10. Bioanalytik 10.1 Bio-Assays 10.1.1 Enzym-Assays

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Quantitative Analytik
10.
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Bioanalytik
Bioanalytik
Die Vielfalt der organischen Verbindungen (> 107) stellt eine Herausforderung für die
Analytik dar, wenn einzelne Analyte selektiv in komplexen Matrices, oder wenn alle
Komponenten in einer Probe bestimmt werden sollen. Dies ist insbesondere wichtig bei
biologischen Proben und relevant in der klinischen Analytik, in der Proteomik und in
der Systembiologie.
Empfohlene Literatur:
• A. Manz, N. Pamme and D. Iossifidis, "Bioanalytical Chemistry", Imperial
College Press, London, 2004.
• S. R. Mikkelsen, E. Corton, "Bioanalytical Chemistry", Wiley, Hoboken, 2004.
10.1
Bio-Assays
Bei diesen Methoden wird die Selektivität biochemischer Reaktionen für analytische
Anwendungen ausgenützt.
• Vielseitig: von Umweltanalytik für Pestizide zu Nachweis von Viren wie etwa
SARS
• Aufwendig in der Entwicklung, dann aber recht einfach, relativ schnell und
billig
10.1.1 Enzym-Assays
Meist Substrat als Analyt, manchmal auch Cofaktoren oder Enzyme selbst (klinische
Analytik).
• Selektiv für Naturstoffe in komplexen Proben die sonst nur mit aufwendigen
Trennmethoden (HPLC) zu bestimmen wären.
• Enantioselektivität
• Selektivität bedeutet, dass nur geringe Probenaufarbeitung zur Unterdrückung
von Matrixeffekten notwendig ist.
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Bioanalytik
Die meisten der eingesetzten Verfahren beruhen auf redoxaktiven Enzymen mit
Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NAD) als Coenzym, welches direkt anhand der UVAbsorption nachgewiesen werden kann, oder auf Reaktionen welche H2O2 als
Nebenprodukt aufweisen, welches dann in einer nachfolgenden Sekundärreaktion zur
Bildung eines farbigen Produktes führt.
Höhere Empfindlichkeiten als mit der UV-Vis-Absorptionsmessung können mit der
Fluoreszenz (NAD, oder derivatisierte Verbindungen (FTIC), Radiometrie oder der
Amperometrie erhalten werden.
Bei relativ langsamer Reaktion wird der vollständige Umsatz des Analyten nicht
abgewartet sondern die Reaktionskinetik gemessen und aus der Reaktionsrate die
Konzentration abgeleitet. Die kinetische Messung erlabut auch eine Diskrimination
gegen ein Hintergrundsignal durch die Probenmatrix.
Eine einfache enzymatische Reaktion mit einem Substrat (und solche bei denen das
Lösungsmittel Wasser Cosubstrat ist) kann wie folgt beschrieben werden:
E + S <-> E·S -> E + P
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Bioanalytik
Die anfängliche Reaktionsrate kann mit der Michaelis-Menton-Gleichung beschrieben
werden:
v = Vmax [S] / (Km + [S]
(where Km = (k-1 + k2)/k1)
Für tiefe Konzentration von S gilt:
v = Vmax [S] / Km = Konstante · [S]
Die Konzentration des Substrates kann also aus der anfänglichen Reaktionsrate
hergeleitet werden.
Enzymreaktionen sind immer abhängig vom pH-Wert und die höchste Umsatzrate wird
in der Regel um den physiologischen pH-Wert von 7.4, und einer Temperatur von 37°C
erreicht.
Anwendungen liegen im Bereich der Biochemie, Lebensmittelanalytik, Pharmazie und
klinische Chemie (da man auf Enzyme und damit auf natürlich vorkommende Analyte
angewiesen ist).
Beispiele:
• Ethanolbestimmung mit Alkoholdehydrogenase:
CH3CH2OH + NAD+ -> CH3CHO + NADH + H+
• Glukosebestimmung mit Hexokinase und Adenosin-5'-triphosphat als Coenzym
gefolgt von einer Indikatorreaktion des Produktes in einer mit NAD gekoppelten
weiteren Enzymreaktion:
Glukose + ATP -> ADP + Glukose-6-Phosphat
Glukose-6-Phosphat + NAD+ -> 6-Phosphoglukonolacton + NADH + H+
(oder mit Glukoseoxidase via Peroxid)
• Cholesterin mit Cholesterinoxidase (via Peroxid)
• Harnsäure mit Uricase (via Peroxid)
• Harnstoff mit Urease und Nachweis des gebildeten NH4+ photometrisch (via
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Bioanalytik
Berthelotreaktion)
• Kreatin mit Creatinase und Nachweis des gebildeten Sarcosin mit Sarcosinoxidase
(via Peroxid)
• Laktat mit Laktatdehydrogenase (via NAD)
Enzymatische Sensoren:
Enzymatische Sensoren weisen ein in einer Membran immobilisiertes Enzym auf
(wichtigstes Beispiel: Glukosesensor in Diabetes).
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10.1.2 Immuno-Assays
Analyte (Antigene) werden mittels einer immunologischen Abwehrreaktion
(Antikörper-Antigen) erkannt.
Spezifische Antikörper (Immunoglobuline) werden durch Inkubation von Lebewesen
(Mäusen) erzeugt. Es kommen entweder Gemische von Antikörpern (polyklonal, aus
dem Blutserum) oder sogenannte monoklonale Antikörper zum Einsatz.
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Bioanalytik
Die Produktion von monokonalen Antikörpern ist aufwendig und teuer hat aber den
Vorteil dass ein standardisiertes und stabiles Produkt erhalten wird.
Kleine Analytmoleküle (< 1000 g/Mol) (Haptene) müssen vor der Inkubation kovalent
an Trägerproteine gebunden werden da sonst keine Antikörper gebildet werden.
In den meisten Verfahren werden die Antikörper an eine Oberfläche gebunden.
Kompetitive Immuno-Assays
Der Nachweis der Antigene erfolgt mittels kompetitiver Absorption von markierten
(labelled) Analytderivaten.
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Nicht-Kompetitive Immuno-Assays
Die gebundenen Antigene werden in einem zweiten Schritt mit einem markierten
zweiten Antikörper versehen.
Markierungsmethoden:
Radio-Immuno-Assay (RIA):
Die älteste Methode basiert auf radioaktiven Markern (etwa 125I, Gamma-Emitter mit
einer Halbwertszeit von 60 Tagen) und hat wegen der Radioaktivitätsmessung eine
inhärente hohe Empfindlichkeit. Die Methoden werden heute aber oft durch
Alternativen ersetzt.
Fluoreszenz-Immuno-Assay (FIA):
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay):
Antikörper die mit einem Enzym wie Meerrettich-Peroxidase derivatisiert sind werden
eingesetzt. Das Enzym katalysiert die Bildunge einer gefärbten Substanz aus einem
nicht gefärbten Substrat.
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Dieser chemische Verstärkungsmechanismus erlaubt den Einsatz der molekularen
Absorptionsspektrometrie welche sonst nur ungenügende Empfindlichkeit aufweisen
würde.
Für den Routineeinsatz werden Einwegtestkits für einzelne Nachweise eingesesetzt
(Umweltanalytik zur Kontaminationskontrolle etwa auf Erdöl, Schwangerschaftstests).
Wo hohe Probenzahlen anfallen (klinische Analytik) kommen standardisierte
sogenannte Mikrotiterplatten, mit 96 Vertiefungen als Gefässe, in Robotern zum
Einsatz die mit Vielfachmikropipetten und CCD-Kameras ausgestattet sind.
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Spezielle Beispiele:
ELISA zum Nachweis von HIV-Antikörpern
Schwangerschaftsnachweis:
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10.2
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DNA-Analytik (Genomics)
10.2.1 Amplifikation: Polymerase Chain Reaction (PCR)
Die PCR erlaubt die Vervielfachung der DNA, und somit eine Erhöhung der
Konzentration, vor der eigentlichen Analyse.
Diese Verdopplung wird 20 bis 35 mal wiederholt.
10.2.2 DNA-Nachweis durch "Fingerprinting"
Die Identität einer DNA ist durch deren Sequenz an Nukleinsäuren bestimmt. Die
komplete Sequenzierung der gesamten DNA ist aber im Einzelfall zu aufwendig (das
menschliche Genom wurde erst vor wenigen Jahren vollständig erfasst). Ein
eindeutiger Nachweis lässt sich aber bereits durch die Analyse von enzymatisch
erhaltenen DNA-Fragmenten durchführen.
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Gelelektrophorese:
DNA-Arrays / DNA-Chips
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Bioanalytik
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Bioanalytik
Anwendungen: Nachweis von genetisch vererbten Krankheiten, Vaterschaftsnachweis,
Forensik, Identifikation von Fleischsorten, Nachweis von genetisch veränderten
Lebensmitteln.
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10.3
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Bioanalytik
Protein-Analytik (Proteomics)
Die Analyse von Proteinen ist sehr viel aufwendiger als diejenige von DNA da nicht
nur eine Spezies vorliegt sondern eine enorm grosse Vielzahl und kein Äquivalent zur
PCR zur Erhöhung der Konzentration zur Verfügung steht.
Trennung:
Biologische Proben werden in der Regel mittels einer planaren 2D-Gelelektrophorese
(2D-GE) getrennt, wobei im ersten Schritt die Isoelektrische Fokussierung, und im
zweiten Schritt die SDS-PAGE zum Einsatz kommt.
Isoelektrische Fokussierung in einem pH-Gradienten. Die amphoterischen Proteine
wandern entweder in anionischer oder kathionischer Richtung entlang des pHGradienten bis zur Stelle an welchem der pH-Wert dem isoelektrischen Punkt entspricht
(keine Nettoladung).
SDS-PAGE: (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
Dodecylsulfat bindet während der Probenvorbereitung (Erhitzen auf 95°C) an die
Proteine welche dabei denaturieren und eine lineare Form annehmen. Die Ladung wird
dabei stark negativ und ist für alle Proteine pro Masseneinheit gleich. Die Trennung
erfolgt dann nur noch nach Grösse durch Siebung im Gel und die Methode wird daher
zur Bestimmung der Molekularmasse eingesetzt (5-10% Genauigkeit).
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Bioanalytik
Identitätsnachweis:
• Detektion mittels Antikörpern
• MALDI-MS (matrix assisted laser desorption ionization-mass spectrometry): milde
Ionisation durch Einbetten in eine UV-absorbierende Matrix welche mit einem Laser
bestrahlt wird.
• ICP-MS: zur selektiven Bestimmung von Metallo-Proteinen.
• Fingerprinting: Fragmentierung durch Enzyme (z. B. Trypsin) und dann
Bestimmung der Fragmentierungsmuster mittels Gelelektrophorese oder mittels MS.
Die Muster sind charkteristisch für die Proteine und durch Vergleich mit einer
Datenbank (Computer) lassen sich diese identifizieren.
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