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Evaluation des MBT Sepsityper IVD
KIT®
1. Zusammenfassung
Sepsis oder „Blutvergiftung“ entsteht, wenn Bakterien oder Sprosspilze sich über den Blutkreislauf im gesamten Körper ausbreiten. Als Folge kommt es zu schweren,
generalisierten Entzündungsreaktionen. Die Heilungschancen sind grösser, wenn man die Sepsis frühzeitig erkennt und behandelt. Bei spätem Therapiebeginn kann
es zu einem septischen Schock kommen und bis zum Tode führen. Um die Erreger einer Sepsis noch schneller zu identifizieren, wurde in dieser Diplomarbeit der
MBT Sepsityper IVD Kit® zur direkten Identifizierung aus positiven Blutkulturflaschen getestet. Dieses System ermöglicht eine schnellere Identifikation von Bakterien
und Sprosspilzen mittels Massenspektrometrie im MALDI-TOF. In MCL Niederwangen werden zwei verschiedene Blutkulturflaschen der Anbieter Biomèrieux und
Becton Dickinson bearbeitet. Es wurde getestet, welche der beiden Systeme sich besser für eine direkte Isolation von Keimen mittels Sepsityper eignet. Der
Nachweis über eine Subkultur als Goldstandard zur Identifizierung mit dem MALDI-TOF-MS wurde mit der direkten Identifizierung mittels Sepsityper bezüglich
Spezifität und Sensitivität verglichen. Gram negative Stäbchen wie E. coli oder Enterobacter spp. und Gram positive Kokken wie Staphylococcus aureus liessen sich
problemlos direkt identifizieren. Streptococcus pneumonie war mit dieser Methode nie nachzuweisen und auch empfindliche anaerobe Keime bereiteten Probleme.
2. Einleitung
3. Ziele und Fragestellungen
Sepsis ist eine lebensbedrohende Erkrankung, deren Ursache möglichst
rasch diagnostiziert werden muss, um die Patienten wirksam zu therapieren.
Vor allem Bakterien aber auch Sprosspilze gelangen in den Blutkreislauf und
verursachen dort eine Infektion. Bei einer Sepsis gerät die
Entzündungsreaktion jedoch ausser Kontrolle und der Körper ist nicht mehr
in der Lage, diesen Prozess zu kontrollieren.
Diese Arbeit beinhaltet die Evaluation des MBT Sepsityper IVD Kit® für die
schnellere Identifikation von Mikroorganismen (Bakterien und Pilzen) aus
Blutkulturen mittels MALDI-TOF-MS mit dem Ziel, diese Methode später in
der Laborroutine des Praktikumslabors anzuwenden. Um das Ziel zu
erreichen, wurde einerseits der kulturelle Nachweis mit dem Sepsityper
verglichen und andererseits wurde versucht herauszufinden, welche der
Blutkulturflaschen besser ist.
Es gibt heute verschiedene Möglichkeiten die Zeit von der Positivität einer
Blutkultur zur Identifizierung des Erregers zu verkürzen. Eine davon ist eine
von verschiedenen Firmen angebotene Multiplex PCR für die häufigsten
Erreger, eine andere die Schnellidentifizierung ausgewählter Erreger mittels
FISH. Der Nachteil dieser Methoden liegt in ihrem eingeschränkten
Erregerspektrum, ausserdem sind sie meistens teuer. Um die Möglichkeiten
einer grösseren Datenbank für eine rasche Identifizierung direkt ab Blutkultur
auszuschöpfen, hat man entschieden, den Sepsityper von Bruker zur
Identifizierung auf dem MALDI-TOF-MS Gerät im Rahmen dieser
Diplomarbeit auszutesten.
1. Identifiziert der MALDI-TOF-MS die Probe, welche mit dem MBT
Sepsityper Kit® behandelt wurde in vergleichbarer Qualität, wie auf
Platten gewachsenen Keime?
2. Wie hoch ist die Sensitivität und Spezifität des MBT Sepsityper
Kit®?
3. Welche der beiden Blutkulturflaschen eignen sich besser für den MBT
Sepsityper Kit®?
Biomèrieux – Blutkulturflaschen
BD - Blutkulturflaschen
4. Gibt es Keime die sich nicht direkt mit dem MBT Sepsityper Kit®
identifizieren lassen?
4. Material, Methodik, Vorgehen
Es wurden 110 Proben von insgesamt 50 zufällig ausgewählten Patienten
auf Erreger getestet, 100 positive- und 10 negative Blutkulturflaschen. Das
Probenmaterial bestand aus Blutkulturflaschen zweier Anbieter. Die Produkte
der Firma Biomérieux enthalten Aktivkohle und die Blutkulturflaschen von
Becton
Dickinson
nur
Kunstharzkügelchen.
Die
BiomérieuxBlutkulturflaschen mussten aufgrund der Aktivkohle mit zusätzlichen
Zwischenschritten behandelt werden. Dafür wurden die SigmaPrep™Spinsäulen eingesetzt.
5. Ergebnisse/Resultate
1.
Die Methodik des Sepsitypers basiert zuerst auf der Lyse der Blutzellen,
gefolgt von mehreren Zentrifugations- und Waschschritten. Sobald die
Probenpräparation und Extraktion fertig sind, kann man den Erreger auf dem
MALDI-TOF-MS identifizieren.
Abb. 5.1 Vergleich Kultur und Sepsityper mittels MALDI-TOF-MS
2.
6. Diskussion
1. Erreger, welche sich mit dem Sepsityper identifizieren lassen, ergeben
meistens gleich gute MALDI-TOF-MS Scores wie die Identifizierung aus
einer Kolonie ab Subkultur. In der Abbildung 5.1 ist zu sehen, dass die
Kategorien zwei und drei keine grossen Differenzen aufweisen. Die Balken
der Kultur und des Sepsityper sind fast identisch. Hingegen ist bei der
Kategorie eins die Differenz zwischen direkter Identifizierung und jener aus
gewachsenen Kolonien wesentlich grösser. Dies resultiert vor allem durch
die 20 nicht identifizierbaren Erreger. Allgemein kann gesagt werden, dass
Erreger, welche sich gut mit dem Sepsityper identifizieren lassen, bei einer
Identifizierung ab Subkultur ebenfalls keine Probleme bereiten.
2. Die Spezifität des Sepsityper beträgt 100%, das heisst alle negativen
Blutkulturflaschen wurden auch als negativ erkannt. Dies ist eine gute
Spezifität. Die Sensitivität liegt etwas tiefer und beträgt 76.69%. Ein Grund
für die tiefe Sensitivität sind Erreger, welche sich schwer mit dem Sepsityper
identifizieren lassen. Eine andere Ursache für die tiefe Sensitivität resultiert
auch aus den polymikrobiellen Kulturen.
3. Aus 70,8% der positiven Biomèrieux-Blutkulturflaschen konnte ein Erreger
identifiziert werden. Aus den BD-Blutkulturflaschen waren es 90,7%.
Natürlich ist der Vergleich nicht optimal, da nicht alle Erregerspezies gleich
einfach aus den Proben zu extrahieren waren. Somit lässt sich auch nicht
sagen, welche der beiden Blutkulturflaschen wirklich besser ist. Die
Verarbeitung der BD-Blutkulturflaschen ist jedenfalls einfacher und schneller.
4. Tatsächlich gibt es Erreger, welche während der Evaluierung des
Sepsityper nicht funktioniert haben. Hervorzuheben ist vor allem
Streptococcus pneumoniae. Dieser Erreger liess sich mit dem Sepsityper nie
identifizieren. Anaerobier wie Bacteroides vulgatus, Bacteroides fragilis,
Bifidobacterium longum und Parabacteroides johnsnii können bei der
Identifizierung Schwierigkeiten bereiten. Allgemein kann gesagt werden,
dass Gram negative Bakterien besser mit dem Sepsityper identifiziert
werden, als Gram positive Bakterien. Diese Erkenntnis wurde schon in
anderen Studien erwähnt (Morgenthaler et al., 2015: S. 6).
Spezifität
100%
Sensitivität
76,69%
Tab .5.2 Spezifität und Sensitivität
3.
Durch Sepsityper
erkannte Erreger
Gesamtzahl der
monomikrobiellen
Blutkulturflaschen
Prozentzahl
Biomèrieux Blutkulturflaschen
34
BD Blutkulturflaschen
39
48
43
≈ 70,8 %
Tab. 5.3 Biomèrieux – vs. BD – Blutkulturflaschen
Quellenverzeichnis
Morgenthaler, N. und Kostrzewa, M. (2015) Rapid Identification of
Pathogens in Positive Blood Culture of Patients with Sepsis:
Review and Meta-Analysis of the Performance of the Sepsityper Kit
| Hindawi Publishing Corporation
Abbildungsverzeichnis
Abb. 5.1 Anic, R. (2016) Vergleich Kultur und Sepsityper mittels
MALDI-TOF-MS. Niederwangen, eigene Abbildung
Tabellenverzeichnis
Tab. 5.2 Anic, R (2016) Spezifität und Sensitivität. Bern, eigene
Tabelle
Tab. 5.3 Anic, R (2016) Biomèrieux – vs. BD – Blutkulturflaschen.
Bern, eigene Tabelle
Anic Ruzica, BMA 13-16
Praktikumsbetrieb: Mikrobiologie, MCL Niederwangen
≈ 90,7%