Bioanalytik - apz

Grammann / Eiden
BioAnalytik
Bioanalytik
04.01.16
Kalorimetrie
012_001
Folienbasis: Prof. Beyer
Rev. 1.5 | 091206
- Standort Recklinghausen-
Wintersemester 2015-16
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2015-2016
Grammann / Eiden
:1
BioAnalytik
Kalorimetrie - Grundlagen
Ein thermodynamisches System ist ein räumlich eingegrenzt
betrachtetes physikalisches System, für das eine Bilanzgleichung wie
eine Energiebilanz oder, bei offenen Systemen, eine Stoffbilanz
aufgestellt werden kann.
offen
geschlossen abgeschlossen
Systeme:
– offene:
∆E/∆t ≠ 0; ∆m/∆t ≠ 0
– geschlossene:
∆E/∆t ≠ 0; ∆m/∆t = 0
– abgeschlossene: ∆E/∆t = 0; ∆m/∆t = 0
„Thermodyn. Systeme“ von Volker Sperlich - Quelle: Volker Sperlich: (2002) Fachbuchverlag Leipzig.
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Grammann / Eiden
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Kalorimetrie – Grundlagen (offene Systeme / Beispiele)
„Thermodyn. Systeme“ von Volker Sperlich - Quelle: Volker Sperlich: (2002) Fachbuchverlag Leipzig.
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BioAnalytik
Kalorimetrie – Grundlagen (geschlossene Systeme / Beispiele)
„Thermodyn. Systeme“ von Volker Sperlich - Quelle: Volker Sperlich: (2002) Fachbuchverlag Leipzig.
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Kalorimetrie – Grundlagen (Begriffe)
Energiegehalt von Systemen:
∆U = ∆Q + ∆W: Änderung Innere E = Wärmefluss + geleistete Arbeit
U ist nicht messbar, sondern immer nur ∆U!
H = U + pV (bzw. ∆H = ∆U + ∆pV):
Enthalpie = Innere E + Vol.arbeit
Energieumsatz chemischer Reaktionen.
∆H0f = Standard-Bildungsenthalpie für 1Mol (25°C, 1bar) [Einheit: kJ/Mol]
Reaktionsenthalpie: ∆H0Reaktion = ∆H0f:Produkte - ∆H0f:Edukte
G = U + pV –TS = H – TS (bzw. ∆G = ∆H – ∆TS) Gibbs-Helmholtz-Gleichung
∆ Gibbs-Energie („freie Enthalpie“) = ∆H – ∆Entropie-Term
Entropie = Maß für die Ordnung eines Systems
∆G = Maß für die Triebkraft einer Reaktion
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Kalorimetrie - Grundlagen
∆G = ∆H – ∆TS (Gibbs-Helmholtz-Gleichung)
exo- / endotherme Reaktion: Bei Ablauf wird Wärme frei / aufgenommen
bei exothermen Reaktionen ist ∆H negativ (∆H < 0, = Wäremeabgabe)
bei endothermen Reaktionen ist ∆H positiv (∆H > 0, = Wäremezufuhr)
exer- / endergone Reaktion: Reaktion läuft / läuft nicht freiwillig ab
exergone Reaktion: läuft freiwillig ab, weil ∆G negativ
∆H negativ (exotherm) und/oder ∆TS positiv
● ∆H negativ: Reaktion exotherm, Wärmeabgabe
● ∆TS positiv: Entropie („Unordnung“) steigt,
ergo kann ggf. eine endotherme Reaktion freiwillig ablaufen.
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Kalorimetrie - Grundlagen
Enthalpie-getriebene Reaktion:
∆H negativ, exotherm, Abnahme der Energie des Systems
(Verbrennungsreaktionen)
Entropie-getrieben Reaktion:
können endotherm sein (sofern ∆H ≥ 0), Zunahme der Entropie
(Lösen von Ammoniumsulfat in Wasser; Phosphorolyse von DNA
Zerstören geordneter Wasserstruktur;
Zunahme von Freiheitsgraden)
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Triebkraft Entropie / Enthalpie
Methanogenese
aus Acetat
∆H
Atmung
Alkohol.
Gärung
Methanogenese
aus CO2
0
∆H
∆H
∆G
- T∆S
endotherm !!
- T∆S
- T∆S
exotherm
Entropie getrieben
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∆H
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Enthalpie getrieben
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Entnommen: von Stockar et al. (2004) Thermodynamische Analyse des mikrobiellen Wachstums. BioPerspectives 2004, Wiesbaden 4.-6.5.2004
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Kalorimetrie => Anwendungen
Titrationskalorimetrie (xTC, engl. ‚… titration calorimetry') ist eine
biophysikalische Technik, die zur Bestimmung von thermodynamischen
Parametern biochemischer Bindungsprozesse eingesetzt wird. Meist
wird dabei die Bindung kleiner Moleküle, etwa medizinisch wirksamer
Substanzen, an größere Makromoleküle (Proteine, DNA usw.)
untersucht und thermodynamisch charakterisiert. Dies lässt
Rückschlüsse auf die Energetik der Bindung sowie die Zahl und das
Verhältnis der beteiligten Teilchen zu.
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(Mikro-)Kalorimetrie
Geräte-Hersteller z.B.:
Microcal Inc. (www.microcalorimetry.com)
Calorimetry Sciences Corp. (www.calorimetrysciences.com)
Isothermische Titrationskalorimetrie (ITC)
– gemessen wird die Wärme, die während einer Reaktion
(bei konstanter Temperatur) aufgenommen/abgegeben wird
Differentielle Scanning Kalorimetrie (DSC)
– gemessen wird die Wärmeaufnahme/-abgabe
als Funktion der Temperatur (bei konstantem Druck)
hiermit möglich: Messung thermodynamischen Parameter einer Bindung:
⇒ KA (bzw. KD), ∆G, ∆H, ∆S, n
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ITC: isotherm. Titrat.kalorimetr.
• zwei Zellen zu je 1 - 1.5 ml Volumen
Protein +
Puffer
• Fülle Probenzelle mit Protein
Puffer
• Automatische Zugabe des Liganden
in ca. 20 Schritten
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• Fülle Spritze mit Liganden
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ITC: Prinzip
beide Zellen sind thermostatisiert und isoliert; Temperatur des
Mantels wird konstant gehalten (isotherme Bedingungen)
Referenzzelle: schwach geheizt (z.B. 20 µW)
Probenzelle:
feedback-kontrolliert geheizt
auf selbe Temperatur
wie Referenzzelle
Aufzeichnung: Heizstrom I = f(t)
∆Heizstrom = posit./ negat. Peak
jacket
feedback
sample
feedback
wird bei Bindungsreaktion in Probenzelle:
• Wärme frei:
Heizstrom I wird durch feedback-Mechanismus gedrosselt
• Wärme aufgenommen:
Heizstrom I wird durch feedback-Mechanismus verstärkt
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: 12
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ITC: Messkurve
Was passiert hier?
Vorzeichen:
exotherm oder endotherm?
0
1
2
3
4
5
6
7
Molar Ratio, L0/P0
Primäre Messgröße = Leistung P [W] des Heizstroms
zum zusätzlichen Heizen der Messzelle
Wärmeleistung: 1 W = 1 J/s (= 0.2388 cal/s)
∆q i =
t,i
∫ P(t) dt
[cal]
t,i −1
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: 13
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ITC: Messkurve
P+L
KD =
kon
koff
PL
[P]⋅ [L]
[PL]
Zugängliche Parameter: ∆H, KD
KD
∆Hb
∆qi, normiert
auf mol Ligand
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: 14
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Fallbeispiel B-FABP
Bindung von Fettsäuren an B-FABP
00
20:4,
nM
22:6, 207
53 nM
-4000
-4000
time [min]
-6000
-6000
-8000
-8000
-10000
6.0
6.0
-10000
-12000
-12000
-14000
-14000
-16000
-18000
-16000
0.0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90100
5.5
µcal/sec
kcal/mol of injectant
-2000
-2000
5.0
5.0
4.5
4.5
4.0
4.0
3.5
3.5
3.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
ratio oleic acid / B-FABP
molar molar
ratio docosahexaenoic
acid / B-FABP
Aus KD ergibt sich die freie Bindungsenergie
∆G = - RT lnK
Damit auch Bindungsentropie zugänglich
T∆S = ∆H - ∆G
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BioAnalytik
ITC-Interpretation
• Die Zusammensetzung von ∆G aus ∆H und T∆S zeigt an,
ob die Reaktion Enthalpie- oder Entropie-getrieben ist
• Positive ∆S weisen oft auf eine Verdrängung
geordneter Wassermoleküle aus einer Bindungstasche hin
mehr Freiheitsgrade
• Negative ∆S: geordnetes Wasser wird in der Kontaktfläche
Protein-Ligand eingebaut und/oder Flexibilität von
Seitenketten eingeschränkt ( weniger Freiheitsgrade)
• Weitere zugängliche Größe: ∆Cp
aus der Temperaturabhängigkeit von ∆H
(gemessen bei unterschiedlichen Temperaturen)
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: 16
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BioAnalytik
Proteinfaltung: Analytik
Methodische Ansätze:
- Wie ändert sich die Größe (der
radius of gyration) mit der Zeit?
(Kleinwinkelstreuung)
- Wann bilden sich Elemente der
Sekundärstruktur? (FTIR, CD)
- Wann bildet sich der hydrophobe
Kern? (Fluoreszenz)
- Wann werden die Wassermoleküle
aus dem Proteininneren verdrängt?
(Fluoreszenz-Quenching)
- Wann sind welche tertiären
Kontakte gebildet? (NMR)
- Was ist die Rolle von Dynamik
(H/D-Austausch-Experimente)
- Wie ist die Energetik? (DSC)
Dobson, Karplus, Angew. Chemie Int. Ed. 37, 868 (1998)
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: 17
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DSC
Differenzielle Scanning Kalorimetrie
•Die dynamische Differenzkalorimetrie ist ein Verfahren der thermischen Analyse,
bei der die Wärmekapazität einer Probe direkt als Funktion der Temperatur
gemessen wird. Änderungen der spezifischen Wärmekapazität treten bei Phasenund Zustandsübergängen auf (enthalpische Effekte durch exo- oder endotherme
Übergänge).
•Bei Proteinen können mit dieser Methode die Übergänge zwischen verschiedenen
Faltungszuständen untersucht werden.
Phasenübergänge:
- Proteinfaltung / -entfaltung (Denaturierung)
- Dissoziation / Assoziation von
Nukleinsäuredoppelsträngen
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2015-2016
: 18
Grammann / Eiden
BioAnalytik
DSC: Kalorimeter-Aufbau
• Referenzzelle wird kontinuierlich aufgeheizt (0.5 - 1.5 °C/min).
• Die Temperatur der Probenzelle wird durch Heizen
der Temperatur der Referenzzelle angepasst.
Unterschied im Heizstrom:
Bestimmung der Differenz der Wärmekapazität
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2015-2016
Grammann / Eiden
: 19
BioAnalytik
DSC: Kalorimeterie
• erfolgt in der Probenzelle ein Phasenübergang (z.B. Proteinentfaltung
endothermer Prozess), so nimmt Probenzelle mehr Strom (Wärme) auf.
• Nach diesem Übergang hat das Protein eine höhere partielle spezifische
Wärmekapazität als das gefaltete Protein
Bei der Proteinfaltung spielen enthalpische und
entropische Faktoren eine Rolle
native
N
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unfolded
U
2015-2016
: 20
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Exkurs: Proteinfaltung
Triebkräfte für Proteinfaltung
1 Typen von Wechselwirkungen
hydrophob / elektrostatisch
2 Entropieänderung
Änderung von Freiheitsgraden
(Seitenketten, Wasserstruktur)
3 Wechselwirkungspartner
Protein-Protein
Protein-Solvens
Solvens-Solvens
Freie Enthalpie (∆G) des Gesamtsystems reduzieren,
(nicht nur die innere Energie des Proteins alleine!)
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2015-2016
: 21
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Bestimmung der Proteinstabilität
Hier: pH-Abhängigkeit
Formulierungen von
Proteinwirkstoffen
(Stabilisierung durch Zusätze)
Biotechnologie
pharmazeutische Industrie
Einfluss von Mutationen
(Protein-Engineering /
Enzymtechnologie)
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2015-2016
: 24
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Aspekte
Systeme
offene / (ab)geschlossene
U, H, G, S
Reaktionen
endotherm/exotherm; endergon/exergon; H-/S-getrieben
ITC
Prinzip, Durchführung
Proteinfaltung
Enthalpie- / Entropie-Anteile
Analytik der Proteinfaltung
DSC
Prinzip, Durchführung
Interpretation eines Thermogramms
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2015-2016
Grammann / Eiden
: 25
BioAnalytik
Foto
"Ever tried. Ever failed. No matter. Try again. Fail again. Fail better"
Samuel Beckett
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2015-2016
: 26
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Fluoreszenztechniken
BioAnalytik
2015-2016
: 27
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Bereiche elektromagn. Strahlung
gespiegelt, s. nächste Seite
menschl. Auge
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2015-2016
: 28
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Bereiche elektromagn. Strahlung
BioAnalytik
2015-2016
: 29
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Absorption elektromgn. Strahlung
Schema möglicher elektronischer
Übergänge zwischen Molekülorbitale
Energieniveaus
elektronischer Zustände
σ*
π*
n−π∗
σ−σ∗
π−π∗
n−σ∗
n
π
σ
n = nichtbindende MO‘s
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2015-2016
: 30
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Jablonski Schema
veranschaulicht die möglichen Übergänge von Valenz-e- in die
verschiedenen Anregungszustände bei Einstrahlung hν
Schwingungs- S1: 1. angeregter Zustand
v5
relaxation
S1 vv43
v2
v1
Absorption
interne und
externe
Konversion:
strahlungslos
(Schwingungszustände
∆Q)
oder
Phosphoreszenz
Fluoreszenz
S0
S0: Grundzustand
Ein Triplett-Zustand ist ein elektronischer Zustand, der in Abwesenheit eines äußeren
Magnetfeldes dreifach entartetist und im Magnetfeld (Zeeman-Effekt) in drei Komponenten
aufspaltet. Einen Triplett-Zustand besetzen z.B. Atome, Moleküle oder Ionen mit zwei
ungepaarten Elektronen, deren Spins parallel ausgerichtet sind.
BioAnalytik
v5
v4
v3
v2
v1
r
v2
v1
3
2
1
0
3
2
1
0
Zum Vergleich: Infrarotspektroskopie
2015-2016
: 31
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Stokes Shift
• Schwingungs- / Vibrationsrelaxation
sehr viel schneller als
∆hν
Absorption & Emission fast nur aus v1-Zusstand
• ∆hν = E-Verlust
Fluoreszenz & Phosphoreszenz bei
niedrigerer E, ergo bei größerem λ:
S1
Absorption
v5
v4
v3
v2
v1
Fluoreszenz
v5
v4
v3
v2
v1
S0
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2015-2016
: 32
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Fluorophore
Fluorophore: meistens Aromaten / konjug. π-Syst.
meisten Aromaten fluoreszieren
starre Moleküle fluoreszieren besser als flexible
weniger E-Abgabe über Molekülschwingungen
Cyaninfarbstoffe
Biphenyl
Fluoren
Steigende Temp
abnehmende Fluoreszenz: mehr
Zusammenstöße, externe Konversion
BigDye
(Terminatoren)
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Der asymmetrische Cyanin-Farbstoff SYBR
Green I wird zum Nachweis von
doppelsträngiger DNA benutzt.
2015-2016
Grammann / Eiden
Fluorescein
: 33
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Fluorophore
Anregung ----- Emission
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2015-2016
: 34
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Quenching
Der Effekt der Fluoreszenzlöschung (englisch Quenching) bezeichnet
Vorgänge, die eine Abnahme in der Intensität der Fluoreszenz eines
Fluorophors zur Folge haben, ohne dass der Fluorophor zerstört wird.
Es existiert eine Reihe von Effekten, die zur Fluoreszenzlöschung führen
können, beispielsweise:
• Komplexbildung
• interne Konversion
• Energieübertragung auf andere Moleküle, sogenannte Quencher
Die Fluoreszenzlöschung eines Fluorophors durch einen Quencher ist
reversibel: Die Fluoreszenz steigt wieder an, sobald der Quencher
entfernt wird.
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2015-2016
Grammann / Eiden
: 35
BioAnalytik
Quenching
Quenching durch Quencher- (Floureszenz-Löscher-)Molekül Q:
S1 + Q
S0 + Q*
danach Q*
Q + ∆EQ (interne Konversion) oder
Q*
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Q + hν (Fluoreszenz bei größerem λ)
2015-2016
: 36
Grammann / Eiden
BioAnalytik
FRET
Förster- oder Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer:
strahlungsfreie Energieübertragung von einem angeregten
Farbstoff ("Donor") auf einen zweiten Farbstoff ("Akzeptor")
über virtuelle Photonen: funktioniert bis zu ca. 10 nm Distanz.
Auf dem Förster-Resonanzenergietransfer basiert beispielsweise der Lichtsammelkomplex Photosynthese betreibender Organismen.
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2015-2016
: 37
Grammann / Eiden
BioAnalytik
FRET
Beziehung der Spektren von FRET-Donor und Akzeptor
: Übergang (in Jablonski-Schema)
: FRET
BioAnalytik
2015-2016
: 38
Grammann / Eiden
BioAnalytik
FRET
Jablonski-Schema
Maurel Damienderivative work: S. Jähnichen (talk)derivative work: S. Jähnichen (talk)
BioAnalytik
2015-2016
Grammann / Eiden
: 39
BioAnalytik
Proteinfaltung: Analytik
Methodische Ansätze:
- Wie ändert sich die Größe (der
radius of gyration) mit der Zeit?
(Kleinwinkelstreuung)
- Wann bilden sich Elemente der
Sekundärstruktur? (FTIR, CD)
- Wann bildet sich der hydrophobe
Kern? (Fluoreszenz)
- Wann werden die Wassermoleküle
aus dem Proteininneren verdrängt?
(Fluoreszenz-Quenching)
- Wann sind welche tertiären
Kontakte gebildet? (NMR)
- Was ist die Rolle von Dynamik
(H/D-Austausch-Experimente)
- Wie ist die Energetik? (DSC)
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2015-2016
: 40
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Anwendungsbeispiele
Analyse von Protein-Protein-Interaktionen
Im Rahmen der auf der Messung des Förster-Resonanzenergietransfers
basierenden Protein-Protein-Interaktionsstudien werden die zu
untersuchenden Proteinpaare mit Hilfe von Paaren fluoreszierender oder
sonstiger lumineszierender Farbstoffe markiert, sodass bei einer
Interaktion der zu untersuchenden Proteine eine Zunahme des FörsterResonanzenergietransfers zwischen den gekoppelten Farbstoffen
beobachtet werden kann.
Diese werden beispielsweise zur
Aufklärung von Signalweiterleitungswegen in der Zelle und bei der Suche
nach neuen Wirkstoffen mit Hilfe des
Hochdurchsatz-Screenings eingesetzt.
BioAnalytik
2015-2016
: 41
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Fusionsproteine
Fusionsprotein
CFP(Donor)-Calmodulin-YFP(Akzeptor)
Yellow fluorescent protein (YFP)
Cyan Fluorescent Protein (CFP)
Überexpression in „cell of interest“
Konstrukt
∆Konf. als f([Ca])
Echtzeit-Messung der intrazellul. [Ca]
(z.B. Muskelzellen in Kultur)
Fusionsprotein = gemeinsame Expression zweier Gene oder Genteile, die hintereinander im Genom liegen
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2015-2016
: 43
Grammann / Eiden
BioAnalytik
DNA-Sonden
Hybridization probes,
Anwendung zum Nachweis
einer bestimmten Sequenz …
… oder zur Quantifizierung in einer realTime PCR
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2015-2016
Grammann / Eiden
: 44
BioAnalytik
FACS
„Dekorieren“ von Zellen
mit Fluoreszenz-gelabelten AK
Zählen / Sortieren im FACS
BioAnalytik
2015-2016
: 45
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Instrumente
Im wesentlichen 3 Typen von Instrumenten, die Fluoreszenz nutzen:
•
Spektrofluorometer
bulk Eigenschaften (µl - ml Proben )
•
Fluoreszenzmikroskop
•
Flow cytometer (FACS)
Ortsauflösung der Fluoreszenz in 2 oder 3D
Monochromator
Xe-Hochdrucklampe
Probe
Grundsätzlicher Aufbau
Fluoreszenzspektrometer
λem
Monochromator
λex
Detektor
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2015-2016
: 46
Grammann / Eiden
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Fluoreszenzspektrometer
I
I0
Einstellungen:
lex, lem, Spaltbreiten, Laserspannung
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2015-2016
: 47
Grammann / Eiden
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Selektion definierter λ
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2015-2016
Grammann / Eiden
: 48
BioAnalytik
Röntgenstrukturanalyse
Bestimmung der Lage der Atome oder Ionen in der Elementarzelle
(Kristall) durch Röntgenstrahlen.
Die Wellenlängen der Röntgenstrahlen liegen in der gleichen
Größenordnung wie die Atomabstände im Kristall (10-8 cm).
Der Kristall wirkt als Beugungsgitter und erzeugt Strahlungsinterferenzen.
Aus der Lage und Intensität der Interferenzmaxima wird die Struktur
des Kristalls bestimmt.
BioAnalytik
2015-2016
: 49
Grammann / Eiden
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Röntgenstrukturanalyse
BioAnalytik
2015-2016
: 50
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Röntgenstrukturanalyse
aa-Sequenz (+/-) leicht ermittelbar, aber
• Ableitung der 3D-Struktur unmöglich!
• Mikroskopische Verfahren nicht anwendbar
(selbst UV: λ weitaus zu „grob“)
EM kann Proteine sichtbar machen, aber nur unstrukturiert
• Spektroskopie liefert nur „allgemeine“ Informationen
- Faltung
- Gehalt an Sekundärstrukturelementen
Also was tun???
λ von Röntgenstrahlung ist klein genug
aber keine Linsensysteme verfügbar!
ergo:
Proteinkristalle züchten
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X-ray Beugung
2015-2016
Fourieranalyse
: 51
Grammann / Eiden
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Prinzip
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2015-2016
: 52
Grammann / Eiden
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„Röntgenstruktur-Fahrplan“
• Proteinaufreinigung
• Kristallisation
• Röntgenbeugung
(Phaseninformation durch Schwermetalle)
• Fourier-Analyse
Die eigentliche Kristallstruktur, d.h. die Lage aller
Atome innerhalb der Elementarzelle, läßt sich aus
den Intensitäten der Reflexe berechnen. Dies
erfolgt durch Fourier-Synthese.
• Elektronen-Dichtekarte
• „ein-fitten“ der aa-Kette
• 3D-Proteinstruktur in atomarer Auflösung
BioAnalytik
2015-2016
: 53
Grammann / Eiden
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Kristallisierung
hochkonzentrierte Proteinlösungen (ca.2-20mg Protein / ml)
mit verschiedenen Pufferlösungen in kleinen (µl) Tropfen vermischt
Tage - Jahre bei konst. Temperatur (4°C / 12°C / 30°C) inkubiert
Pufferlösungen enthalten hohe Konz. an Salzen oder Alkoholen oder
Polyethylenglykol als Fällungsmittel, auch z.T. hygroskopische
Lösungen in der Kammer ( langsamer Wasserentzug)
Hanging Drop
Sitting Drop
Versiegelung
Prot.lsg
Prot.lsg
ReagenzienReservoire
BioAnalytik
ReagenzienReservoire
2015-2016
Grammann / Eiden
: 54
BioAnalytik
Elektronedichtekarte
• das fitten der aa-Kette ist Handarbeit …
BioAnalytik
2015-2016
: 55
Grammann / Eiden
BioAnalytik
Aspekte
Fluoreszenz
Definition, Zusammnhänge
Jablonski-Schema, Stokes-Shift
Anregung / Quenching
Anregung/Emission (Spektren), interne / externe Konversion
FRET
Prinzip, Anwendungen
- Hybridisierungssonden, Prot-Interaktion etc.
Apparativer Aufbau
Floureszensspektrometer (
Optik, Monochromatoren)
Röntgenstrukturanalyse
Prinzip, Schritte
(Prot.reinigung, Kristallisation, Beugung, Phase, Elektronendichte, Fit)
Kristallisationsverfahren
Phasenproblem: Schermetallderivate
BioAnalytik
2015-2016
: 56
"Art is I; scienceBioAnalytik
is we"
Claude Bernard
Grammann / Eiden
Foto
BioAnalytik
2015-2016
: 57