Grammann - apz

Bioanalytik-Vorlesung
Elektrophorese
Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16
Vorlesung Bioanalytik Themen
Vorlesung
Datum
Thema
Grammann
Eiden
1
05.10.2015
Nukleinsäureanalytik (Quantifizierung, Blotting, Hybridisierung, FISH)
X
2
12.10.2015
Microarray
X
3
19.10.2015
DNA-Sequenzierung, Next Generation Sequencing
X
4
26.10.2015
Zell-Aufschlussmethoden, Ammonium-Fällung, Protein-Reinigung,
Chromatographische Methoden
5
02.11.2015
Chromatographische Methoden, Elektrophorese
X
6
09.11.2015
Western-Blots, Enzym-Aktivitätsassays
X
7
16.11.2015
ELISA
X
8
23.11.2015
Immunoassays
X
9
30.11.2015
Proteinaufreinigung mit Tags
10
07.12.2015
Bindungsanalytik
11
14.12.2016
Real-time-PCR
12
04.01.2016
Kalorimetrie, Fluoreszenz, X-ray
13
11.01.2016
Praktikumsauswertung und Wiederholung und weitere Themen?
14
18.01.2016
Wiederholung
X
X
X
X
X
X
X
X
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2
Elelektrophorese: Geschichte
• Entwicklung der ersten Elektrophorese durch schwedischen
Chemiker Arne Tiselius im Jahr 1937.
• Erste Elektrophorese-Apparatur: „U-Rohr“ (Tiselius-Apparatur),
dessen Schenkel mit einer Gleichstromquelle verbunden waren
und zur Auftrennung von menschlichem Serum in die vier
Hauptkomponenten Albumin, -, -, - Globuline genutzt wurde
• Nobelpreis für Chemie im Jahr 1948
Beispiel für eine trägerfreie Elektrophorese:
Arne Tiselius
*20 August 1902 - 29. Oktober 1971
Bildquelle: Instrumentelle Analytik und Bioanalytik, M. Gey, 2 Auflage, Springer Verlag
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3
Elektrophorese allgemein
In der Elektrophorese wandern geladene Teilchen in einem
elektrischen Feld. Da die Teilchen verschieden geladen sind, zeigen
sie eine unterschiedliche elektrophoretische Beweglichkeit.
Sie eignet sich zur Auftrennung von Substanzgemischen, wobei die
Substanzen in einzelne Zonen aufgetrennt werden.
Im Wesentlichen unterscheidet man drei verschiedene Verfahren:
• Zonenelektrophorese (mit Träger und trägerfrei) mit einem
homogenen Puffersystem
• Isotachophorese mit diskontinuierlichem Puffersystem
• Isoelektrische Fokussierung mit pH-Gradienten
Bildquelle: nach Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012
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4
Theorie der Elektrophorese
Im elektrischen Feld wirken auf ein geladenes Teilchen zwei Kräfte:
Eine beschleunigende Kraft (𝐹𝐵 ) die auf die auf die Ladung 𝑞 des Analyten wirkt:
𝐹𝐵 = 𝑞 ∙ 𝐸 = 𝑧 ∙ 𝑒
E = elektrische Feldstärke
q = Ladung
𝑧 = Ladungszahl
𝑒 = Elementarladung in Coulomb
Und die Reibungskraft (𝐹𝑅 ), die dieser Bewegung bremsend entgegen wirkt.
𝐹𝑅 = 𝑘𝑅 𝑣
𝑘𝑅 =Reibungskoeffizient
𝑣 = Wanderungsgeschwindigkeit
Der Reibungskoeffizient ist von der Viskosität des flüssigen Mediums abhängig und z.T.
auch vom Porensystem des Gels und der Porengröße.
Die elektrische Feldstärke beschreibt die Fähigkeit eines elektrischen Feldes Kraft auf
Ladungen auszuüben
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Theorie der Elektrophorese: Mobilität
Sobald die Analytmoleküle nach Anlegen eines elektrischen Felds eine konstante
Geschwindigkeit erreicht haben, befinden sich beschleunigende Kraft und
Reibungskraft im Gleichgewicht.
𝐹𝐵 = 𝐹𝑅 oder 𝑞 ∙ 𝐸 = 𝑘𝑅 ∙ 𝑣
Unter dieser Bedingung bewegen sich Teilchen mit konstanter Geschwindigkeit
im elektrischen Feld, woraus sich die folgende theoretische Gleichung ergibt,
wobei 𝑢 als Mobilität bezeichnet wird
𝑣=
𝑞𝐸
𝑘𝑅
=𝑢∙𝐸
Mobilität
Sie ist eine substanzspezifische
Größe, die die
Wanderungsgeschwindigkeit
im elektrischen Feld bestimmt
und wichtig für die
elektrophoretische Trennung
ist.
𝐸 = elektrische Feldstärke
𝑣
𝑞
𝑢
𝑘𝑅
= Wanderungsgeschwindigkeit
= Ladung
= Mobilität
= Reibungskoeffizient
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Theorie der Elektrophorese: Mobilität von
kugelförmigen Teilchen
Für kleine kugelförmige Analyte resultiert für die Mobilität nach dem Stokes`sche Gesetz:
𝑢=
𝑞
𝑘𝑅
=
𝑧 ∙𝑒
6𝜋𝑟
𝜂 = Viskosität der Lösung
𝑟 = Radius des hydratisierten Teilchens (Stokes Radius)
𝑧 = Ladungszahl
𝑒 = Elementarladung (in Coulomb)
𝑞 = Ladung
𝑘𝑅 = Reibungskoeffizient
Gemäß dieser Gleichung wandern gleich große Teilchen mit höherer Ladung schneller als solche mit
geringerer Ladung. Besitzen die Moleküle aber die gleiche Ladung, dann migrieren kleinere Teilchen schneller
als größere.
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Mobilität von Proteinen und Peptiden
Für nicht kugelförmige Teilchen wie Peptide und Proteine lässt sich ein
empirischer Zusammenhang zwischen Molekülmasse M und Mobilität
angeben.
𝑢=
𝑞
2
𝑀 ൗ3
𝑞 = Ladung
𝑀 = Molekülmasse
Bei der Auftrennung von Peptiden und Proteinen kann die
Wanderungsgeschwindigkeit und damit die Auflösung über den pH-Wert des
Elektrolyten optimiert werden.
Da Peptide und Proteine den schwachen Säuren oder Basen zugeordnet
werden können, hängt die Mobilität vom Dissoziationsgrad ab.
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Theorie der Elektrophorese: Über „Erschöpften
Puffer“ und Wärmeentwicklung
Bei der Elektrophorese werden Puffersysteme aus einer Säure und einer Lauge
verwendet, z.B. Tris-Chlorid, Tris-Borat.
Auch die Ionen der dissoziierten Pufferkomponenten wandern im elektrischen
Feld
 Pufferkonzentrationen und –mengen in diesen Reservoirs müssen hoch
dosiert sein, damit der Puffer nicht erschöpft ist.
Durch den elektrischen Stromfluss entwickelt sich Wärme!
Um maximale Trennschärfe zu erzielen, muß diese abgeführt werden.
 Verwendung geringer Kapillarinnendurchmesser, dünner Gelschichten
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9
Gelelektrophorese-Apparaturen
Vertikale Apparaturen
Horizontale Elektrophoresesysteme
Rundgelapparatur für
isoelektrische Fokussierung
Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012
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10
Polyacrylamid als Gelmedium für Elektrophoresen
Polyacrylamidgele:
• …werden durch chemische Copolymerisation von
Acrylamidmonomeren mit einem Vernetzer, meist N,N‘Methylenbisacrylamid hergestellt
• Sind chemisch inert, recht stabil und durchsichtig mit geringer
Elektroendoosmose
Die Porengröße des Gels wird durch Acrylamidkonzentration und
den Vernetzungsgrad definiert.
𝑇=
𝑔 𝐴𝑐𝑟𝑦𝑙𝑎𝑚𝑖𝑑+𝑔 𝐵𝑖𝑠∙100
[%]
100 𝑚𝑙
𝑔 𝐵𝑖𝑠∙100
𝐶 = 𝑔 𝐴𝑐𝑟𝑦𝑙𝑎𝑚𝑖𝑑+𝑔𝐵𝑖𝑠[%]
Acrylamid-Monomere sind
toxisch (Haut- und Nervengift)!
𝐶 = 𝑉𝑒𝑟𝑛𝑒𝑡𝑧𝑢𝑛𝑔𝑠𝑔𝑟𝑎𝑑
𝑇 = 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑎𝑐𝑟𝑦𝑙𝑎𝑚𝑖𝑑 − 𝐾𝑜𝑛𝑧𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑡𝑖𝑜𝑛
Quelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012
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Auftrennung bei unterschiedliche
Acrylamidkonzentration
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Anfärben von Proteinen im Gel
Silberfärbung
 bevorzugte Bindung von Ag+ an neg. geladene AS-Seitenketten
 Reduktion zu Silber  Sichtbarmachung durch Ag-Kolloid (braun)
 sehr empfindlich, Nachweisgrenze, ca. 5 ng
 keine quantitativen Aussagen, störempfindlich, viele
Waschschritte
Fluoreszenzfärbung
 Färben im Gel mit SYPRO Ruby oder Proteine vorher mit
Fluorezenzfarbstoffen markieren, die an Lysin oder Cystein
binden.
 Detektion mit Fluoreszenzscanner
 Vorteil: quantitative Ergebnisse über einen sehr weiten
Konzentrationsbereich.
 Sehr sensitiv, Nachweisgrenze wie bei Silberfärbung
Coomassie Brilliant Blue (s.o.)
 Nachweisgrenze, ca. 100 ng
 semiquantitativ (vgl. Bradford-Assay)
Fixierung durch 10% Essigsäure bei 50°C
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Zonenelektrophorese
• Bei der Zonenelektrophorese wird ein Puffer mit konstanter Zusammensetzung
und gleichbleibendem pH-Wert zur Trennung von Probemolekülen eingesetzt.
• Unter dem Einfluß des angelegten elektrischen Feldes beginnen die
Probemoleküle sich entsprechend ihrer elektrophoretischen Mobilität auf dem
Trenngel zu positionieren.
Beachte:
• Die Wanderung der Nucleinsäuren ist relativ pH-unabhängig.
• Die elektrophoretische Mobilität im elektrischen Feld ist für alle
Nucleinsäuren in freier Lösung gleich groß und unabhängig vom
Molekulargewicht.
Unterschiede in der Mobilität entstehen erst in der Gelmatrix
und werden durch die verschiedenen Molekülgrößen
hervorgerufen.
• Bei Proteinen ist die elektrophoretische Mobilität sowohl von
der Anzahl der Nettoladungen (abhängig vom pH-Wert) als auch
von ihrem Molekülradius abhängig.
Bildquelle: Instrumentelle Analytik und Bioanalytik, M. Gey, 2 Auflage, Springer Verlag
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Diskontinuierliche Gelelektrophorese
pH6,8
Isotachophorese
pH8,8
1
Anion
2
3
4
5
6
7
1. Glycinat-Ionen im Laufpuffer
2. Probentasche & Sammelgel: pH 6,8,
Zwitterion mit Netto-ladung fast 0 
langsam!
3. Proteine zwischen Gly (Folgeion;
geringe Mobilität  Feldstärke E
hoch) und Leition (hohe Mobilität 
E niedrig) komprimiert („stacking“)
4. Proteine stauen sich zusätzlich an der
Grenze zum stärker vernetzten
Trenngel
5. Proteine und Laufpuffer wandern in
Trenngel ein.
pH 8,8: {Glycin}  {mobileres
Glycinat}, überholt Proteine.
6., 7. homogene Feldstärke  Trennung
wie in der Zonen-elektrophorese
Cl- Glycinat Glycin
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SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli
• Die meisten Proteine binden die Seife SDS (engl. sodium dodecyl sulfate,
SDS), SDS überdeckt die Eigenladung von Proteinen. Es entstehen Micellen
mit konstanter negativer Ladung pro Masseneinheit. (1,4 g SDS/ g Proteine
in 1% SDS-Lösung)
• Durch Erhitzen auf 95°C in Gegenwart von SDS und β-Mercaptoethanol oder
Dithiothreitol werden bei der Probenvorbereitung die Sekundär- und
Tertiärstrukturen der Proteine aufgelöst und die Proteine linearisiert.
• Die Auftrennung im elektrischen Feld erfolgt im SDS-haltigen
Polyacrylamidgel mit diskontinuierliches Tris-HCl/TrisGlycin-Puffersystem in
dem es eine lineare Beziehung zwischen Logarithmus der Molmasse und der
Wanderungsstrecke gibt.
• Mithilfe von Standards lassen sich die Molmassen der Proteine ermitteln.
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Isoelektrische Fokussierung (IEF)
Elektrophoretisches Verfahren in dem Proteine oder Peptide im
elektrischen Feld durch einen pH-Gradienten wandern, bis sie ihren
isolektrischen Punkt erreichen.
pH-Gradient
Isoelektrischer Punkt: der pH-Wert, bei dem die Moleküle als
Zwitterionen ohne Nettoladung vorliegen.
Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012
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Isoelektrische Fokussierung (IEF): Herstellung eines
pH-Gradienten
Herstellung eines pH-Gradienten aus freien Trägerampholyten
Trägerampholyte: Mischung mobiler
aliphatischer Oligoamino-Oligocarbonsäuren
mit unterschiedlichen pI-Werte
Basische Ampholyte sind positiv geladen
 Wanderung zur Kathode
Saure Ampholyte sind negativ geladen
 Wanderung zur Anode
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Isoelektrische Fokussierung (IEF): Herstellung eines
pH-Gradienten
Herstellung eines pH-Gradienten aus freien Trägerampholyten
Bildquelle: Der Experimentator,
Proteinbiochemie/Proteomics, 6. Auflage Spektrum
Akademischer Verlag
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Isoelektrische Fokussierung (IEF): Herstellung eines
pH-Gradienten
Herstellung eines immobilisierten pH-Gradienten
Trägerampholyte sind in Gelmatrix einpolymerisiert.
Es werden sogenannte Immobiline eingesetzt. Das sind
Acrylamidderivate und zugleich schwache Säuren oder schwache
Basen, die durch ihre pK-Werte definiert sind.
R= COOR=NH3+
Mit IPGs können verschiedene pH-Gradienten hergestellt werden.
(sehr eng von 0,01 pH-Einheiten pro cm oder sehr weit mit pH von
2,5 -12
Vorteil gegenüber löslichen Ampholyten:
•
enge pH-Bereiche möglich
•
hohe Reproduzierbarkeit.
Gele sind kommerziell erhältlich (IPG-Streifen)
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2-D-Gelelektrophorese
Auftrennung von Proteinen nach zwei Parametern:
1. Dimension: Auftrennung nach isoelektrischem Punkt (pI)
2. Dimension: Auftrennung nach elektrophoretischer Beweglichkeit
unter denaturierenden Bedingungen.
Methode zur Auftrennung von Zelllysaten, Gewebeextrakten,
Köperflüssigkeiten.
 liefert die aktuell vorhandene Menge jedes Proteins
 Etwa 10.000 Proteinspecies können getrennt werden
z.B. Untersuchung der Wirkungsweise von Medikamenten auf
molekularer Ebene.
Änderungen des Metabolismus in krankem und gesundem Gewebe
Färbung durch Absorptionsfarbstoffe (z.B. Coomassie, Silberfärbung)
Nachteil: enger dynamischer Bereich
Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012
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2-D-Gelelektrophorese
Weitere Analyse der Spots:
Jeder Spot
entspricht
einem
Protein
Spots werden mit Spotpickern oder manuell
ausgestanzt, enthaltene Proteine werden in Peptide
zerlegt und über Massenspektrometrie untersucht
(Ergebnis: Masse/Ladungszustand des Peptids 
Identifizierung durch Vergleich mit theoretischen Daten,
Voraussetzung: Organismus ist vollständig sequenziert)
Alternativ: Übertragung auf Membran und
Sequenzierung des Proteins.
Spotpicker
Auftrennung von Mäuseleber-Proteinen in einem weiten pHGradienten: pH 3-11
Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012
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2D-Gelelektrophorese mit Proteinextrakten
aus E. coli
Einfluß verschiedener Parameter auf die
Proteinexpression
Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012
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2-D-Gelelektrophorese: Vorfraktionierung
Vorteile einer Vorfraktionierung:
Bessere Darstellung der interessierenden Proteine
Höhere Beladungskapazität für interessante Proteinfraktionen
 es können auch Proteine mit niedriger Kopienzahl detektiert
werden
Vorfraktionierung durch:
• Abtrennung verschiedener subzellulärer Komponenten
• Immunpräzipitation
• Fraktionierung nach Ladung (siehe Bild)
Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012
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Differenzgelelektrophorese (DIGE)
DIGE ist eine Variante der 2D-Gelelektrophorese in der mit
Fluoreszenz-markierten Proteinen gearbeitet wird.
Proteine der zu vergleichenden Proben werden mit
unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen (Cy3, Cy5) markiert,
gemischt und auf ein Gel aufgetragen. Als Kontrolle und interner
Standard wird ein Probengemisch mit Cy2 markiert.
 Alle gemessenen Spotpositionen und –volumina werden auf den
entsprechenden Standardspot bezogen und angeglichen
(normalisiert).
 Ergebnis: relative quantitative Werte für das Ansteigen bzw. die
Verringerung der Proteinkonzentration
 Reduktion der Wiederholungsgele
Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012
Fluoreszenzfarbstoffe sind sehr sensitiv: Nachweis von 250 pg
Protein. Linear bis 2,5 µg Protein  4 Größenordnungen
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Differenzgelelektrophorese (DIGE)
Vorteile DIGE gegenüber 2D-Gel:
• Durch Auftragen verschiedener Proben werden Gel zu Gel
Varianzen vermieden.
• Mit Hilfe des Standards sind Intergel-Vergleiche möglich
Nachteile DIGE:
• Komplette Ausrüstung mit Elektrophorese Gerät, Scanner,
Programm u.s.w. kostet etwa 250.000 €. Ein Experiment mit 3
Farbstoffen kostet etwa 100 €
Multiplexing: Die Proteine aus einer Probe werden mit mehr als
einem Farbstoff markiert. So können z.B. durch spezielle
Farbstoffe neben der Proteinmenge, phosphorylierte und
glykosylierte Proteine sichtbar gemacht werden. Die
Massenbeeinflussung der Proteine durch den gebundenen
Farbstoff muß berücksichtigt werden.
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2-D-Gelelektrophorese/DIGE: Vorteile und Nachteile
Vorteile:
• Hohe Auflösung (bis zu 10.000 Komponenten /Gel)
• Bei der IEF können bestimmte pH-Bereiche gespreizt werden 
höhere Auflösung in speziellen pH-Bereichen
• Parallele Analyse vieler Proteine zur gleichen Zeit
Nachteile:
• Fehlende Automatisierung, daher begrenzte Reproduzierbarkeit
• Schwierige technische Durchführung
• Ein einzelner Spot muß nicht unbedingt bedeuten, dass er auch
nur aus einem Protein besteht.
• Proteinverluste von der Übertragung der ersten (IEF) auf die
zweite Dimension (SDS-PAGE)
• Proteine mit extremen Eigenschaften gehen verloren (sehr große,
sehr saure,sehr hydrophobe…)
• Es gibt keine guten Methoden, um Proteine in der Gelmatrix zu
quantifizieren.
Ausschnitte aus 25 Gelen aus verschiedenen Experimenten. Man
sieht signifikante Unterschiede in der Expression des rot
markierten Proteins.
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Kapillarelektrophorese
Prinzipieller Aufbau einer Kapillarelektrophorese (Capillary Electrophoresis, CE)
Der Detektor ist an der Kathodenseite
Die Trennung basiert auf der Wanderung im elektrischen Feld und dem osmotischen Fluss
Bildquelle: Instrumentelle Analytik, Theorie und Praxis, Verlag Europa Lehrmittel, Heinz Hug, 2. überarbeitete Auflage
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Kapillarelektrophorese: Elektroosmotischer Fluss
Der elektroosmotische Fluss ist eine sehr starke, kathodengerichtete Strömung der Pufferlösung innerhalb der
Kapillare.
Bildquelle: Instrumentelle Analytik, Theorie und Praxis, Verlag Europa Lehrmittel, Heinz Hug, 2. überarbeitete Auflage
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Kapillarelektrophorese: Elektroosmotischer Fluss
Kapillarzonenelektrophoretische Trennung von basischen Proteinen
• Kationen wandern schneller als der elektroosmotische Fluss, da sowohl die
Elektrophorese als auch der EOF in die gleiche Richtung laufen
• Große Anionen unterliegen einer zur Anode hin gerichteten elektrischen
Anziehungskraft und würden dorthin wandern, wenn der EOF nicht wäre. Die
viskositätsbedingte Reibungskraft ist höher als die Coulomb-Kraft. Deshalb
migrieren auch große Anionen zur Kathode allerdings langsamer als der EOF.
• Kleine Anionen wandern zu Anode, da der EOF nicht ausreicht, die CoulombKraft zu überwinden.
• Neutrale Moleküle werden nicht getrennt. Sie bewegen sich mit der
Geschwindigkeit des EOF durch die Kapillare
Auftrennung bei U=30kV und pH=3
1) Cytochrom C 2) Lysozym, 3) Trypsin,
4) Trypsinogen 5) -Chymotrypsin
Im Gegensatz zur Chromatographie beruht bei der Kapillarelektrophorese die Trennung auf den unterschiedlichen
elektrischen
Eigenschaften
Analyte
undLehrmittel,
nicht Heinz
aufHug,
deren
Verteilung
Bildquelle: Instrumentelle
Analytik, Theorieder
und Praxis,
Verlag Europa
2. überarbeitete
Auflage zwischen einer stationären und einer mobilen
Phase!
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Automatisierung der DNA-Sequenzierung mit
Kapillargelelektrophorese
Beachte:
Der Detektor
ist an der
Anodenseite
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Theorie der Elektrophorese: Endoosmose
Elektroendosmose: Bei der Gelelektrophorese auftretende Strömung in
Richtung Kathode, die der Wanderunsgrichtung der Probeionen
entgegengesetzt ist.
Elektroendosmose führt zu Verzerrungen
der Banden
 Agarose mit niedrigen
Elektroendosmosewerten verwenden
(ladungsfrei)
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