankheit gebildet, wenn bereits eine Schädigung der Basalmembranzone eingetreten ist
[Gaucherand et al, 1995]. Da die Krankheit über einen längeren Zeitraum persistiert,
überträgt sich die Autoimmunantwort möglicherweise zusätzlich auf andere „sekundäre“
Regionen der BP180- und BP230-Moleküle, von denen man glaubte, dass diese Regionen
aufgrund ihrer intrazellulären Lokalisation nicht an der Initiierung der inflammatorischen
Antwort beteiligt sind. Dieses Phänomen der „Epitopen-Verteilung“ würde also erklären,
warum nur ein kleiner Anteil der CD138+IgG+ Plasmablasten, die vermehrt in Patienten mit
Bullösem Pemphigoid detektiert werden konnten, spezifisch für die NC16a-Domäne sind.
Eine alternative Erklärung wäre, dass sich unter der detektierten, IgG-sezernierenden
CD138+ Zellpopulation Zellen befinden, die nicht den neu generierten Plasmablasten
zugeordnet werden können, sondern tatsächlich vielmehr den residenten Plasmazellen aus
dem Knochenmark angehören, welche im Zuge einer Immunantwort mobilisiert und von den
neu generierten Plasmablasten aus den streng limitierten Überlebensnischen des
Knochenmarks verdrängt wurden. Wenn diese mobilisierten, polyklonalen Plasmazellen
nicht mehr in der Lage dazu sind, ins Knochenmark zurückzukehren, sterben sie ab und
ermöglichen so dem humoralen Gedächtnis, sich in Abhängigkeit der antigenen bzw.
pathogenen Umwelt des Immunsystems neu anzupassen [Odendahl et al, 2005; Manz und
104
Diskussion
Radbruch, 2002]. Hier findet demnach ein Wettbewerb zwischen den alten Plasmazellen und
den neu gebildeten Zellen statt. Diese Hypothese wird durch Arbeiten unterstützt, die sich
mit der Tetanus-Toxoid-Vakzinierung auseinandergesetzt haben. Eine Woche nach
Immunisierung
konnten
im
peripheren
Blut
sowohl
Tetanus-Toxoid-spezifische
Plasmablasten als auch Plasmazellen mit unbekannter Spezifität nachgewiesen werden.
Scheinbar verdrängen hier die Tetanus-Toxoid-spezifischen Plasmablasten einige der alten,
langlebigen Plasmazellen aus den Überlebensnischen im Knochenmark, um sie dann selber
zu besetzen. Somit ist gesichert, dass ein Teil der Plasmazellen aus einer aktuellen
Immunreaktion überleben können und im Sinne eines humoralen Gedächtnisses
kontinuierlich Antikörper über einen langen Zeitraum hinweg sezernieren [Odendahl et al,
2005; Hiepe und Dörner, 2005]. Es bleibt daher zu klären, ob die in dieser Studie
beobachteten
polyklonalen
IgG-sezernierenden
Zellen
tatsächlich
neu
generierte,
migratorische Plasmablasten sind oder eher mobilisierte Plasmazellen, die wahrscheinlich
das humorale Gedächtnis des Knochenmarks repräsentieren. Diese Zellen besitzen ein nur
geringes migratorisches Potenzial und haben daher kaum noch die Möglichkeit, in die
Überlebensnischen des Knochenmarks zurückzukehren. Anhand verschiedener Marker wie
beispielsweise den Chemokinen CXCR3 und CXCR4 oder dem in dieser Arbeit untersuchten
Oberflächenmolekül HLA-DR ist es möglich, die detektierten IgG+CD138+ Zellen einem
Differenzierungsstadium zuzuordnen.
5.3.3 Identifizierung autoantigenspezifischer HLA-DR++ Plasmablasten
Erst kürzlich veröffentlichte Studien identifizierten auf der Oberfläche von Plasmazellen einen
weiteren Marker, der mit einer humoralen Immunantwort unmittelbar in Verbindung gebracht
wurde. Die Überexpression von HLA-DR in CD27++CD19dim Ig-sezernierenden Plasmazellen
wurde hier als ein eindeutiger Indikator für die Krankheitsaktivität bei Patienten mit
systemischem Lupus (SLE) beschrieben [Jacobi et al, 2009].
Im Rahmen der
Phänotypisierungsanalysen sollten daher die angereicherten IgG+CD138+ Zellen von
Patienten mit Bullösem Pemphigoid ebenfalls auf das HLA-DR-Expressionsmuster hin
charakterisiert werden. Dabei lag das Augenmerk besonders auf der bereits identifizierten
CD27++CD38++CD19dim IgG-sezernierenden Zellpopulation. Es ist bekannt, dass HLA-DR auf
frühen Antikörper-sezernierenden Zellen (Plasmablasten) stark exprimiert wird, auf reifen
Plasmazellen, die vom Knochenmark oder der Milz abstammen, jedoch kaum bzw. gar nicht
mehr vorhanden ist. Die Expression dieses Markers korreliert sehr gut mit der
105
Diskussion
Expansionsphase der Antikörper-sezernierenden Population und kann daher als ein
stellvertretender Marker zur Unterscheidung von proliferierenden Plasmablasten und
nichtzyklischen Plasmazellen verwendet werden [Manz et al, 1998].
Tatsächlich deutet die in dieser Arbeit durchgeführte Studie darauf hin, dass bei BPPatienten unter der CD27++CD38++CD19dim IgG-sezernierende Population verstärkt HLADR++ Plasmablasten generiert werden. Wenn man das Expressionsverhalten von HLA-DR
bei BP-Patienten und gesunden Spendern betrachtet, so fällt auf, dass die CD138+Zellpopulation
bei
Normalpersonen
eine
eher
heterogene
Expression
des
Oberflächenmoleküls aufweist (CD138+HLA-DRlow und CD138+HLA-DRhigh), wohingegen bei
Patienten verstärkt eine CD138+HLA-DRhigh-Zellpopulation beobachtet werden konnte. Der
prozentuale Anteil der CD138+HLA-DRhigh Zellen in gesunden Spendern lag bei knapp 50 %
(41.5 % - 68.16 %), bei den Patienten hingegen erhöhte sich die HLA-DR-Expression um
fast ein Drittel auf 72 % (59.25 % - 82.98 %). In zahlreichen Studien konnte gezeigt werden,
dass im Verlauf einer T-Zell-abhängigen sekundären Immunantwort HLA-DRhigh Zellen in der
Zirkulation detektiert und als neu generierte, migratorische Plasmablasten identifiziert
wurden [Manz et al, 1998; Odendahl et al, 2003, 2005; Arce et al, 2004; Hoyer et al, 2004;
Cepok et al, 2005; Moser et al, 2006; González-Garcia et al, 2008; Jacobi et al, 2009]. In der
erst kürzlich veröffentlichten Studie von Jacobi et al konnten unter den zirkulierenden
CD27++CD20-CD19dim Zellen identifiziert werden, welche verstärkt bei Patienten mit aktivem
SLE vorkommen [Jacobi et al, 2003, 2009; Odenthal et al, 2000], neu generierte HLA-DR++
Plasmablasten. Übereinstimmend mit den eigenen Daten waren diese gegenüber den HLADRlow Plasmazellen im peripheren Blut mit durchschnittlich 86 % (59 % - 97 %)
vorherrschend und ihre absolute Anzahl und Häufigkeit korrelierte mit der Krankheitsaktivität
eindeutig stärker, als die gesamte CD27++CD20-CD19dim Untereinheit. Letztere stellte eine
gemischte Zellpopulation dar, welche HLA-DRlow Plasmazellen enthielt und in keiner
Korrelation mit der Krankheitsaktivität stand. Diese Daten unterstützen die These, dass HLADRhigh Plasmablasten das unmittelbare Produkt einer Immunaktivierung im Lupus sind und
diese Untereinheit daher mit der Krankheitsaktivität einhergeht. Des Weiteren konnten in
dieser Studie die für die SLE-Erkrankung typischen anti-dsDNA IgG-produzierenden Zellen
sowohl in der HLA-DRhigh als auch in der HLA-DRlow Subpopulation identifiziert werden,
wobei aber vor allem die aus dem peripheren Blut abstammenden HLA-DRhigh Plasmablasten
die anti-dsDNA Antikörper verstärkt produzierten. Diese Tatsache verdeutlichte noch einmal
mehr die pathogene Rolle der Plasmablasten in dieser Erkrankung [Jacobi et al, 2009].
Entsprechend dieser Daten konnten in der vorliegenden Arbeit anti-NC16a IgG-
106
Diskussion
produzierende Zellen in beiden Subpopulationen identifiziert werden, wobei auch hier
überwiegend in den HLA-DR++ Plasmablasten. Aufgrund dessen scheinen die HLA-DR++
Plasmablasten für das Bullöse Pemphigoid von pathogener Bedeutung zu sein. Um zu
testen, ob die HLA-DR++ Plasmablasten möglicherweise direkt mit dem IgG anti-NC16a
Antikörpertiter in Verbindung stehen, wurde die Frequenz der IgG+NC16a+ Zellen sowohl
unter den HLA-DR++ Plasmablasten als auch unter den HLA-DRlow Plasmazellen analysiert.
Die Frequenz der IgG+NC16a+ Zellen war unter den HLA-DR++ Plasmablasten wesentlich
höher verglichen mit den HLA-DRlow Plasmazellen. Sollten die HLA-DR++ Plasmablasten
tatsächlich eine entscheidende Rolle in der Pathogenese des Bullösen Pemphigoids spielen,
so könnte die Expansion dieser Zellen in Zusammenhang mit der Krankheitsaktivität einen
wichtigen Marker darstellen. Um zu überprüfen, ob tatsächlich ein Zusammenhang zwischen
der Frequenz der HLA-DRhigh Plasmablasten und der Krankheitsaktivität besteht, wurde eine
Korrelationsanalyse durchgeführt. Als Maß des Aktivitätsgrades wurden Ausprägung und
Verteilung frischer Blasen, Erosionen, Krusten, Rötungen und juckender Ausschlag auf der
Haut in die Bewertung (nicht aktiv, aktiv, sehr aktiv) miteinbezogen. Tatsächlich konnte eine
signifikante Korrelation zwischen der Häufigkeit der HLA-DR++ Zellpopulation und der
Krankheitsaktivität nachgewiesen werden. Diese Daten decken sich mit der SLE-Studie, die
von Jacobi und ihren Kollegen kürzlich durchgeführt wurde [Jacobi et al, 2009].
Dass eine Überexpression des HLA-DR-Gens nicht immer nur mit einer
Autoimmunerkrankung einhergeht, sondern als ein allgemeines Kriterium für eine aktive
humorale Immunantwort gelten kann, konnte bereits 2005 in einer Studie von Odendahl et al
belegt werden. Odendahl und seine Mitarbeiter charakterisierten die phänotypische
Heterogenität peripherer Antikörper-sezernierender Zellen und bestimmten den Phänotyp
von Tetanus-Toxin spezifischen Plasmazellen mittels zytometrischer Immunfluoreszenz. Im
Gegensatz zur NC16a-Domäne handelt es sich bei dem Tetanus-Toxin nicht um ein
autoreaktives Antigen, welches kontinuierlich präsent ist, sondern vielmehr um ein Pathogen,
das nur für kurze Zeit im peripheren Blut zirkuliert und nach der intentionalen Immunantwort
nicht mehr vorhanden ist. Die Antikörper-sezernierenden Zellen wurden aufgrund ihrer
starken Expression sowohl von intrazellulärem Immunglobulin G als auch von CD138, CD38,
CD27 und ebenso bezüglich ihrer schwachen Expression von CD19 als migratorische
Plasmablasten identifiziert. Während in einer Autoimmunerkrankung wie dem Bullösem
Pemphigoid oder dem systemischen Lupus HLA-DR++ Plasmablasten aufgrund des
persistierenden Antigens kontinuierlich neu generiert werden, konnten lediglich in einem
Zeitraum von etwa 6 bis 8 Tagen nach der sekundären Immunisierung gegen Tetanus im
107
Diskussion
peripheren Blut von gesunden Individuen migratorische HLA-DR++ Tetanus-spezifische
Plasmablasten unter der CD138+CD27++CD38++CD19dim Population nachgewiesen werden
[Odendahl et al, 2005]. Wie bereits schon zuvor von Manz et al beschrieben, kennzeichnet
eine hohe Expression von HLA-DR bei Tetanus-spezifischen CD27++CD19dim PBMC
Plasmablasten, die in einer intentionalen Immunantwort neu generiert wurden [Manz et al,
1998]. Ebenso war es in dieser Arbeit möglich, in Patienten mit Bullösem Pemphigoid unter
der
als
CD138+CD27++CD38++CD19dimHLA-DR++
definierten
Zellpopulation
NC16a-
spezifische Plasmablasten zu identifizieren (vgl. Abb. 4.26 F). Wie schon bei den IgG
negativen CD138+ Zellen beobachtet werden konnte, ließ sich neben den NC16aspezifischen HLA-DR++ Plasmablasten noch eine zweite Population im peripheren Blut der
BP-Patienten detektieren, die ebenfalls für einige wenige NC16a-spezifischen Zellen
spezifisch war. Diese Autoantikörper-sezernierenden Zellen sind HLA-DRlow, lassen sich
aufgrund ihres Phänotyps als reife Plasmazellen identifizieren [Arce et al, 2004; Manz et al,
1998] und tragen möglicherweise zur Aufrechterhaltung des Autoantikörper-Repertoires im
Bullösen Pemphigoid bei. Im Vergleich dazu konnte die Arbeitsgruppe von Odendahl zwar
auch im peripheren Blut eine zweite Antikörper-sezernierende Zellpopulation identifizieren,
welche entsprechend geringe Mengen an HLA-DR exprimierte, allerdings war diese HLADRlow Subpopulation nicht spezifisch für das Tetanus-Antigen [Odendahl et al, 2005].
Möglicherweise reflektiert die nicht Antigen(Tetanus)-spezifische HLA-DRlow Untereinheit das
Repertoire an Plasmazellen im Knochenmark, die eine Spezifität für Antigene aufweisen, die
beispielsweise charakteristisch für Diphtherie oder Masern sind [Bernasconi et al, 2002;
Odendahl et al, 2005].
Die Mobilisierung von Plasmazellen als Antwort auf ein geimpftes Antigen deutet –
wie bereits schon zuvor diskutiert wurde – auf die bemerkenswerte Fähigkeit des humorales
Gedächtnisses hin, nämlich sich in Abhängigkeit der antigenen/pathogenen Umwelt des
Immunsystems neu anzupassen [Manz & Radbruch, 2002]. Die wenigen NC16aspezifischen HLA-DRlow Zellen, die im peripheren Blut von BP-Patienten detektiert wurden,
könnten auch eine schon weiter differenzierte Population darstellen, die bereits die HLA-DR
Expression herunterreguliert hat und auf dem Weg zum Knochenmark bzw. anderen
Geweben
ist,
um
dort
letztendlich
zur
enddifferenzierten
Plasmazell-Population
heranzureifen. Anhand weiterer Expressionsmarker wie beispielsweise den Chemokinen
CXCR3, CXCR4 und CCR9 könnte man das Differenzierungsstadium der im Blut
zirkulierenden Zellen zusätzlich analysieren. Eine geringe Expression der ChemokinRezeptoren CXCR3 und CXCR4 würde die Antigen-spezifischen Zellen als neu generierte
108
Diskussion
Plasmablasten
identifizieren,
Oberflächenmarker
wohingegen
charakteristisch
für
eine
bereits
stärkere
sich
Expression
dieser
differenzierende,
beiden
migratorische
Plasmablasten in residente Plasmazellen ist [Hauser et al, 2002; Muehlinghaus et al, 2005].
Das Verfahren zur Anreicherung von Plasmablasten (oder Plasmazellen) ermöglicht
eine wesentlich effektivere Detektion antigenspezifischer Zellen. Das konnten auch Horst et
al in einer Studie über PLA-spezifische CD138+ Zellen während einer Hyposensibilisierung
zeigen. PLA ist ein Allergen, welches eine Bienengift(PLA2)- bzw. Wespengift(PLA1b)Allergie hervorrufen kann. Ein limitierender Faktor bei der Analyse PLA-spezifischer
Plasmablasten war vergleichbar mit den NC16a-spezifischen Zellen die geringe Zellzahl, die
sich aus dem Blut der Probanden isolieren ließ. Dennoch konnten, nach Anreicherung der
CD138+ Zellen, Allergen-spezifische Plasmablasten detektiert werden. Während vor der
Therapie und in den ersten Tagen nach Therapiebeginn keinerlei PLA-spezifische CD138+
Zellen im Blut nachweisbar waren, nahm die Zahl der spezifischen Plasmablasten nach 7
Tagen dramatisch zu (22.96 % PLA2-spezifische CD138+ Zellen), um dann wieder relativ
schnell abzusinken [Horst et al, 2002]. Wie zu erwarten und übereinstimmend mit den Daten
von Odendahl et al, die eine Studie über die Frequenz Tetanus-Toxin-spezifischer
Plasmablasten durchführten, stieg die Häufigkeit der Antigen- bzw. Allergen-spezifischen
Zellen an Tag 7 nach Impfung um ein Vielfaches an. Der Verlauf antigenspezifischer
Plasmablasten im Blut korreliert mit weiteren Veröffentlichungen andere Arbeitsgruppen
[Sedgwick und Holtl, 1983; Kodo et al, 1984]. Vergleicht man die Ergebnisse von Horst mit
den eigenen erworbenen Daten, so fällt auf, dass die Frequenz der an Tag 7 nach der
Impfung detektierten PLA2-spezifischen Plasmablasten um das 20-fache höher ist, als die
Frequenz
der
im
Blut
von
BP-Patienten
nachgewiesenen
NC16a-spezifischen
Plasmablasten, die durchschnittlich bei 1.26 % NC16a-spezifischer Plasmablasten lag.
Dieser enorme Unterschied könnte dadurch erklärt werden, dass durch eine Impfung die
induzierte Bildung antigenspezifischer Zellen vermutlich wesentlich höher ist, als die Bildung
autoantigenspezifischer
Plasmablasten
in
einer
Autoimmunerkrankung.
Das
kann
möglicherweise wiederum daran liegen, dass die geimpfte Antigen-Menge um einiges höher
ist, als die Autoantigen-Menge des kontinuierlich präsenten NC16a-Proteins.
Odendahl et al konnten ebenfalls an Tag 7 nach der Impfung Antigen(Tetanus-Toxin)spezifische Plasmablasten im peripheren Blut von Spendern nachweisen. Die Häufigkeit der
rTT.C-bindenden CD19+CD27high Zellen lag hier bei 0.014 % [Odendahl et al, 2005].
Vergleicht man die Frequenz dieser Zellen mit der Häufigkeit der antigenspezifischen
109
Diskussion
Plasmazellen, die sowohl in der Arbeit von Horst als auch während der eigenen Studien
beobachtet werden konnte, so scheint die Frequenz der Zellen extrem gering zu sein. Ein
Grund für diesen gravierenden Unterschied könnte darin liegen, dass die Arbeitsgruppen
zwar das gleiche Detektionsverfahren verwendeten, die antigenspezifischen Zellen jedoch
unterschiedlich dargestellt wurden. Während Odendahl et al die Frequenz der rTT.Cspezifischen Zellen unter CD19+CD27high PBMC bestimmten, wurde in der Studie von Horst
et al und in der vorliegenden Arbeit die bereits beschriebene Anreicherungsmethode mittels
paramagnetischer Mikropartikel verwendet. Odendahl et al färbten mononukleare Zellen des
peripheren Blutes direkt mit CD19- und CD27-Antikörpern, um daraus die neu generierten
Plasmablasten zu detektieren. Im Gegensatz dazu wurden in den anderen beiden Arbeiten
aus den PBMC zunächst CD138+ Zellen angereichert und diese dann mit den
entsprechenden Oberflächen- bzw. intrazellulären Markern gefärbt [Horst et al, 2002; eigene
Dissertation].
Zusammenfassend lässt sich anhand der hier gewonnenen Daten vermuten, dass in
Autoimmunerkrankungen wie dem Bullösen Pemphigoid neu generierte Plasmablasten
entscheidend zur Aufrechterhaltung des humoralen Gedächtnisses beitragen. Diese
Untersuchungen stützen die Annahme, dass beim BP durch das persistierende Autoantigen
kontinuierlich antigenspezifische B-Zellen aktiviert und daraus resultierend stetig neue
kurzlebige Plasmablasten gebildet werden. Die aus dieser Autoimmunreaktion resultierenden
Antikörper
überlagern
möglicherweise
jene
autoreaktive
Antikörper,
die
von
knochenmarksresidenten Plasmazellen abstammen. Plasmablasten könnten somit in
Autoimmunerkrankungen als Haupt-Effektorzellen für die Produktion neuer Autoantikörper
verantwortlich gemacht werden. Auch wenn Plasmablasten nur kurzlebige Immunantworten
liefern und dann entweder sterben oder aber erfolgreich um eine Überlebensnische im
Knochenmark bzw. im entzündeten Gewebe konkurrieren, um eine langlebige reaktive
humorale Immunität zu sichern, zirkulieren weiterhin autoantigenspezifische Gedächtnis-BZellen im Blut, um im Falle exzessiver Antigen-Mengen reaktive humorale Immunität zu
liefern. Daher wäre es sinnvoll, Therapieansätze zunächst auf die Gedächtnis-B-Zellen und
Plasmablasten zu konzentrieren. Erste Erfolge konnten bereits mit dem monoklonalen
Antikörper CD20 (Rituximab) erzielt werden. Rituximab bindet CD20-exprimierende BLymphozyten, einschließlich autoantigenspezifischer Gedächtnis-B-Zellen und reife B-Zellen
(kurzlebige Plasmablasten) [Arin et al, 2005; Schmidt et al, 2006]. Langlebige Plasmazellen
hingegen sind resistent auf Immunsuppressiva und können auch nicht durch B-Zelldepletierende Therapien eliminiert werden, da sie auf der Zelloberfläche kein CD20
110
Diskussion
exprimieren. Diese Zellen können unabhängig von der weiteren Existenz eines AntigenStimulus kontinuierlich (Auto)antikörper sezernieren. Allerdings kann die Generierung neuer
Plasmazellen unterbunden werden, da die B-Zell-Vorläufer durch eine monoklonale
Antikörpertherapie eliminiert werden. Eine Reduktion von (Auto)antikörpertitern nach B-ZellDepletion ist demnach auf das Absterben kurzlebiger Plasmablasten zurückzuführen [Hiepe
und Dörner, 2005].
Was gegen die Möglichkeit spricht, dass beim Bullösen Pemphigoid ausschließlich
neu generierte Plasmablasten für die autoreaktive Immunreaktion verantwortlich sind, ist die
Tatsache, dass stets ein definierter Teil der antigenspezifischen Plasmablasten, sofern sie
nicht extrafollikulär sondern aus einer Keimzentrumsreaktion heraus gebildet wurden, zu
langlebigen
Plasmazellen
differenziert
und
über
Monate
hinweg
in
limitierten
Überlebensnischen des Knochenmarks Antikörper sezernieren kann [Manz et al, 2005]. Die
langlebigen Plasmazellen sezernieren die autoreaktiven Antikörper kontinuierlich weiter,
ohne dass eine erneute Antigenstimulation erforderlich ist. Diese Tatsache ist vereinbar mit
der Beobachtung, dass in der vorliegenden Arbeit vereinzelt CD138+ Zellen identifiziert
werden konnten, die phänotypisch den langlebigen Plasmazellen aus dem Knochenmark
ähnelten (CD138+HLA-DRlow) und zudem Spezifität für das Autoantigen NC16a aufwiesen.
Es ist daher zu vermuten, dass es sich bei diesen Zellen um residente Plasmazellen aus
dem Knochenmark handelte, die im Zuge einer Immunantwort mobilisiert wurden. Im
Gegensatz zu den protektiven Immunreaktionen, die nur dann auftreten, wenn ein Pathogen
vorliegt
(wie
z.B.
durch
Autoimmunerkrankungen
eine
Impfung),
kontinuierlich
finden
autoreaktive
im
Körper
von
Immunreaktionen
Patienten
statt.
mit
Eine
permanente Neugenerierung von Autoantikörper-sezernierenden Plasmablasten führt
demnach zu einer stetigen Neuanpassung des humoralen Gedächtnisses [Odendahl et al,
2005; Manz und Radbruch, 2002]. Vorstellbar ist hier, dass bereits in einer früheren
autoreaktiven Immunreaktion NC16a-spezifische Plasmazellen, die von Follikel-B-Zellen
abstammen, in das Knochenmark gewandert sind und nun durch eine erneute
Immunreaktion von neu generierten Plasmablasten aus den limitierten Überlebensnischen
verdrängt wurden. Diese Beobachtungen sind übereinstimmend mit der These, dass
langlebige Plasmazellen eine entscheidende Rolle in der Autoimmunität spielen und sich das
humorale Gedächtnis seinem Umfeld permanent anpasst [Arce et al, 2002; Höfer et al,
2006]. Die Präsenz knochenmarksresidenter, autoantigenspezifischer Plasmazellen dürfte
eine Erklärung für die Beobachtung sein, dass Autoantikörper nicht immer vollständig nach
111
Diskussion
einer B-Zell-depletierenden Therapie verschwinden. Diese Daten decken sich mit
Untersuchungen
bei
Cyclophosphamid-refraktären
SLE-Patienten,
die
nach
dieser
immunsuppressiven Behandlung noch immer stabile Antikörper-Titer aufwiesen [Hoyer et al,
2005]. Interessanterweise bleiben nach erfolgreicher Immunsuppression die protektiven
Antikörpertiter, z.B. gegen Tetanus-Toxoid, ebenfalls in der Regel unverändert erhalten
[Cambridge et al, 2003].
Vergleicht man demnach die autoreaktive Immunreaktion mit der protektiven, so
scheint
aufgrund
des
persistierenden
Antigens
in
Autoimmunerkrankungen
die
Aufrechterhaltung des humoralen Gedächtnisses im Gegensatz zur protektiven Immunität
durch permanente Neugenerierung von Plasmablasten und den dadurch gebildeten
autoantigenspezifischen Antikörpern bedingt zu sein. Prinzipiell ist dieser Zustand jedoch
gleichzusetzen mit der protektiven Immunreaktion nach einer Impfung, die etwa 6-8 Tage
nach der Immunisierung beobachtet werden kann. So konnten beispielsweise an Tag 7 nach
der Impfung Antigen(Tetanus-Toxin)- bzw. Allergen(PLA2)-spezifische Plasmablasten im
peripheren Blut von Spendern nachgewiesen werden [Odendahl et al, 2005; Horst et al,
2002]. Die kurzlebigen Plasmazellen verschwinden für gewöhnlich nach relativ kurzer Zeit
wieder, der protektive Antikörpertiter hingegen bleibt über Monate bis Jahre hinweg
bestehen. Hier wird die Aufrechterhaltung des humoralen Gedächtnisses durch die Bildung
langlebiger Plasmazellen, den Haupt-Effektorzellen der protektiven Immunität, und deren
Antikörper antigenunabhängig reguliert. Dieser Prozess läuft automatisch ab, bei
Autoimmunerkrankungen hingegen muss er induziert werden, d.h., die kurzlebigen
Plasmablasten werden erst nach einer immunsuppressiven Therapie eliminiert, wodurch die
Erkrankung in eine klinische Remission überführt werden kann. Dennoch bestehende
autoantigenspezifische Antikörpertiter können wie bereits erwähnt durch die Existenz
langlebiger Plasmazellen erklärt werden, die demnach bei der Entwicklung des humoralen
Gedächtnisses in Autoimmunerkrankungen eine ebenso wichtige Rolle spielen können,
vergleichbar mit der protektiven Immunität. Somit tragen nicht nur kurzlebige Plasmablasten,
sondern
auch
autoreaktive,
langlebige
Plasmazellen
Autoimmunprozesses bei (vgl. Abb. 5.1).
112
zur
Aufrechterhaltung
eines
Diskussion
Apoptose
Autoantikörpersynthese
Autoantigen
kurzlebiger Plasmablast
Gedächtnis B-Zelle
Überlebensnische
Autoantikörpersynthese
B-Zelle
langlebige Plasmazelle
Abb. 5.1: Mögliche Angriffspunkte (
) bei Autoimmunerkrankungen wie dem Bullösen Pemphigoid.
Als Haupt-Effektorzellen in Autoimmunerkrankungen könnten die kurzlebigen Plasmablasten von großer
Bedeutung sein. Diese synthetisieren im Zuge einer Immunantwort einen entscheidenden Anteil an autoreaktiven
Antikörpern, die zur Aufrechterhaltung des humoralen Gedächtnisses beitragen. Neue Therapieansätze (z.B.
Antikörper wie CD20), die sich auf die autoantigenspezifischen B-Zellen und Plasmablasten konzentrieren,
könnten eine kontinuierliche Synthese der Autoantikörper unterbinden und somit die Erkrankung dauerhaft in eine
klinische Remission überführen.
Wenn man demnach in Betracht zieht, dass die pathogenen Autoantikörper nicht
ausschließlich von kurzlebigen Plasmablasten sezerniert werden und somit auch die
Autoantikörper, die die langlebigen Plasmazellen produzieren, pathogenetisch relevant sind,
stellen
gerade
jene
Strategien,
die
diese
Zellen
angreifen,
einen
interessanten
therapeutischen Ansatz dar. Die Plasmazell-Homöostase wird durch das Zusammenspiel
von Faktoren reguliert, die die Migration und das Überleben dieser Zellen steuern. Die
Ausprägung bestimmter Chemokinrezeptoren ist an der Regulation der PlasmazellLokalisation beteiligt. Um langfristig überleben zu können, müssen diese Zellen, bzw. ihre
Vorläufer, die sekundären lymphatischen Gewebe verlassen und in das Knochenmark oder
chronisch entzündete Gewebe einwandern. Entsprechende Angriffspunkte könnten hier die
Überlebensfaktoren wie beispielsweise BAFF (BLyS), ein Zytokin aus der TNF-Superfamilie,
113
Diskussion
darstellen, um so zu verhindern, dass Plasmablasten im Knochenmark zu langlebigen
Plasmazellen differenzieren [Manz et al, 1997, 1998]. Erhöhte BAFF-Serumtiter werden mit
zahlreichen, humanen Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht. Dazu zählen die
systemisch-rheumatischen (u.a. SLE) und organ-spezifischen (u.a. BP) Erkrankungen
[Mackay et al, 2005; Asashima et al, 2006; Matsushita et al, 2007]. BAFF-spezifische
Therapien beeinflussen gezielt frühe B-Zellen in der Peripherie, ohne jedoch einen Einfluss
auf Gedächtnis-B-Zellen oder Plasmazellen auszuüben. Erste Erfolge konnten mit dem
humanen, monoklonalen IgG 1 -Antikörper (Belimumab) in einer klinischen Studie (Phase 1)
bei Patienten mit aktivem SLE erzielt werden. Belimumab bindet lösliches BAFF und inhibiert
damit die Bindung an die BAFF-Rezeptoren TACI, BCMA und BR3. Die Spezifität und die
Affinität von Belimumab deuten darauf hin, dass diese Antikörpertherapie möglicherweise
das Überleben von B-Zellen verringert, wie bereits in vorklinischen Studien gezeigt werden
konnte [Levine et al, 2000]. Tatsächlich resultierte die Behandlung mit Belimumab bei SLEPatienten in einer prozentual signifikant höheren Reduktion der CD20+ B-Zellen im Vergleich
zu Patienten, die mit einem Placebo behandelt wurden. Ebenso konnten bei SLE-Patienten
nach dieser Antikörperbehandlung verringerte Serum-Immunglobuline beobachtet werden
[Furie et al, 2008]. Diese Daten unterstützen die Durchführung weiterer Studien mit
Belimumab in Autoimmunerkrankungen wie z.B. dem BP.
Zusammenfassend deuten die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Daten darauf
hin, dass das bullöse Pemphigoid von einer breiten, teilweise autoantigenunabhängigen
Aktivierung des Plasmazellsystems begleitet wird. Die nachgewiesenen Antigen(NC16a)spezifischen,
autoreaktiven
Plasmazellen
gehören
der
kurzlebigen
Plasmablasten-
Population an, womit der häufig gut therapierbare, selbst limitierende Krankheitsverlauf
erläutert werden könnte.
114
Zusammenfassung
Kapitel 6
Zusammenfassung
Das bullöse Pemphigoid (BP) ist eine seltene Autoimmunerkrankung der Haut, welche durch
subepidermale Blasenbildung gekennzeichnet ist. Wesentlich für die Pathogenese dieser
Erkrankung ist das Auftreten zirkulierender Autoantikörper (IgG), die gegen das
Oberflächenprotein BP180 (ebenfalls bekannt als Kollagen Typ XVII) basaler Keratinozyten
gerichtet sind. Die nicht kollagene NC16a-Domäne ist der immundominante Anteil des
BP180-Proteins und wird in über 90 % der BP-Patienten von autoreaktiven Antikörpern
erkannt. Die Hauptquelle dieser autoantigenspezifischen Antikörper sind die Plasmazellen.
Bislang scheiterte die Untersuchung der für die Synthese der pathogenen Antikörper
verantwortlichen, autoantigenspezifischen Plasmazellen an der Seltenheit dieser Zellen und
am Mangel geeigneter Methoden zur Identifizierung der Antigenspezifität.
In der vorliegenden Studie wurden bei Patienten mit bullösem Pemphigoid die
Frequenz und der Phänotyp dieser Plasmazellen spezifisch für die NC16a-Domäne des
BP180 untersucht. Diese Domäne wurde mit einem Hexa-Histidin-Motiv versehen,
rekombinant exprimiert und anschließend mit dem Fluorchrom Alexa Fluor 647 markiert. Die
Anreicherung der Plasmazellen aus dem peripheren Blut von Patienten und gesunden
Individuen erfolgte mittels CD138 Mikropartikeln. Die angereicherten CD138+ Plasmazellen
wurden mit Antikörpern gegen verschiedene Oberflächenmarker, sowie intrazellulär gegen
Immunglobulin G (icIgG) und intrazellulär mit dem rekombinanten Autoantigen NC16a für die
Detektion autoantigenspezifischer Antikörper gefärbt. In Kontrollpersonen wurde eine
intrazelluläre IgG-Expression lediglich in 24 % (+/- 7.9 %; p < 0.0001) der CD138+ Zellen
gefunden, während etwa 50 % (+/- 8.8 %) der CD138 positiven Zellen von BP-Patienten
intrazellulär IgG exprimierten. Durchschnittlich 72 % (+/- 7.0 %) der IgG-sezernierenden
CD138+ Zellen der BP-Patienten zeigten eine deutlich erhöhte Expression für HLA-DR
(CD138+HLA-DRhigh), wohingegen in gesunden Individuen nur 50 % (+/- 9.3 %) der CD138+
Zellen diesen Oberflächenmarker exprimierten (p < 0.0001). Es ergab sich zudem eine
positive Korrelation zwischen der Frequenz der HLA-DR++ Zellen und der Krankheitsaktivität
bei Patienten mit aktivem BP. NC16a positive Plasmazellen konnten spezifisch nur bei BP-
115
Zusammenfassung
Patienten im Wesentlichen in der HLA-DRhigh Zellpopulation mit einer Häufigkeit von 0.99 %
(+/- 0.69 %) nachgewiesen werden.
Diese Untersuchungen zeigen, dass das bullöse Pemphigoid von einer breiten,
autoantigenunabhängigen
Aktivierung
des
Plasmazellsystems
begleitet
wird.
Die
antigenspezifischen autoreaktiven Plasmazellen beim BP gehören zur Population der
kurzlebigen Plasmablasten, was möglicherweise zur hohen Remissionsrate der Erkrankung
beiträgt.
116
Summary
Kapitel 7
Summary
Bullous pemphigoid (BP) is the most frequent autoimmune subepidermal blistering disease
of the skin. It is mainly characterized by the presence of circulating immunoglobulin G (IgG)
autoantibodies directed against a basal keratinocyte surface protein, the 180 kDa bullous
pemphigoid antigen (BP180), also known as collagen XVII. In over 90 % of BP patients the
major immunodominant site of BP180 is located within the noncollagenous NC16a domain.
The main sources of the autoantigen specific antibodies are plasma cells. To date, the study
of autoantigen specific plasma cells responsible for the synthesis of pathogenic antibodies
has been hampered by the rarity of these cells and the lack of appropriate methods to
identify their antigen specificity.
In this study, we investigated frequency and phenotype of plasma cells specific for the
NC16a domain of BP180 in patients with bullous pemphigoid. The NC16a domain was
recombinantly expressed as a Hexa-Histidin-fusion protein and then labelled with Alexa fluor
647. The enrichment of plasma cells from the peripheral blood of patients and healthy
individuals was performed using CD138 microbeads. CD138+ plasma cells were stained for
different surface molecules as well for intracellular immunoglobulin G (icIgG) and
intracellularly with the recombinant autoantigen NC16a to detect autoantigen specific IgG. In
control persons an icIgG expression was only found in 24 % (+/- 7.9 %; p < 0.0001), while
about 50 % (+/- 8.8 %) of the CD138 positive cells of BP patients expressed icIgG. On
average 72 % (+/- 7.0 %) of the CD138+ IgG-secreting cells of BP patients showed a high
expression for HLA-DR (CD138+HLA-DRhigh) whereas in healthy donors only 50 % (+/9.3 %) of these cells expressed this surface marker (p < 0.0001). In addition, a positive
correlation between the frequency of HLA-DR++ cells and disease activity in patients with
active BP was observed. NC16a specific plasma cells could be detected only in BP patients
mainly in the HLA-DRhigh population with a frequency of 0.99 % (+/- 0.67 %).
117
Summary
These studies indicate that bullous pemphigoid is accompanied by a broad autoantigen
independent activation of the plasma cell system. The antigen specific autoreactive plasma
cells belong to the short-lived plasma blasts subset which might contribute to the high
remission rate of the disease.
118
Literatur
Kapitel 8
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131
Abbildungsverzeichnis
Kapitel 9
Abbildungsverzeichnis
Einleitung
Abbildung 1.1:
Schematische Darstellung der B-Zell-Entwicklung
Abbildung 1.2:
Die Bildung der Plasmazellen
Abbildung 1.3:
Phänotypische Veränderung während der B-Zell-Entwicklung (nach
Mei et al, 2007)
Abbildung 1.4:
Schematische Darstellung von Kollagen XVII
Abbildung 1.5:
Modell der epidermalen Basalmembran im Bereich eines
Hemidesmosoms
Material
Abbildung 2.1:
Vektorkarte des Expressionsvektors pCEP4
Abbildung 2.2:
Vektorkarte des Klonierungsvektors pDrive von QIAGEN
Abbildung 2.3:
Vektorkarte des Expressionsvektors pRSET A von Invitrogen
Methoden
Abbildung 3.1:
Schematische Darstellung des Strahlenganges eines FACScanGerätes
Ergebnisse
Abbildung 4.1:
Intrazelluläre Kontrollfärbung von CD138+ Plasmazellen eines
Gesunden Spenders
Abbildung 4.2:
Schematische Darstellung des F-Konstrukts
Abbildung 4.3:
Ausschnitt der Nukleotidsequenz des pCEP4-Vektors mit
F-Konstrukt
Abbildung 4.4:
Sequenz der entworfenen Oligonukleotide zur Amplifikation der
NC16a-Domäne
Abbildung 4.5:
Amplifizierung der NC16a-Domäne
Abbildung 4.6:
Restriktionsanalyse der NC16a-Domäne des Kollagen XVII im
Klonierungsvektor pDrive
Abbildung 4.7:
Restriktionsanalyse der NC16a-Domäne des Kollagen XVII im
132
Abbildungsverzeichnis
Restriktionsvektor pRSET A
Abbildung 4.8:
Expressionsanalyse der rekombinanten NC16a-Domäne
Abbildung 4.9:
Expressionsanalyse der rekombinanten NC16a-Domäne
Abbildung 4.10:
Affinitätsaufreinigung der NC16a-Domäne aus Kulturüberständen
Abbildung 4.11:
Massenspektrum der NC16a-Domäne nach einer PMF-Analyse
Abbildung 4.12:
Immunologischer Nachweis des rekombinant hergestellten
His-NC16a-Proteins
Abbildung 4.13:
Konzentrationsbestimmung der rekombinant hergestellten NC16aDomäne
Abbildung 4.14:
Absorptionsspektrum von His-NC16a-Alexa Fluor 647
Abbildung 4.15:
Detektion NC16a-spezifischer IgG+ Gedächtnis-B-Zellen in BPPatienten
Abbildung 4.16:
Detektion NC16a-spezifischer IgM+ B-Zellen in BP-Patienten
Abbildung 4.17:
Magnetische Anreicherung CD138+ Zellen aus dem peripheren
Blut
Abbildung 4.18:
Intrazelluläre Kontrollfärbung von CD138+ Zellen
Abbildung 4.19:
Phänotypisierung CD138 positiver Zellen aus dem peripheren
Blut
Abbildung 4.20:
Detektion IgG+CD138+ Zellen bei BP-Patienten und gesunden
Spendern
Abbildung 4.21:
Detektion CD138+ HLA-DRhigh Zellen bei BP-Patienten und
gesunden Spendern
Abbildung 4.22:
Expressionsmuster von IgG und HLA-DR unter CD138+ Zellen bei
Donoren und BP-Patienten
Abbildung 4.23:
Detektion IgG+ Zellen unter den HLA-DRlow/high Subpopulationen bei
Patienten und Spendern
Abbildung 4.24:
T-Test der IgG- und HLA-DR-Expression im Vergleich zwischen
Patienten und Kontrollen
Abbildung 4.25:
Korrelationsanalyse zwischen der Häufigkeit HLA-DR++ Zellen und der
Krankheitsaktivität
Abbildung 4.26:
Detektion und Identifizierung NC16a-spezifischer Plasmablasten bei
BP-Patienten
Diskussion
Abbildung 5.1:
Mögliche Angriffspunkte (
Bullösen Pemphigoid
133
) bei Autoimmunerkrankungen wie dem
Tabellenverzeichnis
Kapitel 10
Tabellenverzeichnis
Einleitung
Tabelle 1.1:
Charakterisierung von (Auto)antikörper-sezernierenden Zellen
(nach Hiepe und Dörner, 2005)
Material
Tabelle 2.1:
Auflistung der verwendeten Antikörper
Tabelle 2.2:
Auflistung der Patientendaten
Tabelle 2.3
Auflistung der Kontrollpersonendaten
Ergebnisse
Tabelle 4.1:
NC16a-spezifische IgG+ B-Zellen im Blut von Patienten mit bullösem
Pemphigoid
134
Kapitel 11
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Susanne László
Geburtsdatum
31.05.1982
Geburtsort
Halle/Saale
Familienstand
ledig
Staatangehörigkeit
deutsch
Schulausbildung
09/1988 – 06/1992
Grundschule „W.-Bykowski“ Halle/Saale
09/1992 – 12/1992
Südstadt-Gymnasium Halle/Saale
01/1993 – 06/2001
Leibniz-Gymnasium Dormagen
Abschluss: Abitur
Hochschulausbildung
03/2004
Vordiplom
Fächer: Botanik, Zoologie, Chemie, Physik
03/2006 – 02/2007
Diplomarbeit, Institut der Biochemie II, Köln
(Leitung: Prof. Dr. Mats Paulsson)
02/2007
Erlangung des akademischen Grades Diplom-Biologin
02/2007-09/2009
Promotionsstudium, Uniklinik Köln
Abteilung: Dermatologie und Venerologie
(Leitung: Prof. Dr. Dr. Thomas Krieg)
Veröffentlichungen und Poster
Veröffentlichung:
László, S., Neumann, S., Hertl, M., Hunzelmann, N. (2010)
Generation of Increased Numbers of HLA-DRhigh IgG+ Plasma Cells
In the Peripheral Blood of Patients with Bullous Pemphigoid:
NC16a-Specific Cells Belong to the Short-Lived Plasma Blast
Population. J Invest Dermatol
135
Poster
:
László, S., Neumann, S., Hunzelmann, N.:
Generation of increased numbers of IgG Plasma cells in Bullous
Pemphigoid: NC16a-specific cells belong to the short-lived
Plasma Blast population (39th Annual ESDR Meeting, September
2009, Budapest, Ungarn)
Köln, den 22. September 2010
Susanne László
136