Labordiagnostik der Tuberkulose
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AUS DEM LABOR R Erreger nachweisen und charakterisieren ren Labordiagnostik d der Tube Tuberkulose ulose Die Labordiagnostik der Tuberkulose erfüllt die Aufgabe, eine en erstellte anhand von klinischen und radiologischen Kriterien Verdachtsdiagnose durch den direkten Nachweiss und die Chasi dabei rakterisierung des Erregers zu bestätigen. Siee kann sich nschafte der beteiheute auf ein breites Wissen über die Eigenschaften n Wechselwirkungen Wechselw ligten Mykobakterien, deren vielfältigen d des InfektionsInfektio mit dem menschlichen Organismus während s ndig verbesablaufes und nicht zuletzt auch auff ein sich ständig umenta n. serndes labordiagnostisches Instrumentarium abstützen. rreger der Tuberkulose sind die pathogenen Bakterien Bakteri des Myomplexes (MTB). Dazu gehören die cobacterium-tuberculosis-Komplexes Spezies M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. cabei um unbewegliche, ob netti und M. pinepedii. Es handelt sich dabei obm wachsende St spez ligat aerob und langsam Stäbchen. Durch ihren spezielal t und gelte len Zellwandaufbau sind sie säure- und alkoholfest gelten als hig. Aus diesem Grund lassen sie sich nur nu durch sehr widerstandsfähig. n gut darstellen. Gleichzeitig erlaubt erlaub diese Eigenspezielle Färbungen h die Abtrennung schnell wachsender Begleitkeime B schaft aber auch aus damit belastetem Unters Untersuchungsmaterial. E Infektionsverlauf onsverlauf Die Tuberkulosebakterien werden in der Regel mit Aerosolen aus m respiratorischen Sekret von Patienten mit offener Lungentudem erkulose weiterverbreitet. Fast immer ist is deshalb die Lunge auch berkulose die Eintrittspforte für die Infektion und der Ort der ersten Vermehrung des Erregers. Bei gut 90% aller Infektionen führt die sich innert usbildende zellvermittelte zellve 4–6 Wochen ausbildende Immunabwehr zur Abkaprazellulär vermehrenden verm selung der sich intrazellulär Erreger. Sie können in diesem Zustand Jahre biss Jahrz Jahrzehnte verharren („latente tuberkulö30 Prof. Dr. rer. nat. Günter Siegl Mörschwil se Infekt Infektion, LTBI“), bei Schwinden der Immunantwort aber auch jederze jederzeit wieder reaktiviert werden. In den 2 - 10% der Fälle, in der die Immunantwort I des Patienten nicht in der Lage ist, die Infektion auf den lokalen pulmonalen Primäraffekt und die granulomatösen Läsionen in den drainierenden Lymphknoten einzuschränken, kommt es vor allem in den ersten Jahren nach Infektion zur progressiven primären Tuberkulose. Sie manifestiert sich vornehmlich als offene Lungentuberkulose, nach hämatogener, lymphogener und kanalikulärer Aussaat der Erreger aus den Granulomen aber auch extrapulmonal als Lymphknoten-Tuberkulose, urogenitalTuberkulose, Pleuritis tuberculosa, Miliar-Tuberkulose, Knochenund Gelenk-Tuberkulose und, in heute seltenen Fällen, auch als tuberkulöse Meningitis. Die Reaktivierung einer latenten tuberkulösen Infektion führt zur sogenannten postprimären Tuberkulose, die sich in bis zu 80% der Fälle wieder pulmonal als offene Lungentubekulose manifestiert, daneben aber auch extrapulmonal Lymphknoten, das Urogenitalsystem oder das Skelettsystem befallen kann. Diagnostik Die vorgehend beschriebenen vielfältigen Aspekte des Verlaufs und der Manifestation einer Tuberkuloseinfektion haben direkte Auswirkungen auf die Labordiagnostik. Sie bestimmen die Auswahl, Entnahme und Behandlung des Untersuchungsmaterials genau08 _ 2011 _ der informierte arzt AUS DEM LABOR Untersuchungsmaterial für den Erregernachweis Die für die Labordiagnostik einer aktiven TB-Infektion sinnvollen Untersuchungsmaterialien sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Diese Tabelle enthält auch Angaben zur optimalen Entnahme und zum richtigen Transport der Proben ins Laboratorium. Die ausgeprägte Widerstandsfähigkeit der pathogenen Mykobakterien, macht es möglich, unerwünschte Begleitkeime durch chemische Behandlung aus dem Untersuchungsmaterial weitgehend zu eliminieren, jede derartige Behandlung beeinträchtigt jedoch auch die Lebensfähigkeit der Mykobakterien und verringert damit gerade bei geringer Erregerzahl im Ausgangsmaterial die Wahrscheinlichkeit eines positiven Nachweises. Um die Erfolgsaussichten eines Erregernachweises zu erhöhen gilt die Empfehlung, mehrere Proben zu untersuchen. Zudem wird bei der Aufbereitung von Untersuchungsmaterialien wie Sputum, Magensaft oder Urin nach der Dekontamination ein Anreicherungsschritt eingeschaltet TAB. 1 Material für den Erregernachweis chweis Material Menge Aufbewahrung/ Au Behandlung B Bemerkung merkun Sputum 2–5 ml Nativ Mindestens tens 3 Proben, morgens nüchtern Induziertes Sputum 2–5 ml Nativ Nach Inhalation von 0.9 oder N 3%iger NaCl-Lösung; nach 3%ige Bronchoskopie Bronchos Bronchialsekret oder BAL 2–10 ml Nativ Magensaft Magenspülflüssigkeit mind. 2 besser sser 20–50 ml In Röhrchen mit 1–2ml ml Phosphatpuffer oder er gesättigte Na-Phosphatphatlösung füllen 3 Proben; nurr we wenn kein Sputum gewonnen werden won kannn (z.B. Kleinkinder) In 0.9% NaCl-Lösung NaCl-Lösun Nicht ich in Formalin Biopsien OP-Präparate OP-Präpa Pleurapunktat, Aszites mind. 10 ml m Nativ Liquor 2–3 ml Nativ Möglichst vor Beginn der antituberkulösen Therapie Urin 30 ml Nativ 3x; jeweils erster Morgenurin (Mittelstrahl!); Stuhl Nativ Blut Bl 5–10ml In Heparin oder Citrat Nur bei Verdacht auf Dissemination (z.B. bei HIV-Patienten) Nicht in EDTA In Heparin oder Citrat Nur bei Verdacht auf Miliartuberkulose bzw. Dissemination; Nicht in EDTA Nachweis im mikroskopischen Präparat Knochenmark Üblicherweise der erste Schritt in der Labordiagnose der Tuberkulose ist der mikroskopische Nachweis „säurefester Stäbchen Stäbchen“ ersuchungs aus bronchopulmonalen Untersuchungscht gewonmaterialien oder, wo solche nicht nen werden können, aus Magensaft. Für einen postiven Nachweis y en/ml UntersuchungsmaUntersuchungsma bedarf es dabei etwa 103–104 Mykobakterien/ml terial. Er erfolgt in der Regel nach einem eine Anreicherungsschritt icherungsschritt eentopisch mit der Ziehl-Neelsen-Färbung Ziehl-Ne ärbung oder ode fluweder lichtmikroskopisch isch mit der Auramin-Färbung. Auramin-Färbu Seinee Se oreszenzmikroskopisch Sensitivigkeit von der klinischen Situation Situatio zwischen 20 tät liegt in Abhängigkeit und 78%. (1) ikroskopische Nachweis ist schnell und das Ergebnis Der mikroskopische kann bei semiquantitativer Beu Beurteilung als Ausdruck der Infektiosität des Patienten gewertet werden. Bei der Bewertung des Ergebnissess ist allerdings zu berücksichtigen, d dass die Mikroskopie wederr eine Unterscheidung zwischen lebende lebenden und toten Bakterien m Untersuchungsmaterial erlaubt noch eine Identifizierung der im iegenden Mykob vorliegenden Mykobakterienspezies möglich ist. Das Merkmal der igkeit ist zudem nicht nur auf Mykobakterien beschränkt. Säurefestigkeit Nachweis und Charakterisierung Charakteris in der Kultur Trotz der verfügbaren molekular-genetischen molek Verfahren (siehe unten) sind Isolierung und Charakterisierung der Erreger in der der informierte arzt _ 08 _ 2011 Kultur der Goldstandard in der Labordiagnostik der Tuberkulose. Die angereicherten und dekontaminierten Proben werden dabei gleichzeitig auf festen und flüssigen Nährmedien angezüchtet. Wegen des langsamen Wachstums der Mykobakterien des Tuberkulosekomplexes (Generationszeiten zwischen 6 und 20 Stunden) liegen positive Ergebnisse frühestens nach einer Woche (Flüssigmedien) bzw. nach 2 Wochen (feste Nährböden) vor. Für einen erfolgreichen positiven Nachweis müssen dabei im Inokulum des Flüssigmediums >10 und für feste Nährböden >100 Keime vorhanden sein. Ein negatives Kulturergebnis kann erst 6 Wochen nach Inokulation bei Flüssigmedien und 8 Wochen nach Beimpfung von festen Nährböden berichtet werden. Die Kultur erlaubt die Typisierung der Erreger anhand ihrer Kolonieform, ihres Wachstumsverhaltens und ihrer biochemischen Eigenschaften. Eine erfolgreiche Kultur ist auch die Voraussetzung, um die Empfindlichkeit des Isolates gegenüber den Standardantituberkulostatika zu bestimmen und gegebenenfalls multiresistente Mykobakterienstämme zu entdecken. 31 nach: (1) so wie den sinnvollen Einsatz der heute zur Verfügung stehenden, z.T. sehr aufwändigen und teuren Untersuchungsverfahren. AUS DEM LABOR Nachweis und Charakterisierung mit molekular-genetischen Verfahren Die auf der In-vitro-Amplifikation spezifischer Nukleinsäuresequenzen von Mykobakterien basierenden Nukleinsäureamplifikationsteste (NAT) sind heute ein wesentlicher Bestandteil der Labordiagnose der Tuberkulose. Im Idealfall ist mit ihrer Hilfe eine sensitiver Nachweis der Erreger des M-tuberculosis-Komplexes direkt aus dem Untersuchungsmaterial bereits innert Stunden möglich. Sie erlauben daneben eine rasche Aussage, ob es sich bei den im mikroskopischen Präparat nachgewiesenen säurefesten Stäbchen auch tatsächlich um MTB handelt. Die Erfahrung hat gezeigt, dass bei einem mikroskopisch positiven Befund ein positiver NAT-Befund eine Sensitivität von annähernd 100% aufweist. Bei der Untersuchung von mikroskopisch negativem, jedoch kultur-positivem Material liegt die Sensitivität allerdings nur zwischen 60 und 90%. NAT-Verfahren sind nicht in der Lage zwischen vermehrungs- und vermehrungsunfähigen Mykobakterien in Untersuchungmaterial zu entscheiden. Sie eignen sich deshalb nur sehr bedingt für Kontrolluntersuchungen während einer Therapie. (1,3) Die genaue Differenzierung und Identifizierungg eines isoliergische Abkläten Tuberkuloserregers, wie sie z.B. für epidemiologische rungen nötig ist, wird heute zunehmend mit molekular-genetin schen Verfahren vorgenommen. Molekular-genetische Verfahren hwerden auch ansatzweise bereits zur Erfassung der Empfindlichnkeit/Resistenz gegenüber den Standard-Antituberkulostatika eingesetzt. NAT sind nach wie vor kostenintensive Untersuchungsverfahren. Sie sollten deshalb nicht routinemässig zur Ausschlussdiranheitsbezogen agnostik, sondern vorzugsweise patienten- und kranheitsbezogen nkinder, Verdacht (z.B. HIV-Patienten, Immunsupprimierte, Kleinkinder, verwend werden. auf generalisierte Infektion, Meningitis, etc.) verwendet kann weder in Bezug auf Empfindlichkeit noch Spezifizität und nd Testsysteme auf dem Reproduzierbarkeit befriedigen. Nun sind en, die ssich im Zuge einer aktiven oder latenMarkt, die es erlauben, nfektion au zellu ten Tuberkuloseinfektion ausbildende zelluläre Immunität über die Freisetzung von Interferon Gamma (IFN (IFN-γ) durch Antigenonukleäre Blutzel z erfassen. Auf stimulierte mononukleäre Blutzellen im Labor zu endeten definierten Antigene gene weisen diese di Grund der verwendeten sogeon-Gamma-Rele nannten Interferon-Gamma-Release-Assays (IGRA) eine hohe onen mit M. tuberculosis auf. uf. Die AussageSpezifität für Infektionen ngt wesentlich von der korrekten Durchkraft der Ergebnisse hängt ahme mit Hilfe der testspezifi te führung der Blutentnahme schen Gefässe nter vorgegebenen Bedingungen ins Labor und deren Transport unter nft geben. ab. Jedes Labor wird dazu gerne Auskunft higkeit und den EinUmfassendee Angabe Angaben zur Leistungsfähigkeit keiten der IGRA finden sich in der aktu satzmöglichkeiten aktuellen Literatur (1,2,3) Prof. Dr. r. rer. nat. nat Günter Siegl Seeblickstrasse ckstrasse 17 17, 9402 Mörschwil [email protected] er.siegl@bluewin. Literatur 1. Lange C, Schaberg T, Diel R, Greinert U;2006 U;200 Aktueller Stand der Tuberkulosedichenschrift 131: 341-347 3 agnostik. Dtsch Med. Wochenschrift (2006) 2. Barben Barbe J, Berger C, Bodmer T,, Egger J-M, J-M Merlani G, Helbling P, et al. Handbuch Tuberkulo enliga Schweiz, Bundesamt für Gesundheit (HeTuberkulose, Version 2011; Lungenliga rausgeber) iel R, Loytved G, Nienhaus A, Castell S, Detjen A, et.al., Neue Empfehlungen 3. Diel e Umgebungsuntersuchun für die Umgebungsuntersuchungen bei Tuberkulose, Pneumologie 65: 359-378 (2011) Take-Home Message Take-H ◆ Das ZZiel der Labordiagnostik bei Verdacht auf Vorliegen einer aktiven Immunologische Verfahren in der Diagnostik einer Tuberkuloseinfektion Serologische Verfahren über den Nachweis hweis humoraler h r Antikörper erzeit oh sind in der TB-Labordiagnostik derzeit ohne Bedeutung. Der lalärer Immunität gegen pathogene ene bordiagnostische Nachweis zellulärer weitgehen gesicherMykobakterien erlaubt heute jedoch einen weitgehend en einer Tuberkuloseinfektion, soten Nachweis für das Vorliegen er inaktiven, latenten und u.U. wohl in ihrer aktiven als auch in ihrer reaktivierbaren Form. daf ausschliesslich hliesslich der TuberTub Bis vor wenigen Jahren stand dafür HT) nach Mantoux zur Verfügung. ung. Dieser Diese Test kulin-Hauttest (THT) 32 Tuber Tuberkuloseinfektion ist der Nachweis bzw. der Ausschluss des Erregers. Goldstandard ist dabei nach wie vor der Nachweis säurefester Stäb◆ Gold ch chenbakterien im mikroskopischen Präparat und die Anzüchtung des Erregers auf flüssigen und festen Nährböden. d ◆ Molekular-genetische Verfahren erlauben im Idealfall einen schnellen, direkten Nachweis eines Erregers sowie seine beschleunigte Identifizierung und Charakterisierung nach Isolierung in der Kultur. ◆ Die Aussagekraft des Ergebnisses der Labordiagnostik hängt stark von der Qualität des verwendeten Untersuchungsmaterials ab. Seiner richtigen Auswahl, korrekten Entnahme und fachgerechtem Transport ist deshalb grösste Aufmerksamkeit zu schenken. 08 _ 2011 _ der informierte arzt
