Gendoping
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05/10/2012 Gábor Pozsgai Universität Pécs Medizinische Fakultät Pharmakologie und Pharmakotherapie 2012 • Bisher nur spekulative Gelegenheit 1 05/10/2012 • Folgenede sportleistungsteigernde Verfahren sind verboten: – Übertragung von Zellen oder genetischen Komponenten (z.B. DNS, RNS) – Anwendung von pharmakologischen oder biologischen Erreger die die Genexpression verändern • PPARδ Agonisten und PPARδ-AMP-activated protein kinase Signalwegreizer sind verboten • Bei klassischem oralem oder parenteralem Zufuhr von Mittel gibt es hohe Plasmaspiegel nach der Gabe • Bei Genübertragung ist die Expression des Proteins ständig • Das kann den minimalen effektiven Plasmaspiegel kaum überschreiten 2 05/10/2012 • Das übertragte Protein wird von dem Körper aufgebaut und kann von endogenem Molekül nicht unterschieden werden • Das übertragte Protein kann nur in einigen Geweben (z.B. quergestreiften Muskeln) expressiert werden • Dann ist es aus Harn- und Blutproben unnachweisbar • Da waren mehr als 1000 klinische Untersuchungen über Gentherapie – nur zwei Mittel wurden in China zugelassen – in Juli 2012. wurde der Vorgang von Glybera für die Behandlung von Lipoproteinlipasemangel begonnen • Transgene Tiere – knockout – knock down 3 05/10/2012 Vektoren • Veränderte Viren – Einige oder alle Virusgenen sind von deren Erbgut entfernt – Sie können sich nicht mehr vermehren und dadurch Zellen zerstören oder sich verbreiten • • • • Adenoviren Adeno-assoziierte Viren Herpesviren Retroviren – Lentiviren – Alphaviren • AAV sind am besten geeignet um quergestrafte Muskeln zu verändern • Können alle Muskeln körperweit selektiv in Nagetieren oder größeren Tieren modifizieren 4 05/10/2012 • Viren haben oberflächliche Proteinmoleküle die feststellen welche Zelltypen sie angreifen können • Diese kann man verändern um einige Gewebe zu zielen – Auswahl von manchen Serotypen – Pseudotypisierung • Proteine von andere Viren werden eingeschleust • Virusvektorn haben den Nachteil dass sie immunogen sind – Können nicht mehrfalls verwendet werden – Können unwirksam sein wenn das Immunsystem das Wildtypvirus schon kennengelernt hat • Immunsuppressiva können zugeführt werden, Risiken der Genübertragung werden aber dadurch gesteigert 5 05/10/2012 Plasmide • Sie können so gereinigt werden dass keine Proteine oder Zellen zugeführt werden sollen • Das unspezifisches Abwehrsystem wird trotz stimuliert – Das kann zu lokalisirter Schwellung und grippeähnlichen Beschwerden führen – Zufuhr von Plasmiden kann effektiv wiederholt werden • Plasmide sind für Allkörperanwendung nicht geeignet sondern für lokalen Zufuhr Eintritt in die Zellen ist niedrig • Plasmide können verdichtet werden um sie von Zellen einfacher aufgenommen werden können • Solche Substanze können zugegeben werden die rezeptorvermittelte Endozytose auslösen – Wirkt sehr gut in Zellkultur aber kaum in Geweben 6 05/10/2012 Förderung des Eintritts durch physikale Kräfte • Plasmide treten durch vergänglichen Mikroporen in die Zellen ein – Hochvolumen/Hochdruck (hydrodynamischer Kraft) – Elktrische Impulse (Elektroporation) – Schießen von Plasmide in die Zellen (ballistisches Verfahren) – Ultraschall mit kontrasten Mikroblasen – optische Trasnfektion – Impalefektion – Magnetofektion Genetisch veränderte Zellen • Sie können die Reparatur von beschädigten Muskeln steigern oder Proteine freisetzen • Die fremde Zellen können in eine träge Hülle eingewickelt werden so dass kein Immunantwort vorkommt – So können die Zellen leicht entfernt werden wenn erwünschte Proteine nicht geeignet freigesetzt werden – Homologe Zellen können so auch zugeführt werden 7 05/10/2012 • Menge von freigesetzte Proteine kann vor Implantation einfach gemessen werden bei ex vivo veränderten Zellen • Bei in vivo Genübertragung ist diese Menge schwankend, bei Zellen ist sie ständig • Um die Freisetzung zu kontrollieren können substanzinduzierbare Systeme angewendet werden – Tetracyklin – Rapamycin – Tamoxyfen • Können auch Nachweis von systemisch freigesetzten Proteinen vorbeugen 8 05/10/2012 • 5-Aminoimidazol-4-Carboxamid-1-β-DRibofuranosid • Acadesine • Für die Behandlung von akute lymphoblastische leukämie • Unter klinischer Erprobung für Diabetes und Vorbeugung von Reperfusionschädigung bei Herzkranzgefäßchirurgie 9 05/10/2012 Corton et al. 1995. Eur J Biochem Corton et al. 1995. Eur J Biochem 10 05/10/2012 Thomson et al. 2008. J Appl Physiol • Fördert Glukoseaufnahme der Muskelfasern – Translokation von GLUT in die Plasmamembran – Aktivierung von p38 MAPK • Kronische Aktivierung von AMPK steigert Glykogenenthalt von Muzskelfasern – steigert den Spiegel von Glukose-6-Phosphat in den Fasern – Glukose-6-Phosphat aktiviert Glykogensynthase allosterisch 11 05/10/2012 Lemieux et al. 2003. FASEB J Lemieux et al. 2003. FASEB J 12 05/10/2012 Hunter et al. 2011. Diabetes Hunter et al. 2011. Diabetes 13 05/10/2012 Hunter et al. 2011. Diabetes Hunter et al. 2011. Diabetes 14 05/10/2012 • AICAR ist antiapoptotisch in Endothelzellen • Das kommt durch geringer Aufbau von reaktiven Sauerstoffspezies vor • Die Wirkung findet durch uncoupling protein 2 (UCP2) statt Kim et al. 2008. J Pharmacol Sci 15 05/10/2012 Kim et al. 2008. J Pharmacol Sci • AICAR beeinflusst Genexpression durch Modulierung den PPARδ Signalweg • Von AICAR induzierte Gene überlappen mit Ausdauertraining induzierte Gene • Orale Behandlung mit AICAR für 4 Wochen führte zu 44% Steigerung des Ausdauers in Mäuse ohne Training 16 05/10/2012 Narkar et al. 2008. Cell • Gleichzeitig verhindert aber AICAR von Training ausgelösten Proteinaufbau und Hypertrophie in Skelettmuskeln • Akt/mTOR/S6K1, 4E-BP1, eEF2 17 05/10/2012 Lynch et al. 2008. Physiol Rev Thomson et al. 2008. J Appl Physiol 18 05/10/2012 • AICAR kann ähnliche Wirkungen haben in Herzmuskeln • Das konnte zur Vorbeugung der Training oder kronischer β Agonist Benutzung ausgelöster linksventrikulärer Hypertophie angewendet werden • FOXO1/MuRF1 Ryall & Lynch. 2008. Phramacology & Therapeutics 19 05/10/2012 Chen et al. 2010. Acta Pharmacol Sin Chen et al. 2010. Acta Pharmacol Sin 20 05/10/2012 Chen et al. 2010. Acta Pharmacol Sin • Von GlaxoSmithKline entwickelter PPARδ Receptoragonist • Unter Erprobung für Adipositas, Dyslipidämie, Diabetes und kardiovaskuläre Krankheiten 21 05/10/2012 • • • • • Fördert Glukoseaufnahme von Skelettmuskeln Fördert oxidativen Stoffwechsel der Fasern Macht Mäuse resistent gegen Hochfettdiät Steigert die Rate von Typ I Muskelfasern Steigert Ausdauer in Tierversuchen VP16-PPARδ Transgenmäse mit ständiger Aktivität des Rezeptors in Fettgewebe VP16-PPARδ Transgenmäuse sind resistent gegen 5 Wochen Hochfettdiät Wang et al. 2003. Cell 22 05/10/2012 GW-501516 vermindert braunes Fettgewebe in genetisch adipös Leprdb/db Mäusen Wang et al. 2003. Cell Von PPARβ/δ Agonisten aktivierte (grün) und gehemmte (rot) Stoffwechselwege Dressel et al. 2003. Mol Endocrinol 23 05/10/2012 GW-501516 fördert Fettsäurenoxidierung in Skelettmuskeln von Menschen Krämer et al. 2007. J Biol Chem Ohne Training fördert GW-501516 das Ausdauer von Mäusen nicht, aber steigert die Rate von Typ I Muskelfasern Narkar et al. 2008. Cell 24 05/10/2012 VP16-PPARδ Transgenmause mit ständig aktivem Rezeptor in den Skelettmuskeln haben mehr Typ I Muskelfasern Wang et al. 2004. PLoS Biol VP16-PPARδ Transgenmause mit ständig aktivem Rezeptor in den Skelettmuskeln haben besseres Ausdauer Wang et al. 2004. PLoS Biol 25 05/10/2012 GW-501516 steigert Ausdauer von Mäusen nach Training Narkar et al. 2008. Cell Von GW-501516, AICAR und Training induzierte Gene überlappen Narkar et al. 2008. Cell 26 05/10/2012 • Die Mutter war ein Kurzstreckenläuferin, der Vater ist unbekannt für die Wissenschaftler • Ein Onkel war auch starker als der Durchschnitt • Die Mutter hat genetische Untersuchung des Kinds und sich selbst zugelassen 27 05/10/2012 Ultraschallquerschnitt des Oberschenkel des Kinds im Vergleich mit einer Kontrolle gleiches Alter und Gewicht Schuelke et al. 2004. N Engl J Med Stammtafel des Kinds. Quadrate zeigen Manner, Zirkel zeigen Frauen. Dunkle Zeichen sind Individuelle die über den Durchschnitt stark sind. Schuelke et al. 2004. N Engl J Med 28 05/10/2012 • G-A Transition wurde an Position g.IVS1.5 des Myostatingens in einer Allele der Mutter und beiden Allelen des Kinds gefunden • Nichtkodierender Bereich, führt aber zu Mißspleißung der Prekursor mRNS von Myostatin • Verdeckte Spleißstelle des ersten Introns wird aktiviert und und ein frühes Stopkodon wird in die mRNS eingeschleust • Fehlspleißung von mRNS war 70% • Zellen mit dem mutanten Gen transfektiert produzierten kein Myostatin • Lymphoblastzellen des Kinds synthetisierten kein Myostatin • Kein Myostatinpropeptid war in dem Plasma des Kinds nachweisbar 29 05/10/2012 Schuelke et al. 2004. N Engl J Med 30 05/10/2012 31 05/10/2012 Weißblaue Belgier 32 05/10/2012 33 05/10/2012 34 05/10/2012 Lee. 2007. PLoS One Fettgewebe des Nebenhodens McPherron & Lee. 2002. J Clin Invest 35 05/10/2012 Liam Hoekstra 36 05/10/2012 Kenneth „Flex” Wheeler 37 05/10/2012 Elkima et al. 2011. J Cachexia Sarcopenia Muscle • • • • • Growth/differentiation factor-8 (GDF-8) Mitglied der TGF-β Proteinfamilie Extrazellulares Cytokin Als Propeptid im Blutkreislauf zu finden Aktiviert von bone morphogenetic protein-1 (BMP-1) und tolloid metalloproteinase 38 05/10/2012 • Bindet zu activin type IIB Rezeptor • Rezeptorbindung wird verhindrt von: – Follistatin – growth and differentiation factor-associated serum protein-1 (GASP-1) – latent TGF-β binding protein 3 (LTBP3) • Reguliert Muskelmasse mit IGF-1 • Wird upreguliert in AIDS ausgelöster Kachexie, Krebs, Herzinsuffizienz • MYO-029 (Wyeth) • Humaner rekombinanter Antikörper gegen Myostatin • Nur wenige Nebenwirkungen in Muskeldystrophiepazienten • Hat die Funktion nicht entwickelt, aber förderte Muskelmasse in einigen Teilnehmern 39 05/10/2012 Querschnitt der Muskelfasern von einzelnen Teilnehmer nach Behandlung mit MYO-029 Wagner et al. 2008. Ann Neurol • ActRIIB Köderrezeptor • Rezeptor von Myostatin, Activin, GDF11, usw. • Transgenmäse ohne ActRIIB haben Muskelhypertrophie • Aktivität von ActRIIB Rezeptor ist gesteigert in zahlreichen Tumoren 40 05/10/2012 Wirkung von dominante negative Mutation von ActRIIB an Muskelfaserquerschnitt in Mäusen Lee & McPherron. 2001. PNAS Wirkung von dominante negative Mutation von ActRIIB an Muskelmasse in Mäusen Lee & McPherron. 2001. PNAS 41 05/10/2012 Kachexie und Überlebung in C26 Mausern mit Tumoren werden verbessert durch Bechandlung mit sActRIIB nach verschiedener Zeit Zhou et al. 2010. Cell Muskelatrophie in C26 Mäsuen mit Tumoren wird von sActRIIB ohne der Beeinflussung von Tumorwuchs, Fettstoffwechsel oder inflammatorischen Cytokinen gehemmt Zhou et al. 2010. Cell 42 05/10/2012 • Ein Glykoprotein der zu Mitgliedern der TGF-β Proteinfamilie bindet und sie inaktiviert – Myostatin – Activin • Höchsten Mengen sind in den Eierstöcken und der Haut zu finden • Fst-/- Mäuse sterben nach Geburt • Nur Fst+/- Tiere können untersucht werden Muskelmasse von Transgenmäusen ohne Follistatin im Vergleich mit anderen Stämmen Lee et al. 2010. Mol Endocrinol 43 05/10/2012 Rate von Muskelfasertypen in Transgenmäsen ohne Follistatin Lee et al. 2010. Mol Endocrinol Fehlheilung von Muskeln in Transgenmäsen ohne Follistatin Lee et al. 2010. Mol Endocrinol 44 05/10/2012 Skilaufer Eero Mäntyranta aus Finnland • Primäre familiäre kongenitale Polycythämie – mutiertes EPO Rezeptor • Gesteigertes Ausdauer • Der erste Sportler aus Finnland mit postiven Dopingproben – Amphetamin – er hat Amphetaminbenutzung verweigert, hat aber an der Zeit nicht verbotene Hormone zugegeben 45 05/10/2012 • EPO Gen kann in Nagetieren nach Rapamycin empfindlichem Promoter transfektiert werden • Repoxygen – unter preklinischer Erprobung – EPO Gen nach auf Hypoxie Reagierendem Element (HRE) – Nur in Skelettmuskeln transfektiert – Physikale Belastung löst Synthese von EPO aus – Für die Behandlung von Anämie • Einschleusen von IGF-1 Gen und Überexprimierung von IGF-1 in quergestraften Muskeln steigerte Stärke und führte zu Muskelhypertrophie in Mäusen und Ratten • Training hat die Wirkung weiter gefördert 46 05/10/2012 • Mehre Mittel unter Entwicklung werden für Doping benutzt • Man soll nicht spezielle Mittel sondern Wirkungsmechanismen nachweisen – z.B. erhöte Androgenrezeptoraktivität in Zelltesten • Gendoping ist von Festgewebeproben leichter nachzuweisen – Ektopisch aufbaute Proteine ertragen verschiedene posttranslationale Änderungen als normale Moleküle • Vektoren können auch nachgewiesen werden – single copy primer-internal intron-spanning PCR (spiPCR) – Dafür gibt es nur wenig Zeit besonders bei nichtviralen Vektoren • Antikörper gegen Virusvektoren können nachgewiesen werden – Diese können auch von normaler Virusinfektion stammen 47 05/10/2012 • Mittel die Genexpression regulieren können als normale Arzneimittel nachgewiesen werden • Nachweis der Folgen von Gendoping – Transcriptomics – Proteomics – Metabolomics • Meiste Untersuchungen benutzten Embryos von Nagetieren • Es ist nicht gewusst ob die selbe Verfahren für größere erwachsene Tiere wirken • Mehre i.m. Spritzen • Zufuhr von Vektoren in Blutgefäße aus dem systemischen Blutkreislauf ausgeschlossener Körperteile 48 05/10/2012 • Darstellung von Plasmidvektoren geeigneter Qualität ist einfach • Darstellung von AAV in großen Mengen ist kompliziert und fördert Fachwissen • Vektoren können unspezifische Immunantwort auslösen • Adenovirusvektoren haben unter einer klinischen Untersuchung zu DIC, mehrfacher Organinsuffizienz und Tod geführt • Retroviren können Onkogenese fördern • Überexpression von Genen können auch Nebenwirkungen auslösen – EPO • Autoimmunanämie – IGF-1 • als Wachstumsfaktor kann es onkogen sein 49
