Bedeutung des Autocrine Motility Factor Receptor für den
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Universitätsklinikum Ulm Zentrum für Innere Medizin Klinik für Innere Medizin I Leitung: Prof. Dr. med. G. Adler Bedeutung des Autocrine Motility Factor Receptor für den transformierten Phänotyp von humanen Papillenkarzinomzellen (AVC1) Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Anna Esser aus Tübingen Biberach, 2009 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Klaus-Michael Debatin 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Thomas Gress 2. Berichterstatter: PD Dr. Mathias Schmid Tag der Promotion: 25.06.2010 Für Ida Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis: I Abkürzungsverzeichnis III 1. Einleitung -1- 1.1. Das Papillenkarzinom: -1- 1.2. Stand der Forschung: - 10 - 1.3. Projektbezogene Vorarbeiten der Arbeitsgruppe: - 11 - 1.4. Der Autocrine Motility Factor Receptor (AMFR): - 14 - 1.5. Der Autocrine Motility Factor (AMF): - 15 - 1.6. Ziele der Arbeit: - 16 - 2. - 18 - Material und Methoden 2.1. Chemikalien und Puffer: - 18 - 2.2. Gewebe, Organismen, Nukleinsäuren und Klonierungsvektoren: - 20 - 2.3. Standardtechniken im Umgang mit Nukleinsäuren: - 23 - 2.4. Standardtechniken im Umgang mit prokaryotischen Zellen: - 34 - 2.5. Kultivierung eukaryotischer Zellen: - 37 - 2.6. Genregulation durch Transfektion mit siRNA: - 38 - 2.7. Untersuchungen zum Verhalten adhärenter Ampullenkarzinomzellen in vitro: - 41 - 2.8. Statistik: - 43 - 3. - 44 - Experimente und Ergebnisse 3.1. Expression von AMFR und AMF in verschiedenen Geweben und Zellkulturlinien - 44 - 3.2. Kultivierung von AVC1: - 52 - 3.3. Gene-silencing von AMFR bei AVC1 durch Transfektion mit siRNA: - 53 - 3.4. In vitro Untersuchungen zum Verhalten von Papillenkarzinomzellen in Abhängigkeit von der Expressionsstärke des AMFR in vitro: - 55 - Inhaltsverzeichnis 4. Diskussion II - 64 - 4.1. Das Papillenkarzinom und der AMF-Rezeptor: - 64 - 4.2. RT-PCR und Northern-Blot-Analysen: - 65 - 4.3. Der Einfluss von AMFR auf das Verhalten von AVC1 in vitro: - 67 - 4.4. Ausblicke: - 71 - 5. Zusammenfassung - 73 - 6. Literaturverzeichnis - 74 - 7. Danksagung: - 84 - Abkürzungsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis A. Arteria Abb. Abbildung AMF autocrine motility factor AMFR autocrine motility factor receptor AP alkalische Phosphatase AS Aminosäure AVC Ampulla of Vater Cancer AVC1 von Sorio et al. etablierte Zelllinie eines humanen Papillenkarzinoms AWMF Arbeitsgemeinschaft der wissenschaftlichen medizinischen Fachgesellschaften bp Basenpaar bzw. Beziehungsweise c centi cm centimeter chron. chronisch cDNA ‘copy’ Desoxyribonukleinsäure °C Grad Celsius CD Cluster of differentiation CK Cytokeratin Cl Clorid CO2 Kohlenstoffdioxid COX Cyclooxygenase CT Computertomographie dCTP Desoxycytosin-5´-triphosphat dd bidestilliert DEPC Diethylpyrocarbonate D-MEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium high Glucose DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DNAse Desoxyribonuklease dNTP Desoxyribonukleid-5´-triphosphat DTT Dithiothreitol Abkürzungsverzeichnis IV E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ERCP Endoskopisch retrograde Cholangiopancreaticographie et al. et alteri (und andere) Etbr Ethidiumbromid evtl. eventuell EYFPN Enhanced yellow fluorescent protein Fa. Firma FAP Familiäre Adenomatosis papillomatosa FCS Fetales Kälberserum forw. forward g Gramm/ Erdschwerebeschleunigung Ges Gesund gp78 Glycoprotein78 gpi Glucose-Phosphat-Isomerase xg - fache Erdbeschleunigung ggf. gegebenenfalls h Stunde HIF Hypoxia inducible factor K Kalium kb Kilobasen kDa kilo Dalton l Liter LB Loading-Buffer LB Medium lysogeny broth, komplexes Nährmedium Lsg Lösung m milli- (10-3); Meter M molar µ mikro- (10-6) MF Maturation fator min Minute mind. mindestens MOPS 3-N-Morpholinopropansulfonsäure mRNA messenger RNA Abkürzungsverzeichnis V MRT Magnetresonanztomographie MW Molekulargewicht n nano (10-9) NaAc Natriumacetat NB Northern Blot neg negativ NFAT Nuclear factor of activatet T cells NLK Neuroleukin ORF open reading frame (offener Leserahmen) p piko (10-12) PaAd Pankreasadenom PaCa Pankreaskarzinom PapCa Papillenkarzinom PBS Phosphat gepufferte Kochsalzlölsung PCR Polymerase-Chain-Reaction PE-Folie Polyethylen-Folie PG, PGC anonymisiertes Patientenkürzel von Gewebeproben Pitis Pankreatitis Pn ... (beliebige mehrstellige Zahl) anonymisiertes Patientenkürzel von Gewebeproben pos. positiv Pp ... (beliebige mehrstellige Zahl) anonymisiertes Patientenkürzel von Gewebeproben qRT-PCR quantitative real time PCR RE Restriktionsenzym rev. reverse RISC RNA inducing silencing complex RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease RNF 45 Ring finger protein 45 RPLP0 Ribosomales Protein große Untereinheit rpm rounds per minute RPMI Akronym für Nährmedium entwickelt im Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur RT-PCR Real Time PCR s Sekunde /Svedberg Sedimentationskoeffizient Abkürzungsverzeichnis VI s. siehe S2-007/028 Suit2 007/028 SDS Sodiumdodecylsulfat sf serumfrei sh serumhaltig siRNA silencer RNA/ small interfering RNA SSC Citrat-gepufferte Kochsalzlösung ssDNA Salmon Sperm DNA s.o. siehe oben sog. so genannte s.u. siehe unten Tab. Tabelle TAE Tris-Acetat-EDTA Taq Thermophilus aquaticus TD touch down TE Tris-EDTA TNM Tumor Nodes Metastasis Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminoethan tRNA transfer RNA u.a. und andere/ unter anderem UICC Union internationale contre le cancer UV Ultraviolett ü.N. über Nacht V Volt V. Vena Vol. Volumen v/v Volumen pro Volumen WHO World health organisation w/v Gewicht pro Volumen z.B. zum Beispiel z.T. zum Teil Einleitung -1- 1. Einleitung 1.1. Das Papillenkarzinom: 1.1.1. Begriffsklärung, Anatomie, Entität und Epidemiologie: Das Papillenkarzinom, auch Ampullenkarzinom genannt, ist ein maligner Tumor ausgehend vom Epithel der Ampulla hepatopancreatica bzw. der Papilla Vateri (Papilla duodeni major). Als Ampulle wird die Vereinigung (der „common channel“) des Ductus choledochus mit dem Ductus pankreaticus major bezeichnet (mit oder ohne reservoirartige Erweiterung) welche auf einer Erhebung am Ende der plicae longitudinales duodeni, nämlich der Papilla Vateri, ca. 10cm aboral des Pylorus in die Pars descendens duodeni mündet [40]. In dieser Arbeit sollen der Einfachheit halber die Begriffe Ampullenkarzinom bzw. Papillenkarzinom sowie Karzinom der Ampulla bzw. Papilla Vateri gleichbedeutend verwendet werden. Hiervon abzugrenzen ist unbedingt der Begriff des „periampullären Karzinoms“ welcher früher gebräuchlich war und einen Sammelbegriff unterschiedlicher Tumorentitäten darstellt. Hierunter wurden Karzinome der Ampulla bzw. Papilla Vateri, des periampullären Pankreaskopfes, des distalen Ductus choledochus und des papillennahen Duodenums zusammengefasst [1, 2, 40]. Abzulehnen ist ebenfalls die Zuordnung der Ampullenkarzinome zu den Duodenalkarzinomen, wie sie auch heute noch in einzelnen Lehrbüchern erfolgt [40]. Gerade durch die früher übliche Zusammenfassung der Ampullenkarzinome mit jenen der benachbarten Strukturen ist die genaue Erfassung spezieller Daten für das Ampullenkarzinom oft schwierig[40]. Epitheliale Neoplasien der Ampulla Vateri finden sich gehäuft im höheren Lebensalter und erreichen einen Gipfel in der 6.-7. Lebensdekade. Frauen und Männer sind gleichermaßen betroffen [32]. Vor allem im Rahmen der Familiären Adenomatosis Polyposis (FAP) und des Gardner-Syndroms treten in bis zu 50-95% der Fälle peripapilläre und ampulläre Adenome auf (welche dann nach dem Prinzip der Adenom-Karzinom-Sequenz (s.u.) maligne entarten können) [2, 4, 8, 32]. Das Risiko für Ampullenkarzinome auf dem Boden dieser Adenome ist im Vergleich zur Normalbevölkerung auf das 100- bis 200-fache erhöht, die Gesamtwahrscheinlichkeit für Ampullenkarzinome während des gesamten Lebens bei FAPPatienten wird auf 12% geschätzt [2, 40], weshalb diese Patienten eine engmaschige Kontrolle benötigen. Nach Proktolektomie bei FAP ist die Ampulle Hauptsitz für Karzinome Einleitung -2- [11]. Bei etwa 5% der Patienten mit Ampullenkarzinom tritt metachron ein weiteres Karzinom auf, wobei verschiedene Lokalisationen möglich sind [2, 40]. Das Ampulläre Karzinom ist ca. 5- bis 20-mal seltener als das Pankreaskarzinom, dessen jährliche Inzidenz in der westlichen Welt ca. 4-12/100.000 Einwohner beträgt, und in seiner Häufigkeit unter den Tumoren des Verdauungstraktes (nach kolorektalem Karzinom und Magenkarzinom) an dritter Stelle steht [14]. Unter den Karzinomen des periampullären Bereichs macht das Ampullenkarzinom ca. 5-10% aus [2, 40]. In Autopsieserien liegt das Vorkommen bei nur 0,2% bezogen auf die Gesamtheit der gastrointestinalen Tumoren [6, 26]. Diverse Krebsregister spiegeln diese Zahlen relativ gut wieder. Das von NordrheinWestfalen beispielsweise verzeichnet zwischen 1994 und 2003 3833 Neuerkrankungen an Pankreaskarzinomen und 212 an Karzinomen der Ampulla Vateri [34], damit ist das Papillenkarzinom hier ca. 18-mal seltener als das Pankreaskarzinom. Das Karzinom der Ampulla Vateri ist damit eine eher seltene Tumorentität, jedoch sind zwischen 33 und 36% aller operablen pankreatoduodenalen Tumoren solche der Papilla Vateri [46, 55],und es übertrifft die Duodenalkarzinome um das Drei- bis Vierfache [5]. 1.1.2. Ätiologie und Pathogenese: Über ätiologische Faktoren des Papillenkarzinoms liegen keine gesicherten Erkenntnisse vor. Gerade wegen des früher gebräuchlichen Begriffs des periampullären Karzinoms (s.o.) sind viele der vorhandenen Daten auf diese heterogene Gruppe von Malignomen und nicht ausschließlich auf das Karzinom der Ampulla und Papilla Vateri bezogen. Auffällig ist eine Häufung von Adenomen und Karzinomen der Ampulle bei der Familiären Polyposis und eine erhöhte Inzidenz nicht-gastrointestinaler Malignome, so dass in der Ätiologie unter anderem vermutlich auch genetische Faktoren eine Rolle spielen [6]. Die Pathogenese des Adenokarzinoms der Papilla Vateri ist ähnlich der vieler anderer gastrointestinaler Karzinome. Genau wie beim Kolorektalen Adenokarzinom findet sich beim Papillenkarzinom ein histologisches Wachstumsmuster. Es zeigt eine sog. AdenomKarzinom-Sequenz [28, 40, 57]. Das bedeutet, dass der Grad der Zellatypien, ausgehend von der makroskopisch auszumachenden benignen epithelialen Neubildung (dem Adenom) kontinuierlich zunimmt bis der Übergang in ein invasives Karzinom vollzogen ist. Hinweise hierauf sind zum Beispiel dass der Häufigkeitsgipfel des Karzinoms um ca. 9 Jahre höher liegt als beim Papillenadenom. Außerdem finden sich in kleinen lokalen Papillenkarzinomen in Einleitung -3- über 80% der Fälle Adenomanteile [7]. Genauso weisen etwa 16% aller primär diagnostizierten Papillenadenome bereits Anteile eines Carcinoma in situ auf [60]. In Untersuchungen suchungen von Treitschke et al., al 2000 [60] fanden sich in. 23% der benignen Papillenadenome leichte Dysplasien, in 52% mäßige und in 25% schwere Dysplasien. Dysplasien Wie beim Kolorektalen Adenom steigt auch hier das Risiko maligner Transformation in der Reihenfolge tubuläres → tubulovillöses → villöses Adenom [40, 57].. Dies alles deutet auf präkanzeröses Geschehen hin. 1.1.3. Pathologie und Histologie: Abb. 1: Makroskopisches Bild eines Papillenkarzinoms Gezeigt ist das makroskopische Bild eines Papillenkarzinoms im Resektat. Zu sehen ist die Duodenalwand mit einem polypösen Tumor im Bereich der Papilla Vateri. Quelle: http://www.pathologie.med.uni-rostock.de/ http://www.pathologie.med.uni Makroskopisch zeigen sich AmpullenAmpullen und Papillenkarzinome als polypöse oder ulzerierende Tumoren [3]. Manche Karzinome arzinome entwickeln sich innerhalb der Ampulle, Ampull wobei dann endoskopisch die Gegend egend der Papille stärker vorgewölbt sein kann (intramural vorgewölbter Ampullentyp). Andere ndere Tumoren sind vorwiegend an der Papille selbst lokalisiert (exophytisch wachsender Duodenaltyp).. Es kommen auch kombinierte Formen vor (Mischtyp, Kombinationstyp) [3, 40]. Ampullenkarzinome zeigen alle Zeichen maligner Tumoren, sie wachsen schnell und lokal infiltrierend, metastasieren auf dem LymphLymph- und Blutweg und bilden so Lymphknoten- und Fernmetastasen. Ampullenkarzinome infiltrieren die Duodenalwand, den Ductus choledochus, den Pankreaskopf, die V. lienalis, s, die V. portae, und Einleitung -4- Perineuralscheiden [50]. Lymphknotenmetastasen treten besonders häufig in der posterioren pankreaticoduodenalen Lymphknotengruppe auf (primäre Lymphdrainage) [29, 40]. Ohne deren Befall zeigen andere Lymphknotenstationen, insbesondere die superioren mesenterialen Lymphknoten, nur selten Metastasen [29, 40]. Mit lymphogener Metastasierung ist durchschnittlich in etwa 40% zu rechnen, die Häufigkeit hängt in erster Linie von der lokalen Infiltration und Lymphgefäßinvasion ab [14, 29, 40]. Lymphknoten am Milzhilus und jene um den Pankreasschwanz gelten als nichtregionär, ihr Befall entspricht Fernmetastasen [40]. Durch hämangiosis carcinomatosa erfolgt eine Fernmetastasierung besonders in Leber, Lunge und Peritoneum. Maligne Tumoren der Ampulle sind zu 98% Karzinome, nichtepitheliale und endokrine Tumoren sind sehr selten [2, 40]. Histologisch handelt es sich beim Ampullenkarzinom in mehr als 90% um Adenokarzinome und ihre Varianten, dabei überwiegt mit ca. 80% der Fälle das gut bis mäßiggradig differenzierte, tubuläre Adenokarzinom mit der oben beschriebenen Adenom-Karzinom-Sequenz der Tumorgenese [2, 7, 40]. Weiterhin werden muzinösszirrhöse und papilläre Karzinome beobachtet [2, 40, 47]. Kleinzellige Karzinome, Adenokankroide, anaplastische Karzinome, Siegelringkarzinome und hepatoide Karzinome sind sehr seltene Tumortypen [47]. Im Bereich der Ampulle und der Papille sind unterschiedlich differenzierte Schleimhautareale zu finden: pankreatobiliär und intestinal differenzierte Mucosa liegt nebeneinander vor, außerdem gibt es Mischbereiche. Karzinome können daher auch durch ihren histogenetischen Ursprung klassifiziert werden: So teilt man sie in pankreatobiliär bzw. intestinal differenzierte Papillenkarzinome, sowie Mischformen ein [14, 40]. Diese Einteilung, welche besonders im japanischen Schrifttum vorgenommen wird [6], ist jedoch in der aktuellen WHOKlassifikation nicht vorgesehen [40] weil eine verlässliche Zuordnung nach dem Ausgangsepithel bei vielen Tumoren nicht möglich ist [2]. 1.1.4. Staging und Grading: Die Stadieneinteilung von Karzinomen der Papilla Vateri erfolgt wie die der meisten anderen Tumore (und aller Karzinome) nach der TNM-Klassifikation [40]. Dabei steht das T für Tumorstatus des Primärtumors, das N für Lymphknotenstatus (von engl. „node“ = Knoten), und das M für das Vorliegen von Fernmetastasen (nichtregionäre Lymphknoten eingeschlossen). In der seit 2003 gültigen 6. Auflage der UICC [67] haben sich gegenüber der 5. Auflage [65] die Definitionen von T3 und T4 sowie das Staging geändert. Einleitung Tab. 1: -5TNM-Klassifikation von Tumoren der Papilla Vateri, UICC 2003 [67]: Tumoren der Papilla Vateri T Primärtumor TX Primärtumor nicht beurteilbar T0 Kein Anhalt für Primärtumor T is Carcinoma in situ T1 Tumor begrenzt auf die Ampulla Vateri oder sphincter oddi T2 Tumor infiltriert Duodenalwand T3 Tumor infiltriert 2 cm oder weniger in das Pankreas T4 Tumor infiltriert > 2 cm in Pankreas, peripankreatisches Weichgewebe und/oder benachbarte Organe N Regionäre Lymphknoten NX Regionäre Lymphknoten nicht beurteilbar N0 Keine regionären Lymphknoten-Metastasen N1 Regionäre Lymphknoten-Metastasen M Fernmetastasen MX Fernmetastasen nicht beurteilbar M0 Keine Fernmetastasen M1 Fernmetastasen Abkürzungen: TNM= Tumor Nodes Metastasis, UICC= Union internationale contre le cancer Die aktuelle Stadieneinteilung = „Staging“ erfolgt nach folgendem Prinzip [40] Tab. 2: Stadiengruppierung nach UICC 2003 [67]: Stadiengruppierung Stadium 0 T is N0 M0 Stadium IA T1 N0 M0 Stadium IB T2 N0 M0 Stadium IIA T3 N0 M0 Stadium IIB T2 N1 M0 Stadium III T4 jedes N M0 Stadium IV jedes T jedes N M1 Abkürzungen: UICC= Union internationale contre le cancer Einleitung -6- Das Grading (histopathologische Differenzierung) von Papillenkarzinomen erfolgt wie das der Tumoren der extrahepatischen Gallengänge, den Richtlinien der WHO und UICC folgend [3, 40]. Die Grundlagen der histopathologischen Differenzierung sind in der folgenden Tabelle dargestellt: Tab. 3: Grading nach WHO [47]: Grading GX Differenzierungsgrad kann nicht bestimmt werden G1 Hochdifferenzierter Tumor: Histologisch und zytologisch Muttergewebe übereinstimmend G2 weitgehend mit dem Mittlerer Grad der Differenzierung: Mittelstellung zwischen gut und schlecht differenzierten Tumoren G3 Geringer Grad der Differenzierung: Tumor ist nur durch Spezialmethoden einem Muttergewebe zuzuordnen G4 Anaplastischer Tumor: Tumor vollständig entdifferenziert und nicht einzuordnen. Akürzungen: WHO= World Health Organisation G= Grade 1.1.5. Klinik und Diagnostik: Führendes Symptom ist (mit bis zu 90%) der Ikterus [6], bedingt durch die auch von kleinen Tumoren verursachte Abflussbehinderung (schmerzloser, posthepatischer Ikterus). Im Gegensatz zum duktalen Pankreaskarzinom liegt damit eine Frühsymptomatik der Tumorerkrankung vor. Biliäre Kolikschmerzen oder Oberbauchschmerzen, Pankreatitis (15%), Cholangitis und Maldigestion sind meist Symptome fortgeschrittener Tumore [6]. Durch Arrosionsblutungen kann es zur Anämie kommen. Magen-Darm-Passage-Störungen und Schmerzen durch Tumorinfiltration stellen Spätsymptome dar. Die in der aktuellen Leitlinie der deutschen Krebsgesellschaft (AWMF) empfohlene prätherapeutische Diagnostik [3] lautet folgendermaßen: Besteht nach gründlicher Anamnese und körperlicher Untersuchung der Verdacht auf einen Tumor im Bereich der Ampulla bzw. Papilla Vateri, so erfolgt zu aller erst eine Sonographie des Abdomens. Auch beim Fehlen sonographischer Auffälligkeiten folgt wegen höherer Sensitivität und der Notwendigkeit einer (Zangen-) Biopsie die endoskopische Diagnostik durch Gastroduodenoskopie [3, 40]. Diese Einleitung -7- kann Tumoren der Ampulle meist einfach identifizieren, wenn sie exophytisch in das Darmlumen vorwachsen (Duodenaltyp). Für die in der Ampulle liegenden Neoplasien ist die Diagnose schwieriger. Die endoskopisch retrograde Cholangiopankreatikographie (ERCP) liefert dann bei sondierbarer Papille meist eindeutige Befunde. Bei nicht sondierbarer Papille kann dann eine endoluminale Sonographie (Endosonographie) weiterhelfen, die vom Duodenum aus oder über dünne in den Gallengang eingeführte Sonden durchgeführt wird. Sie liefert auch zusätzliche Erkenntnisse, insbesondere zur Tiefeninfiltration. Bei fehlender Sondierbarkeit einer luminal nicht tumorös veränderten Papille kann auch eine perkutane transhepatische Cholangiographie indiziert sein. Im Rahmen einer vollständigen prätherapeutischen Diagnostik wird außerdem eine Röntgen-Thorax-Aufnahme in 2 Ebenen sowie ein Spiral-CT oder ein MRT des Oberbauchs angefertigt. Bei ulzerierten Papillenkarzinomen ist die histologische Sicherung der Malignität an Zangenbiopsien bei Gastroduodenoskopie in der Regel problemlos möglich. Bei polypösen Tumoren ergeben Zangenbiopsien hingegen häufig nur den Befund von Adenomanteilen bzw. einer niedrig- oder hochgradigen Dysplasie, da die Invasion der Lamina propria mucosae nicht erfasst wurde. Gleiches gilt für Biopsien nach Papillensondierung bei ausschließlich intraampullärem Wachstum, die histologische Sicherung der Malignität kann hier also ein erhebliches Problem darstellen. Hier sollte deshalb eine Schlingenbiopsie durchgeführt werden [3]. Erfahrungsgemäß muss in etwa 50 % der bioptisch diagnostizierten Papillenadenome bereits mit einem infiltrierenden Karzinomwachstum in der Nachbarschaft gerechnet werden [6]. Dies gilt umso mehr, wenn bioptisch ein Carcinoma in situ diagnostiziert wurde, weshalb diese Kategorie von der WHO bereits unter die malignen Tumoren eingereiht wird (s. Tab.1). Das, und die oben beschriebene Tatsache dass sich in etwa 70-80% der Ampullenkarzinome noch Adenomreste nachweisen lassen [60], führt dazu, dass sich auch ohne präoperativen Malignitätsnachweis eine Operationsindikation für eine partielle Duodenopankreatektomie ergibt, zumindest bei Patienten mit makroskopischem Tumorverdacht ohne erhöhtes Operationsrisiko und bei großen (>2cm) polypoiden Tumoren [3]. Einleitung -8- 1.1.6. Therapie und Prognose: Für hochgradige epitheliale Neoplasien und das Carcinoma in situ ist eine endoskopische evtl. auch chirurgische lokale Tumorexzision (Ampullektomie, Papillenresektion) im Gesunden adäquat [40]. Dieses eingeschränkt radikale Verfahren ist außerdem bei Patienten mit hohem Operationsrisiko durch den radikalchirurgischen Eingriff, sowie bei kleinen Karzinomen < 1 cm (klinisch oder intraoperativ Stadium I), low-grade-Tumoren (G1, 2) und fehlender Lymphgefäßinvasion vertretbar [3]. Nach Eickhoff et al. ist die lokal endoskopische Resektion in spezialisierten Zentren Therapie der ersten Wahl sofern keine Zeichen der lokalen Tiefeninfiltration oder histologische Hinweise auf ein Karzinom oder Fernmetastasen vorliegen [12]. Das invasive Ampullenkarzinom wird demgegenüber mit kurativem Ziel chirurgisch angegangen. Zur Verfügung stehen hier die konventionelle partielle Duodenopankreatektomie (Operation nach Whipple-Kausch: Entfernung des ganzen Pankreaskopfes und Duodenums sowie Teilentfernung des Gallenganges und des Magens) sowie die pyloruserhaltende partielle Duodenopankreatektomie. Nach onkologischen Kriterien sind beide Verfahren als gleichwertig anzusehen. Die geringeren funktionellen Beschwerden sowie die Tatsache, dass sich Ampullenkarzinome kaum je in Regionen ausbreiten die hierbei nicht entfernt werden, sprechen für das magenerhaltende Vorgehen. Bei Tumorbefall des Duodenums ist die (klassische) partielle Duodenopankreatektomie vorzuziehen. Bei Ikterus wird allgemein präoperativ eine endoskopische Stenteinlage vorgenommen [3]. Die Entfernung der regionären Lymphknoten, entsprechend dem Vorgehen bei Pankreaskopfkarzinom, empfiehlt sich aus onkologischen Überlegungen und zum genauen Tumorstaging. Der therapeutische Nutzen ist allerdings bislang nicht erwiesen [3]. Der Nutzen einer neoadjuvanten und adjuvanten Therapie ist bislang ebenfalls nicht erwiesen, und deshalb nur in Studien vertretbar [3, 40]. Bei nicht resektablen Tumoren stehen als Palliativmaßnahmen (z.T. kombiniert) medikamentöse, zytostatische, endoskopische, operative, radiotherapeutische und insbesondere supportive Maßnahmen zur Verfügung. Bei Ikterus ist zur Beseitigung der Galleabflußstörung eine endoskopische Schlingenabtragung, Sphinkterotomie, Stent-Einlage oder perkutane transhepatische Galleableitung möglich. Bei Duodenalverschluß mit Magenentleerungsstörung erfolgt die konventionell oder laparoskopisch durchgeführte Gastrojejunostomie, evtl. in Kombination mit einer biliodigestiven Anastomose [3, 6, 40]. Der Wert einer strukturierten Tumornachsorge zur Rezidivfrüherkennung und Prognoseverbesserung ist bisher nicht belegt. Die Nachsorge sollte symptomorientiert Einleitung -9- erfolgen [3, 24]. Prognostisch kann bei allen Patienten (resezierte und nicht resezierte) im heutigen Krankengut mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von etwa 40% gerechnet werden [40] (50% bei Pessot et al. [46]). Die mediane Überlebenszeit liegt bei etwa 40 Monaten [40]. Aufgrund früher stenosebedingter Symptome sind ca. 80-90% der Tumoren mit kurativer Intention chirurgisch angehbar (Resektionsrate). Von allen Resektionen sind dabei 90-98% R0-Resektionen (Tumorentfernung im Gesunden, d.h. histopathologisch sind die Resektionsränder tumorfrei) [40]. In einer Studie von Schramm et al. [51] waren 71% resektabel. Die durchschnittliche 5-Jahres-Überlebensrate nach Resektion von Papillenkarzinomen liegt bei 50% (Schwankungsbreite 30-60%). Sie liegt damit deutlich über der von duktalen Pankreaskopfkarzinomen (ca. 10%) [28]. Die Kenntnisse über Prognosefaktoren beim Ampullenkarzinom sind, verglichen mit anderen Tumorentitäten, relativ begrenzt. Das liegt zum einen an der geringen Häufigkeit von Ampullenkarzinomen und zum anderen an der oben beschriebenen, überholten gemeinsamen Betrachtung der periampullären Karzinome. Außerdem spielen Probleme bei der genauen Zuordnung eine Rolle [40]. Wichtigster Prognosefaktor ist die Operabilität, eine frühe Diagnose ist somit verlaufsentscheidend [14, 40]. Die Prognose von operierten Papillenkarzinomen ist abhängig von der anatomischen Ausbreitung, also von der lokalen Tumorausbreitung und Infiltration des Primärtumors, sowie vom Lymphknotenstatus (lymphogene Metastasierung) [17, 28, 40]. Sind lediglich die Ampullenschleimhaut und der Oddi-Sphinkter infiltriert (pT1) so kann mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von mehr als 80-90% gerechnet werden. Bei einer Infiltration des Pankreas hingegen nur mit 30% [40]. Weitere Prognosefaktoren sind Grading (G3 bzw. high grade ungünstig) [17, 38, 40], histologischer Typ (bessere Prognose bei papillären Karzinomen als bei Karzinomen vom pankreatobiliären und muzinösen Typ, kleinzellige und neuroendokrine großzellige Karzinome sind sehr aggressiv), makroskopischer Tumortyp (ulzerierende Tumoren ungünstig), Tumorgröße (>2-2,5 cm ungünstig), Zeichen der vaskulären und perineuralen Infiltration [38, 40], sowie die anatomische Lage (rein ampulläre Tumore haben eine bessere Prognose [10]). Einleitung 1.2. - 10 - Stand der Forschung: Heute geht man davon aus, dass beim Übergang vom Adenom in ein Karzinom verschiedene molekulargenetische Prozesse in der Zelle eine Rolle spielen. So unterscheidet sich beispielsweise das Expressionsprofil bestimmter Gene von Karzinomzellen stark von dem gesunder Zellen desselben Gewebetyps. Es liegen bereits einige diesbezügliche Forschungsergebnisse für Karzinome der Papilla Vateri vor, von denen im Folgenden einige erläutert werden sollen. Le Pessot et al. [46] konnten bei einer retrospektiven Studie 2004 in der Klassifikation der histologischen Ampullenkarzinom-Subtypen pankreatobiliär, intestinal und Mischtypen einen signifikanten prognostischen Marker entdecken. Dabei betrug die 5-Jahres-Überlebensrate bei operierten intestinal differenzieren Karzinomen 100% gegenüber 35% bei pankreatobiliär differenzierten Ampullenkarzinomen. Außerdem fanden sie in den Cytokeratinen 7 und 20 (CK7 und CK20) hilfreiche Marker für die Identifikation der histologischen Subtypen: Intestinal differenzierte Karzinome waren überwiegend CK7-/CK20+, pankreatobiliär differenzierte Subtypen überwiegend CK7+/CK20-. Perrone et al. untersuchten die Expression von Cyclooxygenase-2 (COX-2) in Ampullenkarzinomen [45] vor dem Hintergrund, dass die regelmäßige Einnahme von COXHemmern (nichtsteroidale Antiphlogistika) epidemiologischen Studien nach mit einer verminderten Inzidenz gastrointestinaler Tumoren einhergeht. Bei den immunhistochemischen Untersuchungen zeigte sich eine erhöhte COX-2- Expression in 77,8% der ampullären Karzinome. COX-2 entpuppte sich dabei auch als ein hilfreicher Marker zur Differenzierung zwischen intestinal und pankreatobiliär differenzierten Ampullenkarzinomen; 95,2% der intestinal differenzierten, und lediglich 50% der pankreatobiliär differenzierten Ampullenkarzinome zeigten eine erhöhte COX2-Expression. Vermutet wird dabei dass eine erhöhte COX-2 Expression zu einer verstärkten Angiogenese und damit einem verstärkten Wachstum des Tumors führt [44]. Santini et al. zeigten, dass die erhöhte Expression von COX-2 mit einem schlechterem „Outcome“ von Patienten mit resiziertem Ampullenkarzinom verbunden ist [50]. Park et al. [42] konnten zeigen, dass der Expressionsverlust von E-Cadherin und Beta-Catenin signifikant assoziiert ist mit der Differenzierung von Tumorzellen (im Sinne der AdenomKarzinom-Sequenz). Der E-Cadherin-Catenin-Proteinkomplex ist maßgeblich an der Verbindung zweier Epithelzellen über die „zona adhaerens“ beteiligt; folglich hängt diese Einleitung - 11 - Verbindung (bzw. deren Lösung) eng zusammen mit der Fähigkeit zur Invasion von Karzinomzellen. Bei Park et al. zeigten nur 6,1% der immunhistochemisch untersuchten Adenome der Ampulle, aber 65,8% der Karzinome der Ampulla Vateri einen Expressionsverlust des E-Cadherins. Außerdem war der Expressionsverlust beider Gene signifikant mit einer schlechteren Prognose assoziiert. Tang et al. [58] zeigten in ihren immunhistochemischen Versuchen, dass die Expression des „KL-6-Muzins“ signifikant mit schlechten Verläufen von Papillenkarzinomen in Verbindung steht. So wurde in 68,4% der untersuchten Gewebe von operierten Ampullenkarzinomen (Duodenopankreatektomie oder lokale Resektion) eine Expression dieses Gens gefunden. Im umgebenden tumorfreien Gebieten der Ampulle konnte dagegen keine Expression nachgewiesen werden. In invasivem Tumorgewebe im Pankreas und Duodenum, sowie in Tumorzellen von Lymphknotenmetastasen wurde ebenfalls Expression von KL-6-Muzin nachgewiesen. Positive Expression des KL-6 ist demnach signifikant verbunden mit Lymphknoten-Metastasierung, Pankreas- und Duodenal-Invasion, sowie fortgeschrittenen TNM-Stadien, also mit einer schlechten Prognose des Ampullenkarzinoms. 1.3. Projektbezogene Vorarbeiten der Arbeitsgruppe: Ein Schwerpunkt unserer Arbeitsgruppe ist die Durchführung von Expressionsprofilanalysen zur Identifizierung differenziell exprimierter Gene bei gastrointestinalen Tumoren, mit anschließender struktureller und funktioneller Charaktisierung unbekannter Gene. Im Vordergrund steht dabei die „DNA-Array-Technologie“, welche die simultane Untersuchung einer großen Anzahl von Genen erlaubt. Das Prinzip dieser Technologie besteht in der Fixierung von DNA-Fragmenten (cDNA oder PCR-Produkte) der zu untersuchenden Gene in regelmäßiger Anordnung und hoher Dichte auf Nylonmembranen (ca. 20 cm2 groß) oder auch auf Glasplatten (1 cm2 oder kleiner, hier spricht man von „Microarrays“). Diese DNA-Proben werden dann mit 33P-markierter mRNA (oder fluoreszierender mRNA für Microarrays) aus verschiedenen Gewebeproben nach Standardprotokollen hybridisiert. Die Analyse der Signalintensitäten auf den Arrays (gebräuchliche PhosphorImager-Technologie bei Nylonmembranen oder mit „chip-reader“ bei Glasarrays) mit anschließender Quantifizierung der Signale mittels spezieller PC-Software erlaubt Rückschlüsse auf die Expressionsstärke der einzelnen Gene in den verschieden Proben [8]. Einleitung - 12 - Die Gesamtmenge an Genen im menschlichen Genom wird auf 30-40 000 geschätzt. Vermutlich werden ca. 10-20 000 dieser Gene zu jeder Zeit in den Zellen exprimiert und stellen somit das „Expressionsprofil“ der entsprechenden Zelle/Gewebe dar. Bei maligner Tranformation einer Zelle ändert sich die Expression von ca. 1000-2000 Genen, dies führt dann zu einem neuen Expressionsprofil [8]. Bei der Analyse von DNA-Arrays entstehen also enorme Datenmengen. Eine Strategie, um aus dieser Menge an potentiell relevanten Genen solche mit wichtigen Funktion im Karzinom herauszufiltern, ist die Zusammenstellung von sog. KandidatengenArrays mit limitierter Genanzahl, mit denen bei vetretbaren Kosten größere Serien von Experimenten durchgeführt werden können. Dafür wurden in unserer Arbeitsgruppe Arrays entwickelt, die ausschließlich aus den Kandidatengenen bestehen, welche bereits im Rahmen verschiedener differentieller größerer Genexpressionsstudien identifiziert wurden [20, 21, 23]. Diese ca. 450 Gene wurden durch verschiedene Zellzyklus-Kontrollgene, Phosphatasen, seruminduzierbare Gene, Transkriptionsfaktoren und durch kommerziell erhältliche cDNAFilter ergänzt, so dass Arrays von rund 2000 potentiell relevanten Genen entstanden. Mit diesen Arrays wurden die Expressionsprofile u.a. von primären Geweben des Pankreas ermittelt (gesundes Pankreas, Pankreatitis, Pankreaskarzinom, hier eingeschlossen Karzinome der Ampulle). Mehrere Gene, unter anderem der autocrine motility factor receptor (AMFR), zeigten ein differentielles Expressionsmuster (Überexpression in malignen Tumoren im Vergleich zu normalen Geweben oder entzündlichen Prozessen) und wurden für spätere funktionelle Analysen ausgewählt. Bei der Analyse der Daten von Karzinomgeweben fiel darüber hinaus auf, dass der AMFR in Karzinomen der Ampulla Vateri besonders deutlich überexprimiert war. Ausgehend von den Expressionsprofilen der verschiedenen Gewebe wurde in einem besonderen Analyse-Ansatz erprobt, ob es anhand der Expression bestimmter Gene möglich ist, pathologisch veränderte Gewebe der Pankreas in Karzinom oder Entzündung zu differenzieren. Dafür wurden die Kandidatengene mit insgesamt 45 mRNA-Proben von Karzinomgewebe sowie 23 mRNA-Proben von Pankreatitisgewebe hybridisiert, und die relativen Expressionsstärken ermittelt. Aus den Daten dieser Arrays wurde rechnerisch ein sog. Entscheidungsbaum für die Differenzierung erstellt (s. Abb. 2). Dabei wird für jedes einzelne Gen jeweils ein Wert der relativen Expressionsstärke als Grenze zwischen „normaler Expression“ und „Überexpression“ festgelegt, der das beste Verhältnis zwischen Sensitivität und Spezifität der Unterscheidung gewährleistet (sog. „cut off“, bei AMFR z.B. 0,3527). Einleitung - 13 - Anschließend wird die Kombination von Genen ermittelt, die mit möglichst wenigen Entscheidungsschritten eine vollständige Trennung der beiden diagnostischen Klassen („maligne“ vs. „entzündlich“) erlaubt. Interessanterweise wurde dabei das AMFR-Gen als am besten geeignet für den ersten Trennungsschritt („Wurzel“ des Entscheidungsbaums) ermittelt: Durch die Bestimmung der Expression von AMFR konnten hier schon 91% der Karzinome und 83% der Pankreatitiden richtig differenziert werden. Eine vollständige Trennung der beiden Klassen war mit 6 Genen möglich (Abb. 2). AMFR >0.3527 [4,19] [41,4] p53 cyclin D3 >1.394 >0.1005 [1,19] [41,2] [3,0] NFATc.b CLTCL2 [0,2] >0.238 [1,0] [0,19] >1.108 cancer inflammation [1,2] [40,0] EST H26271 >0.494 cancer inflammation cancer [1,0] cancer Abb. 2: [0,2] inflammation Entscheidungsbaum, Karzinom vs. Pankreatitis Mit dem Entscheidungsbaum kann jede der 68 Gewebeproben anhand der Expression von 6 Genen (blaue Punkte) eindeutig der Klasse „maligne“ (rote Punkte) oder „entzündlich“ (gelbe Punkte) zugeordnet werden. An jedem Knoten des Entscheidungsbaums werden die Proben entsprechend des „cut-off“-Wertes für das jeweilige Gen entweder in den rechten oder linken Zweig eingeordnet, bis eine eindeutige Zuordnung erreicht ist. Die Zahlen in eckigen Klammern geben an, wie viele maligne (rot) bzw. entzündliche (gelb) Proben in den jeweiligen Zweig eingeordnet werden. Abkürzungen: AMFR= Autocrine Motility Factor Receptor, CLTCL2= Clathrin heavy chain 1, NFAT= Nuclear factor of activatet t-cells, EST=Expressed sequence Tag Da über die Funktion des AMF-Rezeptors und seine potentiellen Bedeutung bei Prozessen wie Proliferation, Invasion und Metastasierung im Pankreaskarzinom und Papillenkarzinom noch keine Daten Vorlagen, sollte er im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht werden. Einleitung 1.4. - 14 - Der Autocrine Motility Factor Receptor (AMFR): Der Autocrine Motility Factor Receptor wird auch „Glycoprotein 78“ (gp 78), und „RNF 45“ genannt. Das Gen ist auf Chromosom 16 q 21 lokalisiert und besteht aus 14 Exons, die 64,1 kb umfassen. Die mRNA existiert in zwei verschieden Transkript-Varianten mit unterschiedlichen offenen Leserahmen (Variante 1 mit 1125 bp und Variante 2 mit 1932 bp). Daraus gehen durch Translation auch 2 verschiedene Isoformen des Rezeptors hervor: Isoform 1 mit 323 AS und einem Molekulargewicht von ca. 34 kDa, und der eigentliche AMF-Rezeptor, Isoform 2 mit 643 AS und einem MW von ca. 73 kDa [39]. Der AMF-Rezeptor ist ein Zell-Oberflächenprotein und besitzt als solches die Funktion eines Rezeptors für seinen Liganden AMF, er wird durch diesen phosphoryliert und damit aktiviert [39]. Der durch AMF und AMFR induzierte Signalweg führt bei einigen Tumoren zur verstärkten Proliferation von Tumorzellen [10, 42, 61, 63]. Die Aktivierung des AMF-Rezeptors durch seinen Liganden stimuliert gerichtete und ungerichtete Zellbewegung und trägt somit vermutlich zum Vorgang der Metastasierung bei [10, 17, 18, 24, 27, 29, 31, 65] u.a. Der AMF-Rezeptor gilt als Marker für Metastasierung und wird bei einigen Tumoren mit einer schlechteren Prognose in Verbindung gebracht. So ist bei Nakamori et al. [36] die erhöhte Expression von AMFR im Kolorektalen Karzinom signifikant mit einer schlechteren Prognose, sowie mit einer erhöhten Rezidivinzidenz verbunden. Die Expression von AMFR korreliert hier mit dem Tumorfortschritt (Stadium nach TNM-Klassifikation). Jiang et al. [27] konnten in ihren Versuchen eine erhöhte Expression von AMFR und seinem Liganden im Mamma-Karzinom und ein schlechteres Outcome der Patientinnen mit AMFR-Überepression nachweisen. Ganz ähnlich konnten Kaynak et al. [31] zeigen, dass die Expression von AMFR ein schlechtes operatives Outcome von Patienten mit nicht kleinzelligen Bronchialkarzinomen (Adenokarzinom) vorhersagt. Bei Timar et al. [59] ist die Expressionsstärke von AMFR im Malignen Melanom signifikant mit der Wachstumsphase des Karzinoms gekoppelt: Er ist beim vertikalen Wachstum (welches durch den Durchbruch der Basalmembran zu Metastasen führt) stärker exprimiert als beim radiären Wachstum. Die Ergebnisse von Onishi et al. sowie Tsutsumi et al. deuten darauf hin, dass AMFR und sein Ligand nicht nur bei der Tumorprogression und der Metastasierung eine Rolle spielt Einleitung - 15 - sondern auch an den Vorgängen der Zelltransformation im Rahmen der Onkogenese beteiligt ist [42, 61]. Außerdem besitzt gp78 als ein „Sieben-Transmembran-Protein“ eine „Ring-FingerUbiquitin-E3-Ligase-Aktivität“ und ist so, lokalisiert im Endoplasmatischen Retikulum, beteiligt am Abbau von Proteinen [10, 14, 61, 65]. Auch diese Eigenschaft trägt vermutlich zur prometastatischen Aktivität von AMFR/ gp78 bei, nämlich indem es unter anderem speziell für den Abbau des transmembranen Proteins KAI1 (CD82) verantwortlich ist, welches als Metastasierungs-Suppressor wirkt [61]. Interessant ist auch ein von mehreren Autoren beschriebener Zusammenhang von AMFR und seinem Liganden mit Rheumatoider Arthritis [18, 24 ,51, 68]. Schaller et al. fanden heraus, dass ein beträchtlicher Anteil der Aufrechterhaltung des entzündlichen Geschehens bei Rheumatoider Arthritis auf die überhöhte Anwesenheit von AMF und gegen diesen gebildete Autoantikörper in der Synovialflüssigkeit zurückzuführen ist [51]. 1.5. Der Autocrine Motility Factor (AMF): Der Autocrine Motility Factor ist identisch mit „GPI“, Neuroleukin (NLK), Maturation Factor (MF) und „sperm antigen 36“. Das Gen liegt auf Chromosom 19 q 13.1, ist ca. 35,4 kb groß, und besteht aus 18 Exons. Die mRNA (2075 bp) kodiert für ein Protein aus 557 AS mit einem Molekulargewicht von ca. 63 kDa, welches interessanterweise intrazellulär und extrazellulär sehr unterschiedliche Funktionen einnimmt. Intrazellulär fungiert das Protein als wichtiges Enzym des Glucosestoffwechsels, als Glucose-6-Phosphat-Isomerase (GPI) welche bei der Glycolyse die Umwandlung von Glucose-6-Phosphat in Fructose-6-Phosphat katalysiert [39]. Im Extrazellulärraum, wohin es durch eine sog. „go-Komponente“ gelangt, nimmt das Protein die Funktion des AMF ein, welches durch die Bindung an seinen Rezeptor als Zytokin wirkt und bestimmte Signalwege aktiviert. Die parakrine Funktion von AMF ist also an die Anwesenheit seines Rezeptors gekoppelt und setzt eine gleichzeitige Expression von AMFR voraus [68]. Nach Haga et al. [24] induziert der AMF in Tumoren einen komplexen Signalweg welcher die Expression von Genen und deren Proteinen verhindert, die an der Bildung des sog. „Apoptosom-Komplexes“ beteiligt sind. Dadurch entsteht bei den Zellen eine „antiapoptotische Aktivität“ welche die Zellen vor Apoptose schützt und resistent gegen Medikamenten-induzierte Apoptose werden lässt (Zytostatikaresistenz). Einleitung - 16 - Die Ergebnisse der Versuche von Funasaka et al. [18] deuten darauf hin, dass die Expression von AMF unter hypoxischen Bedingungen über einen Signalweg mit „hypoxia-inducible factor (HIF)“ reguliert wird, und dadurch in der Zelle die Bildung von Energie durch anaerobe Glycolyse steigt. Andere Experimente von Funasaka et al. lassen vermuten dass AMF bei der Neovaskularisierung in Tumoren eine Rolle spielt indem es parakrin auf Endothelzellen als angiogenetischer Faktor wirkt [17]. Tsutsumi et al. [61] konnten 2004 nachweisen, dass die Überexpression von AMF in MIA PaCa-2 Zellen in vitro das Invasionspotential steigerte. Außerdem bildeten in vivo AMFtransfizierte MIA PaCa-2-Zellen in Nacktmäusen große Tumoren mit Lebermetastasen; relativ gesehen zu untransfizierten oder „Leervektor-transfizierten“ Zellen welche kleinere Tumoren ohne Metastasen bildeten. 1.6. Ziele der Arbeit: Im Rahmen dieser Arbeit sollte die bei den Expressionsprofilanalysen detektierte Überexpression des AMF-Rezeptors durch qRT-PCR und Northern Blots verifiziert werden, um anschließend die funktionelle Rolle des AMFR und seines Liganden für das Karzinom der Ampulla Vateri zu untersuchen. Dabei sollte der Einfluss der AMFR-Expressionsstärke (stärkere oder schwächere Expression als ursprünglich) auf die Prozesse der Proliferation, Migration, Invasion und Metastasierung einer humanen Papillenkarzinomzelllinie genauer untersucht werden. Für die Experimente sollte AVC1, eine Zelllinie eines Karzinoms der Ampulla Vateri herangezogen werden. Bei dieser von Sorio et al. etablierten Zelllinie handelt es sich um eine Zelllinie welche von einem Karzinom abstammte, das einer 71-jährigen Patientin entstammte, welche 1997 einer Duodenopankreatektomie unterzogen wurde. Makroskopisch war die Papilla Vateri durch eine 0,8cm messende villöse Läsion verlegt. Histopathologisch handelte es sich um ein mäßig differenziertes Adenokarzinom der Ampulla Vateri welches den Oddi Sphinkter infiltrierte und sich lokal bis zur Duodenalmukosa ausgebreitet hatte (T1.N0.M0) [55]. Obgleich das Papillenkarzinom ein eher seltener Tumor ist, ist dessen genauere Untersuchung deshalb interessant, weil es zwischen 33 und 36% aller operablen pankreatoduodenalen Tumoren ausmacht [46, 55]. Außerdem ähnelt es in seiner Pathogenese anderen, häufigeren Einleitung - 17 - Tumoren des Gastrointestinaltraktes (z.B. Rektumkarzinom) (s.1.1.2.), Aufschlüsse über Abläufe bei seiner Karzinogenese können auch Aufschlüsse für die anderen Tumoren bringen. Wäre in AMFR ein spezifischer Marker für das Papillenkarzinom gefunden, so wäre das eventuell auch aus diagnostischen Gesichtspunkten von Interesse; da hier die histologische Differenzierung zwischen Adenom und Karzinom manchmal schwierig ist [60]. Ein sicherer Ausschluss eines Karzinoms kann eine lokale Tumorexzision rechtfertigen, und so einen radikalchirurgischen Eingriff vermeiden. Material und Methoden - 18 - 2. Material und Methoden 2.1. Chemikalien und Puffer: Die verwendeten Chemikalien wurden von den Firmen Merck, Roche, Fluka, Roth u.a. bezogen und besaßen den Reinheitsgrad „pro analysi“. Spezielle Chemikalien sind in den jeweiligen Abschnitten entsprechend erwähnt. Für die Versuche wurden folgende Puffer und Lösungen angesetzt: Tab. 3: Puffer und Lösungen (alphabetisch): 5% Bacto-Agar Bacto-Agar 5 % (w/v) dd H2O ad gewünschtes Vol. → Autoklavieren DEPC-H2O Diethylpyrocarbonat in ddH2O 0,1 % (v/v) → 12 h, 37°C → Autoklavieren 1% Formaldehyd-Gel Hybridisierungspuffer Kristallviolett-Lösung Ladepuffer (Gelelelektrophorese) Lysispuffer (RNA-Isolierung) Agarose 1,5 g DEPC H2O 111 ml 10x MOPS 15 ml Formaldehyd für RNA 24 ml 20x SSC 0,25 Vol. Formamid deionisiert 50 % (v/v) Natriumlarylsarcosin 0,1 % (w/v) SDS 0,02 % (w/v) Blocking-Reagenz (Fa. Böhringer) 2 % (w/v) Violet 2,5 g Methanol 100 ml H2O 400 ml 50 x TAE-Puffer 4 % (v/v) Glycerin 25 % (v/v) 10% SDS 5 % (v/v) RLT-Puffer (aus RNeasy 100 Midi Kit, Fa. Qiagen) % (v/v) ß-Mercaptoethanol % (v/v) 1 Material und Methoden 10 x MOPS-Puffer 10 x PBS Prähybridisierungspuffer - 19 - MOPS 42 g 3 M Na-Acetat (pH 8,8) 16,7 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) 20 ml DEPC-H20 ad 1l → pH 7,0 KCL 0,2 g NaCl 8,0 g KH2PO4 0,2 g NaHPO4 1,15 g ddH2O ad 1 l Hybridisierungspuffer 1 ml Salmon Sperm DNA (davor 5 min 95°C und auf Eis) 7,5 µl 10 µl Formamid deionisiert 500 µl Formaldehyd für RNA 167 µl 10x MOPS-Puffer 100 µl DEPC H2O 233 µl → auf Eis 175,3 g 88,2 g ddH2O ad 1 l 1M Na-P-Puffer (pH 7) 5 ml 10% SDS 10 ml dd-H2O ad 1 l Na2-EDTA 50 mM Tris 2 M 100% Acetat 5,5 % (v/v) Na2-EDTA 50 mM Tris 2 M 100% Acetat 5,7 % (v/v) 20x SSC 100 ml 10% SDS 10 ml Kanister-H2O ad 1 l tRNA Probenpuffer (für NB) 20 x SSC (Natriumchlorid- NaCl Natriumcitrat-Lösung) Natriumcitrat Stripping-Lösung (für NB) 50 x TAE (Tris-AcetatEDTA)-Puffer 1 x TE (Tris-EDTA)Puffer Wasch-Puffer 1 (2x SSC, 0,1% SDS) Material und Methoden Wasch-Puffer 2 (0,2x SSC, 0,1% SDS) 2.2. - 20 - 20x SSC 10 ml 10% SDS 10 ml Kanister-H2O ad 1 l Gewebe, Organismen, Nukleinsäuren und Klonierungsvektoren: 2.2.1. Gewebe: Die in dieser Arbeit eingesetzten Gewebe für die Isolierung von RNA waren Gewebeteile aus Pankreasresektaten (gesundes Pankreas, Pankreatitis und Pankreaskarzinom) und Papillenresektaten (Papillenkarzinom), und entstammten den Abteilungen für Chirurgie der Universitätskliniken Ulm und Homburg Saar, sowie der Abteilung für Pathologie der Universitätsklinik Verona. Um bezüglich dem Gebrauch archivierter Gewebe für die klinische Forschung dem deutschen Gesetz zu entsprechen wurde das Material anonymisiert. Die Genehmigung wurde von den lokalen Ethikkomissionen erteilt. 2.2.2. Organismen: Bakterienstämme: Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Bakterienstämme verwendet: - E. coli-Stamm „BL21” (Fa. Amersham Biosciences, Freiburg) Genotyp: „B F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal, dcm.” - E. coli-Stamm „One Shot® Top10 Chemically Competent E. coli“(Fa. Invitrogen life technologies, Karlsruhe) Genotyp: „F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 araD139 ∆(araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG” Material und Methoden - 21 - Zellkulturlinien: Im Rahmen dieser Arbeit wurden folgende Zelllinien eingesetzt: Tab. 4: Zelllinien: Abkürzung: Zelltyp: Herkunft: Medium: AVC1 Humane Abteilung für Ampullenkarzinom- Pathologie der Zelllinie Universitätsklinik Verona. RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Suit-2 007 Subklon einer Lebermetastase eines humanen Pankreasadenokarzinoms Abteilung für Innere Medizin I der Universitätsklinik Ulm D-MEM (Dulbecco´s Modified Eagle Medium) Suit-2 028 Subklon einer Lebermetastase eines humanen Pankreasadenokarzinoms Abteilung für D-MEM Innere Medizin I der Universitätsklinik Ulm Panc-1 Humane PankreaskarzinomZelllinie Abteilung für Innere Medizin I der Universitätsklinik Ulm MIA PaCa-2 Humane PankreaskarzinomZelllinie Abteilung für DMEM Innere Medizin I der Universitätsklinik Ulm D-MEM 2.2.3. Nukleinsäuren: Primer (Fa. Biomers.net GmbH, Ulm Germany): Tab. 5: Primer: Für: Primername Sequenz RTPCR AMFR-RT1-forw 5’-aag ttc tga aga tga tgc ggc-3’ AMFR-RT1-rev 5’-tgc tcc tga agc ctc cgt tc-3’ xs13 for 5’-gtc gga gga gtc gga cga g-3’ xs13 rev 5’-gcc ttt att tcc ttg ttt tgc aaa-3’ Cyclo for 5’-ccc tcc acc cat ttg ct-3’ Cyclo rev 5’-caa tcc agc tag gca tgg ga-3’ Material und Methoden Radio aktive Sonde pBigInsert - 22 - AMFR_ORF_Sonde_forw 5’-ggc acc atc atc agc gcc ta-3’ AMFR_ORF_Sonde_rev 5’-atg acc agg ctg gcc atg ga-3’ amf_gpi forw 5’-cac cat ggc cgc tct cac ccg g-3’ amf_gpi rev 5’-ttg gac tct ggc ctc gcg ctg-3’ AMFR-kpn+ATG for 5’-ggg gta cca tgc cgc tgc tct tcc tcg a3’ AMFR-SpeI+Stop rev 5’-cct gat cac tag gag gtc tgc tgc ttc tga a-3’ Akürzungen: RT-PCR= real time polymerase chain reaction, RT= real time, AMFR Autocrine motility factor receptor, Cyclo=Cyclophilin, for=forward, rev=reverse, amf= autocrine motility factor, gpi=glucose phosphat isomerase, g= Guanin, a=Adenosin, t=Thymin, c= Cytosin. siRNA „®Silencer Pre-designed siRNA“ (Fa. Ambion Europe Ltd., Huntington Cambridge, UK) Tab. 6: siRNA: Name ID# Zielgen Sequenz si1 106386 human AMFR 5’-GGACGGAUUCAAGUACCUUtt-3’ si2 106387 human AMFR 5’-GGACGAAGUCCUCCAGCAAtt-3’ si3 106388 human AMFR 5’-GGAACUCUUGGUUCGAUACtt-3’ Abkürzungen: siRNA: silencer Ribonucleinsäure, AMFR= Autocrine motility factor receptor, 2.2.4. Expressionsvektoren: In dieser Arbeit wurden folgende Plasmid-Vektoren verwendet: Tab. 7: Vektoren: Vektor Eigenschaften Herkunft pEYFPN1-AMFR Fusion von AMFR mit „enhanced yellow fluorescent protein“ Abteilung für Innere Medizin I der Universitätsklinik Ulm pEYFPN1-AMF Fusion von AMF mit „enhanced yellow fluorescent protein“ Abteilung für Innere Medizin I der Universitätsklinik Ulm pOTB7-AMFR oriR pUC, CmR, T7 Promotor, Abteilung für Innere SP6, mit humanem AMFRMedizin I der Gen Universitätsklinik Ulm pBIG2i Doxycyclin-induzierbarer Expressionsvektor Abteilung für Innere Medizin I der Universitätsklinik Ulm Material und Methoden 2.3. - 23 - Standardtechniken im Umgang mit Nukleinsäuren: Beim Umgang mit RNA wurde zur Vermeidung von Kontamination durch RNasen stets auf eine sorgfältige Arbeitsweise geachtet (Verwendung von Handschuhen, sterilen und gestopften Pipettenspitzen und allgemein sauberem Arbeitsmaterial). 2.3.1. Extraktion von Gesamt-RNA aus Gewebe bzw. adhärenten Zellen: Die Isolierung und Aufreinigung von Gesamt-RNA aus Gewebe sowie aus kultivierten adhärenten Zellen erfolgte mittels des RNeasy Midi Kit (Fa. Qiagen; Hilden). Gewebe, welches nach seiner Entnahme sofort mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C aufbewahrt wurde, wurde zunächst mit einem sterilen Mörser in flüssigem Stickstoff sorgfältig gemörsert, und in ein vorbereitetes Falkon-Gefäß mit vorgelegtem Lysispuffer (s. 2.1.) gegeben. Kultivierte adhärente Zellen wurden 2x mit kaltem PBS (s. 2.1.) gewaschen, mit 4ml Lysispuffer überschichtet, und geschwenkt. Die Zellen wurden mit einem sog. Zellscraper von ihrer Bodenhaftung befreit, und in ein steriles Falcon-Gefäß überführt. Zur Weiterverarbeitung wurden die Zellen mit einer Spritze und einer Kanüle von 0,8mm Durchmesser homogenisiert. Die Extraktion der Gesamt-RNA erfolgte nach Herstellerprotokoll: Nach Zugabe von 1Vol. 70% Ethanol und vorsichtigem vortexen, wurde das Zelllysat auf die dafür vorgesehenen Säulen gegeben und bei 3000-5000x g für 5 min zentrifugiert. Die Flüssigkeit im Röhrchen wurde verworfen und die Säule wurde dann 1x mit 1Vol. RW1-Puffer und 2x mit 0,6Vol. RPE-Puffer (beide im Kit enthalten) gewaschen (jedes Mal Zentrifugation wie oben). Nach Überführung der so gereinigten und getrockneten Säule in ein neues Sammelgefäß wurde die an die Membran gebundene RNA mit im Kit enthaltenem RNase-freiem H2O eluiert (bei 4ml Zelllysat wurde mit 200µl RNase-freiem H2O eluiert). Nach Entnahme der benötigten Menge des Eluats für die photometrische Konzentrationsbestimmung sowie die Überprüfung der RNA-Qualität durch AgaroseGelelektrophorese wurde die RNA für spätere Analysen bei -80°C gelagert. Material und Methoden - 24 - 2.3.2. Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren: Die Konzentration von Nukleinsäuren (RNA oder DNA) in wässriger Lösung wurde photometrisch in einem Spektralphotometer („BioPhotometer 6131“ Fa. Eppendorf, Hamburg) bestimmt. Die Messung erfolgte in UV-durchlässigen Einmal-Küvetten (UVKüvette mikro, Brand, Wertheim) von einer geeigneten Verdünnung der Stammlösung (z.B. 99µl H2O + 1µl Probe). 2.3.3. Ethanol-Fällung von RNA (z.B. für cDNA-Herstellung oder Northern Blot): Für die Fällung von RNA wurden die Gesamt-RNA mit 1/10Vol (v/v) 3M Na-Acetat-Puffer pH5,2 und 3Vol (v/v) 100% Ethanol versetzt. Als Fällungshilfe wurde wahlweise 1µl Muschelglycogen zugegeben. Nach gutem Vortexen wurden die Proben für mind. 30min, besser noch über Nacht bei -80°C gefällt. Nach anschließender Zentrifugation für 30min bei 14000rpm und 4°C (Dekantieren des Überstandes), wurde 1x mit 1Vol (v/v) 70% Ethanol gewaschen, dafür wurde für 5-10min bei 14000rpm und 4°C zentrifugiert. Das Pellet wurde in einer Vacuumzentrifuge (SpeedVac-Concentrator, Fa. Bachhofer Reutlingen) getrocknet. Die Weiterverarbeitung der so gefällten RNA wird in den entsprechenden Abschnitten erläutert. 2.3.4. Reverse Transkription: Herstellung von cDNA (z.B. für RT-PCR): Bei copy DNA handelt es sich um ein reverses Transcript der gesamten RNA einer Zelle. Sie spiegelt somit das Expressionsprofil einer Zelle wieder, jedoch in Form von DNA, in welcher es für bestimmte Methoden (z.B Real-Time-PCR) benötigt wird. Um genomische DNA zu entfernen, welche bei einer PCR ebenfalls amplifiziert werden könnte wurden die Proben vorweg mit DNaseI nach folgendem Ansatz behandelt: - Gesamt-RNA (Herstellung s. 2.3.1.) 10 µg - 10x PCR-Puffer 5 µl (15 mM MgCl2, Fa. Roche Applied Biosystems) - RNasin (Fa. Promega) 2 µl - DNaseI (Fa. Roche Diagnostics) 1 µl - ddH2O ad 50 µl Material und Methoden - - 25 - Inkubation bei 37°C 30 min Zur Entfernung störender Proteine wurde eine Phenol-Chloroform Extraktion nach folgendem Ansatz durchgeführt: - Zugabe von 50µl ddH2O Gesamtvolumen von 100µl - 2x Waschen mit 100µl Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Gemisch (25:24:1) - 1x Waschen mit 100µl Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (24:1) (Nach Zentrifugation für 5min bei 14000 rpm und 4°C jeweils den Überstand weiterverwenden!). Anschließend wurde die RNA gefällt (s. 2.3.3.) Zuletzt erfolgte die reverse Transkription der von DNA und Proteinen gereinigten, sowie gefällten RNA: - Random Hexamer Primer [0,5µg/µl] (Fa. MWG Biotech) 1 µl - Inkubation bei 70°C 10 minauf Eis - First Strand Buffer (Fa .Invitrogen Life Technologies) 4 µl - 0,1M DTT (Fa .Invitrogen Life Technologies) 2 µl - 10mM dNTP (Fa. PeQLab Biotechnologie) 1 µl - Inkubation bei 42°C 2 min - Reverse Transkriptase Superscript II 1 µl (Fa. Invitrogen Life Technologies) - Inkubation bei 42°C 50 min - Inaktivierung des Enzyms bei 72°C 10-15 min Die so hergestellte cDNA wurde im 1%igen Agarose-Gel elektrophoretisch (s. 2.3.6.1.) auf seine Reinheit überprüft und bei -80°C gelagert. Material und Methoden 2.3.5. - 26 - Polymerase Chain Reaction (PCR): 2.3.5.1. Konventionelle PCR: Mit PCR ist es möglich eine beliebige DNA-Sequenz welche in einer Vorlage („Template“) enthalten ist zu vervielfältigen, um für weitere Analysen ausreichend DNA zu erhalten. Als Template kann jegliche DNA dienen, ganz gleich ob es sich um die gesamte aus Zellen isolierte DNA, oder nur um ein Plasmid mit der darin enthaltenden gewünschten DNASequenz handelt. In der Reaktion dienen die beiden komplementären Stränge einer doppelsträngigen DNA als Matrize für die Reaktion. Zwei hochspezifisch bindende Primer, welche komplementär zur Matrizen-DNA sind, begrenzen den zu amplifizierenden DNABereich und dienen als Startpunkt für die Reaktion. In einem Thermocycler werden im ersten Schritt die beiden Stränge einer doppelsträngigen DNA bei einer Temperatur von 94°C voneinander getrennt („Denaturierung“). Im zweiten Schritt binden die beiden Primer bei einer für sie spezifischen Temperatur komplementär an die Matrizen-DNA und begrenzen somit den zu amplifizierenden Bereich auf der DNA („Annealing“). Im dritten Schritt erfolgt bei einer Temperatur von 72°C die durch die hitzebeständige Taq-Polymerase katalysierte komplementäre Anlagerung der zugegebenen Nukleotide (dNTP’s), ausgehend vom 3’-Ende („Elongation“). Es folgen mehrere solcher Zyklen, immer beginnend mit der Denaturierung. Da sich mit jedem Zyklus die vorhandene DNA verdoppelt kommt es zu einem exponentiellen Anstieg des Produktes. Die Anzahl der Zyklen beträgt im Schnitt 20-30, weitere Zyklen würden keine erhöhte Ausbeute des spezifischen Produkts bewirken, da hier eine gegenseitige Behinderung der Endprodukte sowie ein Verbrauch der Nukleotide beginnt. Die Annealing-Temperatur ist spezifisch für jeden Primer und abhängig von dessen Länge (Anzahl der bp) und dessen Gehalt an Guanin und Cytosin, und liegt normalerweise 2-3°C unter ihrem Schmelzpunkt. Beim sog. „Touch-Down-Programm“ wird das PCR-Gerät so programmiert dass die Annealing-Temperatur von Zyklus zu Zyklus sinkt (z.B. TD 68°C: Beginn bei 68°C), damit kann oft eine Optimierung der Ausbeute erreicht werden. PCR-Ansatz, 50µl im 0,5µl Reaktionsgefäß für Thermocycler („DNA Engine Gradient Cycler, MJ Research PTC-200, Peltier Thermal cycler“, Fa. GMI, USA): - Template (DNA) 20-500 ng - Primer forward[10 pM] 1 µl - Primer reverse [10 pM] 1 µl Material und Methoden - 10x PCR-Puffer, 15 mM MgCl2 - 27 5 µl (Fa. Roche, applied Biosystems,) - 1 µl dNTP-Mix [2 mM] (Fa. PeQLab) 1 µl - 1 µl Taq-Polymerase 1 µl (AmpliTaq DNA Polymerase, Fa. Roche, applied Biosyst.) - Evtl DMSO 5 Vol% (v/v) - H2O ad 50µl (Ampuwa® H2O für Injektionszwecke, Fa. Fresenius Kabi) Die Zugabe von DMSO ist bei einigen PCR-Reaktionen sinnvoll um die Bildung unspezifischer PCR-Produkte zu vermindern und die Ausbeute des spezifischen Produktes zu erhöhen. Anschließend wurde das PCR-Produkt durch Agarosegelelektrophorese anhand seiner Größe identifiziert und aus dem Gel isoliert, um anschließend für weitere Analysen zur Verfügung zu stehen. 2.3.5.2. Quantitative PCR/ Real Time PCR (qRT-PCR): Grundlagen: Die Real Time PCR ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren die auf dem Prinzip der herkömmlichen PCR beruht, und zusätzlich die Möglichkeit der Quantifizierung von DNA-Sequenzen in einer Probe bietet. Sie wird für die Bestimmung der relativen Expressionsstärke einzelner Gene in verschiedenen Zellproben verwendet. Um als Template für die Amplifikation dienen zu können muss die Gesamt-RNA (s. 2.3.1.) der Zellen in cDNA umgeschrieben werden (s. 2.3.4.). Die Quantifizierung wird mit Hilfe von FluoreszenzMessungen während eines PCR-Laufes (deshalb "Real Time") durchgeführt. Die Fluoreszenz nimmt proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Eine gelelektrophoretische Auftrennung der Fragmente ist damit nicht nötig, die Daten sind sofort verfügbar und das Kontaminationsrisiko ist gering. Zur Quantifizierung wird ein Fluoreszenzfarbstoff namens SYBR®Green eingesetzt, welcher sich in der kleinen Furche („minor groove binder“) doppelsträngiger DNA anlagert, und damit in seiner Menge proportional zur synthetisierten DNA ansteigt. Nach Ablauf der PCR wird Material und Methoden die Fragmentlänge - 28 und damit die Spezifität der Reaktion durch eine sog. Schmelzkurvenanalyse bestimmt. Dabei wird die DNA aufgeschmolzen, indem die Temperatur langsam kontinuierlich erhöht wird (50°C→95°C). Bei einer für die Fragmentlänge spezifischen Schmelztemperatur wird der Doppelstrang denaturiert und der Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt, hier wird eine Fluoreszenzabnahme registriert. Da die doppelsträngige DNA von spezifischen PCR-Produkten einen höheren Schmelzpunkt hat als unspezifisch entstehende Primerdimere, ist eine Unterscheidung möglich. Die Höhe des Peaks der Schmelzkurve gibt annähernd Auskunft über die Menge des gebildeten Fragments. Um die Expression des Zielgens quantifizieren zu können wird die Expression eines Referenz-Gens („Housekeeping-Gen“) zur Normalisierung mit gemessen. Dessen Signal wird verwendet um Variationen in der Ausgangsmenge der eingesetzten cDNA auszugleichen. Weil die Gesamtanalyse auf diesem Signal basiert, ist die Wahl des Referenz-Gens von entscheidender Wichtigkeit. Das ideale Referenz-Gen muss leicht zu detektieren sein, außerdem sollte dessen Expression während des Zellzyklus und zwischen verschiedenen Zelltypen nicht variieren. Für die Exprimente wurden die Gene „CyclophilinA“ (AccessionNr: BC018843) und „RPLP0“ (ribosomales Protein große Untereinheit; Accession-Nr: BC001127), als Referenz-Gene eingesetzt. Durchführung: Ansatz 50µl, in „Thermo-Fast 96 well detection Platten“ (Fa. Steinbrenner Laborsysteme GmbH, Wiesenbach) Für jedes Primer-Paar ein Doppelansatz: - SYBR®-Green PCR Master Mix 25 µl (Fa. Applied Biosystems) - 0,25 µl cDNA (Herstellung s. 2.3.3.) 0,25 µl - Primer-Mix 5 µl - H2O ad 50 µl (Ampuwa® H2O für Injektionszwecke, Fa. Fresenius Kabi) Primer Mix: - forward-Primer [10 oder 20 pMol] 6 µl - reverse-Primer [10 oder 20 pMol] 6 µl Material und Methoden - - 29 - H2O ad 50 µl Die RT-PCR erfolgte im „ABI Prism 7700 Detection System“ (Fa. Applied Biosystems, Foster City, USA) mit folgendem Programm: - 50°C 2min - 95°C 10min - 95°C 15s - 60°C 1min }40x Auswertung: Die Ergebnisse wurden mit der deltaCT-Methode ausgewertet: Für die Berechnung der relativen Expressionen des Zielgens in der cDNA-Probe wurden die CT-Werte von Zielgen und Housekeeping-Gen voneinander abgezogen (delta CT/ ∆CT). Dieser ∆CT-Wert wurde in die Potenz zur Basis 2 gesetzt, daraus wurde der Kehrwert bestimmt (1/2∆CT). Die berechneten Werte entsprachen der relativen Expression des Zielgens, und waren also umso größer je höher die Ausgangsmenge des gesuchten Gens in der cDNA-Probe war. 2.3.6. Gelelektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren: Bei Gelelektrophorese macht man sich die Eigenschaft von Nukleinsäuren, aufgrund ihrer negativen Ladung in einer geeigneten Matrix bei angelegter Spannung von der Anode (neg.) zur Kathode (pos.) zu wandern, zunutze, um die in einer Probe enthaltenen Nukleinsäuren ihrer Größe nach (Anzahl der Basenpaare) aufzutrennen. Dabei entstehen Banden aus Nukleinsäuren gleicher Größe. Dem Gel, welches als Trägermatrix dient, wird Ethidiumbromid zugefügt welches in DNA und RNA interkaliert, um später unter UV-Licht (λ=302nm) die Banden sichtbar zu machen. 2.3.6.1. Agarose-Gelelektrophorese von DNA: Zur horizontalen Auftrennung von linearisierter DNA zu analytischen und präparativen Zwecken wurde ein 1-2%iges (w/v) Agarosegel (SeaKem LE Agarose, Fa. Cambrex BioScience Rockland USA) gegossen. Hierfür wurde die benötigte Menge Agarose im gewünschten Volumen 10x TAE-Puffer (s.o.) durch Aufkochen gelöst. Dem noch flüssigen Material und Methoden - 30 - Gel wurde Ethidiumbromid in einer Konzentration von 0,5µg/ml (Stammlösung: 10mg/ml H2O).zugefügt. Das flüssige Gel wurde in eine dafür vorgesehene Form mit eingesetztem Kamm für die Geltaschen gegossen. Als Elektrophoresepuffer wurde 1x TAE-Puffer verwendet. Vor dem Auftragen wurden die Proben mit 1/5 Vol Loading Buffer (s. 2.1.) versetzt. Dieser beschwert die Proben, denaturiert durch das enthaltene Detergenz SDS eventuell enthaltene Proteine und markiert die Lauffront. Nach Erkalten des Gels bei RT wurden die Proben aufgetragen und durch Anlegen einer konstanten Spannung von 80-120V aufgetrennt. Als Größen- und Mengenmarker diente die „Smart Ladder“ (Fa. Eurogentec, Köln, band size 200-10000 bp, 5µl/lane) Abb. 3: Smart Ladder (Fa. Eurogentec) Dargestellt ist die in den Agarosegelelektrophoresen als Größen- (Band size [bp]) und Mengenmarker eingesetzte DNA-Ladder. Die aufgeführten Mengenangaben (ng/band) gelten für eine eingesetzte Menge von 5µl. Abkürzungen: bp= base pair, DNA= Desoxyribonucleinsäure, ng= nanogramm, µl= mikroliter Auf einem UV-Schirm (λ=302nm) konnten die Banden anschließend sichtbar gemacht werden. Die Dokumentation des Gels erfolgte durch Fotografie des Gels auf dem UV-Schirm mit einer Polaroidkamera (Fa. Bachhofer; Reutlingen). 2.3.6.2. Formaldehyd-Gelelektrophorese von RNA: Die Auftrennung von Gesamt-RNA erfolgte durch denaturierende horizontale Elektrophorese in formaldehydhaltigen Agarosegelen. Alle hierzu benötigten Lösungen wurden mit RNasefreiem DEPC-H2O (s. 2.1.) angesetzt. Kammer, Schlitten und Kamm wurden für mindestens 30min in 3% H2O2 eingelegt, um vorhandene RNasen zu inaktivieren, und anschließend mit DEPC-H2O gespült. Es wurde unter dem Abzug gearbeitet. Für das 1% Formaldehyd-Gel wurde die Agarose in DEPC-H2O unter Aufkochen in der Mikrowelle gelöst. Nach Abkühlen auf Handwärme wurde 10x MOPS-Puffer (s. 2.1.) und Formaldehyd zugegeben. Nach gutem Schwenken wurde das Gel gegossen. Material und Methoden - 31 - Für die Probenbehandlung wurde die zuvor mit Ethanol gefällte und getrocknete RNA (s. 2.3.3.) in je 15µl Probenpuffer (s. 2.1.) aufgenommen, ca. 6min bei 95°C denaturiert, auf Eis gegeben, und vor dem Auftragen auf das Gel mit je 5µl eines LB/Etbr-Gemischs (15% (v/v) Etbr für RNA + 100% (v/v) LB für RNA) versetzt. Bei einer konstanten Spannung von 100-110 V lief das Gel für 2-3 Stunden bis die RNA ca. 2/3 weit im Gel gelaufen war. Als Elektrophoresepuffer diente 1x MOPS-Puffer. Zur Dokumentation wurde das Gel unter UV-Licht fotografiert. 2.3.7. Extraktion von DNA aus Agarosegelen: Die Isolierung von DNA aus einem Agarosegel erfolgte mittels des „Qiaquick Gel Extraktion Kit“ (Fa. Qiagen, Hilden): Die zu isolierende DNA-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten und abgewogen. Durch Zugabe von 3Vol. QG-Puffer und Inkubation bei 50°C für 10min löste sich das Gel vollständig auf. Nach Zugabe von 1Vol. Isopropanol wurde die Lösung auf die dafür vorgesehene Säule gegeben, und 1min bei 13000rpm zentrifugiert. Nach anschließendem Waschen der Säule mit 750µl PE-Puffer und Überführen der Säule in ein frisches Gefäß konnte die DNA mit 30-50µl (je nach Bandenkonzentration) EB-Puffer oder sterilem H2O eluiert werden. Zur Bestimmung der DNA-Konzentration der so gewonnenen Probe konnte diese entweder auf einem 1%igen Agarosegel abgeschätzt (s. 2.3.6.1.), oder photometrisch bestimmt werden (s. 2.3.2.). Die DNA-Probe wurde bei -20°C aufbewahrt. 2.3.8. Northern-Blotting: Northern-Blotting dient der Übertragung gelelektophoretisch aufgetrennter RNA auf Nylonmembranen durch Kapillartransfer für spätere analytische Zwecke. Als Blotting-Puffer wurde 20x SSC-Puffer (s. 2.1.) verwendet. Hierfür wurde eine Nylonmembran (HybondTMN+, Fa. Amersham Pharmacia Freiburg) auf Gelgrösse zugeschnitten, auf der später dem Gel zugewandten Seite markiert, und 10min in 20x SSC-Puffer äquilibriert. Auf einer Glasplatte wurden für den Transfer der RNA folgende Materialien luftblasenfrei übereinander gestapelt: Material und Methoden - - 32 - 1 Lage puffergetränktes Whatman-Papier (GB 002, Fa. Merck Bruchsal), die Enden tauchten in eine mit Blotting-Puffer gefüllte Wanne. - 2 weitere Lagen puffergetränktes Whatman-Papier - Formaldehyd-Gel, mit der Oberseite nach unten (überstehende Filterpapier-Ränder mit Plastikfolie abdecken). - 3 Lagen puffergetränktes Whatman-Papier - ca. 10cm Zellstoff - Mit Glasplatte abdecken - Mit 0,5–1kg Gewicht beschweren. - Blotten für 18-24h Nach Blotabbau wurden auf der Membran unter UV-Licht die 18S und 28S-Bande (18S ≈ 1874 bp, 28S ≈ 4718 bp) markiert. Abschließend wurde die RNA durch UV-Crosslinking (UV Stratalinker 2400, Fa. Stratagene Amsterdam, Niederlande) kovalent an die Nylonmembran gebunden. Bei Raumtemperatur oder im Trockenschrank bei 180°C wurde die Membran getrocknet. Falls der Blot nicht weiterverwendet wurde, wurde er in PE-Folie eingeschweißt und lichtgeschützt bei 4°C gelagert. 2.3.9. Herstellung einer radioaktiv markierten DNA-Sonde: Die Herstellung einer spezifischen und radioaktiv markierten DNA-Sonde zur Hybridisierung eines Northern Blots erfolgte mittels PCR (s. 2.3.5.1.) und anschließendem radioaktivem Labeling. Als Template für die PCR diente eine das Zielgen enthaltene Plasmid-DNA (s. 2.2.3.). Das PCR-Produkt wurde durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt Daraus wurde die gewünschte Bande ausgeschnitten und extrahiert (s. 2.3.6.1. und 2.3.7.) Anschließend erfolgte das radioaktive Labeling der Sonde unter Verwendung des Kits „MegaprimeTm DNA Labeling system“ (Fa. Amersham Pharmacia, Freiburg) mit [α32P]dCTP (Fa. Amersham Pharmacia, Freiburg). Als Ausgangspunkt für die DNA-Neusynthese mit dem Klenow-Fragment der DNA-PolymeraseI diente der Primer welcher auch für die Synthese des Templates durch PCR eingesetzt wurde. Material und Methoden - 33 - Ansatz, 50µl: - H2O 26,5 µl - Primer 5 µl - Template aus PCR 5 µl - Inkubation bei 95°C 5 minauf Eis Im Isotopenlabor: - Labeling Buffer 10 µl - [α32P]-dCTP 1,5 µl - Enzym (Klenow) 2 µl - Inkubation bei 37°C 15 min Aufreinigung der gelabelten Sonde: Zur Entfernung von nicht eingebauten radioaktiven Nukleotiden erfolgte die Aufreinigung der Sonde über eine Sephadex-Säule (Nick TM Column, Fa. Amersham Pharmacia, Freiburg): - Enthaltenen Puffer auskippen, - Säule mit 1x TE-Puffer pH 8,0 äquilibrieren, - Säule mit gelabelter Sonde und 350µl TE-Puffer beladen und durchlaufen lassen, Eluat verwerfen. - Eluieren der Sonde mit 500µl TE-Puffer - Eluat für 5 min bei 95°C denaturieren 2.3.10. Hybridisierung von Northern Blots: Alle Schritte der Hybridisierung erfolgten bei 42°C im Rollinkubator (Fa. Haraeus, Hanau). Zur Absättigung unspezifischer Bindungsstellen auf dem Northern Blot wurde die Membran zuerst mit 15ml Prähybridisierungspuffer (s.o) prähybridisiert (neu hergestellte Blots ü.N., bereits verwendete Blots für ca. 3h). Danach wurde der Puffer verworfen und durch die gleiche Menge Hybridisierungspuffer (s. 2.1.), welcher mit der denaturierten radioaktiv markierten Sonde (s. 2.3.9.) versetzt wurde, ersetzt. Im Rollinkubator wurde ü.N. für ca. 18h hybridisiert. Am darauf folgenden Tag wurde die Membran zur Entfernung unspezifischer Material und Methoden - 34 - Bindungen gewaschen: 2x für 5 min bei RT mit 2x SSC/0,1% SDS-Waschpuffer (s. 2.1.) auf dem Schüttelinkubator, anschließend 2x für 15 min bei 68°C mit 0,2x SSC/0,1% SDSWaschpuffer (s. 2.1.) im Schüttelwasserbad. Zum Schutz vor Austrocknung wurde der Blot in Zellophanpapier gelegt. Die Membran wurde zur Erfassung der Signale für 5-7 Tage auf einen „Storage Phosphor Screen“ in dazugehöriger Kassette (Fa. Amersham Biosciences, Freiburg) aufgelegt. Das Einlesen der Signale erfolgte im Lesegerät „StormTM Phosphorimager (Fa. Amersham Biosciences, Freiburg) und konnte am PC mit der dazu gehörigen Software für Windows bearbeitet werden. Das Löschen der Signale auf dem Screen erfolgte durch Belichtung auf einem Image Eraser. 2.3.11. Wiederverwertung von Membranen: Um Membranen erneut hybridisieren zu können musste das gebundene radioaktive Signal entfernt werden. Dafür musste die Membran, um eine irreversible Bindung der DNA-Sonde zu verhindern, immer leicht feucht gehalten werden. Die Signale wurden durch Waschen der Membran für 10-20min (je nach Signalintensität) bei 90°C im Schüttelinkubator mit Stripping-Lsg. (s. 2.1.) entfernt. Zur Kontrolle der Effizienz wurde die Membran nochmals für ca. 5 Tage auf den Phosphor Screen gelegt und eingelesen. 2.4. Standardtechniken im Umgang mit prokaryotischen Zellen: 2.4.1. Kultivierung und Stammhaltung prokaryotischer Zellen: Die Kultivierung von Bakterienzellen erfolgte in einem dafür vorgesehenen KomplexVollmedium (LB-(Luria-Bertani-)-Medium (SAMBROOK et al.)). Flüssigkulturen wurden bei 37°C im Schüttelinkubator bei 220rpm (gewährleistet eine optimale Belüftung) kultiviert. Zur Selektion wurde dem Medium ein Antibiotikum in wirksamer Konzentration zugesetzt (Ampicillin: Stammlösung: 100mg/ml H2O, Arbeitskonzentration: 100µg/ml). Feste Nährböden wurden durch Zugabe von 1,5% (w/v) Agar-Agar in das LB-Medium vor dem Autoklavieren hergestellt, und zur Kultivierung bei 37°C im Brutschrank bebrütet. Zur Herstellung von Stammkulturen wurden Übernachtkulturen mit 10% (v/v) DMSO oder Glycerin versetzt und bei -70°C gelagert. Material und Methoden - 35 - 2.4.2. Extraktion von Plasmid-DNA aus prokaryotischen Zellen: Die Plasmidisolation erfolgte mittels „Nucleo Spin Plasmid DNA Purification Kit“ (Fa. Macherey-Nagel). Hierfür wurde ein LB-Flüssig-Nährmedium mit einer auf einer Agarplatte gewachsenen Einzelkultur beimpft (zur Selektion der Plasmid-tragenden Zellen wurde den Medien das entsprechende Antibiotikum zugesetzt). Die Kultur wurde ü.N. bei 37°C im Schüttelinkubator bebrütet. Nach Abzentrifugation der Bakterien und Verwerfen des Überstandes wurde das Bakterienpellet folgendermaßen weiterverarbeitet: Für die Zenrtrifugationen wurde eine Mikro-Tisch-Zentrifuge verwendet mit einer Umdrehungszahl von 11000x g. Zur Lyse der Zellen wurde im Eppendorf-Gefäß die vorgegebene Menge an Lysis-Puffern („Buffer A1-A3“ im Kit) zugegeben. Dann wurde 5-10min zentrifugiert. Der Überstand wurde zum Binden der DNA auf die dafür vorgesehenen Säulen gegeben, und 1min zentrifugiert. Zum Waschen der Silica-Membran wurde dann die vorgegebene Menge eines Waschpuffers („Buffer A4“) auf die Säule gegeben, und 1min zentrifugiert. Zum vollständigen trocknen der Mambran wurde zusätzlich 2min zentrifugiert. Nach Inkubation von 1min bei RT wurde die DNA dann mit 50µl Elution-Buffer („Buffer AE“) durch 1minütige Zentrifugation eluiert. Die Reinheit des Plasmids konnte anschließend auf einem Agarosegel kontrolliert werden. Die Konzentration des Plasmids im Eluat wurde photometrisch bestimmt (ds-DNA). Die Lagerung erfolgte bei -20°C. 2.4.3. Klonierung: Der Expressionsvektor pBIG2i, welcher eine stabile Transfektion von eukaryotischen Zellen ermöglicht, verfügt über einen bidirektionalen Promotor mit einem stärkeren CMV- und einem schwächeren TK-Element. Das CMV-Element ist das Promotorelement für das klonierte Gen, und ist bei pBIG2i normalerweise inaktiv. Das TK-Element dient der Ablesung des Transaktivators, bei Anwesenheit von Doxycyclin führt es zur Aktivierung des klonierten Gens. Als Selektionsmarker besitzt er das Gen für Ampicillinresistenz (ampr) Ein Insert, welches den offenen Leserahmen des Gens enthält und mit speziellen Primern durch PCR hergestellt wurde, wurde durch Ligation in diesen Vektor eingebaut. Hierfür wurden Insert und Vektor mit denselben Restriktionsendonukleasen verdaut. Material und Methoden - 36 - Verdau, 100µl-Ansatz: - Insert Gesamte Ausbeute aus PCR oder - Vektor 10 µg - Restriktionsenzym „SpeI“ 2 µl (Fa. NEB, New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main) - Restriktionsenzym „KpnI“ (Fa. NEB) 2 µl - NEB-PufferI (Fa. NEB) 10 µl - H2O (Ampuwa) ad 100 µl - Verdau ü.N. bei 37°C im Heizblock - Abschätzen der Konzentration auf einem 1%-Agarosegel Die bei der Ligation einzusetzenden Mengen von Insert und Vektor wurden über die Formel „1pmol DNA = kb x 0,662µg“ und die im Agarosegel abgeschätzten Konzentrationen berechnet. Ligation, 20 µl Ansatz: - pBIG2i-Vektor 0,1pmol - Insert 0,1pmol - 10 x Ligationspuffer 2 µl 1 µl ad 20 µl (Fa. Roche Diagnostics, Mannheim) - T4-DNA-Ligase (Fa. Roche Diagnostics, Mannheim) - H2O (Ampuwa) - Ligation ü.N. bei RT Zur Selektion der Insert-tragenden Kopien und um eine für die Transfektion ausreichende Menge Vektor zu erhalten wurde ein kompetenter Bakterienstamm transformiert. Material und Methoden - 37 - Transformation: - Kompetente E. coli („One Shot Top10“ oder „BL21“) auf Eis auftauen - β-Mercaptoethanol (für „One Shot Top10“) 2 µl - Ligationsansatz 5 µl - auf Eis 30 min - 42°C Wasserbad 30 secgleich auf Eis - LB Medium 900 µl - Bebrütung im Schüttelinkubator (220rpm, 37°C) 45 min - Zentrifugation - Ausplattieren des Pellets auf ampicillinhaltigem Agar-Nährboden zur Selektion - 37°C im Brutschrank - Beimpfen eines Ampicillin-Selektionsmediums mit einer Einzelkultur - Bebrütung im Schüttelinkubator (220rpm, 37°C) - Vektorisolation mit „Nucleo Spin Plasmid DNA Purification Kit“ (Fa. Macherey-Nagel) ü.N. ü.N. (s. 2.4.2.). 2.5. Kultivierung eukaryotischer Zellen: 2.5.1. Nährmedien und Medienzusätze: Die humane Ampullenkarzinomzelllinie AVC1 wurde in „RPMI 1640 L-Glutamine“ (Fa. (GIBCO) Invitrogen life technologies, Karlsruhe) kultiviert. Für die serumhaltige Kultivierung wurde dem Medium 10% (v/v) fetales Kälberserum (FCS) zugesetzt. Die Zelllinien Suit 007, Suit 028, MIAPaCa-2, Panc-1 wurden in D-MEM, High Glucose (Fa. (GIBCO) Invitrogen life technologies, Karlsruhe) kultiviert. Für die serumhaltige Kultivierung wurde ebenfalls 10% (v/v) FCS zugesetzt. Den Medien wurden keine Antibiotika zugesetzt. Material und Methoden - 38 - 2.5.2. Zellkulturbedingungen: Alle Arbeiten wurden im Zellkulturlabor unter sterilen Bedingungen (Reinraumbank) und mit sterilen Lösungen durchgeführt. Die Kultivierung der Zellen erfolgte im Brutschrank bei 37°C und einer 5% CO2- Atmosphäre in Zellkulturflaschen und Zellkulurschalen (cellstar® Fa. Greiner bio-one, Frickenhausen), in von den jeweiligen Zellen benötigtem Nährmedium. Zum waschen der Zellen wurde PBS-Puffer verwendet. Die Zelldichte der Zelllinien wurde regelmäßig überprüft und bei einer Konfluenz von 80100% wurden die Zellen gesplittet und passagiert. Dafür wurden sie nach Waschen mit PBS durch Trypsin (Trypsin/EDTA Solution, Fa. Biochrom AG) von der Oberfläche des Kulturgefässes abgelöst und vereinzelt. Nach Zentrifugation und Resuspension in frischem Nährmedium wurde ca. 1/5 bis 1/10 der Zellsuspension in eine neue Zellkulturflasche mit vorgelegtem Medium überführt. Für die Lagerung der Zellen in flüssigem Stickstoff wurde ein Gefriermedium aus 70% (v/v) Medium (je nach Zelllinie), 20% FCS und 10% DMSO (Fa. Sigma, Taufkirchen) verwendet. 2.5.3. Bestimmung der Zellzahl [Zellen/ml Zellsuspension]: Die Bestimmung der Zellzahl pro ml Zellsuspension erfolgte lichtmikroskopisch in einer Zählkammer („Neubauer Zählkammer improved bright line“, Tiefe 0,1 mm, 0,0025 mm2 ,Fa. Optik Labor). Es galt: „Zellzahl / ml Suspension = Zellzahl eines Großquadrats x104“. 2.6. Genregulation durch Transfektion mit siRNA: 2.6.1. Das Prinzip des „gene-silencing“: Der Einsatz von siRNA, auch „small interfering RNA“ oder „silencer-RNA“ genannt, ermöglicht durch RNA-Interferenz die Expressionsregulation eines bestimmten Gens. RNA-Interferenz ist ein natürlicher Mechanismus in eukaryotischen Zellen welcher die Expression einzelner Gene hemmt. Bei dieser Form der Genregulation ist immer RNA als zielerkennendes Molekül beteiligt. Wie in Abb. 4 zu sehen, sind für den regulatorischen Mechanismus kleine RNA-Moleküle verantwortlich welche entstehen, indem aus langen RNA-Molekülen durch eine Typ-III-Ribonuklease („Dicer“) 21-23 Nukleotide lange dsRNAMoleküle herausgeschnitten werden. Diese doppelsträngigen RNA-Moleküle werden dann in den sog. „RISC“ (RNA-inducing silencing complex) integriert und dort einzelsträngig [12]. Material und Methoden - 39 - Die einzelsträngige siRNA im „RISC“ wird dann komplementär an den Zielbereich auf der mRNA gebunden (target recognition). Der gebundene Proteinkomplex führt zur Spaltung der Ziel-mRNA (target cleavage), und verhindert so dessen Expression. Auch synthetisch hergestellte kleine einzelsträngige RNAs können als small interfering RNAs (eingeschleust in die Zielzellen), dem natürlichen Mechanismus entsprechend, zur gezielten Genregulation eingesetzt werden [12]. Diese Möglichkeit der Genregulation ermöglicht es, in vitro Hinweise auf die physiologische Bedeutung und Funktion eines Zielgens zu erhalten. Abb. 4: RNA-Interferenz (RNAi) Dargestellt ist der Mechanismus der RNA-Interferenz. Durch Binden der siRNA an die ZielmRNA kommt es zur Inaktivierung dieser, und zur Unterdrückung der Proteinexpression. (Quelle: http://www.bioteach.ubc.ca/MolecularBiology/AntisenseRNA/) Abkürzungen: dsRNA= Doppelstrang-Ribonucleinsäure, siRNA= silencer-RNA, RISC= RNAinducing silencing complex, mRNA= messenger-RNA. 2.6.2. Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA: Zur gezielten Expressionshemmung eines Gens wurden spezifische synthetisch hergestellte siRNA’s eingesetzt („®Silencer Pre-designed siRNA“, Fa. Ambion Europe Ltd., Huntington Cambridge, UK). Die transiente Transfektion adhärenter Zellen mit si-RNA erfolgte mit dem Kit „TransMessenger, No. 301525“ (Fa. Qiagen, Hilden). Dafür wurden in 6-well- Material und Methoden - 40 - Zellkulturschalen 150000-200000 Zellen ausgesät und ü.N. bei 37°C im Brutschrank inkubiert und 2x an 2 hintereinander folgenden Tagen mit folgendem Ansatz transfiziert: Einfacher Transfektionsansatz für ein 6-well (in „Falcon Blue Max Jr. 15ml. Polystyrene conical Tube“, Fa. BD Biosciences, Heidelberg) - ECR-Puffer (Kit) 89 µl - Enhancer (Kit) 4 µl - siRNA [20 pmol] bzw. H2O als negativ-Kontrolle 7 µl - Vortexen und bei RT inkubieren 5 min - TransMessenger Transfektionsreagenz (Kit) 8 µl - Vortexen und bei RT inkubieren 10 min - sf Nährmedium zugeben 900 µl - mit Pipette gut mischen - Medium absaugen und Transfektionsansatz zugeben 1 ml/well - Inkubation bei 37°C im Brutschrank 3-4 h - Mediumwechsel mit sh Nährmedium 2 ml - Inkubation ü.N. bei 37°C im Brutschrank Die Effizienz und das Ausmaß des Gene-silencing wurden mit Northern Blot überprüft. Material und Methoden 2.7. - 41 - Untersuchungen zum Verhalten adhärenter Ampullenkarzinomzellen in vitro: 2.7.1. Proliferations-Assay: Zur Bestimmung der Proliferation also des Wachstums von Zellen in vitro wurde eine definierte Anzahl Zellen (1,6x105 Zellen/well) in die wells einer 6-well Zellkulturplatte ausgesät und in Nährmedium ü.N. bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Am darauf folgenden Tag wurden die Zellen behandelt (z.B. Transfektion mit siRNA, s. 2.6.2.). Nach Transfektion wurden die Zellen zum Auszählen gefärbt, dafür wurden sie einmal mit PBS gewaschen (Entfernung abgestorbener Zellen), anschließend mit Kristallviolett-Lösung (s. 2.1.) überschichtet, und für 15min bei RT inkubiert. Nach Absaugen der Färbelösung wurde zweimal mit PBS gewaschen um die Platten dann anschließend trocknen zu lassen. Die Zellen wurden unter dem Lichtmikroskop (20-er Objektiv) digital fotografiert (je 3 zufällige Bildausschnitte) und anschließend auf dem Ausdruck ausgezählt. Zur Objektivierung des Ergebnisses wurden die gefärbten Zellen mit 1ml 10%-iger Essigsäure überschichtet und 1min lang inkubiert um die Färbung herauszulösen. Dann erfolgte die Messung der Extinktion in einer 96-well-Mikrotiterplatte im „Microplate Reader“ (Fa. Bio-Rad, München) bei einer Wellenlänge von λ=620 nm. 2.7.2. Migrations-Assay: Der Nachweis gerichteter Zellbewegungen in vitro erfolgte mit Hilfe von „transwellMigrationsassays“ mit Zellkulturschalen-Einsätzen mit einer Membran der Porengröße 8µm („BD Falcon PET track-etched membrane, 24 well formed cell culture insert“, No.353097, Fa. BD Biosciences). Nach Herstellung einer Zellsuspension mit 2x105 Zellen/ml in serumfreiem (sf) RPMI wurden in die wells einer 24-Loch-Platte („BD Falcon Multiwell Primaria 24 well“, Fa. BD Biosciences) 750µl serumhaltiges (sh) RPMI-Medium als „Chemo-Lockstoff“ vorgelegt. In die wells wurden die Inserts eingesetzt in welche je 250µl Zellsuspension (=5x104 Zellen) ausgesät wurden. Jede Probe wurde zur Doppelbestimmung doppelt ausgesät, außerdem wurde parallel dazu auf derselben Platte eine Zellsuspensionen zur Proliferationsbestimmung ausgesät (s. 2.7.1.), um bei der Auswertung die Zellmenge herausrechnen zu können, die allein durch Teilung der Zellen nach Durchtritt durch die Membran entsteht. Nach Inkubation bei 37°C für 24h wurde das Medium in den wells Material und Methoden - 42 - abgesaugt und die nicht migrierten Zellen auf der Oberseite der Membran mechanisch entfernt (standardisiertes Auswischen der Einsätze mit Laborwischtüchern). Die Bestimmung der Zellzahl vitaler migrierter Zellen erfolgte Mittels Luminiszenzmessung mit „CellTiter-Glo® Luminiscent Cell Viability Assay“, No.G7570 (Fa. Promega, Madison USA). Hierfür wurde in jedes well 100µl der CellTiter-Glo-Reagenz pipettiert, und für 15min bei Licht und RT auf dem Schüttelinkubator inkubiert. Für die Luminiszenzmessung wurden je 50µl Probe in ein Messröhrchen („BD Falcon 5ml polystyrene Round bottom tube“, Fa. BD Biosciences) gegeben. Die Luciferase-Messung erfolgte 10s im Luminometer („Lumat LB 9501 v. Berthold“ Fa. Nicoles Institute Diagnostics). In der Auswertung wurden für den Ergebniswert, welcher die Zellzahl vitaler migrierter Zellen widerspiegelt, die Mittelwerte der beiden Messwerte der Migrationsanalysen durch die der Proliferationsanalysen geteilt um den Effekt, der allein durch Proliferation der Zellen zustande kommt, herauszurechnen. 2.7.3. Invasions-Assay: Zur Untersuchung von invasivem Verhalten adhärenter Karzinomzellen in vitro wurden Invasions-Einsätze „BD BioCoatTM MatrigelTM Invasion Chamber“ (Fa. BD Biosciences, Bedford USA) verwendet. Die Einsätze waren für 24-well-Zellkulturplatten vorgesehen und bestanden aus einer PET-Membran mit einer Porengröße von 8µm und einer Schicht Matrigel Matrix, welche die extrazelluläre Matrix der Basalmembran simulierte. Diese MatrigelSchicht hindert nicht-invasive Zellen daran durch die Membranporen zu migrieren. Vor Durchführung des Versuches musste die Matrigel-Schicht für 2h in sf Nährmedium (500µl pro Insert und well) bei 37°C im Brutschrank rehydriert werden. Währenddessen wurde von den zu untersuchenden Zellen eine Zellsuspension mit 2x105 Zellen/ml sf Medium vorbereitet. Nach der Rehydrierung wurde das in den wells und den Inserts befindliche sf Medium abgenommen. In die wells wurde je 750µl sh Medium als „Chemo-Lockstoff“ vorgelegt. Die Inserts wurden eingesetzt, es wurden je 250µl Zellsuspension (=5x104 Zellen) ausgesät. Wie beim Migrationsassay wurde jede Probe zwecks Doppelbestimmung doppelt ausgesät. Entsprechend dem Migrationsassay wurden auch hier parallel Zellen zur Proliferationsmessung ausgesät. Nach einer Inkubationszeit für 24h bei 37°C wurden die nicht invasiven Zellen in den Inserts mechanisch entfernt. Die Bestimmung der Zellzahl vitaler invasiver Zellen erfolgte wie im Migrations-Assay (s. 2.7.2.) Material und Methoden - 43 - 2.7.4. Substratunabhängiges Wachstum, Soft-Agar-Assay: Zum Nachweis von substratunabhängigem Wachstum in vitro, also Proliferation ohne Adhäsion an eine Oberfläche, wurden Soft-Agar-Assays durchgeführt. Für diesen Versuch wurde steriler 5% Bacto-Agar durch Erwärmen in der Mikrowelle zum Schmelzen gebracht, 1:10 mit vorgewärmtem sh Nährmedium verdünnt (0,5% Bacto-Agar) und im Wasserbad auf eine konstante Temperatur von 45°C gebracht. In die wells einer 6well Zellkulturplatte wurde je 2ml 0,5% Bacto-Agar als Unterlage vorgelegt und durch Abkühlen bei RT erhärtet. Es wurde dann von den zu untersuchenden Zellen Zellsuspensionen der Zellzahl 1,2x105 Zellen/ml sh Medium angefertigt, und auf 37°C vorgewärmt. Zu 1ml Zellsuspension wurden 2ml vorgewärmter 0,5% Bacto-Agar gegeben und zügig gemischt. Sofort wurden 750µl dieser Zell-Agar-Mischung auf die abgekühlte Agar-Unterlage gegeben (=3x104 Zellen/well). Nach 30min Inkubation im 37°C Brutschrank wurden die Zellen vorsichtig mit je 1ml sh Medium überschichtet. Die Platten wurden 7-10 Tage bei 37°C im Brutschrank inkubiert, alle 2-3 Tage wurde 1ml frisches sh Medium zugegeben. Zur Auswertung wurden nach Inkubation die Zellklone (Zellhaufen von mind. 3 Zellen!) ausgezählt. Dabei wurden pro well ca. 5-10 Gesichtsfelder einer Ebene ausgezählt und gemittelt. 2.8. Statistik: Die statistischen Auswertungen wurden mit dem Programm Microsoft Excel durchgeführt. Für die Ermittlung der Signifikanz der Ergebnisse wurde der Student t-Test herangezogen. Ein Unterschied zwischen zwei Werten wurde dann als signifikant interpretiert, wenn p<0,05 war. Experimente und Ergebnisse - 44 - 3. Experimente und Ergebnisse 3.1. Expression von AMFR und AMF in verschiedenen Geweben und Zellkulturlinien: 3.1.1. qRT-PCR: Um die Ergebnisse der Microarray-Analysen zu verifizieren wurden zunächst qRT-PCR durchgeführt, da hier die Möglichkeit der quantitativen Beurteilung gegeben ist (s. 2.3.5.2). Hierfür wurde aus Gewebeproben (gesundes und chron. entzündliches Pankreas, Pankreasund Papillenkarzinom), RNA gewonnen (s. 2.3.1), um daraus anschließend cDNA-Proben für die RT-PCR herzustellen (s. 2.3.4). Für AMFR wurden eigens dafür synthetisierte Primer eingesetzt („AMFR RT1 forw und rev“, Fa. Biomers.net GmbH, Ulm Germany), zur Normalisierung wurden die Primer der Referenz-Gene RPLP0 und CyclophilinA eingesetzt („xs13 for und rev“, sowie „Cyclo for und rev“, Fa. Biomers.net GmbH, Ulm Germany) (Sequenzen s. 2.2.3.). Für die Berechnungen der relativen Expressionen, die in den Abbildungen 5 bis 8 dargestellt sind, wurde die ∆CT-Methode angewendet (s. 2.3.5.2.). Für die Berechnung wurde immer der Mittelwert der durch die Doppelbestimmung entstandenen CT-Werte herangezogen. Es wurden zwei voneinander unabhängige Experimente durchgeführt (qRT-PCR 1 und 2) Der Vergleich der normalisierten Messwerte zeigte, dass insbesondere für die Papillenkarzinome die Wahl des Haushaltsgens für die Normalisierung starken Einfluss auf die ermittelten Expressionswerte hatte (Abb. 5 und 6). Experimente und Ergebnisse - 45 - 1,4 1,2 1 1/2deltaCT 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 c-DNA-Proben 1,6 1,4 1,2 1/2deltaCT 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 c-DNA-Proben Abb. 5: RT-PCR 1, Normalisierung mit RPLP0 (oben) bzw. CyclophilinA (unten) Die Diagramme zeigen die relativen Expressionsstärken von AMFR (1/2∆CT, Y-Achse) in den verschiedenen Gewebeproben (X-Achse). Die Werte entsprechen den Mittelwerten von 2 unabhängigen Messungen. Als Proben wurden die cDNA’s folgender Gewebe eingesetzt: 1. Ges_Pn308, 2. Ges_Pn335, 3. Ges_PG 4. Pitis_Pp250 5. PaCa_Pp324, 6. PaCa_Pp359 7. PapCa_Pp333, 8.-15. PapCa_1-8 Abkürzungen: cDNA= copy-DNA, RT-PCR= Real Time-Polymerase Chain Reaction, RPLP0= Ribosomal protein large P0, Ges= Gewebe stammt aus gesundem Pankreas, Pitis= Gewebe aus chron. Pankreatitis, PaCa= Pankreaskarzinom, PapCa= Papillenkarzinom, PG, Pn..., Pp...=anonymisiertes Patientenkürzel einer Gewebeprobe. Experimente und Ergebnisse - 46 - 0,06 0,05 1/2deltaCT 0,04 0,03 0,02 0,01 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 12 13 14 15 c-DNA-Proben 0,06 0,05 1/2deltaCT 0,04 0,03 0,02 0,01 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 c-DNA-Proben Abb. 6: RT-PCR 2, Normalisierung mit RPLP0 (oben) bzw. CyclophilinA (unten) Die Diagramme zeigen die relativen Expressionsstärken von AMFR (1/2∆CT, Y-Achse) in den verschiedenen Gewebeproben (X-Achse). Die Werte entsprechen den Mittelwerten von 2 unabhängigen Messungen. Als Proben wurden die cDNA’s folgender Gewebe eingesetzt: 1. Ges_Pn308, 2. Ges_Pn335, 3. Ges_PG 4.-11. PapCa_1-8 12. PaCa_Pp87, 13. PaCa_Pp261, 14. PaCa_Pp276, 15. PaCa_Pp359 Abkürzungen: cDNA= copy-DNA, RT-PCR= Real Time-Polymerase Chain Reaction, RPLP0= Ribosomal protein large P0, Ges= Gewebe stammt aus gesundem Pankreas, Pitis= Gewebe aus chron. Pankreatitis, PaCa= Pankreaskarzinom, PapCa= Papillenkarzinom, PG, Pn..., Pp...=anonymisiertes Patientenkürzel einer Gewebeprobe. Experimente und Ergebnisse - 47 - 3.1.2. Northern Blotting: Um die Expressionsstärken von AMFR und AMF durch eine weitere Methode zu ermitteln, und um zu ermitteln, welches der beiden Referenzgene (CyclophilinA oder RPLP0) sich bei der RT-PCR zur Normalisierung eignet, wurden Northern Blots angefertigt. Dafür wurde, ergänzend zu den bereits vorhandenen RNA-Proben, aus weiteren Geweben von gesunder Pankreas, chron. Pankreatitis, Pankreas- und Papillenkarzinom, sowie einigen geläufigen Pankreaskarzinomzelllinien und der Ampullenkarzinomzelllinie AVC1 RNA isoliert (s. 2.3.1.) Für die Northern Blots wurde davon eine denaturierende FormaldehydGelelektrophorese durchgeführt (s. 2.3.6.2.), das Ergebnis der Elektrophoresen wurde fotografisch unter UV-Licht festgehalten, diese sind in den Abbildungen 7 und 8 dargestellt. Durch Blotting wurden schließlich die Northern Blots angefertigt (s. 2.3.8.). 1 5 10 15 28 s 18 s Abb. 7: Northern Blot 1 Die Abbildung zeigt die für den Northern Blot 1 angefertigte Formaldehyd-Gelelektrophorese unter UV-Licht. Gekennzeichnet sind die Probennummern in den Geltaschen, die 28s Bande welche einer Basenpaarmenge von 4718bp entspricht, sowie die 18s-Bande welche 1874bp entspricht. Als Proben wurde die RNA folgender Gewebe eingesetzt: 1. Ges_Pn308, 2. Ges_Pn335, 3. Ges_PG 4.-11. PapCa_1-8 12. PaCa_Pp87, 13. PaCa_Pp261, 14. PaCa_Pp276, 15. PaCa_Pp359 Abkürzungen: 18/28s= 18/28 Svedberg (Sedimentationskoeffizient), UV= Ultraviolett, bp= basepairs, RNA= Ribonucleinsäure, Ges= Gewebe stammt aus gesundem Pankreas, Pitis= Gewebe aus chron. Pankreatitis, PapCa= Papillenkarzinom, PaCa= Pankreaskarzinom, PG, Pn..., Pp...=anonymisiertes Patientenkürzel einer Gewebeprobe. Experimente und Ergebnisse 1 - 48 - 5 10 15 18 28 s 18 s 28 s 18 s Abb. 8: Northern Blot 2 Die Abbildung zeigt die für den Northern Blot 1 angefertigte Formaldehyd-Gelelektrophorese unter UV-Licht. Gekennzeichnet sind die Probennummern in den Geltaschen, die 28s Bande welche einer Basenpaarmenge von 4718bp entspricht, sowie die 18s-Bande welche 1874bp entspricht. Als Proben wurde die RNA folgender Gewebe eingesetzt: 1. Ges_PGC, 2. Ges_Pn87, 3. Ges_Pn175, 4. Ges_Pn269, 5. Ges_Pn308, 6. Ges_Pn396, 7. Ges_Pn398, 8. Ges_Pn414, 9. Ges_Pn433 10. Pitis_Pp121, 11. Pitis_Pp250, 12. Pitis_Pp427 13. PaCa_Pp87, 14. PaCa_Pp138, 15. PaCa_Pp163, 16. PaCa_Pp223, 17. PaCa_Pp276, 18. PaCa_Pp301 19. PaCa_Pp355, 20. PaCa_Pp359, 21. PaCa_Pp396, 22. PaCa_Pp410, 23. PaCa_Pp414 24. PaAd_Pp273, 25. PaAd_Pp274 26. PapCa_Pp167 27. MIAPaCa-2, 28. Panc-1, 29. Suit-2 007, 30. Suit-2 028, 31. AVC1 Abkürzungen: 18/28s= 18/28 Svedberg (Sedimentationskoeffizient), UV= Ultraviolett, bp= basepairs, RNA= Ribonucleinsäure, Ges= Gewebe stammt aus gesundem Pankreas, Pitis= Gewebe aus chron. Pankreatitis, PaCa= Pankreaskarzinom, PaAd= Pankreasadenom, PapCa= Papillenkarzinom, MIAPaCa/Panc/Suit/AVC1=verschiedene Zellkulturlinien, PGC, PG, Pn..., Pp...=anonymisiertes Patientenkürzel einer Gewebeprobe. 3.1.2.1. Hybridisierung mit AMFR: Zur Visualisierung der Expression von AMFR auf den Northern Blots wurde eine DNASonde mit der Sequenz des AMFR durch PCR hergestellt (s. 2.3.5.1.) Hierfür wurde der Plasmidvektor „pEYFPN1-AMFR“ (s. 2.2.4.), welcher den gesamten offenen Leserahmen des Rezeptors trägt, als Template, und die Primer „AMFR_ORF_SONDE forw. und rev.“(s. Experimente und Ergebnisse - 49 - 2.2.3.) eingesetzt. Dem PCR-Ansatz Ansatz wurde zur Erhöhung der Ausbeute 5% DMSO zugesetzt. Nach Isolierung der DNA aus dem Agarosegel wurde die DNA wurde dann mit [α32P] radioaktiv markiert (s. 2.3.9.). .). Nach Hybridisierung der Northern Blots mit dieser Sonde und nach Auflegen der Blots auf einen Phosphor-Image-Screen sowie dessen Einlesung nach einer Exponierung für 7 Tage zeigte sich das Signal auf Höhe von 3590bp 3590 (s. 1.4.) (zur Orientierung dienten die 28s--Bande ≈ 4718 bp, und die 18s-Bande ≈ 1874 bp). bp Insgesamt bestätigten die Ergebnisse der Hybridisierungen die Tendenz zur Überexpression von AMFR in Pankreastumoren und insbesondere die spezifische Überexpression in Papillenkarzinomen. Alle untersuchten Zelllinien zeigten eine starke AMFR-Expression AMFR (Abb. 9 und 10). Gleichzeitig bestätigte sich die bereits früher gemachte Beobachtung, dass RPLP0 als BezugsBezugs Gen für die Normalisierung von qRT-PCR-Daten qRT Daten aus Pankreasgeweben geeigneter ist als CyclophilinA, da letzteres insbesondere für Papillenkarzinome falsche Messwerte lieferte. 1 Abb. 9: 4 8 12 15 Northern Blot 1, hybridisiert mit AMFR Zu sehen sind die Signale auf dem Northern Blot 1 durch Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten AMFR-Sonde Sonde, das Einlesen des Blots erfolgte mit einem Phosphor Imager. Proben: 1. Ges_Pn308, 2. Ges_Pn335, 3. Ges_PG 4.-11. PapCa_1-8 12. PaCa_Pp87, Pp87, 13. PaCa_Pp261, PaCa 14. PaCa_Pp276, 15. PaCa_Pp359 Abkürzungen: Ges= Gewebe stammt aus gesundem Pankreas, Pitis= Gewebe aus chron. Pankreatitis, PapCa= Papillenkarzinom, Papillenkarzinom PaCa= Pankreaskarzinom, Pankreaskarzinom PG, Pn..., Pp...= anonymisiertes Patientenkürzel einer Gewebeprobe. Experimente und Ergebnisse 1 19 Abb. 10: - 50 - 5 10 25 15 18 30 Northern Blot 2, hybridisiert mit AMFR Zu sehen sind die Signale auf dem Northern Blot 2 durch Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten AMFR-Sonde, Sonde, das Einlesen des Blots erfolgte mit einem Phosphor Imager. Proben: 1. Ges_PGC, 2. Ges_Pn87, 3. Ges_Pn175, 4. Ges_Pn269, 5. Ges_Pn308, 6. Ges_Pn396, 7. Ges_Pn398, 8. Ges_Pn414, 9. Ges_Pn433 10. Pitis_Pp121, Pp121, 11. Pitis_Pp250, 12. Pitis_Pp427 13. PaCa_Pp87, Pp87, 14. PaCa_Pp138, PaCa 15. PaCa_Pp163, 16. PaCa_Pp223, Pp223, 17. PaCa_Pp276, PaCa 18. PaCa_Pp301 Pp301 19. PaCa_Pp355, PaCa 20. PaCa_Pp359, 21. PaCa_Pp396, Pp396, 22. PaCa_Pp410, PaCa 23. PaCa_Pp414 24. PaAd_Pp273, Pp273, 25. PaAd_Pp274 PaAd 26. PapCa_Pp167 27. MIAPaCa-2, 2, 28. Panc-1, Panc 29. Suit-2 007, 30. Suit-2 028, 31. AVC1 Abkürzungen: Ges= Gewebe stammt aus gesundem Pankreas, Pitis= Gewebe aus chron. Pankreatitis,, PaCa= Pankreaskarzinom, PaAd= Pankreasadenom, PapCa= Papillenkarzinom, Papillenkarzinom MIAPaCa/Panc/Suit/AVC1=verschiedene Zellkulturlinien, Zellkulturlinien, PCC, PG, Pn..., Pp...=anonymisiertes Patientenkürzel einer Gewebeprobe. 3.1.2.2. Hybridisierung mit AMF: Um herauszufinden ob die Expression des Liganden AMF mit der Expression seines Rezeptors gekoppelt ist, wurden, nach n waschen aschen der Membranen zur Entfernung der radioaktiven Signale (s. 2.3.11.) 2.3.11 die NB’s 1 und 2 zusätzlich mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde des AMF hybridisiert. ridisiert. Für die PCR wurde der Plasmidvektor „pEYFPN1-AMF“ „pEYFPN1 (s. 2.2.4.) eingesetzt, als Primer dienten „amf_gpi forw. und rev.“ (s. 2.2.3.). 2.2.3 Die weitere Vorgehensweise entsprach der für AMFR. Bei AMF zeigte sich das Signal auf Höhe von 2075bp (s. 1.5.). Die ie Ergebnisse zeigten, dass AMF in allen beurteilbaren Proben exprimiert wurde. Die Höhe der Expression korrelierte dabei nicht ni in allen Fällen mit der Expression des AMFR. Die ie stärksten Signale wurden wiederum in den Zelllinien beobachtet (Abb. ( 11 und 12). Experimente und Ergebnisse 1 15 Abb. 11: - 51 - 4 8 12 Northern Blot 1, hybridisiert mit AMF Zu sehen sind die Signale auf dem Northern Blot 1 durch Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten AMFR-Sonde, Sonde, das Einlesen des Blots erfolgte mit einem Phosphor Imager. Proben: 1. Ges_Pn308, 2. Ges_Pn335, 3. Ges_PG 4.-11. PapCa_1-8 12. PaCa_Pp87, Pp87, 13. PaCa_Pp261, PaCa 14. PaCa_Pp276, 15. PaCa_Pp359 Abkürzungen: Ges= Gewebe stammt aus gesundem Pankreas, Pitis= Gewebe aus chron. Pankreatitis, PapCa= Papillenkarzinom Papillenkarzinom, PaCa= Pankreaskarzinom Pankreaskarzinom, PG, Pn..., Pp...=anonymisiertes Patientenkürzel einer Gewebeprobe. 1 19 Abb. 12: 5 10 25 15 18 30 Northern Blot 2, hybridisiert mit AMF Zu sehen sind die Signale auf dem Northern Blot 2 durch Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten AMFR-Sonde Sonde , das Einlesen des Blots erfolgte mit einem Phosphor Imager Proben: 1. Ges_PGC, 2. Ges_Pn87, 3. Ges_Pn175, 4. Ges_Pn269, 5. Ges_Pn308, 6. Ges_Pn396, 7. Ges_Pn398, 8. Ges_Pn414, 9. Ges_Pn433 10. Pitis_Pp121, Pp121, 11. Pitis_Pp250, 12. Pitis_Pp427 13. PaCa_Pp87, Pp87, 14. PaCa_Pp138, PaCa 15. PaCa_Pp163, 16. PaCa_Pp223, Pp223, 17. PaCa_Pp276, PaCa 18. PaCa_Pp301 Pp301 19. PaCa_Pp355, PaCa 20. PaCa_Pp359, 21. PaCa_Pp396, Pp396, 22. PaCa_Pp410, PaCa 23. PaCa_Pp414 24. PaAd_Pp273, Pp273, 25. PaAd_Pp274 PaAd 26. PapCa_Pp167 27. MIAPaCa-2, 2, 28. Panc-1, Panc 29. Suit-2 007, 30. Suit-2 028, 31. AVC1 Abkürzungen: Ges= Gewebe stammt aus gesundem Pankreas, Pitis= Gewebe aus chron. Pankreatitis, PaCa= Pankreaskarzinom, PaAd= Pankreasadenom, PapCa= Papillenkarzinom, MIAPaCa/Panc/Suit/AVC1=verschiedene Zellkulturlinien, Zellkulturlinien, PGC, PG, Pn..., Pp...=anonymisiertes Patientenkürzel einer Gewebeprobe. Experimente und Ergebnisse - 52 - 3.2. Kultivierung von AVC1: Für die funktionellen Untersuchungen wurde AVC1 in Kultur genommen. Die von einem mäßig differenzierten Adenokarzinom der Ampulla Vateri abstammende Zelllinie wurde im Brutschrank bei 37°C und einer 5% CO2- Atmosphäre in Zellkulturflaschen unter Zusatz von 10% (v/v) fetales Kälberserum (FCS) kultiviert. Abb. 13: AVC1 Die Abbildung zeigt Zellen der Papillenkarzinomzelllinie AVC1, digital fotografiert unter dem Lichtmikroskop. Abkürzungen: AVC= Ampulla of Vater Cancer (Von Sorio et alteri etablierte Zelllinie). Experimente und Ergebnisse - 53 - 3.3. Gene-silencing von AMFR bei AVC1 durch Transfektion mit siRNA: Um die Auswirkungen einer verminderten Expression von AMFR bei AVC1-Zellen in vitro untersuchen zu können wurde die Expression des Rezeptors durch Gene-silencing mit siRNA herunterreguliert. Dafür wurde die humane Papillenkarzinomzelllinie AVC1 mit drei verschiedenen „®Silencer Pre-designed siRNA“ (Fa. Ambion Europe Ltd., Huntington Cambridge, UK, s. 2.2.3) transfiziert (s. 2.6.2.). Aus den untransfizierten Zellen von AVC1 sowie aus den transfizierten Formen wurde für die Anfertigung eines Northern-Blots Gesamt-RNA isoliert. Zur Ermittlung der Expressionsstärke von AMFR in diesen Zellen wurde dieser Blot mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde für AMFR hybridisiert. (Vorgehensweise wie 3.1.2.1.) 1 2 3 4 28 s 18 s Abb. 14: Northern Blot 3 Die Abbildung zeigt die für den Northern Blot 1 angefertigte Formaldehyd-Gelelektrophorese unter UV-Licht. Gekennzeichnet sind die Probennummern in den Geltaschen,die 28s Bande welche einer Basenpaarmenge von 4718bp entspricht, sowie die 18s-Bande welche 1874bp entspricht. Als Proben wurde die RNA folgender Gewebe eingesetzt: 1. RNA aus mit siRNA1 transfizierten AVC1 2. RNA aus mit siRNA2 transfizierten AVC1 3. RNA aus mit siRNA3 transfizierten AVC1 4. RNA aus untransfizierten AVC1 (Kontrolle) Abkürzungen: s= Svedberg (Sedimentationskoeffizient), UV= Ultraviolett, bp=base pair, RNA=Ribonucleinsäure, siRNA= silencer ribonucleinsäure, AVC= Ampulla of Vater Cancer. Experimente und Ergebnisse 1 Abb. 15: 2 3 - 54 - 4 Northern Blot 3, hybridisiert mit AMFR Die Abbildung zeigt die Signale auf dem Northern Blot 2 durch Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten AMFR-Sonde, das Einlesen des Blots erfolgte mit einem Phosphor Imager. Proben: 1. RNA aus mit siRNA1 transfizierten AVC1 2. RNA aus mit siRNA2 transfizierten AVC1 3. RNA aus mit siRNA3 transfizierten AVC1 4. RNA aus untransfizierten AVC1 (Kontrolle) Abkürzungen: AMFR: Autocrine motility factor receptor, RNA: Ribonucleinsäure, siRNA silencer Ribonucleinsäure, AVC= Ampulla of Vater Cancer Die Ergebnisse der Hybridisierung bestätigten eine erfolgreiche Herunterregulation der AMFR-Expression in AVC1 durch alle 3 siRNA-Sequenzen. Experimente und Ergebnisse - 55 - 3.4. In vitro Untersuchungen zum Verhalten von Papillenkarzinomzellen in Abhängigkeit von der Expressionsstärke des AMFR in vitro: Um einen möglichen Einfluss der Expressionsstärke von AMFR auf das Verhalten von Papillenkarzinomzellen zu ermitteln wurde in verschiedenen, voneinander unabhängigen in vitro Experimenten Proliferation, Migrationsverhalten, Invasivität und substratunabhängiges Wachstum von Zellen der humanen Papillenkarzinomzelllinie AVC1 untersucht. Für die Versuche wurden die AVC1-Zellen zur Unterdrückung der Expression von AMFR mit siRNA transfiziert (siRNA1, siRNA2), als Kontrolle wurden Zellen parallel mit einer „non-silencing control“ transfiziert (siRNAk). Für die statistische Auswertung der Ergebnisse wurde der Student t-Test herangezogen. Ein Unterschied zwischen zwei Zellpopulationen wurde dann als signifikant interpretiert, wenn p<0,05 war. 3.4.1. Untersuchung der in vitro Proliferation: Es sollte ermittelt werden, ob die Expressionsstärke von AMFR einen Einfluss auf die Teilungsrate von humanen Papillenkarzinomzellen hat. Dafür wurden in vitro Proliferationsassays durchgeführt (siehe 2.7.1.). Untersucht wurde die Proliferation von AVC1, und den transfizierten Formen (transfiziert mit siRNA1, siRNA2, und siRNAk). Durchgeführt wurden 6 voneinander unabhängige Experimente. Die Quantifizierung der Proliferation erfolgte nach Kristallviolettfärbung durch Auszählen der Zellen welche unter dem Lichtmikroskop bei 200-facher Vergrößerung fotografiert wurden (pro well wurden 3 zufällige Bildausschnitte fotografiert und zum Auszählen ausgedruckt), sowie durch photometrische Messung der Extinktion bei einer Wellenlänge von λ=620nm nach lösen in 10%Essigsäure. Bei den Proliferations-Assays konnte eine signifikant stärkere Proliferation der mit NegativKontrolle transfizierten Zellen von AVC1 verglichen mit den transfizierten Zellen mit schwächerer Expression von AMFR nachgewiesen werden (siehe Abb. 16 und 17). Student-tTest: p=1,09x10-8 für siRNA1 und p=9,11x10-8 für siRNA2 bei Auszählung, sowie p=5,04x10-6 für siRNA1 und p=4,43x10-6 für siRNA2 bei der photometrischen Messung. Bezugswerte waren jeweils die Mittelwerte der Negativ-Kontrollen (siRNAk). Experimente und Ergebnisse - 56 - A 1600 Zellen/Gesichtsfeld 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 siRNA1 siRNA2 siRNAk untransfiziert B Abb. 16: In vitro Proliferation von AVC1, Auszählung Die Abbildung zeigt das Ergebnis des Proliferationsassays. Die Zellzahlen (Y-Achse), ermittelt durch Auszählung, sind gegen die verschiedenen Transfektions-Sequenzen (X-Achse) aufgetragen. A Durchschnittliche Zellzahlen/Bildausschnitt nach Transfektion und einer Inkubationszeit von 24h. Ausgesät wurden 1,6x105 Zellen/well. Die Säulen entsprechen dem Mittelwert von 6 unabhängigen Experimenten, die Fehlerbalken der einfachen Standardabweichung. Ausgezählt wurden nach Kristall-Violett-Färbung je 3 zufällig digital fotografierte Bildausschnitte (Lichtmikroskop, 20x-Objektiv). B Beispielabbildungen der ausgezählten Bildausschnitte nach Kristallviolettfärbung bei 200facher Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop, die Bildreihenfolge entspricht der der Transfektions-Sequenzen in A. Abkürzungen: siRNA= silencer Ribonucleinsäure, AVC= Ampulla of Vater Cancer, h= Stunde. Experimente und Ergebnisse - 57 - A 1,600 1,400 1,200 E 620 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 siRNA1 siRNA2 siRNAk untransfiziert B Abb. 17: In vitro Proliferation von AVC1, Photometrische Messung Die Abbildung zeigt das Ergebnis des Proliferationsassays. Die Messwerte (Y-Achse), ermittelt durch photometrische Messung bei einer Wellenlänge von 620nm, sind gegen die verschiedenen Transfektions-Sequenzen (X-Achse) aufgetragen. A Durchschnittliche Messwerte am Photometer bei 620nm (E620) nach Lösen der KristallViolett-Färbung in 10% Essigsäure. Die Säulen entsprechen den Mittelwerten aus Doppelbestimmungen der 6 Versuchsansätze, die Fehlerbalken der einfachen Standardabweichung. B Makroskopisches Beispielbild der Proliferations-Wells nach Kristall-Violett-Färbung aus einem der 6 Parallelversuche, die Bildreihenfole entspricht der der Transfektions-Sequenzen in A. Abkürzungen: siRNA= silencer Riboncleinsäure, AVC= Ampulla of Vater Cancer, nm= nanometer. Experimente und Ergebnisse - 58 - 3.4.2. Untersuchung des Migrationsverhaltens in vitro: Für die Untersuchung des Migrationsverhaltens von humanen Papillenkarzinomzellen, wurden „transwell-Migrationsassays“ durchgeführt, die den Nachweis gerichteter Zellbewegungen entlang eines FCS-Gradienten ermöglichen (s. 2.7.2.). Dazu wurde die Anzahl der Zellen bestimmt, die nach Aussaat auf einer porösen Membran und einer definierten Inkubationszeit auf die Unterseite der Membran gewandert waren. Für die Bestimmung der Zellzahl wurden die nicht migrierten Zellen entfernt, und die migrierten vitalen Zellen durch Luciferase-Messung nachgewiesen. Um den Effekt der Proliferation der migrierten Zellen herauszunehmen wurde jeweils parallel ein Proliferationsassay ausgesät und durch Luciferase-Messung ausgewertet. Für den Nachweis einer AMFR-abhängigen Änderung des Migrationsverhaltens wurden die Zelllinie AVC1 sowie die transfizierten Formen (siRNA1, siRNA2 und siRNAk) untersucht. In den Versuchen ließ sich bei den humanen Papillenkarzinomzellen die Fähigkeit zur Migration nachweisen. Die siRNA-transfizierten Zellen zeigten im Vergleich zu den kontrolltransfizierten und untransfizierten Zellen eine Tendenz zu reduzierter Migrationsfähigkeit. Dieser Effekt erreichte jedoch nur für siRNA2 statistische Signifikanz (siehe Abb. 18). Student t-Test: p=0,078 für siRNA1 und p=0,024 für siRNA2. Bezugswerte waren jeweils wieder die Mittelwerte der Negativkontrollen (siRNAk). Experimente und Ergebnisse - 59 - 0,450 0,400 Migration 0,350 0,300 0,250 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 siRNA1 Abb. 18: siRNA2 siRNAk untransfiziert In vitro Migration von AVC1 Dargestellt ist die relative Zellzahl vitaler migrierter Zellen nach einer Inkubationszeit von 24 bei einer Aussaat von 5x104 Zellen/Well (Y-Achse), aufgetragen gegen die verschiedenen siRNASequenzen (X-Achse). Die Säulen entsprechen der durchschnittlichen relativen Zellzahl aus 9 unabhängigen Experimenten, die Fehlerbalken der einfachen Standardabweichung. Akürzungen: siRNA= silencer Ribonucleinsäure, AVC= Ampulla of Vater Cancer. Experimente und Ergebnisse - 60 - 3.4.3. Untersuchung der in vitro Invasivität: Um neben dem Migrationsverhalten auch das invasive Potential der Papillenkarzinomzellen zu untersuchen, wurde ein Invasionsassay mit Matrigel Invasionskammern durchgeführt, der in vitro den Durchtritt von Tumorzellen durch eine Basalmembran simuliert (s. 2.7.3.). Der Aufbau ist ähnlich dem transwell-Migrationsassay, wobei die Zellen nicht direkt auf die Membran, sondern auf eine darüber liegende extrazelluläre Matrix ausgesät werden. Entsprechend einer Basalmembran in vivo hindert diese Matrix nicht invasive Zellen an der Migration durch die poröse Membran, wohingegen invasive Zellen diese Matrix durchdringen und durch die Membran migrieren können. Entsprechend dem Migrationsassay wurden diese Zellen durch Luciferase-Messung nachgewiesen und quantifiziert. Für den Nachweis invasiven Potentials und einer möglichen Änderung durch die verminderte Expression von AMFR wurden Zellen der Zelllinie AVC1 sowie die transformierten Formen (siRNA1, siRNA2 und siRNAk) untersucht. Es wurden 4 voneinander unabhängige Parallelexperimente durchgeführt. In den Versuchen konnte für die Papillenkarzinomzellen AVC1 invasives Potential nachgewiesen werden. Ähnlich wie in den Migrationsversuchen zeigten die siRNAtransfizierten Zellen im Vergleich zu den kontrolltransfizierten und untransfizierten Zellen eine Tendenz zu reduzierter Invasivität, wobei dieser Effekt jedoch keine statistische Signifikanz erreichte (siehe Abb. 19). Student t-Test: p=0,199 für siRNA1 und p=0,295 für siRNA2 im. Bezugswerte waren jeweils wieder die Mittelwerte der Negativkontrollen (siRNAk). Experimente und Ergebnisse - 61 - 0,100 0,090 0,080 Invasivität 0,070 0,060 0,050 0,040 0,030 0,020 0,010 0,000 siRNA1 Abb. 19: siRNA2 siRNAk untransfiziert In vitro Invasivität von AVC1 Dargestellt ist die relative Zellzahl vitaler invasiver Zellen nach einer Inkubationszeit von 24 bei einer Aussaat von 5x104 Zellen/Well (Y-Achse), aufgetragen gegen die verschiedenen siRNASequenzen (X-Achse). Die Säulen entsprechen der durchschnittlichen relativen Zellzahl aus 4 unabhängigen Experimenten (jeweils mit Doppelbestimmung) die Fehlerbalken der einfachen Standardabweichung. Abkürzungen: siRNA= silencer Ribonucleinsäure, AVC= Ampulla of Vater Cancer. Experimente und Ergebnisse - 62 - 3.4.4. Untersuchung substratunabhängigen Wachstums in vitro: Neben Proliferation Migrationsfähigkeit und Invasivität sollte die Fähigkeit zu substratunabhängigem Wachstum, also zu Proliferation unabhängig von der Anheftung an eine extrazelluläre Matrix, untersucht werden. Dies führt in untransformierten epithelialen Zellen normalerweise zur Apoptose. Der Verlust diesen Verhaltens ist in vivo ein wichtiger Schritt der Tumorprogression, und ermöglicht die Metastasierung (s. 2.7.4.). Zur Untersuchung dieser Eigenschaft bei Papillenkarzinomzellen wurden sog. Soft-AgarAssays durchgeführt, wobei die vereinzelten Zellen 10 Tage in Soft Agar kultiviert wurden um anschließend die gebildeten Kolonien von mehr als 3 Zellen auszuzählen. Untersucht wurden wieder Zellen der Zelllinie AVC1 sowie deren transfizierte Formen (siRNA1, siRNA2 und die Kontrolle siRNAk), ausgesät wurden je 3x104 Zellen/well. In den Versuchen konnte für AVC1 die Fähigkeit zu substratunabhängigem Wachstum nachgewiesen werden. Für untransfizierte und kontrolltransfizierte Zellen konnten nach 10 Tagen durchschnittlich 5 Kolonien/Gesichtsfeld gezählt werden, im Gegensatz zu ca 2,5 Kolonien/Gesichtsfeld für die transfizierten Formen mit schwächerer Expression des AMFRezeptors. Damit konnte für die mit Negativ-Kontrolle transfizierten AVC1-Zellen ein signifikant stärkeres substratunabhängiges Wachstum nachgewiesen werden, als für die Zellen mit AMFR-„knock-down“ (siehe Abb. 20). Student t-Test: p=7,87x10-3 für siRNA1 und p=1,24x10-4 für siRNA2. Bezugswerte waren jeweils wieder die Mittelwerte der Negativkontrollen (siRNAk). Experimente und Ergebnisse - 63 - 7,0 Kolonien/Gesichtsfeld 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0 siRNA1 Abb. 20: siRNA2 siRNAk untransfiziert Substratunabhängiges Wachstum in vitro von AVC1 Dargestellt ist die durchschnittliche Anzahl Kolonien pro Gesichtsfeld (>3 Zellklone) (Y-Achse), aufgetragen gegen die verschiedenen siRNA-Sequenzen. Es wurden 5 unabhängige Parallelversuche durchgeführt, ausgesät wurden 3x104 Zellen pro/well, ausgezählt wurden nach 10 Tagen 4 Gesichtsfelder pro siRNA-Sequenz unter dem Lichtmikroskop. Die Säulen entsprechen der durchschnittlichen Kolonienzahl/Gesichtsfeld, die Fehlerbalken der einfachen Standardabweichung. Abkürzungen: siRNA= silencer Ribonucleinsäure, AVC= Ampulla of Vater Cancer. Diskussion - 64 - 4. Diskussion 4.1. Das Papillenkarzinom und der AMF-Rezeptor: Das Papillenkarzinom ist ca. 5-20x seltener als das Pankreaskarzinom [14], und damit ein eher seltener Tumor, nichts desto trotz ist es Gegenstand intensiver Forschung. Die Gründe hierfür sind vielseitig. Da das Papillenkarzinom immerhin zwischen 33 und 36% aller operablen pankreatoduodenalen Tumoren ausmacht [46, 55], hat es in der Praxis durchaus klinische Relevanz. Die Diagnose eines Papillenkarzinoms ist mit der 5-JahresÜberlebenswahrscheinlichkeit von etwa 40% [40] mit einer erheblich besseren Prognose verbunden als die eines Pankreaskarzinoms. Die Pathogenese des Papillenkarzinoms ist vergleichbar mit der vieler anderer Tumoren des Gastrointestinaltraktes, es weist wie das kolorektale Karzinom eine Adenom-Karzinom-Sequenz auf [28, 40, 57]. Es gilt dieses Karzinom auf genetischer Ebene genau zu erforschen, um sein Verhalten auf bestimmte genetische Profile zurückführen zu können. Neue Erkenntnisse in diesem Gebiet können auch Aufschluss über pathogenetische Prozesse anderer Tumore bringen. In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe wurden zur Identifizierung von metastasierungsassoziierten Genen und solchen die mit anderen Eigenschaften von Karzinomen der Pankreas und angrenzender Strukturen in Verbindung stehen, Expressionsprofilanalysen mit der cDNAArray-Technologie durchgeführt. Diese Technik erlaubt eine zuverlässige Identifizierung differentiell exprimierter Gene von verschiedenen Karzinomen im Vergleich zu gesundem Gewebe mit guter Validität und Reliabilität [20, 21]. Dafür wurden RNA-Proben zahlreicher Gewebe (bes. Gewebe des Pankreas und der umliegenden Strukturen) mit der cDNA von ca. 2000 potentiell relevanten Genen hybridisiert. Dabei fanden sich 114 differentiell exprimierte Gene [8]. In diesen Analysen zeigte sich der AMF-Rezeptor als ein spezifisch im Papillenkarzinom überexprimiertes Gen, welches darüber hinaus in der Differenzierung zwischen malignen Prozessen und chron. Pankreatitis auf molekularbiologischer Ebene von Bedeutung zu sein schien. Aufgrund dieser Ergebnisse sollte der AMF-Rezeptor in dieser Arbeit in seiner funktionellen Bedeutung für das Papillenkarzinom untersucht werden. Der Autocrine Motility Factor Receptor und besonders sein Ligand AMF werden in der Tumorzellforschung immer wieder als die Tumorzellen in ihren Eigenschaften beeinflussende Faktoren beschrieben. Für einige Tumore konnte deren Überexpression und auch deren Einfluss auf Tumorprogression und andere Charakteristika der Zellen in vitro und in vivo nachgewiesen werden. So werden der Rezeptor und sein Ligand mehrfach als Faktoren Diskussion - 65 - beschrieben, welche die proliferativen, metastatischen und invasiven Eigenschaften verschiedener maligner Tumore verstärkt [10, 17, 18, 27, 31, 35, 42, 59, 61, 63], und deshalb als solches in der Tumorzellforschung von großem Interesse ist. 4.2. RT-PCR und Northern-Blot-Analysen: In cDNA-Array-Analysen ermittelte Expressionsunterschiede bedürfen stets einer Verifizierung durch alternative Methoden [21, 53]. So war es in dieser Arbeit das Ziel, den AMF-Rezeptor als ein differentiell exprimiert gefundenes Gen einer genaueren Prüfung zu unterziehen. Für die Validierung der Ergebnisse durch Real-Time-PCR, welche eine quantitative Interpretation der Ergebnisse erlaubt, wurden cDNA-Proben aus Pankreaskarzinomen, Papillenkarzinomen, Pankreatitiden und gesunden Pankreas auf ihre Expression von AMFR untersucht. In der Auswertung wurden die Ergebnisse von AMFR (∆CT-Werte) mit den Werten der Referenzgene RPLP0 und Cyclophilin A normalisiert. In den beiden RT-PCR-Läufen mit größtenteils identischen Proben konnten reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden. Auffällig waren die sehr unterschiedlichen Ergebnisse, welche sich durch die Normalisierung mit den zwei verschiedenen Referenzgenen CyclophilinA und RPLP0 ergaben. Bei der Normalisierung mit RPLP0 waren die Expressionsstärken von AMFR in den Proben der Papillenkarzinome auffällig erhöht, was den Ergebnissen der ArrayAnalysen entsprechen würde. Bei der Normalisierung mit CyclophilinA war dies jedoch nicht beobachtbar. Die Ergebnisse der qRT-PCR bedurften der Überprüfung durch eine weitere Methode, wofür sich die Northen-Blot-Technik anbot. Auf dafür angefertigten, und mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde des AMFR hybridisierten, Northern Blots zeigte sich eine deutlich stärkere Expression des Rezeptors in Geweben von humanen Papillenkarzinomen, verglichen mit Proben von Pankreaskarzinomen, chron. entzündlicher und gesunder Pankreas. Dieses Ergebnis bestätigt, dass der AMFRezeptor im Papillenkarzinom spezifisch überexprimiert ist. Dies spricht zum Einen für eine mögliche Eignung von AMFR als molekularen Marker für die Differentialdiagnose maligner Tumore des Pankreaskopfes, und liefert zum Anderen interessante Ansatzpunkte zur Aufklärung der molekularen Genese von Papillenkarzinomen. Die Ergebnisse der Northern Blots bestätigen darüber hinaus die Ergebnisse der RPLP0normalisierten qRT-PCR-Analysen und bestätigen damit, dass sich das Haushaltsgen RPLP0 Diskussion - 66 - gut als Referenzgen zur Normalisierung bei qRT-PCR mit Proben des Pankreas und des peripankreatischen Gewebes eignet. Cyclophilin A hingegen scheint, wie andere Experimente der Arbeitsgruppe bereits vermuten ließen, in den untersuchten Geweben nicht stabil exprimiert zu werden. Dieses Ergebnis wird durch Untersuchungen von Li et al. und Shen et al. bestätigt, die CyclophilinA als ein im Pankreaskarzinom überexprimiertes Gen verglichen mit gesundem Pankreas-Vergleichsgewebe beschreiben [35, 54]. CyclophilinA ist daher als Gen für die Normalisierung bei qRT-PCR von Geweben der Pankreas nicht geeignet. Bei Hybridisierung der Northern Blots mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde des Liganden AMF zeigte sich, dass das Expressionsmuster von AMF nur in Teilen mit dem Expressionsmuster von AMFR korreliert. Während in der Literatur die Überexpression des Rezeptors meist im Zusammenhang mit der Überexpression seines Liganden (und umgekehrt) beschrieben wird [24, 27, 31, 59], könnten die hier erzielten Ergebnisse darauf hindeuten, dass die Überexpression des Rezeptors auch in Abwesenheit des Liganden AMF eine Wirkung entfalten kann. Diskussion - 67 - 4.3. Der Einfluss von AMFR auf das Verhalten von AVC1 in vitro: In dieser Arbeit wurde mit vier verschiedenen in vitro Testverfahren der Einfluss einer verminderten Expression des AMF-Rezeptors auf das Verhalten der humanen Papillenkarzinomzelllinie AVC1 untersucht. Zur Verminderung der Expression des Rezeptors wurden die Zellen mit siRNA transfiziert. In den Versuchen wurde das Verhalten von Papillenkarzinomzellen bezüglich substratunabhängigem Wachstum Proliferation, beobachtet. Migrationsfähigkeit, Es wurden Invasivität und kontrollbehandelte Papillenkarzinomzellen, welche eine starke Grundexpression von AMFR zeigen, mit den siRNA-transfizierten Zellen, die eine deutlich schwächere Expression des Rezeptors aufweisen, verglichen. Dabei konnte in zwei von 4 Fällen ein signifikanter Einfluss der Expressionsstärke des AMF-Rezeptors auf das Verhalten der Zellen in vitro nachgewiesen werden. Was die Teilungsrate der Zellen in vitro angeht, konnte im Proliferationsassay ein signifikant stärkeres Wachstum der Papillenkarzinomzellen durch AMFR nachgewiesen werden (p=1,09x10-8 und p=9,11x10-8 sowie p=5,04x10-6 und p=4,43x10-6). Zellen maligner Tumoren teilen sich schneller als die gesunder Gewebe, was zu einem raschen Größenwachstum maligner Gewebe führt. Die verstärkte Expression des AMF-Rezeptors trägt in Papillenkarzinomzellen zu einer schnelleren Teilungsrate bei. In der Literatur wurde für andere Karzinomtypen bereits ein mitogener Effekt für den AMFRLiganden AMF beschrieben [10, 42, 61, 63]. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind dabei noch wenig untersucht. Tsutsumi et al. beschreiben, dass die erhöhte Expression von AMF zu einer verstärkten Expression von Cyclin D1 und Cyclin-abhängigen Kinasen führt, die den Zell-Zyklus beschleunigen, im Sinne eines schnelleren Übergangs von G1 zu S [63]. Der hier beschriebene Mechanismus spielt sich intrazellulär ab und ist auch ohne Beteiligung des AMF-Rezeptors möglich. Die in dieser Arbeit detektierte signifikant stärkere Proliferation der untransformierten AVC1-Zellen mit höherer Expression des AMF-Rezeptors lässt jedoch darauf schließen, dass darüber hinaus auch autokrine oder parakrine Mechanismen existieren und/oder der AMF-Rezeptor unabhängig von AMF mitogene Signale vermitteln kann. Nicht maligne Zellen brauchen für ihre Teilung immer Kontakt zu einer Basalmembran bzw. in vitro zur Oberfläche einer Zellkulturschale (substratabhängiges Wachstum). In den „SoftAgar-Assays“ konnte gezeigt werden, dass humane Papillenkarzinomzellen der Zelllinie AVC1 in vitro substratunabhängig wachsen, und sich damit unabhängig vom Anhaften an eine Oberfläche teilen können. Durch diese Eigenschaft sind maligne Zellen während der Diskussion - 68 - Metastasierung in vivo dazu befähigt sich weiter zu teilen und nicht in Apoptose (hier Anoikis) zu gehen. Es konnte gezeigt werden, dass die Expressionsstärke von AMFR einen signifikanten Einfluss auf diese Fähigkeit bei Papillenkarzinomzellen hat. Untransfizierte Zellen der Zelllinie AVC1 bilden im Soft-Agar-Assay mehr und größere Kolonien als die transfizierten Formen mit schwächerer Expression des Rezeptors. Bezüglich der Migrationsfähigkeit wurde durch die in vitro Migrationsassays nachgewiesen, dass humane Papillenkarzinomzellen der Zelllinie AVC1 dazu befähigt sind, sich aus ihrem Zellverbund zu lösen und durch eine Membran definierter Porengröße gerichtete Zellbewegungen auszuführen. Auch dies ist eine Eigenschaft, die maligne Zellen auszeichnet und die eine notwendige Voraussetzung für die Fähigkeit zur Metastasierung darstellt. In den Versuchen konnte zwar eine Tendenz zu verminderter Migrationsfähigkeit nach „knockdown“ von AMFR beobachtet werden, jedoch war dieser Effekt nicht sehr stark ausgeprägt und erreichte nur für eine der beiden verwendeten siRNA-Sequenzen statistische Signifikanz Ähnliches gilt für die Fähigkeit zur Invasion durch eine künstliche Basalmembran: In den Invasionsassays konnte beobachtet werden, dass AVC1-Zellen in vitro invasiv wachsen können, sich also aus ihrem Zellverbund lösen und durch eine Matrix gerichtet bewegen können. Auch hier wurde eine Tendenz zu verminderter Invasion nach AMFR-„knockdown“ beobachtet, der jedoch keine statistische Signifikanz erreichte. Der Effekt der verminderten AMFR-Expression auf Migration und Invasion von AVC1Zellen war somit deutlich schwächer ausgeprägt als der auf Proliferation und substratunabhängiges Wachstum. Diese Ergebnisse sind interessant, da AMF und sein Rezeptor in der Literatur bisher vor Allem mit erhöhter Invasivität und einem erhöhten Metastasierungspotential in Verbindung gebracht wurden. Mehrere Arbeiten beschreiben die Stimulation gerichteter und ungerichteter Zellbewegung durch AMF und AMFR in vitro in verschiedenen Modellsystemen ([10, 17, 18, 24, 27, 29, 31, 65] u.a.). Der AMF-Rezeptor gilt als Marker für Metastasierung und wird bei einigen Tumoren mit einer schlechteren Prognose in Verbindung gebracht. So ist bei Nakamori et al. [36] die erhöhte Expression von AMFR im Kolorektalen Karzinom signifikant mit einer schlechteren Prognose, sowie mit einer erhöhten Rezidivinzidenz verbunden. Die Expression von AMFR korreliert hier mit dem Tumorfortschritt (Stadium nach TNM-Klassifikation). Jiang et al. [27] konnten in ihren Versuchen eine erhöhte Expression von AMFR und seines Liganden im Mamma-Karzinom und ein schlechteres Outcome der Patientinnen mit AMFR-Überepression nachweisen. Ganz ähnlich konnten Kaynak et al. [31] zeigen, dass die Expression von AMFR ein schlechtes Diskussion operatives - 69 Outcome von Patienten mit nicht kleinzelligen Bronchialkarzinomen (Adenokarzinom) vorhersagt. Bei Timar et al. [59] ist die Expressionsstärke von AMFR im Malignen Melanom signifikant mit der Wachstumsphase des Karzinoms gekoppelt: Er ist beim vertikalen Wachstum (welches durch den Durchbruch der Basalmembran zu Metastasen führt) stärker exprimiert als beim radiären Wachstum. Die hier erzielten Ergebnisse könnten darauf hindeuten, dass der AMF-Rezeptor im Papillenkarzinom eine andere Rolle als in anderen Malignomen einnimmt, indem er eher das lokale Wachstum des Tumors als die Invasivität und Metastasierung fördert. Dafür würde auch sprechen, dass der Rezeptor in Papillenkarzinomen deutlich stärker überexprimiert ist als in Adenokarzinomen des Pankreas, obwohl sich letztere insgesamt deutlich aggressiver darstellen und vor Allem ein deutlich ausgeprägteres infiltratives und metastatisches Potential besitzen. Einschränkend muss allerdings darauf hingewiesen werden, dass mit den hier verwendeten Methoden nur einige isolierte Teilschritte der Invasion und Metastasierung untersucht werden können. Beim Vorgang der Metastasierung handelt es sich um ein hochkomplexes Geschehen, welches durch die Tumorzellen selbst, aber auch durch das Immunsystem und das umgebende Gewebe beeinflusst, sowie von einer Vielzahl von Genen kontrolliert wird. Die einzelnen Schritte sind von sehr vielen Faktoren abhängig, und beeinflussen sich vermutlich auch gegenseitig. Im Groben umfasst die Metastasierung die Loslösung vitaler Tumorzellen aus dem Gewebeverband und eine anschließende Penetration der Tumorblutgefäße. Für eine erfolgreiche Metastasierung müssen die Tumorzellen dann im Blutstrom überleben, sich an das Endothel im Zielorgan anheften und es durchwandern. Erfolgt dann eine Proliferation der Tumorzellen, so resultiert nach einiger Zeit eine klinisch feststellbare Metastase. Bei den in dieser Arbeit angewandten Assays zur Untersuchung von metastasierungsassoziiertem Verhalten handelt es sich um in vitro Verfahren. Sie machen es möglich Teilschritte des in vivo stattfindenden Metastasierungsprozesses außerhalb eines Organismus in Zellkultur nachzuahmen und genauer zu untersuchen. In vivo beobachtete Verhaltensweisen von Zellen müssen nicht unbedingt ebenfalls in vitro zu beobachten sein, weil für einige Vorgänge unter Umständen weit mehr Voraussetzungen gegeben sein müssen, als sie in vitro vorherrschen können. Einige Vorgänge sind zum Beispiel abhängig von der Anwesenheit eines gesamten soliden Tumors mit stromalen Zellen und reagiblem Wirtsstroma, oder auch vom Vorhandensein von Nachbargewebe. Bei einigen Karzinomen, so zum Beispiel beim Pankreaskarzinom, spielt das Tumorstroma eine entscheidende Rolle. Man Diskussion - 70 - weiß mittlerweile, dass es nicht allein, wie lange Zeit postuliert, die Funktion einer statischen Gerüststruktur erfüllt, die nur passiv an den für die Tumorprogression erforderlichen Umbauprozessen beteiligt ist. Vielmehr kann es aktiv und regulierend in den gesamten Prozess der Tumorentstehung, -progression und Metastasierung eingreifen. So kann es den Tumor vor immunologischen Abwehrreaktionen des Wirtsorganismus schützen und über die Freisetzung bzw. Anreicherung von Wachstumsfaktoren, Chemokinen, Angiogenesefaktoren sowie verschiedener Proteasen und deren Inhibitoren ein „tumorfreundliches“ Mikroklima schaffen, welches die Tumorprogression begünstigt. Entscheidend ist hierbei nicht die absolute Konzentration der einzelnen Faktoren sondern ihr komplexes Gleichgewicht untereinander. Weiterhin ist die extrazelluläre Matrix aktiv an der Regulation von Zellwachstum und Zelltod sowie Genexpression und Zelldifferenzierung benachbarter Zellen beteiligt. Dies gilt sowohl für Transformation maligner Zellen als auch die physiologischen Zelldifferenzierung. Auch die Fähigkeit zur gerichteten Zellbewegung wird durch die extrazelluäre Matrix entscheidend mitbeeinflusst. Sie kann hierbei u. a. als Leitstruktur dienen, entlang derer die gerichtete Zellmigration bzw. -invasion erfolgt. Umgekehrt beeinflussen maligne transformierte Zellen das sie umgebende Wirtsstroma und führen zu spezifischen Veränderungen der extrazellulären Matrix, die mit einer vermehrten Tumorprogression einhergehen können [21, 36, 48]. So ist es durchaus möglich, dass der AMF-Rezeptor, der in den in vitro Untersuchungen mit rekonstruierten Basalmembranen zu keiner Erhöhung der Migration und des invasiven Potentials der Papillenkarzinomzellen führte, im komplexeren Umfeld in vivo einen solchen messbaren Einfluss hat. Um diese Fragen abschließend zu klären sind weitere Untersuchungen, insbesondere auch unter Verwendung in vivo-Modellen, notwendig. Diskussion - 71 - 4.4. Ausblicke: Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass der AMFR in der Tumorprogression des Papillenkarzinoms eine Rolle spielt, die beobachteten Effekte sollten weiter charakterisiert werden. Dazu sollen u.a. stabil transfizierte Klone der Linie AVC1 mit dauerhaft reduzierter Expression von AMFR hergestellt werden, um in Maus-Xenograft- und LungenkolonisationsExperimenten die Rolle des Rezeptors im komplexen Umfeld in vivo zu charakterisieren. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des AMF-Rezeptors für das Papillenkarzinom untersucht, indem die starke Expression des Rezeptors in der Zelllinie AVC1 durch Transfektion mit siRNA vermindert wurde, um dann die Zellen auf Unterschiede in ihrem Verhalten zu testen. Um nicht nur die Auswirkung einer verminderten, sondern auch die einer verstärkten AMFR-Expression zu untersuchen ist es sinnvoll, die Zellen auch mit Überexpressionskonstrukten stabil zu transfizieren. Dieses sollte selektionierbar sein, und außerdem die Möglichkeit bieten die Expression des Gens spezifisch zu aktivieren. Hierfür bietet sich der Vektor pBig2i mit doxycyclinabhängiger Genregulation an. Versuche zur Klonierung des offenen Leserahmens von AMFR in pBig2i, sowie zur Transformation eines kompetenten Bakterienstammes mit diesem Vektorkonstrukt, wurden im Rahmen dieser Arbeit bereits durchgeführt, konnten jedoch aus Zeitgründen nicht weiter verfolgt werden. Neben der Untersuchung des AMF-Rezeptors ist auch die Untersuchung des Liganden AMF von Interesse. In der Literatur wird bisher meist vorausgesetzt, dass die Funktion des AMFR an das Vorhandensein seines Liganden AMF gekoppelt ist [10, 18, 24, 29, 31, 61]. Die in diese Arbeit erzielten Ergebnisse zur Expression von AMF und AMFR deuten darauf hin, dass der AMF-Rezeptor möglicherweise auch von AMF unabhängige Funktionen haben könnte. Es ist daher geplant, in „knockdown“- und Überexpressions-Experimenten zu überprüfen, welche der von AMFR vermittelten Effekte auch durch Modulation der AMFExpression zu erzielen sind bzw. welche dieser Effekte unabhängig von AMF sind. In den Expressionsprofilanalysen sowie den durchgeführten Northern Blot- und RT-PCRAnalysen zeigte sich eine verstärkte Expression des Rezeptors in Geweben von Papillenkarzinomen verglichen mit Geweben des peripapillären Bereichs. In Geweben von Pankreaskarzinomen war die Expression des Rezeptors deutlich schwächer. Interessant ist jedoch, dass in RNA-Proben gängiger Pankreaskarzinomzelllinien eine sehr starke, der von AVC1-Zellen entsprechende Expression des AMFR zu nachzuweisen war. Um die in dieser Arbeit aufgestellte Hypothese zu untermauern, dass der AMFR im peripankreatischen Gebiet ein spezifischer Marker für das Papillenkarzinom ist, muss die Expression von AMFR Diskussion - 72 - zusätzlich in Tumoren der Gallenblase, der ableitenden Gallengänge und auch des Duodenums quantifiziert werden. Aber auch die Expression des Rezeptors in Papillenadenomen ist von Bedeutung, denn nur wenn diese signifikant niedriger ist als im Karzinom, kann AMFR als spezifisch für das Papillenkarzinom gelten. Das wäre aus diagnostischen Gesichtspunkten von Interesse, da die histologische Differenzierung zwischen Adenom und Karzinom manchmal schwierig ist [60]. Ein sicherer Ausschluss eines Karzinoms kann nämlich eine lokale Tumorexzision rechtfertigen, und so einen radikalchirurgischen Eingriff vermeiden [40]. In anderen Tumoren, beispielweise dem Kolorektalen Karzinom [36], steht die Expression von AMFR in direktem Zusammenhang mit dem Tumorfortschritt im Sinne der TNMKlassifikation und ist hier somit ein prognostischer Marker. Im Papillenkarzinom gilt der Tumorfortschritt als ein Hauptkriterium für die Prognose [17, 28, 40]; eine mögliche Korrelation der AMFR-Expression mit der Progression ist für diese Tumorentität allerdings nicht untersucht. Es wäre daher interessant, in einer größeren Serie von Gewebeproben von Papillenkarzinomen mit bekannter TNM-Klassifikation die Expression von AMFR zu ermitteln, um eine eventuell vorliegende Korrelation zwischen Prognose und AMFRExpression zu ermitteln. Zusammenfassung - 73 - 5. Zusammenfassung In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass dem bis dahin nur für andere Tumorentitäten vorbeschriebenen Autocrine Motility Factor Receptoreine (AMFR) eine wichtige Rolle bei Prozessen der Tumorprogression im Papillenkarzinom zukommt. Die Identifizierung des Gens erfolgte durch cDNA-Array-Technologie (copy- Desoxyribonucleinsäure-Array-Technologie) über vergleichende Expressionsprofilanalysen zahlreicher Gewebe von Pankreas (gesundes und entzündliches Pankreas sowie Pankreaskarzinom) und Papillenkarzinomen. Hier zeigte sich der AMFR als ein in Papillenkarzinomen stark hochreguliertes Gen, außerdem nahm der AMFR eine Schlüsselrolle bei der Differenzierung zwischen entzündlichen und malignen Prozessen im peripankreatischen Raum ein. Anschließend konnte mit Hilfe von qRT-PCR-Analysen (quantitative Real Time-Polymerase chain reaction-Analysen) und Northern-Blot-Analysen humaner Gewebeproben des Pankreas und der Papille dieses Expressionsmuster von AMFR belegt werden. Das Expressionsmuster des Liganden Autocrine Motilty Factor (AMF) korrelierte nur in Teilen mit dem des Rezeptors AMFR. Um den Einfluss des AMF-Rezeptors auf Prozesse der Tumorprogression und Metastasierung beim Papillenkarzinom zu charakterisieren wurde die von Sorio et al. etablierte humane Papillenkarzinomzelllinie „AVC1“ herangezogen. Diese Zelllinie zeigte im Northern-Blot eine starke Grundexpression des Rezeptors. Die Reprimierung der AMFR-Expression durch siRNA (silencer Ribonucleinsäure) erlaubte über den Vergleich der starken und unterdrückten Expression eine direkte Zuordnung potentieller Veränderungen auf das untersuchte Gen. Die durchgeführten in vitro Experimente zu Proliferation und substratunabhängigem Wachstum zeigten bei den Papillenkarzinomzellen eine signifikante Abnahme des proliferativen Verhaltens und des substratunabhängigen Wachstums nach „Knockdown“ des AMF-Rezeptors. Die durchgeführten Versuche zu Migrationsverhalten und Invasivität zeigten keinen statistisch signifikanten Effekt auf diese metastasierungsassoziierten Eigenschaften. Die endgültige Charakterisierung dieser Prozesse bedarf weiterführender Untersuchungen. Auch zur Klärung der diesen Prozessen zugrunde liegenden Mechanismen sind weitere Untersuchungen nötig. Insbesondere von einer Etablierung eines in vivo NacktmausXenograft-Modells mit der vorliegenden AVC1-Zelllinie erwarten wir weiterführende Erkenntnisse, auch über Zusammenhänge zwischen AMFR und dem Liganden AMF, sowie über assoziierte Prozesse welche sich zwischen Tumorzellen und Tumorstroma abspielen. Literaturverzeichnis - 74 - 6. Literaturverzeichnis [1] Albores-Saavedra J, Henson DE, Sobin LH: Histological typing of tumours of the gallbladder and extrahepatic bile ducts. In: Albores-Saavedra J, Henson DE, WHO, International Histologial Classification of Tumours, 2nd ed. Springer, Berlin Heidelberg New York Tokyo (1991) [2] Albores-Saavedra J, Henson DE, Klimstra DS: Tumors of the Gallbladder, extrahepatic bile ducts and ampulla of Vater. 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Seine konstruktive Stellungnahme und seine hohen Fachkenntnisse halfen bei auftretenden Problemen stets weiter. Weiterer Dank gilt natürlich allen jetzigen und ehemaligen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Arbeitsgruppe für ihre Unterstützung und Hilfe bei der praktischen Umsetzung meiner Arbeit und das angeneme Arbeitsklima. Im Besonderen möchte ich mich hier bei Susanne Braun, und auch bei Karin Lanz und Claudia Ruhland bedanken. Ganz besonders danke ich meinem Ehemann für seine positive Unterstützung. Mein herzlicher Dank gilt hier außerdem meiner Mutter sowie meinen Schwiegereltern für deren tatkräftige Unterstützung bei der Betreuung meiner kleinen Tochter. Zuletzt möchte ich mich bei allen hier nicht namentlich genannten Helferinnen und Helfern bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
