VL Serumenzyme ws1213 - Universitätsklinikum Düsseldorf

Vorlesung
Serumenzyme
Diagnostik, Messung, Anwendung und Interpretation
Wintersemester 2012/2013
Universitätsklinikum Düsseldorf
Institut für Laboratoriumsdiagnostik / Zentrallabor
Enzyme - Eigenschaften
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Die Bestimmung von Enzymaktivitäten in Serum, Plasma oder Harn
hat für die Diagnostik und zur Verlaufs- und Therapiebeurteilung
einen vorrangigen Stellenwert.
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Die Menge von Enzymen im Plasma ist sehr gering, wenn man sie
in Konzentrationen angibt – z.B. ALAT (GPT) 100 µg/ Liter
(Gesamteiweiß 60-80 g/l)
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Funktion des Enzyms: Katalysator biochemischer Reaktionen
A
+ B
Edukte („Substrat“)
Enzym
C
+
D
Produkte
Aktivität eines Enzyms
Aktivität =
Arbeit
=
Zeit
U =
Substratumsatz
Zeit
µmol
min
1 internationale Einheit (U) ist diejenige Enzymaktivität, die pro
Minute unter definierten Bedingungen die Umwandlung von 1
µmol Substrat katalysiert.
(Dies wird für Plasma und Serum auf 1 Liter bezogen).
Die Messtemperatur ist 37 °C
Photometrische Messung
Quelle: Wikipedia, „Photometrische Messung“
Transmission T =
I
I0
I0
Extinktion E = log
I
1
T
1 Unit = diejenige
Enzymmenge die 1 µmol
Substrat pro Minute
umsetzt
trübung
Reagenz
inkomplettes
Proben-
E
inkompletter
Reaktionsansatz
Substratstart
Substrat vollständig
verbraucht
min
Berechnung der Aktivität
E = ε .c . d
c=
aufgelöst nach c:
Veränderung der Konzentration :
Konzentrationsänderung pro Minute:
(Aktivität)
„Volumenaktivität“ [U/l] :
Δc=
Δc
min
Δc
min V
.
=
=
E
ε .d
ΔE
ε .d
ΔE
ε . d . min
ΔE
ε . d . min . V
Substrat
verbraucht
E
Substrat
verbraucht
Schematische Darstellung des Reaktionsablaufes bei unterschiedlicher
Enzymaktivität
Kinetik: Steigung der Kurve
Aktivität = 0
20 U/l
10 U/l
min
Enzyme – Messung der Aktivität
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In klinisch-chemischen Vollautomaten wird alles automatisch
geregelt. Die Temperierung der Messzelle (37°C) findet automatisch
statt. Das Gleiche gilt für das Pipettieren der Reagenzien, eventuelle
Verdünnungen und Umrechnung der Ergebnisse.
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Es gibt verschiedene Messmöglichkeiten: kontinuierliche Verfahren
(Kinetik); diskontinuierliche Verfahren (2-Punkt Messung) oder
Endpunktverfahren.
Enzyme – Messung der Aktivität
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Die Internationale Union für Biochemie (IUB) hat schon 1961
Empfehlungen für die optimierte Bestimmung von Enzymaktivitäten
erarbeitet.
Die Bedingungen für diese optimierten Methoden sind:
Optimaler pH-Wert
Definierte Temperatur d.h. 37 °C
Optimale Substratkonzentration
Optimale Coenzymkonzentration
Optimale Konzentration an Aktivatoren
Beispiel: Enzymaktivitätsbestimmung der AST
Reaktion:
AST
α-Ketoglutarat + Aspartat
Glutamat + Oxalacetat
COOH
COOH
COOH
COOH
C=O
CH – NH2
CH – NH2
C=O
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
COOH
CH2
COOH
COOH
COOH
Indikatorreaktion:
+
Oxalacetat + NADH + H
MDH
Malat + NAD+
COOH
COOH
C=O
CH - OH
CH2
CH2
COOH
COOH
Beispiel: Enzymaktivitätsbestimmung der AST
Reaktion:
α-Ketoglutarat + Aspartat
AST
Glutamat + Oxalacetat
COOH
COOH
COOH
COOH
C=O
CH – NH2
CH – NH2
C=O
CH2
CH2
CH2
CH2
CH2
COOH
CH2
COOH
COOH
Störende Nebenreaktion:
Pyruvat + NADH + H+
COOH
LDH
Lactat + NAD+
COOH
COOH
C=O
CH - OH
CH3
CH3
Messung der AST: Analysenablauf
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Die Probe wird zum Reagenz gegeben. Dieses enthält alles was
für die Reaktion notwendig ist im Überschuss, außer eines der
beiden Edukte (α-Ketoglutarat), sodass die Reaktion nicht
ablaufen kann.
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Um eine wichtige Nebenreaktion, welche auch NADH +H+
oxidiert und damit die Messung verfälscht auszuschalten,
enthält das Reagenz größere Mengen an LDH, um diese
Reaktion blitzartig ablaufen zu lassen.
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Nun wird gewartet bis die Extinktion konstant bleibt, welches
anzeigt, das alle Nebenreaktionen vollständig abgelaufen sind.
Messung der AST: Analysenablauf
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Nun wird das fehlende Reagenz (Startreagenz) hinzugegeben
und damit die Reaktion in Gang gesetzt. Es kann nun die
Abnahme der Extinktion (bei 334 nm) über die Zeit gemessen
werden.
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Diese wird in Units/Liter (Volumenaktivität) angegeben.
 Zusammengesetzter optischer Test mit Indikatorreaktion
Enzyme - Nomenklatur
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Die Enzyme Commission (EC)-Nummer beschreibt die Funktion
eines Enzyms. Die ganze Liste befindet sich im „Enzyme
Nomenclature“ [1972] sowie dem „Enzyme Handbook“ und seinen
„Supplements“ (Springer-Verlag).
Die EC-Nummer hat 4 Komponente:
Stelle 1 definiert die Funktion – z.B. 1 = Oxidoreduktasen
Stelle 2 definiert die Donorgruppe – z.B. 1 = CH-OH
Stelle 3 definiert die Akzeptorgruppe – z.B. 1 = NAD(P)
Stelle 4 ist die Enzymnummer innerhalb der Gruppe.
Beispiel: EC 1.1.1.71 = Alkoholdehydrogenase (NAD(P)) oder
Alkohol: NAD(P) Oxidoreduktase
Reaktion Alkohol + NAD(P) = Aldehyd + reduziertes NAD(P)
Enzyme - Einteilung
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Die Hauptgruppen von Enzymen sind:
1. – Oxidoreduktasen (z.B. GLDH, LDH)
2. – Transferasen (z.B. Gamma-GT, AST, ALT)
3. – Hydrolasen (z.B. alkalische Phosphatase, α-Amylase, Lipase)
4. – Lyasen (z.B. Adenylatcyclase)
5. – Isomerasen (z.B. Glucose-6-Phosphat Isomerase)
6. – Ligasen / Synthetasen (z.B. Harnstoff-carboxylase)
Enzyme - Pathophysiologie
•
Enzyme mit physiologischer Funktion im Blut – z.B. Thrombin,
Plasmin, Cholinesterase – zeigen bei Schädigung der
Ursprungszellen einen Abfall der Aktivität im Blut.
•
Enzyme von sekretorischen (exokrinen) Drüsen – z.B.
Pankreasamylase, -lipase – zeigen bei Schädigung der
Ursprungszellen einen Anstieg der Aktivität im Blut.
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Enzyme mit physiologischer Funktion in der Zelle – z.B. LDH, AST,
ALT, CK - zeigen bei Schädigung der Ursprungszellen einen
Anstieg der Aktivität im Blut.
Enzyme – Pathophysiologie
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Das Erscheinen bzw. Verschwinden von Enzymen im bzw. aus dem
Serum kann wichtige Vorgänge im Körper anzeigen.
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Nicht nur die Geschwindigkeit des An- oder Absteigens eines
Enzyms, sondern das Verhältnis von Enzymen zueinander, gibt
zusätzliche Information zu einem Krankheitsverlauf bzw. zur
Effizienz einer Therapie.
 Leitenzyme von Organen
 Halbwertzeit
Leitenzyme wichtiger Organe
• -Amylase - Pankreas und Speicheldrüsen
• ALT – Leber
• AST – Leber, Muskel
• AP– Leber, Knochen, Darm, Niere
• CK – Skelettmuskel, Herz, glatter Muskel
• Cholinesterase – Leber
• GLDH – Leber
• -GT - Leber
• LDH – Leber, Herz, Skelettmuskel, Erythrozyten, Thrombozyten,
Lymphknoten
• Lipase – Pankreas
(nach L. Thomas: Labor und Diagnose; 7. Auflage)
Serumenzyme – Halbwertszeiten
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-GT – 3-4 d
AP – 3-7 d
ALT – 50 h
AST – 12-14 h
CK – 12 h
CK-MB – 10 h
GLDH – 14-18 h
LDH-1 (HBDH) – 4-5 d
LDH-5 – 10 h
(nach L. Thomas: Labor und Diagnose; 7. Auflage)
Serumenzyme – Referenzbereiche für gesunde
Erwachsene – 37 °C
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-GT – M: < 60 U/l; F: < 40 U/L
AP – M: 40–130 U/l; F: 55-105 U/L
ALT – M: < 45 U/L; F: < 34 U/L
AST – M: < 43 U/L; F: < 36 U/L
CK – M: <190 U/L; F: <170 U/L
CK-MB – M: < 24 U/L; F: < 24 U/L
GLDH – M: < 7 U/L; F: < 5 U/L
LDH – M: < 248 U/L; F: < 247 U/L
LDH-1 (HBDH) – M: < 50 U/L; F: < 50 U/L
(nach L. Thomas: Labor und Diagnose; 7. Auflage)
Isoenzyme: multiple Enzymformen
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Einige Enzyme kommen als Isoenzyme vor – das heißt, dass sie die
gleiche Reaktion katalysieren. Sie kommen in verschiedenen
Geweben bzw. Organen vor (unterschiedliche Genloci)
z.B. Typ M und Typ H der Lactatdehydrogenase, die als Tetramer in
5 verschiedenen Isoformen vorkommt.
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Man kann die LDH elektrophoretisch trennen, um das
Herkunftsorgan herauszubekommen.
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LDH-1 kommt überwiegend im Herzmuskel und Erythrozyten, LDH-5
dagegen in der Leber und Skelettmuskulatur vor.
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Die Isoformen sind H4 (LDH-1), H3M (LDH-2), H2M2 (LDH-3), HM3
(LDH-4) und M4 (LDH-5) (H=Herz; M=Muskel)
Enzyme – Messung der Aktivität
Kinetisch-Optischer Test - IFCC Methode
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Die Bestimmung der LDH-Aktivität im Serum.
Reaktion: Lactat + NAD+  Pyruvat + NADH + H+
Messprinzip: Die Zunahme der Extinktion durch das Entstehen des
Coenzyms NADH bei 334 nm im Spektralphotometer.
Als Substrat dient Lactat.
Im Prinzip kann man die Reaktion in die entgegengesetzten
Richtung steuern. Man muss dann Pyruvat im Überschuss haben
und einen anderen pH-Wert einstellen.
NAD+ - Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid - oxidierte Form
NADH – NAD reduzierte Form
Isoenzyme: CK
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Creatinkinase - CK
CK kommt in hoher Aktivität in der Skelettmuskulatur, im Herzmuskel
und im Gehirn
• 3 Isoenzyme: CK-MB (Myokardtyp), CK-MM (Muskeltyp) und CK-BB
(Gehirntyp)
• Skelettmuskelerkrankungen: Rhabdomyolyse, Myositis, progressive
Muskeldystrophie, Polytrauma, Muskeltrauma (inkl. i.m. Injektionen)
• Herzmuskelerkrankungen: akuter Myokardinfarkt (Diagnostik und
Verlaufskontrolle), Kontrolle einer Thrombolysetherapie, Myokarditis
Enzyme – Messung der Aktivität
Zusammengesetzter optischer Test mit Hilfs- und
Indikatorreaktion
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Bestimmung der Creatinkinase (CK) im Serum:
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Reaktion: Enzym Creatinkinase
Creatinphosphat + ADP  Creatin + ATP
Hilfsreaktion: Enzym Hexokinase
ATP + D-Glucose  ADP + D-Glucose-6-Phosphat
Indikatorreaktion: Enzym G-6-P-dehydrogenase
G-6-P + NADP+  6-Phosphogluconat + NADPH + H+
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Messprinzip: Messung der Extinktionszunahme bei 334 nm
(Reduktion des NADP zu NADPH)
IFCC Methode – Creatin Kinase
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Messbedingungen für die CK
Temperatur: 37,0 °C ± 0,1 °C
Wellenlänge: 339 nm ± 1 nm
Bandbreite:  2 nm
Lichtweg (in der Kuvette): 10,00 mm ± 0,01 mm
Inkubationszeit: 180 s
Verzögerungszeit: 120 s
Messinterval: 120 s
Anzahl der Messpunkte: mindestens 6
Enzyme – Messung der Aktivität
Verfahren zur Messung im Bereich des sichtbaren Lichtes
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Bestimmung der alkalischen Phosphatase im Serum:
• Reaktion: p-Nitrophenylphosphat (pNPP)  pNP + PO4
• pNPP ist farblos; pNP dagegen gelb bei pH 10
• Messprinzip: AP katalysiert die Hydrolyse von pNPP bei pH 9,8
unter Zunahme der Farbe (Extinktion) bei 405 nm)
• Kontinuierliche (kinetische) Messung
• Als Cofaktoren werden Mg+2 und Ca+2 benötigt
• EDTA- bzw. Citratplasma können, wegen ihrer komplexierenden
Eigenschaften nicht als Probe benutzt werden.