RNA-Viren

Allgemeine Virologie – SS 2016
Genetik und Evolution von Viren
Mi 01.06.2016
PD Dr. Stefan Finke
Friedrich-Loeffler-Institut, Greifswald - Insel Riems
[email protected]
Allgemeine Virologie – SS 2016
01.06.2016 Genetik und Evolution von Viren
08.06.2016 Tumorviren, Transformation und Tumorbildung
15.06.2016 Immunantwort und Impfstoffe
22.06.2016 Viren als Werkzeuge
29.06.2016 Chemotherapie und Cytokine
06.07.2016 Führung FLI – Insel Riems
Ursprung von
Viren
aus: Evolution of complexity in the viral world: The dawn of a new vision. Koonin und Dolja, Virus Research 2006.
Ursprung von Viren - Theorien
Regressive Theorie: Degeneration von zuvor
unabhängigen Lebensformen; viele Funktionen verloren,
nur die für die parasitäre Lebensweise notwendigen
Funktionen erhalten. (“Reduction Hypothesis”)
Zellulärer Ursprung: Subzelluläre, funktionelle
Komplexe aus Makromolekülen, die die Fähigkeit erlangt
haben zu replizieren und von Zelle zu Zelle zu wandern.
(“Escape Hypothesis”).
Unabhängige Entitäten: Entwicklung parallel zu
zellulären Organismen, vom selbst replizierenden Molekül
aus, das vermutlich schon in der präbiotischen RNA-Welt
existierte. (“Virus First Hypothesis”)
vermutlich gemeinsamer Vorläufer vor der Aufteilung
in Eukaryonten, Prokaryonten und Archaea
(> 3 Milliarden Jahre)
Struktur der Kapside und Faltung der Strukturproteine eines
Virus aus thermophilen Archaebakterien entspricht der des
E. coli-Phagen PRD1
Algenvirus PBCV
menschlichen Adenovirus
Fig. 3. (A) Surface capsomer architecture of T = 31 STIV (Left), adenovirus (Center), and PRD1 (Right)‫‏‬
STIV: Sulfolobus turreted icosahedral virus
STIV
Adenovirus
PRD1
hexon x-ray crystal structures
PRD1 / STIV
icosahedral asymmetric
unit of capsid
PRD1 / STIV
trimer
PRD1
Adenovirus
Rice, George et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 7716-7720
Copyright ©2004 by the National Academy of Sciences
• Unterschiedliche Theorien zur Entstehung von Viren.
• Strukturhomologien deuten auf Vorläuferviren hin, die
bereits vor der Auftrennung in Bakterien, Archaebakterien
und Eukaryonten existierten.
• Alle Stufen der Entwicklung von einer RNA- zu einer
DNA-Welt spiegeln sich in viralen Genomorganisationen
wieder.
Virale Genetik
- Viren haben eine größere genetische Vielfalt als
andere Organismengruppen.
- genetische Vielfalt erzeugt durch natürliche
Selektion an den viralen Genomen
Virus-Evolution bestimmt durch:
Hohe Diversität‫‏‬
sehr hohe Vermehrungsrate
schnelle turn-over Raten
Rekombination, Komplementierung
RNA-Viren: fehlerhafte Replikation
Dynamische Interaktion mit dem Wirt (Selektionsdruck)‫‏‬
a) Anpassung an einen Wirt, Ko-Evolution (v.a. DNA-Viren)
b) Breiteres Wirtsspektrum, Interaktion mit
verschiedenen Wirtsorganismen (v.a. RNA-Viren)
Neue Eigenschaften von Viren durch…
Mutation
Rekombination
Insertion zellulärer Gene
Phänotyp – Mischen
Komplementierung
Reassortment
Mutationen
Mutation: Veränderung genetischer Information
Meist wird unter diesem Begriff die Punktmutation verstanden.
Wo können Mutationen erfolgen?
A) in nichtkodierenden Regionen
B) in Protein-kodierenden Regionen
stille (silent) Mutation (ohne Veränderung der AS-Sequenz)
nicht stille (nonsilent) Mutation (mit Veränderung der ASSequenz)
Mutation ohne Veränderung der Aminosäuresequenz
- silent ACT CCT CCT TCT ACA ATG CTA TCA TTG ATG GTT AGT AGA
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --Thr Pro Pro Ser Thr Met Leu Ser Leu Met Val Ser Arg
Leu Leu Leu Leu Gln Cys Tyr His *** Trp Leu Val Glu
Ser Ser Phe Tyr Asn Ala Ile Ile Asp Gly *** *** Arg
ACT CCT CCT TCT ACA ATG CTC TCA TTG ATG GTT AGT AGA
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --Thr Pro Pro Ser Thr Met Leu Ser Leu Met Val Ser Arg
Leu Leu Leu Leu Gln Cys Ser His *** Trp Leu Val Glu
Ser Ser Phe Tyr Asn Ala Ile Ile Asp Gly *** *** Arg
Mutation mit Veränderung der Aminosäuresequenz
- nonsilent ACT CCT CCT TCT ACA ATG CTA TCA TTG ATG GTT AGT AGA
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --Thr Pro Pro Ser Thr Met Leu Ser Leu Met Val Ser Arg
Leu Leu Leu Leu Gln Cys Tyr His *** Trp Leu Val Glu
Ser Ser Phe Tyr Asn Ala Ile Ile Asp Gly *** *** Arg
ACT CCT CCT TCT ACA TTG CTA TCA TTG ATG GTT AGT AGA
--- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --Thr Pro Pro Ser Thr Leu Leu Ser Leu Met Val Ser Arg
Leu Leu Leu Leu His Cys Tyr His *** Trp Leu Val Glu
Ser Ser Phe Tyr Asn Ala Ile Ile Asp Gly *** *** Arg
 Möglicherweise Veränderungen in der Proteinfunktion
Spontane Mutationen
- während der viralen Replikation
- ohne äussere Einflüsse
Häufigkeit von spontanen Mutationen: Mutationsrate
Mutationsraten bei Viren – RNA Genom
- fehlerhafte RNA-Replikation und Retrotranskription
- biochemische Basis: begrenzte Replikationsgenauigkeit in
Abwesenheit der Korrekturlese/Reparatur-Fähigkeit, die
normalerweise während der zellulären DNA-Replikation
stattfindet
RNA-Polymerasen: keine „proofreading“-Funktion
(keine 3‘ – 5‘ Exonukleaseaktivität)
 Mutationsrate RNA-Viren: ca. 10-4 (10-3-10-5)
pro eingebautes Nukleotid
Mutationsraten bei Viren – RNA Genom
Mutationsrate RNA-Viren: ca. 10-4
 1 Fehler pro 104 Nukleotide
Größe des HIV-Genoms: ~ 104 nt
 1 Fehler pro Replikationsrunde!
(106 mal mehr als in eukaryotischen Zellen)
 bei jedem HIV-Patienten entsteht jede mögliche
Mutation sowie jede mögliche Kombination aus
zwei Mutationen in kurzer Zeit
(> 109 Varianten pro Tag und Patient)
Ein weiteres Beispiel für die hohe Variabilität von RNA-Viren:
Poliovirus-Lebendimpfstoff
Ein weiteres Beispiel für die hohe Variabilität von RNA-Viren:
Poliovirus-Lebendimpfstoff
 Eine Passage durch einen menschlichen Impfling genügt,
um aus dem attenuierten Polioimpfvirus eine
neurovirulente Revertante entstehen zu lassen.
 genetisch instabile Lebendvakzine aufgrund der hohen
Mutations- und Vermehrungsrate
Quasispezies
hohe Fehlerrate
hohe Vermehrungsrate
Replikationszyklus Stunden bis wenige Tage
Nachkommen pro Zyklus (bis zu mehrere 1000)
Virusnachkommen in einem infizierten Menschen (109 – 1011 pro Tag)
 inhomogene Viruspopulation: Quasispezies
Selektionsdruck (z.B. Immunitätslage des Wirts) bestimmt die
Auswahl der im Moment „überlebenstüchtigsten“ Viren
 hohe Variabilität des HIV
RNA-Viren
- hoch variable und adaptive Natur von viralen
Quasispezies
- virale Fitness (oder die Fähigkeit zur Replikation
infektiöser Nachkommenschaft) kann in relativ kurzen
Zeitintervallen millionenfach variieren
Induktion viraler Evolution durch hohen Selektionsdruck
(Chemotherapie)
Infektion mit HIV
Chemotherapie:
Azidothymidin: Hemmung RT
ddC: Hemmung RT
Saquinavir:Hemmung Protease
Virusmutanten
werden selektioniert
Resistente HIV
Chemotherapie:
AZT: Hemmung RT
ddI: Hemmung RT
Saquinavir:Hemmung Protease
Virusmutanten
werden selektioniert
usw.
DNA-Viren
- Die Fehlerrate während der Replikation bei DNA-Viren ist
beträchtlich geringer als bei RNA-Viren
(Mutationsrate ist bei DNA-Viren ca. 10-8 – 10-11 pro
eingebautes Nukleotid)
- verschiedene DNA-Viren (Parvoviren, Papovaviren) nutzen
die zelluläre DNA-Replikationsmaschinerie
 Korrekturlese/Reparatur-Fähigkeit
- andere besitzten viruseigene Reparaturmechanismen
(Herpesviren, Poxviren)
Fig. 1. Relationship between error rate and genome size for different genetic systems,
including viruses
Holmes, E. C.. 2011. J. Virol. 85(11):5247-5251
Model of error catastrophe.
Crotty S et al. PNAS 2001;98:6895-6900
©2001 by National Academy of Sciences
Inverse Korrelation
von Genomgrößen und Mutationsraten
- zu hohe Mutationsraten
 hohe Anzahl an Mutationen pro Replikation
 “loss of fitness”
- zu niedrige Mutationsraten
 geringere genetische Vielfalt
 “reduzierte Anpassungsfähigkeit”
- Genomgrößen von RNA-Viren durch hohe
Mutationsraten beschränkt
Viroide:
Poliovirus:
Tollwutvirus:
SARS-Coronavirus:
241 bis 401 Nukleotide
7.440 Nukleotide
12.000 Nukleotide
29.700 Nukleotide
Coronaviren haben Korrekturlesefunktion:
Exonukleaseaktivität (ExoN)
• RNA Genom deutlich größer als andere RNA-Viren
Smith EC, Denison MR (2013) Coronaviruses as DNA Wannabes: A New Model for the Regulation of RNA Virus Replication Fidelity. PLoS
Pathog 9(12): e1003760. doi:10.1371/journal.ppat.1003760
http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1003760
Coronaviren haben Korrekturlesefunktion:
Exonukleaseaktivität (ExoN)
• RNA Genom deutlich größer als andere RNA-Viren
• Eperiment: wild-type (ExoN+) or ExoN-deleted (ExoN−)‫‏‬
SARS-CoV in the presence of the mutagenic pyrimidine
analogue 5-fluorouracil
•
 160-fold reduction in viral replication
 ExoN−‫‏‬SARS-CoV harboured 3,648 mutations
 ExoN+ SARS-CoV accumulated only 259 mutations
Figure 1. CoV genomic architecture and nonstructural proteins (nsps).
Smith EC, Denison MR (2013) Coronaviruses as DNA Wannabes: A New Model for the Regulation of RNA Virus Replication Fidelity. PLoS
Pathog 9(12): e1003760. doi:10.1371/journal.ppat.1003760
http://www.plospathogens.org/article/info:doi/10.1371/journal.ppat.1003760
Induzierte Mutationen - Künstliche Mutagenese
• Mutationen mittels sogenannter Mutagene:
- UV-Strahlung
- chemische Substanzen: wirken meist auf Nukleinsäure, die
sich nicht in der Replikationsphase befinden
a) Salpetersäure deaminiert Adenin: (A:T -> G:C)
Adenin  Hypoxanthin  Cytosin (bei der nächsten Replikation)
b) Hydroxylamine reagiert mit Cytosin (C:G zu T:A)
Induzierte Mutationen - Künstliche Mutagenese
• Anpassung der Viren an in vitro- und in vivo-Systeme
(z.B. kultivierte Zellen oder Labortiere)
- meist erst schlechtes Wachstum in kultivierten Zellen (oder Labortieren)
- serielle Passagen in Zellkulturen/Labortieren
 Selektion der am besten wachsenden Mutante = adaptive Mutation
- dann meist gutes Wachstum in Zellkulturen/Labortieren
Wichtig:
Mit den adaptiven Mutationen verlieren Viren häufig ihre
krankmachenden Eigenschaften
 Attenuierung im natürlichen Wirt = Impfstoff
Gerichtete Mutationen
Mit der rekombinanten DNA-Technik ist es möglich, gezielt
Mutationen in virale Genom einzufügen
DNA-Viren
Addition genetischer Inf.
Deletion genetischer Inf.
Substitution genetischer Inf.
Gerichtete Mutationen
Mit der rekombinanten DNA-Technik ist es möglich, gerichtet
Mutationen in virale Genom einzufügen
DNA-Viren
RNA-Viren
Addition genetischer Inf.
Deletion genetischer Inf.
Substitution genetischer Inf.
Addition genetischer Inf.
Deletion genetischer Inf.
Substitution genetischer Inf.
Gerichtete Mutationen
Mit der rekombinanten DNA-Technik ist es möglich, gerichtet
Mutationen in virale Genom einzufügen
DNA-Viren
RNA-Viren
Addition genetischer Inf.
Deletion genetischer Inf.
Substitution genetischer Inf.
Addition genetischer Inf.
Deletion genetischer Inf.
Substitution genetischer Inf.
?
Wie kann das gehen?
Manipulierbarkeit RNA-Viren
infektiöses Virus
virales RNA Genom
Reverse Transkription
virale cDNA
Transkription
virale cRNA
Transfektion
infektiöses Virus
I
N
V
I
T
R
O
Manipulierbarkeit RNA-Viren
infektiöses Virus
virales RNA Genom
Reverse Transkription
virale cDNA
Transkription
virale cRNA
Transfektion
infektiöses Virus
I
N
V
I
T
R
O
Manipulierbarkeit RNA-Viren
infektiöses Virus
virales RNA Genom
Reverse Transkription
virale cDNA
Transkription
virale cRNA
Transfektion
infektiöses Virus
I
N
V
I
T
R
O
genetische Manipulation
Gezielte Manipulation von DNA- und RNAViren mit Hilfe von gentechnischen
Methoden möglich
Phänotypische Charakterisierung von Mutanten
- Mutationen, die die Plaquemorphologie beeinflussen
- Mutationen, welche den Wirtswechsel beinflussen
(Host range mutants)
- Temperatur-sensitive Mutanten
(konditional-lethaler Phenotyp)
- Deletionsmutanten
Mutationen, die die Plaquemorphologie beeinflussen
Temperatur-sensitive Mutanten
(konditional-letaler Phenotyp)
Temperatur-sensitive Mutanten
(konditional-letaler Phenotyp)
Mutationen, welche den Wirtswechsel beinflussen
(Host Range Mutants)
Isolation aus dem natürlichen Wirt (Mensch)
Mutationen
serielle Passagen im
Versuchstier
Anpassung an das Versuchstier
(effiziente Replikation)
Deletionsmutanten
Deletion
z.B. durch serielle Passagen
in der Zellkultur
Defekte Viren (keine autonome Virusreplikation)
intaktes Virusgenom: autonome Vermehrung
Fehlt dem Virusgenom ein essentielles Gen (z. B. bei Deletionsmutanten),
so kann sich das Virus nicht mehr vermehren.
(Delta oder )
Komplementierung
Ausgleich eines Defekts einer Mutation (z. B. ts- Mutation,
Deletion) durch den Ersatz des defekten Elements (z. B.
Protein) durch ein Helfervirus (intaktes Protein wird durch
Helfervirus in trans zur Verfügung gestellt).
Komplettes Virus
= Helfervirus
Defektes Virus
Komplettes Virus
= Helfervirus
Defektes Virus
Beispiel: Hepatitis-D-Virus
RNA-Genom kodiert nicht für virales Hüllprotein
Virionen enthalten Hepatitis-B-Virus Hüllprotein (HBsAg)
Adeno-associated virus (Dependovirus)
Entry and transit to nucleus
In absence of helper-virus, integrates into host genome
- usually within specific region (recognized by rep)
- head-tail tandem repeats of genome
- remains dormant, unless super-infected by helper virus
Defekte interferierende RNAs bzw. Partikel
(DIs; DIPs)‫‏‬
Virale Partikel mit Defekt in essentiellen Genen
(meist in Folge einer Deletion, selten aufgrund von Mutationen)
-
defekte Viren
replizieren meist effizienter als das Helfervirus)
Entstehen oft in Folge von Zellkulturpassagen
Interferenz mit Helfervirus durch Kompetition
- Interferenz mit Viren vmtl. aufgrund von
Interferon-stimulierenden Eigenschaften
Defekte Interferierende RNAs
Intern deletierte oder copy-back DIs
Präferentielle Replikation
(DIs vs Helfervirus)
Defekte Interferierende RNAs als Antivirals?
Homologer Interferenz
Heterologe Interferenz
113pSK II (-)
Neue Eigenschaften von Viren durch…
Mutation
Rekombination
Insertion zellulärer Gene
Phänotyp – Mischen
Komplementierung
Reassortierung
Phänotyp Mischung (phenotypic mixing)
Quelle: Microbiology and Immunology online, http://pathmicro.med.sc.edu/mhunt/genet.htm
Beispiel Phenotypic Mixing: HIV-1 / MuLV-related retrovirus
HIV-1
 Infektion von CD4+-T-Lymphocyten
HIV-1 / MuLV
 Infektion von verschiedenen CD4--Zellen
Zelle
Zytoplasma
ZK
Polyploidie
Heteroploidie
Zelle
Zytoplasma
Transcapsidation
ZK
Neue Eigenschaften von Viren durch…
Mutation
Rekombination
Insertion zellulärer Gene
Phänotyp – Mischen
Komplementierung
Reassortierung
Rekombination
Ein Nukleinsäureabschnitt eines Virus wird durch
einen anderen ersetzt.
Resultat: Nachkommenviren mit neu kombinierter,
nichtelterlichen genetischer Information.
Bei DNA-Viren und RNA-Viren mit einer DNA-Phase in
der Replikation erfolgt die Rekombination durch:
Strangbruch – Wiedervereiningungs – Mechanismus
Homologe Rekombination
humanes HeRpesvirus + humanes HerPesvirus
1. humanes Herpesvirus
2. humanes HeRPesvirus
3. humanes HeRpesvirus
4. humanes HerPesvirus
Elternviren
Heterologe Rekombination:
Hepatitis-B-Virus-s-Antigen + Vacciniavirus
Vacciniavirus- Hepatitis-B-Virus-s-Antigen -Vacciniavirus
Bei RNA-Viren erfolgt Rekombination mittels
des‫“‏‬Copy-choice”‫‏‬Mechanismus:
Neue Eigenschaften von Viren durch…
Mutation
Rekombination
Insertion zellulärer Gene
Phänotyp – Mischen
Komplementierung
Reassortment
Reassortment
Charakteristikum von Viren mit segmentiertem Genom
Rotavirus
`5‘-GGCA/UA/UUA/UAA/UA/U---
---A/UUG/UU/GG/UA/GCC-3‘
Zelle
Zytoplasma
ZK
Klassisches Beispiel für Virus-Reassortment
?
Klassisches Beispiel für Virus-Reassortment
Influenza A Virus
Reassortment zwischen humanen und aviären
Influenzaviren in einem Zwischenwirt
Antigen Shift
(Viren mit segmentiertem Genom)‫‏‬
genetic reassortment führt zum Austausch von Genomsegmenten,
die für Oberflächenproteine kodieren
neu entstehende Viren besitzen ein neues antigenes Muster.
Antigen Drift
Mutationen in den Genen, die für virale Oberflächenproteine kodieren
Selektionsdruck: Immunsystems des Wirtes
Evolution humaner Influenzaviren von 1889 bis 1977
Spanische
Grippe
Asiatische
Pandemie
Hongkong
Pandemie
Entstehung neuer Viren :
1. genetische Veränderung eines Virus und ihrer Selektion
2. Änderung der sozialen Strukturen und/oder
Lebens- und Umweltbedingungen in der Wirtspopulation
Emerging Diseases:
Neue oder neu identifizierte, regional oder weltweit
auftretende Infektionskrankheiten.
Re-Emerging Diseases:
Bekannte Infektionskrankheiten, die nach Perioden der
geringeren Bedeutung wieder bzw. vermehrt oder mit
neuen Eigenschaften auftreten.
Zoonosen:
Krankheiten, die von Tieren auf Menschen übertragen
werden.
Beispiele‫‏‬für‫‏‬virale‫‏‬Zoonosen‫‏‬mit‫„‏‬Emergence“-Faktoren
Quellen‫‏‬von‫“‏‬emerging”‫‏‬Infektionen
HIV: Übertragung von Affen auf Menschen
SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome): Übertragung von
Fledermaus über Zibetkatze auf Menschen
West Nile Virus
Familie: Flaviviridae
Genus: Flavivirus
Erstbeschreibung: 1937 (West-Nile-District, Uganda)
infiziert Vögel, kann aber auch Menschen, Hunde,
Katzen, Pferde etc. infizieren
Übertragung: Stechmücken
Menschen: asymptomatisch bis neuroinvasive
Erkrankung (Meningitis/Enzephalitis)‫‏‬
West Nile Virus
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
West Nile Virus
Ökologie des Pathogens
?
Cx. pipiens
West Nile Virus Cx. restuans West Nile Virus
Cx. salinarius
West Nile Virus
Cx. pipiens in the USA bite both humans and birds
Africa, Southern Europe
bird biter
Northern Europe
USA
aboveground species
Culex pipiens
Genetic analysis
mammal biter
Cx. pipiens
underground species
Culex molestus
Science, March, 2004
West Nile Virus
Cx. pipiens in the USA bite both humans and birds
Africa, Southern Europe
bird biter
Northern Europe
USA
aboveground species
Culex pipiens
Cx. pipiens
Genetic analysis
mammal biter
underground species
Culex molestus
Science, March, 2004
http://www.hpa.org.uk/webc/HPAwebFile/HPAweb_C/1204100434554
Virus-Evolution
Hohe Diversität (Quasispezies)
Dynamische Interaktion mit dem Wirt/Umwelt (Selektionsdruck)
Neue Eigenschaften von Viren durch ….‫‏‬
Mutation, Rekombination, Insertion zellulärer Gene,
Phänotypisches Mischen, Komplementierung, Reassortment
Virusevolution findet täglich statt:
HIV-Therapie
(Re-)Emerging Viruses (v.a. RNA-Viren)
Reassortment von Influenza A Viren