Lernskript Instrumental Analysis
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Instrumental Analysis Stephanie Negele Eine Zusammenfassung der Vorlesung von Dr. U. Ritgen aus dem 3. Semester der Naturwissenschaftlichen Forensik an der Hochschule Bonn-Rhein-Sieg Sommer 2014 Inhaltsverzeichnis 1 Proteine 1.1 Räumliche Strukturen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1.1 Thermische Zersetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4 5 2 Aminosäuren 2.1 Chemische Struktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Der isoelektrische Punkt pI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1 pKS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 7 9 9 3 SDS-PAGE 3.1 Elektrophoretische Mobilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Das Gel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3 Geräteaufbau und Proteintrennung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 10 11 12 4 Kapillar-Elektrophorese 4.1 Elektroosmotischer Fluss . . . . 4.1.1 Peakveränderung . . . . 4.2 Injektionsmethoden . . . . . . . 4.3 Ionic stacking . . . . . . . . . . 4.4 Kapillaren . . . . . . . . . . . . 4.5 Capillary Zone Electrophoresis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 14 15 16 17 17 17 5 Isoelektrische Fokussierung 5.1 Probenvorbereitung . . . . . . . . . . . 5.1.1 Reinigung . . . . . . . . . . . . . 5.1.2 Homogenisierung . . . . . . . . . 5.1.3 Fällung . . . . . . . . . . . . . . 5.1.4 Zentrifugieren . . . . . . . . . . . 5.1.5 Entsalzung . . . . . . . . . . . . 5.2 Detergentien in der Probenvorbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 20 20 21 22 22 23 24 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Abbildungsverzeichnis 26 Literaturverzeichnis 27 1 Vorwort D iese Zusammenfassung dient als Lernskript zur Prüfungsvorbereitung im Fach Instrumental Analysis des 3. Semesters an der Hochschule Bonn-Rhein-Sieg. Alle Texte und Abbildungen, wenn sie nicht anders gekennzeichnet sind, wurden von mir selbst erstellt. Als Grundlage dient das vom Dozenten Dr. U. Ritgen veröffentlichte Skript zur Vorlesung. Alle Quellen, ob Literatur oder Websiten, sind im Text markiert und können im angefügten Literaturverzeichnis nachgesehen werden. Das Fach steht im Curriculum der Prüfungsordnung von 2008 als Instrumental Analysis, wonach man schließen möchte, dass es hier um die Instrumentelle Analytik geht. Warum dieses Fach so benannt worden ist, konnte uns nicht einmal der Dozent selbst sagen. Thema ist die Einführung in die Biochemie, explizit werden hier Proteine, Aminosäuren und biochemische Trennungsmethoden besprochen. Im nachfolgenden Studienjahrgang wurde das Curriculum bereits entsprechend geändert und dieses Fach mit der Organischen Chemie I zur Biochemie zusammengefasst. Das Fach Instrumental Analysis wird in englischer Sprache gehalten. Da das Lernen und Verstehen mir in meiner Muttersprache jedoch einfacher fällt, habe ich dieses Lernskript in deutscher Sprache verfasst. Die meisten Fachbegriffe sind in beiden Sprachen ähnlich. Wenn es Abweichungen gibt, so werde ich diese entsprechend in den Fußnoten angeben. 2 Kapitel 1 Proteine A lle Lebewesen bestehen aus Molekülen der vier Hauptklassen organischer Verbindungen. Neben den Kohlehydraten, Lipiden und Nucleinsäuren sind dies vor allem die Proteine. Die Proteine unterscheiden sich durch die Art, Anzahl und Reihenfolge der am Aufbau beteiligten Aminosäuren. Diese Reihenfolge der Aminosäuren bestimmt die chemische Struktur der Proteine und damit ihrer biologischen Funktion. Bei Störung der Struktur z.B. durch chemische oder thermische Veränderung der Umgebung kann die Funktion der Proteine gestört werden, was dramatische Folgen für den Organismus haben kann. Eine irreversible Strukturänderung nennt man Denaturierung. Proteine können als Enzyme eingesetzt sein. Im Organismus dienen sie dann als biologischer Katalysator, der beispielsweise die Aktivierungsenergie einer chemischen Reaktion vermindern kann, sodass diese Reaktion mit weniger Energieaufwand ablaufen können. Ein Beispiel für einen solch katalysierendes Enzym ist die Alkohol Dehydrogenase. Ein Protein kann aber auch als Trägerstoff dienen, in dem es sich an ein anderes Molekül bindet. Im Falle des Hämoglobin dient es sowohl als Speicher- als auch Transportmolekül für den Sauerstoff im Blut. Ebenso können Proteine strukturgebend wirken. So können sie (inter-)zellulare Strukturen bilden, wie es beim Collagen der Fall ist. In spezialisierten Zellen sorgen sie für die Muskelkontraktion und die Bewegung von Flagellen, den Geißeln auf der Zelloberlfäche, die der Zellfortbewegung dienen. Im Zellkern sind sie Teil der Biosynthese oder regulieren die Genexpression. Hormone regulieren die biochemischen Aktivitäten anderer Zellen und sind ebenfalls aus Proteinen aufgebaut. Die hochspezialisierten Proteine sind Antikörper, Neurotoxine und Zellgifte, die dramatische Auswirkungen auf andere Zellen haben. Proteine sind sehr große und komplexe Moleküle mit einem großen Molekulargewicht. In der Biochemie wird das Molekulargewicht in Dalton angegeben, was der Atommasse u entspricht. Aminosäuren sind die kleinste Einheit der Proteine und tetraedrisch aufgebaut. Sie sind in ihrer Grundstruktur identisch und unterscheiden sich nur im Aufbau des Restsubstituenten R. Proteinogene1 Aminosäuren sind α-Aminosäuren. Die Aminogruppe (-NH2 ) befindet sich am ersten Kohlenstoffatom neben der Carboxyl-Gruppe (-COOH). Bei der β-Aminosäure befindet sich die Aminogruppe am zweiten Kohlenstoff. 1 Proteinogen: Proteine erzeugend, in der Proteinbiosynthese verwendete Aminosäuren. 3 1.1 Räumliche Strukturen Primärstruktur Die Aminosäuresequenz, also die Anzahl und Reihenfolge von Aminosäuren in einer Kette, bildet die Primärstruktur eines jeden Proteins. Am Anfang dieser Kette steht stets eine freie Aminogruppe (N-terminales Ende) und ihr gegenüberliegend eine freie Carboxylgruppe (C-terminales Ende). Die Anordnung der Substituenten kann in trans und cis-Stellung sein, wobei letztere aufgrund der geringeren Distanz zwischen der Kohlenstoffatome seltener ist. Die Aminosäuresequenz ist spezifisch für jedes Protein. Schon kleinste Änderungen können zu Veränderungen der Eigenschaften und der biologischen Wirksamkeit führen. Die Krankheit der Sichelzellanämie wird durch einen einzigen Aminosäureaustausch in einem einzigen Protein ausgelöst. Zwei Aminosäuren verbinden sich durch Abspaltung von Wasser an den Amino- und Carboxylgruppen. Sekundärstruktur Neben den atomaren Bindungen gibt es noch die Ionen- und Wasserstoffbrückenbindungen, die für die räumliche Struktur eines Proteins verantwortlich sind. Je mehr dieser Bindungen ausgebildet werden können, desto stabiler ist die Sekundärstruktur. Durch die unbewegliche Peptidbindung können nur zwei stabile räumliche Strukturen gebildet werden. Diese Strukturen kommen durch Rotationen um die Peptidbindung zustande. Mit Hilfe von Modellrechnungen hat man alle Winkelkombinationen untersucht und die möglichen und ungünstigen Winkel im sogenannten RamachandranDiagramm dargestellt. Durch diese Einschränkungen in der Rotationsfreiheit ergeben sich nur zwei stabile Strukturen, die α-Helix- und β-Faltblattstruktur. Eine Helix ist eine schraubenförmige Konformation, die zuAbbildung 1.1 – Das Ramachandran Diagramm meist rechtsdrehend auftritt. Die Dipole der Carbonylstellt die erlaubten und verbotenen Winkelgebiete gruppen erstrecken sich alle in gleicher Richtung enteiner Peptidbindungsrotation dar.[4, S. 806] lang der Helixachse, während alle NH-Bindungen entgegengesetzt ausgerichtet sind. So wird eine spannungsfreie und damit stabile Konformation erreicht. Sie wird durch Wasserstoffbrückenbindungen stabilisiert. Einzelne Helixstränge können sich mit weiteren Helices zu einer Tripelhelix vereinen, wie sie im Collagen vorkommt. In der β-Faltblattstruktur ordnen sich die Peptidbindungen wellblechartig an, sodass die Seitenketten abwechselnd auf oder unter der Hauptebene liegen. Legt man zwei entgegenläufige Faltblätter aufeinander, so erhält man eine antiparalelle Faltblattstruktur, die noch immer nach außen hin die Wellblechform behält. Schichtet man weitere Faltblätter auf diese Weise aufeinander, so erhält man eine nach außen hin sehr stabile Tertiärstruktur. Tertiärstruktur Die einzelnen Sekundärstrukturen können im Raum in bestimmter Weise angeordnet werden. Hier sorgen chemische Bindungen zwischen den Substituenten für Stabilität. Von besonderer Wichtigkeit sind die hdyrophoben Wechselwirkungen, die bei der Faltung durch Verdrängung von Wasser entstehen. Die Tertiärstrukturen werden durch Wasserstoffbrückenbindungen, van-der-Waals-Kräfte und 4 Sulfidbindungen2 zusammengehalten. Bei den Proteinen treten teilweise recht komplizierte Tertiärstrukturen auf. Quartärstruktur Die meisten Proteine bestehen aus mehreren Polypetidketten, also aus mehreren Tertiärstrukturen. Die Quartärstruktur kommt durch Wechselwirkungen der Polypeptidketten zustande. Moleküle, die neben Polypeptidketten noch eiweißfremde Bestandteile beinhalten, werden als Proteine bezeichnet. Ihre Benennung erfolgt in Abhängigkeit von ihrem spezifischen Bestandteil. Die Untereinheiten der Quartärstruktur können aus identischen Polypeptidketten bestehen, sind in der Regel jedoch verschieden. Zwei identische Untereinheiten werden Dimer genannt. Die räumliche Struktur der Proteine ist direkt mit ihrer Funktion verknüpft. Die kleinste Änderung in einer dieser vier Strukturen hat Einfluss auf die seine Funktion im Organismus. Polyamid-Ketten sind typische Grundbausteine von Peptiden. Die Kette ohne Substituenten wird Rückgrat 3 des Peptids genannt. 1.1.1 Thermische Zersetzung Durch Erhöhung der Temperatur können Wasserstoffbrückenbindungen zerstört werden, was zu einer Veränderung der räumlichen Struktur führt. In Gegenwart eines Reduktionsreagenten können Sulfidbrückenbindungen in Cysteinverbindungen ebenfalls zerstört werden. Je nach Höhe der Temperaturänderung kann die Denaturierung irreversibel sein. 2 3 Sulfidbindungen treten nur bei Cystein auf. Rückgrat: engl. backbone. 5 Kapitel 2 Aminosäuren I m menschlichen Organismus kommen 20 Aminosäuren vor, von denen 12 vom Organismus selbst synthetisiert werden können. Die verbleibenden acht müssen über die Nahrung zugeführt werden und daher essentiell genannt. Biogene1 Aminosäuren sind α-Aminosäuren mit einem asymmetrischen Kohlenstoffatom, sodass die vier Substituenten verschieden besetzt werden und das Molekül so nicht mehr durch Drehung deckungsgleich gemacht werden kann. Man unterscheidet die Links-(L)-drehenden und Rechts-(D)-drehenden Moleküle. Im Organismus werden jedoch nur die linksdrehenden Aminosäuren für die Proteinsynthese verwendet. In Projektionsformeln steht die Aminogruppe daher immer nach links, wenn die Carboxylgruppe nach oben zeigt. Alle biogenen Ami- Abbildung 2.1 – Aufbau einer Aminosäure. nosäuren haben mit Ausnahme des Glycins mindestens ein chirales C-Atom, was sie optisch aktiv macht. Die Substituenten der Aminosäuren bestehen meist aus unterschiedlichen funktionellen Gruppen mit verschiedenen Ladungen, sodass das Molekül zwar insgesamt neutral geladen ist, jedoch lokale Ladungen aufweist. Aus diesem Grund nennt man diese Moleküle in wässriger Lösung ZwitterioAbbildung 2.2 – Chemische Zustände in Abhängigkeit vom pH-Wert nen. Sowohl die Carboxylgruppe und am Isoelektrischen Punkt.[8, S. 48] als auch die Aminogruppe sind ionisierbar. Je nach der chemischen Umgebung treten die Substituenten als Kation oder Anion auf. Bei einem bestimmten pH-Wert der umgebenden Lösung existieren gleich viele negativ geladene Carboxylgruppen wie positiv geladene Aminogruppen. Bei diesem Isoelektrischen Punkt wandern Aminosäuren im elektrischen Feld nicht mehr, da ihre Ladungen sich gegenseitig ausgleichen. Dieser Effekt wird bei der Elektrophorese (Kapitel 4) genutzt. 1 Biogen: auch manchmal als organogen bezeichnet bedeutet biologischen oder organischen Ursprungs oder durch Lebewesen entstanden. Hier sind die nichtessentiellen Aminosäuren gemeint, die also vom Organismus selbst synthetisiert 6 werden können. 2.1 Chemische Struktur Die Substituenten lassen sich nach ihrer biochemischen Wirkung in vier Gruppen einteilen: • Hydrophobe Seitenkette: bestehend nur aus Kohlenwasserstoffen. Sie bilden den hydrophoben2 Kern der Proteine. Die Aminosäuren sind in diesem Falle nach außen hin neutral. • Hydrophile Seitenkette: enthalten elektronegative Atome wie O, S, N oder Se. Sie können aufgrund ihrer Polarität Wasserstoffbrückenbindungen bilden und erzeugen so die Tertiärstruktur (s. 1.1). • Saure Aminosäuren: zusätzliche Carboxylgruppe an der Seitenkette. Durch die polare Seitengruppe sind diese Aminosäuren hydrophil. • Basische Aminosäuren: zusätzliche Aminogruppe an der Seitenkette. Auch diese Aminosäuren sind hydrophil. Die Aminosäuren können somit anhand der Eigenschaften ihrer Substituenten klassifiziert werden. Es wird entsprechend nach den Wirkungen der Polarität der Seitenketten eingeteilt. Zu den neutralen hydrophoben Aminosäuren zählen Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, welche alle Kohlenwasserstoffketten als Substituenten haben. Neben diesen Aminosäuren sind aber auch Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan mit den aromatischen Seitenketten neutral und hydrophob. Basisch und damit hydrophil sind Histidin, Lysin und Arginin, die alle eine zusätzliche Aminogruppe haben. Die einzigen sauren und damit hydrophilen Aminosäuren sind Aspartat und Glutamat, welche beide eine zusätzliche Carboxylgruppe haben. Die Derivate3 dieser sauren Aminosäuren, Asparagin und Glutamin, haben eine zusätzliche Aminogruppe an Abbildung 2.3 – Die Entstehung einer der Carboxylgruppe sodass sie zwar hydrophil sind, aber neu- Peptidbindung. [8, S. 49] tral geladen sind. Prolin nimmt aufgrund seiner Eigenschaft als sekundäre4 Aminosäure eine Sonderstellung ein. Es ist neutral und damit hydrophob. Tyrosin, Serin und Threonin haben eine Hydroxylgruppe, Methionin und Cystein enthalten Schwefel. Die -HN-CO-Bindung zwischen zwei Aminosäuren wird Peptidbindung genannt, weshalb Proteine auch häufig Peptide genannt werden. Unter Abspaltung von Wasser reagieren zwei Aminosäuren miteinander und verbinden sich zwischen der Aminogruppe der einen und der Carboxylgruppe der anderen Aminosäure. Eine Besonderheit bildet das schwefelhaltige Cystein, welches sich durch Oxidation mit einem anderen Cysteinmolekül verbinden. Dabei werden zwei Wasserstoffatome abgespalten, sodass Disulfidbrücken entstehen können. Diese doppelten Cysteinmoleküle werden häufig als Cystin bezeichnet. Durch posttranslationale Modifikation5 können nachträglich Hydroxyl-, Carboxyl- oder Acetylgrup2 Hydrophob: Wasserabweisend. Derivat: abgeleiteter Stoff von ähnlich chemischer Struktur des Grundstoffs. 4 Sekundär: Das Stickstoffmolekül hat zwei Bindung zu Kohlenstoffen und ist damit sekundär. 3 7 Abbildung 2.4 – Die 20 biogenen α-Aminosäuren. [8, S. 51] pen angefügt werden. Ein Molekül aus zwei Aminosäuren wird Dipeptid genannt, zwischen 2 und 9 Aminosäuren nennt man die Proteine Oligopeptide und alle größeren Proteine werden zu den Polypeptiden zusammengefasst. Die meisten Proteine gehören den Polypeptiden an, da sie meist aus hunderten oder sogar tausenden Aminosäuren aufgebaut sind. Aufgrund der Multiplizität der Aminosäuren in Proteinen werden in der Beschreibung der Zusammensetzung von Proteinen häufig Buchstabencodes als Abkürzung für die vorkommenden Aminosäuren verwendet. Biochemiker verwenden in der Regel den Code aus drei Buchstaben, wie er in Abbildung 2.4 auch dargestellt ist. Genetiker verwenden hingegen häufig die Abkürzung mit nur einem Buchstaben. 5 Posttranslationale Modifikation: chemischer Veränderung eines oder mehrerer Substituenten einer Aminosäure nach der Synthese. 8 2.2 Der isoelektrische Punkt pI 2.2.1 pKS Die Säurekonstante KS ist eine Stoffkonstante, die angibt, in welchem Verhältnis ein Stoff in Wasser dissoziiert. Je stärker die Säure, desto größer die Dissoziation. Große KS -Werte spiegeln ein hohes Maß an Dissoziation wieder. Der pKS -Wert ist der negative dekadische Logarithmus und beschreibt die Stärke der Säure im antiproportionalen Verhältnis. Kleine pKS -Werte stehen für starke Säuren. Entsprechend gilt dies für den gegenläufigen pKB -Wert, der das Bestreben der Base beschreibt, Protonen aufzunehmen. Je kleiner der pKB -Wert, desto stärker ist die Base. Beide pK-Werte können ineinander umgerechnet werden, in dem sie von 14 subtrahiert werden. Definition: Der isoelektrische Punkt ist der pH-Wert einer Lösung, bei dem sich die positive und negative Ladung eines Ampholyten oder Zwitterion (Aminosäure, Protein) gegenseitig ausgleichen. Er ist für jede Aminosäure bzw. jedes Protein charakteristisch.[2] Jede funktionelle Gruppe einer Aminosäure hat einen anderen pKS -Wert, sodass der isoelektrische Punkt bei jeder Aminosäure und somit auch bei jedem Protein anders ist. Der basische Teil liegt protoniert vor, der saure Teil hingegen unprotoniert, wodurch das Molekül zwar lokale Ladungen aufweist, insgesamt aber ungeladen vorliegt, da sich alle Teilladungen ausgleichen. Unterhalb des isoelektrischen Punktes liegt das Molekül positiv geladen vor, da die basischen Gruppen protoniert werden und die sauren Gruppen unverändert vorliegen. Überhalb des isoelektrischen Punktes hingegen liegt das Molekül negativ geladen vor. Die basischen Gruppen liegen ungeladen vor, während die sauren Gruppen deprotoniert werden und die negative Ladung bestimmen. Unter physiologischen Bedingungen liegt der pH-Wert etwa bei 7. In diesem Bereich liegen die meisten isoelektrischen Punkte der Aminosäuren, sodass sie in Form von Zwitterionen, sowohl positiv als auch negativ geladen vorliegen und nach außen hin keine Ladung zeigen. Histidin bildet hier eine Ausnahme, da es seinen isoelektrischen Punkt erst bei 7,59 hat. Für Aminosäuren gilt: 1 pHpI = · (pKSCarboxyl + pKSAmino ) (2.1) 2 Man bildet den Mittelwert aus den pKS -Werten der Carboxyl- und Aminogruppen. Der pI lässt sich experimentell ebenso durch Titration bestimmen. Bei Aminosäuren mit mehreren Amino- oder Carboxylgruppen werden die Konstanten der stärksten Gruppen für die Berechnung verwendet. 9 Kapitel 3 SDS-PAGE D ie Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamid Gelelektrophorese ist eine zweidimensionale Gelelektrophorese. Proteine werden bei diesem Verfahren entsprechend ihrer Molmasse aufgetrennt. Durch Inkubation mit dem Detergens DTT1 werden die Disulfidbrücken reduziert, wodurch das Protein denaturiert und dissoziiert. SDS bindet nun an die hydrophoben Regionen der Proteine (z.B. CH3 ). Durch diese Bindung werden die Proteine alle in den gleichen Ladungszustand gebracht, da das stark negativ geladene SDS alle anderen Ladungen maskiert oder überlagert. Proteine sind zunächst einmal aus den 20 verschiedenen Aminosäuren aufgebaut. Sie unterscheiden sich in ihrer Struktur, Funktion und Eigenschaften voneinander. Im vorigen Kapitel haben wir bereits besprochen, dass die Aminosäuren je nach ihren Substituenten verschiedene Ladungen haben können. Dies resultiert in einer Nettoladung des gesamten Proteins. Zusammen mit seiner Molekularen Masse und der Konformation beeinflussen diese Faktoren die Wanderungsgeschwindigkeit in einem elektrischen Feld. Diese Tatsache nutzt man in der Gelelektrophorese, bei der man die Analyten in einer Gelmatrix platziert und ein elektrisches Feld durch eine Anode und Kathode erzeugt. So kann man die molekulare Masse der Proteins oder den Reinheitsgrad einer Proteinpräparation bestimmen. Zur Auftrennung von Proteinmischungen verwendet man heute die effizienteren Chromatographiemethoden. Bei der nativen Gelelektrophorese wird kein SDS hinzugegeben, sodass die Auftrennung nach molekularer Masse, Konformation und Ladung geschieht. Dadurch sind die Proteine zwar nicht miteinander vergleichbar, erhalten jedoch ihre Aktivität und erfahren keine Konformationsänderung. Für die Bestimmung der molekularen Masse ist dieses Verfahren daher nicht geeignet. Nach dem Prozess der Wanderung im Gel werden die aufgetrennten Proteine angefärbt, um sie sichtbar zu machen. 3.1 Elektrophoretische Mobilität Die Elektrophoretische Mobilität µ beschreibt die Wanderungsgeschwindigkeit u von Ionen in einem elektrischen Feld und wird wie folgt berechnet: u=µ·E 1 DTT: Dithiothreitol, auch Clelands Reagenz 10 (3.1) V Elektrische Feldstärke [ m ] Wanderungsgeschwindigkeit [ m s] 2 Elektrophoretische Mobilität [ Vm·s ] E u µ Die Ionen wandern mit konstanter Geschwindigkeit durch das elektrische Feld. Die Elektrophoretische Mobilität ist charakteristisch unter konstanten Pufferbedingungen für jeden Analyten. Mit zunehmender Spannung oder elektrischer Feldstärke steigt die Wanderungsgeschwindigkeit: E= U Ltotal U Ltotal (3.2) angelegte Spannung [V] Länge des elektrischen Felds (Distanz zwischen Kathode und Anode) [m] Die elektrophoretische Mobilität ist abhängig von der Masse, Ladung und der Konformation des Analyten im Raum. 3.2 Das Gel Für die Elektrophorese von Proteinen werden hauptsächliche Gele aus dem vernetzen Polymer Polyacrylamid verwendet. Dieses Gel wirkt wie eine Art Molekularsieb, sodass die Proteine etwa proportional zu ihrer molekulaAbbildung 3.1 – Chemische Struktur des Sodium Dodecyl ren Masse bei der Wanderung durch das Gel Sulfate. [7, Vorlesung 2, Folie 1] zu bevorzugten Ladungsquelle behindert werden. Je größer die Proteine also sind, desto langsamer wandern sie im elektrischen Feld. Sollen die Proteine aber nur nach der Größe und nicht nach ihrer Ladung getrennt werden, so setzt man das Detergens Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) hinzu. Das Detergens bindet sich proportional zur Anzahl der Aminosäuren im Protein an die unpolaren Bindungsstellen. Ein Molekül SDS bindet etwa an zwei Aminosäuren. Da das Molekül negativ geladen ist, wird das Protein, an das SDS bindet aufgrund der zahlreichen SDS-Bindungen stark negativ geladen. Durch die Zerstörung der intramolekularen Bindungen erhalten alle Proteine eine ähnliche Konformation2 . Durch den Vergleich mit einem Proteinstandard lassen sich dann die aufgetrennten Proteine identifizieren. Die am häufigsten verwendete Methode bei der Gelelektrophorese ist das SDS-PAGE-System nach Laemmli, bei dem ein diskontinuierliches System aus zwei Gelen eingesetzt wird. Im Sammelgel (engl. stacking gel) mit einem größeren Porendurchmesser werden die Proben zunächst konzentriert, bevor sie im Trenngel (engl. separation gel) aufgetrennt werden. Abbildung 3.2 – Polymerisation von Dies führt zu schärferen Banden und erlaubt größere Pro- Acrylamid und Methylenbis(acrylamid) zu benvolumina als bei der herkömmlichen Methode mit nur einem Polyacrylamid-Gel.[5] einem Gel. 2 Konformation: räumliche Anordnung der drehbaren Bindungen der Substituenten. 11 Die Funktion des Sammelgels zu Beginn der Elektrophorese ist die Konzentrierung der Proben in einem möglichst schmalen Streifen. Das Pufferion in allen Zonen ist Tris3 , eine Verbindung, die entweder neutral oder positiv geladen vorliegen kann. Das Gegenion zur Ladungsausgleichung ist Chlorid. In den Elektrodenkammern puffert man mit Glycin, das bei einem pH von 6,8 schwach negativ geladen vorliegt, bei pH 8,3 und 8,6 jedoch seine negative Ladung verstärkt. Der chloridhaltige Puffer des Sammelgels wird auch zum Auflösen der Probe verwendet. Wird nun die Spannung angelegt, wandern die Glycin-Anionen aus der oberen Kathodenkammer in Richtung Sammelgel. Im Sammelgel verlieren sie durch den niedrigeren pH-Wert ihre Ladung nahezu vollständig und werden ausgebremst. Gleichzeitig wandern die Chloridionen in Richtung Anode. Zwischen den wegwandernden Chloridionen und den ausgebremsten Glycin-Anionen entsteht so eine Zone, in der kaum Ionen vorliegen, wodurch die Leitfähigkeit in diesem Bereich sehr gering ist. Diese Zone mit einem hohen elektrischen Widerstand wandert nun durch die Probenzone und das Sammelgel. Der gesamte Probeninhalt konzentriert sich in dieser wenigen Mikrometer breiten Zone. Erreicht diese nun das Trenngel, ändert sich der pH-Wert und die Glycin-Anionen werden wieder stärker negativ geladen, sodass sie die Proben überholen und zusammen mit den Chloridionen in Richtung Anode wandern. Die Proben treffen auf die feinen Poren des Trenngels und werden ihrer Größe entsprechend zurückgehalten. Das Gel besteht in der PAGE in der Regel aus Acrylamid und N,N’-Methylenbis(acrylamid). Die Porengröße ist dabei variabel und hängt vom Mischungsverhältnis der beiden Substanzen ab. Normalerweise liegt sie Polyacrylamid-Konzentration zwischen 3-15%. Etwa 5% vom Acrylamid-Anteil entspricht dem Bisacrylamid-Anteil. Mit einem solchen Gel lassen sich Proteine zwischen 20 und 250 kDa trennen. 2In Gegenwart von freien Radikalen (SO4 ), die durch Tetramethylendiamin (TEMED) stabilisiert werden, wird die Polymerisation der beiden Komponenten initiiert. In manchen Fällen wird auch ein Agarose Gel eingesetzt, welches aus Polysacchariden aufgebaut ist. Es ist bei Erwärmung wasserlöslich und bildet bei Abkühlung ein Gel mit relativ großen Poren. Analyten mit einem Molekulargewicht über 100kDa werden mit diesem Gel untersucht. Es ist nicht giftig und daher in der Handhabung leichter als Polyacrylamid. 3.3 Geräteaufbau und Proteintrennung Das Polyacrylamid-Gel befindet sich zwischen zwei Glasplatten und wird in eine Pufferlösung gestellt. Die mit SDS vorbehandelten Proben werden in die mit einem Gelkamm vorher geformten Taschen im Gel injiziert. Anschließend wird eine elektrische Spannung an beiden Pufferreservoiren angelegt, sodass im Polyacrylamid-Gel ein elektrisches Feld entsteht. Durch das SDS sind alle Proteine annähernd gleich negativ geladen, sodass sie alle in Richtung der positiven Spannung im unteren Reservoir wandern möchten. Die Poren im Gel behindern die Proteine bei ihrer Wanderung, sodass sie entsprechend ihrer Größe aufgetrennt werden. Im unteren Teil der Abbildung sieht man ein schematisches Gel, bei dem die Proteine bereits angefärbt sind. Es entsteht ein Bandenmuster. Am unteren Ende des Gels befinden sich die kleinsten Proteine, da sie am wenigsten Behinderung durch das Gel erfahren. Nach der Auftrennung im Gel werden die Proteinbanden in den meisten Fällen durch Färbung sichtbar gemacht. Coomassie und Silber sind die häufigsten Färbungsmethoden zur Detektion von Proteinen. Die Anwendung der Methoden hängt von der zur Verfügung stehenden Zeit, der benötigten Sensitivität und der weiteren Verwendung des Gels nach der Färbung ab. Viele Farbstoffe binden bevorzugt an 3 Tris: Abkürzung für Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan. 12 positiv geladene Aminosäuren, sodass Proteine mit vielen dieser Aminosäuren stärker gefärbt werden als andere. Diese Methoden sind für die quantitative Auswertung daher ungeeignet. Bei der CoomassieFärbung ist die Intensität proportional zur Proteinkonzentration. Für die Färbung wird das Gel fixiert, da die Färbungsreaktion nur im sauren Millieu stattfinden kann. Dafür werden die Proteine im Gel denaturiert und anschließend mit der Färbelösung inkubiert. Nicht gebundener Farbstoff kann mit dem Fixierungsmittel entfernt werden, sodass nur die Banden angefärbt werden und das Gel mehr oder weniger durchsichtig ist. Polypeptide mit vielen basischen Resten werden verstärkt angefärbt. Untersucht man eine unbekannte Mischung von Proteinen, gibt man einen Standard in eine Geltasche und erstellt anhand der Wanderungsstrecke eine Kalibrierkurve, in der die Wanderungsstrecke proportional zur logarithAbbildung 3.3 – Geräteaufbau der SDS-PAGE. a) Gelek- mierten molekularen Masse ist. In der Praxis trophorese Kammer. b) Entwickeltes, gefärbtes Gel.[6] misst man in diesem Falle den Abstand von der Oberkante des Gels zur Bande. Die erhaltene Kurve aus den Banden des Standards ergibt eine Gerade bis hin zu einer leicht sigmoiden4 Kurve. Anschließend misst man die Wanderungsstrecke und kann anhand der Kalibrierkurve die Proteinmasse auf der y-Achse ablesen. Bovine Serum Albumin Albumin ist ein globuläres5 Protein, das im menschlichen Organismus für die Aufrechterhaltung des kolloidosmotischen6 Drucks. Außerdem kann das Protein die Wasserlöslichkeit von Stoffen erhöhen, in dem es sie reversibel bindet. Albumine haben eine Molekülmasse von etwa 66 kDa und bestehen aus 584-590 Aminosäuren. Durch einen hohen Cysteinanteil haben diese Proteine einen relativ hohen Schwefelgehalt. Sie können als Ampholyte7 sowohl Kationen als auch Anionen reversibel binden. Das Rinderalumin (Bovine Serum Albumin) wird in der Forschung vor allem in der Immunologie eingesetzt. Es besteht aus zwei Untereinheiten und wird daher als Dimer bezeichnet. Da das Molekulargewicht der beiden Monomere nahezu identisch ist, lassen sie sich anhand der SDS-PAGE-Methode nicht identifizieren. 4 Sigmoid: S-förmige Kurve. Globulär: annähernd kugelförmige Tertiar- und Quartiärstruktur. 6 Kolloid: kleinste Teilchen oder Tröpfchen in einer Lösung. Die Teilchen sind nur wenige Nano- oder Mikrometer groß. Die Blutgefäße sind für diese Kolloide unterschiedlich durchlässig, wodurch Druckunterschiede auftreten können. Diese werden durch Albumin und Globuline reguliert. 7 Ampholyt: je nach chemischer Umgebung sind diese Stoffe sauer oder basisch. Sie können sowohl Protonen aufnehmen als auch abgeben. 5 13 Kapitel 4 Kapillar-Elektrophorese L egt man ein elektrisches Feld an einer wässrigen Lösung mit Ionen an, so kann man eine Wanderung der Ionen zu den bevorzugten Ladungsquellen beobachten. Die Wanderungsgeschwindigkeit hängt von der Größe der geladenen Teilchen, ihrer Ladung und Masse ab. Dieses Prinzip ist grundlegend für die Elektrophorese und wurde bereits im vorigen Kapitel besprochen. Ein großes Problem in der Elektrophorese stellt die Joul’sche Wärmeentwicklung dar. Sie entsteht durch die Ionenbewegung, bei der molekulare Reibungsenergie in Form von Wärme freigesetzt wird. Dadurch kann in einer Kapillare ein Temperaturgradient zwischen dem Lösungsinneren und der Kapillarwand entstehen. Dadurch entstehen unkontrollierbare Kovektionsströmungen. Die warmen Teilchen strömen nach außen hin, kühlen sich ab und strömen wieder ins Kapillarinnere. Dadurch vermischen sich bereits getrennte Ionen wieder. Die Joul’ sche Wärme tritt bei allen Elektrophorese-Methoden Abbildung 4.1 – Schematisierte Messapperatur für auf, daher müssen die verwendeten Gele in der Redie Kapillar-Elektrophorese. [1] gel gekühlt werden, damit sie nicht austrocknen. Um diese Problematik zu umgehen, ohne Gele einzusetzen, wurden Kapillaren entwickelt, die mit Elektrolyten gefüllt wurden. Wegen des großen Verhältnisses von Oberfläche zu Volumen konnte die entstehende Wärme effizient abgeführt werden, wodurch der thermische Einfluss durch die Konvektionsströmung minimiert wurde. Durch die Transparenz der eingesetzten Quarzkapillaren ist eine UV-Detektion möglich. 4.1 Elektroosmotischer Fluss Die Elektrophoretische Mobilität µ wurde bereits im Kapitel 3.1 besprochen. Sie beschreibt die charakteristische Ionenbeweglichkeit, die vom Lösungsmittel und dem Ion selbst abhängig ist. 14 Die Elektrophorese, also die Wanderung von Ionen in einem elektrischen Feld, bewirkt letztendlich auch den Fluss der gesamten Pufferlösung im elektrischen Feld. Diese Bewegung wird als Elektroosmotischer Fluss (EOF) bezeichnet. Er überlagert die elektrophoretische Wanderung der Ionen. Die Oberfläche der Kapillare besteht aus Siliciumdioxid, welches deprotoniert und damit negativ geladen vorliegt. Positiv geladene Elektrolytteilchen lagern sich bevorzugt daran an. Legt man nun längs der Kapillare ein elektrisches Feld an, werden die beweglichen Kationen in der Mitte der Kapillare in Richtung der negativ geladenen Elektrode gezogen. Durch den geringen Durchmesser der Kapillare ziehen die Kationen die umgebenden Lösungsmittelmoleküle in die gleiche Richtung mit. Dadurch entsteht ein sehr flaches Flussprofil wodurch die Bandenverbreiterung minimiert wird. Die Lineargeschwindigkeit des EOF uEOF bestimmt die Zeit, die benötigt wird, die Länge der Kapillare zu durchfließen. Sie berechnet sich wie folgt aus der effektiven Kapillarlänge Lef f , der Distanz zwischen dem Kapillarinlet und dem Detektor, und der Zeit tm , die bis zum Erreichen des Detektors vergangen ist. Lef f uEOF = µ · E = (4.1) tm Zusammen mit der Gleichung 3.2 für die Elektrische Feldstärke E erhalten wir die Gleichung für die Elektrophoretische Mobilität in der Kapillare: µ= Lef f Ltotal U t z η r Lef f · Ltotal z = U ·t 6·π·η·r (4.2) Distanz zwischen Kapillarinlet und Detektor Distanz zwischen Kapillarein- und -ausgang. angelegte Spannung Zeit bis zum Erreichen des Detektors Ionenladung Viskosität der Lösung Ionenradius Kleine, stark geladene Teilchen wandern damit schneller als große, schwach geladene Teilchen. Die Unterschiede in der elektrophoretischen Mobilität ermöglichen die Trennung von verschiedenen Analyten in einer Lösung. Positiv geladene Teilchen wandern schneller als der EOF, da sie besonders stark von der Kathode angezogen werden. Negativ geladene Teilchen bestreben eigentlich entgegen der Flussrichtung zu wandern. Der EOF zieht sie aber dennoch in Richtung der Kathode. Ihre Migrationsgeschwindigkeit ist deutlich geringer als der EOF. Ungeladene Teilchen wandern einfach mit dem EOF, sie werden von der Kathode weder an- noch abgestoßen. Dafür werden sie auch kaum voneinander getrennt. Da der EOF von der Ladungsdichte der Silanolgruppen an der Kapillarwand abhängig ist, ist er somit auch pH-abhängig, da die Ladungsdichte bei hohen pH-Werten größer ist als bei niedrigen. Bei hohen pH-Werten ist die Lineargeschwindigkeit höher. Ebenso hängt der EOF von der Ionenstärke des Puffers ab. Mit steigender Ionenstärke verringert sich die Doppelschicht an der Kapillarwand, wodurch der EOF verringert wird. 4.1.1 Peakveränderung Die Ionenkonzentration ist in der Probenzone höher als in der Pufferzone. Dadurch entsteht eine geringere Feldstärke wodurch sich die Wanderungsgeschwindigkeit vermindert. Die Analyten bewegen sich in der Pufferzone damit schneller als in der Probenzone. Dadurch entsteht ein steil ansteigender 15 und flach abfallender Peak im Elektropherogramm. Diese Peakform nennt man Fronting. Ist die Leitfähigkeit in Puffer- und Probenzone identisch, entstehen gaussförmige, symmetrische Peaks. Ebenso kann es passieren, dass die Leitfähigkeit in der Probenzone geringer ist als in der Pufferzone. Die Feldstärke ist größer, die Wanderungsgeschwindigkeit nimmt zu, sodass die Analyten in der Probenzone schneller migrieren als in der Pufferzone. Dies äußert sich im sogenannten Tailing. Es ist daher entscheidend, auf die Leitfähigkeit des Puffers zu achten. Sie sollte der der Probenlösung entsprechen, um unsymmetrische Peaks zu vermeiden. 4.2 Injektionsmethoden Die Probenaufgabe gestaltet sich in der Kapillar-Elektrophorese deutlich komplizierter als in der GelElektrophorese. Hier dürfen nur 0,5-50nL injiziert werden, damit die Bandenverbreiterung möglichst gering bleibt. Die in der HPLC eingesetzten Injektoren können aufgrund des geringen Durchflussvolumens der Kapillare nicht verwendet werden. Stattdessen verwendet man elektrokinetische, hydrodynamische oder hydrostatische Injektionsmethoden. Sie erlauben eine reproduzierbare Probeninjektion. Hydrostatische Injektion Bei der hydrostatischen Injektion wird eine Druckdifferenz durch das Anheben des Probengefäßes erzeugt. Durch die Schwerkraft bestrebt die Flüssigkeit dann in das tieferliegende Gefäß zu strömen. Dies nennt man den Siphoneffekt. Die Probenlösung wird in die Kapillare gesaugt. Die aufgegebene Probenmenge V ist von der Höhendifferenz ∆h, der Injektionsdauer t und den hydrodynamischen Eigenschaften Viskosität η und Dichte ρ abhängig. V = π · ∆p · d4 · t 128 · Ltot · η (4.3) Hier sind d der Innendurchmesser der Kapillare und Ltot die Gesamtlänge der Kapillare. ∆p berechnet sich aus: ∆p = ρ · ∆h · g (4.4) mit g als Erdbeschleunigung. Hydrodynamische Injektion Die Probenaufgabe erfolgt hier durch das Anlegen einer Druckdifferenz. Diese wird hier nicht durch eine Höhendifferenz sondern durch einen Überdruck auf der Probenseite oder ein Vakuum auf der Detektionsseite erzeugt. Die Berechnung des Probenvolumens erfolgt nach obriger Gleichung 4.3. Für diese Injektion ist ein druckstabiles Probengefäß notwendig. Außerdem muss die Temperatur konstant gehalten werden, da sonst nicht kontrollierbare Druckschwankungen auftreten aufgrund der Viskositätsveränderungen. Das Ansetzen eines Vakuums ist weniger präzise als die Erzeugung des Überdrucks. Dafür sind die Anforderungen an die Apperatur geringer. Elektrokinetische Injektion Nach dem Eintauchen der Kapillare in das Probengefäß wird ein elektrisches Feld angelegt, durch das geladene Analyten in die Kapillare gelangen. Die Wanderungsgeschwindigkeiten und damit auch die injizierten Probenmengen variieren untereinander. Sie sind konzentrationsabhängig und setzen sich aus den elektrophoretischen Mobilitäten und dem elektroosmotischen Fluss zusammen. Das Probenvolumen berechnet sich entsprechend: V = (µEP + µ0 ) · π · d2 · t · U · ci L 16 (4.5) µEP µ0 d U ci t elektrophoretische Mobilität des Analyten elektroosmotische Mobilität Innendurchmesser der Kapillare angelegte Spannung molare Konzentration des Analyten Zeitdauer der angelegten Spannung Das Probenvolumen hängt somit stark von der Probenzusammensetzung ab. 4.3 Ionic stacking Das Ionic stacking ist eine Aufkonzentrierung der Probe, um die geringe Detektionsleistung in der 1 Kapillar-Elektrophorese auszugleichen. Dafür wird die Leitfähigkeit in der Probenzone auf etwa 10 des Puffers herabgesetzt. Dadurch steigt die Feldstärke in der Probenzone, die Migrationsgeschwindigkeit nimmt zu und der Peak wird schärfer. 4.4 Kapillaren Die Kapillaren müssen widerstandsfähig gegenüber den verwendeten Chemikalien sein und müssen eine gewisse Transparenz für die UV-Detektion haben. Sie sollen robust, zugleich flexibel und preiswert sein. In der Kapillar-Elektrophorese haben sich die polyimid-beschichteten Quarzkapillaren durchgesetzt. Diese Beschichtung muss für die UV-Detektion an der Detektionsstelle entfernt werden. Vor der Anwendung müssen die Kapillaren mit einem sauberen, senkrechten Schnitt präpariert werden, um eine gleichmäßige Probeninjektion zu garantieren. Durch die Produktion können sich noch störende Partikel und Substanzen in der Kapillare befinden. Daher ist eine mehrmalige Spülung mit Methanol notwendig. Anschließend wird mit NaOH nachgespült, um die Silanolgruppen auf der Kapillarinnenoberfläche zu aktivieren. Vor der Probenaufgabe wird mehrmals mit der eingesetzten Pufferlösung gespült um ein Gleichgewicht auf der Innenoberfläche zu erzeugen. Um die bereits eingangs besprochene Joule Wärme zu verringern wird die Kapillare gekühlt. Geringe Kapillardurchmesser sorgen für eine weitere Verringerung der Joule Wärme. Die Optimierung der angelegten Spannung ist ebenso notwendig wie die möglichst geringe Leitfähigkeit des Puffers. 4.5 Capillary Zone Electrophoresis Die Kapillar-Zonen-Elektrophorese (CZE) ist das häufigst eingesetzte Verfahren zur Trennung von Ionen. Die Trennung erfolgt in elektrolytgefüllten Kapillaren aufgrund von unterschieden in der Mobilität der Analyten. Das Trennverfahren ist anwendbar bei Aminosäuren, Peptiden und kleine bis mittlere geladene Moleküle und Ionen. Bei der normalen Kapillar-Elektrophorese erfolgt die Probeninjektion auf der Anodenseite, die Detektion auf der Kathodenseite. Die im Analyten vorkommenden Anionen wandern entgegen des EOFs, was für die Detektion problematisch werden kann. Anionen mit einer hohen elektrophoretischen Mobilität können den Detektor gar nicht erreichen, sodass sie mit diesem Verfahren nicht nachweisbar sind. Durch Umpolung der Spannungsquelle können auch diese Anionen bestimmt werden, jedoch wandern die langsamen Anionen nach der Injektion wieder ins Kathodengefäß zurück und liegen gar nicht in der Kapillare vor. Will man nun also sowohl schnelle als auch langsame Anionen detektieren, so muss der EOF unterdrückt und umgepolt werden. Dies geschieht durch Zugabe von Kationentensiden, die an 17 die Silanolgruppen binden, sodass die Oberfläche nun positiv geladen ist. Der EOF fließt in Richtung Anode und die mitfließenden Anionen können getrennt werden. Die Trennung erfolgt auch hier wieder aufgrund von Mobilitätsdifferenzen wie auch bei der normalen Kapillar-Elektrophorese. Ähnlich wie in der RP-Chromatographie gibt es auch in der CZE inverse Kapillarbeschichtungen, die bereits mit Kationen beschichtet sind, sodass die Oberfläche eine positive Ladung aufweist. Eine Umpolung durch einen Puffer ist dann nicht mehr nötig. Die Trennung ist auch hier wieder stark vom pH-Wert des Puffers abhängig, da dieser den EOF und damit die Selektivität der Trennung beeinflusst. 18 Kapitel 5 Isoelektrische Fokussierung D ie Isoelektrische Fokussierung (IEF) ist ein elektrophoretisches Trennverfahren, mit dem man zwitterionische und amphotere Proteine und Peptide trennen kann, wenn sich diese in ihrem isoelektrischen Punkt (pI) unterscheiden. Das Verfahren liefert ähnlich wie die Kapillar-Elektrophorese hochauflösende Elektropherogramme, da auch dieses Verfahren mit Kapillaren durchgeführt werden kann. Eine Anwendung im Flachbett ist jedoch ebenso möglich. Zur Trennung nach pI-Werten ist ein pH-Gradient im Bett nötig, den die Analyten durchwandern. An einem bestimmten pH-Wert liegt die amphotere Substanz nach außen hin elektrisch neutral geladen vor und wandert nicht mehr im elektrischen Feld. In der Kapillare erzeugt man diesen pH-Gradienten durch unterschiedliche Verhältnisse von Aminocarbonund Carbonsäuren. Je nach Art der verwendeten Ampholyte können unterschiedlich große pH-WertBereiche abgedeckt werden, wodurch eine relativ genaue Anpassung an das Trennproblem möglich ist. Nachdem das elektrische Feld angelegt wurde ordnen sich die Ampholyte entsprechend ihrer pI-Werte an, wodurch sich ein stabiler pH-Gradient (IPG) über die gesamte Trennstrecke bildet. Die Analyten wandern zu dem von ihnen bevorzugten pH-Wert-Bereich und bleiben dort aufgrund ihrer elektrisch neutralen Ladung dort stehen. Dadurch bilden sie eine schmale stabile Zone, der aufgrund der fokussierenden Eigenschaft des pH-Gradienten entsteht. Eine Bandenverbreiterung durch Diffusion findet somit nicht statt, da die fokussierten Analyten bewegungsunfähig sind. In der Flachbett-IEF geschieht die Detektion nach der Auftrennung durch Anfärben. In der Kapillar-IEF können sie elektrokinetisch durch den EOF oder durch Anlegen einer Druckdifferenz am Detektor vorbeigeführt werden. Die einfachste Form der Isoelektrischen Fokussierung ist die Verwendung eines pH-Papiers, das einen pH-Gradient an der Oberfläche fixiert hat. Im Flachbett werden in der Regel Polyacrylamid-Gele eingesetzt, wie sie auch in der Gelelektrophorese vorkommen. Die bereits erwähnten Aminocarbon- und Carbonsäuren nennt man Immobilines. Sie werden in die dreidimensionale Gelmatrix polymerisiert, so dass ein sehr präziser unbeweglicher pH-Gradient (IPG) entsteht. Durch die Verwendung von Standards können sogar die pI-Werte von unbekannten Substanzen ermittelt werden. 19 5.1 Probenvorbereitung Je nach Molekulargewicht des zu analyiserenden Moleküls muss die effizienteste Methode gewählt werden. Proteine können aus nur wenigen Aminosäuren bestehen, wie es beim Insulin der Fall ist, aber auch sehr komplex und groß werden, sodass sie über 500kDa groß sind. Je größer ein Protein ist, desto schwieriger ist seine Isolierung und Reinigung. Die analytischen Trennverfahren zeigen bei solch großen Molekülen nur eine sehr geringe Effizienz. In der nebenstehenden Abbildung sieht man die Trennkapazitäten der verschiedenen Trennverfahren bei Biomolekülen in Abhängigkeit von der molekularen Masse. Bei kleinen Analyten sind chromatographische Verfahren in der Lage, bis zu 50 Analyten zu trennen. Im BeAbbildung 5.1 – Trennmethoden für Biomoleküle.[3, S. 14] reich der größeren Proteine eignen sich diese Verfahren nicht mehr. Hier sind die elektrophoretischen Methoden effizienter. Für größere Moleküle, wie den Proteinkomplexen über 150kDa, gibt es keine ausreichend effizienten Methoden. Wie eingangs bereits erwähnt wurde, haben Proteine sehr vielfältige Aufgabenbereiche im Organismus. Dementsprechend gibt es verschiedene Ziele bei der Analyse der Proteine. Zum einen benötigt man in der Medizin eine hohe Reinheit, in der Forschung interessiert vor allem die Struktur und die Proteinmengen, die für einen therapeutischen Effekt benötigt werden. Die Matrices, in denen die zu untersuchenden Proteine vorliegen, sind häufig sehr komplex, weshalb zur näheren Analyse eine vorhergehende Isolation notwendig ist. Proteine können aber auch quantitativ analysiert werden, z.B. bei Drogentests. Die Sequenzierung wird zur Strukturanalyse und Identifikation von Peptiden herangezogen. Bei der Aufreinigung von Proteinen geht man nach dem immer gleichen Prinzip vor. Zunächst werden die betreffenden Proteine gelöst, um sie anschließend zu isolieren. Im Organismus unterscheidet man im Groben zwei Proteinklassen: die Extrazellularen und Intrazellularen Proteine. Die Gruppe der Einschlusskörperchen (engl. inclusion bodies 1 ) bilden eine weitere Gruppe. Die Membranen im Organismus bestehen aus einer Lipiddoppelschicht. Nach außen hin ist diese Schicht wasserdurchlässig. Zwischen den polaren Kopfgruppen der Membranlipiden befinden sich die unpolaren Schwanzgruppen, die eine wasserabweisende Zone bilden. In einer solchen Membran liegen die sogenannten Membranproteine, die für den Transport von Ionen und kleineren Molekülen zuständig sind. 5.1.1 Reinigung Bei der Analyse solcher Membranproteine ist eine Aufreinigung (engl. Purification) notwendig, um störendes Matrixmaterial zu beseitigen. Bei extrazellulären Proteinen werden Zellen und andere unlösliche Bestandteile abgetrennt, um eine homogene Lösung zu erhalten. Diese kann dann für weitere Analyseschritte verwendet werden. Solche extrazellulären Proteine sind in z.B. in Körperflüssigkeiten, 1 Inclusion bodies: Kleine Partikel im Inneren von Zellen, die aus Ansammlungen von zumeist fehlerhaft oder unvollständig gefalteten Proteinen bestehen. 20 im Überstand der Kulturen von Mikroorganismen oder Zellkulturmedien vorhanden. Intrazelluläre Proteine liegen innerhalb einer Zelle vor, weshalb die Zellmembranen oder Zellwände erst zerstört werden müssen, damit der lösliche Inhalt der Zelle frei wird. Dies nennt man Zelldisruption. Die Methoden unterscheiden sich je nach Zellart und Menge der aufzuschließenden Zellen. Membranproteine und andere unlösliche Proteine werden üblicherweise mit der relevanten Membranfraktion isoliert und erst dann gereinigt. Peripher gebundene Proteine können durch eine leichte Erhöhung des pH-Werts, Hinzugabe eines gering konzentrierten nichtionischen Detergens oder die Zugabe von EDTA von den Membranen gelöst werden und anschließend wie gelöste Proteine weiterbehandelt werden. Integrale Membranproteine benötigen eine höhere Konzentration eines Detergens, lassen sich dann jedoch auch aus der Membran lösen. Diese isolierten Membranproteine sind unlöslich, weshalb die Aufreinigung hier schwierig ist. Strukturproteine wie die Skelettproteine sind ein Beispiel für solch unlösliche Proteine. Sie verfügen meist über posttranslational angefügte funktionelle Gruppen mit denen sie quervernetzt sind. Der erste Reinigungsschritt ist hier die Entfernung der löslichen Proteine. Anschließend wird die native Struktur des Proteins zerstört und die Quervernetzungen der denaturierten Proteine unter Verwendung von chaotropen2 Reagenzien unterbrochen. Rekombinante Proteine3 können nach der Expression in inclusion bodies relativ einfach gereinigt werden. Durch Zentrifugation werden alle unlöslichen Zellbestandteile abgetrennt, sodass das reine Protein vorliegt, welches zur weiteren Verwendung durch Renaturierung in den biologisch aktiven Zustand überführt werden muss. Es kann vorkommen, dass solche Proteine nicht in inclusion bodies kumuliert vorliegen. Dann erfolgt die Reinigung wie bei natürlichen Proteinen. Die Reinigung ist hier jedoch einfacher, da das Protein in höherer Konzentration vorliegt. Die Markierung mit sogenannten tags hat sich bewährt, da dies die Reinigung noch erleichtert. Eine bestimmte Sequenz ist in der Lage, den Marker zu binden, wodurch eine sehr hohe Selektivität erreicht wird, was die Reinheit der Proteine erhöht. 5.1.2 Homogenisierung Biologisches Gewebe besteht in der Regel aus Zellverbänden. Um die Proteine reinigen und isolieren zu können, ist eine Homogenisierung notwendig. Dabei werden die komplexen Zellverbände zerstört, sodass ein Gemisch aus intakten und aufgebrochenen Zellen und Zellbestandteilen erhalten wird. An das Homogenisierungsmedium werden aufgrund der anschließenden Überführung des Zellmaterials in eine unphysiologische Umgebung einige Kriterien gestellt. Das Medium muss das osmotische Platzen der Zellen verhindern, Schutz vor Proteasen und Aggregation bieten, die biologische Aktivität bewahren und keinerlei Einfluss auf die Zellorganellen und nachfolgende Analysen und Tests haben. Zu diesem Zweck werden Pufferlösungen mit einem bestimmten pH-Wert eingesetzt, dem meist eine Vielzahl von Protease-Inhibitoren zugesetzt wird. Sollen Zellorganellen untersucht werden, müssen alle intakten Zellen aufgebrochen werden. Dies wird durch mechanische Zerstörung der Zellwand erreicht, die jedoch aufgrund der entstehenden Reibungswärme unter Kühlung stattfinden muss. Bei sehr empfindlichen Zellen empfiehlt sich wiederholtes Pipettieren der Zellsuspension oder das Pressen durch ein Sieb, wodurch ein Aufschluss durch schwa2 Chaotrope Verbindungen: Wirken störend auf geordnete Wasserstoffbrücken. Dadurch nimmt die Entropie, also die Unordnung, in einer Lösung zu. Chaotrope Salze wirken strukturbrechend, in dem sie die Wasserstruktur stören und damit zur Denaturierung von gelösten Makromolekülen wie Proteinen führen. 3 Rekombinante Proteine: Biotechnisch hergestellte Proteine, die durch gentechnisch veränderte Organismen oder Zellkulturen erzeugt werden. Ein Beispiel ist das in der Medizin verwendete Insulin, welches von Bakterien erzeugt wird. 21 che Scherkräfte4 erreicht wird. Für pflanzliche und Bakterienzellen sind diese Methoden nicht geeignet. Zellen, die keine Zellwand besitzen und nicht im Zellverband vorliegen, können osmolytisch aufgebrochen werden, indem sie in eine hypertonische Umgebung gebracht werden, in der das umgebende Wasser in die Zelle strömt, um die dort höhere Salzkonzentration auszugleichen, wodurch die Zelle platzt. Dies wird häufig bei isolierten Blutzellen angewendet. Bei Zellen mit Zellwänden werden Enzyme eingesetzt, die die Zellwand aufbrechen, um den osmotischen Aufschluss zu ermöglichen. Diese Methode ist sehr schonend, sodass Zellorganellen und -kerne in der Regel intakt bleiben. Bei Bakterien wendet man als Aufschlussmethode häufig wiederholten Einfrieren und Auftauen an, da der Wechsel der Aggregatzustände zur Deformation der Zellmembran führt, bis die aufbricht. Durch den Einsatz von Ultraschallwellen werden Druckänderungen erzeugt, die Zellen und Organellen zum Aufbrechen bringen. Die Beschallung ist nur wenige Sekunden möglich, da bei dieser Methode viel Wärme freigesetzt wird. 5.1.3 Fällung Die Fällung ist eine der ersten Methoden zur Reinigung von Proteinen. Der homogenisierten Lösung aus Zellbestandteilen wird ein fällendes Reagenz (präzipitierendes Agenz hinzugegeben, was dann zum Ausfällen der Proteine führt. Diese Agenzien sind meist unspezifisch und fällen alle vorhandenen Proteine. Es gibt jedoch auch selektiv wirkende Agenzien, die z.B. nur Plasmaproteine ausfällen. Bei der Fällung ist stets zu beachten, dass die Agenzien auch Einflüsse auf die biologische Aktivität der Proteine haben können. Außerdem muss das Agenz nach der Fällung vom Analyten rückstandslos trennbar sein. Die Hofmeister-Serie beschreibt die Eigenschaft eines Salzes Proteine zu fällen. Die antichaotropen + + 32bzw. kosmotropen Salze wie NH4 , K , aber auch PO4 und SO4 sind besonders gute und schonende Fällungsmittel. Dahingegen sind Guanidin (C(NH2 )3 ), SCN und I chaotrope Agenzien und für die Proteinfällung nicht geeignet, da sie die Proteine in Lösung halten. Die kosmotropen Salze fördern hydrophobe Effekte und damit die Proteinaggregationen. Organische Lösungsmittel werden schon seit über 100 Jahren zur Fällung von Proteinen eingesetzt. Vor allem kaltes Aceton und kurzkettige Alkohole, wie Ethanol, sind sehr effektiv. Langkettige Alkohole sind zu wenig wasserlöslich und deshalb für die Fällung nicht verwendbar. Ethanol wird gerne zur Fällung von Plasmaproteinen genutzt. Die Fällung mit Trichloressigsäure wird häufig eingesetzt, um Proteine aus Lösungen auszufällen. Dafür wird 10%ige Säure verwendet, abzentrifugiert und mit einem Puffer resuspendiert und weiterverwendet. Da beim Einsatz von Trichloressigsäure die Proteine denaturiert werden, wird diese Methode gern zur Konzentrierung in der Gelelektrophorese verwendet. 5.1.4 Zentrifugieren Die Zentrifugation ist eine der ältesten Techniken zur Abtrennung von unlöslichen Bestandteilen in einer Lösung. Teilchen bewegen sich aufgrund der auf die Flüssigkeit durch Rotation ausgeübten Zentrifugalkräfte. Die unlöslichen, schweren Bestandteile der Lösung setzen sich möglichst weit entfernt vom Rotationszentrum ab. Es gibt verschiedene Ausführungen, wie die Festwinkelrotoren, Vertikaloder Schwingbecherrotoren. Dadurch lassen sich auch sowohl sehr geringe aber auch größere Volu4 Scherkräfte: Verformung eines Körpers unter Einwirkung einer Kraft, bei der die Kraft antiparallel zu parallelen Flächen des Körpers wirkt. 22 mina zentrifugieren. In der Biologie werden häufig gekühlte Systeme angeboten, da die entstehende Reibungswärme das biologische Material beschädigen würde. Bei der Zentrifugation erfolgt eine Trennung nach Größe und Dichte. In der Praxis werden häufig Dichtegradienten eingesetzt. Für einen kontinuierlichen Gradienten benötigt man ein Lösungsmittel, das durch das Konzentrationsgefälle des darin gelösten Analyten eine von oben nach unten ansteigende Dichte aufweist. Das Konzentrationsgefälle verläuft entgegengesetzt, da sich die größeren, schweren Partikel entsprechend dem Schwerefeld der Erde unten ablagern. Cäsium-Chlorid wird in der Biochemie zur Nucleinsäuren häufig eingesetzt. Es hat eine geringe Viskosität, jedoch eine hohe Leitfähigkeit, die zur Dissoziation von biologischen Substanzen führen kann. Für osmotisch senAbbildung 5.2 – Rotoren für die Zentrifugation. [3, S.22] sible Materialien ist dieser Gradient nicht geeignet. Sucrose 5 hat eine geringe Dichte, ist billig und leicht verfügbar und zudem nicht-ionisch. Gegenüber biologischem Material verhält sich eine Saccharose-Lösung relativ inert, weshalb sie häufig für die Zonenzentrifugation 6 mit einem kontinuierlichen Gradienten verwendet wird. Aufgrund der hohen Osmolarität und Viskosität kann die Auflösung der Trennung beeinträchtigt sein, weshalb man in der Praxis höher molekulare Polysaccharide verwendet. Sie weisen eine bessere Osmolarität auf, haben jedoch eine noch höhere Viskosität, was die Trenndauer verlängert. 5.1.5 Entsalzung Salze werden in destilliertem Wasser gelöst, was aufgrund der im Salz vorliegenden Ionen gut funktioniert. Anschließend gibt es verschiedene Methoden, um die Salze von den in der Lösung vorhandenen Proteinen zu trennen. • Dialyse - Hier wird eine Membran verwendet, die semipermeabel kleine Moleküle, wie Wasser passieren lässt, größere Moleküle jedoch zurück hält. Teilweise sind reinigende Schritte im Vorfeld notwendig, um die Membran nicht zu überlasten. Um den für die Separation notwendigen Konzentrationsgradienten aufrecht zu erhalten muss der Puffer mehrmals ausgetauscht werden. Die Trennung durch Dialyse ist sehr zeitaufwändig, aber effektiv. Durch die abnehmende Ionenstärke des Puffers können die Proteine ausfallen. Durch Hinzugabe eines stärkeren Puffers können diese wieder gelöst werden. • Ultrafiltration - Durch unsymmetrische Membranen mit verschiedenen Porengrößen auf der Ober- und Unterseiten werden Salze und andere Moleküle, wie Wasser durch die Membran durch Druck, Vakuum oder Zentrifugation gepresst. Anders als bei der Dialyse wird hier kein Konzentrationsgradient aufgebaut. Die Flussrate des Lösungsmittels durch die Ultrafiltrationsmembran 5 Sucrose: Synonym für Saccharose. Zonenzentrifugation: auf einen flachen Dichtegradienten aus Saccharose wird die Probe gegeben und durch die Unterschiede in der Sedimentationsgeschwindigkeit getrennt. 6 23 dient als Grundlage. Die für die Poren zu großen Proteine bleiben an der Membranaußenwand hängen und werden so von der restlichen Lösung getrennt. • Gel Chromatographie - Trennung der in der Probe vorhandenen Substanzen entsprechend ihrer Größe. Die Salze eluieren nach etwa einem Säulenvolumen. Diese Methode ist für große Probenvolumina ungeeignet. • RP Chromatographie - Geeigent für hydrophile Proteine als später Reinigungsschritt. Proteine binden an die Säule und werden so von den nichtgebundenen Salzen getrennt. • Immobilisierung auf einer Membran - Transfer auf eine chemisch inerte Membran (Immobilisierung), z.B. durch Auftragen der salzhaltigen Proteinlösung auf eine hydrophobe Membran. Anschließend wird die Membran getrocknet und gewaschen. Die Proteine bilden eine relativ starke Bindung an die Membran, sodass die Salze abgewaschen werden können. Dieses Verfahren wird häufig in der Sequenzanalytik oder Massenspektrometrie eingesetzt. 5.2 Detergentien in der Probenvorbereitung Detergentien in der Probenvorbereitung müssen bestimmte Anforderungen erfüllen. Sie müssen ampholyt sein, sodass sie einen hydrophilen und einen hydrophoben Teil haben. Dadurch sollten sie dazu tendieren, Micellen zu bilden. Dies sind Molekülverbände, bei denen die hydrophilen Teile nach außen und die hydrophoben Teile nach innen zeigen. Die Proteine werden in die Mitte der Micellen eingebaut, wodurch sie wasserlöslich werden, ohne ihre biologische Aktivität zu verlieren. Die niedrigste Konzentration, bei der die Micellenbildung noch möglich ist, wird kritische micellare Konzentration (CMC) genannt. Sie hängt vom jeweiligen Detergens ab, ebenso wie von Parametern wie Temperatur, Ionenstärke, pH-Wert, Anwesenheit von Kationen und organischen Lösungsmitteln. Die Wahl des passenden Detergens muss daher für jeden Fall einzeln empirisch ermittelt werden. Detergentien in der Probe haben aber auch negative Wirkung auf die analytische Auswertung. Manche von ihnen absorbieren UV-Strahlung, sodass die Detektion der Proteine erschwert oder sogar unmöglich ist. Ionische Detergentien sind für die Auswertung durch die Ionenaustausch-Chromatographie ungeeignet, da sie mit dem Messgerät reagieren würden. Zudem haben sie eine denaturierende Wirkung auf Proteine. Hydrophobe Interaktionen mit einer RP-Phase in der Chromatographie beeinflussen die Trennung der Proteine. Einige nicht-ionische Detergentien haben eine oxidierende Wirkung, wodurch Proteine verändert werden können. Daher sollten die Detergentien möglichst frisch angesetzt werden, mit Stickstoff gekühlt werden und stets mit einer Spritze aufgezogen werden. Sie sind vor allem für voll funktionsfähige Proteinkomplexe geeignet. Die Entfernung der Detergentien sollte trotzdem immer erst kurz vor der Analyse erfolgen, damit keine weitere Probenmanipulation stattfinden muss. Es gibt verschiedene Methoden, um Detergentien aus der Proteinlösung zu entfernen. Einerseits kann man die Lösung so stark verdünnen, dass die Konzentration der Micellen unterhalb der CMC liegt. Ist dies erreicht, so können sie durch Dialyse entfernt werden. Ist dies nicht möglich, da so können spezielle chromatographische Säulen eingesetzt werden, die die Detergentien binden. Die Porengröße ist jedoch zur gering, sodass Proteine nicht an der stationären Phase binden können. Eine weitere Methode ist die Extraktion mit Chloroform/Methanol zur Entfernung von SDS oder die Ionenpaarextraktion, bei der die trockene Probe mit einem Reagenz in einem organischen Lösungsmittel extrahiert wird. Wasser muss immer genügend vorhanden sein, damit sich das relativ unpolare 24 Alkylammonium-SDS-Ionenpaar bildet, welches sich mit dem organischen Lösungsmittel dann extrahieren lässt. Mit dieser Methode lassen sich bis zu 95% SDS aus einer Probe mit einem Extraktionsschritt entfernen. Die freien Proteine können dann durch Zentrifugieren isoliert werden. Eine weitere Methode ist die Gelfiltration in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels. In diesem Lösungsmittel können schwach hydrophobe Proteine in Lösung gehalten werden und durch Gelfiltration von Salzen und Detergentien getrennt werden. Stark hydrophobe Proteine müssen durch möglichst flüchtige Lösungsmittelgemische mit einem hohen Anteil an organischen Säuren in Lösung gehalten werden. Zuletzt sei noch die Bindung (Blotten) auf chemisch inerten Membranen erwähnt. Es ist die einfachste Methode, um hydrophobe Proteine zu reinigen. Dafür wird die Proteinlösung auf ein detegenshaltiges Polyacrylamidgel gegeben, um es dann auf eine chemisch inerte Membran zu blotten. Das immobilisierte Protein kann dann direkt für weitere Analysen verwendet werden. Das Verfahren ist prinzipiell vergleichbar mit der Immobilisierung bei der Entsalzung der Proteinlösung. 25 Abbildungsverzeichnis 1.1 2.1 2.2 2.3 2.4 3.1 3.2 Das Ramachandran Diagramm stellt die erlaubten und verbotenen Winkelgebiete einer Peptidbindungsrotation dar.[4, S. 806] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Aufbau einer Aminosäure. . . . . . . . . . . . . . . . . . Chemische Zustände in Abhängigkeit vom pH-Wert und S. 48] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Die Entstehung einer Peptidbindung. [8, S. 49] . . . . . Die 20 biogenen α-Aminosäuren. [8, S. 51] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . am Isoelektrischen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Punkt.[8, . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 6 6 7 8 Chemische Struktur des Sodium Dodecyl Sulfate. [7, Vorlesung 2, Folie 1] . . . . . . . Polymerisation von Acrylamid und Methylenbis(acrylamid) zu einem PolyacrylamidGel.[5] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Geräteaufbau der SDS-PAGE. a) Gelektrophorese Kammer. b) Entwickeltes, gefärbtes Gel.[6] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 4.1 Schematisierte Messapperatur für die Kapillar-Elektrophorese. [1] . . . . . . . . . . . . 14 5.1 5.2 Trennmethoden für Biomoleküle.[3, S. 14] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rotoren für die Zentrifugation. [3, S.22] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 23 3.3 26 11 13 Literaturverzeichnis [1] Arbeitsgruppe an der Technische Universität Braunschweig Dr. H. Wätzig; Braunschweig. www. pharmchem.tu-bs.de/forschung/waetzig/kpep/, Aufgerufen am 28.06.2014. [2] Wiley Information Services GmbH; Berlin. www.chemgapedia.de/vsengine/glossary/de/ isoelektrischer_00032punkt.glos.html, Aufgerufen am 26.06.2014. [3] Friedrich Lottspeich; Joachim W. Engels. Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag; Heidelberg, 3. Auflage; 2012. [4] Eberhard Breitmaier; Günther Jung. Organische Chemie. Georg Thieme Verlag; Stuttgart, 7. Auflage; 2012. [5] Dr. Susanne Hemschemeier; Prof. Dr. Alfred Maelicke. www.chemgapedia.de/vsengine/ vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/proteinanalytik/elektrophorese.vlu/Page/vsc/de/ch/8/bc/ proteinanalytik/methoden_protein/elektro_pageherstellung.vscml.html, Aufgerufen am 27.06.2014. [6] H.R. Horton; L.A. Moran; K.G. Scrimgeour; M.D. Perry; J.D. Rawn. Biochemie. Pearson Deutschland GmbH; München, 4. Auflage. [7] Dr. Ulf Ritgen. Vorlesungsskript Instrumental Analysis. Hochschule Bonn-Rhein-Sieg; St. Augustin/Rheinbach, 2012. [8] Prof. Dr. Wilfried Probst; Petra Schuchardt. DUDEN Basiswissen Schule Biologie Abitur. Dudenverlag; Mannheim, 2. aktualisierte Auflage; 2007. 27
