Thema Gentechnologie

Thema Gentechnologie
Erwin R. Schmidt
Institut für Molekulargenetik
Vorlesung #2
28. 04. 2015
Struktur R-Enzym HincII
Struktur der R-Endonuklease Bam HI
Hochmolekulare DNA
Erkennungssequenz
Typ II-Restriktionsenzyme erkennen und schneiden die
DNA an palindromischen Sequenzen
z. B. 5´-GGAATTCC-3´
Restriktionsenzyme
• Sternaktivität? R-Enzyme können bei
suboptimalen Bedingungen eine reduzierte
Spezifität bezüglich der Erkennungssequenz
aufweisen
Restriktionsenzyme
Alles über R-Enzyme: http://rebase.neb.com
• http://www.neb.com/nebecomm/products/ca
tegory1.asp
REBASE—a database for DNA restriction and modification:
enzymes, genes and genomes
Richard J. Roberts*, Tamas Vincze, Janos Posfai and Dana Macelis
Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, D234-236
http://rebase.neb.com
Komplementäre
überhängende
Enden
(„Sticky ends“)
erleichtern das
Wiederverknüpfen
von DNAMolekülen
Die DNA-Ligase verknüpft zwei DNA-Moleküle
T4-DNA-Ligase
Ligase AMP
Ligase
AMP
E. coli DNA-Ligase
Die DNA-Ligasen sind in der Lage, Phosphodiesterbindungen zu knüpfen. Sie brauchen
dafür Energie, die entweder durch ATP oder
NAD+ geliefert wird
Die DNA-Ligase schleißt typischerweise „nicks“
Oder verbindet „glatte“ Enden miteinander
In der Gentechnologie
ist die Neukombination
unterschiedlicher DNAMoleküle wichtig.
Das Verknüpfen von DNAMolekülen erledigt das
Enzym „DNA-Ligase“
Wie kann man die Ligationsreaktion in
Richtung der „bimolekularen“ Reaktion treiben?
Asymmetrische Restriktion von Vektor und
Integrat-DNA
GGCC
AATT
CCGG
AATT
Eine weitere Möglichkeit, nachträglich rekombinante
Klone zu identifizieren, ist die Doppelselektion,
dazu sind spezielle Vektoren notwendig
Die Voraussetzungen
für Gentechnologie
Funktionen der Vektor DNA
• Sorgt für Replikation in der Wirtszelle
• Stellt selektierbare Markergene bereit
• Hat Vielzweck-Klonierungsstelle
• Trägt Signalsequenzen für Genexpression
• Verschiedenste Modifikationen für spezielle Anwendungen (z. B.
„Shuttle“ zwischen Pro- und Eukaryoten; Elemente für künstl.
Chromosomen)
Typen von Klonierungsvektoren
- Plasmide
- Phagen (M13, Lambda, P1)
- Phasmide; Phagemide
- Cosmide
- künstl. P1_Phagenchromosomen (PAC)
- künstl. Bakterienchromosomen (BAC)
- künstl. Hefechromosomen (YAC)
- künstl. Humanchromosomen (HAC)
Typische Vektoren
besitzen mindestens
einen Replikationsursprung (ori),
selektierbare Marker-Gene
und eine multiple Klonierungsstelle
Typische Vektoren besitzen einen Replikationsursprung (Origin),
selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle
Inzwischen gibt es die verschiedensten Farbvariationen als Marker oder
Reportergene
Plasmide als Vektoren
Plasmide sind extrachromosomale,
autonom replizierende,
meist zirkuläre DNA-Moleküle,
die natürlicherweise in vielen
Bakterien vorkommen
E. coli DNA
Plasmid-DNA
Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Plasmids in der
Zustandsform „supercoiled“(rechts) bzw. „relaxed circle“ (links)
http://www.gen.cam.ac.uk/Images/summers/plasmids.jpg
z.B. Resistenzplasmide
aus Weaver/Hedrick