Abschlussbericht zum Projekt KHV

Abschlußbericht zum Projekt
KHV Antikörpernachweis im Zusammenhang mit der
aktuellen Seuchensituation und zur Erfolgskontrolle des
KHV- Tilgungsprogramms
- gefördert aus Mitteln der Fischereiabgabe des Freistaates Sachsen
Dr. Grit Bräuer; Dr. Kerstin Böttcher
Präambel:
Seit 2003 wird in Sachsen die äußerst verlustreich verlaufende Koi- Herpesvirusinfektion
(KHV-I) nachgewiesen. Sie wird innerhalb der EU-RL 2006/88/EG in die Liste der
nichtexotischen Fischseuchen (Anhang IV) eingeordnet und stellt in Deutschland eine
anzeigepflichtige Fischseuche dar.
Bis 2008 musste eine stetige Zunahme der Erkrankungsfälle mit Existenz bedrohenden
Verlusten verzeichnet werden. Besonders im ostsächsischen Raum gibt es eine Häufung der
Erkrankungsfälle durch die besondere Teichstruktur der Oberlausitz, wo Karpfenhaltung in
dicht aneinanderliegenden Teichgebieten erfolgt und im Falle von Seuchenausbrüchen eine
schnelle Verbreitung des Erregers durch Prädatoren erfolgt.
Der Krankheitsnachweis erfolgt beim Vorliegen klinischer Verdachtsfälle oder im Rahmen
von Bestandsuntersuchungen gemäß dem „KHV-Programm“ des Sächsischen
Staatsministeriums für Soziales und der Sächsischen Tierseuchenkasse durch den direkten
Erregernachweis mit der PCR Technik.
Auch 2010 konnte man trotz erster Sanierungserfolge innerhalb des EU-genehmigten
Sächsischen KHV- Tilgungsprogramms (Entscheidung der Kommission 2009/975/EU) auf
Grund eines massiven flächenhaften Seuchenausbruchs in der Oberlausitz nicht von einer
Entspannung der KHV-Situation im Freistaat Sachsen sprechen.
Immerhin gab es bei 63 untersuchten Fischhaltungsbetrieben bzw. – Betriebsteilen 15
Betriebe bzw. Betriebsteile mit amtlichen Feststellungen für das Vorliegen der KHV-I (Tabelle
1). Von insgesamt 395 untersuchten Fischbeständen wurden 67 (16,96%) KHV- positiv
befundet. Das entspricht den KHV-I Nachweisen aus dem Jahr 2009, auch wenn die Anzahl
der betroffenen Fischhaltungsbetriebe deutlich rückläufig war. Bei 88% der 2010
nachgewiesenen KHV-I Fälle verlief die Erkrankung mit mittel- bis hochgradigen Verlusten.
Nur bei 12% der PCR- Nachweise zeigten die untersuchten Fischbestände keine klinischen
Anzeichen der Infektion.
Von diesen 12% handelte es sich bei einem Großteil um einsömmrige Karpfenbestände.
Jahr
untersuchte Betriebe/-teile
Betriebe/
mit amtl.
Betriebsteile Feststellung
2003
2004
53
2005
untersuchte Bestände mit amtl.
Bestände
Feststellung
3
80
5
1
143
1
6
194
28
2006
49
5
260
18
2007
57
14
324
83
2008
65
26
390
111
2009
60
24
413
68
395
67
63
15
2010
Tabelle 1: KHV Befunde 2003 - 2010
Aus den direkten Erregernachweisen durch PCR und den vorliegenden
Untersuchungsergebnissen
von
KHV-Antikörper-Untersuchungen
aus
anderen
Bundesländern wurde die Atbeitshypothese aufgestellt, dass einerseits auch in Sachsen KHV
spezifische AK großflächig verbreitet sein könnten, ohne dass die Erkrankung in solchen
Haltungseinheiten bisher in Erscheinung getreten ist oder andererseits die Verbreitung KHVspezifischer AK dem Auftreten der klinisch manifesten KHV-I entspricht.
Material und Methoden:
Die am Projekt teilnehmenden Betriebe wurden anhand der Teilnehmer aus dem KHVUntersuchungsprogramm des SMS und der TSK ausgewählt. Insgesamt wurden in 54
sächsischen Betrieben Blutproben untersucht. In den Betrieben wurden möglichst nur 10
Blutproben von Fischen eines Fischbestandes entnommen, da die biologische
Stichprobengröße mit 10 Proben/Betrieb insgesamt sehr gering war. Nur in Ausnahmefällen
wurden Blutproben aus mehreren Beständen herangezogen, so dass insgesamt Blutproben
aus 66 Beständen ausgewertet werden können. Vorrangig wurden Blutproben von
dreijährigen Karpfen (K3) entnommen, die möglichst drei Jahre im Betrieb aufgezogen
wurden. Bei ca. 35% der Betriebe handelte es sich jedoch um Fische, die im Frühjahr als K2Besatz in den Betrieb verbracht wurden. Dieser K2 Frühjahrsbesatz stammte aus
Teichanlagen in Ungarn, Tschechien, Thüringen, Bayern sowie zwei WWA in Brandenburg.
Von den untersuchten Fischbeständen wurden die Vorberichte erhoben und sofern
vorhanden durch Laborergebnisse aus den Unterlagen des FGD ergänzt.
Die Verteilung der beprobten Betriebe entspricht Abbildung 1.
7
41
6
Abb. 1: geografische Aufteilung der beprobten Betriebe
Die Probenahme erfolgte im Zeitraum von August bis Oktober 2010 bei
Wassertemperaturen von 23,6°C im August bis 6°C im Oktober.
Zur Serumgewinnung erfolgte die Blutentnahme aus der kaudalen Schwanzvene (Vena cava)
(Abb.2). Dazu wurden die Fische mit MS 222 (Tricainmesilat, Hersteller Pharmaq UK) betäubt
und unter Verwendung von sterilen Einmalkanülen 0,90 x 40 mm mindestens 2ml Blut in
Serumkabevetten mit einer Aufnahmemenge von 4,9ml entnommen. Nach Transport der
Serumkabevetten zum Labor erfolgte die Zentrifugation 5 min bei 2000 U/min sowie die
anschließende Serumgewinnung aus den Proben. Von Vorteil war die Lagerung der
Kabevetten über Nacht bei 4°C, um das Absetzen der zellulären Bestandteile des Blutes zu
fördern. Das vorhandene Serum wurde abpipettiert, gedrittelt und in Safe-Lock
Reaktionsgefäßen (Fa. Eppendorf, 1,5ml) bei -18°C gefrostet. Nach einem maximalen
Aufbewahrungszeitraum von 4 Wochen zum Sammeln der Einzelproben erfolgte der
Transport der Proben in gefrostetem Zustand innerhalb von 12h durch TNT Express Service
in das Untersuchungslabor nach England. Die Transportzeit sollte nach Empfehlung des
Labors 12 h nicht überschreiten, der Versand der Proben war dem Labor anzukündigen. Die
Bearbeitung der Proben erfolgte im „Centre for Environment, Fisheries & Aquaculture
Science“,
CEFAS
Suffolk.
Es
ist
gegenwärtig
europaweit
die
einzige
Untersuchungseinrichtung, welche einen kommerziellen KHV-AK-ELISA (Enzyme-Linked
Immuno- Sorbent- Assay) sowie Untersuchungen damit anbietet. Außerdem sollte durch die
Inanspruchnahme dieses
ELISAs eine methodische Vergleichbarkeit der
Untersuchungsergebnisse mit anderen Bundesländern, die ähnlich gelagerte Projekte
durchgeführt hatten, hergestellt werden.
Abb.2: Blutprobenentnahme aus der kaudalen Schwanzvene
Der ELISA auf KHV-spezifische AK basiert auf der durch St-Hilaire et al . (2005, 2008)
publizierten und von Taylor et al. (2009) optimierten Methode. Das Untersuchungsverfahren
wurde bereits im Projektbericht „Vergleich von diagnostischen Methoden zum Nachweis der
Koi-Herpesvirus-Infektion (KHV-I) am Beispiel von Proben aus sächsischen
Angelgewässern”(Böttcher & Bräuer 2011) beschrieben.
Auszug aus dem Projektbericht:
“Gereinigtes KHV wird in die 96 Vertiefungen einer Mikrotestplatte (ELISA-Platte) gegeben
und mit Magermilchpulver geblockt. Das zu testende Serum sowie negative und positive
Kontrollseren werden in Doppelansätzen für eine Stunde auf den Platten inkubiert.
Die an das KHV-Antigen gebundenen spezifischen Karpfenantikörper aus dem Proben-Serum
werden mit monoklonalen Anti-Karpfen-IgM-Antikörpern von der Maus in einer 45minütigen Inkubation detektiert. Die so gebundenen monoklonalen Antikörper werden nach
einer 45-minütigen Inkubation mit polyklonalen Anti-Maus-IgM-Antikörpern von der Ziege,
die mit Peroxidase konjugiert sind, nachgewiesen. Mittels der gebundenen Peroxidase wird
enzymatisch Tetramethylbenzidin (TMB) in einer Farbreaktion umgesetzt.
Nach Stoppen der Farbreaktion mit Schwefelsäure wird die Extinktion mit einem
Spektrophotometer bei 450 nm gemessen.“
Dabei werden die Proben im Doppelansatz untersucht. Positiv bewertet werden die Proben,
bei denen der Mittelwert der Doppelbestimmung über einem bestimmten Schwellenwert
(SP Ratio) liegt. Dieser Wert wurde beim KHV-AK-ELISA mit größer als 14 (SP ratio ≥ 14)
festgelegt. Verdächtig werden Proben mit einer SP ratio über 6,05 bis 14 eingestuft. Negativ
sind Proben, die unter der SP ratio von 6,05 liegen.
Ergebnisse:
Zur Untersuchung gelangten 610 verwertbare Blutproben aus 54 Betrieben.
42 der 54 Betriebe (77%) wiesen mit dem CEFAS AK-ELISA KHV-spezifische AK auf (Abbildung
3). KHV- Genomnachweis 2010 erfolgten bei 25% der untersuchten Betriebe (15 von 60).
Allerdings gab es auch nur bei diesen 25% KHV bedingte Seuchenausbrüche.
Ergebnisse der ELISA Untersuchungen bei n= 54 Betriebe
17%
6%
77%
ohne Ak
verdächtig
positiv
Abb. 3: Ergebnisse der ELISA Untersuchungen bezogen auf die Gesamtzahl der untersuchten
Betriebe
In 8 der 54 untersuchten Betriebe wurden in 70 bis 90% der Serumproben KHV-spezifische
AK nachgewiesen. Bei den untersuchten Fischbeständen aus diesen Betrieben handelte es
sich außer in einem Fall um Fischbestände, die entweder 2008 als einsömmrige Karpfen (K1)
oder 2009 als zweisömmrige Karpfen (K2) einen KHV-I-spezifischen Seuchenausbruch
durchlebt hatten und an der Landesuntersuchungsanstalt für das Gesundheits- und
Veterinärwesen Sachsen (LUA) zum Zeitpunkt des Seuchengeschehens positiv mit PCR
getestet wurden. Nur einer dieser Fischbestände stammte aus einem bisher KHV-negativ
untersuchtem Betrieb, der sich jedoch in unmittelbarem epidemiologischen Zusammenhang
zu einem Seuchenherd befindet und als KHV-verdächtig angesehen werden muss. Auf eine
erneute PCR-Untersuchung zum Zeitpunkt der Blutprobenentnahme wurde verzichtet.
Abbildung 4 zeigt Untersuchungsergebnisse aus einem solchen dreijährigen Karpfenbestand
(K3), der als K2-Bestand einen akuten KHV Ausbruch durchlebt hatte. 80% der untersuchten
Fische zeigten KHV-spezifische AK.
ELISA Ergebnisse 2009 KHV-PCR positiv
120
100
80
SP ratio
60
40
20
0
V1
V2
V3
V4
V5
V6
Probennummer
V7
V8
V9
V10
Abb. 4: ELISA Ergebnisse eines 2009 mittels PCR KHV-positiv getesteten Fischbestandes
In Abbildung 5 wird die Höhe der KHV-spezifischen AK eines 2008 als K1 KHV-PCR-positiv
getesteten Fischbestandes dargestellt. In diesem 2010 als K3 untersuchten Fischbestand
wiesen 90% der untersuchten Proben KHV-spezifische AK auf.
ELISA Ergebnisse 2008 KHV-PCR positiv
70
60
50
40
SP ratio
30
20
10
0
OZ1
OZ2
OZ3
OZ4
OZ5
OZ6
Probennummer
OZ7
OZ8
OZ9
OZ10
Abb. 5: ELISA Ergebnisse eines 2008 mittels PCR KHV-positiv getesteten Fischbestandes
Nur bei 11 der insgesamt 54 untersuchten Betriebe erfolgte kein Nachweis KHV-spezifischer
AK oder lediglich eine Probe war KHV-verdächtig. Ein eindeutiger regionaler Bezug dieser
Betriebe/Bestände zum KHV-I Geschehen in Sachsen 2010 konnte nicht hergestellt werden.
D.h. auch in Betrieben/Beständen, die außerhalb des KHV-I Kerngebietes (Ostsächsischer
Raum) lagen, wurden KHV-spezifische AK festgestellt. Allerdings wiesen dann weniger als
50% der untersuchten Proben KHV-spezifische AK auf. Auch Betriebe, die aus eigenen
Laichfischen Satzfische gewinnen, sich in isolierter Lage befinden, keine Satzfischzukäufe
pflegen und bisher nie durch KHV-I Ausbrüche auffällig geworden waren, zeigten bei einem
geringen Prozentsatz der untersuchten Proben mit dem hier verwendeten CEFAS ELISA AK
auf KHV.
ELISA Ergebnisse aus einem KHV unverdächtigen Fischbestand
50
45
40
35
30
25
SP ratio
20
15
10
5
0
-5
K1
K2
K3
K4
K5
K6
Probennummer
K7
K8
K9
K10
Abb. 6: ELISA Ergebnisse bei einem Betrieb mit eigenem, KHV-unverdächtigen
Laichfischbestand
Ein Fischbestand, der aus KHV-I durchseuchten Laichfischen gewonnen wurde, erbrachte mit
2 von 10 positiven Proben das Ergebnis wie in Abbildung 6 dargestellt, d.h. ein Bezug zu den
durchseuchten Laichfischen ließ sich nicht herstellen. K3 Bestände, die von Satzfischen aus
anderen Bundesländern bzw. EU Mitgliedsstaaten aufgezogen wurden wiesen meist keine
oder nur bei wenigen Fischen AK auf.
Aus 5 Betrieben, die am KHV Tilgungsprogramm teilgenommen hatten, wurden
Serumproben untersucht.
Zwei Bestände aus zwei Betrieben wiesen nach Neubesatz mit unverdächtigen Fischen keine
AK auf, bei zwei Beständen aus zwei anderen Betrieben hatten 40 bis 50% der Fische AK, in
einem weiteren Betrieb sogar 90% der Fische. Bei letzterem deuten die Ergebnisse darauf
hin, dass die Fische sich nach dem Besatz infiziert haben, jedoch im Sommer nach der
Sanierung nicht erkrankten. Diese Aussage kann dadurch getroffen werden, da ein Teil
dieser Fische derselben Herkunft in einen Teich eines anderen Sanierungsgebietes
ausgesetzt wurde und diese Fische bei der AK-Untersuchung vollständig negativ blieben.
Diskussion:
Der Nachweis der KHV-Infektion in sächsischen Fischbeständen sowie deutschlandweit
basiert gegenwärtig allein auf dem direkten Erregernachweis durch PCR. In den letzten
Jahren wurde eine Reihe von PCR Methoden entwickelt, die u.a. das Ziel hatten, die
Sensivität des PCR zu erhöhen, eine möglichst geringe Nachweisgrenze für das KHV festlegen
zu können, um auch bei Vorhandensein weniger Viruskopien positive Ergebnisse zu erzielen
und latent infizierte Fischbestände herauszufiltern (S St.-Hilaire et al. 2009). Keine der PCR
Methoden scheint bisher jedoch ausreichend in der Lage zu sein, das Virus in der Phase der
Latenz bzw. Persistenz nachzuweisen. Die Bestimmung KHV-spezifischer AK kann ein
wirksames zusätzliches indirektes Testverfahren zum Nachweis der Infektion sein. Das
Projekt hatte zum Ziel, die Verbreitung KHV-spezifischer AK in Sachsen zu untersuchen und
bezüglich der aktuellen Seuchenlage bzw. nach vorangegangenen Tilgungsmaßnahmen zu
interpretieren.
Eindeutige Interpretationen lassen sich ableiten bei Fischbeständen, die zuvor durch einen
direkten Erregernachweis in Form des PCR positiv getestet wurden und in der Regel einen
Seuchenausbruch durchlebt hatten. In diesen Fischbeständen zeigten 80 bis 90 % der Fische
Serokonversion bezüglich KHV und zwar unabhängig davon, ob die Fische als K1 oder K2 den
Seuchenausbruch überstanden hatten und unabhängig davon, bei welcher
Wassertemperatur die Blutproben zur Serumgewinnung genommen wurden. Anhand der
Höhe der AK, die sich zumeist bei einer SP ratio zwischen 20 und 40 einpegelte, liegt die
Vermutung nahe, dass in diesen Fischbeständen immer wieder eine leichte Durchseuchung
stattfand und die AK Produktion erneut angeregt wurde. Bei einem Fischbestand, der aus
einem bisher KHV unverdächtigen Betrieb stammte, sich jedoch mitten im KHV
Seuchengebiet befindet, kann geschlussfolgert werden, dass eine KHV-I ohne amtlichen
Nachweis vorlag. Der Nachweis von KHV spezifischen AK zwei Jahre nach vorangegangener
Infektion bei solch einem hohen Prozentsatz infizierter Fische lag weit über den von Adkison
et al. (2005) und Ronen et al. (2003) beschriebenen Nachweiszeiträumen. Selbst geringe
Wassertemperaturen zum Zeitpunkt der Probenahme wie z.B. OZ1 – OZ 10, bei 8,5 °C (siehe
Anlage 1) schienen eine untergeordnete Bedeutung für das Vorhandensein KHV spezifischer
AK zu haben.
Keine eindeutige Interpretation kann geliefert werden für Betriebe bzw. Bestände bei denen
verdächtige oder wenige AK-Nachweise durch ELISA erhoben wurden. Bei diesen Betrieben
müssten weitere serologische Tests durchgeführt werden. Es kann weder ein eindeutiger
Bezug zur geografischen Lage der Betriebe, den Produktions- und Zukaufsbedingungen oder
der Art und Weise der Reproduktion gezogen werden. Die Ergebnisse zeigen, dass es sich bei
den Nachweisen nicht alleinig um KHV-spezifische AK handeln kann. Beispiel sind die Proben
K1 – K 10 (Anlage 1; Abb.6) entnommen aus einem isoliert in Sachsen liegenden
Fischereibetrieb mit eigenem Laichfischbestand ohne Fischzukäufe und seit Jahren KHV-I
unauffällig.
Der AK-Nachweis scheint von der Herkunft der Fische und u.U. vom Alter der zugekauften
Fische abzuhängen.
So wiesen Fische, die als K2 aus Ungarn, Tschechien, Bayern, Brandenburg oder Thüringen
zugekauft wurden entweder keine (Ungarn, Tschechien, BY, 1x Brandenburg) oder und nur
10-20% AK auf. Dies war unabhängig davon, ob die Fische in einem KHV-verdächtigen,
sanierten oder unauffälligen Gebiet aufgezogen wurden.
Es lässt sich erkennen, dass serologische Ergebnisse nur im konkreten einzelnen
Fischbestand und nur unter Einbeziehung eines genauen Vorberichts interpretieren lassen.
Aussagen zum Betriebsstatus können mit einer derart geringen biologischen
Stichprobengröße nicht gezogen werden.
Der AK-ELISA ist als alleiniges diagnostisches Verfahren zur Kontrolle des Sanierungserfolges
im Rahmen des KHV-Tilgungsprogrammes nur bedingt geeignet. Auf die Kopplung der
Methodik mit der PCR-Diagnostik kann fachlich und rechtlich nicht verzichtet werden.
AK-positive Ergebnisse sind als Richtung weisend anzusehen.
Bei Neubesatz in Sanierungsgebieten sollte die AK Untersuchung als zusätzliche
Untersuchungsmethode einbezogen werden. Um zu belastbaren Aussagen zu gelangen, sind
hier weitere AK-Untersuchungen begleitend notwendig.
Die Untersuchungsergebnisse des AK-ELISA im Rahmen des Projektes lassen
Interpretationen offen, da
1. Der AK-Status des Ausgangsmaterials in diesem Projekt nicht untersucht wurde
(keine Zielstellung des Projektes).
2. Eine Stichprobengröße von 10 Proben nur aus einem Fischbestand eines Betriebes
das biologische Merkmal KHV-AK zu wenig widerspiegelt.
3. AK-Nachweise in völlig unverdächtigen Betrieben ohne epidemiologischen
Zusammenhang zu KHV- Seuchenausbrüchen und bei Betrieben mit eigener
Reproduktion den Verdacht auf Kreuzreaktionen zuläßt.
4. Der CEAFAS AK-ELISA eine hohe Serumverdünnung benutzt, um die Spezifität
gegenüber KHV zu erhöhen. Diese wiederum führt zu einem Sensitivitätsverlust, so
dass bei latent infizierten Fischen falsch negative Ergebnisse auftreten können.
Zusammenfassung:
Mit dem vorliegenden Projekt konnten erste Aussagen zum Vorhandensein KHV-spezifischer
AK in sächsischen Fischhaltungsbetrieben getroffen werden. Um die Ergebnisse in Beziehung
zum aktuellen Seuchengeschehen bzw. zu Sanierungserfolgen des KHV Tilgungsprogramms
setzen zu können, sind höhere Stichprobenzahlen bei konkreten Vorberichten in einzelnen
Betrieben notwendig.
Besonders wichtig wäre zu klären, wie sich der AK-Verlauf nach erfolgter KHV- Infektion im
Jahresverlauf bzw. über mehrere Jahre hinweg darstellt. Die vorliegenden
Untersuchungsergebnisse lassen eine Reaktivierung der Immunantwort vermuten.
Diesen Fragestellungen wäre nachzugehen, um zukünftig serologische
Untersuchungsergebnisse in die Erkenntnisse um den Verlauf der KHV-I, deren
Überwachung und Bekämpfung einbeziehen zu können sowie nachweislich freie Bestände
überwachen und schützen zu können.
Literatur:
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Feneis B, Scheinert P, Geldhauser F, Wedekind H (2009): KHV-Monitoring in Karpfenteichen
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N G H Taylor, P F Dixon, K R Jeffery, E J Peeler, K L Denham and K Way (2009): Koi
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Ronen A, Perelberg A, Abramowitz J, Hutoran M, Tinman S, Bejerano I, Steinitz M & Kotler M
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S St-Hilaire, N Beevers, C Joiner, R P Hedrick and K Way (2009): Antibody response of two
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Journal of Fish Diseases 32, 311-320
Uchii K, Matsui K, Iida T and Kawabata Z (2009): Distribution of the introduced cyprinid
herpesvirus 3 in a wild population of common carp, Cyprinus carpio L.
Journal of Fish Diseases 32, 857-864
Anlagen:
Anlage 1, Brauer samples Nov 2010
Anlage 2, Brauer samples Oct 2010