Christian Pasule - des Instituts für Physiologie und Biotechnologie

Universität Hohenheim
Institut für Physiologie und Biotechnologie der Pflanzen
Prof. Dr. Andreas Schaller
“Loss of function” Analyse der Matrix Metalloproteinase 1
(Le-MMP 1) in Tomate
Diplomarbeit vorgelegt von
Christian Pasule
Hohenheim, Januar 2006
Betreut von Prof. Dr. Andreas Schaller
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung.................................................................................................................... III
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
Einleitung ...................................................................................................................... 1
Matrix Metalloproteinasen ............................................................................................. 2
Primäre Zellwand ........................................................................................................... 3
Bakterielle Invasionsmechanismen ................................................................................ 5
Phenolische Verbindungen............................................................................................. 7
Ziele der Arbeit............................................................................................................... 9
2
2.1
2.1.1
2.1.2
2.2
2.3
2.4
2.4.1
2.4.2
2.4.3
2.4.4
2.4.5
2.4.6
2.4.7
Material und Methoden ............................................................................................. 10
Organismen................................................................................................................... 10
Pflanzliches Material .................................................................................................... 10
Bakterien Stämme ........................................................................................................ 10
Vektoren und Plasmide................................................................................................. 10
Oligonukleotide ............................................................................................................ 10
Puffer und Lösungen .................................................................................................... 11
Reverse Transkription .................................................................................................. 11
Gelelektrophorese......................................................................................................... 11
Einbettung von pflanzlichem Gewebe in Technovit 7100® ......................................... 12
Northern Blot ............................................................................................................... 12
Extraktion phenolischer Substanzen............................................................................. 14
Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)....................................................... 15
Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und
Western Blot................................................................................................................. 15
Sonstige Puffer und Lösungen...................................................................................... 17
Medien.......................................................................................................................... 18
Methoden...................................................................................................................... 18
Reverse Transkription .................................................................................................. 18
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ............................................................................ 19
Auftrennung und Sichtbarmachung der DNA.............................................................. 19
Reinigung der PCR-Produkte aus Agarosegelen.......................................................... 20
Reinigung der PCR-Produkte ....................................................................................... 20
Einbettung von Gewebe von Tomate in Technovit 7100® ........................................... 20
Schneiden von Dünnschnitten am Rotationsmikrotom ................................................ 21
Färben mit Toluidin Blau ............................................................................................. 21
Färben mit Sudan Black ............................................................................................... 21
Untersuchung der Segmente mit dem Lichtmikroskop ............................................... 22
Northern Blot................................................................................................................ 22
Hybridisierung von Northern Blots mit radiomarkierten Sonden .............................. 24
Strippen der Blots ......................................................................................................... 25
Extraktion phenolischer Verbindungen (nach Goldwasser et al. 1999) ....................... 25
Bestimmung des Gehalts an löslichen und gebundenen Phenolen (Folin-Ciocalteu)
(nach Goldwasser et al,. 1999) ..................................................................................... 26
Bestimmung des Gehalts an Lignin (nach Goldwasser et al., 1999)............................ 26
HPLC-Analyse phenolischer Verbindungen ............................................................... 26
Infektion durch Xanthomonas campestris pv. campestris............................................ 27
Isolierung von Blattproteinen ....................................................................................... 28
2.5
2.6
2.7
2.7.1
2.7.2
2.7.3
2.7.4
2.7.5
2.7.6
2.7.7
2.7.8
2.7.9
2.8
2.8.1
2.8.2
2.8.3
2.8.4
2.8.5
2.8.6
2.8.7
2.8.8
2.8.9
I
2.9
Bestimmung der Proteinkonzentration (Bradford Test) ............................................... 28
2.9.1 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und
Western Blot................................................................................................................. 28
3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6
Ergebnisse ................................................................................................................... 30
“Silencing” von LeMMP-1........................................................................................... 30
Histologische Untersuchungen..................................................................................... 32
Northern Blot................................................................................................................ 36
Extraktion phenolischer Substanzen............................................................................. 37
HPLC-Analyse phenolischer Verbindungen ................................................................ 39
Infektion durch Xanthomonas campestris pv. campestris............................................ 41
4
Diskusion ..................................................................................................................... 44
5
Literatur ...................................................................................................................... 49
6
6.1
6.2
6.3
Anhang......................................................................................................................... 55
cDNA Sequenz der LeMMP-1 und LeMMP-2 ............................................................ 55
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................ 56
SI-Einheiten.................................................................................................................. 57
Eidesstattliche Erklärung.......................................................................................................... 58
Danksagung.............................................................................................................................. 59
II
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im Vorfeld dieser Arbeit, wurden transgene Tomatenpflanzen von Elke Sieferer erzeugt, die
ein Hairpin-Konstrukt zur Unterdrückung der LeMMP-1 Expression durch RNA-Interferenz
tragen. Diese transgenen Tomatenpflanzen, dienten in dieser Arbeit als Werkzeug, zur
funktionellen Charakterisierung der LeMMP-1.
Hairpin-Pflanzen zeigen bereits drei bis vier Wochen nach der Keimung Veränderungen in
der Oberflächenstruktur des Hypocotyls. Die Veränderungen, werden drei bis vier Wochen
nach der Keimung als dunkle, nekrotisch erscheinende Flecken sichtbar. Mit fortschreitendem
Alter der Pflanzen wird das gesamte Hypocotyl von den oberflächlichen Veränderungen
erfasst. Mikroskopische Untersuchungen von Dünnschnitten der Hypocotyle von HairpinPflanzen, und deren Färbung mit Toluidin Blau zeigten, dass es zur Akkumulation
phenolischer Substanzen in Cortex-Zellen unterhalb der Epidermis kommt. Färbungen mit
Sudanfarbstoffen zeigten eine Imprägnierung der Zellwände mit Suberin und Cutin. Weiterhin
zeigte sich ein verändertes Zellmuster im Cortex von Hairpin-Pflanzen. Die mikroskopischen
Beobachtungen deuten auf eine erhöhte Akkumulation von phenolischen Substanzen in
Hairpin-Pflanzen.
Extraktion
löslicher
und
gebundener
phenolischer
Substanzen
und
deren
Konzentrationsbestimmung, bestätigte diese Annahme. Neben der quantitativen wurde auch
eine qualitative Veränderung in der Zusammensetzung der phenolischen Substanzen in
Hairpin-Pflanzen beobachtet. Die Akkumulation von Phenolen kann auf eine Induktion der
Phenylalanin Ammoniumlyase zurückgeführt werden. Induktion der PAL und Akkumulation
von Phenolen stellen typische Reaktionen der Pathogenabwehr dar. Daher wurde überprüft,
ob es Unterschiede in der Resistenz gegenüber Phytopathogenen zwischen Hairpin und
UC82B-Pflanzen gibt. Die Pflanzen wurden mit dem Phytopathogen Xanthomonas campestris
pv. campestris Stamm 93-1 infiziert, und eine bakterielle Wachstumskurve wurde erstellt. Es
zeigte sich ein vermindertes Bakterienwachstum in Hairpin-Pflanzen. SDS-PAGE und
Western Blot Analysen von Proteinextrakten aus Blättern von infizierten UC82B-Pflanzen
zeigten eine Induktion der LeMMP-1 infolge der Infektion mit Xanthomonas campestris.
Die Befunde deuten auf eine Rolle der LeMMP-1 sowohl in der Pathogenese, als auch in der
Entwicklung des Stängel-Cortex in Tomatenpflanzen.
III
Einleitung
1.
Einleitung
Die Tomate (Lycopersicon esculentum), hat ihren Ursprung in Mittel- und Südamerika. Sie
wurde bereits 200 v. Chr. von den Azteken und Inkas kultiviert. Christoph Kolumbus führte
die Tomate nach 1492 in Europa ein. Sie gehört deshalb in Europa zu den hemerochoren
Pflanzen, und wegen ihrer Einführung nach 1492 zu den Neozoe. Erste Beschreibungen der
Tomate stammen aus Italien aus dem Jahre 1522. In Deutschland begann erst ab 1925 der
``Siegeszug`` der Tomate, die davor eher als Zierpflanze Verwendung hatte.
Tomaten sind einjährige, frostempfindliche Pflanzen, die 30-150 cm groß werden können. Die
gesamte Pflanze ist mit Drüsenhaaren überzogen. Der Stamm ist nicht verholzt, und macht
einen “krautigen” Eindruck. Die Blätter sind meist unregelmäßig fiederschnittig bis lappig
gezähnt. Ihre Blütezeit haben sie von Juli bis Oktober, und die Blüten haben eine gelbe Farbe.
Die Frucht der Tomate kann je nach Sorte sehr unterschiedlich sein in Größe und Farbe.
Botanisch gesehen ist die Tomatenfrucht eine Beere. Heutzutage ist die Tomate eine wichtige
und weit verbreitete Kulturpflanze, mit einer enormen wirtschaftlichen Bedeutung.
Interessant als Forschungsobjekt ist die Tomate nicht nur aufgrund ihres relativ kleinen
Genoms. Sie besitzt 12 Chromosomen bei einer Genomgröße von 950 Mb. Man schätzt, dass
ungefähr 730 Mb des Genoms als Heterochromatin vorkommt, welches reich an repetitiven
Sequenzen ist. Die restlichen 220 Mb des Genoms kommen als Euchromatin vor, wo man
90% der vorhandenen Gene vermutet (Mueller et al., 2005). Die Tomate ist ausserdem ein
diploider Organismus, der leicht mit Agrobakterium tumefaciens zu transformieren ist. Die
Fähigkeit zur Selbstbestäubung ermöglicht es, homozygote Inzuchtlinien zu erhalten,
wodurch genetische Studien erleichtert werden. In 2003 wurde das “Tomato Sequencing
Project” ins Leben gerufen, an dem zehn Länder beteiligt sind, mit dem Ziel das Genom der
Tomate zu sequenzieren. Dies geschieht im Rahmen des “International Solanaceae Project”,
mit dem Ziel eine Datenbank für den Informationsaustausch zu erstellen (Mueller et al.,
2005). Die Tomate dient auch als Modellorganismus um Vorgänge wie Fruchtentwicklung
(Tanksley, 2004), oder pflanzliche Abwehrmechanismus gegen phytopathogene Bakterien
wie Pseudomonas syringae pv. tomato (Pedley und Martin, 2003) zu studieren. Die
Wundantwort der Solanaceen ist in Tomate sehr gut untersucht und stellt ein Modell für
systemische Reaktionen in Pflanzen dar (Ryan, 2000).
Bei Untersuchungen zur Reaktionen von Tomatenpflanzen auf exogene Gabe des Pilztoxins
Fusicoccin, fiel die Matrix-Metalloproteinase 1 (LeMMP-1) auf, welche Gegenstand der
1
Einleitung
vorliegenden Arbeit ist. Microarray Analysen zeigten eine rasche und transiente Induktion der
LeMMP-1 Expression nach Behandlung mit Fusicoccin, was auf eine mögliche Beteiligung
des LeMMP-1 in der Pathogenese hindeutet (Frick und Schaller, 2002).
1.1
Matrix Metalloproteinasen
Matrix Metalloproteinasen (MMPs) gehören zur Superfamilie der Metzinkine, der Zinkabhängigen Metallopeptidasen, die durch das Zink-bindende-Motiv HEXXHXXGXXH
charakterisiert sind. MMPs werden als PrePro-Enzyme in einer zymogenen Form
synthetisiert. Die aminoterminale Transmembrandomäne scheint Teil eines Signalpeptids zu
sein, welches das Enzym für den cotranslationellen Transport in das endoplasmatisches
Retikulum markiert. In der Propeptiddomäne befindet sich ein “Cystein-Switch”, welches das
katalytische Zinkion bindet und das Zymogen dadurch inaktiviert. Durch enzymatische
Spaltung der Propeptiddomäne wird das Enzym aktiviert (Bode et al., 1999). Die Regulation
der MMPs kann auf transkriptioneller Ebene erfolgen, oder durch eine regulierte
enzymatische Spaltung der Propeptiddomäne, was zur Aktivierung des Enzyms führt. Darüber
hinaus ist eine Regulierung der Enzymaktivität durch endogene Inhibitoren (TIMPs = Tissue
Inhibitors of Metalloproteinases) beschrieben (Gomez et al., 1997). In Vertebraten haben
MMPs eine Funktion im Ab- und Umbau der extrazellulären Matrix, in der Entwicklung,
Embryogenese und Organogenese. Aktuelle Forschung befasst sich auch mit der Rolle von
MMPs bei der Entstehung von Krankheiten wie Krebs und Arthritis. Auch in höheren
Pflanzen wurden einige MMPs identifiziert, deren Funktion allerdings noch weitgehend
unbekannt ist. Bisherige Befunde deuten darauf hin, dass auch die MMPs in Pflanzen an
Entwicklungsprozessen und Pathogenese beteiligt sein können. In Arabidopsis thaliana
konnten fünf potentielle MMP-Gene identifiziert werden (Maidment et al., 1999). Für die
At1-MMP konnte nach Expression in Escherichia coli die autokatalytische Aktivierung
(Abspaltung des Propeptids) gezeigt werden (Maidment et al., 1999). Die At2-MMP scheint
eine wichtige Funktion in Pflanzenwachstum, Morphogenese, Entwicklung, im Speziellen bei
der Seneszenz und Blütenbildung zu haben (Golldack et al., 2002). In Gurke (Cucumis
sativus) wird die Cs1-MMP im Endstadium der Seneszenz exprimiert (Delorme et al., 2000).
Für die GmMMP-2 aus Sojabohne, wurde die Akkumulation des Transkripts nach Befall mit
Phytophora sojae und Pseudomonas syringae pv. glycinea gezeigt (Liu et al., 2001).
2
Einleitung
Die LeMMP-1 aus Tomate weist alle eben genannten typischen Merkmale und Strukturen von
Matrix Metalloproteinasen auf. Von zwei potentiellen Transmembrandomänen ist eine Teil
des N-terminalen Signalpeptides, die andere bildet einen Membrananker am CTerminus, in
dessen Nähe eine ω-site zur Verknüpfung mit einem GPI-Anker prognostiziert wird. Es
findet sich ebenso das Zink-Binde-Motiv HEXGHXXGXXH wie auch der konservierte
„Met-turn“ im Motiv AIMYP. Im Propeptid befindet sich ein PRCG(V/N)(P/A)D-Motiv mit
dem charakteristischen „Cystein-Switch“.
Die cDNA Sequenz der LeMMP-1 (EST Klon cLEC15M21, Clemson University) umfasst
1181 Basenpaare mit einem offenen Leserahmen von 1104 Basenpaare und sie codiert für ein
PrePro-Protein von 367 Aminosäuren bei einem errechneten Molekulargewicht von 40,2 kDa
(Frick, 2002). Für die katalytische Domäne konnte eine caseinolytische und gelatinolytische
Aktivität nachgewiesen werden. Chelatoren zweiwertiger Metallionen sowie in geringen
Massen thiolmodifizierende Reagenzien hemmten die Aktivität der LeMMP-1. Maximale
Aktivität wurde bei pH 6,3 in Gegenwart von 500 µM CaCl2 beobachtet (Frick und Schaller,
2002).
Aufgrund der Charakteristika von pflanzlichen MMPs und der für die LeMMP-1
beobachteten Induzierbarkeit durch das Pilztoxin Fusicoccin wurde für die LeMMP-1 eine
Funktion im Umbau der Zellwand (Apoplast) im Verbindung mit der Abwehr von
mikrobiellen Pathogenen vorgeschlagen (Frick und Schaller, 2002).
1.2
Primäre Zellwand
Die primären Wände pflanzlicher Zellen bestehen aus einer amorphen Matrix aus
Hemicellulosen und Pektinen, sowie einem geringen Anteil an Strukturproteinen, in welche
die Cellulosemikrofibrillen eingebettet sind. Hemicellulosen bilden eine heterogene Gruppe
von Polysacchariden. Die am besten untersuchte Hemicellulose bei Dikotyledonen ist das
Xyloglucan. Xyloglucan ist ein Polysaccharid mit β-1-4-verknüpften β-D-Glucosebausteinen,
mit 1-6-verknüpften Seitenketten aus Xylose, Galaktose und oftmals, aber nicht immer, mit
endständiger Fucose. Molekulare Modelle besagen, dass sich die terminale Fucose der
Seitenkette zurückfaltet, und dabei mit der Glucankette in Wechselwirkung tritt. Die
nächstgelegenen Glucosereste werden dabei in einer linearen Konfiguration fixiert. Die nun
entstandene
flache
Struktur
erleichtert
die
Anlagerung
kurzer
Bereiche
des
Xyloglucanrückgrats an die Oberfläche der Cellulosemikrofibrille (Levy et al., 1997).
3
Einleitung
Pektine bilden wie Hemicellulosen eine heterogene Gruppe von Polysacchariden.
Charakteristischerweise enthalten Pektine saure Zucker wie Galacturonsäure und neutrale
Zucker wie Rhamnose, Galactose und Arabinose. Sie sind lösliche Zellwandpolysaccharide
und können sehr einfach aufgebaut sein, wie Homogalacturonan (lineares Polymer aus 1-4
verknüpfter α-D-Galakturonsäure). Pektine können aber auch sehr komplex aufgebaut sein
wie das Rhamnogalacturonan II, das aus mindestens zehn verschiedenen Zuckern besteht, mit
einem komplizierten Verknüpfungsmuster. Pektine bilden molekulare Netzwerke, indem sich
die Carboxylgruppen benachbarter Pektinmoleküle über Calcium-Ionen miteinander
verbinden. Die Komplexität mancher Pektine deutet darauf hin, dass es sich hierbei nicht
ausschließlich um Strukturkomponenten handelt! Eine mögliche Rolle als Elicitoren bei der
Pathogenantwort wurde vorgeschlagen (Van Cutsem und Messiaen, 1993).
Die Zellwand enthält auch mehrere Typen von Strukturproteinen (Showalter, 1993). Welche
anhand
ihrer
Aminosäurezusammensetzung
als
hydroxyprolinreiche
Glycoproteine,
glycinreiche Proteine, prolinreiche Proteine usw. klassifiziert werden. Der Gehalt an
Strukturproteinen kann in verschiedenen Zelltypen sehr unterschiedlich sein, und sich im
Laufe der Entwicklung sowie in Reaktion auf Umweltstimuli verändern (Showalter, 1993).
Die Synthese der Cellulosemikrofibrillen erfolgt an der Plasmamembran durch so genannte
Rosettenkomplexe oder Terminalkomplexe (Brown et al., 1996). Die einzelnen Glucanketten
der Cellulose bestehen aus 2000 bis 25000 Glucosemolekülen die β-1-4 verknüpft sind
(Brown et al., 1996). Mehrere solcher Glucanketten bilden dicht gepackte Mikrofibrillen.
Im Zuge der Differenzierung, kann der Primärwand eine Sekundärwand aufgelagert werden.
Sekundärwände sind durch den Verlust der Verformbarkeit gekennzeichnet. Sie bestehen aus
Cellulosemikrofibrillen,
Hemicellulose
und
Lignin.
Cellulosemikrofibrillen
und
Hemicellulose scheinen in der Sekundärwand strukturell besser organisiert zu sein als in der
Primärwand. Die Sekundärwand lässt sich in drei Schichten (S1 bis S3) unterteilen. S1 besteht
aus links- und rechts-gedrehten Mikrofibrillenhelices. S2 und S3, bestehen jeweils aus nur
einer Art Mikrofibrillenhelices (entweder links- oder rechts-gedrehten). Die Orientierung der
Helices in S2 und S3 unterscheiden sich jedoch. Während der Sekundärwandbildung, kommt
es in der S1, S2, in der Primärwand und in der Mittellamelle seltener aber in S3 zur
Lignifizierung (Goodwin et al., 1983). Sekundärwände sind häufig in Festigungsgewebe und
Leitgewebe (Xylem) zufinden.
Neben der Funktion in der Formgebung und als Festigungselemente, stellen pflanzliche
Zellwände auch eine physikalische Barriere gegen das Eindringen phytophatogener
Organismen dar.
4
Einleitung
1.3
Bakterielle Invasionsmechanismen
Mikrobielle Pathogene nutzen unterschiedliche Strategien, um Pflanzen zu befallen. Die
Invasion von Phytopathogenen kann aktiv oder passiv erfolgen. Viele Pilze durchdringen mit
Hilfe von Druck und Zellwand-abbauenden Enzymen die Kutikula und Zellwand, um
Pflanzen zu besiedeln. Wunden, sowie natürliche Öffnungen wie Stomata, Lentizellen,
Nektarien und Hydathoden (Hugouvieux et al., 1998), um nur einige zu nennen, können
ebenfalls Eintrittspforten für Pathogene darstellen. Fusicoccum amygdali, ein Pathogen auf
Pfirsich und Mandelbäumen, sondert ein Toxin aus, das Fusicoccin, welches eine ProtonenATPase in der Plasmamembran aktiviert. Dies führt zur Hyperpolarisierung der
Plasmamembran, gefolgt von Kalium Einstrom. Das Ergebnis ist eine unphysiologische
Öffnung der Stomata, was dem Pathogen die Penetration erleichtert. Im Gegensatz zu Pilzen
sind Bakterien nicht in der Lage, aktiv die Kutikula zu penetrieren. Die meisten
phytopathogenen Bakterien sind fakultative Pathogene. Sie “warten” auf Gelegenheiten, um
über natürliche Öffnungen oder Wunden in den Pflanzenorganismus einzudringen, was durch
eine hohe Populationsdichte unterstützt wird.
Um
eine
Infektion
zu
etablieren,
benötigen
die
Phytopathogene
verschiedene
Virulenzfaktoren. Als Virulenzfaktoren können hydrolytische Enzyme, Toxine oder sonstige
sekretierte Proteine (Effektorproteine) dienen. Xanthomonas campestris pv. campestris, z.B.
besitzt eine Metalloprotease, welche in der Lage ist, ein prolinreiches Glycoprotein (gp120)
abzubauen, welches mit der extrazellulären Matrix der Leitbündel assoziiert ist. Eine Aktivität
wurde auch gegen hydroxyprolinreiche Glycoproteine wie Extensine in Kartoffel und Tomate
gezeigt (Dow et al., 1998). Sekretionssysteme von Typ I-IV, wie sie bei vielen gramnegativen Phytopathogenen vorkommen, werden ebenfalls zu den Virulenzfaktoren gezählt.
Das hrp-Gencluster (hrp, hypersensitive response and pathogenicity) von Xanthomonas
campestris pv. campestris, einem Pathogen welches Paprika und Tomaten befällt, ist
notwendig für die Pathogenität und die Induktion der Hypersensitivitätsreaktion (HR) (Bonas
et al., 1991). Sequenzanalysen geben Hinweise auf die biochemische Funktion der hrp-Gene.
Ähnlichkeiten zwischen hrp-Proteinen von Xanthomonas campestris pv. vesicatoria und
Proteinen von Pathogenen von Säugetieren (wie z.B. Ysc und Spa/Mix von Yersinia spp und
Shigella flexneri) weisen darauf hin, dass Hrp-Proteine an der Proteinsekretion durch
(Fenselau et al., 1992; Van Gijsegem et al., 2000). Typ III Sekretionssysteme (TTSS), sind
bei pathogenen Bakterien weit verbreitet. Elektronenmikroskopische Untersuchungen des
TTSS von Shigella (Tamano et al., 2000, Blocker et al., 2001) zeigten die Existenz eines
5
Einleitung
makromolekularen Komplexes, welcher die bakterielle Membranen durchspannt. Der
Komplex besteht aus einem Basalkörper mit zwei oberen und zwei unteren Ringen, welche
durch eine sich nach außen fortsetzende nadelähnliche Struktur miteinander verbunden sind
(„Nadelkomplex“). TTSS sind essentiell für die Pathogenität und Persistenz der Bakterien in
den Wirtspflanzen (Minsavage et al., 1990). Xanthomonas campestris pv. vesicatoria Stämme
mit einem Defekt im TTSS sind nicht mehr pathogen, und auch nicht mehr zur Vermehrung
im Apoplasten fähig, da Sie auf Ressourcen wie Nährstoffe und Wasser aus den Wirtszellen
angewiesen sind. Das TTSS wird für die Translokation von Effektorproteinen in die
Wirtszelle benötigt, um lebensnotwendige Ressourcen verfügbar zu machen. Zahlreiche
potentielle Effektorproteine wurden in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria identifiziert,
welche mit der TTSS-Pathogenitätsinsel co-reguliert werden (Noel et al., 2001). Ein
Effektorprotein, das XopD, welches TTSS-abhängig sekretiert wird (Noel et al., 2002), besitzt
eine proteolytische Aktivität gegen SUMO-gebundene Proteine in Wirtszellen. SUMO (small
ubiquitin-like modifier) gehören zu einer Familie Ubiquitin-ähnlicher Proteine, welche durch
ein System das ähnlich arbeitet wie das Ubiquitinkonjugatiossystem, kovalent mit
eukaryontischen Proteinen verknüpft werden können (Melchoir, 2000; Kurepa et al., 2003).
SUMO
und
SUMO
Proteasen
regulieren
zahlreiche
zelluläre
Prozesse
wie
Signaltransduktionen, Progression des Zellzyklus, und die Stressantwort bei Pflanzen
(Melchoir et al., 2000). Durch de-SUMO-ylierung von Proteinen der Wirtszellen, greift das
Pathogen in den pflanzlichen Zellregulierungsmechanismus ein, um sein Fortbestehen in der
infizierten Pflanze zu sichern.
TTSS sind essentiell für die Pathogenität vieler phytopathogener Bakterien, da sie dadurch die
Möglichkeit besitzen, die pflanzliche Zellwand zu überbrücken, und durch Injektion von
Effektorproteinen in das Cytoplasma den pflanzlichen Stoffwechsel zu modifizieren (Alfano
et al., 1997). Werden aber die Effektorproteine (oder deren Wirkung) von korrespondierenden
Resistenzproteinen der Wirtspflanze erkannt, so wirken sie als „avirulence (Avr)“-Faktoren
und lösen eine Abwehrreaktion aus, durch die das Wachstum und die Ausbreitung des
Phytopathogens limitiert wird (Hotson et al., 2003). Die Verstärkung der pflanzlichen
Zellwände durch Lignin oder weitere polymere phenolische Substanzen ist Bestandteil der
pflanzlichen Abwehrreaktion (Review, Nicholson und Hammerschmidt, 1992). Durch die
Lignifizierung der Zellwände bildet die Pflanze eine mechanische Barriere gegen
eingedrungene
Phytopathogene.
Gleichzeitig
erhöht
die
Lignifizierung
die
Widerstandsfähigkeit der Zellwände gegenüber zellwandabbauenden Enzymen. Die Diffusion
von Toxinen in das Cytoplasma der Wirtszelle und der Austritt von Wasser und Nährstoffen
6
Einleitung
aus der Wirtszelle in den Apoplasten werden erschwert. Es wurde gezeigt, dass Infektionen
mit Cladosporium cucumerpum in Gurke die Ligninsynthese induziert (Robertson, 1987).
Gurken, die resistent gegenüber Cladosporium cucumerpum sind, zeigen eine schnellere
Akkumulation von Lignin als nicht-resistente Gurkenpflanzen (Hijwegen, 1963). Werden
Kartoffelknollen mit Phytophora infestans infiziert, kommt es ebenfalls zur Einlagerung von
polymeren phenolischen Verbindungen in der Knolle (Friend et al., 1973). Möglicherweise
handelt es sich dabei um Chlorogensäurepolymere, da nach einer Infektion die Konzentration
löslicher Chlorogensäure in der Kartoffelknolle stark absinkt (Friend, 1981). Neben der Rolle
von Lignin in der mechanischen Verstärkung der Zellwände während der Pathogenantwort,
können Ligninvorstufen und deren freie Radikale möglicherweise auch als toxische
Substanzen in der direkten Pathogenabwehr fungieren (Ride, 1978).
1.4
Phenolische Verbindungen
Pflanzen sind in der Lage zahlreiche phenolische Substanzen zu synthetisieren, mit
vielfältigen Aufgaben. Sie dienen der Pathogenabwehr (Phytoalexine), als Frassschutz
(Tannine), zur mechanischen Stabilität (Lignin), als Farbpigmente (Anthocyane) und der
Allelopathie (Kaffeesäure). Durch ihre Vielfalt und unterschiedliche Funktionen, stellen
phenolische Substanzen eine große heterogene Gruppe sekundärer Inhaltsstoffe in Pflanzen
dar, die durch den Phenolring als gemeinsames Strukturmerkmal gekennzeichnet sind. Einige
phenolische Verbindungen sind nur in organischen Lösungsmitteln löslich, einige sind
wasserlösliche Carbonsäuren, und andere bilden große hydrophobe Makromoleküle.
Phenolische Verbindungen werden in Pflanzen über unterschiedliche Stoffwechselwege
synthetisiert. Die wichtigsten Stoffwechselwege sind der Shikimisäureweg, und der AcetatMalonat-Weg. Im Shikimisäureweg werden einfache Kohlenhydrat-Vorstufen aus der
Glykolyse und dem Pentosephosphatweg in aromatische Aminosäuren umgewandelt. Dadurch
sind Pflanzen in der Lage, die drei aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und
Tryptophan herzustellen. Aus Phenylalanin entsteht unter Eliminierung von Amoniak die
Zimtsäure. Zimtsäure ist ein Vorläufer vieler phenolischer Substanzen. Die Umwandlung von
Phenylalanin zu Zimtsäure wird durch das Enzym Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL)
katalysiert. Die PAL befindet sich an einem Scheideweg zwischen Primär- und
Sekundärstoffwechsel, und ist damit ein wichtiger Regulator bei der Bildung vieler
phenolischer Verbindungen. Die trans-Zimtsäure wird durch Addition von Hydroxylgruppen
7
Einleitung
und weitere Substituenten an den aromatischen Ring in weitere phenolische Verbindungen
umgewandelt. Die trans-Zimtsäure und ihre Derivate werden auch Phenylpropane genannt,
weil sie einen Benzolring und eine Seitenkette mit drei Kohlenstoffatomen enthalten.
Einfache phenolische Verbindungen wie Hydroxyzimtsäuren (Kaffeesäure und Ferulasäure)
werden von Pflanzen an die Umgebung abgegeben, und entfalten dort ihre allelopathische
Wirkung. In Konkurrenz um Wasser, Licht und Nährstoffe wird so das Wachstum
benachbarter Pflanzen beeinträchtigt. Neben einfachen phenolischen Verbindungen, gibt es
auch sehr komplex aufgebaute wie z.B. Lignin. Lignin ist ein Polymer aus stark verzweigten
Phenylpropaneinheiten. Die genaue Struktur ist jedoch nicht bekannt. Im Allgemeinen besteht
Lignin aus drei verschiedenen Phenylpropanalkoholen (Coniferyl-, Cumaryl-, und
Sinapylalkohol), die durch Enzyme, welche freie Radikale als Zwischenprodukte erzeugen, zu
einem Polymer verknüpft werden. Lignin befindet sich in den Zellwänden von
Stützelementen und Leitgeweben. Es verleiht den Pflanzen mechanische Stabilität, und
verstärkt das Gewebe des Stamms und der Leitgefäße, und erlaubt so einen aufrechten Wuchs
der Pflanzen, und eine Weiterleitung von Wasser und Mineralstoffen durch das Xylem. Die
Fähigkeit zur Bildung von Lignin, ist wahrscheinlich eine der wichtigsten Anpassungen der
Pflanzen an das Landleben (Taiz und Zeiger, 2000).
Suberin besteht wie Lignin aus den drei zuvor genannten Phenylpropanalkoholen
(Monolignolen). Die Penylpropane in Suberin sind jedoch mit langkettigen Fettsäuren
verestert. Dadurch ist Suberin sehr hydrophob. Aufgrund dieser Eigenschaft wird Suberin zur
Bildung wasserundurchlässigen Schichten in den pflanzlichen Organismen verwendet (z.B.
Caspary-Streifen der Endodermis, Kork).
Flavonoide stellen die umfangreichste Gruppe der phenolischen Verbindungen dar. Sie
bestehen aus zwei aromatischen Ringen, die über eine C3 Brücke miteinander verbunden
sind. Nur einer der beiden aromatischen Ringe leitet sich wie die zuvor genannten
phenolischen Verbindungen von der Zimtsäure ab (B-Ring). Der zweite aromatische Ring (ARing) stammt vom Acetat-Malanat-Weg ab. Flavonoide können als Antioxidantien fungieren
(z.B. Quercetin). Sie reagieren mit freien Radikalen, und inaktivieren sie. Sie dienen auch als
Frass-Schutz (z.B. Naringenin-7-Rhamnoglucosid in Citrusfrüchten), oder zum Schutz gegen
UV-Strahlung. Auch eine wichtige Gruppe pflanzlicher Pigmente, die Anthocyane, gehören
zu den Flavonoiden.
Viele phenolische Substanzen haben antimikrobielle Wirkung und wirken als Phytoalexine.
Sie werden als Reaktion auf Infektionen durch Bakterien oder Pilze von den Pflanzen
synthetisiert, und helfen eine Ausbreitung der eingedrungenen Pathogene zu vermindern. Die
8
Einleitung
Art der gebildeten Phytoalexine ist charakteristisch für die jeweilige Pflanzenfamilie.
Hülsenfrüchtler z.B. bilden üblicherweise Isoflavonoide als Phytoalexine, während in
Solanaceaen verschiedene Sesquiterpene anzutreffen sind. Phytoalexine lassen sich
normalerweise nicht vor einer Infektion in Pflanzen nachweisen. Wie die Bildung komplexer
polymerer Phenole stellt also auch die Bildung von Phytoalexine eine Abwehrreaktion auf
Pathogenbefall dar.
1.5
Ziele der Arbeit
In dieser Arbeit sollten LeMMP-1 “Loss of function” Tomatenpflanzen charakterisiert
werden, um dadurch nähere Erkenntnisse über die Funktion des Enzyms zu bekommen. Die
Rolle der LeMMP-1 in der Entwicklung von Tomatenpflanzen sollte histologisch untersucht
werden. Die Bildung löslicher und polymerer Phenole in den „loss of function“-Mutanten
sollte qualitativ und quantitativ erfasst werden. In wieweit sich die Akkumulation
phenolischer Verbindungen auf die Resistenz gegenüber mikrobiellen Pathogenen auswirkt,
sollte im Pathosystem Tomate/Xanthomonas campestris pv. Tomate untersucht werden.
9
Material und Methoden
2.
Material und Methoden
2.1
Organismen
2.1.1 Pflanzliches Material
Lycopersicon esculentum cv. UC82B
ROYAL SLUIS (Holland)
2.1.2 Bakterien Stämme
Xanthomonas campestris pv. campestris
Geschenk von Harry J. Klee
Stamm 93-1
Department of Horticultural Sciences of
Florida, Gainesville, Florida 32611
2.2
Vektoren und Plasmide
PAL (171)
580 bp Fragment von LePAL5 (Görlach et
al., 1995)
Ubq. (61)
1050 bp Fragment in pSK(-) (Frick und
Schaller, 2002)
2.3
Oligonukleotide
Primer
Sequenz (5’ -----> 3’-Orientierung)
MMP 15
CCTTTATTCATCGCCATACT
MMP 13
TCTTGTTCGCCGGCCACCGT
MMP 25b
TGCCATTGCTTATGTTGTAATA
MMP 23
GTCTTACCCTCGGGCCACTT
ToMV F
TCATCTGTATGGGCTGACCCTA
ToMV R
CAACCGTAGCGTCGTCTACCCT
10
Material und Methoden
Aktin F
TGTGGGAGATGAAGCTCAATCG
Aktin R
TCAAACTATCAGTGAGGTCACG
PAL F
M13 rev
PAL R
M13-21
Ubq. F
T3
Ubq. R
T7
2.4
Puffer und Lösungen
2.4.1 Reverse Transkription
DNase I
Fermentas, St.Leon-Rot
M-MuLV Reverse Transkriptase
Fermentas, St.Leon-Rot
Taq-DNA-Polymerase
Peqlab, Erlangen
2.4.2 Gelelektrophorese
50 x TAE-Puffer
242 g Tris/HCl
57,1 ml Essigsäure
100 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
mit H2O auf 1 l aufgefüllt
Zugabe von 14 µg/l EtBr (Ethidiumbromid)
nach Verdünnen
10 x Ladepuffer
50% Glycerin
1 mM EDTA
11
Material und Methoden
2.4.3 Einbettung von pflanzlichem Gewebe in Technovit 7100®
Fixierungslösung
5 % v/v Formaldehyd (37 %)
5 % v/v Essigsäure (99 %)
90 % Ethanol (70 %)
Dehydrierung
75% Ethanol (v/v)
90% Ethanol (v/v)
100% Ethanol
Präinfiltration
EtOH/Technovit Basislösung 2:1
EtOH/Technovit Basislösung 1:1
EtOH/Technovit Basislösung 1:2
Technovit Basislösung unverdünnt
Infiltrationsmedium
Technovit 7100
(GMA mit Co-Katalysator XCL)
Polyethylenglycol 400 (100 ml)
Dibenzoylperoxid (Härter I) (1 g)
Einbettungsflüssigkeit
Infiltrationsmedium (30 ml)
Technovit 7100 (Härter II) (1,5 ml)
2.4.4 Northern Blot
1 M KPP-Puffer
1 M K2HPO4
1 M KH2PO4
pH 6,5 durch mischen der beiden Lösungen
einstellen
TE-Puffer
10 mM Tris/HCl pH 8,0
1 mM EDTA
10 x RNA-Gelpuffer
0,4 M MOPS
12
Material und Methoden
100 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
pH 7,0 mit NaOH einstellen
10 x Ladepuffer
50 % Glycerol
1 mM EDTA
Spatelspitze Bromphenolblau
20 x SSC
175,3 g NaCl
100,5 g Na3Citrate x 2 H2O
pH 7,0 mit HCl einstellen
Mit ddH2O auf 1 l auffüllen
20 % SDS
20 g Natriumdodecylsulfat auf 100 ml ddH2O
Hybridisierungslösung
50 % Formamid
5 x SSC
50 mM KPP pH 7,0
Heringssperma DNA, partiell hydrolysiert,
denaturiert
100 µg/ml
2 x Denhardt’s Reagenz
0,5 % SDS
50 x Denhardt’s Reagenz
5 g Ficoll
5 g Polyvinylpyrrolidon
5 g Rinderserumalbumin (BSA)
Mit ddH2O auf 500 ml auffüllen, sterilfiltrieren
Waschlösung 1
1 x SSC
0,5 % SDS
13
Material und Methoden
Waschlösung 2
0,2 x SSC
0,5 % SDS
Waschlösung zum Strippen
0,04 x SSC
0,04 % SDS
2.4.5 Extraktion phenolischer Substanzen
1 N HCL
8,3 ml HCl 37 %
auf 100 ml mit ddH2O aufgefüllt
2 N HCL
16,6 ml HCl 37 %
auf 100 ml mit ddH2O aufgefüllt
0,1 N HCL
0,83 ml HCl 37 %
auf 100 ml mit ddH2O aufgefüllt
0,5 N NaOH
2 g NaOH
auf 100 ml mit ddH2O aufgefüllt
37 % HCL
Thioglycolsäure (98 %)
Sigma-Aldrich
Folin-Ciocalteu’s Phenolreagenz 2 N
Sigma-Aldrich
20 % Na2CO3
20 g Na2CO3
auf 100 ml mit ddH2O aufgefüllt
p-Cumarsäure
Sigma-Aldrich
14
Material und Methoden
2.4.6 Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
Phosphorsäure 85 %
ROTISOLV® HPLC Gradient Grade
Roth, Karlsruhe
HPLC-Wasser
Acetonitril
Roth
Zimtsäure (trans)
Fluka, Buchs SG
Ferulasäure
Roth
Sinapinsäure
Roth
Chlorogensäure
Sigma-Aldrich
Kaffeesäure
Roth
Methanol
Roth
2.4.7 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und Western Blot
Trenngelpuffer (4x)
1,5 M Tris/HCl pH 8,8
0,4 % (w/v) SDS
Sammelgelpuffer (4x)
0,5 M Tris/HCl pH 6,8
0,4 % (w/v) SDS
APS 10 %
10 % (w/v) Ammoniumperoxidisulfat in H2O
15
Material und Methoden
Trenngel 12 %ig, für 2 Gele (1,5 mm)
5,4 ml Acrylamid-Stammlösung (rotiphorese®
Gel40, Roth)
4,5 ml Trenngelpuffer
8,1 ml H2O
60 µl APS 10%
13µl Tetramethyläthylendiamin (TEMED)
Komponenten mischen, ca. 2/3 hoch in
Gelkassette gießen, mit H2O überschichten,
polymerisieren lassen (ca. 30 min).
Sammelgel 4,5 %ig für 2 Gele (1,5 mm)
0,75 ml Acrylamid-Stammlösung
1,7 ml Sammelgelpuffer
4,25 ml H2O
20 µl APS 10 %
12 µl TEMED
Wasser vom festem Trenngel entfernen,
Sammelgel auf Trenngel gießen, Taschenkamm
einschieben, polymerisieren lassen (ca. 30 min)
SDS PAGE-Puffer (Laufpuffer)
50 mM Tris/HCl pH 8,3
384 mM Glycin
0,1 % (w/v) SDS
SDS Probenpuffer
200 mM Tris/HCl pH 6,8
400 mM Dithiothreit (DTT)
8 % (w/v) SDS
0,4 % (w/v) Bromphenolblau
40% (v/v) Glycerin
Kathodenlösung
40 mM 6-Aminohexansäure
20 % (v/v) Methanol
Anodenlösung 1
0,3 M Tris/HCl pH 10,4
20 % (v/v) Methanol
16
Material und Methoden
Anodenlösung 2
25 mM Tris/HCl pH 10,4
20 % (v/v) Methanol
TBS (Tris-Buffered Saline, 25 mM Tris)
8 g NaCl
0,2 g KCl
3 g Tris
in 800 ml H2O lösen, pH auf 7,4 einstellen,
mit H2O auf 1 l auffüllen
(20x konzentriert hergestellt)
TBS/Tween
0,1 % (v/v) Tween®20 in TBS
Blockierungslösung
6 % (w/v) Magermilchpulver in TBS Tween
sekundärer Antikörper
Anti-Rabbit IgG, Heavy and Light Chain (Goat),
Peroxidase Conjugate (Calbiochem, Darmstadt)
“Enhanced Chemiluminescence”
2.5
Super Signal® West Dura Trial Kit (Pierce)
Sonstige Puffer und Lösungen
PCR-Puffer (5 x)
15 mM MgCl2
100 mM (NH4)2 SO4
0,08 % Triton X-100
20 % DMSO
250 mM KCl
50 mM Tris/HCl pH 8,3
Protein-Extraktionspuffer
500 mM NaCl
250 mM Tris/HCl pH 7,5
2,5 % (v/v) Triton X-100
50 mM β-Mercaptoethanol
17
Material und Methoden
10 µl/ml Protease-Inhibitor-Cocktail (SigmaAldrich, Steinheim), frisch zugesetzt
Toluidin Blau O (Serva)
0,03 g Toluidin Blau O
in 100 ml lösen
Sudan Black (Serva)
0,1g Sudan Black in 50 ml
96 % Ethanol lösen
50 ml Glycerin hinzufügen
2.6
Medien
Nutrient Broth
8 g/l Nutrient Broth No. 4 (Fluka)
15 g/l Agar
Autoklaviert (20 min)
2.7
Methoden
2.7.1 Reverse Transkription
Die reverse Transkriptionsreaktion wurde mit der RevertAID™ M-MuLV Reverse
Transkriptase (MBI-Fermentas) durchgeführt. Für die reverse Transkriptionsreaktion wurde
4µg Gesamt RNA eingesetzt und mit DEPC behandeltem Wasser auf 16 µl aufgefüllt. Zu
diesem Volumen wurde 4 µl DNase (RNase frei) und 2 µl 10 x Puffer zugegeben und für 30
min bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurden 2 µl EDTA hinzugefügt und zur
Inaktiverung der DNase ein Hitzeschritt (15 min bei 70 °C) durchgeführt. 8 µl des Ansatzes
wurden auf ein Kontrollgel aufgetragen. Für die reverse Transkription wurden zu 10 µl des
Ansatzes 1 µl 10 mM oligo(dT) hinzugegeben und für 5 min bei 70 °C inkubiert, danach
sofort auf Eis. Nun wurde mit 4 µl 5 x Reaktion-Puffer, 2 µl dNTP-Mix (10mM) und mit 2 µl
Wasser auf 19 µl aufgefüllt, für 5 min bei 37 °C inkubiert, und wieder auf Eis gestellt. Zum
Schluss gab man 200 U der Reversen Transkriptase hinzu und inkubierte 60 min bei 42 °C.
18
Material und Methoden
Die Reaktion wurde durch einen Hitzeschritt (15 min bei 70 °C) gestoppt. Für die
anschließende PCR wurde je 1,0 µl cDNA verwendet, der Rest wurde bei -20 °C eingefroren.
2.7.2 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die Standard-PCR wurde in einem Volumen von 25/50 µl durchgeführt, die Ansätze
enthielten dabei je nach Ausgangsmaterial (Plasmid-DNA, genomische DNA, cDNA)
unterschiedliche Mengen an Templat-DNA, 5/10 µl 5x PCR-Puffer, 1/2 µl dNTPs (10 mM),
je 1/2 µl “forward” und “reverse” Primer (10 µM) und 1 µl Taq-Polymerase (5 U/µl).
Aufgefüllt wurde mit autoklaviertem ddH2O. Die verwendeten Programme bestanden aus
folgenden Zyklen:
PCR-Programm (1)
PCR-Programm (2)
PCR-Programm (3)
95 °C/2 min (1 x)
95 °C/5 min (1 x)
95 °C/5 min (1 x)
95 °C/30 sec
95 °C/30 sec
95 °C/30 sec
58 °C/40 sec
30 x
58 °C/30 sec
25-35 x
55 °C/30 sec
72 °C/60 sec
72 °C/45 sec
72 °C/45 sec
72 °C/3 min
72 °C/7 min
72 °C/7 min
35 x
2.7.3 Auftrennung und Sichtbarmachung der DNA
Die Auftrennung von DNA erfolgte auf TAE-Agarosegelen (1 % Agarose, 1 µl 1%
Ethidiumbromidlösung/ 120 ml Gelvolumen) in TAE-Puffer bei 80 bis 120 V. Vor dem
Auftragen der Proben wurden diese mit 10 % (v/v) Ladepuffer versetzt. Als Größenstandard
wurden 5 µl 1kb DNA-Ladder (GeneRulerTM 1kb DNA ladder, Fermentas) aufgetragen.
Nach der Auftrennung wurde die DNA unter UV-Licht sichtbar gemacht und die Lage im Gel
mit dem INFINITY-CAPT-SYSTEM, (Peqlab) dokumentiert.
19
Material und Methoden
2.7.4 Reinigung der PCR-Produkte aus Agarosegelen
Das gewünschte DNA-Fragment wurde unter UV-Licht aus dem Gel ausgeschnitten mit Hilfe
des QIAquick® Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) nach Protokoll des Herstellers eluiert.
2.7.5 Reinigung der PCR-Produkte
Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden mit Hilfe des QIAquick® PCR Purification Kit
(Qiagen, Hilden) nach Protokoll des Herstellers gereinigt.
2.7.6 Einbettung von Gewebe von Tomate in Technovit 7100®
Hypocotyl, Blattstiel und Wurzel von Tomatenpflanzen (UC82B und “Hair pin”-Pflanzen)
wurden unter fließendem Wasser von Verunreinigungen gereinigt, und mit einer Rasierklinge
in 0,5 cm große Segmente geschnitten.
Die Segmente, wurden in einem Gemisch aus Formaldehyd, Eisessig, und 70 % Ethanol
fixiert (5 % Formaldehyd (37 %)), 5 % Eisessig (99 %), 90 % Ethanol (70 %)), welches unter
Vakuum infiltriert wurde, bis keine Bläschenbildung mehr zu erkennen war. Die
Fixierungslösung wurde 3-mal ausgetauscht. Die Segmente wurden für drei Tage in der
Fixierungslösung belassen.
Nach der Fixierung erfolgte ein Waschschritt, 30 min mit 75 % Ethanol. Anschließend wurde
zweimal mit 75 % Ethanol 30 min infiltriert. Die Segmente wurden über Nacht in 75 %
Ethanol belassen.
Anschließend wurde das Gewebe dehydriert. Dazu wurde das Gewebe zunächst für sechs
Stunden mit 90 % Ethanol, dann für 18 Stunden mit 95 % Ethanol infiltriert, bis keine
Bläschen mehr zu erkennen waren. Anschließend wurde dreimal für drei Stunden mit
absolutem Ethanol und abschließend für 18 Stunden mit absolutem Ethanol infiltriert. Es
folgte die Infiltration eines Gemisches aus zwei Teilen Ethanol und einem Teil Technovit
7100 Basislösung, gefolgt von Ethanol/Technovit 1/1, Ethanol/Technovit 1/2, und reiner
Technovit Basislösung. In der Basislösung wurden die Segmente für 18 Stunden belassen.
Anschließend wurde Technovit Basislösung mit Härter I infiltriert (Vorbereitungsflüssigkeit).
Der Vorbereitungsflüssigkeit wurde der Härter II zugegeben, die Segmente wurden in der
20
Material und Methoden
Histoform S ausgerichtet, und bei Raumtemperatur (RT) zur Polymerisation belassen. Nach
der Polymerisation, wurden die Technovit Blöcke mit Technovit 3040 auf die Histoblocks
aufgeklebt.
2.7.7 Schneiden von Dünnschnitten am Rotationsmikrotom
Der Histoblock wurde in den Objekthalter vom Rotationsmikrotom (1165/ROTOCUT,
JUNG) fest eingespannt. Durch gleichmäßige Bewegung wurden Schnitte von 5 µm erstellt.
Die Sektionen wurden mit einem Pinsel auf die Objektträger (Super Frost® Plus, MenzelGläser) übertragen, auf die vorher Wasser (100 µl) getropft wurde. Anschließend wurden die
Schnitte bei 60 °C auf einer Heizplatte gestreckt.
2.7.8 Färben mit Toluidin Blau
Die auf den Objektträgern haftenden Schnitte, wurden anschließend zur weiteren
Untersuchung gefärbt. Dafür wurde 0,03 g Toluidin Blau O Salz in 100 ml Wasser gelöst.
Anschließend gab man einen Tropfen (50 µl) der Färbelösung auf die Schnitte, und inkubierte
diese 5 Minuten bei Raumtemperatur. Anschließend wurden sie unter fließendem Wasser
gewaschen, um die überschüssige Farbe zu entfernen.
2.7.9 Färben mit Sudan Black
0,1 g Sudan Black Salz wurde in 50 ml 96 % Ethanol gelöst. Anschließend wurde die
Suspension filtriert, und mit 50 ml Glycerin versetzt. Zum Färben wurden die Segmente mit je
einem Tropfen (50 µl) der Sudan Black Färbelösung für 5 Minuten bei 60 °C inkubiert.
Anschließend wurden die Objekte unter fließendem Wasser gewaschen.
21
Material und Methoden
2.8
Untersuchung der Segmente mit dem Lichtmikroskop
Die gefärbten Sektionen wurden mit dem Lichtmikroskop (Axioskop 2 plus, Zeiss) im
Hellfeld betrachtet. Hierzu wurden verschiedene Vergrößerungen verwendet (x 2,5, x 10, x
40).
2.8.1 Northern Blot
Zur Kontrolle der Qualität der RNA und um das Expressionsmuster einzelner Gene zu
überprüfen wandte man die Methode der Northern Blot Hybridisierung an.
Dazu wurden 4 identische Gele hergestellt, ein Gel für die Ethidiumbromidfärbung, und die
restlichen drei Gele zum Blotten. Als erster Schritt wurde ein denaturierendes Gel bestehend
aus 3 g Agarose, 180 ml H2O, 25 ml 10 x RNA Gelpuffer und 45 ml Formaldehyd gegossen.
Dann wurden 5,5µg RNA (max. 5,5µl) mit 1 µl 10 x RNA Gelpuffer, 3,5 µl Formaldehyde
und 10 µl Formamide versehen (Endvolumen 20µl), 15min bei 65°C inkubiert, anschließend
auf Eis abgeschreckt und dann anzentrifugiert. Nun wurden 2µl Ladepuffer zugefügt, die
Gelkammer mit 1xGelpuffer gefüllt und 20µl der Probe geladen. Bei der Elektrophorese
wurde eine Spannung von 120 V angelegt. Bei einer Laufstrecke des Bromphenolblau
Farbstoffs von ca. 9 cm wurde die Elektrophorese gestoppt. Nach dem Lauf wurde das Gel
zweimal 20 min in einem großen Volumen Wasser geschwenkt, anschließend der Teil für die
Ethidiumbromidfärbung abgeschnitten, der anschließend 30min in Wasser mit 1µg/ml
Ethidiumbromid inkubiert wurde. Die Gele die für das Blotten vorgesehen waren, wurden
noch 15min in 10x SSC gewaschen. Anschließend wurde die Blottingapparatur in einer
Glasschale aufgebaut, wobei 10x SSC als Transferpuffer diente.
22
Material und Methoden
Aufbau der Blottingapparatur:
200g
Glasplatte
ca. 5cm Papierhandtücher
3 Lagen Gel-Blotting-Papier GB 002
Nitrocellulosemembran
Gel
2 Lagen Gel-Blotting-Papier GB 002
Glasplatte
Glasschale
10xSSC
Die Gele wurden auf eine “Brücke” aus zwei Lagen Gel-Blotting-Papier GB 002 (Roth)
gelegt. Rund um das Gel wurde mit Parafilm abgedichtet. Die Nitrocellulosemembran wurde
zuerst mit sterilem ddH2O angefeuchtet, und anschließend in 10 x SSC getaucht. Die
Nitrocellulosemembran wurde danach auf das Gel gelegt. Drei Stücke Gel-Blotting-Papier
wurden in Größe des Gels geschnitten, mit 10 x SSC angefeuchtet, und einzeln auf die
Nitrocellulosemembran aufgelegt. Auf das Gel-Blotting-Papier wurde nun ein Stapel
Papierhandtücher aufgelegt, und mit einem Gewicht von ca. 200 g beschwert. Der Transfer
erfolgte ÜN bei RT.
Das Gel für die Ethidiumbromidfärbung wurde nach der Inkubation mit der Färbelösung über
Nacht in einem großen Volumen Wasser gewaschen und am darauf folgenden Tag wurde das
Ergebnis mit Hilfe einer Videodokumentationsapparatur festgehalten.
Nach dem Transfer, wurde das Papier entfernt, und eine Ecke des Blots wurde zur
Markierung abgeschnitten. Der Blot wurde kurz in 2 x SSC geschwenkt, anschließend auf ein
Stück Gel-Blotting-Papier mit der Schichtseite nach oben angetrocknet. Danach wurde die
RNA durch UV-Licht (Stratalinker, Stratagene) auf der Membran fixiert. Der Blot wurde bei
RT vollständig getrocknet, und zwischen Filterpapier bei RT bis zur weiteren Verwendung
aufbewahrt.
23
Material und Methoden
2.8.2 Hybridisierung von Northern Blots mit radiomarkierten Sonden
Für die Hybridisierung wurden die Blot’s mit ddH2O befeuchtet, und anschließend in 5 x SSC
überführt. Danach gab man die Blot’s aufgerollt und mit der RNA-Seite nach oben in die
Hybridisierungsröhren, und man setzte 20 ml Prä-Hybridisierunslösung hinzu. Die PräHybridisierung erfolgte mindestens 2 Stunden bei 42 °C.
Für die Markierung der Proben wurde 25 ng DNA in 21 µl ddH2O 5 min aufgekocht, danach
auf Eis abgekühlt, und kurz anzentrifugiert. Auf Eis wurde hinzugefügt:
1 µl 500 µM dATP
1 µl 500 µM dTTP
1 µl 500 µM dGTP
20 µl 2,5 x Random Primer Lösung
5 µl (50 µCi) (α-32P)-dCTP mix
1 µl Klenow-Fragment
Mischen, kurz anzentrifugieren, 10 Minuten bei 37 °C inkubieren. Danach 5 µl Stop-Puffer
hinzufügen, gut mischen und kurz anzentrifugieren. Zur Reinigung der Sonde, wurde eine
Bio-Spin-Column (BioRad) unten geöffnet, in ein 2 ml Eppendorfgefäß gestellt, und die
Lösung innerhalb der Säule wurde entfernt. Es wurde 2 Minuten bei 3500 rpm (1000 x g)
zentrifugiert, und der Durchlauf entfernt. Das Säulchen wurde in ein 1,5 ml SchraubdeckelEppendorfgefäß überführt. In der Mitte der Säule wurden 55 µl der radioaktiven Probe
aufgetragen, und 4 Minuten bei 3500 rpm (1000 x g) zentrifugiert. Die benutzte Säule wurde
entsorgt, und die Aktivität im Durchlauf wurde bestimmt. Die Probe wurde anschließend 5
Minuten
gekocht,
auf
Eis
abgeschreckt
und
kurz
anzentrifugiert.
Aus
der
Hybridisierungsröhre wurde die Prähybridisierungslösung entfernt und durch 10 ml
Hybridisierungslösung ersetzt. Der Lösung wurde die denaturierte Sonde zugesetzt, und die
Hybridisierung erfolgte bei 42 °C ÜN. Am darauffolgenden Tag wurden die Filter gewaschen.
Die Hybridisierungslösung wurde
ausgegossen und es wurde kurz mit Waschlösung 1
gespült. Dann wurde 5min in Lösung1 gewaschen, währenddessen auf 60°C geheizt wurde.
Anschließend wurde 30min bei 60°C in Lösung 1 und 30min bei 60°C in Lösung2
gewaschen.
Nach dem Waschen wurde der Filter in eine Schale mit Lösung2 überführt, zwischen
Frischhaltefolie eingepackt damit diese nicht austrocknen und je nach Stärke der Aktivität
zwischen 5-14 Tagen bei -80 °C auf einen Röntgenfilm exponiert.
24
Material und Methoden
2.8.3 Strippen der Blots
Die Membranfilter wurden aus der Frischhaltefolie ausgepackt, in eine Glasschale mit etwas
Waschlösung überführt. 400 ml der Waschlösung wurde vorher in einer Glasschale in der
Mikrowelle bis zum Siedepunkt erhitzt, und die Membranfilter wurden damit übergossen.
Anschließend wurde die Glasschale mit der Waschlösung und den Membranfilter nochmals
für zwei Minuten in die Mikrowelle gestellt, und danach ließ man sie auf einen Schüttler
abkühlen. Diese Waschung wurde noch zweimal wiederholt. Nach der Waschung wurden die
Membranfilter auf Filterpapier getrocknet und bei RT gelagert.
2.8.4 Extraktion phenolischer Verbindungen (nach Goldwasser et al., 1999)
Hypocotyle und Blattstiele von vier Wochen alten Tomaten-Pflanzen, wurden in flüssigem
Stickstoff gemörsert. Anschließend wurde das Pflanzenpulver, in ein Eppendorfgefäß mit 1
ml 50 % Methanol übertragen, und 90 Minuten bei 80 °C inkubiert, um die löslichen Phenole
zu extrahieren. Nach anschließender Zentrifugation bei 14 000 rpm für 15 Minuten in der
Eppendorf Zentrifuge 5402, wurde der Überstand dekantiert und bis zur Bestimmung der
löslichen Phenole im Kühlschrank gelagert. Zur Hydrolyse gebundener Phenole wurde das
Sediment in 1 ml 0,5 N NaOH aufgenommen, und für 24 Stunden bei RT geschüttelt.
Anschließend wurde mit 0,5 ml 1 N HCl neutralisiert. Nach Zentrifugation (15 min, 14 000
rpm in Eppendorf 5402) wurde der Überstand dekantiert und zur Bestimmung der
gebundenen Phenole verwendet. Das Sediment, wurde zweimal mit je 1 ml ddH2O und einmal
mit 1 ml Methanol gewaschen, und abzentrifugiert (15 min, 14 000 rpm in Eppendorf 5402).
Nach der letzten Zentrifugation wurde der Überstand verworfen, und das Sediment für 48
Stunden in Alufolie bei 37 °C getrocknen. Anschließend wurde das Trockengewicht des
Sediments bestimmt. Zur Bestimmung des Ligningehaltes wurde das trockene Sediment in 1
ml 2 N HCl mit 100 µl Thioglycolsäure aufgenommen, und für vier Stunden bei 95 °C im
Heizblock (Eppendorf, Thermomixer Comfort) inkubiert. Nach vier Stunden wurde auf Eis
abgekühlt, und 10 Min bei 14 000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das
Sediment wurde zweimal in je 1 ml ddH2O gewaschen und zentrifugiert (15 min, 14 000 rpm,
in Eppendorf 5402). Anschließend wurde das Sediment in 1 ml 0,5 N NaOH resuspendiert
und ÜN bei 4 °C geschüttelt. Unlösliche Bestandteile wurden abzentrifugiert (10 min, 14 000
rpm), und der Überstand abgenommen. Das Sediment wurde in 0,3 ml ddH2O gewaschen und
25
Material und Methoden
abzentrifugiert (10 min, 14 000 rpm), und der Überstand wurde mit dem Überstand vom
vorherigen Schritt vereinigt.
Die vereinigten Überstände wurden mit 0,2 ml konzentrierter HCl angesäuert, und bei 4 °C
ÜN gefällt. Das Präzipitat wurde abzentrifugiert (15 min, 14 000 rpm), mit 1 ml 0,1 N HCl
gewaschen, und erneut abzentrifugiert. Das Präzipitat wurde nun in 1 ml 0,5 N NaOH
aufgenommen.
2.8.5 Bestimmung des Gehalts an löslichen und gebundenen Phenolen
(Folin-Ciocalteu) (nach Goldwasser et al., 1999)
Jeweils 100 µl der Methanol (lösliche Phenole) bzw. NaOH (gebundene Phenole) Extrakte,
wurden mit 900 µl ddH2O auf 1 ml aufgefüllt, mit 0,5 ml 2 N Folin-Ciocalteu’s Phenol
Reagenz versetzt, gut gemischt und für 3 Minuten bei RT inkubiert. Nach 3 Minuten wurde
2,5 ml 20 % Na2CO3 hinzugegeben, ordentlich vermischt, und für eine Stunde bei RT
stehengelassen. Anschließend wurde die Konzentration der Phenole als p-CumarsäureÄquivalente, bei einer Wellenlänge von 725 nm im Photometer (Carry 100 BIO) ermittelt.
2.8.6 Bestimmung des Gehalts an Lignin (nach Goldwasser et al., 1999)
Der
Ligningehalt
wurde
Photometrisch
bei
280
nm
als
Lignin-ähnliche
Thioglycolsäurederivate bestimmt.
Die Proben wurden dazu 10fach verdünnt, und die Absorption (OD280, Eppendorf, Bio
Photometer) wurde ermittelt. Die Werte wurden angegeben als Extinktion/gTrockengewicht
2.8.7 HPLC-Analyse phenolischer Verbindungen
Die Chromatographie gehört zu den Verfahren, bei denen Stoffgemische untersucht werden,
indem man sie in ihre einzelnen Bestandteile auftrennt.
Basis der Auftrennung ist die
unterschiedliche Verteilung der Stoffe in zwei Phasen. Die mobile Phase (Flüssigkeit oder
Gas) bewegt sich an der stationären Phase (Feststoff oder Flüssigkeit) vorbei und nimmt die
Stoffe dabei unterschiedlich schnell mit.
26
Material und Methoden
Bei der Säulen-Chromatographie befindet sich die stationäre Phase in einer Säule
(NUCLEOSIL 5, C 18, 120A), durch die die mobile Phase fließt (Laufmittel A: 0,25 %
H3PO4 in HPLC-Wasser: Laufmittel B: 0,25 % H3PO4 in Acetonitril). Die zu trennenden
Proben werden auf der Säule festgehalten, und durch einen Gradienten, bestehend aus den
Laufmitteln A und B von der Säule eluiert. Die Detektion erfolgte bei einer Wellenlänge von
254 nm. Injiziert wurde ein Volumen von 50 µl der methanolischen bzw. NaOH-Extrakte, bei
einer Durchlaufgeshwindigkeit von 1 ml/min. Das verwendete HPLC-System war die La
Chroma®, von Hitachi.
Verwendete Gradienten:
Zeit (min)
Laufmittel A %
Laufmittel B %
Durchlauf (ml/min)
0
100
0
1
30
65
35
1
40
0
100
1
40,1
100
0
1
65
100
0
1
Zeit (min)
Laufmittel A %
Laufmittel B %
Durchlauf (ml/min)
0
100
0
1
50
65
35
1
60
0
100
1
60,1
100
0
1
85
100
0
1
2.8.8 Infektion durch Xanthomonas campestris pv. campestris
Sieben Wochen alte Tomatenpflanzen (5 x UC82B und 5 x HP 1.3 abc) wurden mit dem
Pflanzenpathogen Xanthomonas campestris pv. campestris Stamm 93-1 infiziert.
Die Bakterien wurden für drei Tage bei 30 °C auf Nutrient Broth-Medium (NB) (8 g NB mit
15 g Agar/l) kultiviert. Anschließend wurden über Nacht (ÜN) Kulturen von den Bakterien in
NB Flüssigmedium angesetzt (8 g NB/l). Am folgenden Tag wurde die Bakteriensuspension
auf einem OD600 Wert von 0,4 mit ddH2O verdünnt. Die Suspension wurde nochmals 1:100
27
Material und Methoden
mit ddH2O verdünnt, zu einer endgültigen Konzentration von 106 colony-forming-units/ml
(cfu/ml).
Die Suspension (50 µl, 50 000 cfu) wurde anschließend mit einer Spritze (ERSTA® 1 ml) in
die Blätter infiltriert. Infizierten Blätter von jeder Pflanze wurden nach 24 Stunden mit einem
Skalpell entfernt, und in einem 2 ml Eppendorfgefäß in 1 ml Proteinextraktionspuffer mit 10
µl Protease-Inhibitor-Cocktail mit einem Minithorax (POLYTRON PT 1200, KINEMATICA
AG) homogenisiert. Anschließend wurde eine Verdünnungsreihe in ddH2O erstellt (103, 104,
105, 106, 107-pro Probe/Pflanze), und je 100 µl (pro Probe/Pflanze) auf NB-Platten
ausplattiert. Die Platten wurden für drei Tage bei 30 °C kultiviert, wonach die Anzahl der
Kolonien auf den verschiedenen Platten ermittelt und gemittelt wurde. Anhand dieser Werte
wurde eine Bakterienwachstumskurve mit Hilfe des Computerprogramms EXEL erstellt. Für
das Experiment wurden fünf HP 1.3 abc und fünf UC82B benutzt.
2.8.9 Isolierung von Blattproteinen
Die Extrakte von 2.8.7 wurden 5 Minuten bei 14 000 rpm und 4 °C in Eppendorf 5402
zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Die
Aufbewahrung des Proteinextraktes erfolgte bei -80 °C.
2.9
Bestimmung der Proteinkonzentration (Bradford Test)
Zur Messung der Proteinkonzentration der Extrakte wurde von einer 1:250 –Verdünnung, 800
µl entnommen, und mit 200 µl Bradford Reagenz (Roti®-Quant, Roth) versetzt. Nach 10
Minuten bei RT wurde die Proteinkonzentration über die Absorptionsänderung bei 595 nm
gegen BSA (Rinderserumalbumin Fraktion V, Roth, Karlsruhe) als Standard ermittelt.
2.9.1 Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese (DISK-PAGE) und
Western Blot
Proteinextrakte wurden 3:1 mit SDS Probenpuffer versetzt, für 10 min im Wasserbad gekocht
und über Polyacrylamidgele (12 %) in SDS PAGE-Puffer bei 100 V aufgetrennt. Als
28
Material und Methoden
Größenstandard wurden 3 µl „PageRulerTM Prestained Protein Ladder“ (Fermentas)
aufgetragen.
Anschließend wurden Proteine vom Gel auf Blotting Membranen (Westran® Clear Signal,
zugeschnitten auf 9 x 5,5 cm, Schleicher & Schuell, Dassel) übertragen. Das ebenfalls auf 9 x
5,5 cm zugeschnittene Blotting-Papier (NOVABLOT Elektroden-Papier, Amersham) wurde
10 min in den entsprechenden Puffern gewässert (drei Papiere in Anodenlösung 1, sechs
Papiere in Anodenlösung 2, sechs Papiere in Kathodenpuffer). Die Membran wurde kurz in
Methanol getaucht und dann 10 min in Anodenlösung 1 gewässert. Die Graphitelektroden
wurden etwa 30 min in H2O gewässert, abgetrocknet und die Blotting Apparatur wie aus der
Abbildung ersichtlich luftblasenfrei aufgebaut.
Kathode
6 Lagen Papier in Kathodenlösung
Gel
Membran
3 Lagen Papier in Anodenlösung 1
6 Lagen Papier in Anodenlösung 2
Anode
Nach elektrophoretischem Transfer während 1,5 h bei 100 mA/Blot wurden die Membranen
ÜN in Blockierungspuffer (6 % Magermilchpulver in TBS/Tween) unter Schütteln bei 4 °C
abgesättigt. Die Membranen wurden anschließend mit dem primären Antikörper (antiLeMMP1, 1:400 in Blockierungspuffer) zwei Stunden bei RT auf einem Schüttler inkubiert.
Die Membranen wurden anschließend dreimal während 5 Minuten mit TBS/Tween
gewaschen. Die Inkubation mit dem sekundären Antikörper (Anti-Rabbit IgG, Heavy and
Light Chain (Goat) Peroxidase Conjugate (Calbiochem, Darmstadt), 1:10.000 in
Blockierungspuffer) erfolgte während 1 h bei Raumtemperatur. Anschließend wurde wie oben
dreimal mit TBS/Tween gewaschen und der Blot mittels enhanced chemiluminescence (ECL)
entwickelt. Dazu wurden 200 µl frisch angesetzte ECL-Lösung (Super Signal® West Dura
Trial Kit) für 5 min hinzugegeben. Nach dem Abtropfen des Blots wurde dieser in Folie
gelegt und in der Dunkelkammer auf Röntgenfilm (CL-XPosure™ Film, Pierce) exponiert.
29
Ergebnisse
3.
Ergebnisse
3.1
“Silencing” von LeMMP-1
Zur funktionellen Charakterisierung der LeMMP-1 in Tomatenpflanzen sind im Vorfeld
dieser Arbeit von Elke Sieferer transgene Pflanzen erzeugt worden, die ein Hairpin-Konstrukt
zur Unterdrückung der LeMMP-1 Expression durch RNA-Interferenz (Wesley et al., 2001)
tragen. Es stehen fünf transgene Linien zur Verfügung, die in der T0-Generation mit HP 1, HP
2, HP 3, HP 4 und HP 5 bezeichnet wurden. Individuen der T1 Generation wurden mit HP 1(2,
3, 4, 5) .x, die der T2 Generation mit HP 1 (2, 3, 4, 5) .x.y bezeichnet. Im Rahmen dieser
Arbeit sollte zunächst überprüft werden, ob das Hairpin-Konstrukt tatsächlich zum
“silencing” der LeMMP-1 Expression in den transgenen Linien geführt hat. Außerdem sollte
überprüft werden, ob das “silencing” für LeMMP-1 spezifisch ist, oder ob eine zweite MMP
der Tomate, die anhand von EST`s (expressed sequence tag) in Datenbanken nachgewiesen
werden konnte, ebenfalls betroffen ist. Zum Nachweis des “silencing” auf Ebene der
Transkripte wurde die Technik der Reversen Transkriptase (RT) – PCR eingesetzt. RNAPräparationen aus Hypocotylen und Sprossmaterial oberhalb der Kotyledonen von 24 Tage
alten Keimlingen der Linien HP 1.6, HP 2.9, HP 5.4 und UC82B (Wildtyp Kontrolle) wurden
von Andreas Schaller zur Verfügung gestellt. Die während der PCR eingesetzten Primerpaare
sollten jeweils spezifisch cDNA-Fragmente von LeMMP-1 und LeMMP-2 amplifizieren
(siehe Anhang).
Zu Kontrollzwecken, und zur Abschätzung der Templatmenge wurde eine PCR auf Aktin
(Abb. 3.1.1) durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Konzentration des Aktintranskriptes in den
acht zu untersuchenden Proben (Spuren 1-8 in Abb. 3.1.1) ähnlich hoch ist. Ein Vergleich mit
der Kontrollreaktion mit genomischer DNA als Templat zeigte ausserdem, dass die RNAPräparation frei von DNA-Verunreinigungen waren (Spur 10 in Abb. 3.1.1).
Die Abbildung 3.1.2 zeigt, dass die Transkripte von LeMMP-1 in Hypocotyle der transgenen
Linien HP 1.6, HP 2.9, HP 5.4 im Vergleich zum Wildtyp deutlich vermindert sind. In
Blättern zeigte sich jedoch keine Reduktion des LeMMP-1 Transkriptes.
Das Transkript von LeMMP-2 liess sich nur in den Blättern von Kontrollpflanzen nachweisen
(Abb. 3.1.2, Spur 1).
Es wurde auch eine PCR mit Primern spezifisch für das Tomaten Mosaik Virus (TMV)
durchgeführt, um zu überprüfen, ob die verwendeten Pflanzen mit dem TMV infiziert waren
30
Ergebnisse
(Abb. 3.1.2). Dies wurde notwendig, da im Versuchszeitraum eine TMV Infektion in den
Gewächshäusern des Instituts festgestellt wurde. Hier musste sichergestellt werden, dass die
Versuchspflanzen nicht betroffen waren, da anderenfalls keine eindeutige Interpretationen der
Ergebnisse zu erzielen sind. Als Positiv-Kontrolle wurde RNA aus Blattmaterial TMVinfizierter Pflanzen (zur Verfügung gestellt von J. Babo) eingesetzt (Abb. 3.1.2 Spur 9). Hier
zeigte sich ein starkes Signal nach der RT-PCR. In den zu untersuchenden Proben (Spuren 18) liess sich die virale RNA nicht, oder nur in verschwindenden Mengen (Abb. 3.1.2, Spur 5)
nachweisen.
Abschliessend lässt sich sagen, dass in den transgenen HP Linien zumindest im Hypocotyl ein
spezifisches “Silencing” der LeMMP-1 Expression erreicht worden war.
Abb.3.1.1
Nachweis des Aktin Transkriptes durch RT-PCR nach 25, 30 und 35 Zyklen. Als Größenstandard
wurde die 1 Kb DNA-Leiter von Fermentas verwendet. Die Länge der Fragmente ist in bp
angegeben. In den Spuren 1-4 wurde RNA aus Blattmaterial, in den Spuren 5-8 wurde RNA aus
Hypocotyle eingesetzt. 1 = UC82B, 2 = HP 1.6, 3 = HP 2.9, 4 = HP 5.4, 5 = UC82B, 6 = HP 1.6, 7
= HP 2.9, 8 = HP 5.4, 9 = RNA aus Blättern einer TMV infizierten Pflanze (UC82B), 10 =
Genomische Tomaten-DNA, M=Größenstandard.
31
Ergebnisse
Abb.3.1.2
3.2
Nachweis der Transkripte von LeMMP-1, LeMMP-2 und TMV durch RT-PCR nach 30 Zyklen.
Als Größenstandard diente ebenfalls die 1 Kb DNA-Leiter von Fermentas. Die Länge der
Fragmente ist in bp angegeben. In den Spuren 1-4 wurde RNA aus Blattmaterial, in den Spuren 58 wurde RNA aus Hypocotyle eingesetzt. 1 = UC82B, 2 = HP 1.6, 3 = HP 2.9, 4 = HP 5.4, 5 =
UC82B, 6 = HP=1.6, 7 = HP=2.9, 8 = HP 5.4, 9 = RNA aus Blättern einer TMV infizierten
Pflanze (UC82B), 10 = Genomische Tomaten-DNA, M=Größenstandard.
Histologische Untersuchungen
Die HP – Pflanzen zeigen im Vergleich zum Wildtyp (UC82B) einen ausgeprägten Phänotyp.
Der Phänotyp ist im Hypocotyl am deutlichsten ausgeprägt. Dieser ist bereits drei bis vier
Wochen nach der Keimung sichtbar. Es bilden sich dunkle, wahrscheinlich nekrotische
Flecken, die sich mit fortschreitendem Alter der Pflanzen immer mehr ausdehnen, bis das
gesamte Hypocotyl damit überzogen ist. Einhergehend kommt es zum Verlust der Trichome
des Hypocotyls. Blattstiele zeigen einen ähnlichen Phänotyp, der beginnend an den ältesten
Filderblätter zum Absterben und schliesslich zum Abwurf der betroffenen Blätter führt
(Abb.3.2.1). Um die Veränderungen des Gewebes in den HP-Linien genauer zu untersuchen,
wurden Hypocotyle, nach der in Material und Methoden beschriebenen Methode in Technovit
7100 eingebettet, am Rotationsmikrotom geschnitten, und anschliessend mikroskopisch
untersucht.
32
Ergebnisse
B
A
Abb.3.2.1
A) Hypocotyl HP 1.3 abc, B) Hypocotyl UC82B. Gut zu erkennen ist der dunkle, nekrotisch
erscheinende Hypocotyl von HP 1.3 abc, der das ganze Hypocotyl vollständig überzieht. Ebenso
erkennt man das Fehlen der Fliederblätter im Vergleich zu UC82B.
Cortex
Epidermis
Trichom
Xylem
Leitbündel
Phloem
Vasculäres Kambium
Mark
Abb.3.2.2
Übersicht über die zelluläre Organisation im Hypocotyl einer vier Wochen alten UC82B Pflanze.
Querschnitt wurde gefärbt mit Toluidin Blau.
33
Ergebnisse
A
B
Abb.3.2.3
Hypocotyl-Querschnitte vier Wochen alter Tomatenpflanzen, gefärbt mit Toluidin Blau. A) HP
4.3, B) UC82B. Der Pfeil markiert den Bereich unter der Epidermis, wo verschiedenste
phenolische Substanzen eingelagert werden.
A
B
2
1
Abb.3.2.4
A
Abb.3.2.5
Hypocotyl-Querschnitte vier Wochen alter Tomatenpflanzen, gefärbt mit Toluidin Blau. A) HP 1.3
abc, B) UC82B. Der Pfeil (1) markiert die abgestorbene Epidermis. Pfeil (2) markiert das
desorganisierte Gewebe des Cortex.
B
Hypocotyl-Querschnitte vier Wochen alter Tomatenpflanzen, gefärbt mit Toluidin Blau. A) HP 1.3
abc, B) UC82B. Der Pfeil markiert die beginnende Einlagerung phenolischer Substanzen.
34
Ergebnisse
A
Abb.3.2.6
A
Abb.3.2.7
B
Hypocotyl-Querschnitte vier Wochen alter Tomatenpflanzen, gefärbt mit Toluidin Blau. A) HP 1.3
abc, B) UC82B.
B
Hypocotyl-Querschnitte vier Wochen alter Tomatenpflanzen, gefärbt mit Sudan Black. A) HP 1.3
abc, B) UC82B. Pfeile markieren Zellen des Cortex, welche mit Sudan Black gefärbt sind.
Abbildung 3.2.2. zeigt den Querschnitt durch das Hypocotyl einer Tomatenpflanze des
Wildtyps (UC82B). Deutlich ist der geschlossene Zylinder sekundären Xylems zu sehen, der
das Mark umschliesst. Die Abbildung 3.2.6. A, zeigt, dass der Zylinder sekundären Xylems in
HP-Pflanzen noch nicht vollständig geschlossen ist. Im Mark von HP-Pflanzen sind keine
Veränderungen zu erkennen. Das Cortex von HP-Pflanzen zeigt ebenfalls dramatische
Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp (UC82B) (Abb. 3.2.3-3.2.6). In HP-Pflanzen kommt
es im Cortex, in den subepidermalen Zellschichten, zur Akkumulation von phenolischen
Substanzen, die im Wildtyp-Cortex nicht vorkommen (Abb. 3.2.3). Ebenso kommt es in HPPflanzen zur Einlagerung von Cutin und Suberin (Abb. 3.2.7). Das Cortex erscheint in HPPflanzen zusätzlich äusserst desorganisiert (Abb. 3.2.4), und die Cortexzellen unterscheiden
sich in ihrer Form vom Wildtyp-Cortexzellen. Zusätzlich scheint die Epidermis in HPPflanzen teilweise abgestorben zu sein (Abb. 3.2.4). Die Cortexzellen von HP-Pflanzen
35
Ergebnisse
zeigen auch ein Zellmuster, dass an einem sekundären Abschlussgewebe erinnert (Abb.
3.2.6). Die Akkumulation der phenolischen Substanzen beginnt in den subepidermalen
Zellschichten, was in der Abb. 3.2.5 zu erkennen ist.
Zur Identifizierung der eingelagerten Substanzen wurde mit Toluidin Blau und Sudan Black
gefärbt. Toluidin Blau dient zum Nachweis phenolischer Substanzen, wie z.B. Lignin. Es
bietet jedoch keine Möglichkeit zur Bestimmung einzelner Substanzen. Toluidin Blau färbt
Cellulose-Zellwände rot-violett und phenolische Bestandteile der Zellwand grün-blau. Die
Sudanfarbstoffe erlauben es Substanzen wie Suberin und Cutin zu identifizieren, bietet jedoch
nicht die Möglichkeit zwischen diesen zu unterscheiden.
Generell kann gesagt werden, das HP-Pflanzen phenolische Substanzen im Cortex
akkumulieren. Die Färbung mit Sudan Black zeigte, dass Suberin und Cutin eingelagert
werden. Neben Suberin und Cutin, werden weitere phenolische Substanzen eingelagert, die
jedoch nicht identifiziert sind. Die Tatsache, dass das Muster der Toluidin Blau-Färbung die
Bereiche mit einbezieht, die von den Sudan-Farbstoffen gefärbt werden, und über diese
hinausgeht, verstärkt die Vermutung, das es sich um weitere phenolische Substanzen handelt,
die eingelagert werden.
3.3
Northern Blot
Die mikroskopischen Untersuchungen zeigten, dass HP-Pflanzen phenolische Substanzen im
Hypocotyl einlagern. Mit der Methode des Northern Blot, wurde die Expression der
Phenylalanin-Ammoniak-Lyase (PAL), das Schlüsselenzyms in der Synthese von
phenolischen Substanzen in Blättern von UC82B und HP 1.6/2.9/5.4 verglichen. Ubiquitin
(UBQ) diente als positive Kontrolle, da man davon ausgeht, dass Ubiquitin in alle Geweben
in gleichem Masse exprimiert wird. Ein Ethidiumbromid gefärbtes Gel, diente als
Ladekontrolle (Abb. 3.3.1). In der Tat war für Ubiquitin in allen vier Spuren ein Signal
gleicher Stärke zu beobachten. In zwei der drei HP-Linien, nicht aber im Wildtyp, liess sich
das Transkript der PAL nachweisen. Die Synthese und Einlagerung von phenolische
Verbindungen in den Hypocotylen der HP-Linien geht also einher mit einer gesteigerten
Expression der PAL.
36
Ergebnisse
Abb. 3.3.1
3.4
Nothern Blot Analyse. 5,5 µg totaler RNA aus Hypocotyle des Wildtyps und drei LeMMP-1 HPLinien wurden elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran übertragen und mit
radiomarkierte cDNA Sonden für Phenylalanin Ammoniak Lyase (PAL) und Ubiquitin (UBQ)
hybridisiert. Als Ladekontrolle diente ein zweites, mit Ethidiumbromid (EtBr) gefärbtes Gel.
Extraktion phenolischer Substanzen
HP-Pflanzen zeigten bei der Northern Blot Untersuchung (3.3) eine Induktion der PAL im
Vergleich zum Wildtyp. Die PAL ist ein Schlüsselenzym in der Synthese von phenolischen
Verbindungen, und katalysiert die Umwandlung von Phenylalanin zu Zimtsäure, dem
wichtigsten Vorläufer aller phenolischen Verbindungen. Ausserdem wurde während der
histologischen Untersuchungen (3.2) eine Einlagerung phenolischer Verbindungen im
Hypocotyle der HP-Pflanzen beobachtet. Im folgendem sollte die Bildung löslicher und
gebundener Phenole, sowie die Akkumulation von Lignin in den transgenen Linien im
Vergleich zum Wildtyp quantifiziert werden. Untersucht wurden Hypocotyl und Blattstiele
von vier Wochen alten UC82B und HP 1.3 abc Pflanzen. Es wurde die Konzentration in
37
Ergebnisse
jeweils fünf unabhängigen Extrakte aus Organe von UC82b und fünf HP 1.3 abc Pflanzen
bestimmt, und die Mittelwerte wurden graphisch dargestellt (Abb. 3.4.1-3.4.3). Zur
Bestimmung der Konzentration an löslichen und gebundenen phenolischen Verbindungen
wurde der “Folin-Ciocalteu”-Test (Goldwasser et al., 1999) durchgeführt, und die
Konzentration der phenolischen Verbindungen wurde bei einer Wellenlänge von 725 nm als
p-Cumarsäure-Äquivalente im Photometer bestimmt.
B
600
600
500
500
400
400
Konz. µg/gFG
Konz. µg/gFG
A
300
200
100
200
100
0
0
UC82b
Abb. 3.4.1
300
HP 1.3 abc
UC82b
HP 1.3 abc
Lösliche phenolische Substanzen im Blattstiel (A) und im Hypocotyl (B). Gezeigt ist der
Mittelwert von fünf unabhängigen Messungen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung
vom Mittelwert. Die Konzentration phenolischer Substanzen wurde bestimmt als p-CumarsäureÄquivalente bei einer Wellenlänge von 725 nm.
B
350
700
300
600
250
500
Konz. µg/gFG
Konz. µg/gFG
A
200
150
100
50
300
200
100
0
0
UC82b
Abb. 3.4.2
400
HP 1.3 abc
UC82b
HP 1.3 abc
Gebundene phenolische Substanzen im Blattstiel (A) und im Hypocotyl (B). Gezeigt ist der
Mittelwert von fünf unabhängigen Messungen. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung
vom Mittelwert. Die Konzentration an phenolische Substanzen wurde bestimmt als p-CumarsäureÄquivalente bei einer Wellenlänge von 725 nm.
38
Ergebnisse
Man beobachtete eine deutliche Erhöhung der Konzentration an löslichen und gebundenen
phenolischen Verbindungen in Hypocotylen und Blattstielen von HP 1.3 abc. Die HP 1.3 abc
Pflanzen zeigten eine nahezu um das Doppelte erhöhte Konzentration an löslichen und
gebundenen phenolischen Verbindungen (Abb. 3.4.1 B und 3.4.2 B) im Hypocotyl. Die
Konzentration an löslichen und gebundenen phenolischen Verbindungen im Blattstielen von
HP 1.3 abc war ebenfalls deutlich erhöht (Abb. 3.4.1 A und 3.4.2 A).
A
B
Extinction/gTG
Extinction/gTG
500
400
300
200
100
0
UC82b
Abb. 3.4.3
1200
1000
800
600
400
200
0
HP 1.3 abc
UC82b
HP 1.3 abc
A) Ligningehalt des Blattstiels. B) Ligningehalt des Hypocotyls. Lignin wurde bestimmt als
Lignin-ähnliche Thioglycolsäurederivate. Die Konzentration ist als E 280/gTG angegeben. Gezeigt
ist der Mittelwert von fünf unabhängigen Experimenten. Die Fehlerbalken zeigen die
Standardabweichung vom Mittelwert.
Nach der Extraktion von löslichen und gebundenen phenolischen Verbindungen, wurde
Lignin im Rückstand als Thioglycolsäurederivate bestimmt. Für Lignin (Abb.3.4.3) zeigte
sich kein bedeutender Unterschied zwischen UC82B und HP 1.3 abc.
3.5
HPLC-Analyse phenolischer Verbindungen
Mit Hilfe des HPLC-Systems wurden Extrakte löslicher und gebundener phenolischer
Substanzen auf ihre Zusammensetzung untersucht. Als stationäre Phase wurde eine
NUCLEOSIL 5, C 18, 120A Säule verwendet. Als Laufmittel diente 0,25 % H3PO4 in H2O
und 0,25 % H3PO4 in Acetonitril. Detektiert wurde bei einer Wellenlänge von 254 nm.
39
0,25
100
0,2
80
0,15
60
0,1
40
0,05
20
0
Laufmittelkonzentration
(%)
E254
Ergebnisse
Zimtsäure
Sinapinsäure
Ferulasäure
Kaffeesäure
Chlorogensäure
Laufmittel A
Laufmittel B
0
10
20
30
40
50
60
RT (min)
Trennung der Substanzen, die als Standard benutzt wurden (siehe Legende). Für jede Substanz
wurde 50 µl einer Lösung von 1mg/ml Methanol eingesetzt.
0,15
100
0,13
80
0,11
E254
0,09
60
0,07
40
0,05
0,03
20
0,01
-0,01
Laufmittelkonzentration
(%)
Abb. 3.5.1
UC82B
HP 1.3 abc
Laufmittel A
Laufmittel B
0
10
20
30
40
50
60
RT (min)
Trennung gebundener phenolischer Substanzen von UC82B und HP 1.3 abc aus dem Hypocotyl.
Die aufgetragene Menge entspricht 23,8 µgFG.
0,15
100
0,13
80
0,11
E254
0,09
60
0,07
40
0,05
0,03
20
0,01
-0,01
Laufmittelkonzentration
(%)
Abb. 3.5.2
UC82B
HP 1.3 abc
Laufmittel A
Laufmittel B
0
10
20
30
40
50
60
RT(min)
Abb. 3.5.3
Trennung löslicher phenolischer Substanzen von UC82B und HP 1.3 abc aus dem Hypocotyl. Die
aufgetragene Menge entspricht 15,7 µgFG.
40
Ergebnisse
Die Trennung der gebundenen phenolischen Substanzen aus den Extrakten von Hypocotylen
zeigte deutliche Unterschiede in Zusammensetzung und Konzentration phenolischer
Substanzen zwischen HP 1.3 abc undUC82B (Abb. 3.5.2). Die in HP 1.3 abc akkumulierten
Phenole
liessen
sich
anhand
der
Retentionszeiten
nicht
eindeutig
eines
der
Standardsubstanzen (Abb. 3.5.1) zuordnen und müssen daher unidentifiziert bleiben. Die
Trennung der löslichen phenolischen Substanzen (Abb. 3.5.3) gibt keine Hinweise über
Änderungen in Zusammensetzung oder Konzentration dieser Substanzen. Dieser Befund
überrascht angesichts des Ergebnisses der Quantifizierung löslicher Phenole im Hypocotyl
nach Folin-Ciocalteau (Abb. 3.4.1), oder aber ihre Konzentration lag unter der
Nachweisgrenze des eingesetzten HPLC-Systems.
3.6
Infektion durch Xanthomonas campestris pv. campestris
Microarray Analysen im Vorfeld dieser Arbeit zeigten eine Induktion der LeMMP-1 nach
Behandlung mit dem Pilztoxin Fusicoccin. Dies deutete auf eine Funktion des Enzyms in der
Pathogenabwehr. Um zu überprüfen, ob es Unterschiede in der Sensitivität gegenüber
phytopathogenen Bakterien zwischen HP-Pflanzen und UC82B gibt, wurden vier Wochen alte
HP 1.3 abc und UC82B Pflanzen mit dem phytopathogen Xanthomonas campestris pv.
campestris Stamm 93-1 nach der in Material und Methoden beschriebenen Methode infiziert,
und eine Bakterienwachstumskurve wurde erstellt.
1,00E+09
1,00E+08
cfu/Blatt
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
UC82b
1,00E+04
HP 1.3 abc
1,00E+03
1,00E+02
1,00E+01
1,00E+00
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Tage nach der Infektion
Abb.3.6.1
Bakterielle Wachstumskurve erstellt aus den Mittelwerten der ermittelten Kolonienzahlen von HP
1.3 abc und UC82B an den angegebenen Zeitpunkten (siehe Material und Methoden). Die XAchse zeigt die Zeitpunkte der Probenentnahme nach der Infektion. Die Y-Achse zeigt die
ermittelte Anzahl an colony-forming-units in infizierten Fliederblättern.
41
Ergebnisse
Es zeigte sich ein vermindertes Wachstum von Xanthomonas campestris pv. campestris auf
HP 1.3 abc Pflanzen im Vergleich zu UC82B. Während zum Zeitpunkt 0 (Zeitpunkt der
Infiltration) und ein bis zwei Tage nach der Infiltration kein signifikanter Unterschied zu
erkennen ist, werden die Unterschiede des bakteriellen Wachstums zwischen HP 1.3 abc und
UC82B von dritten bis zum achten Tag nach der Infiltration immer größer (Abb. 3.6.1).
A
Abb. 3.6.2
A
B
Expression der LeMMP-1 in UC82B nach Infektion mit Xanthomonas campestris pv. campestris
A) Western Blot, B) SDS-Page Gel, 0 bis 8 Tage nach Infiltration der Bakteriensuspension wurden
Blattextrakte erstellt, und jeweils 15.6 µg Protein wurde analysiert. Der Pfeil markiert die Position
des TMV-Hüllproteins. Als Grössenstandard diente die “Prestained Protein Ladder” (Fermentas;
Grössenangaben in kDa).
B
M
0
1
2
3
4
5
6
7
8
TMV
M
170
130
100
72
55
40
33
24
17
11
Abb. 3.6.3
Expression der LeMMP-1 in HP 1.3 abc nach Infektion mit Xanthomonas campestris pv.
campestris A) Western Blot, B) SDS-Page Gel, 0 bis 8 Tage nach Infiltration der
Bakteriensuspension wurden Blattextrakte erstellt, und jeweils 24,9 µg Protein wurde analysiert.
Der Pfeil markiert die Position des TMV-Hüllproteins. Als Grössenstandard diente die “Prestained
Protein Ladder” (Fermentas; Grössenangaben in kDa).
Wie die Western Blot Analyse in Abb. 3.6.2 zeigt, induziert die Infiltration des
Phytopathogen Xanthomonas campestris pv. campestris die Expression von LeMMP-1 im
UC82B Wildtyp. Am zweiten Tag nach der Infektion ist das erste LeMMP-1 Signal zu
42
Ergebnisse
erkennen, vier Tage nach der Infektion ist die höchste Konzentration erreicht, danach erfolgt
eine Herunterregulierung des Enzyms, mit der niedrigsten Konzentration am achten Tag nach
der Infektion (Abb. 3.6.2).
In HP 1.3 abc war auch nach bakterieller Infektion kein Signal der Le-MMP1 zu erkennen
(Abb. 3.6.3). Offenbar führt das Hairpin-Konstrukt zum effizienten “silencing” der LeMMP-1
in den transgenen Pflanzen.
Wie bereits zuvor erwähnt, kam es im Versuchszeitraum zu einer TMV-Infektion in den
Gewächshäusern des Instituts. In der Tat ist das Hüllprotein des TMV auf Coomassiegefärbten Gelen nachzuweisen (Pfeil in Abb. 3.6.2 B und Abb. 3.6.3 B). UC82B und HP 1.3
abc Pflanzen scheinen in Gleicherweise TMV-infiziert. Dabei ist es wahrscheinlich, dass die
beobachteten Unterschiede in Resistenz gegenüber Xanthomonas campestris pv. campstris
und Induktion der LeMMP-1-Expression nicht auf TMV, sondern auf den Genotyp der
Versuchspflanzen zurückzuführen ist.
Trotzdem sollten die Ergebnisse unter Vorbehalt betrachtet werden, und das Experiment sollte
unbedingt wiederholt werden.
43
Diskussion
4.
Diskussion
Zur funktionellen Charakterisierung der LeMMP-1 in Tomaten wurden in dieser Arbeit
transgene Pflanzen eingesetzt, in denen die Expression der LeMMP-1 durch RNAInterferenze unterdrückt sein sollte. Es galt zunächst zu überprüfen, ob das Hairpin-Konstrukt
in den Tomatenpflanzen tatsächlich zur Unterdrückung der LeMMP-1 Expression auf
Transkript- und Protein-Ebene geführt hatte. Mittels RT-PCR konnte gezeigt werden, dass die
Menge des LeMMP-1-Transkriptes in Hypocotylen der Hairpin-Pflanzen vermindert war. Im
Falle der Linie HP 1.6 war das Transkript nicht mehr nachweisbar (Abb.3.1.2). In Blättern der
Hairpin-Pflanzen dagegen schien die Menge des LeMMP-1-Transkriptes nicht verändert zu
sein (Abb. 3.1.2). Das Resultat ist äußerst überraschend, da auf Proteinebene die LeMMP-1
auch in Blättern nicht nachweisbar ist (Abb. 3.6.3 A). Daher sollten die Produkte der RT-PCR
unbedingt durch Sequenzierung überprüft werden, ob es sich tatsächlich um die LeMMP-1
handelt. Es wäre möglich, dass es sich um cDNAs von Tomaten-Transkripten handelt, die
eine gewisse Ähnlichkeit mit der LeMMP-1 aufweisen, und daher von den LeMMP-1Primerpaaren erkannt wurden. Da von Tomate noch nicht das gesamte Genom entschlüsselt
wurde, muss man diese Möglichkeit in Betracht ziehen. Die Sequenzierung der PCR Produkte
wird in dieser Frage Gewissheit geben.
Das Transkript der LeMMP-2 liess sich mittels RT-PCR in Blättern, nicht aber in
Hypocotylen von Tomatenpflanzen nachweisen (Abb. 3.1.2). Die Expression der LeMMP-2
war in Blättern der Hairpin-Pflanzen unterdrückt. Dieses Resultat ist zunächst überraschend,
kann aber durch die grosse Sequenzähnlichkeit zwischen der LeMMP-1 und LeMMP-2
erklärt werden (siehe Anhang). Im Hinblick auf die Interpretationen der hier erzielten
Ergebnisse ist wichtig, dass eine LeMMP-2 Expression in Hypocotylen des Wildtyps nicht
nachweisbar war. Alle im Hypocotyl der transgenen Pflanzen beobachteten Veränderungen
müssen also auf “silencing” von LeMMP-1 zurückzuführen sein.
Mikroskopische Beobachtungen zeigten in Hypocotylen der Hairpin-Pflanzen einen Verlust
der zellulären Organisation im Cortex (Abb. 3.2.4 A). Im Vergleich zu UC82B KontrollPflanzen waren die Cortexzellen der Hairpin-Pflanzen kleiner, zahlreicher und sehr
unregelmässig geformt und angeordnet, was möglicherweise auf eine unregelmässige
Zellteilung zurückzuführen ist. Gillmor et al. (2005) zeigten, dass Mutationen in einem Gen
(PNT 1) in Arabidopsis thaliana, welches ein Enzym kodiert, das notwendig für die Synthese
44
Diskussion
des GPI-Ankers ist, zur verzögerten Morphogenese (Übergang von Globulär- ins HerzStadium), Störung der Zellteilung (unregelmässige Zellteilungen im Proembryo und der
Hypophyse) und zu Änderungen in den Bestandteilen der Zellwand führt (niedrigere
Konzentration an Cellulose, erhöhte Konzentration von Pektinen, und unregelmässige und
zufällige Ablagerung von Pektin, Xyloglucanen und Callose). All diese Veränderungen,
welche zumindest teilweise an die in den LeMMP-1 Hairpin-Pflanzen beobachteten
Veränderungen erinnern, waren auf die Unfähigkeit der Pflanzen zur Bildung des GPIAnkers, und dadurch zur GPI-Verankerung von Proteinen in der Plasmamembran
zurückzuführen. Von nur sieben Proteinen aus Pflanzen ist eine GPI-Verankerung
experimentell nachgewiesen, und die Sequenz bekannt (Eisenhaber et al., 2003). Vier davon
sind Arabinogalactan Proteine (AGPs). Das sind extrazelluläre Glycoproteine, die einen
Einfluss auf Wachstums und Entwicklungsprozesse haben (Schultz et al., 2000 und Zhao et
al., 2002). So wird für das Protein LeAGP-1 wird eine Beteiligung am Dickenwachstum der
Zellwände und bei der Lignifizierung angenommen(Gao und Showalter, 2000).
Von Gillmor et al. (2005) werden die in der pnt1 Mutanten beobachteten Defekte in
Embryonalentwicklung, Zellteilung und Zellwandsynthese in einen kausalen Zusammenhang
mit dem Verlust des GPI-verankerten AGPs gestellt. Für die LeMMP-1 wird aber auch eine
Verankerung in der Plasmamembran durch einen GPI-Anker prognostiziert (Zimmermann,
2004). Es ist also durchaus denkbar, dass ein Verlust der LeMMP-1 Funktion in der pnt1
Mutante zu den dort beobachteten Veränderungen beiträgt. Die in Hypocotylen der LeMMP-1
HP-Pflanzen beobachteten Störungen in der Zellteilung belegen eine Funktion der LeMMP-1
in der Entwicklung zumindest des Stängelcortex von Tomatenpflanzen. Durch Färbung
mikroskopischer Schnitte, konnte hier auch eine veränderte Zusammensetzung der Zellwand
gezeigt werden. Allerdings scheint es sich nicht wie in der pnt1 Mutante um eine
Veränderung des Anteils an kristalliner Cellulose zu handeln. Durch Färbung mit Toluidin
Blau konnte die Akkumulation von phenolischen Verbindungen in Zellwänden des Cortex
nachgewiesen werden (Abb. 3.2). Der durch Toluidin Blau gefärbte Bereich war teilweise
identisch mit der Färbung durch Sudan Black, das spezifisch hydrophobe Substanzen wie
Cutin und Suberin färbt. Es ist also wahrscheinlich, dass die positive Phenolfärbung auf den
phenolischen Anteil des Suberin zurückzuführen ist. Suberin und Cutin dienen als Matrix für
Wachse, und bilden durch ihren hydrophoben Charakter wasserundurchlässige Schichten.
Derart ausgerüstete Zellen finden häufig als innere (Caspary-Streifen) und äußere Häute
(Wurzel) Verwendung, mit der Funktion den Wasserdurchtritt zu kontrollieren oder zu
verhindern. Im Kork ist Suberin ebenfalls zu finden. Dieser dient dem nachträglichen
45
Diskussion
Abschluss der Oberfläche des Pflanzenkörpers, wie etwa nach Verletzungen. Das in HairpinPflanzen beobachtete Absterben der Epidermis ist möglicherweise auf die Inkrustierung der
Cortexzellen zurückzuführen, da dadurch die Versorgung der Epidermis mit Nährstoffen und
Wasser vermindert ist.
Die Extraktion löslicher und gebundener Phenole und deren Konzentrationsbestimmung,
zeigte erhöhte Konzentrationen in Hairpin-Pflanzen (3.4). Diese Resultate stehen im Einklang
mit der beobachteten Suberinisierung im Cortex von HP-Pflanzen. Es wurde gezeigt, dass die
in verwundeten Kartoffelknollen eintretende Suberinisierung mit einer Steigerung der PALAktivität einhergeht (Bernards et al., 2000 und Oosterhaven et al., 1995). PAL katalysiert die
Umwandlung von Phenylalanin zu Zimtsäure, welche im Phenylpropanweg zu weiteren
phenolischen Substanzen umgewandelt wird. Auch in dieser Arbeit konnte mittels Northern
Blot Analysen (3.3) die Akkumulation von PAL-Transkripten in Hypoctylen von HPPflanzen nachgewiesen werden. Ishizuka et al. (1991) zeigten ebenfalls, dass es zur rapiden
Akkumulation von PAL-Transkripten nach Verwundung in Kartoffelknollen kommt. Eine
chromatographische Trennung phenolischer Substanzen mittels der Methode der HPLC,
bestätigte den zuvor beobachteten gesteigerten Gehalt an gebundenen (in der Zellwand
veresterten) Phenolen, in LeMMP-1 Pflanzen. Auch liessen sich in Extrakten aus
Hypocotylen von HP-Pflanzen Unterschiede in der Zusammensetzung der phenolischen
Substanzen im Vergleich zu UC82B-Kontrollpflanzen feststellen. Eine Identifizierung der
hier gebildeten Phenole durch Vergleich mit Referenzsubstanzen ist allerdings im Rahmen
dieser Arbeit nicht mehr gelungen. Die Trennung löslicher phenolischer Substanzen führte zu
keinem Ergebnis. Möglicherweise waren die zu trennenden Substanzen degradiert, oder ihre
Konzentration lag unter der Nachweisgrenze.
Die Zelluläre Organisation im Stängelcortex von LeMMP-1 HP-Pflanzen sowie die
Suberinisierung der Zellwände erinnert stark an die Ausbildung eines sekundären
Abschlussgewebes (Abb. 3.2). Ob es in diesem Zusammenhang auch zu einer Lignifizierung
der Zellwände kommt, konnte noch nicht eindeutig geklärt werden. Die Tatsache, dass nur ein
Teilbereich der mit Toluidin Blau als phenolhaltig identifizierten Zellwände mit Sudan Black
gefärbt wurden, also suberinisiert waren, mag darauf hindeuten. Allerdings konnte eine
signifikante Erhöhung des Ligningehaltes nicht nachgewiesen werden (Abb. 3.4.3). Hier
sollte der Einsatz Lignin-spezifischer Färbetechniken in histologischen Untersuchungen
Aufschluss geben. Weitere Hinweise könnte die Analyse von Markerenzymen liefern.
Bernards et al. (2000) zeigten, dass es im Zusammenhang der Lignifizierung und
Suberinisierung zur Induktion von Enzymen des Phenylpropanstoffwechsels kommt (PAL,
46
Diskussion
Zimtalkohol Dehydrogenase, 4-Coumaryl-CoA Ligase). Die Cinnamoyl-CoA: NADP+
Oxidoreduktase aber wird charakteristischerweise nur während der Lignifizierung induziert.
Dieses Enzym könnte also als molekularer Marker herangezogen werden, um zwischen
Lignifizierung und Suberinisierung zu unterscheiden (Bernards et al., 2000).
Mikroarray Analysen zeigten, dass die LeMMP-1 nach Behandlung mit dem Pilztoxin
Fusicoccin induziert wird (Frick und Schaller, 2002). In dieser Arbeit wurde darüber hinaus
eine Akkumulation der LeMMP-1 nach Infektion mit Xanthomonas campestris pv. campestris
beobachtet (Abb. 3.6.1) Diese Befunde deuten auf eine mögliche Beteiligung des Enzyms bei
der Pathogenantwort. Sollte die LeMMP-1 eine Rolle in der Pathogenabwehr spielen, würde
man für HP-Pflanzen eine erhöhte Anfälligkeit gegenüber Phytopathogenen erwarten. Die
erzielten Resultate zeigten jedoch ein im Vergleich zu UC82B-Kontrollpflanzen vermindertes
bakterielles Wachstum auf HP-Pflanzen.
Die Resistenz von Tomatenpflanzen gegenüber Xanthomonas campestris pv. campestris
scheint also bei Verlust der LeMMP-1 erhöht zu sein.1 Dieser Widerspruch lässt sich
möglicherweise durch die Tatsache erklären, dass phytopathogene Bakterien mit Hilfe von
Effektorproteinen als Virulenzfaktoren in vielfältiger Weise in den Stoffwechsel der
Wirtspflanze eingreifen. Es wäre denkbar, dass die Phytopathogene die Expression der
LeMMP-1 induzieren um die Besiedlung der Wirtspflanze zu erleichtern. Die Induktion der
LeMMP-1 könnte der Bildung phenolischer Substanzen und der Verstärkung der Zellwand
entgegenwirken und so die Reaktionen der Pathogenabwehr vermindern. HP-Pflanzen haben
die Fähigkeit zur LeMMP-1 Bildung verloren und damit ist den Bakterien möglicherweise ein
wichtiger Faktor, zur Besiedlung der Pflanze entzogen.
Vielleicht ist das verminderte Bakterien-Wachstum auf HP-Pflanzen aber auch ein sekundärer
Effekt, der auf die im Hypocotylen beobachteten Veränderungen der Zellwand zurückzuführen
sein könnte. Sollte es in den Blättern zu ähnlichen Veränderungen kommen, wäre es denkbar,
dass die Einlagerung phenolischer Substanzen wie Suberin für die Bakterien, die
Zugänglichkeit der Wirtszelle erschwert. Der hydrophobe Charakter von Suberin
beeinträchtigt möglicherweise auch die Mobilität der Bakterien. Auch die Akkumulation
löslicher phenolischer Substanzen, mag zu einer erhöhten Resistenz beitragen. Lösliche
phenolische Substanzen wie Isoflavonoide sind in den letzten Jahren vor allem durch ihre
Rolle als Phytoalexine bekannt geworden (Review, Nicholson und Hammerschmidt, 1992).
Phytoalexine sind sekundäre Inhaltsstoffe mit antimikrobieller Wirkung, die als Reaktion auf
eine Infektion gebildet werden, mit dem Ziel, die Ausbreitung der Pathogene in der Pflanze zu
1 Einschränkend soll hier nochmals erwähnt werden, dass es im Versuchszeitraum zu einer TMV-Infektion in den
Gewächshäusern des Instituts kam, von der auch die Pflanzen des bakteriellen Infektionsexperiments betroffen waren.
Die erzielten Ergebnisse sind deshalb mit Vorbehalt zu betrachten.
47
Diskussion
verhindern. Ebenso wurde gezeigt, dass die PAL nach Pathogenbefall induziert wird, was die
Pflanze zur Synthese phenolischer Substanzen veranlasst, um die Ausbreitung der Pathogene
einzudämmen (Review, Nicholson und Hammerschmidt, 1992). Es ist weiterhin bekannt, dass
die Ablagerung von Lignin und anderen polymeren, phenolischen Substanzen, einen Teil der
pflanzlichen Reaktion auf Phytopathogene darstellt (Review, Nicholson und Hammerschmidt,
1992).
Ob der Funktionsverlust der LeMMP-1 direkt oder indirekt für das verminderte bakterielle
Wachstum in HP-Pflanzen verantwortlich ist, werden weitere Untersuchungen zeigen müssen.
Infektionsexperimente mit Bakterien-Stämmen, die wegen Verlustes von Effektorproteinen in
ihrer Pathogenität vermindert sind, könnten möglicherweise diese Frage beantworten.
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54
Anhang
6.
Anhang
6.1
cDNA Sequenz der LeMMP-1 und LeMMP-2
cDNA Sequenz der LeMMP-1 und LeMMP-2. Gezeigt sind die Ansatzstellen der
verwendeten Primer für die LeMMP-1 (Rot) und LeMMP-2 (Grün) die zur Überprüfung des
“Silencing” benutzt wurden. Sternchen (*) markieren homologe Bereiche zwischen der
LeMMP-1 und LeMMP-2.
LeMMP-1
LeMMP-2
ATATATATATAATAAAGAGCAGAGAGAAGTTGCAAGTAAGCAAATTAGAACAATTTAGCA
-----------------------------------------------------------MMP 15
LeMMP-1
LeMMP-2
AGCAAGTTTCTGATGAGGATTCCTTTATTCATCGCCATACTTTTTGTTCTTAGTGTTCCA
---AA-----TGAGGAGGATTCATCTATACATTGCCATTGCTTATGTTGT-AATATTGCA
**
*** ******** * *** *** *****
** **** * * * ** **
MMP 25 b
LeMMP-1
LeMMP-2
TTTCCATC-TTCAGCTCATTTCTTCCCAAATATTTCTTCAATTCCTCCTAATTTATTGAA
AACTAGTTGTTCAGCTCATTTCTTTCCAAATATTTCATCAATCCCTTCTTCTTTACTCAA
* *************** *********** ***** *** ** **** * **
LeMMP-1
LeMMP-2
ACCAAATGCCACTGCCTGGGATGCTTTTAACAAGTTATTAGGATGCCATTCCGGTCAGAC
ACCTAATGCCACTGCTTGGACTTCTTTTCAAAAGTTGTTAGGATGTCAACCTGCTCAGAA
*** *********** *** * ***** * ***** ******** ** * * *****
LeMMP-1
LeMMP-2
GGTCGACGGCTTAGCGAAAATCAAAAAATATTTTCACTACTTTGGATACATTAATAATTC
AGTCGACGGCATTGCTAAAATCAAAAAATATTTTCAACATTTTGGTTACATTAATAATTT
********* * ** ******************** * ***** *************
LeMMP-1
LeMMP-2
TTCCA---CTAACTTCACTGATGATTTTGATGATACTCTTGAATCTGCTCTCAAGACCTA
GAGTAGTTTTAATTTCACTGATGAATTTGATGATACTCTTGAATCTGCTCTCAAGACGTA
*
*** *********** ******************************** **
LeMMP-1
LeMMP-2
CCAGCTTAACTTCAACCTCAACACCACCGGTGTGCTCGACGCGAACACCATTCAGCATCT
TCAGAGAAATTTCAACCTCAAAGCCACCGGTGTGCTCGATGCGCCCACCATTCAGCATCT
***
** *********** **************** *** ***************
LeMMP-1
LeMMP-2
CATAAAACCCAGATGTGGAAACGCTGATGTAGTTAACGGTACTAGTACTATGAACTCCGG
CATAAAACCCAGATGTGGAAATGCCGATCTAGTTAACGGTACTAGTACTATGAACGCTGG
********************* ** *** ************************** * **
LeMMP-1
LeMMP-2
TAAGCCACCGGCAGGTTCTCCGACGATGCACACCGTAGCTCACTACTCCTTCTTTCCGGG
AAAGCC---------------------GCACACGGNGGCTCACTACTCCTTCTTTCCTGG
*****
****** * ******************** **
MMP 13
LeMMP-1
LeMMP-2
AAGTCCACGGTGGCCGGCGAACAAGAGAGATCTGACATATGCTTTTGCACCGCAGAATGG
AAGACCAAAGTGGCCCGAGGGTAAGACTGATTTGACTTATGCCTTTCTACCGGCAAACAA
*** *** ****** * *
**** *** **** ***** *** ****
**
MMP 23
55
Anhang
LeMMP-1
LeMMP-2
ACTGACGGATGATATTAAGATTGTGTTCACACGAGCGTTTGATAGGTGGTCGGAGGTGAC
TTTGACGGATGATATTAAGAGTGTCTTCTCACGTGCGTTTGATCGGTGGTCGGAGGTAAC
****************** *** *** **** ********* ************* **
LeMMP-1
LeMMP-2
TCCATTGACGTTTACTGAAATAGCATCGTACCAATCGGCTGATATTAAGATCGGGTTTTT
CCCGTTGA-----------------------------GCT-------------------** ****
***
LeMMP-1
LeMMP-2
LeMMP-1
CAGCGGAGATCACAACGATGGAGAGCCGTTTGATGGTCCTATGGGGACATTAGCACACGC
---------TCACGG--------------------------------------------****
GTTTTCCCCACCGGCGGGGCATTTTCACTTGGACGGCGAGGAGAACTGGGTGATCGACGG
LeMMP-1
TGCGCCGATAGTTGATGGGAATTTCTTTTCTATATTGTCGGCGGTGGACCTTGAATCGGT
LeMMP-1
TGCGGTTCATGAAATCGGGCATTTATTGGGTTTGGGTCATTCATCCGTAGAAGATGCTAT
LeMMP-1
TATGTACCCGACTTTAGGAGCGGGTACCCGAAGAGTCGAGCTTAGAAATGATGATATATT
LeMMP-1
GGGAGTCCAGGAGTTATACGGGTCTAACCCGAATTATACTGGGCCAAACCCAAATTTGAC
LeMMP-1
TCCGAGCCAAGAGAGTGACACAAATGGAGCCCCGATATTTGAGTTATCATGGTTTCATGG
LeMMP-1
GTTTCTTGGTTTATTCTTTGCTTTGTTCATTCAACTGTAGTTGATGGCATGATGTGATTA
LeMMP-1
TTTTTTAATACTATATACTTGATTCATCTTTTTAAAAAAAAAAAAA
6.2
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
Abbildung
APS
Ammoniumperoxidisulfat
At
Arabidopsis thaliana
bp
Basenpaare
cDNA
komplementäre DNA
ddH2O
doppelt destilliertes H2O
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxynukleotidtriphosphat
DISK-PAGE
Diskontinuierliche Polyacrylamidgelelektrophorese
ECL
Enhanced Chemiluminescence
ECM
Extrazelluläre Matrix
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EST
„expressed sequence tag“
56
Anhang
GPI / GPI-Anker
Glycosyl-Phosphatidylinositol (-Anker)
HPLC
High Pressure Liquid Chromatography
kDa
Kilo Dalton
Le
Lycopersicon esculentum
NB
Nutienth Broth
MMP
Matrix Metalloproteinase
PAL
Phenylalanin Amoniak Lyase
PCR
Polymerase Chain Reaction
RNase
Ribonuclease
rpm
rounds per minute
RT (min)
Retentionszeit (Minuten)
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
SDS
Natriumdodecylsulfat
TBS
Tris-Buffered Saline
TEMED
Tetramethyläthylendiamin
TIMPs
Tissue Inhibitors of Metalloproteinases
TMV
Tomaten Mosaik Virus
Ubq.
Ubiquitin
ÜN
Über Nacht
z.B.
zum Beispiel
6.3
SI-Einheiten
°C
Grad Celsius
l
Liter
M
Molar
min
Minuten
m
Milli-
µ
Mikro-
57
Eidesstattliche Erklärung
Eidesstattliche Erklärung
Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Diplomarbeit selbständig angefertigt, keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt und sowohl wörtliche, als auch sinngemäß
entlehnte Stellen als solche kenntlich gemacht habe.
Die Arbeit wurde in gleicher oder ähnlicher Form noch keiner anderen Prüfungsbehörde
vorgelegt und auch nicht veröffentlicht.
Hohenheim, 18. Januar 2006
58
Danksagung
Danksagung
Einen besonderen Dank geht an,
•
Herrn Professor Dr. Andreas Schaller, für die Vergabe des Diplomarbeitsthemas,
Bereitstellung des Arbeitsplatzes und für die optimale Betreuung.
•
Herrn Professor Dr. Arthur Pfitzner, der freundlicherweise die Zweitkorrektur
übernommen hat.
•
allen Mitarbeiter des Instituts, für die praktische und theoretische Unterstützung und
für die angenehme Arbeitsatmosphäre.
•
meinen Eltern (Sponsoren), für die Materielle und Moralische Unterstützung während
meines Studiums.
•
an meiner Freundin Anna Xianhua Chen, für ihre Unterstützung und ihre
aufmunternden Worte, während des gesamten Studiums.
59