Enzyme - Diagnostik

Serumenzyme
Diagnostik, Messung, Anwendung
und Interpretation
Enzyme - Eigenschaften
• Die Bestimmung von Enzymaktivitäten in Serum,
Plasma oder Harn hat für die Diagnostik und zur
Verlaufs- und Therapiebeurteilung immer noch einen
vorrangigen Stellenwert eingenommen.
• Die Menge von Enzymen im Plasma ist sehr gering,
wenn man sie in Konzentrationen angibt – z.B. ALAT
(GPT) 100 µg/ Liter (Gesamteiweiß 60-80 g/l)
• Enzyme, die ihre Aufgaben im Blut haben, z.B.
Cholinesterase (CHE), Gerinnungsfaktoren – kommen in
höheren Konzentrationen vor.
• Enzyme gelangen meistens durch die Zellumsatz ins
Blut.
Enzyme - Eigenschaften
• Enzyme mit physiologischer Funktion im Blut – z.B.
Thrombin, Plasmin, Cholinesterase – zeigen bei
Schädigung der Ursprungszellen einen Abfall der
Aktivität im Blut.
• Enzyme von sekretorischen (exokrinen) Drüsen – z.B.
Pankreasamylase, -lipase – zeigen bei Schädigung der
Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivität im Blut.
• Enzyme mit physiologischer Funktion in der Zelle – z.B.
LDH, GOT, GPT, CK - zeigen bei Schädigung der
Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivität im Blut.
Enzyme - Eigenschaften
• Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms,
das spezifisch in einem Organ synthetisiert und ins Blut
sezeniert wird – z.B. CHE -, kann auf eine Schädigung
des Herkunftsorgans geschlossen werden, wenn die
Enzymaktivität im Blut sinkt.
• Von der im Serum enthaltenen Aktivität eines Enzyms,
das spezifisch in einem Organ synthetisiert wird, aber
nicht ins Blut abgegeben wird – z.B. CK -, kann auf eine
Schädigung des Herkunftsorgans geschlossen werden,
wenn die Enzymaktivität im Blut steigt.
Enzyme - Eigenschaften
• Einige Enzyme kommen als Isoenzyme vor – das heißt,
dass sie die gleiche Reaktion katalysieren. Sie kommen
in verschiedenen Geweben bzw. Organen vor – z.B.
Lactatdehydrogenase oder LDH, die als Tetramer in 5
verschiedenen Isoformen vorkommt.
• Man kann die LDH elektrophoretisch trennen, um das
Herkunftsorgan herauszubekommen.
• LDH-1 kommt überwiegend im Herzmuskel und
Erythrozyten, LDH-5 dagegen in der Leber und
Skelettmuskulatur vor.
• Die Isoformen sind H4 (LDH-1), H3M (LDH-2), H2M2
(LDH-3), HM3 (LDH-4) und M4 (LDH-5) (H=Herz;
M=Muskel)
Serumenzyme – Diagnostisches Nützen
• Das Erscheinen bzw. Verschwinden von Enzymen im
bzw. aus dem Serum kann wichtige Vorgänge im Körper
widerspiegeln. Nicht nur die Geschwindigkeit des Anoder Absteigens eines Enzyms, sondern das Verhältnis
von Enzymen zueinander, gibt zusätzliche Information zu
einem Krankheitsverlauf bzw. zur Effizienz einer
Therapie.
• Es gibt verschiedene Komponente der Enzymkinetik,
die separat betrachtet werden müssen, um ein
diagnostischen Nutzen der Ergebnisse zu optimieren.
Enzyme – Messung der Aktivität
• Die Internationale Union für Biochemie (IUB) hat schon
1961 Empfehlungen für die optimierte Bestimmung von
Enzymaktivitäten erarbeitet.
• Die Bedingungen für diese optimierten Methoden sind:
• Optimaler pH-Wert
• Definierte Temperatur d.h. 37 °C
• Optimale Substratkonzentration
• Optimale Coenzymkonzentration
• Optimale Konzentration an Aktivatoren
Enzyme – Messung der Aktivität
• Enzymaktivität wird in Einheiten/l (U/l) angegeben.
• 1 internationale Einheit (U) ist diejenige Enzymaktivität,
die pro Minute unter definierten Bedingungen die
Umwandlung von 1 µmol Substrat katalysiert. (Dies wird
für Plasma und Serum auf 1 Liter bezogen).
• Die Messtemperatur ist 37 °C (definierte und validierte
Referenzbereiche sind oft nur für 25 °C vorhanden!)
Enzyme - Nomenklatur
• Die Enzyme Commission (EC)-Nummer beschreibt die Funktion
eines Enzyms. Die ganze Liste befindet sich im „Enzyme
Nomenclature“ [1972] sowie dem „Enzyme Handbook“ und seinen
„Supplements“ (Springer-Verlag).
• Die EC-Nummer hat 4 Komponente:
• Stelle 1 definiert die Funktion – z.B. 1 = Oxidoreduktasen
• Stelle 2 definiert die Donorgruppe – z.B. 1 = CH-OH
• Stelle 3 definiert die Akzeptorgruppe – z.B. 1 = NAD(P)
• Stelle 4 ist die Enzymnummer innerhalb der Gruppe.
• Beispiel: EC 1.1.1.71 = Alkoholdehydrogenase (NAD(P)) oder
Alkohol: NAD(P) Oxidoreduktase
• Reaktion Alkohol + NAD(P) = Aldehyd + reduziertes NAD(P)
Enzyme - Nomenklatur
• Die Hauptgruppen von Enzymen sind:
• 1.x.x.x – Oxidoreduktasen (z.B. GLDH: EC 1.4.1.3,
LDH: EC 1.1.1.27)
• 2.x.x.x – Transferasen (z.B. Gamma-GT: EC 2.3.2.2,
ASAT/GOT: EC 2.6.1.1, ALAT/GPT: EC 2.6.1.2)
• 3.x.x.x – Hydrolasen (z.B. alkalische Phosphatase:
EC 3.1.3.1, α-Amylase: EC 3.2.1.1, Lipase EC 3.1.1.3)
• 4.x.x.x – Lyasen (z.B. Adenylatcyclase: EC 4.6.1.1)
• 5.x.x.x – Isomerasen (z.B. Glucose-6-Phosphat
Isomerase: EC 5.3.1.9)
• 6.x.x.x – Ligasen / Synthetasen (z.B. Harnstoffcarboxylase: EC 6.3.4.6)
Enzyme – Messung der Aktivität
• In klinisch-chemischen Vollautomaten wird alles
automatisch geregelt. Die Temperierung der Messzelle
findet automatisch statt. Das Gleiche gilt für das
Pipettieren der Reagenzien, eventuelle Verdünnungen
und Umrechnung der Ergebnisse.
• Es gibt verschiedene Messmöglichkeiten: kontinuierliche
Verfahren (Kinetik); diskontinuierliche Verfahren (2-Punkt
Messung) oder Endpunktverfahren.
Enzyme – Berechnung der Aktivität
Berechnung des molaren
Extinktionskoeffizienten - 
• Die Konzentration der zumessenden Substanz in der
Probe errechnet sich nach der Gleichung:
• c = (ΔE / [ µmol * d])
• c = Konzentration der Substanz
• ΔE = Extinktionsdifferenz zwischen Analysen- und
Leerwert bzw. Extinktionsdifferenz durch Verbrauch
oder Bildung von NAD(P)H
• d = Schichtdicke der Kuvette in cm
•  µmol = spezifischer mikromolare Extinktionskoeffizient
Enzyme – Berechnung der Aktivität
• Die Enzymaktivität entspricht der Änderung der
Konzentration von Substrat oder Produkt während
der Messzeit (t). Meist wird bei einer Enzymaktivitätsbestimmung aus mehreren Messungen das
durchschnittliche ΔΕ/Minute ermittelt. Von diesen
Beobachtungen haben wir:
• Volumenaktivität = Δc / t = ΔE / (t*  µmol *d)
µmol/min * ml Messlösung
• Δc = Änderung der Konzentration von Substrat oder
Produkt
• t = Messzeit in Minuten
Enzyme – Berechnung der Aktivität
• Ein Substratumsatz von 1 µmol/min = 1U. Analog zur
Bestimmung von Metabolitkonzentrationen sind das
Volumen der Messlösung und das Probenvolumen zu
berücksichtigen.
• Volumenaktivität = ΔE * V/ (t*  µmol *d * v) U/ml
• V = Volumen der Messlösung
• v = Volumen, das in dem Test eingesetzten Probe
• Da man Ergebnisse meistens in U/l angibt, muss man
mal mit dem Faktor 1000 multiplizieren.
• Wird verdünntes Material eingesetzt, muss dies auch
berücksichtigt werden.
Serumenzyme - Herkunft
• Sekretionsenzyme – Cholinesterasen
• Reaktion: Acylcholin + H2O  Cholin + R.COOH
• Es gibt zwei Gruppen von Cholinesterasen: die wahre
Acetyl(thio)cholinesterase (AChE) (2 Typen bekannt)
und die Pseudocholinesterasen (CHE)
(Serumcholinesterasen, ca. 18 Typen bekannt), die
neben Acetylcholin auch Butyrylcholin und andere
Acylcholine sowie Thiocholine spalten.
• Die Bestimmung von AChE hat – im Gegensatz zur
CHE– so gut wie keine klinische Bedeutung. Die CHE
biologische Halbwertzeit im Serum beträgt ca. 10 Tage.
Cholinesterase – diagnostisches Nutzen
• Aktivitätsänderungen bei der Cholinesterase:
• Erhöhung bei: Proteinverlustsyndrom (nephrotisches
Syndrom), unkomplizierte Fettleber (Frühform der
alkoholischen Leberschädigung), funktionelle
Hyperbilirubinämie, Hypertriglyceridämie, Adipositas,
Diabetes mellitus.
• Erniedrigung bei: chronischer Hepatitis, Leberzirrhose,
Kwashiokor, ChE-Inhibitoren [ Physostigmin,
Cyclophosphamid ], Schwangerschaft (2. Trimenon bis 6
Wochen post partum), Verschiedenes ( Septikämie,
Verbrennungen, postoperativ, Antikontrazeptiva,
Malignome, Anämien)
Weitere Serumenzyme – Beispiele und
diagnostische Anwendung in der Gerinnung
• Andere Enzyme mit Aktivität im Plasma sind die, die mit der
Blutgerinnung zu tun haben. Hierzu gehören u.a. Urokinase,
Gewebetyp Plasminogenaktivator (t-PA) und Thrombin sowie die
überwiegende Zahl der Gerinnungsfaktoren, die je in einer
inaktiven Form vorliegen, die während des Gerinnungsprozesses
stufenweise aktiviert werden.
• Normalerweise werden die Enzyme selber nicht gemessen, sondern
ihre biologische Aktivität im Form von „globalen“ Tests, wie der
Quick-Wert [auch Thromboplastinzeit, TPZ oder
Prothrombinzeit genannt]. Hier werden eine Verminderung der
Faktoren II, V, VII, X sowie Vitamin-K und Fibrinogen erfasst. Der
Quick-Wert wird u.a. zur Kontrolle einer Cumarin-Derivat
Antikoagulantientherapie angewendet. Die Werte werden
normalerweise als Prozent eines Normal-Poolplasmas angegeben
(Normal: 70-130%).
Serumenzyme – als Globalteste in der
Gerinnung
• Andere Globalteste (mit ähnlichen Abkürzungen!) sind:
• Partielle Thromboplastinzeit [PTT] und aktivierte
partielle Thromboplastinzeit [aPTT] – Prüft die
Faktoren XII, XI und IX sowie die gemeinsame
Endstrecke der Gerinnung (Faktoren X, VIII, II, V und I).
Mit der aPTT erfasst man auch Prokallikrein und HMWKininogen durch den Zusatz von Oberflächenaktivatoren,
wie Kaolin.
• Plasma Thrombinzeit [PTZ] – Die PTZ wird eingesetzt,
um ein Fibrinogenmangel zu prüfen.
Enzyme – Messung der Aktivität
Kinetisch-Optischer Test - IFCC Methode
• Die Bestimmung der LDH-Aktivität im Serum.
• Reaktion: Lactat + NAD+  Pyruvat + NADH + H+
• Messprinzip: Die Zunahme der Extinktion durch das
Entstehen des Coenzyms NADH bei 339 nm im
Spektralphotometer.
• Als Substrat dient Lactat.
• Im Prinzip kann man die Reaktion in die
entgegengesetzten Richtung steuern. Man muss dann
Pyruvat im Überschuss haben und einen anderen pHWert einstellen.
• NAD+ - Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid - oxidierte Form
• NADH – NAD reduzierte Form
Enzyme – Messung der Aktivität
Zusammengesetzter optischer Test mit
Indikatorreaktion
• Die Bestimmung des ASAT (GOT) im Serum
• ASAT – Aspartat-Amino-Transferase
• GOT – Glutamat-Oxalacetat-Transaminase
•
•
•
•
Reaktion: Enzym ASAT/GOT
L-Aspartat + α-Oxoglutarat  L-Glutamat + Oxalacetat
Indikatorreaktion: Enzym/Malatdehydrogenase
Oxalacetat + NADH + H+  Malat – NAD+
• Messprinzip – Abnahme der Extinktion bei 334 nm
(Oxydation des NADH)
Enzyme – Messung der Aktivität
Zusammengesetzter optischer Test mit Hilfsund Indikatorreaktion
• Bestimmung der Creatinkinase (CK) im Serum:
•
•
•
•
•
•
Reaktion: Enzym Creatinkinase
Creatinphosphat + ADP  Creatin + ATP
Hilfsreaktion: Enzym Hexokinase
ATP + D-Glucose  ADP + D-Glucose-6-Phosphat
Indikatorreaktion: Enzym G-6-P-dehydrogenase
G-6-P + NADP+  6-Phosphogluconat + NADPH + H+
• Messprinzip: Messung der Extinktionszunahme bei 334 nm
(Reduktion des NADP zu NADPH)
IFCC Methode – Creatin Kinase
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Messbedingungen für die CK
Temperatur: 37,0 °C ± 0,1 °C
Wellenlänge: 339 nm ± 1 nm
Bandbreite:  2 nm
Lichtweg (in der Kuvette): 10,00 mm ± 0,01 mm
Inkubationszeit: 180 s
Verzögerungszeit: 120 s
Messinterval: 120 s
Anzahl der Messpunkte: mindestens 6
Enzyme – Messung der Aktivität
Verfahren zur Messung im Bereich des sichtbaren
Lichtes
• Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum:
• Reaktion: p-Nitrophenylphosphat (pNPP)  pNP + PO4
• pNPP ist farblos; pNP dagegen gelb bei pH 10
• Messprinzip: AP katalysiert die Hydrolyse von pNPP bei pH
9,8 unter Zunahme der Farbe (Extinktion) bei 405 nm)
• Kontinuierliche (kinetische) Messung
• Als Cofaktoren werden Mg+2 und Ca+2 benötigt
• EDTA- bzw. Citratplasma können, wegen ihrer
komplexierenden Eigenschaften nicht als Probe benutzt
werden.
Enzyme - Diagnostik
• GPT / ALAT
• Wird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetzt
• GPT ist überwiegend im Zytoplasma der
Leberparenchymzellen zu finden.
• Wichtigster Leberzellnekroseparameter
• in kleinen Mengen auch in der Niere, Herz- und
Skelettmuskulatur
• Störungen – Stark lipämische Seren können nicht
analysiert werden.
• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <41; f: <31 U/l
Enzyme - Diagnostik
• GOT / ASAT
• Wird zur Lebererkrankungs-Diagnostik eingesetzt
• GOT ist überwiegend in der Leber sowie im Herz- und
Skelettmuskulatur zu finden
• in kleinen Mengen auch im Gehirn
• Wichtiger Leberzellnekroseparameter, in Verbindung
mit der GPT Hinweis auf die Schwere der
Leberzellschädigung.
• Erhöhte Werte: akuter und chronischer Hepatitis,
Leberzirrhose, Fettleber, aber auch Herzinfarkt und
Muskeldystrophie.
• Störungen – Stark lipämische Seren können nicht
analysiert werden.
• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <38; f: <32 U/l
Enzyme - Diagnostik
• Laktatdehydrogenase - LDH
• LDH kommt in allen Geweben vor, wobei sich die höchste
Aktivität in Skelettmuskulatur, Herzmuskel, Niere, Gehirn und
Leber findet
• Aufgrund der fehlenden Organspezifität eignet sich die
Gesamt-LDH allein nur wenig als diagnostischer Parameter.
• LDH-1 als „Spätindikator“ für einen Herzinfarkt
• LDH erhöht bei: hämolytische Anämien, Lungenembolie
Skelettmuskelerkrankungen
• Leber und Gallenwegserkrankungen (LDH-5): akute Hepatitis,
akute Parenchymzellschädigung durch Intoxicationen
• Störungen – Hämolytische Seren können nicht analysiert
werden.
• IFCC Referenzmethode (37 °C) - m: <225; f: <215 U/l
Enzyme - Diagnostik
• Glutamatdehydrogenase - GLDH
• Wird zur Leber-Diagnostik eingesetzt, da GLDH
ausschließlich intramitochondrial in Leber vorkommt.
• Ein starker Anstieg der GLDH weist immer auf eine
schwere Leberschädigung hin, insbesondere der
zentroazinären Abschnitte, z.B. bei akuter Stauungsleber.
• Reaktion:
• α-Oxoglutarat + NADH + NH4  L-Glutamat + NAD+ + H2O
• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <6,4; f: <3,8 U/l
Enzyme - Diagnostik
• Gamma-Glutamyltransferase – γGT
• γGT findet sich in der Leber überwiegend in den
kanalikulären Segmenten der Hepatozytenmembran und
in den Epithelien der intrahepatischen Gallenwege.
• γGT ist ein Leberzellnekrose- und
Cholestaseparameter
• Reaktion:
• γ-Glutamyl-p-Nitroanilid (farblos) + Glycylglycin  γGlutamyl-Glycylglycid + p-Nitroanilin (gelb) (405 nm)
• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <49; f: <32 U/l
Enzyme - Diagnostik
• Alkalische Phosphatase - AP
• Cholestaseparameter und Knochenerkrankungen mit
erhöhter Osteoblastenaktivität
• Isoenzyme: Leber-AP, Knochen-AP und Nieren-AP. Die
Aktivität im Normalserum ist hauptsächlich auf das Leberund Knochenisoenzym zurückzuführen.
• Störungen – nur Serum bzw. Heparinplasma, nicht
Citrat und EDTA verwenden.
• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <270; f: <240 U/l.
Kinder in Wachstumsalter haben höhere Werte
(Knochenbau)
Enzyme - Diagnostik
• Bei Cholestase steigen AP und -GT im Serum an.
• erhöhte gesamt AP kommt auch bei andere
Erkrankungen vor: Osteopathie mit erhöhter
Osteoblastenaktivität, Nierenerkrankungen, Rachitis,
Schwangerschaft (letztes Trimenon), maligne Tumoren.
• -GT Erhöhungen im Serum sind bei etwa 95% aller
Fälle durch eine hepatobiliären Erkrankung zustande
gekommen.
• -GT ist ein guter Marker für Alkoholabusus
• Mäßig erhöhte -GT kommt bei einer chronisch aktiven
Hepatitis, primär biliäre Zirrhose und chronische
Pankreatitis vor.
Bedeutung von Quotientenbildung
• De-Ritis Quotient = GOT/GPT
- akute Virushepatitis:
< 0,7 unkompliziert, >0,7 nekrotisierend
- chronische Hepatitis, Leberzirrhose: ca.1
- nicht hepatisch (Trauma/Herzinfarkt): >1
• Quotient (GOT+GPT)/GLDH gilt als Maßstab für den
Schweregrad der Hepatozytenschädigung.
- < 20 bei schwerer Schädigung
- 20 – 50 bei mäßiger Schädigung
Bedeutung von Quotientenbildung
• Beispiele von Quotienten bei einer Hepatitis-A
• Typischer ikterischer Verlauf / cholestatischer Verlauf
Wochen
AST/ALT
25 °C
37 °C
1
0,54 / 0,49
0,54 / 0,49
(AST +ALT)/ 116 / 93
GLDH
174 / 140
3
5
7
0,28 / 0,28
0,28 / 0,28
0,31 / 0,36
0,31 / 0,36
0,65 / 0,31
0,66 / 0,31
107 / 109
160 / 164
49 / 200
74 / 300
38 / 88
57 / 132
Enzyme - Diagnostik
• Creatinkinase - CK
• CK kommt in hoher Aktivität in der Skelettmuskulatur, im
Herzmuskel und im Gehirn
• 3 Isoenzyme: CK-MB (Myokardtyp), CK-MM (Muskeltyp)
und CK-BB (Gehirntyp)
• Skelettmuskelerkrankungen: Rhabdomyolyse, Myositis,
progressive Muskeldystrophie, Polytrauma, Muskeltrauma
(inkl. i.m. Injektionen)
• Herzmuskelerkrankungen: akuter Myokardinfarkt
(Diagnostik und Verlaufskontrolle), Kontrolle einer
Thrombolysetherapie, Myokarditis
• Referenzbereiche: (37 °C) – m: <170; f: <145 U/l
Enzyme - Diagnostik beim Herzinfarkt
• CK-MB erreicht im Myokard ihre höchste Konzentration
• Obwohl CK-MB nicht vollständig kardiospezifisch ist, wird
sie in Verbindung mit der Gesamt-CK neben den
kardialen Troponinen weiterhin als biochemischer Marker
für den akuten Herzinfarkt eingesetzt.
• Cardiac-Troponin-T - Methode der Wahl, da
standardisiert
• Cardiac-Troponin-I
• Troponin-C ist nicht spezifisch genug für die
Herzinfarktdiagnostik.
• CK,CK-MB und Troponin T steigen 2-6 h nach einem
Infarkt.
• Myoglobin nach 1-2 h; GOT nach 4-6 h; LDH-1 (HBDH)
nach 6-12 h;
Serumenzyme – Referenzbereiche für gesunde
Erwachsene – 37 °C
•
•
•
•
•
•
•
•
•
-GT – M: < 50 U/l; F: < 32 U/L (IFCC)
AP – M: 40-120 U/l; F: 30-90 U/L
GPT – M: < 40 U/L; F: < 33 U/L
(IFCC mit P-5-P)
GOT – M: < 43 U/L; F: < 36 U/L
(IFCC mit P-5-P)
CK – M: 24-207 U/L; F: 24-170 U/L (IFCC)
CK-MB – M: < 18 U/L; F: < 18 U/L
GLDH – M: < 6,7 U/L; F: < 4,8 U/L
LDH – M: 135-225 U/L; F: 135-215 U/L (IFCC)
LDH-1 (HBDH) – M: < 171 U/L; F: < 202 U/L
•
(Wood et al.: Clin Lab 2004; 50: 455-75)