Aus der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und
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Aus der Klinik für kleine Klauentiere und forensische Medizin und Ambulatorischen Klinik der Tierärztlichen Hochschule Hannover Vergleich von Methoden zum Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniae-Infektionen beim Schwein sowie epidemiologische Untersuchungen über die Verbreitung der Enzootischen Pneumonie im Weser-Ems Gebiet im Jahre 1996 INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover Vorgelegt von Elke Hiltermann-Linden aus Dissen a. T. W. Hannover 2004 Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. M. Ganter 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. M. Ganter 2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Th. Blaha Tag der mündlichen Prüfung: 24.11.2004 Meiner Familie Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 9 2 Schrifttum 10 2.1 Mycoplasma (M.) hyopneumoniae 2.1.1 Ätiologie 2.1.2 Epidemiologie 2.1.3 Pathogenese 2.1.4 Klinik 2.1.5 Immunität 2.1.6 Pathologie 2.1.7 Diagnose 2.1.7.1 Nachweis spezifischer Antikörper 2.1.7.2 Immunfluoreszenztest 2.1.7.3 Kultureller Nachweis des Erregers 2.1.7.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 2.1.8 Bekämpfung 2.1.8.1 Sanierungsverfahren 2.1.8.2 Impfung 2.1.8.3 Therapie 10 10 11 13 14 15 16 18 18 20 22 23 25 26 28 31 3 Material und Methode 32 3.1 Chemikalien und Reagenzien 3.2 Geräte und Hilfsmittel 3.3 Lösungen 3.4 Antigen für den TiHo-ELISA 3.5 Hyperimmunseren für den Immunfluoreszenztest 3.6 Probenmaterial und –auswahl 3.7 Vergleich der serologischen Testsysteme 3.7.1 Enzyme Linked Immunosorbent Assay des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo-ELISA) 3.7.2 DAKO Mycoplasma hyopneumoniae ELISA (DAKO-ELISA) 3.7.3 Chekit-Hyoptest I nach Dr. Bommeli (Bommeli I-ELISA) 3.7.4 Chekit-Hyoptest II nach Dr. Bommeli (Bommeli II-ELISA) 3.8 Vergleich der unterschiedlichen Methoden zum Nachweis von M. hyopneumoniae-Infektionen 3.8.1 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur 3.8.1.1 Nachweis von M. hyopneumoniae in Lungen mit dem indirekten Immunfluoreszenztest 3.8.2 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion 3.9 Epidemiologische Untersuchung 3.9.1 Kartographierung der Betriebe 3.10 Vergleich der Epidemiologie von M. hyopneumoniae mit denen von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) und Influenza 32 32 33 34 34 34 37 37 38 39 41 41 41 42 42 43 43 43 3.11 Statistische Auswertung 43 4 Ergebnisse 45 4.1 Vergleich der serologischen Testsysteme 45 4.1.1 Analyse von Häufigkeiten qualitativer Daten mit Berechnung von Sensitivität und Spezifität 45 4.1.2 Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemar-Test 46 4.1.3 Regressionsanalyse 47 4.2 Drei verschiedene Nachweismethoden für M. hyopneumoniae-Infektionen im Vergleich 47 4.2.1 Der indirekte Immunfluoreszenztest 47 4.3 Vergleich des indirekten Immunfluoreszenztests an Lungenproben mit dem Bommeli II-ELISA korrespondierender Serumproben 48 4.3.1 Überprüfung der Sensitivität und Spezifität des Bommeli II-ELISAs 49 4.3.1.1 Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemartest 49 4.4 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur 50 4.5 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion 51 4.5.1 Auswertung der Sektionsprotokolle 51 4.5.2 Vergleich der Ergebnisse der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit den makroskopischen Untersuchungen der Lungen auf M. hyopneumoniae 52 4.6 Epidemiologische Untersuchung 53 4.6.1 Auswertung der untersuchten Serumproben von Schlachtschweinen 53 4.6.1.1 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von M. hyopneumoniae 53 4.6.1.2 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von Antikörpern gegen Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) 53 4.6.1.3 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von Antikörpern gegen Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) 54 4.6.1.4 Scheinbare Herden-Prävalenz von M. hyopneumoniae 54 4.6.1.5 Scheinbare Herden-Prävalenz von Antikörpern gegen Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) 55 4.6.1.6 Scheinbare Herden-Prävalenz von Antikörpern gegen Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) 55 4.6.2 Einflussfaktoren auf die Intra-Herden-Prävalenzen 55 4.6.2.1 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf die M. hyopneumoniaePrävalenz 56 4.6.2.2 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) 57 4.6.2.3 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) 58 4.6.2.4 Einfluss der Betriebsform auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz 59 4.6.2.5 Einfluss der Betriebsform auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) 60 4.6.2.6 Einfluss der Betriebsform auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) 61 4.6.2.7 Einfluss der Einstallungsform auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz 61 4.6.2.8 Einfluss der Einstallungsform auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) 63 4.6.2.9 Einfluss der Einstallungsform auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) 64 4.6.2.10 Einfluss der Ferkelherkunft auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz 65 4.6.2.11 Einfluss der Ferkelherkunft auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) 66 4.6.2.12 Einfluss der Ferkelherkunft auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) 67 4.6.2.13 Einfluss der Produktionsverfahren auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz 68 4.6.2.14 Einfluss der Produktionsverfahren auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) 71 4.6.2.15 Einfluss der Produktionsverfahren auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) 73 4.7 Beziehung zwischen Lungenbefundung und dem jeweiligen Testsystem für M. hyopneumoniae und den beiden Influenzavirus Subtypen (H1N1) und (H3N2) 74 4.7.1 Beziehung zwischen Lungenbefundung und M. hyopneumoniaeAntikörpernachweisen 74 4.7.2 Beziehung zwischen Lungenbefundung und Influenzavirus H1N1Antikörpernachweisen 75 4.7.3 Beziehung zwischen Lungenbefundung und Influenzavirus H3N2Antikörpernachweisen 76 4.8 Geographische Verteilung einzelner Erreger respiratorischer Erkrankungen bei Mastschweinen 77 4.8.1 Geographische Verteilung von M. hyopneumoniae 77 4.8.2 Geographische Verteilung von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) 79 4.8.3 Geographische Verteilung des Influenzastammes A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) 80 4.8.4 Geographische Verteilung des Influenzastammes A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) 81 4.9 Vergleich der Epidemiologie von M. hyopneumoniae mit denen von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) nach POPPE (1997) und den beiden Influenzastämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) nach SCHENK 2000 82 5 Diskussion 84 5.1 Vergleich der serologischen Testsysteme 5.2 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur 5.3 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion 5.4 Epidemiologische Studie 5.5 Lungenbefundung 5.6 Geographische Verteilung von M. hyopneumoniae 5.7 Vergleich der Epidemiologie von M. hyopneumoniae mit denen von Actinobacillus pleuropneumoniae nach POPPE (1997) und den beiden Influenzavirusstämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) nach SCHENK (2000) 84 86 87 88 90 90 6 Zusammenfassung 94 7 Summary 96 8 Literaturverzeichnis 98 91 Abkürzungsverzeichnis Abb. A. pp. Aqua dest. Aqua tridest. BALF bp -NAD bzgl. bzw. BO II-ELISA cfu d. h. DNA ELISA EP fg FITC IFT Ig IBA IVD Ig PO kDa LT LW MIRD M. hyo. n ng P. multocida PBS PCR PRDC PRRS RT ® sm SPF Tab. ™ v. a. v/v z. B. Abbildung Actinobacillus pleuropneumoniae Aqua destillata (destilliertes Wasser) Aqua tridestillata (3-fach destilliertes Wasser) bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit Basenpaare -Nicotinamid-adenin-dinucleotid bezüglich beziehungsweise Bommeli II-ELISA colony forming units das heißt Desoxyribonucleid Acid Enzyme Linked Immunosorbent Assay Enzootische Pneumonie femtogramm 10-15 Fluoresceinisothiocyanat Immunfluoreszenztest Immunglobulin Immuno-Binding-Assay Innovative Diagnostik Immunglobulin Peroxidase kiloDalton Lebenstag Lebenswoche Mycoplasma Induced Respiratory Disease Mycoplasma hyopneumoniae Anzahl der untersuchten Proben nanogramm 10-9 Pasteurella multocida phosphate buffered saline polymerase chain reaction Porcine Respiratory Disease Complex Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Raumtemperatur registered registered service mark spezifisch pathogenfrei Tabelle trademark vor allem volume per volumen zum Beispiel 9 1 Einleitung Untersuchungen zur Enzootischen Pneumonie besagen eine weltweite Verbreitung des Erregers Mycoplasma (M.) hyopneumoniae. Dieser verursacht erhebliche wirtschaftliche Verluste, v. a. durch eine Verschlechterung der Futteraufnahme sowie Futterverwertung, damit Wachstumsminderung und somit Verlängerung der Mastdauer. Der ökonomische Verlust resultiert aus einer komplexen Interaktion zwischen M. hyopneumoniae und anderen Infektionen, schlechtem Management und schlechten Umweltbedingungen (ROSS 1999). Da die Ausbreitung der Infektion weder durch eine antibiotische Behandlung noch durch Impfungen verhindert werden kann, besteht die einzige Möglichkeit, diese Erkrankung in den Griff zu bekommen, in der Eliminierung infizierter Schweine (HOWARD und TAYLOR 1985, SCHATZMANN et al. 1996, CALSAMIGLIA und PIJOAN 1998). Die exakte Diagnostik ist jedoch ein Problem, da insbesondere Trägertiere oder chronisch infizierte Tiere mit den gängigen Methoden oft nicht erkannt werden. Ein Ziel dieser Arbeit ist daher der Vergleich der bisher am häufigsten gebrauchten Nachweismethoden für M. hypneumoniae in Blut- und Lungenproben. Ein weiteres Ziel ist die epidemiologische Untersuchung über die Verbreitung von M. hyopneumoniae an Mastschweinen im Weser-Ems Gebiet aus dem Jahre 1996. Abschließend sollen die gefundenen Ergebnisse mit den Ausbreitungsmustern von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) aus der Arbeit von POPPE (1996) und den Influenzastämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) mit den Daten von SCHENK (2000) aus dem gleichen Probenpool von 1996 verglichen werden. 10 2 Schrifttum 2.1 Mycoplasma (M.) hyopneumoniae 2.1.1 Ätiologie Die zellwandlosen und daher pleomorphen Mykoplasmen passieren die üblichen bakteriendichte Filter, da sie mit 0,1-0,3 µm Durchmesser die kleinsten Mikroorganismen sind, die sich außerhalb von Zellen selbständig vermehren können (BISPING und AMTSBERG 1988, ROLLE und MAYR 1993, 2002). Für Mensch und Tier von besonderer Bedeutung ist die Familie der Mykoplasmataceae, die zur Klasse der Mollicutes und der Ordnung Mykoplasmatales gehören. Von diesen stellt die Gattung Mycoplasma mit ihren ca. 100 Arten die wohl wichtigste Gruppe dar. Mykoplasmen sind überwiegend harmlose Parasiten der Schleimhäute, vor allem im Respirations- und Urogenitaltrakt, kommen aber auch im Euter und in den Gelenken vor. Neben den vielen apathogenen Mykoplasmaarten gibt es jedoch viele Spezies, die als Sekundärerreger bekannt sind, und einige, die als primäre Krankheitserreger isoliert wurden (ROLLE und MAYR 1993, RAZIN et al. 1998). Für das Schwein gelten die folgenden vier Arten als bedeutend: 1. M. flocculare 2. M. hyopneumoniae 3. M. hyorhinis 4. M. hyosynoviae Von besonders großer Bedeutung für das Schwein ist dabei M. hyopneumoniae. Zwei unabhängig voneinander arbeitende Forschergruppen in England und den U.S.A. (GOODWIN et al. sowie MARÉ und SWITZER) gelang 1965 der Beweis, dass dieses Bakterium als der primäre Erreger der Enzootischen Pneumonie der Schweine anzusehen ist. Die kulturelle Anzüchtung der Mykoplasmen ist sehr aufwändig, da sie extreme Nährbodenansprüche stellen, u.a. benötigen sie Bausteine der DNA, Cholesterin, enthalten in den zugesetzten Tierseren (v.a. Pferdeserum), und Hefeextrakt. Hinzu kommt die relativ lange Bebrütungszeit von mindestens zehn Tagen (BISPING und AMTSBERG 1988, ROLLE und MAYR 1993, 2002). Beim Gelingen der Anzucht von M. hyopneumoniae zeigen sich dann sehr kleine Kolonien mit 0,25–1 mm Durchmesser (ROLLE und MAYR 1993, 2002), die jedoch nicht wie die meisten Mykolasmen ein spiegeleiförmiges, d.h. biphasisches Wachstum (WHITTLESTONE 1979), sondern eine homogene Kolonieoberfläche aufweisen. Die Isolierung von M. hyopneumoniae wird nach WHITTLESTONE (1979) und ROLLE und MAYR (1993) zudem oft noch durch die Anwesenheit und das schnellere Wachstum von M. hyorhinis, der nach ROLLE und MAYR (1993) als ein häufiger Begleiter auf der Bronchialschleimhaut anzusehen ist, erschwert. Seine Beteiligung am Krankheitskomplex wurde schon 1991 von FALK und Mitarbeitern vermutet, und ist nach ROLLE und MAYR (2002) mittlerweile nicht mehr auszuschließen. 11 Anhand der typischen biochemischen Merkmale für M. hyopneumoniae, wie der Sterolabhängigkeit, der Glukosefermentation, einer fehlenden Arginin- und Harnstoffhydrolyse etc. kann eine Artbestimmung versucht werden, größere Sicherheit bringt aber (ROLLE und MAYR 2002) die serologische Differenzierung von Mykoplasmen, wobei das Arbeiten mit DNA-Sonden und der PCR zunehmend an Bedeutung gewinnt. 2.1.2 Epidemiologie Die Enzootische Pneumonie ist eine der häufigsten und ökonomisch wichtigsten Erkrankung der Schweine. Sie ist in der ganzen Welt verbreitet (SIMECKA et al. 1992, MAES et al. 1996, ROSS 1999). Fast 50 % aller Mastschweine weisen Lungenveränderungen auf, die auf eine Enzootische Pneumonie zurückgehen (WHITTLESTONE 1972, EICH und SCHMIDT 2000). Dieser Prozentanteil liegt aber wahrscheinlich höher, denn nach WALLGREN et al. (1993, 1994) werden abgeheilte Lungenläsionen früher Infektionen bei der Schlachtung oft nicht erkannt und damit registriert. BERNER (1995) sowie PFÜTZNER und BLAHA (1995) gehen davon aus, dass ein hoher Prozentanteil deutscher Betriebe mit M. hyopneumoniae infiziert ist. Dies konnte 1997 durch HORST et al. bestätigt werden. Sie zeigten, dass der Anteil seropositiver Bestände in den einzelnen Bundesländern bei 75-100 % liegt. In Belgien beträgt die mittlere Seroprävalenz auf Herdenbasis 88 % (MAES et al. 1999). In Skandinavien sind die Herden-Prävalenzen mit 39 % im Westen Finnlands (RAUTIAINEN 1998) und in Dänemark mit 30 % (SØRENSEN et al. 1992b) deutlich geringer. Die Infektion mit M. hyopneumoniae erfolgt als Tröpfcheninfektion entweder direkt durch das Nasensekret kranker Tiere oder über ein Aerosol in der Atemluft (WHITTLESTONE 1979, LEON et al. 2001). Der Nachweis einer in-utero Infektion fehlt (DONE 1996). Das Bakterium überlebt besonders gut im Regenwasser bei niedrigen Temperaturen, also in feucht-kalter Luft, so dass eine Tendenz für beginnende Ausbrüche im Herbst und Winter zu beobachten sind (GOODWIN 1985). Neben den klimatischen Bedingungen spielen für die Einschleppung von M. hyopneumoniae in einen Betrieb, bzw. für die generelle Verbreitung dieser multifaktoriellen Erkrankung, eine ganze Reihe von weiteren Faktoren eine große Rolle, wie die Luftübertragung über mehrere Kilometer, der Zukauf subklinisch infizierter Tiere und der Tiertransport, v. a. von Schlachtschweinen (GOODWIN 1985, STÄRK et al. 1992, 1998, MAES et al. 2000, HEGE et al. 2002). Unterschiedliche Managementsysteme, das Stallklima sowie eine hohe Schweinedichte im Bestand bzw. in der Region sind prädisponierend (STÄRK et al. 1992, BERNER 1995, DONE 1996, ROSS 1999). Ein besonderes Infektionsrisiko stellt dabei (STÄRK et al. 1992, DONE 1996) die Größe und die Entfernung des nächsten infizierten Nachbarbetriebes dar. Ein weiterer beeinflussender Faktor ist nach STÄRK et al. (1992) und DONE (1996) die Topographie. Hier bilden so genannte „Hanglagen“ der Betriebe und isolierte Standorte außerhalb einer Gemeinde einen gewissen Schutz vor einer Infektion mit M. hyopneumoniae. Nach BATISTA et al. (2002) kann die Übertragung von M. hyopneumoniae über exponierte Personen durch das Tragen von betriebseigener Schutzkleidung und Stiefeln sowie Duschen und Kleiderwechsel zwischen den Bestandsbesuchen verhindert werden. 12 BESKOW und Mitarbeiter (1998) untersuchten die Schnelligkeit der Ausbreitung einer Mykoplasmeninfektion. Sie kamen dabei zu dem Schluss, dass diese eher von dem Antikörperstatus der Ferkel bei der Einstallung abhängig zu sein scheint als z. B. vom Stallklima. Die Schwierigkeit der Bekämpfung der Enzootischen Pneumonie spiegelt v. a. die jährliche Reinfektionsrate wieder. Sie beträgt nach WHITTLESTONE (1990) 5–10 %. Im Jahre 2000 lag sie in der Schweiz bei immerhin 2,6 % (HEGE et al. 2002). Als Hauptursache dafür nennen die Schweizer Autoren den Zukauf von Tieren, aerogene Infektionen und chronisch unentdeckte Infektionen in der Herde. Nach SØRENSEN et al. (1994b) können die ersten Symptome einer Infektion in einer Herde klinische Symptome, positive serologische Befunde oder pneumonische Läsionen bei der Schlachtung sein. Sehr oft verkompliziert sich eine Mykoplasmenpneumonie durch bakterielle Sekundärinfektionen (MAES et al. 1996, SØRENSEN et al. 1997), so dass man in diesem Zusammenhang besser von der Mycoplasma Induced Respiratory Disease (MIRD) spricht (BÆKBO et al. 1994, PFÜTZNER und BLAHA 1995, ROLLE und MAYR 2002). Nach CLARK (1999) beschreibt der Name Porcine Respiratory Disease Complex (PRDC) die Erkrankung noch treffender, denn Viren, hauptsächlich das Influenza-Virus, das PRRS (Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome)-Virus und das PRC (Porcine Respiratory Corona)-Virus, initiieren den Lungenschaden. M. hyopneumoniae verstärkt die bakteriellen Sekundärinfektionen, und es entsteht eine sehr ernste respiratorische Erkrankung. So soll M. hyopneumoniae selbst nach Untersuchungen von THACKER et al. (1999) sowie OPRIESSNIG und HALBUR (2004) die Schwere und Dauer einer PRRS-induzierten bzw. einer PCV2 (Porcine Circo-Virus Type 2)-induzierten Viruspneumonie potenzieren. Neuere Untersuchungen von THANAWONGNUWECH und THACKER (2003) ergaben unter anderem einen signifikanten Anstieg des Cytokins Interleukin-12 (Il-12) in Schweinen mit beiden Infektionen. Dadurch könnte ihrer Meinung nach die Fähigkeit des Immunsystems beeinträchtigt werden, PRRS aus der Lunge zu eliminieren. Dies würde die verlängerte Präsens von PRRS und die Verstärkung der Pneumonie in dualinfizierten Schweinen erklären. Nach Untersuchungen von THACKER et al. (2001) wird dagegen eine InfluenzaVirusinfektion im Gegensatz zur PRRS-Virusinfektion nicht von M. hyopneumoniae potenziert. ROSS und Young (1993) konnten wiederum in ihren Untersuchungen zeigen, dass eine Anfälligkeit der Schweine für Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) durch eine M. hyopneumoniae-Infektion verstärkt wird. Dabei führen nicht nur offensichtliche Pneumonien, sondern auch subklinische Infektionen durch Reduktion der Wachstumsrate und der Futterverwertung, zu erheblichen wirtschaftlichen Einbußen (POINTON et al. 1985, STRAW et al. 1989, REGULA et al. 2000). In diesem Zusammenhang scheinen besonders Sekundärinfektionen und Umweltfehler eine besondere Rolle zu spielen (RAUTIAINEN et al. 2000b, ESCOBAR et al. 2002). CLARK et al. 1991 schätzen, dass die Enzootische Pneumonie der nordamerikanischen Schweineindustrie Kosten in Höhe von $ 200 Millionen bis zu $1 Milliarde jährlich verursachen. Nach ROSS (1999) ist der ökonomische Verlust assoziiert mit dieser Erkrankung das Resultat einer komplexen Interaktion zwischen den Mykoplasmen und anderen Infektionen, schlechtem Management und schlechten Umweltbedingungen. Nach CLARK et al. (1991) übertragen erkrankte oder infizierte Sauen M. hyopneumoniae auf wenigstens einige ihrer Ferkel. Die Sau ist allerdings nicht als Hauptübertragungsquelle anzusehen (SHELDRAKE et al. 1990, ROSS 1992, 1999). Als eine weitere Möglichkeit ist die Übertragung zwischen Wurfgeschwistern und zwischen den Würfen in der Aufzuchtphase anzusehen. Eine besonders wichtige 13 Stellung nimmt die Infektion der Mastläufer, vorwiegend durch ältere Mastschweine, ein (CLARK et al. 1991). Wie schon GROßE BEILAGE (1999) zeigen konnte, verdeutlichen auch die Untersuchungen von RAUTIAINEN et al. (2000b) die Bedeutung der erst im Verlauf der Mast erfolgenden Ausbreitung der M. hyopneumoniae-Infektion. In zwei Mastbeständen stieg die Seroprävalenz von anfänglich 6 auf 54 % bzw. von 31 auf 81 % respektive zum Ende der Mastperiode. Nach ROSS (1992, 1999) trägt die lange Inkubationsperiode, die langsame Ausbreitung der Organismen in den Würfen, die Zunahme der Tierdichte, die Ausbreitung anderer infektiöser Keime und Umweltfaktoren dazu bei, dass nach dem Absetzen die Prävalenz der M. hyopneumoniae-Erkrankung bei Läufer und Mastschweinen am höchsten ist. RAUTIAINEN et al. (2001) stellten fest, dass v.a. geschlossene Betriebe und Mastbetriebe mit kontinuierlicher Belegung ein konstantes Risiko für eine M. hyopneumoniae-Infektion auf andere Herden, durch Tiertransport, Verkauf von Mastläufern und enger Nachbarschaft der Betriebe, darstellen. 2.1.3 Pathogenese M. hyopneumoniae produziert eine chronische, lymphohistiozytäre Bronchopneumonie bei Schweinen (THACKER et al. 1999). Nach natürlicher Infektion reicht die Inkubationszeit von 10-16 Tagen bis zu 3-5 Monaten (BETTS 1952, GOODWIN 1984) und scheint damit abhängig von der Antigendosis zu sein (BARFOD 1994). Nach experimentell induzierter Infektion liegt die Inkubationszeit gewöhnlich bei 7-10 Tagen (WHITTLESTONE 1985). Die Tröpfcheninfektion führt zu einer bronchogenen Ausbreitung und zur Anheftung des Erregers an die Oberflächen des Flimmerepithels von Trachea, Bronchien und Bronchiolen (ROLLE und MAYR 1993, 2002). KWON und Mitarbeiter (2002) konnten im Rahmen eines Infektionsversuches durch in situ Hybridisation die DNA von M. hyopneumoniae eine Woche post inoculationem in bronchialen und bronchiolären Epithelzellen und eine weitere Woche später in alveolären und interstitiellen Makrophagen und Typ I Pneumozyten nachweisen. Starke Hybridisationssignale konnten hauptsächlich an der luminalen Oberfläche der Bronchialepithelzellen entdeckt werden. Wie jedoch schon GOODWIN (1972) vermutete, konnten UTRERA und Mitarbeiter (2002a) in einem in vitro Versuch in zwei verschiedenen genetischen Schweinezuchtlinien, die sich im übrigen als sehr resistent gegenüber der Kolonisierung von M. hyopneumoniae zeigten, Unterschiede in den Ausmaßen der von Mykoplasmen besetzten Tracheen zwischen Ferkelwürfen feststellen. Des Weiteren schien auch das Geschlecht der Tiere bei der Ausprägung eine Rolle zu spielen. Hier bedarf es weiterer Klärung. Elekronenmikroskopische Untersuchungen ergaben, dass die Mykoplasmen bis ca. einen Monat nach experimenteller Infektion am zahlreichsten vorliegen, und zwar hauptsächlich zwischen den Zilien des Bronchiolarepithels und nur selten in den Alveolen (BERTSCHINGER et al.1972, WHITTLESTONE 1972). Für die Adhärenz von M. hyopneumoniae an den Zilien scheinen nicht nur strahlenförmige Fibrillen auf der äußeren Membranoberfläche der Bakterien (TAJIMA und YAGIHASHI 1982, BLANCHARD et al. 1992) sowie spezielle Strukuren ZHANG und Mitarbeiter konnten dort 1995 ein Adhesin identifizieren - eine Rolle zu spielen, sondern auch spezifische Strukturen auf der Zilienoberfläche, die als Glykolipidrezeptoren für die Bakterien funktionieren (ZHANG et al. 1994). Nach ZIELINSKI und ROSS (1993) sind auch unspezifische hydrophobische Interaktionen am 14 Anheftungsprozess beteiligt. Diese zumindest enge Assoziation von M. hyopneumoniae an das zilientragende Epithel, unterstützt durch die den Mykoplasmen eigene Pleomorphie durch das Fehlen einer Zellwand (HOWARD und TAYLOR 1985), scheint die folgende Ziliostase mit Verlust der Zilien zu induzieren (MEBUS und UNDERDAHL 1977, BLANCHARD et al. 1992, DE BEY und ROSS 1994). Der exakte Zerstörungsvorgang ist noch nicht genau geklärt, u.a. soll auch ein zytopathischer Faktor, lokalisiert auf der Membran von M. hyopneumoniae (GEARY und WALCZAK 1985), beteiligt sein. HOWARD und TAYLOR (1985) vermuten hingegen, dass die Freisetzung von toxischen Produkten zur Zellzerstörung führt. Durch Desquamation der Epithelzellen, besonders der Alveolarepithelzellen mit folgendem Mangel des Surfactants (produziert von den Typ II Pneumozyten), kommt es zur Störung der mukoziliären Clearance. Ein weiterer wichtiger Faktor der pathogenen Kapazität von M. hyopneumoniae liegt nach ADEGBOYE (1978) in der Unterdrückung der zellulären Immunabwehr. CARUSO und ROSS konnten 1990 zeigen, dass eine Suppression des Phagozytosepotentials der Alveolarmakrophagen bei einer Sekundärinfektion auftritt. Hieraus resultiert eine Begünstigung der Anheftung von Sekundärerregern. In der Regel führt dies zu ausgeprägteren Erkrankungsformen (CIPRIÁN et al. 1988, AMASS et al. 1994, BERNER 1995, THACKER et al. 1999). M. hyopneumoniae hat nicht nur eine immunsuppressive Wirkung sondern auch eine immunstimulierende (MESSIER et al. 1990) und zwar kommt es durch die Infektion zu einer zunehmenden Anhäufung von Lymphozyten im perivaskulären und peribronchialen Raum. Weiterhin induziert M. hyopneumoniae nach neueren Untersuchungen von ESCOBAR und Mitarbeitern (2002) einen signifikanten Anstieg des inflammatorischen Zytokins Interleukin-1beta (Il-1 ß) und einen statistisch nicht ät des Wirtes trägt zu einem großen Teil an der Entstehung der pathologischen Läsionen bei. Über eine mögliche Variabilität der Virulenz von M. hyopneumoniae ist bislang noch recht wenig bekannt. So stellten ARTIUSHIN und MINION (1996) eine genetische Heterogenität in den von ihnen untersuchten Feldisolaten von M. hyopneumoniae fest, konnten aber eine gesicherte Korrelation dieser Heterogenität mit der Virulenz nicht überprüfen. VICCA und Mitarbeiter (2002a, b) untersuchten das Infektionsmuster von M. hyopneumoniae anhand von fünf klinisch infizierten Herden mit guten und fünf subklinisch infizierten Herden mit schlechten Haltungs- und Managementbedingungen. Da die Seroprävalenzen in den klinisch infizierten Herden höher waren, und sich die meisten Schweine dort in einem jüngeren Alter mit M. hyopneumoniae angesteckt hatten, folgerten sie, dass eine ziemlich hohe Variation der Virulenz zwischen den Feldisolaten vorliegt, wie schon ROSS (1996) vermutete. Virulenzmarker könnte ein 5000 bp Fragment, gewonnen mit der arbitrarily primedPCR (AP-PCR), sein. Weitere Untersuchungen müssen folgen (VICCA et al. 2002a). 2.1.4 Klinik Die Enzootische Pneumonie ist eine ansteckende respiratorische Erkrankung, charakterisiert durch einen chronischen Husten, Wachstumsverzögerung, einer hohen Morbidität von 30 bis 80 % aller Schweine und einer Mortalität, die gegen Null geht (SIMECKA et al. 1992, MAES et al. 1996, SIEVERDING 2000). Generell sind Schweine aller Altersklassen anfällig für eine Infektion mit M. hyopneumoniae, wobei sich die Schweine innerhalb einer Herde gewöhnlich in den aller ersten Lebens- 15 wochen infizieren (GOODWIN und WHITTLESTONE 1967, SIMECKA et al. 1992). PIFFER und ROSS (1984) untersuchten Ferkel im Alter von 3, 6 und 12 Wochen und konnten keinen Unterschied in der Anfälligkeit finden, während nach STRASSER et al. (1992) zwei Wochen alte Schweine nach experimenteller Infektion schwerer erkrankten als acht Wochen alte Tiere. Gewöhnlich breitet sich die Erkrankung unter den Tieren langsam aus. Ferkel unter sechs Wochen sind meistens noch nicht betroffen. Hauptsächlich erkranken Schweine im Alter von drei bis sechs Monaten, d. h. bei Läufern und Mastschweinen ist die Hustenintensität oft am größten (ROSS 1992, DONE 1996, ROSS 1999), wobei nach BAHNSON et al. (1996) ein spät einsetzender und lang andauernder Husten mit einer hohen Prävalenz der Lungenveränderungen zum Mastende korreliert. Die Dauer der aktiven Infektion wird von WALLGREN et al. 1994 auf ca. 12 Wochen geschätzt. Der Husten tritt erstmalig 6-21 Tage post infektionem (BERTSCHINGER et al.1972, WHITTLESTONE 1985, ABIVEN et al. 1990, BEREITER et al. 1990, KOBISCH et al. 1993, FEENSTRA et al. 1994, SØRENSEN et al. 1997) auf, erreicht ein Maximum zwischen 3. und 4. Woche (FEENSTRA et al. 1994, SØRENSEN et al. 1994b, 1997) und hört ca. zwei Monate post infektionem auf, bzw. ist danach nur noch sporadisch zu beobachten (BERTSCHINGER et al. 1972, SØRENSEN et al. 1997) in Abhängigkeit vom Immunstatus des Tieres und dem Herdenmanagement (MAES et al. 1996). Nach SØRENSEN et al. (1994b) besteht nicht nur eine Korrelation zwischen dem Auftreten von Husten und der Entwicklung einer Pneumonie, sondern die Pneumonie verhält sich auch, parallel zur Abnahme des Hustens, rückläufig. Eine M. hyopneumoniae-Infektion ist zwar selten unkompliziert, ist dann aber gewöhnlich subklinisch oder charakterisiert durch einen trockenen, unproduktiven Husten, der meistens bemerkt wird, wenn die Schweine plötzlich nach einer Ruheperiode aktiv werden, geringgradigem Fieber und Anorexie (MAES et al. 1996, RUNNELS 1988). Bei einer Mykoplasmenpneumonie begleitet von einer Sekundärinfektion, z. B. durch Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Arcanobacterium pyogenes, Streptococcus- und Staphylococcus-Spezies, aber auch Wanderlarven von Ascaris suum in der Lunge, ist gewöhnlich ein größerer Anteil der Lunge betroffen. Dies spiegelt sich meistens in einem mehr feuchten Husten, hohem Fieber, Anorexie, hochgradiger Atemnot bis hin zu Todesfällen, aber auch ungleiches Wachstum bzw. Wachstumsstillstand und ein rauhes Haarkleid wieder (RUNNELS 1988, MAES et al. 1996, SIEVERDING 2000). Nach PLONAIT (1988) werden Schwere und Verlauf dieser Erkrankung dann zu einem großen Teil vom Stallklima und Infektionsdruck bestimmt. 2.1.5 Immunität Auf eine M. hyopneumoniae-Infektion folgt eine adequate Immunantwort auf ein breites Spektrum virulenter Faktoren und zwar nicht nur systemisch, sondern auch lokal (ROSS und YOUNG 1993). Es kommt zum Aufbau einer Resistenz (KOBISCH und FRIIS 1996) in den Schweinen. Die Serokonversion tritt dabei ungefähr zur gleichen Zeit wie der Husten (LEON et al. 2001), bzw. nach SØRENSEN et al. (1994b) durchschnittlich neun Tage nach Hustenbeginn auf. In dem von BAHNSON al. (1994) entwickeltem Modell verläuft die Höhe des Antikörpertiters parallel zu den Lungenläsionen und zum Husten. Die ersten Serumantikörper können sich schon nach 8-46 Tagen post infektionem entwickeln, wobei 50 % der untersuchten spezifisch pathogenfreien (SPF)-Schweine 16 innerhalb der ersten drei Wochen serokonvertierten (KOBISCH et al. 1993, BARFOD et al. 1994, DONE 1996). Der Höhepunkt der Antikörperproduktion ist nach 10-12 Wochen (KOBISCH et al. 1993, DONE 1996) erreicht. Danach erfolgt eine graduelle Abnahme, und einzelne Immunglobuline können ein bis drei Jahre persistieren (BEREITER et al. 1990, KOBISCH et al. 1993, DONE 1996, RAUTIAINEN et al. 2000a). Bei einer natürlichen Infektion kann die Serokonversion (SØRENSEN et al. 1993), in Abhängigkeit vom Managementsystem, nach drei bis fünf Wochen auftreten. Nach Untersuchungen von WALLGREN und SCHWAN (1994) serokonvertierten vier Monate alte Schweine in einem geschlossenen Zuchtbetrieb innerhalb 50–70 Tagen nach Einstallung mit älteren infizierten Tieren. Im Serum können erstmalig zwei Wochen nach experimenteller Infektion Antikörper der Klasse IgG entdeckt werden (SUTER et al. 1985, STRASSER et al. 1992). Nach HOLMGREN (1974a) bestanden die Serumantikörper zwei bis vier Wochen post infektionem aus den Ig-Klassen G und hochmolekularem IgA. In den tracheobronchialen Sekreten zeigten die Immunglobuline der Klassen IgA, IgG, IgM zwei Wochen post infektionem nach SUTER et al. (1985) erhöhte Werte. Hier erreichten die Antikörper der IgM- und IgG-Klasse fünf Wochen nach Infektion ihre Maximalwerte und herrschten somit in der frühen Phase der Infektion vor, während die Antikörper der IgA-Klasse im Verlauf des achtwöchigen Experiments stetig zunahmen. Nach MESSIER et al. (1990) bestanden die Antikörper in Lungenspülungen von Schweinen zwei bis sechs Wochen post infektionem hauptsächlich aus IgG und IgA Isotypen. Das Kolostrum der Muttersauen besteht in den ersten 6 Stunden nach dem Abferkeln, neben IgM und IgA, hauptsächlich aus dem Immunglobulin G (KLOBASA 1987). Dieses Kolostrum verleiht den neugeborenen Ferkeln, zumindest bis zu einem Alter von zwei Wochen, einen kompletten passiven Schutz unabhängig vom Alter und dem Immunstatus der Sauen (RAUTIAINEN et al. 1998, WALLGREN et al. 1998). Die Persistenz der maternalen Antikörper bezieht sich letztlich auf die Höhe der Antikörper im Serum der Sauen, deren Höhe auch wiederum vom Alter der Sau abhängig zu sein scheint (MORRIS et al. 1994, ZIMMERMANN und WEISKOPF 1996) und variiert so zwischen Würfen (WALLGREN et al. 1998). Nach MORRIS et al. (1994) beträgt die mittlere Halbwertzeit der M. hyopneumoniae-Antikörper 15,8 (8,3-28,4) Tage in Abhängigkeit von der initialen Konzentration der passiv erworbenen Antikörper im Ferkel. In Bezug auf den Zeitpunkt einer prophylaktischen Impfung sind dabei an die suppressiven Effekte maternaler Antikörper zu denken (MORRIS et al. 1994, HODGINS et al. 2002). Im weiteren Verlauf verfügen Schweine besonders zu Beginn der Mastperiode nur über eine niedrige Antikörperkonzentration (LEON et al. 2001). Das ist, nach Untersuchungen dieser Autoren in drei geschlossenen Betrieben, die kritische Periode für eine Übertragung von M. hyopneumoniae. 2.1.6 Pathologie Ein bis zwei Wochen nach experimenteller Infektion von Schweinen mit M. hyopneumoniae können die ersten für eine Mykoplasmenpneumonie typischen makroskopischen Lungenveränderungen zu sehen sein (WHITTLESTONE 1972, 1985, BLANCHARD et al. 1992, KOBISCH et al. 1993). Im ersten Monat post infektionem zeigten bei SPF-Schweinen vorwiegend die ventralen Abschnitte der Spitzen- und Mittellappen verfestigte Bezirke, die farblich von rot bis dunkelrot, über blaßrot bis blaßgelb zu blaßgrau reichen (BERTSCHINGER et al.1972, 17 WHITTLESTONE 1972, 1985, FEENSTRA et al. 1994). Die meist scharf lobulär begrenzten Herde waren im Anschnitt saftreich und nicht erhaben. In einigen zeigte sich lufthaltiges eingesprengtes Gewebe. Nur aus den Bronchien makroskopisch veränderter Lungenlappen ließ sich trüber, weißlicher Schleim auspressen, der meist auch in der Trachea zu sehen war. Die Pleura zeigte nie eine Veränderung, und die Bronchiallymphknoten waren leichtgradig geschwollen (BERTSCHINGER et al. 1972). Die makroskopischen Lungenveränderungen können bei SPF-Schweinen nach BERTSCHINGER et al. (1972) schon innerhalb von zwei Monaten verschwinden. Länger vorhandene Veränderungen zeigten sich dann als wenig ausgedehnte band- oder sternförmige Einziehungen der Lungenoberfläche. Nach KOBISCH und NICOLET (1987) sowie KOBISCH et al. (1993) sind Reparationsvorgänge 7-10 Wochen post infektionem erkennbar. Eine vollständige Abheilung kann nach WHITTLESTONE (1972, 1985) neun Monate und länger dauern. Nach Abheilung sind bei makroskopisch negativem Lungenbefund aber histologisch meist immer noch deutliche Läsionen sichtbar (BERTSCHINGER et al. 1972). Sehr oft verkompliziert sich diese Lungenerkrankung durch bakterielle Sekundärinfektionen. Dies kann zu ausgedehnteren Läsionen bis hin zur Perikarditis, Pleuritis und Abszedierungen (CIPRIÁN et al. 1988, AMASS et al. 1994, SØRENSEN et al. 1997, SIEVERDING 2000) führen. Die histologische Untersuchung in der frühen Phase der Infektion zeigt das Bild einer Pneumonie, charakterisiert durch eine bronchioläre und lymphorretikuläre Hyperplasie mit einer zunehmenden perivaskulären Akkumulation mononuklearer Zellen (BLANCHARD et al. 1992). Die Bronchiolen und Alveolen enthalten anfangs polymorphkernige neutrophile Granulozyten. Es kommt zur Proliferation und Vergrößerung von Alveolarzellen mit Vakuolen im Zytoplasma. Nach WHITTLESTONE (1972, 1985) ist dies eine der auffälligsten Merkmale der Enzootischen Pneumonie. Im weiteren Verlauf akkumulieren Lymphozyten, Histiozyten und Plasmazellen erst im perivaskulären und dann im peribronchiolären Gewebe. In der etablierten Pneumonie entwickelt sich ein alveoläres Exsudat, und es kommt zur Proliferation von lymphoretikulärem Gewebe im perivaskulären und besonders im peribronchiolären Gewebe. Nach HODGES et al. (1969) ist das alveoläre Exsudat ein signifikantes Merkmal für die Dissemination von M. hyopneumoniae. DONE (1996) beschreibt dagegen das Vorliegen von Exsudat als variabel und seinen Untersuchungen zufolge ist es gewöhnlich in unkomplizierten, einfachen Mykoplasmeninfektionen nicht vorhanden. Die so um Bronchien und Bronchiolen zirkulär ausgebildeten Infiltratmäntel können die einzelnen Bronchiolen deutlich einengen und sich häufig auch auf die benachbarten Alveolarsepten fortsetzen. Diese Infiltratmäntel enthalten in der Regel die eigentlichen Lymphfollikel. Das zelluläre Exsudat enthält nun weniger polymorphkernige neutrophile Granulozyten, dafür aber mehr Plasmazellen. In den Reparationsvorgängen kommt es gewöhnlich an den Spitzen der apikalen und kardialen Lungenlappen zu flachen Fissuren, entstanden aus kollabierten Alveolen neben alveolären Emphysemen. Das alveoläre Exsudat verschwindet, und die Hyperplasie des Bronchialepithels bildet sich mit der Zeit zurück (BERTSCHINGER et al.1972, WHITTLESTONE 1972, 1985). Auch die Sekundärinfektionen führen zu veränderten histologischen Befunden, wie z. B. einer Betonung der exsudativen Komponente (CIPRIÁN et al. 1988). Nach HURNIK et al. (1993) hat die makroskopische Beurteilung der Lunge nach M. hyopneumoniae-verdächtigen Veränderungen, verglichen mit der histologischen Untersuchung als „Golden Standard“, nur eine Sensitivität von 76 % und eine Spezifität von 71 %. 18 2.1.7 Diagnose Klinische Symptome einer M. hoypneumoniae-Infektion erlauben nur eine Verdachtsdiagnose. Die Lungenläsionen sind zwar charakteristisch, aber nicht pathognomonisch (ROSS 1992, ARMSTRONG 1994, ROSS 1999). ZIMMERMANN et al. (1989) sowie ZIMMERMANN (1990) sind der Überzeugung, dass Mischmastversuche, Kontrollschlachtungen und die ELISA-Serologie für eine sichere Diagnose ausreichen und sogar latente Infektionen aufdecken können. Nach ARMSTRONG (1994) wird für die definitive Diagnose der Enzootischen Pneumonie ein positives Ergebnis in der Immunfluoreszenz oder ein kultureller Erregernachweis gefordert. ROSS (1996) empfiehlt für die Diagnose bei dem Ausbruch einer akuten Infektion im Rahmen der PRDC die ELISA-Serologie, und zwar die Anfertigung eines Serumprofils zur Dokumentation der Antikörper und des Antikörper-Titeranstiegs bei gleichzeitigem Anstieg der klinischen Symptome. Für die Bestätigung der Diagnose sollte die Histopathologie verbunden mit dem Immunfluoreszenztest angewendet werden. Folgende Laboruntersuchungen stehen für einen Antikörper- bzw. Erregernachweis zur Verfügung. 2.1.7.1 Nachweis spezifischer Antikörper Für den Nachweis von spezifischen Antikörpern sind verschiedene Testsysteme entwickelt worden, u. a. sind das der indirekte Hämagglutinationstest, die Komplementbindungsreaktion und der Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Vergleichsuntersuchungen der verschiedenen Techniken sind mehrfach unternommen worden. So zeigte sich der indirekte Hämagglutinationstest relativ unsensitiv bei der Untersuchung von kontaktinfizierten Schweinen und technisch umständlich und war damit ungeeignet als praktischer Feldtest (ARMSTRONG et al. 1983, FREEMAN et al. 1984b, FELD et al. 1992). Mit der Komplementbindungsreaktion können v. a. frühe Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachgewiesen werden (ARMSTRONG et al. 1983, BEREITER et al. 1990), aber für den Nachweis der späten Antikörperantwort war sie am unzuverlässigsten (ARMSTRONG et al. 1983, MORI et al. 1987). Für beide Testsysteme konnten FREEMAN et al. (1984a) Kreuzreaktionen zwischen M. hyopneumoniae, M. flocculare und M. hyorhinis feststellen. Letztlich stellte sich der ELISA als der sensitivste und als der am einfachsten handzuhabende diagnostische Test heraus (ARMSTRONG et al. 1983, PIFFER et al. 1984, KOBISCH und NICOLET 1987, FELD et al. 1992, KENNY 1992, SØRENSEN et al. 1992a, 1992b). Auch eine Untersuchung von Kolostrumproben ist mit dem ELISA möglich (NICOLET et al. 1990, SØRENSEN e t al. 1992a, 1992b, LEVONEN 1994). Von Vorteil ist dabei, dass im Kolostrum eine z. T. bis zu fünf mal höhere Antikörper-Konzentration vorliegt als im Serum. Daher ist die Kolostrum-Serologie für die Herdenkontrolle von Bedeutung (CHASTTONAY 1988, SØRENSEN et al. 1992a, YAGIHASHI et al. 1993, MORRIS et al. 1994, RAUTIAINEN et al. 2000a). Der ELISA hat viele Vorteile, aber er ist abhängig von der Fähigkeit des Schweins, die für ihn spezifischen Antikörper zu produzieren (SIMECKA et al. 1992). Weiterhin zeigten sich auch beim ELISA Kreuzreaktionen zwischen M. hyopneumoniae und den obengenannten Mykoplasmen sowie M. hyosynoviae (FREEMAN et al. 1984a). Je nach Testsystem und abhängig vom Versuchsaufbau sind Antikörper gegen M. 19 hyopneumoniae erstmals ab dem 8. Tag bis zu sieben Wochen und längstens bis zu ein bis drei Jahren nachweisbar (ARMSTRONG et al. 1983, BEREITER et al. 1990, BARFOD et al. 1994, LE POTIER et al. 1994, FUTO et al. 1995, WALLGREN et al. 1996, RAUTIAINEN et al. 2000a). Da jedoch nicht jedes mit M. hyopneumoniae subklinisch infizierte Schwein bzw. Trägertier einen mit diesem Testsystem detektierbaren Antikörper-Titer aufweist, ist der ELISA ungeeignet für die Einzeltierdiagnostik und damit für Eradikationsprogramme. Für die Herdendiagnostik und Herdenüberwachung hat er sich jedoch bewährt (RUNNELS 1988, WHITTLESTONE 1990, VAN AKEN und GEERTS 1992, ARMSTRONG 1994). Eine Verbesserung der Spezifität des von BRUGGMANN et al. (1977) entwickelten ELISAs, bei dem ein mit Natriumdodecylsulfat gelöster Extrakt von M. hyopneumoniae als Antigen verwendet wird, konnte erst durch Reinigung dieses Antigens mit Tween 20 erreicht werden (NICOLET et al. 1980, BOMMELI und NICOLET 1983). Nach NICOLET et al. (1990) ist dieser Tween 20-ELISA eine sehr sensitive Methode und erlaubt auch eine Diagnose der Infektion ohne Schwierigkeiten in chronisch infizierten Herden, allerdings nur auf Herdenbasis. SHELDRAKE und ROMALIS (1992) ermittelten für diesen ELISA auf Einzeltierbasis eine Sensitivität von 95,6 % und eine Spezifität von 98,8 % in Bezug auf die pathologischanatomische Beurteilung der Lunge als „Golden Standard“. Nach Angaben von ABIVEN et al. (1990) konnten sie zwar schwache Kreuzreaktionen zwischen M. hyopneumoniae und M. flocculare im Immunoblot belegen, diese hatten allerdings keine Auswirkungen in Bezug auf falsch-positive Ergebnisse des Tween 20-ELISAs. BEREITER et al. (1990) konnten dagegen in Seren mit einem hohen Antikörpertiter gegen M. flocculare schwache Kreuzreaktionen mit dem M. hyopneumoniae-Antigen im ELISA nachweisen. Beim indirekten ELISA, wie z. B. dem TiHo-ELISA (AMMAR et al. 1980, SCHERM et al. 2002) und dem kommerziell erhältlichem Chekit®Hyoptest I bzw. II nach Dr. Bommeli, werden Mikrotiterplatten verwendet, die mit dem Tween 20 gereinigtem Antigen von M. hyopneumoniae beschichtet sind. Beim Chekit®-Hyoptest ist das Antigen ein Membran-Lysat und für den TiHo-ELISA wird ein Ganzzell-Antigen verwendet. Nacheinander werden die zu untersuchenden Serumproben, der zweite mit Peroxidase markierte Antikörper, bei Chekit®-Hyoptest I und dem TiHo-ELISA ist das Konjugat polyklonal; bei Chekit®-Hyoptest II, einer Weiterentwicklung Ende der 90iger Jahre im letzten Jahrhundert, monoklonal und das Enzymsubstrat, mit den jeweiligen Waschschritten dazwischen, aufgetragen. Der Test ist mit Entstehung des gefärbten Produkts, der Enzymreaktion, beendet, und das Resultat kann mit Hilfe eines Photometers abgelesen werden. Die Intensität der Verfärbung ist dabei proportional zur Konzentration der Serum-antikörper. LEVONEN (1994) ermittelte für den Chekit®-Hyoptest I eine Spezifität von 91,5 % und eine Sensitivität von 66,7 % auf Herdenbasis in Bezug auf die klinische Untersuchung. Nach SCHELP1 zeigten interne Untersuchungen der Firma Intervet eine Spezifität des Chekit®-Hyoptest II mit Proben aus negativen Beständen von 97,2 %. In akut infizierten Beständen wurden etwa 93 % der Tiere positiv getestet. Bei chronisch infizierten Herden lag der Anteil positiver Tiere bei etwa 13 %. Daneben wurde in Dänemark ein Blocking-ELISA entwickelt, der mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern spezifische Proteine der cytoplasmatischen Membran von M. hyopneumoniae entdecken kann (FELD et al. 1992, DJORDJEVIC et al. 1994, LE POTIER et al. 1994, FUTO et al. 1995). LE POTIER et al. (1994) konnte mit dieser Methode und einem 40 kDa Membran-Protein, und FUTO et al. (1995) mit einem rekombinanten 46 kDa Oberflächenantigen, keine Kreuzreaktionen zwischen M. 1 Persönliche Mitteilung von Dr. Chr. Schelp vom 27.06.03 20 hyopneumoniae, M. flocculare und M. hyorhinis beobachten. Nach WALLGREN et al. (1996) ist durch den Gebrauch monoklonaler Antikörper das Risiko für Kreuzreaktionen mit anderen Mykoplasmenspezien reduziert worden. Dieser Test ist unter dem Namen DAKO Mycoplasma hyopneumoniae ELISA auf dem Markt. Hier sind die Mikrotiterplatten mit dem M. hyopneumoniae-Antigen, einem 74 kDa Protein, beschichtet. Der methodische Ablauf ist der gleiche wie oben beschrieben, außer, dass zwischen dem Auftragen der Serumproben und dem monoklonalen Konjugat der Waschschritt entfällt. Dieser 2. markierte Antikörper tritt nun in Konkurrenz zu den Antikörpern im Serum. Die gemessene Farbintensität ist hier nun umgekehrt proportional zur Konzentration der Antikörper im Serum. BARFOD und Mitarbeiter (1994) sowie SØRENSEN und Mitarbeiter (1997) berechneten mit Proben von SPFKontrolltieren für den DAKO-ELISA eine Spezifität von 93-100 %, und eine Sensitivität von 98-100 % mit den Proben von experimentell infizierten Schweinen. Auf Herdenbasis, anhand klinischer, pathologischer und kultureller Untersuchungen, konnten SØRENSEN und Mitarbeiter (1992a, b) eine Spezifität von 96 % und eine Sensitivität von 93 % ermitteln. RAUTIAINEN und Mitarbeiter (1996) errechneten auf der Grundlage von klinischen und pathologischen Untersuchungen für den DAKOELISA auf Herdenbasis eine Spezifität von 98,7 % und eine Sensitivität von annähernd 100 %. Bei dem direkten Vergleich des DAKO-ELISAs mit einem Tween 20-ELISA war der DAKO-ELISA nach THACKER et al. (2004) und FANO et al. (2004b) die sensitivere Methode. LEVONEN und Mitarbeiter (1999) verglichen die beiden kommerziellen Testsysteme Chekit®-Hyoptest und den DAKO-ELISA. Leider ist in ihren Ausführungen nicht ersichtlich, ob sie den Chekit®-Hyoptest I oder II untersucht haben. Nach Meinung dieser Autoren sind bei Anwendung beider Tests die Einteilung der Proben in richtig-positiv und falsch-positiv möglich, da sie sich ergänzen. In ihren Untersuchungen zeigte sich der DAKO-ELISA auf individuellem Niveau sensitiver, doch auf Herdenniveau war ihre geschätzte Sensitivität gleich und hoch genug für eine Eradikation der Erkrankung auf Herdenbasis. Dies entsprach somit den Angaben der beiden Hersteller, dass es sich um Herdentests handelt. Basierend auf klinischen, pathologischen und epidemiologischen Folgeuntersuchungen konnten sie anhand individueller Proben für den DAKO-ELISA eine Spezifität von 99,3 % und für den Chekit®-Hyoptest eine Spezifität von 98 % bestimmen. Die höhere Spezifität des DAKO-ELISAs erklären sie sich hauptsächlich durch den unterschiedlichen Aufbau des Testsystems und den Gebrauch von monoklonalen Antikörpern. Die falsch-positive Kategorie besteht ihrer Meinung nach aus kontaminierten Proben und so genannten „singleton reactors“, bei denen Antikörper der IgM Klasse untypisch reagieren. 2.1.7.2 Immunfluoreszenztest Mit der in den 60iger Jahren des letzten Jahrhunderts von DEL GIUDICE et al. (1967) entwickelten Fluoreszenz-Antikörper-Methode, war die schnelle Identifizierung von auf Agar wachsenden Kolonien von Mykoplasmen möglich. Die mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-konjugierten Antiköper wurden auf die Kolonien aufgebracht, um diese dann nach Inkubation und folgenden Waschschritten unter dem Fluoreszenzmikroskop zu untersuchen. Die Methode zeigte sich effektiv, da auch Mischkulturen auf den Primärplatten durch Verwendung homologer Antiseren erkannt werden konnten. SCHULLER und Mitarbeiter (1976) beschrieben eine weiter entwickelte Immunfluoreszenz-Technik zur Identifizierung von M. hyopneumoniae- 21 Kolonien. Hierbei wird das Kulturmedium in einer dünnen Schicht auf Objektträger aufgebracht, die dann mit der Flüssigkultur von M. hyopneumoniae beschickt und inkubiert werden. Der entscheidende Schritt besteht nun in der Lufttrocknung der Objektträger mit Hilfe eines Ventilators für 12-14 Stunden. Diese Prozedur fixiert die Kolonien so dauerhaft, dass sie bei der weiteren Behandlung mit dem Fluoresceinkonjugiertem Antiserum und den Waschschritten mit PBS nicht mehr abgespült werden können. Kreuzreaktionen mit M. hyorhinis und M. hyosynoviae traten in ihren Untersuchungen nicht auf. M. flocculare wurde nicht getestet. L’ECUYER und BOULANGER (1970) sowie MEYLING (1971) wendeten die direkte Nachweismethode für die Diagnose der Enzootischen Pneumonie unter anderem in Gewebeproben der Lunge an. In den Fällen mit deutlich positiven Befunden ist die Oberfläche des Epithels der Bronchien und Bronchiolen von einer intensiven, gelbgrünen fluoreszierenden Mykoplasmenschicht bedeckt. In den Untersuchungen von MEYLING (1971) zeigte sich M. hyorhinis in pneumonisch veränderten Lungen von Ferkeln in der gleichen Lokalisation, die auch für M. hyopneumoniae typisch ist. Die ansonsten vergleichbare Fluoreszenz war aber oft reichlicher, und manchmal wurden Herde von Organismen auch im Alveolargewebe gefunden. Kreuzreaktionen mit M. hyorhinis oder M. hyosynoviae konnten nicht beobachtet werden. Selbst selten auftretende Kreuzreaktionen mit M. flocculare sind im Gegensatz zu WHITTLESTONE (1990) nach FRIIS (1990) von geringer Bedeutung für die Spezifität des indirekten Immunfluoreszenztests (einer Modifikation) für M. hyopneumoniae. Nach RUNNELS (1988) ist der Immunfluoreszenztest an verändertem Gewebe die verlässlichste Untersuchungsmethode, und positive Ergebnisse sind daher spezifisch und diagnostisch signifikant. Dies konnte ARMSTRONG (1994) bestätigen. Aber ein negatives Ergebnis besagt nicht, dass eine M. hyopneumoniae-Infektion nicht vorliegt (ARMSTRONG et al. 1984, RUNNELS 1988, ARMSTRONG 1994). So konnten L’ECUYER und BOULANGER (1970) erst ab dem 25. Tag post infektionem M. hyopneumoniae mit dem Immunfluoreszenztest nachweisen. FEENSTRA et al. (1994) sowie SØRENSEN et al. (1997) konnten zeigen, dass in chronischen Krankheitsstadien diese Methode eine deutlich geringere Sensitivität besitzt als der kulturelle Nachweis von M. hyopneumoniae. So lag er nach SØRENSEN et al. (1997) am 57. Tag post infektionem bei 59-85 % und sank bis auf 11-38 % am 85. Tag nach experimenteller Infektion. Zwei Gründe für die Schwierigkeit der Diagnostik in den Frühstadien wären nach L’ECUYER und BOULANGER (1970): die Schwierigkeit repräsentative Lungenproben zu bekommen, wenn die Gebiete der Lungenveränderungen noch sehr klein sind, und ein Auswaschen des Antigens aus dem Epithel der Luftwege während des Immunfluoreszenztests. Dieser Wascheffekt dürfte noch bedeutender sein in den Frühstadien der Infektion, da der so genannte „Verschluss“ durch das bronchioläre Exsudat, welches oft die Luftwege in späteren Stadien ausfüllt, fehlt. Generell kann man aber sagen, dass die Sensitivität des Immunfluoreszenztests von der Anzahl der Organismen in dem untersuchten Probestück abhängt (L’ECUYER und BOULANGER 1970, MEYLING 1971, HOLMGREN 1974b, VAN WEES 1987, FEENSTRA et al. 1994). Nach WHITTLESTONE (1990) sind für ein definitives positives Ergebnis wahrscheinlich mehr als 104-105 Mykoplasmen/g Gewebe notwendig. Weiterhin ist auch die Zugänglichkeit dieser Organismen zu den markierten Antikörpern von Wichtigkeit. Lokale Antikörper, die die Mykoplasmen von den markierten Antikörpern abschirmen, könnten auch für die schwachen oder negativen Färbeergebnisse in chronischen Fällen einer M. hyopneumoniae-Infektion verantwortlich sein (L’ECUYER und BOULANGER 1970, MEYLING 1971, HOLMGREN 1974b, SCHULLER et al. 1977, FEENSTRA et al. 1994). Daher ist 22 diese Methode wenig geeignet, um Trägertiere oder subklinische Erkrankungen zu erkennen. Ist die Anzahl von Mykoplasmen aber hoch, wie es in akuten Krankheitsstadien der Fall ist, liegt seine Sensitivität bei 86-100 % und seine Spezifität bei 93-100 % verglichen mit dem kulturellen Nachweis (SØRENSEN et al. 1997). In solchen Fällen erweist sich diese schnelle und einfach zu handhabende Technik als brauchbare Diagnostikmethode (WHITTLESTONE 1990, SIMECKA et al. 1992, ROSS 1992, 1999). GIGER und Mitarbeiter (1977) sowie DOSTER und LIN (1988) verglichen den Immunfluoreszenztest mit dem Immunoperoxidase-Test. Anstelle von Fluoresceinisothiocyanat (FITC) werden hier Peroxidase-Enzym-Einheiten an die Antikörper gekoppelt. Die Untersuchung von GIGER et al. (1977) zeigte eine gute Korrelation zwischen Immunofluoreszenz und Peroxidasetest. Beide immunologischen Methoden hatten eine hohe Spezifität, d. h. bei positiven immunologischen Befunden war der Nachweis von M. hyopneumoniae gesichert. Nach DOSTER und LIN (1988) zeigte sich der Peroxidasetest sensitiver als der Immunfluoreszenztest, da die Meerrettich-Peroxidase eine Verstärkung der Chromogenwirkung bewirkte. Geringe Mengen der Erreger, wie bei chronisch infizierten Trägern oder bei abflauenden Infektionen, führten aber auch zu Problemen bei der Interpretation ähnlich wie bei der Immunfluoreszenz-Technik. Der Vorteil des Peroxidasetests liegt jedoch in dem Gebrauch eines gewöhnlichen Labormikroskops im Vergleich zum relativ teuren Fluoreszenzmikroskop. 2.1.7.3 Kultureller Nachweis des Erregers Die Isolierung von M. hyopneumoniae ist sehr schwierig und zeitaufwendig (MCKEAN et al. 1976, WHITTLESTONE 1990, ROSS 1992, 1999), da er sehr hohe Nährstoffansprüche stellt (ROLLE und MAYR 1993, 2002), und die Kulturansätze häufig mit bakterieller Kontamination überwachsen waren. Deshalb sollte nach SCHULLER (1986) eine Isolierung nur bei frischen, d.h. akut veränderten Gewebeteilen versucht werden. Die Isolierung und Differenzierung kann schon innerhalb von 7-10 Tagen erfolgen, es kann aber auch 20-30 Tage dauern. Der Schnitt liegt zwischen 10-21 Tage (WHITTLESTONE 1985, 1990). Eine negative Beurteilung sollte erst nach mehrwöchiger Inkubation getroffen werden (WHITTLESTONE 1985). Eine weitere Schwierigkeit in der Kultivierung besteht darin, dass M. hyopneumoniae häufig von M. hyorhinis, der sich schneller an das künstliche Medium adaptieren kann, überwuchert wird, wodurch dessen Isolierung noch schwieriger und zeitaufwendiger wird, und es so zu falsch-negativen Ergebnissen kommt (FRIIS 1975, SCHULLER et al. 1977, WHITTLESTONE 1985, ARMSTRONG 1994). Andere Mykoplasmen stören dagegen selten bei der Isolierung (WHITTLESTONE 1985). Um das schnellere Wachstum von M. hyorhinis zu unterdrücken, hat sich der Zusatz des Antibiotikums Cycloserin, sowie Antiserum gegen M. hyorhinis und fünf bis sieben wöchentliche Passagen, nach denen sich M. hyopneumoniae aber nicht M. hyorhinis weiterhin vermehrt, bewährt (ARMSTRONG 1994, GOI M. hyorhinis wächst M. hyopneumoniae etwas besser in nichtselektivem Medium (WHITTLESTONE 1979). Nach FRIIS (1975), WHITTLESTONE (1979) und ARMSTRONG (1994) sollte die Primärisolierung aus dem Gewebe in flüssigem Kulturmedium erfolgen, da wenig bis kein Wachstum aus der Inokulation direkt auf festem Medium erfolgt. Da M. hyopneumoniae ein Säurenbildner ist, wird sein Wachstum durch eine pHWertänderung angezeigt. Die Subkultivierung kann nach Farbumschlag des pH- 23 Indikators in beiden Medien erfolgen. Auf festem Medium erscheinen die ersten Kolonien nach zwei- bis dreitägiger Inkubation. Im Gegensatz zu den meisten anderen Mykoplasmen haben die Kolonien von M. hyopneumoniae keinen dunklen Zentralbereich (FRIIS 1975, WHITTLESTONE 1979). Misslungene Isolierungen können auch auf kleine Unterschiede zwischen den einzelnen Chargen des Kulturmediums zurückzuführen sein (WHITTLESTONE 1985). Für die Isolierung von M. hyopneumoniae haben sich besonders die Selektivmedien, die von FRIIS (1971, 1975) und von GOODWIN (1976) beschrieben wurden, bewährt. Eine weitere Verbesserung des Friis-Med -NAD erreicht werden (ETHERIDGE et al. 1979). Die Identifizierung der Art erfolgt serologisch anhand des Wachstumshemmtests, des Immunfluoreszenztests an auf Agar wachsenden Kolonien oder dem indirekten Immunfluoreszenztest an gewachsenen Kolonien auf einer Filtermembran (ARMSTRONG 1994). Nach ARMSTRONG et al. (1984) sowie HURNIK et al. (1993) ist die Isolierung von M. hyopneumoniae nicht nur teuer, sondern die Kulturtechniken sind zudem auch unzuverläßlich, da viele falsch-negative Ergebnisse auftreten. In den chronischen Stadien der Infektion sollte die kulturelle Untersuchung jedoch nach SØRENSEN et al. (1997) als Bestätigung negativer Ergebnisse des indirekten Immunfluoreszenztests, der PCR und des Antigen-ELISAs nach PEDERSEN et al. (1990) dienen. 2.1.7.4 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die von MULLIS und Mitarbeitern (1986) erarbeitete Methode ist in der Lage, die DNA lebender Organismen zu vervielfältigen. Ausgangsmaterial ist ein Gemisch an doppelsträngiger DNA, die die zu vermehrende und als Matrize dienende DNASequenz enthält. Der PCR-Prozess, das so genannte „Amplifizieren“, besteht aus mehreren Wiederholungen der drei folgenden Schritte. Zunächst wird die doppelsträngige DNA bei hoher Temperatur in ihre beiden Einzelstränge aufgetrennt. Danach lagern sich zwei Primer (Oligonukleotide), die komplementär zu den Randsequenzen des zu vermehrenden DNA-Abschnitts sind, an ihre Zielsequenzen und dienen der DNA-Polymerase als Startstellen für den letzten Schritt, d. h. für die Synthese der komplementären DNA-Stränge. Als Endergebnis ist die zunächst sehr kleine Menge an DNA exponentiell vermehrt und kann, nach Gelelektrophorese mittels Ethidiumbromidfärbung oder Hybridisierung mit DNA-Sonden, nachgewiesen werden (MULLIS et al. 1986, MATTSSON et al. 1995). Durch die Detektion von speziesspezifischen DNA-Sequenzen kann auf die Anwesenheit des gesuchten Organismus in der Probe geschlossen werden. Seit der Einführung dieser Technik sind eine ganze Reihe von PCRs entwickelt worden. Die Nachweisgrenze konnte immer mehr verbessert werden (siehe Tabelle 1). Die bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit und Nasentupfer haben als Untersuchungsmaterial an Bedeutung gewonnen (SØRENSEN et al. 1997, CALSAMIGLIA et al. 1999, KURTH et al. 2002, SIBILA et al. 2002), wobei der Nachweis in Nasentupfern selbst mit der nested-PCR (zwei speciesspezifische Primerpaare werden verwendet) bzw. der neuesten Entwicklung, der Real-Time-PCR, nicht immer gelingt (RUIZ und PIJOAN 2002, FANO et al. 2004c, ZEEH et al. 2004). Mit der Weiterentwicklung der nested-PCR ist man jetzt in der Lage, die kleinste Menge an Organismen aufzuspüren, die anwesend sein könnte (VERDIN et al. 2000, KURTH et al. 2002). Heute ist es daher möglich, nicht nur Infektionen im Frühstadium, sondern auch subklinische Erkrankungen und damit Trägertiere eindeutig zu erkennen (VERDIN et al. 2000, KURTH et al. 2002). Die Vorteile der PCR liegen nicht nur in der Schnelligkeit, 24 sondern vor allem in der hohen Sensitivität und der hohen Spezifität, da die beiden Werte bis 100 % erreichen (BAUMEISTER 1996, THOMSON et al. 1996, SØRENSEN et al. 1997, BAUMEISTER et al. 1998, KURTH et al. 2002). So ist die nested-PCR in Kombination mit einer Luft-Filtration (STÄRK et al. 1998) für den Nachweis von Aerosol-Übertragungen geeignet. Ein weiterer Vorteil der PCR liegt darin, dass auch unkultivierbare Stämme von M. hyopneumoniae bzw. tote oder beschädigte Organismen, die dann in der Kultur natürlich nicht wachsen, erkannt werden (BAUMEISTER et al. 1998, CALSAMIGLIA 1999). Nachteilig kann dies allerdings für die nested-PCR sein, denn aufgrund ihrer hohen Sensitivität ist es möglich, dass sie in einer kontaminierten Umgebung falsch-positive Ergebnisse liefert (KURTH et al. 2002). Vorsichtsmaßnahmen sind daher ein wichtiger Bestandteil für die Durchführung dieser Methode. Nach CALSAMIGLIA et al. (2001) ist die nested-PCR eine gut geeignete Untersuchungsmethode, wenn histopathologisch nicht ganz eindeutige Befunde erhoben werden können. Den Untersuchungen von VERDIN et al. (2000) zufolge ist die nested-PCR verglichen mit dem Blocking-ELISA und dem Immunfluoreszenztest signifikant sensitiver. An die für die Routinediagnostik besser geeignete Real-Time-PCR und an der multiplex Real-Time-PCR, die eine schnelle und gleichzeitige Entdeckung von mehreren PRDC-assoziierten Keimen ermöglicht, wird gearbeitet (HARDER und HUEBERT 2004, KUHNERT et al. 2004, SIBILA et al. 2004). 25 Tab. 1: In der Literatur beschriebene PCRs zum Nachweis von M. hyopneumoniae Autor Art der Größe des Herkunft des Nachweisgrenze Anwendung PCR amplifizierten amplifizierten Produktes Fragments STEMKE et al. single- 238 bp (1994) stage Sequenz aus 3 ng DNA dem 16S-r- = ca. 1000 RNA-Gen Organismen DNA von einem Laborstamm und 4 Feldisolaten von M. hyo. THOMSON et al. (1996) Sequenz aus 500 cfu dem 16S-rRNA-Gen Lungenproben von natürlich infizierten Schweinen single- 230 bp stage BAUMEISTER single- 853 bp (1998) stage Unbekannte Sequenz CALSAMIGLIA nested- 649 bp + 352 Sequenzen et al. (1999) PCR bp aus dem 16S-r-RNAGen VERDIN et al. (2000) nested- nicht Unbekannte PCR genanntes Sequenz bp-Produkt + 706 bp 10² cfu/ml BALF Bronchoalveoläre Lavageflüssigkeit von experimentell infizierten SPFSchweinen 80 Organismen Nasentupfer von natürlich und experimentell infizierten Schweinen Ca. 1fg Tracheo= ca. 1 bronchialOrganismus lavage und Nasentupfer von natürlich infizierten Schweinen 2.1.8 Bekämpfung Nach den Untersuchungen von CLARK et al. (1991) ist ein Rein-RausManagementsystem, verbunden mit einer routinemäßigen Reinigung und Desinfektion und stabilen Umweltbedingungen, bei Schweinen einer enzootisch mit M. hyopneumoniae infizierten Herde geeignet, die Entwicklung von Pneumonien zu 26 verhindern und die Gewichtszunahme der Schweine zu erhöhen. Dies belegt die große Bedeutung optimaler Umwelt- und Managementbedingungen. Daneben erfolgt die Bekämpfung der Enzootischen Pneumonie über Sanierungsverfahren zur Eliminierung des Erregers, prophylaktische Impfungen und Gabe von Chemotherapeutika. 2.1.8.1 Sanierungsverfahren Schon WALDMANN und RADTKE erkannten 1937 die Vorteile der räumlichen Isolierung von Sauen und deren Nachkommen und konnten erste Erfolge in der Bekämpfung der Enzootischen Pneumonie mit Hilfe der so genannten „Riemser Einzelhüttenanlage“ vorweisen. Das Grundprinzip aller Sanierungsverfahren ist seitdem die frühe Isolierung der Ferkel von der Sau und anderen Schweinen, um Übertragungswege für Krankheitserreger zu unterbrechen. Die extremste Form stellt dabei das spezifisch pathogenfrei (SPF)-Verfahren dar, bei dem Ferkel per Sectio Cesarea gewonnen, kolostrumfrei und isoliert aufgezogen werden. Das Ziel ist eine Schweineproduktion im Zucht- und Mastbereich ohne die Gegenwart von vorher festgelegten schweinespezifischen Krankheitserregern, wozu auch M. hyopneumoniae gehört. Das SPF-Verfahren wird heute noch in Dänemark und der Schweiz durchgeführt (BLAHA 1992, ROSS 1992, EICH und SCHMIDT 2000). Das Medicated early weaning (MEW)-Verfahren wurde von ALEXANDER et al. (1980) in den U.S.A. entwickelt und dort angewandt, und ist nach PLOMGAARD et al. (1992) als effektive und günstige alternative Methode zum SPF-Verfahren zu sehen. Das Ziel ist der Aufbau von Minimal-Disease-Herden, die das SPF-Verfahren zum Zwecke der Sanierung von Nukleus- oder Vermehrungsherden ersetzt (BLAHA 1992, EICH und SCHMIDT 2000). Die Unterbrechung der vertikalen Erregerübertragung von der Sau auf die Ferkel basiert auf der Verabreichung eines Medizinalfutters an die Sauen ab dem Eintritt in einen isolierten Abferkelstall bis zum frühen Absetzen der Ferkel mit 5 Tagen, die dann jeweils in einer isolierten Abteilung aufgezogen bzw. gemästet werden. Auch die Ferkel werden antibiotisch vom Tag der Geburt bis zum 10. Lebenstag behandelt. Mit dieser Behandlung blieben die Schweine bis zur Schlachtung mykoplasmenfrei. Ein ähnliches Sanierungsprogramm beschreibt MÉSZÁROS et al. (1985). Aber hier werden die mit 6 Tagen früh abgesetzten, stärkeren Ferkel dann auf eine isolierte und desinfizierte Farm verbracht und dort aufgezogen und die 2. und 3. Generation gezüchtet. Auch hier war keines der 2000 untersuchten Schweine in der drei Jahre dauernden Versuchsperiode mit M. hyopneumoniae infiziert. In den Seren der drei Tage alten Saugferkel der 2. und 3. Generation ließen sich keine maternalen Antikörper gegen diesen Erreger nachweisen. HOFMO und LIUM (1998) erreichten mit dieser Methode in Norwegen die Schaffung einer M. hyopneumoniae- und Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp)-freien Herde mit Elterntieren, die mit beiden Erregern infiziert waren. Zusätzlich impften sie vorher alle Tiere gegen A. pp. mit Pleurinord® und verbrachten die Schweine in einen isolierten Stall vier Wochen vor dem erwarteten Wurftermin. Die Verabreichung eines Medizinalfutters erfolgte fünf Tage vor bis fünf Tage nach dem Transport und fünf Tage vor dem erwarteten Wurftermin bis zum Absetzen der Ferkel mit fünf Tagen. Die Ferkel wurden dann in einen mehrere km entfernten Stall verbracht und vom Tag der Geburt an bis zum 5. Tag nach dem Absetzen antibiotisch behandelt. Diese Ferkel bildeten nun die Grundlage der neuen Herde. Die zwei Jahre dauernde Versuchsperiode wurde mit 27 Hilfe serologischer Untersuchungen überwacht, und es wurden weder Antikörper gegen M. hyopneumoniae noch gegen A. pp. gefunden. ZIMMERMANN et al. (1989, 1990) führten in der Schweiz eine erfolgreiche Teilsanierung in 17 infizierten Herden durch. Ihr Sanierungsprogramm beinhaltete die Entfernung aller Tiere, die jünger als zehn Monate waren, sowie die Verabreichung eines Medizinalfutters in einer ferkelfreien Periode von 10-14 Tagen. Ihrer Meinung nach kann die Teilsanierung als vollwertige Alternative zur Totalsanierung, d. h. dem Verkauf des ganzen Bestandes und Aufbau einer neuen Herde aus z. B. SPF-Tieren, betrachtet werden. Im August 1995 begann dann in der Schweiz das landesweite Tilgungsprogramm gegen die Enzootische Pneumonie auf der Basis der Teilsanierung und gegen Actinobacillus pleuropneumoniae Serotyp 2 (A. pp.2) auf der Basis der Totalsanierung. Seit Oktober 2003 sind alle Betriebe, die unter der Aufsicht des Schweizer Schweinegesundheitsdienstes stehen, EP und A. pp. frei (SCHEER und ZEHNDER 2004). Die Anwendung dieses Verfahrens mit kleinen Modifikationen führte auch in anderen Ländern, wie z. B. Australien, zum gewünschten Erfolg (BARÁ 2002). ANDERSEN und GRAM (2004) erreichten in einer Sauenherde in Dänemark, die positiv auf A. pp. 2, M. hyopneumoniae und PRRS getestet wurde, durch eine Teilsanierung und dem mit 14 Tagen frühen Absetzen der in dieser Zeit geborenen Ferkel die Eliminierung von A .pp. 2, M. hyopneumoniae und PRRS. Die Teilsanierung beinhaltete die Entfernung aller Jungtiere zwischen 14 Tagen und 6 Monaten, eine Medikation der Sauen über 24 Tage und eine antibiotische Behandlung der in diesem Zeitraum geborenen Ferkel. Die nach der Medikationsperiode geborenen Ferkel wurden nicht mehr behandelt und mit 21 Tagen abgesetzt. Eine Gruppe von SPF-Jungsauen wurde 4 Monate nach der Sanierung in die Herde eingestallt und serologisch weitere 11 Monate überwacht. Keines der Tiere serokonvertierte. SØRENSEN und BARFOD (1992) konnten einen weiteren Beweis dafür erbringen, dass die Infektionskette für M. hyopneumoniae hauptsächlich durch Jungtiere aufrechterhalten wird. Sie verbrachten tragende Jungsauen, älter als 10 Monate, aus einer mit M. hyopneumoniae infizierten ursprünglichen SPF-Herde an einen isolierten Ort. Die Sauen, und auch die später geborenen Ferkel, erhielten kein Medizinalfutter. Am Ende des Experiments konnte anhand der Untersuchungen der Ferkel gezeigt werden, dass auch ohne Medikation eine Eradikation serologischer Reagenten gegen M. hyopneumoniae erfolgreich war. BÆKBO et al. (1994) bewiesen, dass sogar in großen Beständen mit mehreren hundert Sauen ein Tilgungsprogramm mit Medikation der über 10 Monate alten Zuchttiere über 2-3 Wochen, während eines jungtierfreien Intervalls von 14 Tagen, erfolgreich ist. Im Vergleich zur Erneuerung des Betriebs mit SPF-Tieren ist dieses Verfahren kostengünstiger, da Produktionsverluste reduziert werden, und das genetische Potential der Zuchtsauen erhalten bleibt. Es ist damit relevant für Nukleus-ZuchtHerden und Aufzucht-Mastbetriebe mit schweren Verlusten durch den MIRDKomplex. Das Risiko der Reinfektion sollte jedoch vorher abgewogen werden (BÆKBO et al. 1994). In diesem Zusammenhang sollten auch die neuesten Untersuchungen von FANO et al. (2004a) betrachtet werden. Sie zeigten, dass natürlich und experimentell infizierte drei Monate alte Jungsauen noch 185 Tage post infektionem zu ca. 80-100 % nested-PCR M. hyopneumoniae-positiv waren. In dieser Studie wurde zwar eine Erregerübertragung nicht überprüft, doch selbst ein „cutoffAlter“ einiger Eradikationsprogramme von zehn Monate könnte hiernach ungenügend sein und dadurch zu der hohen Reinfektionsrate beitragen. Als eine Weiterführung des MEW-Verfahrens kann das Isoweansm –Verfahren nach HARRIS (1990) angesehen werden. Die mit 8-24 Tagen früh abgesetzten Ferkel und die Mastschweine werden zusätzlich an weit auseinanderliegenden Orten gehalten, 28 um eine Infektion zwischen verschiedenen Altersklassen zu verhindern (BLAHA 1992). Dies führte in den U.S.A. zur Entwicklung des SEW-Verfahrens nach DRITZ et al. (1996). Hier verhindert schon das so genannte „segregated early weaning“die vertikale Übertragung von M. hyopneumoniae. Die Ferkel werden im Alter von sieben bis zehn Tagen, also mit dem kompletten passiven Schutz über das Kolostrum (RAUTIAINEN et al. 1998), abgesetzt und an isolierter Lokalisation ohne Medikation aufgezogen. Dieses Verfahren zeigt damit, dass die Verabreichung von Antibiotika nicht der wichtigste Faktor in der Kontrolle dieser Erkrankung spielt. Nach CLARK (1999) sind die Bedingungen eines erfolgreichen Gelingens aber an die strikte Befolgung der Regeln des SEW-Verfahrens und an ein Absetzalter unter 14-17 Tagen gebunden. Nach LINDBERG et al. (2004) gewinnt dieses Verfahren in Schweden immer mehr an Bedeutung. 2.1.8.2 Impfung Da die Infektion mit M. hyopneumoniae zu einer humoralen und zellulären Immunantwort und damit zum Aufbau einer Resistenz (HOWARD und TAYLOR 1985, KOBISCH et al. 1993, KOBISCH und FRIIS 1996) führt, lag der Gedanke nicht fern, dies zur Kontrolle der Enzootischen Pneumonie in Form von Impfungen auszunutzen. Nach OKADA et al. (2000) sowie THACKER et al. (2000) induziert die Impfung gegen M. hyopneumoniae eine lokale humorale und zelluläre Immunantwort in der Mukosa des Respirationstrakts der Schweine. Außerdem trägt die Impfung zu und es kommt zur Unterdrückung der Antwort der Entzündungszellen in der Lunge auf eine M. hyopneumoniae-Infektion. Es entstehen weniger Lungenläsionen. Bei einer Auswertung der Ergebnisse untersuchter Impf- und Kontrollgruppen zeigen sich neben dem signifikant verbesserten Lungenläsionen-score, weiterhin Verbesserungen der Wachstumsrate, der Futterverwertung sowie eine signifikante Reduktion der Medikamentenkosten für die geimpften Gruppen im Vergleich zu Kontrollgruppen (SCHEIDT et al. 1994, SCHATZMANN et al. 1996, REYNAUD et al. 1998, MAES et al. 1999b, OKADA et al. 1999, BOUWKAMP et al. 2000, THACKER et al. 2000, KYRIAKIS et al. 2001). Auch positive Beeinflussungen auf Viruserkrankungen werden berichtet (HORST et al. 1998, OPRIESSNIG und HALBUR 2004). Bei dem Vergleich einer geimpften Herde mit einem hohen gesundheitlichen Status ohne klinische Zeichen einer respiratorischen Infektion und einer geimpften Herde mit niedrigem Gesundheitsstatus und ernsten epidemiologischen und ökonomischen Problemen kommen OKADA et al. (1999) zu dem Schluss, dass eine Impfung nur dann von Vorteil ist, wenn die Herde signifikante klinische Symptome und ökonomische Verluste aufweist. Nach CLARK (1999) ist eine Impfung nur dann kosteneffektiv, wenn die Schweine länger als 180 Tage brauchen, um ihr Schlachtgewicht zu erreichen. Eine Impfung verhindert jedoch nicht eine Kolonisation von M. hyopneumoniae im Respirationstrakt befallener Tiere und schützt nicht vor einer weiteren Verbreitung der Erkrankung, denn durch eine Vakzination wird eine Erregerausscheidung weder verhindert noch vermindert (SCHATZMANN et al. 1996, CALSAMIGLIA und PIJOAN 1998, THACKER et al. 1998a, THACKER et al. 1998b). Neueste Untersuchungen (THACKER et al. 2002, 2004) ergaben allerdings, dass möglicherweise einige „OneShot-Produkte“ dazu beitragen könnten, die Anzahl der Organismen in den infizierten Schweinen zu reduzieren. Im Gegensatz zum „Two-Shot-Produkt“, mit dem nach der 29 Grundimmunisierung eine Boosterimpfung nach 2-3 Wochen vorgenommen wird, wird mit dem so genannten „One-Shot–Produkt“ nur einmal geimpft. Die Impfung tragender Sauen führt zu einer Schutzwirkung für die Saugferkel durch die kolostralen Antikörper (KOBISCH et al. 1987), wobei nach dem Impfen der Antikörper-Titer der Sauen zum Zeitpunkt des Ferkelwerfens signifikant ansteigt. Die Übertragung hoher Konzentrationen maternaler Antikörper zeigte sich dann bei den Saugferkeln, die einen signifikant höheren Antikörper-Spiegel im Vergleich zu den Ferkeln nicht geimpfter Sauen bis zu einem überprüften Alter von drei Wochen aufwiesen (KRISTENSEN et al. 2002). Ging man bislang davon aus, dass maternale Antikörper den Impferfolg bei Ferkeln beeinträchtigen können (MORRIS et al. 1994, BERNER 1995, HODGINS et al. 2002), konnten THACKER et al. (2002, 2004) in Untersuchungen über zwei „One-Shot-Produkte“ zeigen, dass weder maternale Antikörper noch das Impfalter der Ferkel Auswirkungen auf die Effizienz dieser Vakzine haben. Einfluss auf den Impferfolg von Ferkeln in einem infizierten Bestand haben dagegen nach BERNER (1995) v. a. der Infektionsdruck und der Krankheitsgrad im Bestand aber auch die anzutreffenden Sekundärerreger, Stallklima und Management. CLARK (1999) schlägt in Verbindung mit dem SEWSystem die Sauenimpfung vor. Die Ferkelimpfung sollte dann erst ab einem Alter von sechs Wochen erfolgen, da die Tiere ungefähr in diesem Alter seronegativ werden. Im geschlossenen System sollten die Ferkel, in Abhängigkeit von kolostralen Antikörpern, ab einem Alter von drei bis vier Wochen geimpft werden. Zur Zeit sind in Deutschland verschiedene inaktivierte Vakzinen gegen M. hyopneumoniae erhältlich, so u. a. Suvaxyn®M.hyo (Fort Dodge Veterinär GmbH, Würselen), Hyoresp® (Merial, Hallbergmoos), Stellamune®Mycoplasma bzw. Stellamune®oneshot (Pfizer, Karlsruhe) und Ingelvac®M.hyo (Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Ingelheim). Die Impfungen werden entweder vor dem Absetzen (häufig schon in der 1. Lebenswoche), nach dem Absetzen oder zu Beginn der Mastperiode durchgeführt. Neben den „Two-Shot-Produkten“, geht die neueste Entwicklung in der Impfstofftechnik in Richtung „One-Shot-Produkte“, wie z. B. Ingelvac®M.hyo, welches durch das Depot-Adjuvans Impran® über eine verlängerte Freisetzung des Antigens verfügt. Tabelle 2 gibt eine Übersicht über verschiedene Impfprogramme der oben genannten Impfstoffe. Die von den einzelnen Autoren empfohlenen Impfstrategien sind dabei aber immer im Zusammenhang mit den jeweiligen Versuchsbedingungen bzw. dem Zeitpunkt der Infektion in der untersuchten Herde zu sehen. So zeigten einige empfohlene Impfstrategien noch Verbesserungen im Wachstum oder der Lungenqualität (VRAAANDERSEN et al. 1994, LILLIE et al. 2004). MARTINON und Mitarbeiter (1998) sowie KYRIAKIS und Mitarbeiter (2001) bevorzugen die frühe Impfung beim frühen Auftreten von Infektionen in der Herde, oder um das Risiko für die Ferkel zu minimieren. Auch hier empfiehlt MARCO et al. (2004) das „One-Shot-Produkt“ Ingelvac®M.hyo, verabreicht in der 3. Lebenswoche. Eine Impfung zu Beginn der Mast bzw. nach dem Absetzen in Kombination mit der Sauenimpfung sollten dann vorgenommen werden, wenn Anzeichen einer Infektion sehr spät auftreten (KYRIAKIS et al. 2001, GROßE BEILAGE und SCHREIBER 2002). Nach PABST et al. (2004) ist auch hier die alleinige Impfung der Ferkel im Alter von vier Wochen mit dem „One-Shot-Produkt“ Ingelvac®M.hyo effizient. 30 Tab. 2: Vergleich der untersuchten Impfprogramme einiger Impfstoffe Autor Impfstoff Untersuchte Impfstrategien VRAA-ANDERSEN Suvaxyn®M.hyo 1. + 3. LW et al. 1994 (Two-Shot-Produkt) beim Absetzen + 2 Wo später MARTINON et al. Hyoresp® 1.-2. + 4.- 5. LW 1998 (One-Shot- bzw. 6.-8. + 9.-11. LW Two-Shot-Produkt) 10.-11. LW REYNAUD et al. 1998 KYRIAKIS et al. 2001 GROßE BEILAGE und SCREIBER 2002 DAWSON et al. 2002 LILLIE et al. 2004 DIAZ et al. 2002 ROOF und KOLB 2004 Stellamune® oneshot Stellamune® oneshot Stellamune® Mycoplasma (Two-Shot-Produkt) Ingelvac®M.hyo (One-Shot-Produkt) Empfohlene Impfstrategien Beim Absetzen +2 Wo später Ab 3. LT + 3 Wo später und 10.LW Kein Unterschied 1. + 4. 6.-8. +11. 11. 1. + 4. 10. 1. + 4. 4. + 8. LW LW LW LW LW LW LW 3.-5. LW 1. 4. LW LW 1. + 4. LW 5. LW 5. LW 3. LW 3. LW 1.+ 4. LW Sauenimpfung + 4. + 8. LW 3.-5. LW 1.LW, Ergebnisse geringfügig besser; die beiden anderen Impfstrategien sind gleichwertig gut Nach DÍAZ et al. (2004a,b) zeigte sich eine Ferkelimpfung mit Ingelvac®M.hyo im Alter von sechs Wochen in Kombination mit der Sauenimpfung einer Impfung mit Stellamune®Mycoplasma in der 1.+3. Lebenswoche, allerdings ohne Sauenimpfung, überlegener. Kein Unterschied bestand dagegen zwischen dem „Two-Shot-Produkt“ und dem „One-Shot“ in der 4. Lebenswoche. Für die Ferkel bedeutet eine einmalige Verabreichung jedoch weniger Stress. An Neuentwicklungen wie intradermaler Impfungen (JONES et al. 2002), eine oral zu verabreichende Vakzine mit mikroeingekapselten M. hyopneumoniae-Erregern (LIN et al. 2002) und der Entwicklung von verschiedenen avirulenten Lebendvakzinen (UTRERA et al. 2002b, MENDOZA und PIJOAN 2004, OISHI et al. 2004) wird gearbeitet. 31 2.1.8.3 Therapie Nach STIPKOVITS et al. (2001) werden die besten Resultate in der Behandlung mit M. hyopneumoniae experimentell infizierter Schweine mit den Chemotherapeutika Econor® (Tiamulinderivat) in Kombination mit Chlortetracyclin, gefolgt von Tetramutin® (Tiamulin und Chlortetracyclin), Pulmotil® (Tilmicosin), Cyfac® (Sulfadimidin und Chlortetracyclin), sowie der Kombination von Lincomycin und Chlortetracyclin, erzielt. BOUSQUET et al. (1998) zeigte, dass die durchschnittliche Dosis von 11 mg Doxycyclin/kg Körpergewicht pro Tag im Futter über 8 Tage in der Kontrolle einer Pneumonie ausgelöst durch M. hyopneumoniae und P. multocida bei Mastschweinen effektiv war. Nach den neuesten Untersuchungen von STIPKOVITS et al. (2004) reagiert M. hyopneumoniae am sensibelsten auf Valnemulin und Tiamulin. Ein synergistischer Effekt wird noch durch Kombination dieser Antibiotika jeweils mit Doxycyclin erreicht. Durch die Behandlung erkrankter Tiere mit Chemotherapeutika wird die Infektion jedoch nicht vollständig beseitigt (HOWARD und TAYLOR 1985). Der therapeutische Einsatz reduziert nicht nur die Schwere der Erkrankung, sondern verbessert die Futterverwertung und die Wachstumsrate (HOWARD und TAYLOR 1985, BOUSQUET et al. 1998, WALTER et al. 1999). Antibiotika finden aber auch in der Prophylaxe ihren Einsatz. So u. a. als Fütterungsarzneimittel in einigen Eradikationsprogrammen. So verwendete BÆKBO et al. (1994) Tiamulin und Chlortetracyclin, MADSEN und LARSEN (1996) benutzten Enrofloxacin (Baytril®), und ZMMERMANN und WEISKOPF (1996) verwendeten Lincomycin (LINCOMIX/ALBIOTIC Premix). Das Ziel dieser prophylaktischen Maßnahmen ist die Verminderung des Infektionsdruckes und Verbesserung der Wiederstandsfähigkeit eines Betriebes gegen eine M. hypneumoniae-Infektion. Erschwerend für die Bekämpfung sind allerdings die neuesten Untersuchungen über erste Resistenzen gegen einige Chemotherapeutika. So fanden VICCA et al. (2004) erste erworbene Resistenzen einiger Feldisolate von M. hyopneumoniae gegen Makrolide (Tylosin und Tilmicosin), dem Lincosamid Lincomycin und dem Fluochinolon Enrofloxacin. LATELL und NEIKE (1998) stellten eine verbesserte Gewichtszunahme und Futterverwertung bei Kombination der Impfungen am 7. und 28. Tag (Suvaxyn®M.hyo) mit der Futtermedikation (Lincocin Premix) über 21 Tage, angefangen am Tag des Absetzens, verglichen mit der nur Impfung oder der nur Futtermedikation fest. Auch STIPKOVITS et al. (2003) konnten eine Reduzierung ökonomischer Verluste durch die späte Impfung der Tiere am 69. bzw. 69. und 80. Tag in Kombination mit einer Fütterungsprophylaxe erreichen. Die positiven Effekte einer präventiven Fütterungsmedikation über mehrere Wochen scheinen nach MATEUSEN et al. (2001, 2002) mit der zweimaligen Impfung von Stellamune®Mycoplasma in der 1. und 4. Lebenswoche vergleichbar zu sein. Nur die durchschnittliche Anzahl der zusätzlichen kurativen Medikamententage pro Schwein war in der Gruppe mit der Futtermedikation signifikant höher. Im Gegensatz zu MATEUSEN et al. (2002), die durch Kombination der Futtermedikation mit der Impfung keinen weiteren Vorteil erkennen konnten, zeigten THACKER und Mitarbeiter (2002a), dass die Verabreichung einer Fütterungsarznei über drei Wochen um den Zeitpunkt einer experimentellen Infektion mit M. hyopneumoniae und PRRSV bei den gegen M. hyopneumoniae geimpften Ferkeln zu einer sogar noch größeren Reduzierung der respiratorischen Symptome und einer signifikanten Verminderung der Potenzierung einer PRRS-Viruspneumonie durch M. hyopneumoniae führte. 32 3 Material und Methoden 3.1 Chemikalien und Reagenzien ABTS (2,2`-Azino-di-[3-äthyl-benzthiazolinsulfonat (6)], Boehringer, Ingelheim Aceton, CG Chemikalien GmbH & CO. KG, Laatzen di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4), Merck, Darmstadt di-Natriumhydrogenphosphat-Dodecahydrat (Na2HPO4 x12H2O), Merck, Darmstadt Einbettmedium, Microm, Walldorf FITC Fluoresceinisothiocyanat, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Glycerin, 99 % (C3H8O3), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Kaliumchlorid (KCl), Merck, Darmstadt Kaliumdihxdrogenphosphat (KH2PO4 ), Merck, Darmstadt Methanol, reinst, Merck, Darmstadt Natriumcarbonat (Na2C03), Merck, Darmstadt Natriumchlorid (NaCl), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Natriumhydrogencarbonat (NaHC03), Merck, Darmstadt Natronlauge (NaOH), 1 M, Merck, Darmstadt Salzsäure (HCl), 1 M, Merck, Darmstadt Schweineserum von Gnotobioten (Klinik für kleine Klauentiere, Hannover) Tween 20 (Polyoxyethylensorbitammonolaurat), Merck, Darmstadt Tris Tris(Hydroxymethyl)-aminomethan, Serva, Heidelberg Wasserstoffperoxid (H2O2), Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin, Dianova, Hamburg Zitronensäure, Serva, Heidelberg 3.2 Geräte und Hilfsmittel Analysenwaage, Sartorius über Landgraf, Hannover Eppendorf-Reaktionsgefäße, Eppendorf, Hamburg Fotometer, Revelation MRX mit eingebautem PC, Dynex Technologies MRX pH-Meter, CG707, Schott über Landgraf, Hannover Magnetrührer, neolab 500 series Microelisa Auto Reader, MR 580, Dynatech, Denkersdorf Mikrotom-Kryostat, HM500OM, Microm, Walldorf Photomikroskop III für Durchlicht mit Fluoreszenz-Auflichtkondensor III RS, Carl Zeiss, Oberkochen Plattenwaschgerät, Dynatech MRW, Denkersdorf Polysorb®-Mikrotiterplatte, Nunc, Wiesbaden Rotationsschüttler, Janke u. Kunkel GmbH & Co. KG, Staufen Software: Dynex Revelation G 3.2 (1997), Microsoft Windows Ultraschall Wasserbad, Bandelin, Sonorex Super AK 103 H Zentrifuge, Omnifuge2, Heraeus, Kendro Laboratory Products GmbH, Langenselbold 33 3.3 Lösungen Coatingpuffer pH 9,6 NaHC03 Na2C03 bis pH 9,6 erreicht ist in Aqua tridest 8,4 g ca. 4,9 g 1.000,0 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)) 10-fach NaCl KH2PO4 KH2PO4 x 12 H2O KCl Aqua dest. ad 80,0 g 2,0 g 29,0 g 2,0 g 1.000,0 ml PBS + Tween 20 PBS 10-fach Aqua dest. Tween 20, 0,05 % PBS mit 1 % Schweineserum PBS Schweineserum von Gnotobioten Tris HCl Puffer (0,025 M) Tris HCl, 0,1 M Aqua dest. ad Einstellung des pH-Wertes auf 8,0 mit NaOH Glycerin-Tris HCl Puffer (1:2) Tris-HCl Puffer (0,025 M) Glycerin 99 % Zitronenpuffer Lösung 1 Na2HPO4 in Aqua dest. Lösung 2 Zitronensäure Aqua dest. ad Lösung 1 vorlegen und mit Lösung 2 auf den pH-Wert 4,25 einstellen Chromogenlösung 400 mg ABTS ad 1.000,0 ml Zitratpuffer alliquotieren à 10 ml und einfrieren 100,0 ml 900,0 ml 0,5 ml 9,9 ml 0,1 ml 3.037,0 g 134,0 ml 1.000,0 ml 5,0 ml 5,0 m l 17,8 g 1.000,0 ml 21,0 g 1.000,0 ml 34 3.4 Antigen für den TiHo-ELISA Die Präparation des M. hyopneumoniae-Ganzzell-Antigens erfolgte im Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Es wurde dort routinemäßig in der Diagnostik eingesetzt. 2,5 µg Antigen pro ml Coatingpuffer wurden dabei verwendet. 3.5 Hyperimmunseren für den Immunfluoreszenztest Die Kaninchenhyperimmunseren gegen M. hyopneumoniae bzw. M. bovirhinis sowie M. hyorhinis wurden im Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover hergestellt. Sie wurden in der Verdünnung 1:300 in PBS mit Zusatz von 1 % Schweineserum verwendet. Die Konjugierung des Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulins mit dem Fluorochrom FITC wurde ebenfalls im Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover vorgenommen und gleichfalls in PBS mit 1 % Schweineserum 1:50 verdünnt. 3.6 Probenmaterial und -auswahl Die Blutproben für den Vergleich der serologischen Testsysteme und für die epidemiologische Untersuchung wurden im Rahmen eines Projektes der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover in Bakum von August bis Dezember 1996 auf zwei Schlachthöfen gewonnen (GANTER et al. 1997). Die insgesamt 6960 Blutproben stammten aus 136 Betrieben zweier Erzeugergemeinschaften ansässig im Landkreis Osnabrück. Zu 107 Betrieben wurden außerdem Angaben zur Betriebsgröße und -struktur sowie zu Art und Herkunft der Ferkel aufgenommen. Die Anzahl der Blutproben je Bestand lag unabhängig von der Größe der Schlachtpartie und dem Geschlecht der Schweine zwischen 15 und 100, in der Regel jedoch bei 50 Proben. Nach der Lagerung von maximal einem Tag auf den Schlachthöfen wurden die Blutproben in der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zentrifugiert (3000 g für 8 min bei 14 ºC), und das überstehende Serum in entsprechend den Blutproben nummerierten 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäße dekantiert und bei -20 ºC eingelagert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden nun von den Proben aus insgesamt 106 Betrieben nach dem Zufallsprinzip jeweils durchschnittlich 13 Stichproben pro Betrieb ausgewählt und serologisch untersucht. Statistisch gesehen liegt, bei 13 Stichproben aus einer Bestandsgröße von z. B. 500 Tieren, die Wahrscheinlichkeit, eine falschnegative Aussage zu machen, bei höchstens 5 % (MÜLLER et al. 1988). Von den Schweinen aus 11 Betrieben lagen außerdem auf dem Schlachthof erhobene Lungenbefunde vor, die nach einem einheitlichen Bewertungsschlüssel nach BLAHA (1993) folgendermaßen kategorisiert wurden: 1. Pneumonische Veränderungen der Lunge: Pn 0: keine makroskopischen Veränderungen der Lunge Pn 1: geringgradige (bis 10 %) „ „ „ Pn 2: mittelgradige (bis 30 %) „ „ „ Pn 3: hochgradige (über 30 %) „ „ „ 35 2. Verwachsungsgrad der Pleura: Pl 0: keine makroskopisch sichtbaren Verwachsungen der Pleura Pl 1: geringgradige (bis 5-DM-Stück-große) Verwachsungen der Pleura Pl 2: mittelgradige (bis handflächengroße) „ „ „ Pl 3: hochgradige (über handflächengroße) „ „ „ Die Höfe mit den bekannten Betriebsdaten liegen in Ortschaften (siehe Tabelle 1), in denen die Struktur der Schweineproduktion durch die allgemeine Viehzählung vom 03. Dezember 1996 (Niedersächsisches Landesamt für Statistik und Landwirtschaftskammer Westfalen-Lippe) bekannt ist. Tab. 3: Anzahl der Mastschweine und Schweine insgesamt in folgenden Ortschaften Landkreis Osnabrück Ankum Badbergen Bad Essen Bad Iburg Bad Rothenfelde Belm Bersenbrück Bissendorf Bohmte/Hunteburg Bramsche Dissen Eggermühlen Fladderlohhausen/ Bad Laer Fürstenau Gehrde Georgsmarienhütte Glandorf Hagen Hilter Melle Menslage Merzen Neuenkirchen Nortrup Ostercappeln/Venne Rieste Landkreis Steinfurt Mettingen Landkreis Vechta Damme Mastschweine Schweineinsgesamt Halter 17.872 8.166 9.689 5.435 1.519 2.916 16.009 5.201 9.230 14.140 2.787 4.404 37.029 21.689 31.904 14.395 6.741 9.936 27.304 17.658 25.328 28.212 4.549 13.021 99 70 156 59 27 43 65 89 105 115 30 48 7.249 17.171 111 8.704 2.399 6.733 18.551 857 10.290 45.128 3.333 17.918 12.903 2.790 6.813 7.100 27.862 7.070 13.791 48.048 5.731 24.453 12.2415 11.024 56.771 31.301 6.422 18.974 14.312 116 31 72 151 54 92 540 68 134 144 23 103 43 5.446 7.791 83 104.154 17.1821 240 36 Abbildung 1 verdeutlicht noch einmal die Schweinedichte in Bezug auf die Gemeindefläche im Landkreis Osnabrück (BROECKER und SCHERBRINK 2000). Abb. 1: Schweinedichte – bezogen auf die Gemeindefläche – im Landkreis Osnabrück 37 Die Proben für den zweiten Block der Untersuchungen stammten von 153 Schweinen, die in dem Zeitraum von September 1997 bis Juli 1998 zur Sektion nach Bakum, in die Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover, geschickt wurden. Die Blutproben wurden, wie oben beschrieben, behandelt. Die Organproben aus den Lungenspitzenlappen für den Immunfluoreszenztest wurden sofort nach der Sektion bei –20 °C eingefroren. Ebenso sind die Lungenproben für den kulturellen Nachweis sofort in Friis-Medium überführt und an das Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Untersuchung weitergeleitet worden. 3.7 Vergleich der serologischen Testsysteme Für den Nachweis von Antikörpern im Blutserum standen vier ELISA Testsysteme zur Verfügung. 3.7.1 Enzyme Linked Immunosorbent Assay der Mikrobiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo-ELISA) Die zu untersuchenden Seren sowie die Kontrollen, das Konjugat, das Substrat und das Antigen wurden vor der Durchführung aufgetaut. Bei dieser Methode wurde das Antigen des Mycoplasmenstammes M. hoypneumoniae J an die Trägeroberfläche einer Polysorb®–Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Wells) gebunden. Bei diesem als „coating” bezeichneten Vorgang wurde das Antigen zunächst 1:1500 mit Coatingpuffer verdünnt und jeweils 100 µl dieser Verdünnung in jedes Well pipettiert. Die Platten wurden anschließend mit Folie abgedeckt und bei RT über Nacht auf einem Rotationsschüttler inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Platten dreimal in einem Plattenwaschgerät mit PBSTween 20 als Waschpuffer gewaschen. Die Seren sowie die Positiv- und NegativKontrollen wurden 1:10 mit dem Waschpuffer vorverdünnt. Jeweils 200 µl dieser Seren wurden in die Wells 1-10 der Reihe A, 200 µl der Positiv-Kontrolle wurden in das Well A11 und 200 µl der Negativ-Kontrolle in das Well A12 pipettiert. In die Wells der Reihen B bis H wurden jeweils 100 µl Waschpuffer vorgelegt. Anschließend wurden die Seren und die Kontrollen durch Überführen von jeweils 100 µl aus Reihe A in Reihe B und gründliches Mischen verdünnt. Die Verdünnungen wurden in gleicher Weise bis Reihe H fortgeführt. Aus den Wells der Reihe H wurden zum Schluss jeweils 100 µl verworfen. So entstand eine 1:2-er Verdünnungsreihe für die Seren und Kontrollen von 1:10 in Reihe A bis zu 1:1280 in Reihe H. Die abgedeckten Platten wurden 30 Minuten inkubiert und anschließend dreimal mit dem PBS-Tween 20 gewaschen. Im nächsten Arbeitsschritt wurden 100 µl des Peroxidase-anti-Schwein-Konjugates in einer Gebrauchsverdünnung von 1:3000 mit PBS in jedes Well eingefüllt. Nach 30 minütiger Inkubation wurden die Platten, wie oben beschrieben, gewaschen. Als Chromogen wurde ABTS (2,2`-Azino-di-[3-äthylbenzthiazolinsulfonat (6)], gelöst in Zitronenpuffer, eingesetzt. Unmittelbar vor der Verwendung wurden zu je 10 ml der 0,04 %igen Chromogen-Lösung 20 µl H2O2 1 %ig (v/v) zugegeben. 100 µl dieser Substratlösung wurden im letzten Schritt in jedes Well pipettiert. Bei der letzten Inkubation wurden die Platten nicht abgedeckt. Nach 30 Minuten wurde die Enzym-Substrat-Reaktion schließlich mit 50 %-igem Methanol (jeweils 100 µl pro Well) gestoppt und die Absorptionen bei 405 nm gegen 492 nm in einem Fotometer gemessen. 38 Für die Auswertung wurde die Extinktion der Negativkontrolle in dem Well A12 mit dem Faktor 2 multipliziert. Die Verdünnungsstufe, bei welcher der Extinktionswert der Probe oberhalb dieses errechneten Grenzpunktes liegt, beschrieb somit die Höhe des Titers. Die Inkubationen erfolgten bei RT auf einem Rotationsschüttler, die Waschschritte wurden mittels eines Plattenwaschgerätes durchgeführt. Tab. 4: Bewertung des Titers des TiHo-ELISAs Kriterium Titer < 1:10 Titer 1:10 Titer > 1:20 Aussage negative Probe, d. h. es sind keine Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachweisbar zweifelhafter Bereich positive Probe, d. h. es sind Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachweisbar 3.7.2 DAKO Mycoplasma hyopneumoniae ELISA (DAKO-ELISA) Mit dem (käuflichen) kommerziell erhältlichen Enzymimmuntest-Kit von DAKO A/S, Glostrup, Dänemark, wird das Verdünnungsmedium, der Substratpuffer (enthält Wasserstoffperoxid), die Stopp-Lösung (Schwefelsäure-Lösung) und das Konjugat gebrauchsfertig geliefert. Bei dem Konjugat handelt es sich um Peroxidasekonjugierte monoklonale Mäuse-Antikörper, die gegen ein spezifisches Epitop eines 74 kDa Proteins gerichtet sind. Das Chromogen, ein 1,2-Phenylenediamin, in Tablettenform muss kurz vorher mit Substratpuffer im Dunkeln aufgelöst werden. Die mitgelieferten Platten, bestehend aus 16 Vertiefungen, angeordnet in zwei Reihen (siehe Abbildung 2), sind gebrauchsfertig mit M. hyopneumoniae-Antigen beschichtet. Auch bei diesem System müssen die beiden mitgelieferten Kontrollen (positiv und negativ) und die Serumproben zuvor 1:10 mit dem Verdünnungsmedium verdünnt werden. Es wurden von allen Proben und Kontrollen Doppelansätze sowie vom Verdünnungsmedium ein Vierfachansatz (jeweils 100 µl) gemacht und in die Wells nach folgendem Muster eingebracht. P N V V 1 2 3 4 P N V V 1 2 3 4 5 6 7 5 6 7 Abb. 2: 2 Mikrotiterplatten mit jeweils 16 Wells und ein Beispiel der Probenverteilung P = Positivkontrolle N = Negativkontrolle V = Verdünnungsmedium 1, 2, 3, 4, 5, 6, usw. = Probennummer 39 Die mit Folie abgedeckten Platten wurden für 1,5 Stunden ohne Schütteln bei RT (20-25 °C) inkubiert. Im nächsten Arbeitsschritt wurden jeweils 100 µl Konjugat zusätzlich in alle Wells gegeben und 15 Minuten ohne Schütteln inkubiert. Anschließend wurden die Platten viermal mit Aqua dest. gewaschen und schließlich 100 µl Chromogen in jedes Well pipettiert. Die Inkubation erfolgte im Dunkeln für 10 Minuten bei RT (20-25 °C). Im letzten Arbeitsschritte wurden jeweils 100 µl der Stopp-Lösung in jedes Well überführt und die Absorption bei 490 nm (Referenzfilter zwischen 600 und 650 nm) innerhalb einer Stunde nach Zufügen der Stopp-Lösung gemessen. Die optischen Dichten (OD) wurde folgendermaßen ermittelt: Berechnung der Absorptions-Mittelwerte für die zwei Positivkontrollen (= ODPositivkontrolle), die zwei Negativkontrollen (= OD-Negativkontrolle), die vier Pufferkontrollen (= OD-Pufferkontrolle) und den einzelnen Proben (= OD-Probe). Qualitätskontrolle: - OD-Pufferkontrolle muss > 0.75 und < 2.500 sein (der erwartete Wert liegt bei ca. 1.000 - 1.400) - OD-Positivkontrolle muss < 50 % der OD-Pufferkontrolle sein (der erwartete Wert liegt bei ca. 20 – 40 %) - OD-Negativkontrolle muss > 75% der OD-Pufferkontrolle sein (der erwartete Wert liegt bei ca. 90 - 110%) Tab. 5: Interpretation der Ergebnisse des DAKO-ELISAs Kriterium Aussage OD-Probe > 50 % der negative Probe, d.h. es sind keine Antikörper gegen M. hyopneumoniae OD-Pufferkontrolle nachweisbar OD-Probe < 50 % der positive Probe, d.h. es sind Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachweisbar OD-Pufferkontrolle Liegt die OD-Probe zwischen 50 und 65 %, sollte, entsprechend der Empfehlung des Herstellers, das Tier nach zwei Wochen noch einmal getestet werden. 3.7.3 Chekit®-Hyoptest I nach Dr. Bommeli (Bommeli I-ELISA) Dieser Enzymimmuntest (Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern, Schweiz, jetzt: Intervet International bv, Niederlande) liefert Testplatten, deren 96 Wells gebrauchsfertig mit dem inaktivierten Erregerantigen M. hyopneumoniae beschichtet sind. Außer dem Chromogen wird die Stopplösung gebrauchsfertig mitgeliefert. Nach Herstellung der Wasch- und Verdünnerlösung aus dem 10-fach-Konzentrat wurden das Positiv- und Negativ-Kontrollserum sowie die einzelnen Proben 1:100 sowie das Protein A-Konjugat (polyklonal), markiert mit Meerrettichperoxydase, 1:200 verdünnt. Von den Proben wurden Doppelansätze, von den Kontrollen Vierfach-ansätze gemacht (siehe Abbildung 3), wobei jeweils 200 µl der verdünnten Proben und Kontrollen in die Wells der Testplatte übertragen wurden. Die Testplatten wurden mit Folie abgedeckt und 90 Minuten bei RT in einer feuchten Kammer ohne Schütteln inkubiert. Der nächste Arbeitsschritt beinhaltete das dreimalige Waschen der Platten mit der Wasch- und Verdünnerlösung (mindestens 300 µl pro Well). 40 A B C D E F G H 1 N P 1 2 3 4 5 6 2 N P 1 2 3 4 5 6 3 N P 7 8 4 N P 7 8 5 6 7 8 9 10 11 12 Abb. 3: Format der Testplatte und ein Beispiel der Probenverteilung N = Negativkontrolle P = Positivkontrolle 1,2,3, usw. = Probennummer Nach dem Waschen werden die Platten sorgfältig ausgeklopft, bevor in jedes Well 200 µl des verdünnten Konjugats pipettiert wird. Die Testplatten wurden wiederum abgedeckt und 90 Minuten bei RT in einer feuchten Kammer inkubiert. Der folgende Waschschritt wurde, wie bereits oben beschrieben, durchgeführt. Anschließend erfolgte die Verteilung des auf 25 °C vorgewärmten Chromogens (jeweils 200 µl) mit Inkubation bei RT oder optimal bei 25 °C. Die Differenz der Extinktionen zwischen negativer und positiver Kontrolle, gemessen im Fotometer bei einer Wellenlänge von 405 nm (Referenzwellenlänge = 492 nm), sollte nach 15 bis 30 Minuten größer oder gleich 0,7 sein. Dann wurde die Farbreaktion mit 50 µl/Well der auf RT erwärmten Stopplösung gestoppt. Bewertung der Ergebnisse: Nach Berechnung der Mittelwerte der optischen Dichte (OD) der beiden Kontrollen sowie der Proben, wurden die ODs der positiven Kontrolle und der Proben durch Subtraktion der OD der negativen Kontrolle korrigiert. Die Proben wurden dann auf die positive Kontrolle (=100%) bezogen. OD-Probe – OD-neg. Probenwert (%)= ---------------------------- x 100 % OD-pos. – OD-neg. Tab. 6: Interpretation der Ergebnisse des Bommeli I-ELISAs Kriterium Probenwert < 50 % Probenwert 50 – 70 % Probenwert > 70 % Aussage negative Probe, d. h. es sind keine Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachweisbar grenzwertiger Bereich positive Probe, d. h. es sind Antikörper gegen M. hyopneumoniae nachweisbar Nach Angaben des Herstellers sollte eine grenzwertige Probe ein zweites Mal getestet werden. Bleibt sie auch dann grenzwertig, so sollte von dem gleichen Tier eine zweite Probe untersucht werden. Ergibt diese Probe abermals ein grenzwertiges 41 Resultat, sollte das Ergebnis mit einer anderen Labormethode überprüft und das epidemiologische Umfeld mit in die Diagnose einbezogen werden. Dies konnte hier im Zweifelsfalle nicht vorgenommen werden, da es sich um Blutproben schon geschlachteter Mastschweine handelte. 3.7.4 Chekit®-Hyoptest II nach Dr. Bommeli (Bommeli II-ELISA) Die wichtigste Weiterentwicklung dieses Enzymimmuntests (Dr. Bommeli AG, Liebefeld-Bern, Schweiz, jetzt: Intervet International bv, Niederlande) war hier die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein Immunglobulin vom Schwein, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist. Auch dieses Konjugat wurde in einer Verdünnung von 1:200 verwendet. Weitere Änderungen waren das direkte Verdünnen der Kontrollen und der Proben in die Wells in einer Endverdünnung von 1:10 sowie der Gebrauch des halben Volumens der verdünnten Kontrollseren, der Proben und des Konjugats für die weiteren Testschritte. Abgesehen von diesen Änderungen verlief die Durchführung dieses Tests genauso wie die des Bommeli IELISAs. Bei der Ablesung der Ergebnisse soll dann die Differenz der Extinktionen zwischen negativer und positiver Kontrolle größer gleich 0,3 sein (siehe oben). Die Bewertung der Ergebnisse erfolgte analog zum Bommeli I-ELISA. Tab. 7: Interpretation der Ergebnisse des Bommeli II-ELISAs Kriterium Aussage negative Probe, d. h. es sind keine Antikörper gegen M. Probenwert < 20 % hyopneumoniae nachweisbar Probenwert 20 – 30 % grenzwertiger Bereich positive Probe, d. h. es sind Antikörper gegen M. Probenwert > 30 % hyopneumoniae nachweisbar 3.8 Vergleich der unterschiedlichen Methoden zum Nachweis von M. hyopneumoniae-Infektionen 3.8.1 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur Durch die Untersuchungen sollten drei verschiedene Methoden zum direkten oder indirektem Nachweis von M. hyopneumoniae miteinander verglichen werden. Das Probenmaterial für diese Untersuchungen stammte von der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover (siehe Kapitel 3.6). Zum Nachweis der Antikörper aus dem Blutserum diente der Bommeli II-ELISA (siehe Kapitel 3.7.4). Die Ergebnisse der kulturellen Untersuchungen der entsprechenden Lungenproben lagen aus dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule vor (siehe Kapitel 3.6). 42 3.8.1.1 Nachweis von M. hyopneumoniae in Lungen mit dem indirekten Immunfluoreszenztest Von jeder gefrorenen Lungenprobe wurden zwei Lokalisationen untersucht. Hierzu wurde jeweils ein ca. 1 cm großes Lungenstück auf dem Schneidetisch des Kryotoms mit Hilfe des dazugehörenden Einbettmediums befestigt und 3-4 µm dicke Gefrierschnitte angefertigt. Insgesamt entstanden so 5 Gefrierschnitte pro Lungenprobe, wobei der 5. Schnitt von der zweiten Lokalisation stammte und als Kontrolle diente. Nach dem Trocknen bei RT wurden die Gefrierschnitte 10 Minuten in 20 °C warmem Aceton fixiert. Es wurden jeweils 1-2 Tropfen (ca.20-40 µl) 1:300 in PBS, mit Zusatz von 1 % Schweineserum, verdünntes Kaninchenhyperimmunserum gegen M. hyopneumoniae auf den 1. und den 5. Gefrierschnitt, gegen M. bovirhinis auf den 2. Gefrierschnitt und gegen M. hyorhinis auf den 3. Gefrierschnitt aufgetragen. Der 4. Gefrierschnitt blieb unbehandelt und diente als Konjugatkontrolle. Die Gefrierschnitte wurden 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei RT inkubiert, die Hyperimmunseren mit Leitungswasser abgespült und die Objektträger in einer Schale mit PBS-Tween (0,05 %) 10 Minuten auf einem Rotationsschüttler gewaschen. Dieser Schritt wurde ein zweites Mal wiederholt. Als 2. Antikörper diente ein FITC-konjugiertes Ziege-antiKaninchen-Immunglobulin in der Verdünnung 1:50 in PBS mit Zusatz von 1 % Schweineserum. Alle 5 Schnitte wurden mit jeweils einem Tropfen (ca. 20 µl) dieses Konjugats beschichtet und für eine halbe Stunde bei RT in einer feuchten Kammer bei Dunkelheit inkubiert. Der sich anschließende Waschvorgang erfolgte wie oben beschrieben. Nach dem Trocknen mit dem Fön wurden die Schnitte schließlich mit einem Tropfen (ca. 20 µl) Glycerin-Tris HCl-Puffer überschichtet und mit einem Deckglas belegt. Die Auswertung erfolgte unter dem Fluoreszenzmikroskop bei 160und 400-facher Vergrößerung. Lungenschnitte mit einer deutlichen Fluoreszenz von einzelnen Mykoplasmen oder Aggregaten von Mykoplasmen am Rand oder im Lumen von Bronchien wurden als positiv beurteilt, wenn bei der negativen Kontrolle mit M. bovirhinis-Antiserum oder der Konjugatkontrolle keine typische Fluoreszenz auftrat. Als Beispiel für das Aussehen einer positiven Reaktion diente der Schnitt mit M. hyorhinis-Antiserum. Durch die Zugabe von 1 % Schweineserum zum Verdünnungsmedium wurde die bei fluoreszenzserologischen Untersuchungen häufig auftretende unspezifische Hintergrundfluoreszenz eliminiert. Die Hintergrundfluoreszenz wird durch Antikörper hervorgerufen, die bei der Herstellung von Antiserum mit in Schweineserummedium angezüchteten Mykoplasmen entstehen können. 3.8.2 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion Ein Zusammenhang zwischen den serologischen Ergebnissen und den Ergebnissen des Immunfluoreszenztests mit den Befunden der Sektionsberichte, die von der Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt wurden, sollte überprüft werden. 43 3.9 Epidemiologische Untersuchung Für die serologischen Untersuchungen der insgesamt 1392 Blutproben aus 106 Betrieben diente der Bommeli II-ELISA (siehe Kapitel 3.7.4). Zu 83 der untersuchten Betriebe waren Angaben zur Betriebsgröße und -struktur sowie zu Art und Herkunft der Ferkel bekannt. Die Lungenbefunde aus den 11 Betrieben wurden mit den Ergebnissen der Blutprobenuntersuchung in Beziehung gesetzt. 3.9.1 Kartographierung der Betriebe 96 Betriebe mit bekannten Adressen konnten mit Hilfe der Programme PhotoImpact, Version 5.0 (Ulead Systems, Inc., Taipeh, Taiwan) und Falk Reiseplaner City 6.51 (MAP&GUIDE GmbH, Karlsruhe) in die Landkarte des Weser-Ems Gebietes eingetragen werden. Dabei gilt die in Tabelle 8 dargestellte farbliche Differenzierung. Tab. 8: Darstellung der Intra-Herden-Prävalenzen scheinbare Intra-HerdenPrävalenz 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Farbe schwarz blau grün orange rot 3.10 Vergleich der Epidemiologie von M. hyopneumoniae mit denen von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) und Influenza Die Ergebnisse der epidemiologischen Untersuchungen von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) entstammten der Dissertation von POPPE (1997). Die Daten für die statistische Auswertung der beiden Influenzastämme A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) und A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) wurden der Dissertation von SCHENK (2000) entnommen. Die Proben von diesen Arbeiten kommen aus dem gleichen Probenpool von 1996 (GANTER et al. 1997). Um die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz von M. hyopneumoniae mit denen von A. pp. und den beiden Influenzastämmen (H3N2) und (H1N1) außerdem direkt visuell vergleichen zu können, wurden für jeden Erreger gesondert eine Landkarte angefertigt, aus der die geographische Lage der Betriebe mit der jeweiligen scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz ersichtlich ist. 3.11 Statistische Auswertung Sensitivität und Spezifität charakterisieren den Wert einer diagnostischen Methode. Die Sensitivität oder Empfindlichkeit des Messverfahrens drückt bei den hier durchgeführten Untersuchungen die Wahrscheinlichkeit aus, dass mit dem Test M. hyopneumoniae-infizierte Tiere erkannt werden, während die Spezifität oder Treffsicherheit die Wahrscheinlichkeit angibt, dass der Test bei M. hyopneumoniaefreien Tieren negativ ausfällt. 44 Sensitivität (%)= Anzahl der richtig Positiven mit der untersuchten Methode ------------------------------------------------------------------------------ x 100 Anzahl der Positiven mit der Referenzmethode Spezifität (%)= Anzahl der richtig Negativen mit der untersuchten Methode ------------------------------------------------------------------------------- x 100 Anzahl der Negativen mit der Referenzmethode Für die statistische Bearbeitung wurde das Auswertungsprogramm EXEL (Microsoft GmbH, Unterschleißheim) verwendet. Mit dem Statistikprogramm SAS® (statistical analysis system, Version 8.2, SAS Institute Inc. 1988, Cary, NC, USA.) wurden im Rechenzentrum der Tierärztlichen Hochschule Hannover die Berechnungen durchgeführt. Für den Vergleich zweier diagnostischer Tests (Zusammenhang dichotomer Merkmale) wurden der Konkordanzindex Kappa sowie der McNemar-Test verwendet. Des Weiteren wurde zur Prüfung der Häufigkeitsverteilung eines qualitativen Merkmals in verschiedenen Stichproben mit dem Chi²-Test und dem „exakten Test“ von Fischer und mit dem WILCOXON-Test gearbeitet. Für einzelne Ergebnisse wurden das relative Risiko und das „Odds Ratio“ berechnet (KREIENBROCK und SCHACH 1995). 45 4 Ergebnisse 4.1 Vergleich der serologischen Testsysteme: Aus dem Pool der Serumproben für die epidemiologische Untersuchung wurden 99 Proben mit den ELISA Testsystemen DAKO, Bommeli I (Chekit®-Hyoptest I), Bommeli II (Chekit®-Hyoptest II) und dem der TiHo parallel gemessen. Tab. 9: Ergebnisse der Testsysteme DAKO Bommeli I Bommeli II TiHo Gesamtanzahl der Proben: 99, davon: negativ fraglich positiv 12 19 68 58 8 33 17 21 61 35 35 29 Da alle fraglichen Ergebnisse in der folgenden Auswertung unberücksichtigt bleiben würden, werden sie von mir durch die Einrichtung eines jeweiligen neuen Cutpoints zu den seropositiven Proben gezählt. 4.1.1 Analyse von Häufigkeiten qualitativer Daten mit Berechnung von Sensitivität und Spezifität Da der DAKO-ELISA auf individuellem Niveau mit einer Sensitivität von 98-100 % (berechnet anhand von Proben von experimentell infizierten Schweinen) in dem akuten Stadium der Mykoplasmenpneumonie und einer Spezifität von 93-100 % (mit Proben von SPF-Kontrolltieren ermittelt) nach Untersuchungen von S∅RENSEN et al. (1997) bekannt ist, wird er als „Golden Standard“ angenommen und mit den übrigen drei Systemen verglichen. Tab. 10: Vergleich des DAKO-ELISAs mit dem Bommeli I-ELISA positiv Golden Standard (DAKO) positiv Negativ 39 3 Summe 42 48 87 57 99 Bommeli I negativ Summe A. Sensitivität: 39/87 = 0,448 = 45 % B. Spezifität : 9/12 = 0,75 = 75 % 9 12 46 Tab. 11: Vergleich des DAKO-ELISAs mit dem Bommeli II-ELISA positiv Golden Standard (DAKO) positiv Negativ 74 8 Summe 82 13 87 17 99 Bommeli II negativ Summe 4 12 A. Sensitivität: 74/87 = 0,851 = 85 % B. Spezifität : 4/12 = 0,33 = 33 % Tab. 12: Vergleich des DAKO-ELISAs mit dem TiHo-ELISA positiv Golden Standard (DAKO) positiv Negativ 58 6 Summe 63 29 87 35 99 TiHo negativ Summe 6 12 A. Sensitivität: 58/87 = 0,66 = 66 % B. Spezifität : 6/12 = 0,5 = 50 % Das Testsystem Bommeli II-ELISA, die Weiterentwicklung des Bommeli I-ELISAs, zeigt, dass durch die Erhöhung der Sensitivität von 45 % auf 85 % eine Abnahme der Spezifität von 75 % auf nur 33 % in Kauf genommen wurde, d.h. die Zahl der falschnegativen Diagnosen konnte zwar herabgesetzt werden, die Zahl der falsch-positiven Diagnosen steigt dagegen an. 4.1.2 Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemar-Test Die Ergebnisse der Vergleiche der Testsysteme zeigt folgende Tabelle: Tab. 11: Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemar-Test DAKO und Bommeli II DAKO und Bommeli I DAKO und TiHo Kappa 0,155 0,0758 0,0913 Pr > S 0,2752 <0,0001 0,0001 Nur die beiden Testsysteme DAKO-ELISA und Bommeli II-ELISA unterscheiden sich trotz der geringen Übereinstimmung der Testergebnisse von nur 16 % (Kappa = 0,155) hinsichtlich des prozentualen Anteils positiver Proben nicht signifikant (p > 0,05) voneinander. Der Bommeli I- sowie der TiHo-ElLISA weisen mit p < 0,01 signifikante Unterschiede zum DAKO-ELISA auf. 47 4.1.3 Regressionsanalyse Das lineare Regressionsmodell kann keine sehr gute Annäherung der berechneten Funktion an die tatsächlichen Werte der beiden Testsysteme DAKO- und Bommeli IIELISA liefern. Das geringe Bestimmtheitsmaß (R² = 0,2571) macht auch hier deutlich, dass durch das Testsystem Bommeli II-ELISA nur 26 % der Variation des DAKO-ELISAs linear erklärt wird. Extinktionswerte Dako 160 140 120 100 y = -0,7361x + 74,769 R2 = 0,2571 80 60 40 20 0 0 20 40 60 80 100 120 Extinktionswerte BII Abb. 4: Korrelation zwischen den Extinktionswerten der Testsysteme DAKO-ELISA und Bommeli II-ELISA 4.2 Drei verschiedene Nachweismethoden für M. hyopneumoniae-Infektionen im Vergleich 4.2.1 Der indirekte Immunfluoreszenztest Insgesamt wurden 127 Lungenschnitte auf M. hyopneumoniae untersucht. Davon war bei 49 Präparaten die typische Fluoreszenz von Mykoplasmen am Rand oder im Lumen von Bronchien zu sehen und sie wurden somit als positiv beurteilt. Auf eine Bewertung der Stärke der Fluoreszenz wurde dabei zugunsten der einfacheren Auswertung verzichtet. 23 Lungenschnitte ließen sich nicht eindeutig beurteilen und wurden somit als fraglich gekennzeichnet. 55 der 127 untersuchten Lungen zeigten keine spezifische Fluoreszenz. Abbildung 5 stellt zwei positive Lungenbefunde dar. 48 A B Abb. 5: Immunfluoreszenzmikroskopisch-positive Lungenbefunde A: am Bronchialepitel und umgebendes Lungengewebe; B: außerdem im Lumen eines Bronchus. Der Immunfluoreszenztest wurde an Gefrierschnitten von Lungengewebe mit Kaninchenhyperimmunserum gegen M. hyopneumoniae durchgeführt. Als Konjugat diente FITC-gekoppeltes Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin. a: Bronchus, b: umgebendes Lungengewebe (400fache Vergrößerung) 4.3 Vergleich des indirekten Immunfluoreszenztests an Lungenproben mit dem Bommeli II-ELISA korrespondierender Serumproben Ausgehend von den 153 Schweinen, die in die Außenstelle für Epidemiologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover zur Sektion kamen, wurden insgesamt 127 Lungenschnitte und 137 Serumproben untersucht, Auswertungen konnten allerdings nur für 111 „Paare“ vorgenommen werden (siehe Tabelle 13). 49 Tab. 13: Ergebnisse des Immunfluoreszenztests mit n = 111 M. hyo. IFT negativ fraglich positiv Mw-M. hyo. ELISA % 23,30 20,06 28,79 n 48 22 41 Auch bei dem Immunfluoreszenztest werden die fraglichen Ergebnisse zu den positiven Proben gezählt, um sie in der Auswertung berücksichtigen zu können. Mittels Chi²-Test konnte kein signifikanter Zusammenhang (p>0,05) zwischen den Ergebnissen des Immunfluoreszenztests und den Extinktionswerten des Bommeli IIElisas nachgewiesen werden. 4.3.1 Überprüfung der Sensitivität und Spezifität des Bommeli II-ELISAs Zur Überprüfung der Sensitivität und Spezifität des Bommeli II Testsystems wird der Immunfluoreszenztest zum „Golden Standard“ gewählt, da seine Spezifität nach SØRENSEN et al. (1997) in Bezug auf die kulturelle Untersuchung als „Golden Standard“ bei 93-100 % und seine Sensitivität zumindest bei akuten Erkrankungen zwischen 86-100 % lag. Tab. 14: Vergleich des IFTs mit dem Bommeli II-ELISA positiv Golden Standard (IFT) positiv negativ 19 13 Summe 32 44 63 79 111 Bommeli II negativ Summe 35 48 A. Sensitivität: 19/63 = 0,30 = 30 % B. Spezifität : 35/48 = 0,73 = 73 % In Bezug zum IFT zeigt der Bommeli II-ELISA eine sehr geringe Sensitivität von nur 30 % und eine Spezifität von 73 %. 4.3.1.1 Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemar-Test Der Vergleich der beiden Testsysteme ergibt folgendes: Tab. 15: Konkordanzindex Kappa und Mc-Nemar-Test IFT und Bommeli II Kappa 0,0286 Pr > S <0,0001 Die beiden Testsysteme IFT und Bommeli II-ELISA unterscheiden sich mit p<0,01 signifikant voneinander. 50 4.4 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur Von den 51 kulturellen Untersuchungen hätten 50 mit den dazugehörenden Serumproben, 38 mit den jeweiligen Lungenschnitten und insgesamt 37 mit beiden Methoden verglichen werden können. Von den 51 kulturellen Untersuchungen waren jedoch 27 Kulturen (53 %) wegen Kontamination mit anderen Keimen nicht auswertbar. Die Ergebnisse der verbliebenen 26 Kulturuntersuchungen sind in Tabelle 16 aufgeführt. In keiner dieser Kulturen konnte M. hyopneumoniae nachgewiesen werden. Tab. 16: Ergebnisse der kulturellen Untersuchung der Lungen auf M. hyopneumoniae mit den dazugehörenden Befunden der Serologie sowie des Immunfluoreszenztests Nummer BO IIELISA 1366 -5 1617 -3,3 1618 76,5 1631 19 1632 21,3 1636 -5,2 2441 -4,45 2934 -5,5 2936 -4 3780 93,3 2935 3,9 3938 4 3939 0,3 1633 4,4 1635 103,6 2334 -3,7 4281 16,8 4336 14 4434 132,8 4222 106,9 1829 n.u. 551 -6,6 4643 5,1 3500 20 552 47,2 4205 30,5 BO II IFT Kultur Neg Neg Pos Neg ? Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Neg Pos Pos Neg Neg ? Pos Pos Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg Neg ? ? ? Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg n.u. n.u. n.u. n.u. n.u. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. M.hyorhinis n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. n.n. M.hyorhinis n.n. M.hyorhinis n.n. n.n. Mykoplasmen 1 n.n. n.n. Mykoplasmen 2 n.n. n.n. BO II-ELISA = Bommeli II-ELISA (Prozent der Positivkontrolle); BO II = Beurteilung des Bommeli II-ELISAs; n. u. = nicht untersucht; n. n. = Mykoplasmen konnten nicht nachgewiesen werden; Mykoplasmen 1 = es konnten Mykoplasmen nachgewiesen werden, die sich jedoch nicht differenzieren ließen. Mittels IBA wurden folgende Spezies ausgeschlossen: M. hyorhinis, M. hyopneumoniae, M. hyosynoviae und A. granularum; Mykoplasmen 2 = es konnten Mykoplasmen nachgewiesen werden, die sich jedoch nicht passagieren ließen. 51 4.5 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion 4.5.1 Auswertung der Sektionsprotokolle Von den 135 ausgewerteten Sektionsberichten der eingesendeten Schweine nach Bakum (überwiegend aus dem süd-westlichen Niedersachsen) konnten mit den Daten von insgesamt 106 Tieren die Zusammenhänge zwischen Gewicht, Lungenveränderungen, dem Bommeli II-ELISA und dem IFT überprüft werden. Allein 99 Sektionen konnten mit dem Bommeli II-ELISA verglichen werden. Tabelle 17 gibt das Gewicht, die Anzahl dieser Sektionstiere sowie ihre Lungenveränderungen wieder. Tab. 17: Gewicht und Anzahl der Sektionstiere und ihre Lungenveränderungen Gewicht in kg Anzahl Lunge o. b. B. 0,7 - 9 10,6 - 20 22 - 30 31 - 38 43 - 48 60 - 81 Summe 59 18 8 4 4 6 99 29 4 2 1 1 37 Pneumonie chron. Lungenspitzenlappenveränderung¹ 20 10 7 7 6 1 3 3 1 4 29 33 Pleuritis 1 1 Lunge o. b. B.: Lunge ohne besonderen Befund ¹: mit und ohne Pneumonie Nach dem „exakten Test“ von Fischer ist das Verteilungsmuster der Lungenveränderungen in den einzelnen Gewichtsklassen mit p<0,05 signifikant verschieden. 57,14 % der bis zu 20 kg schweren Tiere zeigten Lungenveränderungen (in Form von Pneumonien, Pleuritiden und chronische Veränderungen der Lunge) auf, davon allein 22,08 % chronische Lungenspitzenlappenveränderungen. Nur 42,86 % der Lungen aus dieser Altersklasse waren ohne makroskopische Lungenveränderungen. Insgesamt zeigten 81,82 % der älteren (22–81 kg) Tiere Lungenveränderungen. Bei diesen Tieren war der Anteil der chronischen Lungenspitzenlappenveränderungen mit 72,73 % schon mehr als dreimal so hoch als bei den jüngeren Schweinen. Nur noch knapp 1/5 (nämlich 19,05 %) der Lungen zeigten sich ohne makroskopische Lungenveränderungen. Ohne einen Anhaltspunkt für eine Ursache zu haben, lässt sich hieraus schließen, dass bei den untersuchten Schweinen die Lungen in über 50 % der Fälle schon in einem sehr frühen Lebensalter geschädigt wurde. Die Anzahl der Lungengeschädigten steigt mit zunehmendem Alter an, wobei allein die chronischen Lungenveränderungen bei den noch nicht ausgewachsenen Tieren mit bis zu 81 kg schon über 70 % betragen. 52 4.5.2 Vergleich der Ergebnisse der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit den makroskopischen Untersuchungen der Lungen auf M. hyopneumoniae Bei der Korrelation der Lungenveränderungen (Lunge o. b. B., Pneumonie, Chron. Lungenspitzenlappenveränderungen, Chron. Lungenspitzenlappenveränderungen mit Pneumonie) mit den ELISA Testergebnissen (n = 99) zeigt der Spearman Korrelationskoeffizient r = -0,11 mit p>0,05, dass die beiden Variablen nicht nennenswert miteinander korreliert sind. Mit dem Chi²-Test konnte kein signifikanter Zusammenhang (p>0,05) zwischen den Lungenveränderungen und den Ergebnissen des Immunfluoreszenztests (n = 88) festgestellt werden. Bei einem Vergleich der beiden Testsysteme für jede der 4 Lungenkategorien (Einteilung siehe oben) konnte nur für die zuletzt genannte Kategorie (n = 16) mit dem McNemar-Test für den Bommeli II-ELISA ein signifikanter Unterschied zum IFT (p<0,05) nachgewiesen werden. Der Immunfluoreszenztest war bei 10 von 16 Lungen mit chronischen Lungenspitzenlappenveränderungen und Pneumonie positiv im Gegensatz zum Bommeli II-ELISA, der von den 16 Lungen nur 3 als positiv erkannte. Tabelle 18 zeigt die unauffällige Lunge in Bezug zu den negativen Ergebnissen des Bommeli II-ELISAS und des Immunfluoreszenztestes und die pathologischen Veränderungen der Lunge in Beziehung zu den positiven Ergebnissen der beiden Testsysteme. Tab. 18: Lungenveränderungen in Bezug zu den Nachweisraten (n = 81) Nur BO II-ELISA nur IFT negativ negativ Lunge o. b. B. 68,75 % 46,88 % Nur BO II-ELISA nur IFT positiv positiv Lungenveränderungen 26,53 % gesamt chron. Lungenspitzenlappenver- 30,77 % änderungen¹ BO II-ELISA negativ + IFT negativ 31,25 % BO II-ELISA positiv + IFT positiv 63,27 % 16,33 % 61,54 % 19,23 % Lunge o.b.B.: Lunge ohne besonderen Befund ¹: mit und ohne Pneumonie Nur bei 10 von 32 (31,25 %)der Tiere mit einer unauffälligen Lunge waren sowohl der Bommeli II-ELISA als auch der Immunfluoreszenztest negativ. Bei einem Vergleich der Lungen ohne besonderen Befund nur mit dem Immunfluoreszenztest bzw. nur mit dem ELISA lag der Anteil der Übereinstimmungen bei 46,88 % bzw. 68,75 %. Bei den Lungenveränderungen allgemein und speziell bei den chronischen Lungenspitzenlappenveränderungen war es teilweise ähnlich. Hier zeigte sich bei dem Vergleich mit den positiven ELISA- und Immunfluoreszenztestergebnissen eine Übereinstimmung in 16,33 % (8 von 49) bzw. 19,23 % (5 von 26) der Fälle. Wurden jedoch diese Lungenveränderungen nur mit dem Immunfluoreszenztest verglichen, stimmten 63,27 % bzw. 61,54 % der Untersuchungen überein. Verglich 53 man aber die Pathologie nur mit dem Bommeli II-ELISA, so waren 13 von 49 (26,53 %) der Tiere bzw. 8 von 26 (30,77 %) der Schweine positiv. 4.6 Epidemiologische Untersuchung 4.6.1 Auswertung der untersuchten Serumproben von Schlachtschweinen Die Proben für die Antikörperbestimmung auf M. hyopneumoniae stammen aus 106 Betrieben, die Proben für die Titerbestimmung mit dem Hämagglutinationshemmungstest gegen porcine Influenzaviren der Subtypen A (SCHENK 2000) kommen aus 136 Betrieben aus den Landkreisen Osnabrück, Vechta und Steinfurt und wurden 1996 auf zwei Schlachthöfen durch Mitarbeiter des Veterinäramtes des Landkreises Osnabrück gewonnen. Zu dieser Zeit wurden noch keine Impfungen gegen M. hyopneumoniae durchgeführt. 4.6.1.1 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von M. hyopneumoniae Die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz ergibt sich aus dem Anteil sero-positiver Proben an der Gesamtstichprobenzahl. Die serologische Untersuchung auf M. hyopneumoniae erfolgte mit dem Bommeli II-ELISA. Auch hier wurden die fraglichen Proben zu den positiven gezählt. Tab. 19: Anteil positiver Proben an der Gesamtstichprobenzahl Gesamtstichprobenzahl M. hyopneumoniae-sero-positiv scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) (%) 1392 1131 81,25 Von den 1392 untersuchten Serumproben sind 1131 Proben positiv, d.h. sie wiesen eine Antikörperaktivität gegen M. hyopneumoniae auf. Hiermit beträgt die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz 81,25 %. Pro Herde (106) wurde jeweils separat die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz errechnet und daraus der Mittelwert gebildet. Dieser ergibt somit: 81,41 % ± 26,88 % (Mittelwert (PN) ± einfache Standardabweichung). 4.6.1.2 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von Antikörpern gegen Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) Tab. 20: Anteil positiver Proben an der Gesamtstichprobenzahl Gesamtstichprobenzahl Influenzavirus H1N1-sero-positiv scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) (%) 2057 1208 58,73 54 Von den 2057 untersuchten Serumproben sind 1208 Proben positiv, d.h. sie wiesen Antikörperaktivitäten gegen Influenzavirus H1N1 auf. Hiermit liegt die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz bei 58,73 % Der arithmetische Mittelwert aus der Gesamtheit der 136 scheinbaren Intra-HerdenPrävalenzen ergibt: 58,44 % ± 33,25 % (Mittelwert (PN) ± einfache Standardabweichung). 4.6.1.3 Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) von Antikörpern gegen Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) Tab. 21: Anteil positiver Proben an der Gesamtstichprobenzahl Gesamtstichprobenzahl Influenzavirus H3N2-sero-positiv scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) (%) 2756 360 13,06 Von den 2756 untersuchten Serumproben sind 360 Proben positiv. Die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz beträgt also 13,06 % Der arithmetische Mittelwert aus der Gesamtheit der 136 scheinbaren Intra-HerdenPrävalenzen ergibt: 17,53 % ± 24,29 % (Mittelwert (PN) ± einfache Standardabweichung). 4.6.1.4 Scheinbare Herden-Prävalenz von M. hyopneumoniae: Die scheinbare Herden-Prävalenz gibt den prozentualen Anteil der seropositiven Bestände bezogen auf die 106 bzw. 136 untersuchten Bestände an. Ein Bestand gilt hierbei als positiv, wenn mindestens ein Tier seropositiv reagiert. Auf M. hyopneumoniae bezogen stellen sich 103 Betriebe als seropositiv heraus (siehe Tabelle 22). Die scheinbare Herden-Prävalenz beträgt somit 97,17 %. Tab. 22: Anzahl der seropositiven Bestände, ausgehend von der scheinbaren Herden-Prävalenz Untersuchte Bestände 106 M. hyopneumoniae-seropositiv 103 scheinbare Herden-Prävalenz 97,17 (%) 55 4.6.1.5 Scheinbare Herden-Prävalenz von Antikörpern gegen Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) Tab. 23: Anzahl der seropositiven Bestände, ausgehend von der scheinbaren Herden-Prävalenz Untersuchte Bestände 136 Influenzavirus H1N-seropositiv 131 scheinbare Herden-Prävalenz 96,32 (%) Für die scheinbare Herden-Prävalenz von Influenzavirus H1N1 läßt sich ein Wert von 96,32 % ermitteln. 4.6.1.6 Scheinbare Herden-Prävalenz von Antikörpern gegen Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) Tab. 24: Anzahl der seropositiven Bestände, ausgehend von der scheinbaren Herden-Prävalenz Untersuchte Bestände Influenzavirus H3N2-seropositiv scheinbare Herden-Prävalenz (%) 136 83 61,03 Die scheinbare Herden-Prävalenz von Influenzavirus H3N2 entspricht 61,03 %. 4.6.2 Einflußfaktoren auf die Intra-Herden-Prävalenzen Von 107 Betrieben sind die Aufstallungsform und das Hygieneregime nach POPPE (1997) bekannt, so dass nun die Berechnung von Risikofaktoren der verschiedenen Managementsysteme vorgenommen werden kann. Im Einzelnen werden die Einflüsse durch Betriebsgröße und –struktur sowie Art und Herkunft der Ferkel auf die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (PN) geprüft. Für die verschiedenen Risikofaktoren sind das relative Risiko (RR) sowie das „Odds Ratio“ (OR) berechnet worden. Das relative Risiko ist definitionsgemäß das Verhältnis des Risikos bei den Exponierten zum Risiko bei den Nicht-Exponierten. Es gibt den Faktor an, um den sich die Erkrankungswahrscheinlichkeit erhöht, wenn man einer definierten Exposition unterliegt. Das „Odds Ratio“ ist als der Faktor zu interpretieren, um den die Chance zu erkranken steigt, wenn man exponiert ist. Für die einzelnen Berechnungen sind die scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen verwendet worden. In den Tabellen 9, 11, 13, 15 und 17 nehmen die Intra-HerdenPrävalenzen jeweils horizontal von links nach rechts bzw. von oben nach unten ab. Das „Odds Ratio“ der vertikal aufgeführten im Vergleich zu den horizontal aufgeführten Einflussfaktoren befindet sich in den Tabellen oben rechts, während das relative Risiko der horizontal aufgereihten gegenüber den vertikal aufgereihten Einflussfaktoren unten links in den Tabellen zu finden ist. 56 4.6.2.1 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz In der folgenden Tabelle sind die Häufigkeiten der Intra-Herden-Prävalenz in Bezug auf die Anzahl der Mastplätze dargestellt. Aus Gründen der besseren Übersicht ist die Intra-Herden-Prävalenz in fünf Klassen eingeteilt worden. Von den insgesamt 83 Betrieben sind nur 3 Betriebe seronegativ. Die meisten Betriebe haben eine Größe von 301-900 Mastplätzen, davon besitzen 45 Bestände 301-600 und 22 Bestände 601-900 Mastplätze. Tab. 25: Häufigkeiten der Intra-Herden-Prävalenz in Bezug auf die Anzahl der Mastplätze PN 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe <300 0 0 0 1 5 6 301-600 1 4 4 5 31 45 601-900 2 2 0 1 17 22 > 900 0 0 0 1 9 10 Summe 3 6 6 8 62 83 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Anteile der Betriebe und der Intra-HerdenPrävalenz (PN) in Prozent Abbildung 6 zeigt die Anzahl der Mastplätze der untersuchten Betriebe mit den dazugehörenden Mittelwerten der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz. 100 90 80 70 60 Betriebe PN 50 40 30 20 10 0 300 301-600 601-900 900 Anzahl der Mastplätze Abb. 6: Mastplätze und scheinbare Intra-Herden-Prävalenz der untersuchten Bestände Für die Einflussgröße Anzahl der Mastplätze pro Betrieb in Bezug auf die IntraHerden-Prävalenz haben sich mittels WILCOXON-Test keine signifikanten Unterschiede (p>0,05) ergeben. 57 Die Berechnungen des relativen Risikos (RR) und des „Odds Ratio“s (OR) zeigen, dass z. B. für Ferkel in Betrieben mit mehr als 900 Mastplätzen das relative Risiko um das 1,29fache höher ist, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, als in Betrieben mit 601-900 Mastplätzen und um das 1,26fache höher als in Betrieben mit 301-600 Mastplätzen. Die Chance steigt dabei um den Faktor 6,47 bzw. 5,79, dass die Ferkel sich tatsächlich mit M. hyopneumoniae infizieren. Weiteres siehe Tabelle 26. Tab. 26: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich aufgrund der Anzahl der Mastplätze mit M. hyopneumoniae zu infizieren > 900 (PN=94,6 %) > 900 < 300 301-600 601-900 1,10 1,26 1,29 < 300 (PN=85,9 %) 2,88 1,14 1,18 301-600 (PN=75,9 %) 5,79 2,01 601-900 (PN=72,4 %) 6,47 2,24 1,12 1,03 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen 4.6.2.2 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) Der Großteil der untersuchten Betriebe hat eine Größe von 301-900 Mastplätzen. Von diesen haben 62 Betriebe zwischen 301-600 Mastplätze und 27 Betriebe haben 601-900 Mastplätze. Tab. 27: Häufigkeiten der Intra-Herden-Prävalenz in Bezug auf die Anzahl der Mastplätze PN 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe <300 0 0 0 2 4 6 301-600 2 14 13 8 25 62 601-900 2 2 7 3 13 27 > 900 0 2 3 3 4 12 Summe 4 18 23 16 46 107 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Mittels WILCOXON-Test ließ sich für die Einflussgröße Anzahl der Mastplätze pro Betrieb in Bezug auf die Intra-Herden-Prävalenz keine signifikanten Unterschiede (p>0,05) errechnen. Tabelle 28 ist zu entnehmen, dass das relative Risiko für Ferkel, sich mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren, in Betrieben mit weniger als 300 Mastplätzen 1,52fach höher ist als in Betrieben mit 301-600 Mastplätzen. Desgleichen steigt die Chance, dass sich diese Ferkel in den Betrieben, die bis zu 300 Mastplätze aufweisen, mit diesem Erreger infizieren um den Faktor 4,38 verglichen mit den Ferkeln aus den Betrieben mit 301-600 Mastplätzen. 58 Tab. 28: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich aufgrund der Anzahl der Mastplätze mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren < 300 (PN=85,0 %) < 300 601-900 > 900 301-600 1,31 1,38 1,52 601-900 (PN=62,3 %) 3,01 1,06 1,16 > 900 (PN=60,7 %) 3,50 1,16 301-600 (PN=56,0 %) 4,38 1,46 1,25 1,10 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen 4.6.2.3 Anzahl und Einfluss der Mastplätze auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) Die Anzahl und Verteilung der Bestände auf die verschiedenen Betriebsgrößen ist für Influenzavirus H3N2 genauso wie für Influenzavirus H1N1 (siehe unter 4.6.2.2, Tabelle 27), nur die Anzahl der Betriebe innerhalb der Intra-Herden-PrävalenzKlassen ist unterschiedlich. Tab. 29: Häufigkeiten der Intra-Herden-Prävalenz in Bezug auf die Anzahl der Mastplätze PN 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe <300 2 3 1 0 0 6 301-600 26 20 8 5 3 62 601-900 14 7 3 1 2 27 > 900 2 7 1 1 1 12 Summe 44 37 13 7 6 107 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Die Beziehung zwischen Anzahl der Mastplätze pro Betrieb und Intra-HerdenPrävalenz ist mittels WILCOXON-Test überprüft worden. Es haben sich keine signifikanten Unterschiede (p>0,05) ergeben. Ferkel aus Betrieben mit mehr als 900 Mastplätzen haben ein um 1,97fach höheres relatives Risiko, sich mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren, als Ferkel aus Betrieben mit weniger als 300 Mastplätzen (siehe Tabelle 30). Im gleichen Fall steigt die Chance, dass sich Ferkel in Betrieben mit mehr als 900 Mastplätzen eher mit Influenzavirus H3N2 infizieren als in Beständen mit weniger als 300 Mastplätzen, um den Faktor 2,20. 59 Tab. 30: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich aufgrund der Anzahl der Mastplätze mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren > 900 (PN=19,5 %) > 900 601-900 301-600 <300 1,07 1,13 1,97 601-900 (PN=17,9 %) 1,09 1,06 1,84 301-600 (PN=17,2 %) 1,16 1,07 < 300 (PN=10,1 %) 2,20 2,02 1,89 1,74 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen 4.6.2.4 Einfluss der Betriebsform auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz Die Beziehung zwischen der Intra-Herden-Prävalenz und der Betriebsform ist in der folgenden Tabelle aufgeführt. Von den 83 untersuchten Betrieben werden 28 als so genannte geschlossene Betriebe und 55 als reine Mastbetriebe bezeichnet. Tab. 31: Beziehung zwischen der Intra-Herden-Prävalenz und der Betriebsform PN 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe Geschlossener Betrieb 1 3 0 3 21 28 Mastbetrieb Summe 2 3 4 5 41 55 3 6 4 8 62 83 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Mittels WILCOXON-Test ist der Zusammenhang zwischen der Intra-HerdenPrävalenz und der Betriebsform überprüft worden. Da mit p>0,05 kein statistischer Unterschied aufgetreten ist, ist ein Einfluss der Betriebsform auf die Intra-HerdenPrävalenz nicht gegeben. Tabelle 32 zeigt, dass die Ferkel in Mastbetrieben einem 1,06fach höherem relativen Risiko ausgesetzt sind, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, als Ferkel in geschlossenen Betrieben. Die Chance, dass sie sich infizieren, steigt dabei um den Faktor 1,28. Tab. 32: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich aufgrund der Betriebsform mit M.hyopneumoniae zu infizieren Mastbetrieb (PN=78,9 %) Mastbetrieb geschlossener Betrieb geschlossener Betrieb (PN=76,1 %) 1,28 1,06 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen 60 4.6.2.5 Einfluss der Betriebsform auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) Unter den 107 untersuchten Betrieben befinden sich 69 Mastbetriebe und 38 geschlossene Betriebe. Tab. 33: Beziehung zwischen der Intra-Herden-Prävalenz und der Betriebsform PN 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe Geschlossener Betrieb 1 8 9 7 13 38 Mastbetrieb Summe 3 10 14 9 33 69 4 18 23 16 46 107 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Die Auswertung mittels WILCOXON-Test weist keine statistischen Unterschiede innerhalb der Betriebsformen auf (p>0,05). Ein Einfluss der Betriebsform auf die Intra-Herden-Prävalenz von Influenzavirus H1N1 kann daher ausgeschlossen werden. Die Chance, dass sich Ferkel in Mastbetrieben mit Influenzavirus H1N1 infizieren, steigt um den Faktor 1,53 im Vergleich zu den Tieren aus geschlossenen Betrieben. Gleichwohl sind diese Ferkel in Mastbetrieben einem 1,19fach höherem relativen Risiko ausgesetzt, sich mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren, als Ferkel in geschlossenen Betrieben (siehe Tabelle 34). Tab. 34: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich aufgrund der Betriebsform mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren Mastbetrieb (PN=63,0 %) Mastbetrieb geschlossener Betrieb geschlossener Betrieb (PN=54,3 %) 1,53 1,19 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen 61 4.6.2.6 Einfluss der Betriebsform auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) Auch hier ist nur die Anzahl der Betriebe in den einzelnen Intra-Herden-PrävalenzKlassen im Vergleich zu Influenzavirus H1N1 unterschiedlich. Tab. 35: Beziehung zwischen der Intra-Herden-Prävalenz und der Betriebsform PN 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe Geschlossener Betrieb 14 12 5 5 2 38 Mastbetrieb Summe 30 25 8 2 4 69 44 37 13 7 6 107 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Die beiden Betriebsformen in Beziehung zur Intra-Herden-Prävalenz sind anhand des WILCOXON-Tests miteinander verglichen worden. Es traten keine statistischen Unterschiede (p>0,05) auf. Die Ferkel in geschlossenen Betrieben sind einem 1,40fach höherem relativen Risiko ausgesetzt, sich mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren, als Ferkel in Mastbetrieben (siehe Tabelle 36). Die Chance, dass sie erkranken, ist dabei um den Faktor 1,50 erhöht. Tab. 36: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich aufgrund der Betriebsform mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren geschlossener Betrieb (PN=21,40 %) geschlossener Betrieb Mastbetrieb Mastbetrieb (PN=14,9 %) 1,50 1,40 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen 4.6.2.7 Einfluss der Einstallungsform auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz Die 83 untersuchten Bestände weisen unterschiedliche Einstallungsformen auf. Eine davon ist die kontinuierliche Belegung, die nur in geschlossenen Betrieben zu finden ist. Eine weitere ist das so genannte „Rein-Raus-Verfahren“. Hier werden entweder sämtliche Stallungen des Hofes (hofweise rein-raus) vollständig ausgestallt, gereinigt und desinfiziert, bevor die nächsten Ferkel eintreffen, oder aber nur einzelne Abteile in den Stallungen (abteilweise rein-raus). Die Einstallungsform hofweise rein-raus wird dabei nur in Mastbetrieben angewendet. Das abteilweise Rein-Raus-Verfahren wird von beiden Betriebsformen genutzt. Die 39 hier untersuchten Betriebe dieser Kategorie teilen sich dabei in 18 geschlossene Betriebe und 21 Mastbetriebe auf. 62 Beim Erzeuger-Mäster-Direktverkehr erhält der Mäster die Ferkel immer direkt vom selben Ferkelerzeuger, die Einstallungsform ist jedoch nicht bekannt. Tab. 37: Einfluss der Einstallungsform auf die Intra-Herden-Prävalenz PN kontinuierlich hofweise rein-raus 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe 0 0 0 2 8 10 0 0 3 3 19 25 abteilweise Erzeuger-Mästerrein-raus Direktverkehr mit unbekannter Einstallungsform 3 0 3 3 1 0 3 0 29 6 39 9 Summe 3 6 4 8 62 83 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Die Auswertung mittels WILCOXON-Test weist keine statistischen Unterschiede innerhalb der Einstallungsformen auf (p>0,05). Ein Zusammenhang zwischen der Einstallungsform und der Intra-Herden-Prävalenz ist daher unwahrscheinlich. Die Chance, dass sich Ferkel aus Betrieben mit kontinuierlicher Belegung mit M. hyopneumoniae infizieren, steigt um den Faktor 3,07 im Vergleich zu den Tieren aus Betrieben, die ihre Ferkel direkt vom Erzeuger beziehen. Gleichermaßen sind die Ferkel aus Betrieben mit kontinuierlicher Belegung einem 1,28fach höherem relativen Risiko ausgesetzt, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, als Tiere aus den Betrieben des Erzeuger-Mäster-Direktverkehrs. Weitere Informationen sind der folgenden Tabelle zu entnehmen. Tab. 38: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich in verschiedenen Einstallungsformen mit M. hyopneumoniae zu infizieren kontinuierlich hofweise rein-raus abteilweise rein-raus Erzeuger-MästerDirektverkehr mit unbekannter Einstallungsform Erzeuger-MästerDirektverkehr mit hofweise abteilweise unbekannter kontinuierlich rein-raus rein-raus Einstallungsform (PN=85,9 %) (PN=82,3 %) (PN=75,6 %) (PN=67,5 %) 1,36 2,10 3,07 1,05 1,55 1,15 1,20 1,28 1,22 2,25 1,46 1,11 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen 63 4.6.2.8 Einfluss der Einstallungsform auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) Von den insgesamt 107 untersuchten Betrieben werden die 49 Betriebe, die mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren arbeiten, in 23 geschlossene Betriebe und 26 Mastbetriebe aufgeteilt. Tab. 39: Einfluss der Einstallungsform auf die Intra-Herden-Prävalenz PN kontinuierlich hofweise rein-raus 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe 1 1 3 3 7 15 0 4 6 5 17 32 abteilweise Erzeuger-Mästerrein-raus Direktverkehr mit unbekannter Einstallungsform 2 1 11 2 12 2 7 1 17 5 49 11 Summe 4 18 23 16 46 107 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Für die Einflussgrösse Einstallungsform in Bezug auf die Intra-Herden-Prävalenz haben sich mittels WILCOXON-Test keine signifikanten Unterschiede (p>0,05) gezeigt. Die Berechnungen des relativen Risikos (RR) und der „Odds Ratio“ (OR) zeigen, dass für Ferkel in Betrieben, die hofweise rein-raus einstallen, das relative Risiko um das 1,29fache höher ist, sich mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren, als in Betrieben mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren (siehe Tabelle 40). Die Chance steigt dabei um den Faktor 1,96, dass sich die Tiere tatsächlich mit Influenzavirus H1N1 infizieren. Tab. 40: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich in verschiedenen Einstallungsformen mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren kontinuierlich Erzeuger-Mäster- abteilweise hofweise Direktverkehr mit rein-raus rein-raus unbekannter Einstallungsform (PN=69,7 %) (PN=62,6 %) (PN=55,6 %) (PN=53,6 %) hofweise rein-raus kontinuierlich Erzeuger-Mäster Direktverkehr mit unbekannter Einstallungsform abteilweise rein-raus 1,38 1,11 1,19 1,06 1,29 1,16 1,61 1,96 1,17 1,43 1,22 1,09 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen 64 4.6.2.9 Einfluss der Einstallungsform auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) Die Einteilung der 49 Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren in geschlossene Betriebe und Mastbetriebe ist genauso, wie unter 4.6.2.8 beschrieben. Tab. 41: Einfluss der Einstallungsform auf die Intra-Herden-Prävalenz PN kontinuierlich hofweise rein-raus 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe 4 6 1 3 1 15 15 10 5 1 1 32 abteilweise Erzeuger-Mästerrein-raus Direktverkehr mit unbekannter Einstallungsform 20 5 18 3 6 1 3 0 2 2 49 11 Summe 44 37 13 7 6 107 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Die verschiedenen Einstallungsformen in Bezug auf die Intra-Herden-Prävalenzen sind mittels WILCOXON-Test überprüft worden. Es zeigten sich keine statistischen Unterschiede (p>0,05). Tabelle 42 zeigt, dass das relative Risiko der Ferkel, sich mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren, in Betrieben mit kontinuierlicher Belegung 1,95fach höher ist als für Ferkel in Betrieben mit hofweisem Rein-Raus-Verfahren. Im gleichen Fall steigt die Chance, dass sich die Ferkel in den Betrieben mit kontinuierlicher Belegung eher mit Influenzavirus H3N2 infizieren, um den Faktor 2,27 verglichen mit den Ferkeln in Betrieben, die hofweise rein-raus einstallen. Tab. 42: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich in verschiedenen Einstallungsformen mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren kontinuierlich Erzeuger-MästerDirektverkehr mit unbekannter Einstallungsform abteilweise rein-raus hofweise rein-raus Erzeuger-Mästerkontinuierlich Direktverkehr mit unbekannter Einstallungsform (PN=25,6 %) (PN=23,9 %) 1,02 abteilweise rein-raus 1,01 1,78 1,60 1,59 1,95 1,92 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen hofweise rein-raus (PN=15,9 %) (PN=13,1 %) 1,81 2,27 2,23 1,25 1,21 65 4.6.2.10 Einfluss der Ferkelherkunft auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz Die zu mästenden Ferkel lassen sich in vier Gruppen einteilen: Betrieb aus bis zu 40 Ferkelerzeugerbetrieben aufgekauft und bis zu einem Körpergewicht von ca. 28 kg (10.-12. Lebenswoche) aufgezogen, um sie anschließend an die Mäster weiter verkaufen zu können. Das Ziel dieses Verfahrens ist die Schaffung eines annähernd einheitlichen Immunstatus innerhalb der Ferkelgruppe. Für die Mäster ist es dann von Vorteil, wenn sie die Ferkel möglichst von nur einem Systemferkelaufzüchter beziehen. der Mäster aber erwirbt sie von verschiedenen Ferkelerzeugern. Hierdurch weisen diese Ferkel einen sehr uneinheitlichen Immunstatus auf. -Mäster-Direktverkehr arbeiten der Ferkelerzeuger und der Mäster sozusagen eng zusammen, da der Mäster die ca. 28 kg schweren und über einen einheitlichen Immunstatus verfügenden Ferkel immer von demselben Ferkelerzeuger erhält. Tab. 43: Beziehung zwischen der Ferkelherkunft und der M. hyopneumoniae-IntraHerden-Prävalenz PN eigene Ferkel Systemferkel Qualitätsferkel 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe 1 3 0 3 21 28 1 0 2 1 14 18 1 0 2 4 21 28 ErzeugerMästerDirektverkehr 0 3 0 0 6 9 Summe 3 6 4 8 62 83 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Die verschiedenen Ferkelherkünfte in Beziehung zur Intra-Herden-Prävalenz sind anhand des WILCOXON-Testes miteinander verglichen worden. Dabei sind keine statistischen Unterschiede (p>0,05) sichtbar geworden. Tabelle 44 zeigt, dass das relative Risiko für Qualitätsferkel, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, 1,22fach höher ist als für Ferkel aus den Betrieben des Erzeuger-Mäster-Direktverkehrs. Außerdem steigt die Chance, dass sich Qualitätsferkel eher mit M. hyopneumoniae infizieren als Tiere aus Betrieben, die ihre Ferkel direkt vom Erzeuger beziehen, um den Faktor 2,30. 66 Tab. 44: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich aufgrund verschiedener Ferkelherkünfte mit M. hyopneumoniae zu infizieren Qualitätsferkel Systemferkel (PN=82,5 %) Qualitätsferkel Systemferkel 1,04 Eigene Ferkel 1,10 ErzeugerMäster1,22 Direktverkehr (PN=79,2 %) 1,23 Eigene Ferkel (PN=76,1 %) 1,61 1,30 1,06 1,18 ErzeugerMästerDirektverkehr (PN=67,5 %) 2,30 1,86 1,43 1,11 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen 4.6.2.11 Einfluss der Ferkelherkunft auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) Tab. 45: Beziehung zwischen der Ferkelherkunft und der Intra-Herden-Prävalenz PN eigene Ferkel Systemferkel Qualitätsferkel 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe 1 8 9 7 13 38 0 3 3 4 12 22 2 5 9 4 16 28 ErzeugerMästerDirektverkehr 1 2 2 1 5 11 Summe 4 18 23 16 46 107 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Auch hier wurden die verschiedenen Ferkelherkünfte in Beziehung zur Intra-HerdenPrävalenz anhand des WILCOXON-Testes miteinander verglichen, und es sind keine statistischen Unterschiede (p>0,05) sichtbar geworden. Die Chance, dass sich Systemferkel mit Influenzavirus H1N1 infizieren, steigt um den Faktor 2,15 im Vergleich zu den eigenen Ferkeln aus geschlossenen Betrieben. Des Weiteren sind die Systemferkel einem 1,33fach höherem relativen Risiko ausgesetzt, sich mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren, als die eigenen Ferkel (siehe Tabelle 46). 67 Tab. 46: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich aufgrund verschiedener Ferkelherkünfte mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren Systemferkel (PN=71,1 %) Systemferkel Qualitätsferkel 1,17 ErzeugerMäster1,21 Direktverkehr Eigene Ferkel 1,33 Qualitätsferkel ErzeugerMästerDirektverkehr (PN=60,3 %) (PN=55,6 %) 1,59 1,74 1,10 Eigene Ferkel 1,04 1,23 1,14 (PN=54,3 %) 2,15 1,35 1,10 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen 4.6.2.12 Einfluss der Ferkelherkunft auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) Tab. 47: Beziehung zwischen der Ferkelherkunft und der Intra-Herden-Prävalenz PN 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe eigene Ferkel Systemferkel Qualitätsferkel 14 12 5 5 2 38 11 7 3 1 0 22 14 15 4 1 2 28 ErzeugerMästerDirektverkehr 5 3 1 0 2 11 Summe 44 37 13 7 6 107 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz Bei der Einflussgröße Ferkelherkunft sind mittels WILCOXON-Test zwischen den 4 Klassen in Bezug auf die Intra-Herden-Prävalenz keine signifikanten Unterschiede zum Vorschein gekommen (p>0,05). Tiere aus den Betrieben des Erzeuger-Mäster-Direktverkehrs sind einem 2,52fach höherem relativen Risiko ausgesetzt, sich mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren, als Systemferkel. Das „Odds Ratio“ beträgt dabei 3,03. Weiteres siehe Tabelle 48. 68 Tab. 48: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich aufgrund verschiedener Ferkelherkünfte mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren ErzeugerMästerDirektverkehr (PN=71,1 %) ErzeugerMästerDirektverkehr eigene Ferkel 1,21 Qualitätsferkel 1,61 Systemferkel 2,52 eigene Ferkel Qualitätsferkel Systemferkel (PN=60,3 %) (PN=55,6 %) (PN=54,3 %) 1,28 1,81 3,03 1,42 2,37 1,67 1,33 1,87 1,56 PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen 4.6.2.13 Einfluss der Produktionsverfahren auf die M. hyopneumoniae-Prävalenz Wie aus Tabelle 49 ersichtlich, sind die 83 untersuchten Betriebe in 7 Klassen bzgl. ihrer Managementsysteme bzw. Produktionsverfahren eingeteilt worden. Das Produktionsverfahren ist dabei als eine Zusammenstellung von Betriebsstruktur, Einstallungsform und Ferkelherkunft zu verstehen. Tab. 49: Zusammenhang zwischen den Produktionsverfahren und der Intra-HerdenPrävalenz 1 hofweise reinPN raus; Qu.ferkel 0% 0 1-25 % 0 26-50 1 % 51-75 2 % 76-100 10 % Sum13 me 2 hofweise reinraus; Systemferkel 0 0 3 abteilweise reinraus; Qu.ferkel 1 0 Klassen 4 abteilweise reinraus; Systemferkel 1 0 2 1 1 5 ErzeugerMästerDirektverkehr 6 geschl. Betrieb; kontinuierlich 0 3 0 0 7 geschl. Betrieb; abteilweise reinraus 1 3 0 0 0 0 4 2 0 0 2 1 8 9 11 5 6 8 13 62 12 15 6 9 10 18 83 Summe 3 6 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz In Bezug auf den Einflussfaktor Produktionsverfahren sind mittels WILCOXON-Test zwischen den 7 Klassen hinsichtlich der Intra-Herden-Prävalenz keine signifikanten Unterschiede aufgetreten (p>0,05). 69 Abbildung 7 veranschaulicht den Einfluss der Managementsysteme auf die IntraHerden-Prävalenz von M. hyopneumoniae sowie auf die Mittelwerte der Extinktionswerte pro Betrieb. Tendenziell zeigten geschlossene Betriebe mit kontinuierlicher Belegung sowie Betriebe mit hofweisem Rein-Raus von Qualitätsferkeln aus zahlreichen Herkünften die höchsten Intra-Herden-Prävalenzen, die niedrigsten wiesen die Betriebe mit Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehr. 120 100 (%) 80 Prävalenz Mw-OD 60 40 20 0 =5 =7 =2 =3 =4 =1 =6 Managementsysteme Abb.7: Einfluss der Managementsysteme auf die Intra-Herden-Prävalenz und die Mittelwerte der Extinktionswerte der 83 Betriebe Zeichenerklärung: 1 = Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Qualitätsferkel 2 = Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Systemferkel 3 = Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Qualitätsferkel 4 = Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Systemferkel 5 = Mastbetrieb; Erzeuger-Mäster-Direktverkehr 6 = geschlossener Betrieb; kontinuierliche Belegung 7 = geschlossener Betrieb; abteilweise rein-raus Mw-OD = Mittelwerte der gemessenen Optischen Dichten im ELISA Die Berechnungen des relativen Risikos (RR) und des „Odds Ratio“ (OR) zeigen, dass z.B. für eigene Ferkel aus den geschlossenen Betrieben mit kontinuierlicher Belegung das relative Risiko, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, 1,28fach höher liegt als für Ferkel aus dem Erzeuger-Mäster-Direktverkehr und 1,25fach höher als für eigene Ferkel aus den geschlossenen Betrieben mit abteilweiser Rein-RausBelegung (siehe Tabelle 50). Im gleichen Fall steigt für diese eigenen Ferkel die Chance, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, bis zum Faktor 3,07 verglichen mit den Ferkeln aus dem Erzeuger-Mäster-Direktverkehr und bis zum Faktor 2,82 verglichen mit den Ferkeln aus den geschlossenen Betrieben mit abteilweisem ReinRaus-Verfahren. 70 Tab. 50: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich bei verschiedenen Produktionsverfahren mit M. hyopneumoniae zu infizieren Klasse 6 (PN= 85,9 %) Klasse 6 Klasse 1 Klasse 3 Klasse 4 Klasse 2 Klasse 7 Klasse 5 1,01 1,07 1,08 1,09 1,25 1,28 Klasse Klasse 1 3 (PN= (PN= 85,4 %) 79,9 %) 1,11 1,04 1,39 1,06 1,07 1,01 1,07 1,02 1,23 1,16 1,26 1,19 Klasse Klasse 4 2 (PN= (PN= 79,5 %) 79,1 %) 1,04 1,66 1,46 1,50 1,05 2,93 2,93 1,01 1,15 1,14 1,18 1,18 Klasse 1: Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Qualitätsferkel Klasse 2: Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Systemferkel Klasse 3: Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Qualitätsferkel Klasse 4: Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Systemferkel Klasse 5: Mastbetrieb; Erzeuger-Mäster-Direktverkehr Klasse 6: geschlossener Betrieb; kontinuierliche Belegung Klasse 7: geschlossener Betrieb; abteilweise rein-raus PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen Klasse 7 (PN= 70,6 %) 2,82 2,55 1,84 1,74 1,70 1,03 Klasse 5 (PN= 67,5 %) 3,07 2,77 2,00 1,89 1,85 1,09 71 4.6.2.14 Einfluss der Produktionsverfahren auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) Auch die 107 Betriebe sind in 7 verschiedene Produktionsverfahren eingeteilt worden. Tab. 51: Zusammenhang zwischen den Produktionsverfahren und der Intra-HerdenPrävalenz 1 hofweise reinPN raus; Qu.ferkel a, b 0% 0 1-25 % 1 26-50 3 % 51-75 2 % 76-100 11 % Sum17 me 0 3 3 abteilweise reinraus; Qu.ferkel b, c 2 4 Klassen 4 abteilweise reinraus; Systemferkel c 0 0 3 6 3 2 hofweise reinraus; Systemferkel 5 ErzeugerMästerDirektverkehr c 6 geschl. Betrieb; kontinuierlich c 1 2 1 1 7 geschl. Betrieb; abteilweise reinraus a, c 0 7 0 2 3 6 23 2 1 1 3 4 16 6 5 6 6 7 6 46 15 19 7 11 15 23 107 Summe 4 18 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz; a, b, c: mit gleichen Buchstaben gekennzeichnete Klassen zeigen im WILCOXON-Test signifikante Unterschiede (p < 0,05) Mit Hilfe des WILCOXON-Tests sind die einzelnen Produktionsverfahren statistisch geprüft worden. Dabei hat sich gezeigt, dass die Mastbetriebe mit dem abteilweise Rein-Raus-Einstallen von Systemferkeln signifikant höhere Intra-HerdenPrävalenzen aufweisen als Mastbetriebe mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren von Qualitätsferkeln (p < 0,05) und als Mastbetiebe, die mit dem FerkelerzeugerMäster-Direktverkehr arbeiten (p < 0,05), und als geschlossene Betriebe, die sowohl das abteilweise Rein-Raus-Verfahren anwenden wie auch die kontinuierliche Belegung (p < 0,05). Zudem zeigen die Mastbetriebe mit dem hofweise Rein-RausVerfahren von Qualitätsferkeln signifikant höhere Intra-Herden-Prävalenzen als Mastbetriebe, die ihre Qualitätsferkel abteilweise rein-raus einstallen (p < 0,05) und geschlossene Betriebe mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren (p < 0,05). Die Berechnungen für das relative Risiko und das „Odds Ratio“ haben gezeigt, dass z. B. Systemferkel aus Betrieben mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren ein 1,87fach höheres relatives Risiko besitzen, sich mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren, als Ferkel in geschlossenen Betrieben, die ihre Tiere abteilweise rein-raus einstallen. Ebenso steigt die Chance der Systemferkel, sich mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren, in Mastbetrieben, die mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren arbeiten bis zum Faktor 9,49 deutlich an gegenüber den geschlossenen Betrieben, 72 die abteilweise rein-raus einstallen. Weitere Informationen sind der Tabelle 52 zu entnehmen. Tab. 52: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel, sich bei verschiedenen Produktionsverfahren mit Influenzavirus H1N1 zu infizieren Klasse 4 (PN= 89,8 %) Klasse 4 Klasse 1 Klasse 6 Klasse 2 Klasse 5 Klasse 7 Klasse 3 1,18 1,44* 1,44 1,53* 1,87* 1,86* Klasse Klasse 1 6 (PN= (PN= 76,3 %) 62,6 %) 2,74 5,24* 1,91 1,22 1,22 1,00 1,30 1,06 1,59* 1,30 1,58* 1,30 Klasse Klasse 2 5 (PN= (PN= 62,3 %) 55,6 %) 5,27 6,14* 1,92 2,24 1,01 1,17 1,16 1,06 1,30 1,23 1,29 1,22 Klasse 7 (PN= 48,9 %) 9,49* 3,46* 1,81 1,80 1,55 0,99 Klasse 1: Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Qualitätsferkel Klasse 2: Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Systemferkel Klasse 3: Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Qualitätsferkel Klasse 4: Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Systemferkel Klasse 5: Mastbetrieb; Erzeuger-Mäster-Direktverkehr Klasse 6: geschlossener Betrieb; kontinuierliche Belegung Klasse 7: geschlossener Betrieb; abteilweise rein-raus PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen *: Beziehungen, in denen zuvor signifikante Unterschiede statistisch berechnet werden konnten Klasse 3 (PN= 46,0 %) 9,39* 3,43* 1,79 1,78 1,53 0,99 73 4.6.2.15 Einfluss der Produktionsverfahren auf Infektionen mit Influenzavirus A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) Tab. 53: Zusammenhang zwischen den Produktionsverfahren und der Intra-HerdenPrävalenz PN 0% 1-25 % 26-50 % 51-75 % 76-100 % Summe 3 abteilweise reinraus; Qu.ferkel Klassen 4 abteilweise reinraus; Systemferkel 6 7 2 hofweise reinraus; Systemferkel a 9 3 8 8 3 2 0 1 hofweise reinraus; Qu.ferkel 5 ErzeugerMästerDirektverkehr 6 geschl. Betrieb; kontinuierlich a 7 geschl. SumBetrieb; me abteilweise reinraus 2 4 5 3 4 6 10 6 44 37 1 1 1 1 4 13 1 1 0 0 3 2 7 1 0 1 0 2 1 1 6 17 15 19 7 11 15 23 107 PN: scheinbare Intra-Herden-Prävalenz; a: mit gleichem Buchstaben gekennzeichnete Klassen zeigen im WILCOXON-Test signifikante Unterschiede (p < 0,05) Bei der Überprüfung des Einflusses der Produktionsverfahren auf die Intra-HerdenPrävalenz (Tabelle 53) ergeben sich signifikante Unterschiede zwischen den Ferkeln in geschlossenen Betrieben mit kontinuierlicher Belegung und den Systemferkeln, die hofweise rein-raus eingestallt werden (p < 0,05). Die Auswertung verdeutlicht, dass die Ferkel in geschlossenen Betrieben mit kontinuierlicher Belegung signifikant höhere Intra-Herden-Prävalenzen aufweisen als die Systemferkel in den Mastbetrieben mit hofweisem Rein-Raus-Verfahren. Die Chance, dass sich die Ferkel in geschlossenen Betrieben mit kontinuierlicher Belegung mit Influenzavirus H3N2 infizieren, steigt um den Faktor 2,70 im Vergleich zu den Systemferkeln in Betrieben mit hofweiser Rein-Raus-Einstallung. Genauso sind die Ferkel in den geschlossenen Betrieben mit kontinuierlichem Einstallungsverfahren einem 3,28fach höherem relativen Risiko ausgesetzt, sich mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren, als Systemferkel in den Betrieben, die hofweise ein- und ausgestallt werden (siehe auch Tabelle 54). 74 Tab. 54: Relatives Risiko (unten links) und „Odds Ratio“ (oben rechts) für Ferkel sich bei verschiedenen Produktionsverfahren mit Influenzavirus H3N2 zu infizieren Klasse 6 (PN= 25,6 %) Klasse 6 Klasse 5 Klasse 7 Klasse 1 Klasse 3 Klasse 2 Klasse 4 1,01 1,42 1,56 1,69 2,70* 2,27 Klasse Klasse 5 7 (PN= (PN= 23,9 %) 18,6 %) 1,02 1,56 1,54 1,40 1,54 1,10 1,67 1,19 2,67 1,90 2,24 1,60 Klasse Klasse 1 3 (PN= (PN= 16,1 %) 14,9 %) 1,75 1,93 1,72 1,90 1,12 1,23 1,10 1,09 1,73 1,60 1,46 1,34 Klasse 2 (PN= 9,6 %) 3,28* 3,23 2,10 1,88 1,70 Klasse 4 (PN= 9,4 %) 2,70 2,66 1,73 1,55 1,40 0,82 0,84 Klasse 1: Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Qualitätsferkel Klasse 2: Mastbetrieb; hofweise rein-raus; Systemferkel Klasse 3: Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Qualitätsferkel Klasse 4: Mastbetrieb; abteilweise rein-raus; Systemferkel Klasse 5: Mastbetrieb; Erzeuger-Mäster-Direktverkehr Klasse 6: geschlossener Betrieb; kontinuierliche Belegung Klasse 7: geschlossener Betrieb; abteilweise rein-raus PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen *: Beziehung, in der zuvor ein signifikanter Unterschied statistisch berechnet werden konnte 4.7 Beziehung zwischen Lungenbefundung und dem jeweiligen Testsystem für M. hyopneumoniae und den beiden Influenzavirus Subtypen (H1N1 und H3N2) 4.7.1 Beziehung zwischen Lungenbefundung und M. hyopneumoniae-Antikörpernachweisen Von den 1392 serologisch mit dem Bommeli II Testsystem untersuchten Tieren sind auf den Schlachthöfen 84 Lungenbefundungen durchgeführt worden. Hier soll nun geprüft werden, ob eine Beziehung zwischen den Pneumonie- bzw. Pleuritisgraden und der Anzahl sero-positiver Reagenten vorliegt. Sero-positiv heißt in diesem Fall, dass die Tiere in der serologischen Untersuchung Extinktionswerte >20 % aufweisen. Bei 66 der 84 Tiere (78,6 %) wurde eine mindestens geringgradige Lungenveränderung vorgefunden. 17 Tiere aus dem gleichen Pool (20,2 %) zeigten Anzeichen einer Pleuritis. 75 Tab. 55: Anzahl der M. hyopneumoniae-seropositiven und -negativen Reagenten in Bezug zum Pneumoniegrad Pneumoniegrad 0 1 2 3 Summe seropositiv 13 39 23 4 79 seronegativ 2 3 0 0 5 Summe 15 42 23 4 84 Die statistische Auswertung der Tabellen 55 und 56 mittels dem „exakten Test“ nach Fischer weist keine signifikanten Zusammenhänge zwischen den Seroreagenten und dem Pneumoniegrad bzw. dem Pleuritisgrad auf (p>0,05). Tab. 56: Anzahl der M. hyopneumoniae-seropositiven und -negativen Reagenten in Bezug zum Pleuritisgrad Pleuritisgrad 0 1 2 3 Summe seropositiv 62 7 6 4 79 seronegativ 5 0 0 0 5 Summe 67 7 6 4 84 4.7.2 Beziehung zwischen Lungenbefundung und Influenzavirus H1N1Antikörpernachweisen 2057 Schweine sind serologisch mit dem Hämagglutinationshemmungstest auf Antikörper gegen Influenzavirus H1N1 untersucht worden. Von 237 Tieren dieser Gruppe war eine Lungenbefundung auf dem Schlachthof vorgenommen worden. Auch hier soll nun geprüft werden, ob eine Beziehung zwischen den Pneumoniebzw. Pleuritisgraden und der Anzahl seropositiver Reagenten nachgewiesen werden kann. Tab. 57: Anzahl der Influenza H1N1-seropositiven und -negativen Reagenten in Bezug zum Pneumoniegrad Pneumoniegrad 0 1 2 3 Summe seropositiv 40 71 27 7 145 seronegativ 22 44 19 7 92 Summe 62 115 46 14 237 Mittels dem „exakten Test“ nach Fischer konnte keine Beziehung zwischen den seropositiven Reagenten und dem Pneumoniegrad (Tabelle 57) bzw. zwischen den seropositiven Reagenten und dem Pleuritisgrad (Tabelle 58) festgestellt werden (p>0,05). 76 Tab. 58: Anzahl der Influenzavirus H1N1-seropositiven und -negativen Reagenten in Bezug zum Pleuritisgrad Pleuritisgrad 0 1 2 3 Summe seropositiv 119 8 11 7 145 seronegativ 70 11 6 5 92 Summe 189 19 17 12 237 4.7.3 Beziehung zwischen Lungenbefundung und Influenzavirus H3N2Antikörpernachweisen Hier wurden Blutproben von 2756 Mastschweinen serologisch mit dem Hämagglutinationshemmungstest auf Antikörper gegen Influenzavirus H3N2 untersucht. Auch von diesen Tieren konnten von 237 Schweinen auf dem Schlachthof Lungenbefundungen durchgeführt werden. Tab. 59: Anzahl der Influenzavirus H3N2-seropositiven und -negativen Reagenten in Bezug zum Pneumoniegrad Pneumoniegrad 0 1 2 3 Summe seropositiv 15 36 8 4 63 seronegativ 47 79 38 10 174 Summe 62 115 46 14 237 Die statistische Bearbeitung der Tabellen 59 und 60 mit Hilfe des „exakten Tests“ nach Fischer zeigt keinen Zusammenhang zwischen den seropositiven Reagenten und dem Pneumoniegrad bzw. zwischen den seropositiven Reagenten und dem Pleuritisgrad auf (p>0,05). Tab. 60: Anzahl der Influenzavirus H3N2 seropositiven und -negativen Reagenten in Bezug zum Pleuritisgrad Pleuritisgrad 0 1 2 3 Summe seropositiv 53 3 3 4 63 seronegativ 136 16 14 8 174 Summe 189 19 17 12 237 77 4.8 Geographische Verteilung einzelner Erreger respiratorischer Erkrankungen bei Mastschweinen Von 96 der 106 untersuchten Betriebe sind die Adressen bzw. mindestens der Wohnort bekannt, so dass in diesen Beständen die räumliche Verteilung der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen von M. hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) nach POPPE (1997) und den beiden Influenzastämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) nach SCHENK (2000) kartographisch dargestellt werden kann. 4.8.1 Geographische Verteilung von M. hyopneumoniae Abb. 8: Räumliche Verteilung der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz von M. hyopneumoniae in den bekannten Betrieben Zeichenerklärung: Kreuze: • rot: PN = 76-100 % • Orange: PN = 51-75 % • grün: PN = 26-50 % • blau: PN = 1-25 % • schwarz: PN = 0 % PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen In den Randbereichen der Erzeugergemeinschaften und Höhenzügen der Waldgebiete befinden sich mehr grüne, blaue und schwarze Kreuze. Direkt in der Nähe der schwarzen Kreuze liegen „rote Betriebe“. Die nähere Aufschlüsselung dieser Betriebe ergibt folgendes: 78 1. Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 0 % Zwei der drei Betriebe weisen 700 Mastplätze auf, einer davon liegt in der Ortschaft Glandorf. Der 3. Bestand hat eine Größe von 500 Mastplätzen. Allen 3 Betrieben gemeinsam ist das Arbeiten mit dem Einstallungsverfahren: abteilweise Rein-Raus. 2. Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 1-25 % Die Größenordnung dieser 7 Betriebe liegt zwischen 400 und 750 Mastplätze. Es handelt sich hier entweder um geschlossene Betriebe mit abteilweise Rein-RausVerfahren oder um Mastbetriebe mit Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehr. 3. Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 26-50 % Alle 4 Bestände sind Mastbetriebe mit 350-500 Mastplätze. Die beiden Betriebe in Ankum und Bad Rothenfelde mästen Systemferkel - die beiden anderen Qualitätsferkel. Der Betrieb in Dissen arbeitet mit dem Einstallungsverfahren abteilweise Rein-Raus, die übrigen mit dem hofweise Rein-Raus-Verfahren. 79 4.8.2 Geographische Verteilung von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) Abb. 9: Räumliche Verteilung der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) in den bekannten Betrieben Zeichenerklärung: Kreuze: • rot: PN = 76-100 % • orange: PN = 51-75 % • grün: PN = 26-50 % • blau: PN = 1-25 % • schwarz: PN = 0 % PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen Die schwarzen Kreuze befinden sich im nördlichen Randbereich des Wiehengebirges. Die blauen Kreuze liegen im Bereich der beiden bewaldeten Höhenzüge und im Randbereich der Erzeugergemeinschaft. Dies sind: 1. Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 0 % Es handelt sich hierbei um 3 Betriebe mit 300-600 Mastplätzen. Die verwendeten Einstallungsformen sind entweder hofweise Rein-Raus (ein Betrieb in Bohmte) oder abteilweise Rein-Raus. 2. Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 1-25 % Diese 3 Betriebe liegen in einer Größenordnung von 350-500 Mastplätzen. Allen 3 gemeinsam ist das Arbeiten mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren. 80 4.8.3 Geographische Verteilung des Influenzastammes A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) Abb. 10: Räumliche Verteilung der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz von A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) in den bekannten Betrieben Zeichenerklärung: Kreuze: • rot: PN = 76-100 % • orange: PN = 51-75 % • grün: PN = 26-50 % • blau: PN = 1-25 % • schwarz: PN = 0 % PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen Die schwarzen Kreuze sind in den Randbereichen der Erzeugergemeinschaften angesiedelt. Im besonderen handelt es sich um folgende Betriebe: 1. Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 0 % Die Größenordnung der 3 Mastbetriebe, von denen mir Betriebsdaten vorliegen, liegt zwischen 600 und 900 Mastplätzen. Der Mastbetrieb in Bissendorf bezieht seine Ferkel direkt vom Erzeuger, die beiden anderen Betriebe in Bohmte und Melle mästen Qualitätsferkel im abteilweise Rein-Raus-Verfahren. 81 4.8.4 Geographische Verteilung des Influenzastammes A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) Abb. 11: Räumliche Verteilung der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz von A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) in den bekannten Betrieben Zeichenerklärung: Kreuze: • rot: PN = 76-100 % • orange: PN = 51-75 % • grün: PN = 26-50 % • blau: PN = 1-25 % • schwarz: PN = 0 % PN: Mittelwerte der scheinbaren Intra-Herden-Prävalenzen Hier nun befinden sich die roten und orangen Kreuze in der Minderheit. Sie liegen im wesentlichen in den Randbereichen der Erzeugergemeinschaften. Aufgeschlüsselt sind dies: 1. Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 51-75 % Von den 5 Betrieben verfügen 4 über 450-600 Mastplätze, der 5. Betrieb in Fürstenau gelegen arbeitet mit 1000 Mastplätzen. Die verwendeten Produktionsverfahren sind in den 2 Mastbetrieben in Georgsmarienhütte und in Fürstenau das abteilweise Rein-Raus von Qualitätsferkeln und das hofweise ReinRaus von Systemferkeln und in den 3 geschlossenen Betrieben die kontinuierliche Belegung und das abteilweise Rein-Raus-Verfahren. 82 2. Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 76-100 % Von den 4 Betrieben mit vorliegenden Betriebsdaten mästen 3 zwischen 360 und 800 Schweine und der Betrieb in Hunteburg mästet 1100 Schweine pro Mastdurchgang. Die beiden Betriebe in Melle und Hunteburg arbeiten mit dem Erzeuger-Mäster-Direktverkehr, der Betrieb in Bad Iburg benutzt das hofweise ReinRaus-Verfahren von Qualitätsferkeln und der Betrieb in Glandorf ist ein geschlossener Betrieb mit abteilweise Rein-Raus-Verfahren. 4.9 Vergleich der Epidemiologie von M. hyopneumoniae mit denen von Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) nach POPPE (1997) und den beiden Influenzastämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) nach SCHENK (2000) Tab. 61: Scheinbare Intra-Herden-Prävalenz (%) und scheinbare Herden-Prävalenz (%) von M. hyopneumoniae, A. pp., Influenzavirus H1N1 und Influenzavirus H3N2 scheinbare Intra-HerdenPrävalenz (%) scheinbare HerdenPrävalenz (%) M. hyo. A. pp. H1N1 H3N2 81,25 63,56 58,73 13,06 97,17 96,32 96,32 61,03 Bei dem Vergleich dieser 4 Erreger respiratorischer Erkrankungen liegt die scheinbare Intra-Herden-Prävalenz von M. hyopneumoniae mit 81 % am höchsten und die des Influenzastammes H3N2 mit 13 % am niedrigsten. Die scheinbare Herden-Prävalenz beträgt für alle 96-97 % mit Ausnahme von Influenzavirus H3N2, für den sie bei 61 % liegt. Bei der Überprüfung der Einflussfaktoren auf die Intra-Herden-Prävalenz können nur für die Einstallungsform bei A. pp. und für die Produktionsverfahren bei A. pp. und den beiden Influenzastämmen signifikante Unterschiede ermittelt werden. 1. Einstallungsform Nur bei A. pp. weisen die Betriebe mit kontinuierlichem Einstallungsverfahren signifikant höhere wahre Intra-Herden-Prävalenzen auf als die Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren und dem Erzeuger-Mäster-Direktverkehr. 2. Produktionsverfahren Bei A. pp. zeigen die geschlossenen Betriebe nach POPPE (1997) mit kontinuierlicher Einstallung signifikant höhere wahre Intra-Herden-Prävalenzen als die Betriebe, die ihre Ferkel über den Erzeuger-Mäster-Direktverkehr beziehen. Weiterhin besitzen diese geschlossenen Betriebe mit kontinuierlichem Einstallungsverfahren und Mastbetriebe, die sowohl hofweise rein-raus als auch 83 abteilweise rein-raus Qualitätsferkel einstallen signifikant höhere wahre Intra-HerdenPrävalenzen als die geschlossenen Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren. Bei Influenzavirus H3N2 zeigen die geschlossenen Betriebe mit kontinuierlicher Belegung signifikant höhere Intra-Herden-Prävalenzen als Mastbetriebe, die hofweise rein-raus Systemferkel einstallen. Bei Influenzavirus H1N1 weisen Mastbetriebe mit hofweisem Rein-Raus von Qualitätsferkeln signifikant höhere Intra-Herden-Prävalenzen auf, als geschlossene Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren und Mastbetriebe mit abteilweisem Einstallen von Qualitätsferkeln. Außerdem zeigen bei Influenzavirus H1N1 die Mastbetriebe mit abteilweisem ReinRaus von Systemferkeln signifikant höhere Intra-Herden-Prävalenzen als Mastbetriebe mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren von Qualitätsferkeln und als Betriebe, die mit dem Erzeuger-Mäster-Direktverkehr arbeiten und als geschlossene Betriebe, die sowohl mit kontinuierlicher als auch mit dem abteilweise Rein-RausVerfahren arbeiten. Tendenziell zeigt M. hyopneumoniae in geschlossenen Betrieben mit kontinuierlicher Belegung und in Betrieben mit dem hofweise Einstallen von Qualitätsferkeln die höchsten Intra-Herden-Prävalenzen . Die Betriebe, die ihre Ferkel über den Erzeuger-Mäster-Direktverkehr beziehen sowie in geschlossenen Betrieben mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren sind die niedrigsten Intra-Herden-Prävalenzen zu beobachten. 84 5 Diskussion Ziel dieser Arbeit ist ein Vergleich verschiedener Nachweismethoden für Mycoplasma hyopneumoniae, dem Erreger der Enzootischen Pneumonie. Weiterhin folgt die epidemiologische Untersuchung über die Verbreitung von M. hyopneumoniae an 1392 Schlachtschweinen im Weser-Ems Gebiet im Jahre 1996 sowie die Überprüfung einiger Einflussfaktoren auf die Intra-Herden-Prävalenz. Abschließend werden diese Ergebnisse mit den Untersuchungen über zwei Influenzavirusstämme und Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) aus dem gleichen Probenpool von 1996 verglichen. 5.1 Vergleich der serologischen Testsysteme Anhand von 99 Serumproben aus dem Probenpool von 1996 erfolgt ein Vergleich der vier serologischen Testsysteme: DAKO-, Chekit®-Hyoptest I (Bommeli I)-, Chekit®-Hyoptest II (Bommeli II)- und dem TiHo- ELISA. Nach LORENZ (1990) beschreibt die Sensitivität die Fähigkeit eines Tests, ein positives Ergebnis zu erkennen, wenn das untersuchte Tier eine bestimmte Krankheit hat. Wichtig ist dabei, dass die Sensitivität als der Anteil der kranken Tiere mit positivem Testergebnis an der Gesamtheit der getesteten kranken Tiere zu verstehen ist. Eine ungenügende Sensitivität des Tests führt zu falsch-negativen Ergebnissen. Versucht man diese Diagnosen herabzusetzen, so bezahlt man dies meistens mit der Abnahme der Spezifität. Die Spezifität ist die Fähigkeit eines Tests, ein negatives Ergebnis zu liefern, wenn das untersuchte Tier die betreffende Krankheit nicht hat. Die Spezifität wird dabei durch den Anteil der nicht erkrankten Tiere mit negativem Testergebnis an der Gesamtheit der getesteten nicht erkrankten Tiere gemessen. Eine ungenügende Spezifität verursacht falsch-positive Testergebnisse. Auch hier führt eine Verbesserung der Spezifität häufig zu einer Abnahme der Sensitivität. Die exakte Bestimmung der Sensitivität und Spezifität ist schwierig. Ein praktikabler Ausweg besteht darin, diesen Test mit einem anderen diagnostischen Test zu vergleichen. Wichtig ist dabei, dass dessen Qualität bekannt ist und die Sensitivität und Spezifität dieses so genannten „Standards“ Werte nahe bei 100 % haben, denn sonst liegt die Anzahl der falsch-positiven und falsch-negativen Ergebnisse zu hoch. Die meisten Untersuchungen liegen über den DAKO-ELISA vor. SØRENSEN et al. (1997) haben für diesen ELISA auf individuellem Niveau eine Sensitivität von 98-100 % anhand der Proben von experimentell infizierten Schweinen und eine Spezifität von 93-100 % mit Hilfe der Proben von SPF-Kontrolltieren ermittelt. Daher wurde er hier als der „Golden Standard“ gewählt. Eine Berechnung von Sensitivität und Spezifität des DAKO-ELISAs für chronisch infizierte Schweine ist der Literatur nicht zu entnehmen. Internen Untersuchungen der Firma Intervet zufolge, liegt nach Schelp2 die Spezifität des Bommeli II-ELISAs in negativen Herden bei 97,2 % und die Sensitivität in akut infizierten Herden bei ca. 93 %, in chronisch infizierten Beständen bei ca. 13 %. Es ist wahrscheinlich, dass sich der DAKO-ELISA mit Proben aus chronischen Infektionsstadien ähnlich verhält, deshalb ist dies auch hier die 2 Persönliche Mitteilung von Dr. Chr. Schelp vom 27.06.03 85 eigentliche Sensitivität, mit der wir rechnen müssen. Das beinhaltet jedoch eine hohe Anzahl falsch-negativer Ergebnisse in den eigenen Untersuchungen (siehe oben). Laut Statistik sind verglichen mit dem DAKO-ELISA als „Golden Standard“ der Bommeli I- und der TiHO-ELISA schlechter. Nur der Bommeli II-ELISA liefert ähnlich gute Ergebnisse wie der DAKO-ELISA, trotz der geringen Übereinstimmung der Testergebnisse von nur 16 %. Für das Zustandekommen der unterschiedlichen Ergebnisse der hier geprüften vier Testsysteme könnten folgende Gründe eine Rolle gespielt haben: erdünnungsstufen der Seren und die Probenvolumina sind (ausgenommen DAKO- und Bommeli II-ELISA) nicht einheitlich (siehe Tabelle 62). oder polyklonale Antikörper (ausgenommen DAKO- und Bommeli II-ELISA, siehe Tabelle 62). Schlachtung zugeführt wurden. Anzunehmen ist dabei, dass es sich bei den positiven Tieren in erster Linie um Trägertiere oder chronisch infizierte Tiere handelte, die somit per se niedrige Antikörper-Titer aufweisen. Demzufolge sind also die Schwellenwerte oder Grenzwerte für die Detektion der Antikörper der vier Testsysteme unterschiedlich hoch. Wie die Ergebnisse zeigen, ist es nicht möglich mit einem ELISA als „Golden Standard“ andere serologische Testsysteme in den chronischen Stadien von M. hyopneumoniae-Infektionen zu vergleichen. Dies liegt daran, dass mit Sicherheit auch der DAKO-ELISA bei chronisch infizierten Tieren eine erhebliche Sensitivitätsabnahme aufweist. Hinzu kommt, dass all diese Testsysteme als Herdentests konzipiert sind und somit Vergleiche von Testergebnissen an einzelnen Probanden problematisch sind. Tab. 62: Verdünnungsstufen, Probenvolumina und Konjugate der 4 Testsysteme Testsystem ProbenVerdünnung DAKO 1:10 BO I 1:100 BO II 1:10 TiHo 1:10 DAKO BO I BO II TiHo Probenvolumen Konjugat Peroxidase anti Schwein monoklonal Peroxidase Protein A polyklonal Peroxidase anti Schwein monoklonal Peroxidase anti Schwein polyklonal = DAKO Mykoplasma hyopneumoniae-ELISA = Chekit®-Hyoptest I-ELISA = „ „ II-ELISA = TiHo-ELISA Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass sich die vier serologischen Testsysteme nach wie vor nur für die Herdendiagnostik, nicht aber für die 86 Einzeltierdiagnostik eignen. Außerdem ist zu vermuten, dass diese Tests für die Diagnostik von chronisch infizierten Herden, die weltweit den Hauptanteil der Herden in der Welt ausmachen (ARMSTRONG 1994), nicht zuverlässig sind. 5.2 Vergleich der Serologie mit dem Immunfluoreszenztest und der Kultur Vergleichende Untersuchungen an 111 Lungenschnitten mit dazugehörenden Serumproben zeigen keinen Zusammenhang zwischen den Ergebnissen der beiden Testmethoden: Bommeli II-ELISA und indirekter Immunfluoreszenz. Auf die Einschränkungen bei der Beurteilung von ELISA-Ergebnissen bei chronischen Fällen von M. hyopneumoniae wurde im vorangegangen Kapitel hingewiesen. Die Sensitivität des Immunfluoreszenztests hängt im wesentlichen vom verwendeten Antiserum ab. Das hier verwendete M. hyopneumoniae-Antiserum stammte aus dem Institut für Mikrobiologie und Tierseuchen der Tierärztlichen Hochschule Hannover aus eigener Herstellung. Eine gewisse Kreuzreaktion mit M. hyorhinis kann nicht ganz ausgeschlossen werden. In den eigenen Untersuchungen diente der Schnitt mit M. hyorhinis-Antiserum als Beispiel für eine positive Reaktion, da Schweine zu einem sehr hohen Prozentsatz mit dieser Mykoplasmenart infiziert sind. Nach MEYLING (1971) wird M. hyorhinis in pneumonischen Lungen von Ferkeln in der gleichen Lokalisation gefunden, die auch für M. hyopneumoniae typisch sind. Auch das Muster der Fluoreszenz ist ähnlich, es sieht aus wie ein glänzender, gelbgrüner Überzug des Bronchialepithels, siehe Abbildung 6, es ist jedoch nicht identisch. Bei M. hyorhinis ist die Fluoreszenz oft reichlicher und manchmal werden auch Herde von Organismen im Alveolargewebe gefunden. Nach SØRENSEN et al. (1997) liegt die Spezifität des Immunfluoreszenztests bei 93100 % bezogen auf die kulturelle Untersuchung als „Golden Standard“. Die Sensitivität beträgt in akuten Stadien der M. hyopneumoniae-Infektion 86-100 % und sinkt in chronischen Stadien (hier gemessen am 85. Tag post infektionem) auf 11-38 % ab. Nach FEENSTRA et al. (1994) könnte die geringere Sensitivität des indirekten Immunfluoreszenztests in chronischen Infektionen an der geringen Anzahl von Mykoplasmen liegen oder an Blocking-Effekten durch lokale Antikörper. In den eigenen Untersuchungen zeigte der Bommeli II-ELISA bezogen auf den Immunfluoreszenztest eine Sensitivität von nur 30 % und eine Spezifität von 75 %. Ein höherer Wert für die Sensitivität wäre eigentlich zu erwarten gewesen. Nach den Ergebnissen von SØRENSEN et al. (1997) sind die positiven ImmunfluoreszenztestErgebnisse diagnostisch signifikant, so dass hier mit großer Sicherheit von einer Besiedelung und Infektion ausgegangen werden kann. Offenbar ist die Antikörperaktivität in diesen chronischen Krankheitsstadien sehr gering und wird mit dem verwendeten ELISA nicht detektiert. Negative Resultate sind aber nicht nur beim ELISA sondern auch beim indirekten Immunfluoreszenztest laut ARMSTRONG et al. (1984), FEENSTRA et al. (1994) und SØRENSEN et al. (1997) aufgrund der unzureichenden Sensitivität nicht verlässlich. Leider ist ein Vergleich der Serologie mit der Kultur nicht möglich gewesen, da in keiner der untersuchten Kulturen M. hyopneumoniae nachgewiesen werden konnte. Die kulturelle Nachweismethode hat sich am wenigsten effizient und praktikabel gezeigt, da allein 53 % der Kulturen durch Kontamination mit anderen Keimen nicht auswertbar gewesen sind. Dies ist wahrscheinlich in erster Linie auf die anspruchsvollen Nährstoffbedingungen des Erregers zurückzuführen (ROSS 1992, 87 ROLLE und MAYR 1993, 2002) und die schwierigen Kultivierungsbedingungen (WHITTLESTONE 1979, 1990). In 5 der 26 auswertbaren Kulturuntersuchungen wurden M. hyorhinis bzw. andere Mykoplasma species nachgewiesen. Speziell M. hyorhinis könnte anhand der schnelleren Adaptierung an das künstliche Medium durch Überwucherung den Nachweis von M. hyopneumoniae verhindert haben (L’ECUYER and BOULANGER 1970, WHITTLESTONE 1979). 5.3 Vergleich der Serologie und des Immunfluoreszenztests mit der Sektion VAN AKEN und GEERTS haben in ihren 1992 vorgenommenen Forschungsarbeiten keine eindeutige Beziehung zwischen der Anwesenheit von M. hyopneumoniaeAntikörpern und der Pneumonie-Inzidenz bei wachsenden bzw. pneumonischen Läsionen bei Schlachttieren gefunden. Übereinstimmend mit diesen beiden Autoren konnte bei den eigenen Untersuchungen eine Korrelation zwischen den ELISATestergebnissen und den Lungenveränderungen der Schweine unterschiedlichen Alters nicht festgestellt werden. Dagegen haben YAGIHASHI et al. (1993) in Schlachtschweinen eine Korrelation zwischen Seropositivität und dem Vorliegen von Lungenveränderungen gefunden, der ELISA-Wert korrelierte jedoch nicht mit dem Grad der Lungenveränderungen. Mögliche Gründe für das Vorliegen von Lungenläsionen ohne positiven AntikörperTiter könnten sein: stimuliert nur die Produktion von niedrigen Antikörper-Titern und diese sind dann wegen einer unzureichenden Sensitivität des Testsystems nicht detektierbar. -Antwort neigt sich dem Ende zu und damit folgt eine Abnahme der Antikörper-Aktivität unterhalb des positiven Grenzbereichs des Testsystems. M. hyopneumoniae ist schon aus der Lunge entfernt worden, hierdurch erfolgt eine Abnahme der Antikörper-Aktivität und Sekundärerreger sind für ein Fortbestehen der Lungenläsionen verantwortlich. Lokalisation relativ charakteristisch für die Enzootische Pneumonie sind, andere Erreger, wie z. B. Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida oder Bordetella bronchiseptica, ähnliche pneumonische Veränderungen hervorrufen können (PLONAIT 1988, KOBISCH und TILLON 1989, SØRENSEN et al. 1997, SIEVERDING 2000). Mögliche Ursachen für das Auffinden von Antikörpern ohne pathomorphologische Lungenveränderungen könnten sein: Läsionen hervorzurufen. Nach RUNNELS (1988) ist der Immunfluoreszenztest an verändertem Gewebe der verlässlichste diagnostische Test zur Auffindung von M. hyopneumoniae-Infektionen. Auch in den eigenen Untersuchungen zeigt sich der Immunfluorstenztest im Vergleich zum Bommeli II-ELISA an typisch verändertem Lungengewebe in Form von chronischen Lungenspitzenlappenveränderungen mit Pneumonie überlegen. 88 Hier liegt ein deutlicher signifikanter Unterschied zwischen den beiden Testmethoden vor. 5.4 Epidemiologische Studie Anhand der 1392 Serumproben von Mastschweinen aus 106 Betrieben zweier Erzeugergemeinschaften ist die Intra-Herden-Prävalenz als der Anteil der mit M. hyopneumoniae infizierten, test-positiven Tiere in einer Herde sowie daraus folgend die Herden-Prävalenz der 106 Betriebe gemessen worden. Wie aus den vorangegangen Ausführungen hervorgeht, ist die Sensitivität und Spezifität des verwendeten ELISAs weit von 100% entfernt. Die mit diesem Testsystem ermittelte Prävalenz ist aufgrund der geringen Sensitivität des ELISAs sicherlich zu niedrig geschätzt. Da die Sensitivität und Spezifität des ELISAs im chronischen Stadium der Infektion nicht genau bekannt ist, konnte die Prävalenzschätzung nicht korrigiert werden. Der hier beobachtete Anteil der serologisch-positiven Schweine an der Gesamtheit getesteter Tiere ist die scheinbare Prävalenz. Den eigenen Untersuchungen zufolge liegt der Durchseuchungsgrad innerhalb der untersuchten 106 Betriebe bei 81,25 %. Aus der Literatur liegen in Belgien IntraHerden-Prävalenzen von 76 % (MAES et al. 2000) vor. Im Süd-Osten Norwegens variiert die Intra-Herden-Prävalenz nach FALK und LIUM (1991) in Herden mit subklinischen bis moderaten respiratorischen Problemen und in Herden mit schweren respiratorischen Problemen zwischen 21 und 83 %. Der hier gemessene Wert für die Herden-Prävalenz der 106 Betriebe aus Niedersachsen beträgt 97,17 %. Da auch HORST et al. (1997) eine relativ hohe Herden-Prävalenz von 84,36 % für die Mastbestände in Niedersachsen ermittelt haben, kann somit die hohe Infektionsrate deutscher Schweinebestände (BERNER 1995, PFÜTZNER und BLAHA 1995) bestätigt werden. Auch in Belgien liegt nach MAES et al. (1999) eine mit 88 % hohe Herden-Prävalenz vor. Diese hohe M. hyopneumoniae-Prävalenz zieht sich über den gesamten Schweinegürtel im Nordwesten des europäischen Festlands von Weser-Ems über Holland, Belgien bis nach Frankreich. In weniger mit Schweinen besetzten Gebieten wie z.B. in Skandinavien sind die Prävalenzen deutlich geringer. In Dänemark haben SØRENSEN et al. (1992b) eine Herden-Prävalenz von 30 % ermittelt und im Westen Finnlands, in der Provinz von Vaasa, hat sie 1998 nach RAUTIAINEN 39 % betragen. Der 2. Teil der epidemiologischen Studie beinhaltet die Untersuchung einiger Einflussfaktoren auf die Verbreitung von M. hyopneumoniae. Da die Aufstallungsform und das Hygieneregime von 83 der 106 untersuchten Betriebe bekannt waren, wurde versucht, die Risiken der verschiedenen Managementsysteme bezüglich der Verbreitung von M. hyopneumoniae miteinander zu vergleichen. Für die Anzahl der Mastplätze pro Betrieb, die Betriebsform (Unterscheidung zwischen geschlossenen Betrieben und Mastbetrieben), die Einstallungsform (kontinuierlich, hofweise rein-raus, abteilweise rein-raus und Erzeuger-MästerDirektverkehr mit unbekannter Einstallungsform), die Ferkelherkunft (eigene Ferkel, Systemferkel, Qualitätsferkel und Ferkel des Erzeuger-Mäster-Direktverkehrs) sowie für die 7 Produktionsverfahren (hofweise rein-raus bzw. abteilweise rein-raus von 89 Qualitätsferkeln bzw. Systemferkeln, Erzeuger-Mäster-Direktverkehr und Aufteilung der geschlossenen Betriebe in die mit kontinuierlicher Belegung und die mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren) in Bezug auf die Intra-Herden-Prävalenz haben sich statistisch keine signifikanten Unterschiede ergeben. Tendenziell lässt sich aber sagen, dass geschlossene Betriebe mit kontinuierlicher Belegung sowie Betriebe mit hofweisem Rein-Raus von Qualitätsferkeln aus zahlreichen Herkünften die höchsten Intra-Herden-Prävalenzen aufweisen. Die niedrigsten Prävalenzen weisen die Betriebe mit Ferkelerzeuger-MästerDirektverkehr und geschlossene Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren auf. Die Berechnungen des relativen Risikos und der „Odds Ratio“ für die einzelnen Einflussgrößen spiegeln diese Tendenzen wieder. So zeigt sich z. B., dass für geschlossene Betriebe mit kontinuierlicher Belegung das relative Risiko, sich mit M. hyopneumoniae zu infizieren, um das 1,28fache höher ist als in Mastbetrieben mit Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehr. Die Chance steigt dabei um den Faktor 3,07, dass die Ferkel sich tatsächlich mit M. hyopneumoniae infizieren. Die Gründe für das schlechte Abschneiden der zwei obengenannten Produktionsverfahren sind folgende: Erwerben die Mäster ihre Ferkel von verschiedenen Ferkelerzeugern, so liegt es in der Natur der Sache, dass diese sogenannten Qualitätsferkel über einen sehr uneinheitlichen Immunstatus verfügen und sich sozusagen von allen Seiten mit einer Flut neuer auf sie einstürmender Antigene in Form von Krankheitserregern von subklinisch infizierten Schweinen oder rekonvaleszenten Tieren, die aber noch ausscheiden, auseinandersetzen müssen. Ähnliches gilt für die Betriebe mit kontinuierlicher Belegung. Hier wird durch die kontinuierliche Einstallung naiver Ferkel zu den älteren Tieren auf die jungen ein sehr hoher Infektionsdruck ausgeübt. Nach erfolgter Infektion kommt es zu einer massiven Vermehrung und Ausscheidung der Erreger und dadurch auch zur Übertragung auf bisher nicht infizierte Tiere. Hierdurch kommen die hohen Intra-Herden-Prävalenzen zustande. Der Vorteil des Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehrs liegt in dem einheitlichen Immunstatus der Ferkel, da sie ja sinngemäß alle aus dem gleichen Stall kommen, begründet. Die Möglichkeit einer gesteigerten Ansteckung wird dadurch ausgeschlossen. Gleiches gilt für die geschlossenen Betriebe, die mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren arbeiten, d.h. auch sie halten eine strikte Trennung der Altersklassen aus seuchenhygienischen Gründen ein. Da es sich hier aber um Tendenzen (die Tabellen 38 und 50 zeigen immerhin, dass „Odds Ratios“ bis zum Faktor 3 möglich sind) und nicht um statistisch abgesicherte Fakten handelt, scheinen die Managementsysteme, im Gegensatz zu den Untersuchungen anderer Autoren wie DONE (1996), ROSS (1999) und RAUTIAINEN et al. (2001), zumindest im Weser-Ems-Gebiet, nicht zu den entscheidenden Faktoren für die Verbreitung von M. hyopneumoniae zu gehören. Die Unterschiede zwischen den Haltungsformen sind hier wahrscheinlich deshalb so gering, weil nahezu alle Bestände infiziert sind (siehe Herden-Prävalenz der untersuchten 106 Betriebe) und aufgrund der insgesamt hohen Schweinedichte im Nord-Westen Deutschlands. Nach STÄRK et al. (1992) sowie DONE (1996) gehört eine hohe Schweinedichte im Bestand bzw. in der Region zu den prädisponierenden Faktoren für die generelle Verbreitung von M. hyopneumoniae. Die Größe und die Entfernung des nächsten infizierten Nachbarbetriebes stellt dabei ein besonderes Infektionsrisiko dar. Weiterhin tragen auch das oft feucht-kalte Wetter im Norden Deutschlands, die Möglichkeit der Luftübertragung über mehrere Kilometer, der Zukauf subklinisch infizierter Tiere und v. a. der Tiertransport (GOODWIN 1985, STÄRK et al. 1992, MAES et al. 2000, HEGE et al. 2002) zu der weiten Verbreitung 90 von M. hyopneumoniae im Weser-Ems Gebiet bei. Nach BESKOW et al. (1998) scheint dabei die Schnelligkeit der Ausbreitung einer Mykoplasmeninfektion eher von dem Antikörperstatus der Ferkel bei der Einstallung abhängig zu sein als z. B. vom Stallklima. Diese These unterstützt wiederum die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen, d.h. bei M. hyopneumoniae laufen die Infektionen wahrscheinlich früher ab als z.B. bei A. pp. Dies ist ein deutlicher Unterschied zu den Ergebnissen von POPPE (1997). Aber auch tendenzielle Ähnlichkeiten (siehe unter 5.7, Seite 91) liegen vor. VICCA und Mitarbeiter (2002a,b) haben das Infektionsmuster von M. hyopneumoniae anhand von fünf klinisch infizierten Herden mit guten und fünf subklinisch infizierten Herden mit schlechten Haltungsund Managementbedingungen untersucht. Sie haben herausgefunden, dass die Seroprävalenzen in den klinisch infizierten Herden höher gewesen sind und dass sich die meisten Schweine dort in einem jüngeren Alter mit M. hyopneumoniae angesteckt haben. Weiterhin haben diese Herden einen signifikant höheren Hustenund Lungenläsionen-score sowie eine intensivere Immunfluoreszenz und histopathologische Veränderungen der Lungen im Vergleich zu den subklinisch infizierten Herden gezeigt. Die Autoren schließen daraus, dass nicht die Haltungsund Managementbedingungen das Infektionsmuster dieses Bakteriums und den klinischen Verlauf der Infektion hauptsächlich bestimmen, sondern die ziemlich hohe Variation der Virulenz zwischen den Feldisolaten. Als möglichen Virulenzmarker haben sie ein 5000 bp Fragment vorgestellt. Auch die Untersuchung der Virulenz der Feldisolate im Weser-Ems Gebiet könnte noch mehr Aufschluss über die Epidemiologie von M. hyopneumoniae bringen. 5.5 Lungenbefundung Auf individueller Basis konnten keine Beziehungen zwischen den Pneumonie- bzw. Pleuritisgraden der insgesamt 84 befundeten Lungen und der Anzahl seropositiver Reagenten hergestellt werden. Auf Herdenbasis besteht logischerweise eine enge Korrelation von r = 0,83 zwischen den seropositiven Reagenten und den durchschnittlichen Extinktionswerten im ELISA der untersuchten Bestände. Anzumerken ist, dass auch bei hohen Extinktionswerten im ELISA nicht zwangsläufig die für eine M. hyopneumoniae-Infektion charakteristischen pathologischen Lungenbefunde erwartet werden dürfen (siehe auch unter 5.3, Seite 87). BERTSCHINGER et al. (1972) sowie ARMSTRONG et al. (1984) kommen in ihren Untersuchungen zu dem Schluss, dass die makroskopische Lungenuntersuchung als alleinige Methode zum Ausschluss der Enzootischen Pneumonie nicht genügt. Bei den eigenen Untersuchungen lagen für diese Frage zu wenig pathologisch unveränderte Lungen (n=15) und zu wenig seronegative Reagenten (n=2) vor. 5.6 Geographische Verteilung von M. hyopneumoniae Von 96 der 106 untersuchten Betriebe wurde die räumliche Lage im Weser-Ems Gebiet festgestellt und in Beziehung zur scheinbaren Intra-Herden-Prävalenz des jeweils untersuchten Erregers gesetzt. Da die Proben von Mitarbeitern des Veterinäramtes des Landkreises Osnabrück auf den Schlachthöfen im Landkreis entnommen worden waren, liegen die meisten Betriebe im Landkreis Osnabrück 91 bzw. in den angrenzenden Gebieten. Interessanterweise fällt bei M. hyopneumoniae auf, dass sich fast alle Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 0-50 % im SüdOsten des Weser-EmsGebietes konzentrieren. Dies könnte vielleicht auch an der geographischen Lage liegen, denn betrachtet man z. B. den Raum um Melle, so sieht man, dass sich nördlich von Melle das Wiehengebirge entlang zieht und südwestlich der Teutoburger Wald, sozusagen als natürliche Barriere für M. hyopneumoniae. Möglicherweise liegen hier auch andere Handelsstrukturen als weiter nördlich vor. Die Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 0-25 %, die entweder mit dem abteilweise Rein-Raus-Verfahren oder dem FerkelerzeugerMäster-Direktverkehr arbeiten, liegen in den Randbereichen der Erzeugergemeinschaften bzw. in den Höhenzügen der Waldgebiete in eher isolierter Lokalisation. Hier ist aber anzumerken, dass die Anzahl der Betriebe mit 11 zu gering ist, um daraus definitive Schlüsse zu ziehen. Aus der Literatur ist jedoch bekannt, dass die Topographie zu den beeinflussenden Faktoren für die Verbreitung von M. hyopneumoniae zählt (STÄRK et al. 1992, DONE 1996). Ein gewisser Schutz vor einer Infektion mit diesem Erreger bilden dabei z. B. Standorte der Betriebe in Hanglagen oder in isolierten Lokalisationen außerhalb einer Gemeinde. 5.7 Vergleich der Epidemiologie von M. hyopneumoniae mit denen von Actinobacillus pleuropneumoniae nach POPPE (1997) und den beiden Influenzavirusstämmen A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) nach SCHENK (2000) Aus dem gleichen Blutprobenpool von insgesamt 136 Betrieben sind serologische Untersuchungen auf Antikörper gegen M. hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) und Influenzaviren der Subtypen A (H1N1) und (H3N2) durchgeführt worden. Die Gesamtstichprobenzahl beträgt dabei für M. hyopneumoniae 1392, für A. pp. 2605, für den Influenzastamm H1N1 2057 und für den Influenzastamm H3N2 2756. Bei den untersuchten Tieren handelte es sich um klinisch gesunde Mastschweine, die der Schlachtung zugeführt wurden. Der Durchseuchungsgrad innerhalb der Betriebe ist bei M. hyopneumoniae mit 81 % am höchsten, es folgen A. pp. mit ca. 64 % und der Influenzastamm H1N1 mit rund 59 %. Für den Influenzastamm H3N2 ist eine Intra-Herden-Prävalenz von 13 % ermittelt worden. Die Herden-Prävalenz liegt für M. hyopneumoniae, A. pp. und für den Influenzastamm H1N1 zwischen 96 und 97 %, für den Influenzastamm H3N2 beträgt sie 61 %. Nur für A. pp. und die beiden Influenzastämme ergeben sich signifikante Beeinflussungen der Produktionsverfahren (für A. pp. auch der Einstallungsform) auf die Intra-Herden-Prävalenz. In Bezug auf A. pp. zeigen sich statistisch gesicherte Vorteile der Managementsysteme: Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehr und geschlossene Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren. Für M. hyopneumoniae geht zumindest die Tendenz auch in diese beiden Richtungen. Bei A. pp. befinden sich die Betriebe mit einer Intra-Herden-Prävalenz von 0-25 % in ähnlichen geographischen Lokalisationen wie die entsprechende Klasse bei M. hyopneumoniae. Bis auf einen Betrieb arbeiten diese alle mit dem Einstallungsverfahren abteilweise Rein-Raus. 92 Zusammenfassend kann festgestellt werden: Für A. pp. scheinen Handel- und Einstallungsformen eine höhere Bedeutung zu haben, als dies bei M. hyopneumoniae der Fall ist. Für den zuletzt genannten Erreger scheinen dagegen natürliche Barrieren für die Ausbreitung bedeutender zu sein (STÄRK et al. 1992, DONE 1996). Für die Bekämpfung des Influenzastammes H3N2 scheinen die Mastbetriebe mit hofweisem Rein-Raus-Belegen von Systemferkeln, statistisch gesehen am geeignetsten zu sein. Die Mastbetriebe, die ihre Systemferkel abteilweise rein-raus einstallen, zeigen ähnlich niedrige Intra-Herden-Prävalenzen, doch ein Unterschied kann statistisch nicht abgesichert werden. Für diese niedrigen Intra-HerdenPrävalenzen des Influenzastammes H3N2 sind die Systemferkel auch mitverantwortlich. Eine Begünstigung dieser Ferkel liegt in ihrem annähernd einheitlichen Immunstatus begründet. Bei dem Influenzastamm H1N1 scheint es komplizierter zu sein. Auf dem ersten Blick scheinen die Produktionsverfahren, die in Bezug auf die Bekämpfungsstrategie mit dem abteilweise Rein-Raus-Belegen von Ferkeln arbeiten, begünstigt zu sein, doch die Betriebe, die mit diesem Verfahren Systemferkel mästen, fallen da ganz heraus. Sie haben sogar signifikant höhere Intra-Herden-Prävalenzen als alle anderen Produktionsverfahren, mit Ausnahme der Betriebe, die ihre Ferkel hofweise einstallen. Da es sich hierbei aber um nur sieben Betriebe handelt, könnte man vermuten, dass sie alle ihre Ferkel von demselben Systemferkelaufzüchter beziehen, was zu überprüfen wäre. Die Influenzavirus H1N1-negativen Betriebe, die abteilweise rein-raus einstallen oder ihre Ferkel direkt vom Erzeuger beziehen, liegen in den Randbereichen der Erzeugergemeinschaften, während beim Influenzavirus H3N2 in den gleichen Randbereichen die Betriebe mit Intra-Herden-Prävalenzen von 50-100 % liegen. Es zeigten sich keine Anhaltspunkte über mögliche Interaktionen zwischen den vier untersuchten Erregern. Auch aus der Literatur sind darüber keine eindeutigen Belege bekannt. Man geht zwar davon aus, dass Virusinfektionen beim Schwein den Lungenschaden initiieren und M. hyopneumoniae die dann folgenden Sekundärinfektionen verstärkt (CLARK 1999, THACKER et al. 1999, OPRIESSNIG und HALBUR 2004). Untersuchungen von THACKER et al. (2001) zeigten jedoch, dass zumindest eine Influenza-Virusinfektion nicht von M. hyopneumoniae potenziert wird. Die Anfälligkeit der Schweine für Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) soll dagegen durch eine M. hyopneumoniae-Infektion verstärkt werden (ROSS und YOUNG 1993). Wenngleich die epidemiologischen Untersuchungen nur Hinweise liefern, lassen sich unter Zuhilfenahme der Literatur einige Empfehlungen für die Bekämpfung der Enzootischen Pneumonie im Norddeutschen Raum ableiten. Anzustreben wäre eine wirksame flächendeckende Impfung über mehrere Jahre, um einen ähnlichen hohen Antikörperstatus der Schweinepopulation zu erreichen. Zur Minimierung der Erregerübertragung sollte das Segregated early weaning (SEW)-Verfahren nach DRITZ et al. (1996) flächendeckend eingesetzt werden. Auf der Basis fester Ferkelerzeuger-Mäster-Beziehungen und konsequentem Rein-Raus-Verfahren könnte eine deutliche Reduktion der Übertragung erzielt werden. Wie die vorliegenden Daten zeigen, würde damit nicht nur die Enzootische Pneumonie 93 sondern auch Actinobacillus pleuropneumoniae und teilweise auch Influenza bekämpft. Voraussetzung wäre aber eine noch konsequentere Änderung der Handels- und Haltungsstrukturen. Wenngleich eine gerichtete flächendeckende Impfung nicht durchgeführt wird, so gehört die Impfung gegen Mycoplasma hyopneumoniae (GANTER et al. 1999) heute zum Standard-Impfprogramm in Ferkelerzeugerbetrieben. Zum Zeitpunkt der Entnahme der hier untersuchten Proben im Jahre 1996 wurden diese Impfungen noch nicht durchgeführt. Es wäre deshalb zu erwarten, dass in wenigen Jahren die Enzootische Pneumonie zurückgedrängt werden kann. Allerdings wäre mit einem koordinierten Vorgehen, das Impfung und Produktionsbedingungen flächendeckend koordiniert, sicherlich mehr zu erreichen. 94 6 Zusammenfassung Elke Hiltermann-Linden Vergleich von Methoden zum Nachweis von Mycoplasma hyopneumoniaeInfektionen beim Schwein sowie epidemiologische Untersuchungen über die Verbreitung der Enzootischen Pneumonie im Weser-Ems Gebiet im Jahre 1996 Ein Vergleich von vier Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) zum Nachweis von Antikörpern gegen Mycoplasma hyopneumoniae, dem Erreger der Enzootischen Pneumonie, wurde an denselben Proben durchgeführt. Die ELISAs, Chekit®-Hypotest I und II nach Dr. Bommeli, DAKO Mycoplasma hyopneumoniae und ein ELISA der Tierärztlichen Hochschule Hannover, die auf individuellem Niveau miteinander verglichen wurden, bestätigten ihre Eignung für die Herdendiagnostik, aber nicht für die Einzeltierdiagnostik. Für das Auffinden chronisch infizierter Tiere sind sie nicht zuverlässig. Ein Zusammenhang zwischen dem indirekten Immunfluoreszenztest (iIFT) und dem Chekit®-Hyoptest II bestand nicht. Auch eine Korrelation zwischen den ELISA-Ergebnissen und den Lungenveränderungen der Schweine lag nicht vor. Aber im Vergleich zum Chekit®-Hyoptest II zeigte sich der iIFT an typisch verändertem Lungengewebe in Form von chronischen Lungenspitzenlappenveränderungen mit Pneumonie überlegen (p< 0,05). Die kulturelle Untersuchung auf M. hyopneumoniae war ineffizient, da allein 53 % der Lungenproben wegen Kontamination mit anderen Keimen nicht auswertbar waren. Das Hauptziel dieser Arbeit war die Erfassung der Verbreitung von M. hyoppneumoniae im nord-westlichen Niedersachsen (Weser-Ems-Gebiet) mit Überprüfung einiger Einflussfaktoren auf die Intra-Herden-Prävalenz. Die serologische Untersuchung von 1392 Blutproben von Schlachtschweinen aus 106 Betrieben aus dem Jahre 1996 erfolgte mittels Chekit®-Hyoptest II. Zu dieser Zeit sind noch keine Impfungen gegen M. hyopneumoniae durchgeführt worden. 97,17 % der untersuchten Betriebe waren hiernach seropositiv mit einem Durchseuchungsgrad innerhalb der Betriebe von 81,25 %. Tendenziell zeigten die geschlossenen Betriebe mit kontinuierlicher Belegung sowie Betriebe mit hofweisem Rein-Raus-Belegen von Qualitätsferkeln aus zahlreichen Herkünften die höchsten Intra-Herden-Prävalenzen. Die niedrigsten Intra-Herden-Prävalenzen konnten die Betriebe mit Ferkelerzeuger-Mäster-Direktverkehr und geschlossene Betriebe mit abteilweisem Rein-Raus-Verfahren aufweisen. Die Veranschaulichung der geographischen Verteilung von M. hyopneumoniae deutete eine Beeinflussung der Topographie auf die Intra-Herden-Prävalenz an. Ein weiteres Ziel war der Vergleich dieser Ergebnisse mit den Untersuchungen über Antikörper gegen Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) nach POPPE (1997) und Influenza A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) und Influenza A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) nach SCHENK (2000) aus dem gleichen Probenpool von 1996 wie die eigenen Proben. Der Durchseuchungsgrad innerhalb der Betriebe war bei M. hyopneumoniae am höchsten. Es folgten A. pp. mit ca. 64 %, Influenza A H1N1 mit rund 59 % und Influenza A H3N2 mit 13 %. Die Herden-Prävalenz lag für M. hyopneumoniae, A. pp. und Influenza A H1N1 zwischen 96 und 97 %, für Influenza A H3N2 betrug sie 61 %. Für A. pp. ergaben sich eine signifikante Beeinflussung der Einstallungsform und 95 signifikante Beeinflussungen der Produktionsverfahren auf die Intra-HerdenPrävalenz (siehe POPPE 1997). Auch für Influenza konnten signifikante Einflüsse der Produktionsverfahren auf die Intra-Herden-Prävalenz festgestellt werden. Abschließend lässt sich sagen, dass mit festen Ferkelerzeuger-Mäster-Beziehungen und einem konsequenten Rein-Raus-Verfahren bei der Belegung der Ställe die Übertragung von M. hyopneumoniae, respektive A. pp. und zum Teil auch von Influenza einschränken lässt. 96 7 Summary Elke Hiltermann-Linden: Comparison of diagnostic assays for Mycoplasma hyopneumoniae infections of pigs and epidemiological investigations about the distribution of Enzootic Pneumonia in the region of Weser-Ems of the year 1996 A comparison of four enzyme linked immunosorbent assays (ELISAs) for the detection of antibodies against Mycoplasma hyopneumoniae, the causative organism of Enzootic Pneumonia, was carried out using the same samples. The ELISAs Chekit®-Hyoptest I und II by Dr. Bommeli, DAKO Mycoplasma hyopneumoniae and the ELISA established by the University of veterinary medicine Hannover (TiHo) tested on individual level have proven their ability for herd diagnostics, but not for single animal diagnostics. They are not reliable for the detection of chronic infected animals. A significant correlation between the indirect immunofluorescence (iIF) and the Chekit®-Hyoptest II didn’t exist. A correlation between the results of the ELISA and the gross lesions of the pigs wasn’t on hand either. The iIF applied to gross lesions in terms of chronic alterations of the tips of the lobes appeared superior to the Chekit®-Hyoptest II (p<0,05). Cultivation of M. hyopneumoniae was inefficient, because 53 % of the lung samples were contaminated with other bacteria. This investigation was mainly aimed at drawing a study on the distribution of M. hyopneumoniae in the north-west of Lower Saxony (region of the Weser-Ems) and checking of the influence of some specific factors of the farms on the intra-herdprevalence. 1392 blood samples from fattening pigs of 106 farms of the year 1996 were examined with the Chekit®-Hyoptest II. At that time vaccination of the pigs against M. hyopneumoniae were not carried out. 97,17 % of all farms were seropositive. The intra-herd-prevalence of M. hyopneumoniae in these farms were 81,25 %. Farrowing to finishing farms with continuous flow and farms with an all in/all out practise of all barns with piglets from many different breeders tended to result in the highest intra-herd-prevalence and farms with piglets from only one breeder and farrowing to finishing farms with an all in/all out practise of units tended to result in the lowest intra-herd-prevalence. The visualization of the geographical distribution of M. hyopneumoniae indicated an influence of the topography on the intra-herdprevalence. Another aim of this study was the comparison of these results with the investigations of POPPE (1997) about antibodies against Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pp.) and of SCHENK (2000) about antibodies against influenza A/swine/Bakum/5/95 (H1N1) and influenza A/swine/Bakum/909/93 (H3N2) out of the same pool of samples of 1996 like those examined here. The intra-herd-prevalence of M. hyopneumoniae was the highest, A. pp. followed with approximately 64 %, then Influenza A H1N1 with approximately 59 % and Influenza A H3N2 with 13 %. The herd-prevalences of M. hyopneumoniea, A. pp. and Influenza A H1N1 ranged between 96% and 97 %, and for Influenza A H3N2 it was 61 %. For A. pp. specific factors of the farm significantly influenced the intra-herd-prevalence (see POPPE 1997). For influenza significant influences of the management systems on the intraherd-prevalence were found, too. 97 In conclusion of the study tight relations between breeders and finishing farms and consequential all in/all out management systems will reduce the transmission of M. hyopneumoniae, respectively A. pp. and of Influenza to some degree. 98 8 Literaturverzeichnis ABIVEN, P., M. STRASSER, M. KOBISCH u. J. NICOLET (1990): Antibody response of swine experimentally infected with Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma flocculare. J. Vet. Med. B, Suppl. 20, 817-818 ADEGBOYE, D.S. (1978): A review of mycoplasma induced immunosuppression. Br. Vet. J. 134, 556-560 AKEN, D. Van und P. GEERTS (1992): Mycoplasma hyopneumoniae infections in fattening swine in Luzon, Philippines. in: 12th Congr. Int. Pig Vet. Soc., Den Haag, Niederlande, Proc., S. 314 ALEXANDER T.J.L.,K. THORNTON, G. BOON,R.J. LYSONS u.A. F. 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Ganter für die Überlassung des Themas, für seine Unterstützung bei der Durchführung und nicht zuletzt für seine unendliche Geduld. Bei Herrn Dr. M. Runge bedanke ich mich ebenfalls für seine Hilfsbereitschaft und freundschaftlichen Ratschläge. Bei den Mitarbeitern des Instituts für Mikrobiologie und Tierseuchen, besonders bei Frau S. Jeckstadt und ganz besonders bei Frau R. Schmidt möchte ich mich für die stets freundlich gewährte Hilfe bei der Einführung in die Untersuchungstechniken bedanken. Auch den Mitarbeitern der Klinik für kleine Klauentiere, besonders Frau P. Röhrig danke ich für ihre Mithilfe bei der Durchführung der labordiagnostischen Untersuchungen. Ein ganz besonderer Dank gilt meinen beiden Söhnen Elias und Jesse, ohne deren meist großes Verständnis ich diese Arbeit nie zu Ende gebracht hätte. Ganz herzlich möchte ich auch Uli Schwöppe, Irma Kleine-Hörstkamp, Sabine Brinkmann und meinem Mann für die geduldige Durchsicht der Arbeit und kritische Anmerkungen danken. Im Besonderen danke ich meinen Eltern und Schwiegereltern, ohne deren großzügige Hilfe das Erreichen dieses Ziels unmöglich gewesen wäre. Der Firma Dr. Bommeli AG bin ich für die Bereitstellung der ELISA Chekit®-Hyoptest I und II zu Dank verpflichtet.
