Tierärztliche Hochschule Hannover Entwicklung eines multiplex real

Tierärztliche Hochschule Hannover
Entwicklung eines multiplex real-time PCR-Protokolls zum
Nachweis von Koi-Herpesvirus (KHV) und
Untersuchungen zur Pathogenese der Koi-HerpesvirusInfektion bei experimentell infizierten Spiegelkarpfen
(Cyprinus carpio)
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Meike Cornelia Martina Ulrike Riechardt
aus Hannover
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung:
Apl. Prof. Dr. rer. nat. Dieter Steinhagen, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover,
Zentrum für Infektionsmedizin, Abteilung Fischkrankheiten
Dr. med. vet. habil. Volker Kaden, Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für
Tiergesundheit, Institut für Infektionsmedizin
Dr. med. vet. Sven Michael Bergmann, Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut
für Tiergesundheit, Institut für Infektionsmedizin
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. rer. nat. Dieter Steinhagen
2. Gutachter: PD Dr. rer. nat. Martin Runge
Tag der mündlichen Prüfung: 13.10.2011
Diese Arbeit wurde mit den Mitteln des Strukturfonds FIAF gemäß Verordnung (EG)
2792/1999 und mit Hilfe des Sächsischen Staatsministeriums für Umwelt und Landwirtschaft
gefördert.
Es ist was es ist sagt die Liebe.
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG...................................................................................................................... 9
2 LITERATURÜBERSICHT.............................................................................................. 12
2.1
Die Koi-Herpesvirus-Infektion ............................................................................................................. 12
2.1.1 Der Erreger ............................................................................................................................................... 12
2.1.1.1
Taxonomie, Morphologie .......................................................................................................... 12
2.1.1.2
Physikalische Eigenschaften...................................................................................................... 13
2.1.1.3
Genomorganisation und Proteine .............................................................................................. 14
2.1.2 Die Erkrankung......................................................................................................................................... 16
2.1.2.1
Wirtsspektrum............................................................................................................................ 16
2.1.2.2
Klinik und Pathologie ................................................................................................................ 18
2.1.2.3
Pathogenese ............................................................................................................................... 21
2.1.2.4
Vorkommen und Epidemiologie................................................................................................ 28
2.1.2.5
Bekämpfung und Impfung ......................................................................................................... 29
2.1.2.6
Die Diagnose der Koi-Herpesvirus-Infektion............................................................................ 34
2.1.2.6.1 Allgemeines und Differentialdiagnose ................................................................................. 34
2.1.2.6.2 Indirekter Erregernachweis ................................................................................................... 35
2.1.2.6.3 Direkter Erregernachweis ..................................................................................................... 35
2.2
Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion......................................................................... 38
2.2.1 Grundprinzip und Detektionssysteme....................................................................................................... 38
2.2.2 Anwendung............................................................................................................................................... 42
2.2.3 Auswertung der Daten .............................................................................................................................. 43
2.2.4 Quantifizierung ......................................................................................................................................... 45
2.2.5 Multiplex real-time PCR........................................................................................................................... 47
2.2.6 Interne Kontrollen..................................................................................................................................... 49
3 MATERIAL UND METHODEN..................................................................................... 51
3.1
Virusisolate ............................................................................................................................................. 51
3.2
DNA-Extraktion ..................................................................................................................................... 51
3.2.1 Allgemeines .............................................................................................................................................. 51
3.2.2 DNA-Extraktion mit dem QIAamp® DNA Mini Kit................................................................................ 52
3.2.2.1
Protokoll für Gewebe................................................................................................................. 52
3.2.2.2
Protokoll für Kiemenabstriche und PBL ................................................................................... 52
3.2.2.3
Protokoll für Virusmaterial aus infizierter Zellkultur................................................................ 53
3.3
Konventionelle (single round) PCR und nested PCR .......................................................................... 54
3.4
Agarosegelelektrophorese...................................................................................................................... 56
3.5
Herstellung einer positiven Kontrolle .................................................................................................. 57
3.5.1 Allgemeines .............................................................................................................................................. 57
3.5.2 Amplifizierung mittels PCR und Aufreinigung........................................................................................ 57
3.5.3 Klonierung und Überprüfung der Sequenz............................................................................................... 59
3.5.3.1
Ligation...................................................................................................................................... 59
3.5.3.2
Herstellung von transformationskompetenten Bakterien .......................................................... 59
3.5.3.3
Transformation .......................................................................................................................... 60
3.5.3.4
DNA-Präparation (Mini) ........................................................................................................... 60
3.5.3.5
DNA-Kontrollspaltung .............................................................................................................. 61
3.5.3.6
Sequenzierung............................................................................................................................ 61
3.5.4 Retransformation ...................................................................................................................................... 62
3.5.5 DNA-Präparation (Maxi).......................................................................................................................... 62
3.6
Real-time PCR......................................................................................................................................... 63
3.6.1 Primer und Sonden ................................................................................................................................... 63
3.6.2 Reaktionsbedingungen, Durchführung und Auswertung ......................................................................... 63
3.7
Zellen und Zellkulturtechnik und Virusvermehrung......................................................................... 66
3.8
Virustitration .......................................................................................................................................... 67
3.9
Virusreisolierung.................................................................................................................................... 67
3.10
Indirekter Immunfluoreszenztest ......................................................................................................... 68
3.11
Elektronenmikroskopie ......................................................................................................................... 69
3.12
Untersuchungen zur Pathogenese der Koi-Herpesvirus-Infektion bei experimentell infizierten
Spiegelkarpfen ........................................................................................................................................ 70
3.12.1 Infektionsversuchsaufbau ................................................................................................................... 70
3.12.1.1
Versuchstiere ............................................................................................................................. 70
3.12.1.2
Hälterung der Infektions- und Kontrollgruppen ........................................................................ 70
3.12.1.3
Infektion..................................................................................................................................... 71
3.12.2 Beprobung, Narkose und Tötung ....................................................................................................... 72
3.12.3 Untersuchungsmaterial ....................................................................................................................... 73
3.12.3.1
Kiemen- und Nierengewebe ...................................................................................................... 73
3.12.3.2
Kiemenabstriche ........................................................................................................................ 74
3.12.3.3
PBL ............................................................................................................................................ 74
3.12.3.3.1 Zellzählung.......................................................................................................................... 75
4 ERGEBNISSE.................................................................................................................... 76
4.1
Entwicklung und Validierung eines multiplex real-time PCR Protokolls zum Nachweis von KoiHerpesvirus............................................................................................................................................. 76
4.1.1 Herstellung einer positiven Kontrolle und externer DNA-Standards....................................................... 76
4.1.2 Wahl der Primer und Sonden, Reaktionsbedingungen ............................................................................. 76
4.1.3 Sensitivität ................................................................................................................................................ 77
4.1.3.1
Analytische Sensitivität ............................................................................................................. 77
4.1.3.2
Sensitivität des single und multiplex real-time PCR assays ...................................................... 80
4.1.3.3
Sensitivität im Vergleich zur konventionellen PCR bzw. nested PCR ..................................... 82
4.1.4 Spezifität ................................................................................................................................................... 86
4.2
Untersuchungen zum direkten Nachweis von Koi-Herpesvirus in akut erkrankten sowie
rekonvaleszenten juvenilen und adulten experimentell infizierten Spiegelkarpfen ........................ 87
4.2.1 Klinik ........................................................................................................................................................ 87
4.2.1.1
Adulte Karpfen .......................................................................................................................... 87
4.2.1.2
Juvenile Karpfen ........................................................................................................................ 88
4.2.2 Nachweis von Virusgenom - Diagnostische Sensitivität der multiplex real-time PCR zum Nachweis von
KHV im Infektionsversuch zur Untersuchung der Pathogenese der Koi-Herpesvirus-Infektion ............ 89
4.2.2.1
Adulte Spiegelkarpfen ............................................................................................................... 89
4.2.2.2
Juvenile Spiegelkarpfen............................................................................................................. 90
4.2.3 Quantitativer Nachweis und Verteilung der Virusgenomlast................................................................... 91
4.2.3.1
Adulte infizierte Karpfen – alle Einzeltiere im Vergleich......................................................... 91
4.2.3.2
Adulte infizierte Karpfen - Genomlast der einzelnen Organe ................................................... 95
4.2.3.2.1 Niere...................................................................................................................................... 95
4.2.3.2.2 Kieme.................................................................................................................................... 96
4.2.3.2.3 Kiemenabstriche ................................................................................................................... 97
4.2.3.2.4 PBL ....................................................................................................................................... 98
4.2.3.3
Juvenile infizierte Karpfen ...................................................................................................... 100
4.2.3.4
Auswertung.............................................................................................................................. 102
4.2.4 Elektronenmikroskopischer Virusnachweis ........................................................................................... 103
4.2.5 Detektion von Antigen oder infektiösem Virus...................................................................................... 106
5 DISKUSSION .................................................................................................................. 107
5.1
Entwicklung eines quantitativen multiplex real-time PCR-Protokolls zum Nachweis von KoiHerpesvirus........................................................................................................................................... 107
5.2
Untersuchungen zur Pathogenese der Koi-Herpesvirusinfektion bei experimentell infizierten
Spiegelkarpfen ...................................................................................................................................... 112
5.2.1 Verteilung der Viruslast über die Zeit, Virusnachweis in PBL und Virusausscheidung........................ 113
5.2.2 Latenz und Persistenz ............................................................................................................................. 114
5.2.3 Organe mit hoher Viruslast zum Zeitpunkt des Todes ........................................................................... 115
5.2.4 Altersbedingte Resistenz ........................................................................................................................ 115
5.2.5 Einfluss der Infektionsdosis auf die Mortalität....................................................................................... 116
5.2.6 Infektionsdosis........................................................................................................................................ 117
5.2.7 Elektronenmikroskopie........................................................................................................................... 117
5.2.8 Virusreisolierung und Immunfluoreszenztest......................................................................................... 118
5.2.9 Diagnostische Sensitivität....................................................................................................................... 119
5.2.10 Quantitative Bestimmung der Virus-DNA....................................................................................... 119
5.2.11 Geeignetes Probenmaterial für die KHV-Diagnostik....................................................................... 120
6 ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................. 123
7 SUMMARY...................................................................................................................... 126
8 LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................... 129
9 ANHANG ......................................................................................................................... 150
9.1
Material ................................................................................................................................................. 150
9.1.1 Virusisolate ............................................................................................................................................. 150
9.1.2 Bakterienstämme .................................................................................................................................... 150
9.1.3 Primer, Sonden, Nukleinsäuren und Längenstandards ........................................................................... 151
9.1.4 Enzyme, Enzymkits und kommerziell erhältliche Systeme ................................................................... 153
9.1.5 Puffer, Lösungen, Nährmedien und Wasser ........................................................................................... 153
9.1.5.1
DNA-Extraktion, PCR, Agarosegelelektrophorese, Klonierung ............................................. 153
9.1.5.2
Zellkultur und Virusvermehrung ............................................................................................. 155
9.1.5.3
sonstige Lösungen ................................................................................................................... 156
9.1.6 Reagenzien, Chemikalien und Fertiglösungen ....................................................................................... 157
9.1.7 Verbrauchsmaterialien ............................................................................................................................ 158
9.1.8 Geräte und Gebrauchsgegenstände......................................................................................................... 158
9.2
Software ................................................................................................................................................ 160
9.3
Tabellenverzeichnis.............................................................................................................................. 160
9.4
Abbildungsverzeichnis......................................................................................................................... 161
9.5
Abkürzungsverzeichnis, Fachtermini ................................................................................................ 162
9
1
EINLEITUNG
Das Koi-Herpesvirus (KHV) verursacht Massensterben bei Koi und Nutzkarpfen (Cyprinus
carpio) (HEDRICK et al. 2000, PERELBERG et al. 2003). Ausbrüche der Erkrankung
werden seit den 1990er Jahren in Israel, Europa, Amerika und dem asiatischen Raum
gemeldet (WALSTER et al. 1999, HEDRICK et al. 2000, HEDRICK et al. 2005, OH et al.
2001, MIYAKAZI et al. 2000, HAENEN et al. 2004, SANO et al. 2004, POKOROVA et al.
2007). Die Erkrankung verursacht bei infizierten Karpfen neben einer Mortalität von bis zu
100 % (HEDRICK et al. 2000) klinische Symptome wie Hautblutungen (WALSTER et al.
1999), Flossensaumschädigung (HEDRICK et al. 2000, BRETZINGER et al. 1999),
vermehrte Schleimbildung (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et al. 2000, PERELBERG
et al. 2003), Enophthalmus (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et al. 2000, PERELBERG
et al. 2003), Nierenentzündungen (HEDRICK et al. 2000), Hautläsionen (BRETZINGER et
al. 1999, HEDRICK et al. 2000) und Kiemennekrosen (BRETZINGER et al. 1999,
HEDRICK et al. 2000, PERELBERG et al. 2003), aber auch eine Vielzahl von anderen
klinischen und histopathologischen Symptomen. Bisher konnte beobachtet werden, dass alle
Altersklassen von Karpfen klinisch an KHV erkranken und sterben können (HEDRICK et al.
2000). Nur Larven scheinen von der Infektion ausgeschlossen zu sein (ITO et al. 2007). In
Deutschland zählt KHV seit Dezember 2005 zu den anzeigepflichtigen Erkrankungen, eine
Impfung konnte aber bisher nicht zugelassen werden (ANONYMUS 2004 - 2008). Mit einer
295 kbp großen, doppelsträngigen Desoxyribonukleinsäure (DNA) besitzt KHV das Größte
aller bekannten Herpesvirusgenome (DAVISON et al. 2002, WALTZEK et al. 2005, AOKI et
al. 2007). Zunächst wurde das Virus zu den „nicht klassifizierten“ Herpesvirinae gezählt,
derzeit wird die Spezies KHV als nicht klassifizierte Art der neu entstandenen Familie der
Alloherpesviridae zugeordnet (MC GEOCH et al. 2006, DAVISON et al. 2009). Diese
Familie umfasst die Herpesviren der Fische und Amphibien in der Ordnung der Herpesvirales
(DAVISON et al. 2009).
Nachdem die Klinik von KHV und hier besonders eine hohe Mortalität erste Hinweise auf
die Seuche geben kann (WALSTER et al. 1999, BRETZINGER et al. 1999, HOFFMANN et
al. 2000), stehen mit der Elektronenmikroskopie (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et al.
2000) und der Virusisolierung (NEUKIRCH et al. 1999, HEDRICK et al. 2000, RONEN et
al. 2003) anhand empfänglicher Zelllinien Möglichkeiten zur Verfügung, den Erreger näher
10
zu bestimmen. Der spezifische Erregernachweis kann mittels In situ-Hybridisierung (ISH)
(LE DEUFF et al. 2001) und (indirektem) Immunfluoreszenztest (PIKARSKY et al. 2004,
HEDRICK et al. 2000, DISHON et al. 2005, HAENEN et al. 2004) in Organen bzw. einem
Virusisolat erfolgen. Außerdem stehen mittels konventioneller, nested und real-time PCR
sensitive, weniger aufwendige und schnellere diagnostische Werkzeuge in Form des direkten
Nachweises der spezifischen Nukleinsäure von KHV zur Verfügung (GILAD et al. 2002,
GILAD et al. 2004, GRAY et al. 2002, YUASA et al. 2005, PIKARSKY et al 2004,
BERCOVIER et al. 2005, BERGMANN et al. 2006, BERGMANN et al. 2010).
Die real-time PCR bietet im Gegensatz zur konventionellen und nested PCR die
Möglichkeit zur absoluten Quantifizierung der untersuchten DNA (HEID et al. 1996). Daher
eignet sie sich für die Bestimmung der Viruslast in Pathogenesestudien oder prognostische
Aussagen (RYAN et al. 2003, BRUNBORG et al. 2004, OLIVERA et al. 2004, TOWNER et
al. 2004, GILAD et al. 2004). GILAD et al. (2004) setzten die real-time PCR zum Nachweis
von KHV-DNA erstmals zu diesen Zwecken ein. Als schnelles diagnostisches Verfahren ist
die real-time PCR-Technik für Untersuchungen in Folge von Massenbeprobungen ein
wichtiges Instrument (DE WIT et al. 2000, DROSTEN et al. 2001).
In der vorliegenden Arbeit wird ein multiplex real-time PCR-Protokoll vorgestellt, mit dem
KHV-Genom mit den von GILAD et al. (2004) entworfenen Primern und Sonde sensitiv und
spezifisch detektiert werden kann. Gleichzeitig wird bei dieser multiplexen PCR eine interne
Kontrollnukleinsäure (interne Kontroll-DNA, engl. internal control, IC-2-DNA) nach
HOFFMANN et al. (2006) in der Probe gemessen, die den Erfolg und die Effizienz von
DNA-Extraktion und Polymerasekettenreaktion überprüft. Die interne Kontrollnukleinsäure
wird dabei in bekannter Konzentration während der Aufreinigung der DNA zugefügt. Der
zusätzliche Nachweis der IC-2-DNA soll die diagnostische Sicherheit erhöhen, da neben der
Detektion von KHV-Genom auch eine Überprüfung des Ablaufes der DNA-Extraktion
erfolgen kann. Die Bestimmung der Sensitivität der multiplex real-time PCR soll um einen
Vergleich mit verschiedenen konventionellen und einer nested PCR erweitert werden, um die
aktuell nicht einheitlichen PCR-Untersuchungsmethoden für KHV ins Verhältnis zu setzen.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines multiplex real-time PCRProtokolls zum quantitativen Nachweis von KHV-Genom in Fischproben. Dafür sollte
definiertes Probenmaterial in einem Infektionsversuch generiert und mit unterschiedlichen
11
Methoden untersucht werden. Mit der Infektion von Karpfen aus unterschiedlichen
Altersklassen und einer Versuchsdauer von 56 Tagen sollten sowohl akute als auch
chronische klinische Verläufe der Erkrankung erzeugt werden. Die klinischen Parameter der
Erkrankung, der Nachweis von Herpesviruspartikeln mittels Elektronenmikroskopie sowie die
Virusanzucht aus Organmaterial mit anschließendem Nachweis mittels Immunfluoreszenztest
sollten mit der quantitativen Bestimmung von KHV-DNA in Fischproben verglichen werden.
Die Quantifizierung der KHV-DNA in verschiedenen Proben stellt das Kernstück der
Untersuchung dar. Damit soll ein Beitrag zur Aufklärung der Pathogenese der KHV-Infektion
geleistet werden. Mit sowohl letal als auch nicht-letal entnommenem Material soll zudem die
Eignung der Proben für die diagnostische Untersuchung geprüft werden.
12
2
LITERATURÜBERSICHT
2.1
2.1.1
Die Koi-Herpesvirus-Infektion
Der Erreger
2.1.1.1 Taxonomie, Morphologie
Das Koi-Herpesvirus (KHV) wird taxonomisch aufgrund der Virusmorphologie der Ordnung
der Herpesvirales und dort der Familie der Alloherpesviridae zugeordnet (DAVISON et al.
2009, Abbildung 1). Es zeichnet sich wie alle Herpesviren (GINSBERG 1988 MINSON et al.
2000, DAVISON et al. 2005) durch ein lineares, doppelsträngiges DNA-Genom (DISHON et
al. 2005) im Kern aus, welches vom ikosaedrischen Kapsid umgeben wird (HUTORAN et al.
2005). Zusammen stellen beide das Nukleokapsid mit einem Durchmesser von etwa 100 - 110
nm (HUTORAN et al. 2005, HEDRICK et al. 2000) dar, dem vermutlich die
Tegumentschicht folgt. Die behüllten (HUTORAN et al. 2005) Virionen haben einen
Durchmesser von 180 - 230 nm (HEDRICK et al. 2000).
Abbildung 1 Ultrastruktur und schematische Darstellung des Koi-Herpesvirus
Phylogenetisch unterscheidet man 3 große Gruppen der Herpesviren, die auf genetischer
Ebene kaum miteinander verwandt sind: Die Herpesviren der Säugetiere, Vögel und
Reptilien, diejenigen der Fische und Amphibien und als Drittes die Herpesviren, die
Invertebraten infizieren. Aus diesem Grund wurde vorgeschlagen, die Herpesviren innerhalb
einer Ordnung der Herpesvirales in drei Familien zu unterteilen (MC GEOCH et al. 2006).
Demnach gehören zu der Familie der Herpesviridae nur noch die Herpesviren der Säuger,
13
Vögel und Reptilien, die weiterhin in die Subfamilien der Alpha-, Beta-, und
Gammaherpesvirinae unterteilt werden. In der Familie der Malacoherpesviridae sind die
Herpesviren der Invertebraten zu finden und die Herpesviren der Fische und Amphibien
werden in der Familie der Alloherpesviridae zusammengefasst (MC GEOCH et al. 2006,
DAVISON et al. 2009).
Sequenzanalysen von 4 kompletten Genen zeigten, dass das KHV nahe mit den cypriniden
Herpesviren 1 und 2 (WALTZEK et al. 2005); dem Erreger der Karpfenpocken (CyHV-1)
(SANO et al. 1985a, b) und dem haematopoetischen Goldfisch-Nekrose-Virus (CyHV-2)
(JUNG et al. 1995) sowie entfernt mit dem Herpesvirus der Ictaluridae (IcHV-1) (DAVISON
et al. 2002) und dem Ranid Herpesvirus 1 (RaHV-1) der echten Frösche verwandt ist
(WALTZEK et al. 2005).
Sequenzhomologien zu Herpesviren der Säuger beschränken sich auf Enzyme, die in der
DNA-Replikation eine Rolle spielen und in der DNA von allen Orgamnismen konserviert
sind. Daher wurde vorgeschlagen, KHV im Genus Alloherpesvirus unter der Spezies des
cypriniden Herpesvirus 3 (CyHV-3) einzuordnen (MC GEOCH et al. 2006).
Neben der systematischen Namensgebung des CyHV-3 (WALTZEK et al. 2005) ist in der
Literatur synonym "Koi-Herpesvirus" (KHV) nach dem Wirt der Erstisolierung (HEDRICK
et al. 2000) und der Pathologie der Erkrankung entsprechend „Carp (interstitial) Nephritis
and Gill necrosis Virus“ (CNGV) zu finden (NEUKIRCH et al. 2001, RONEN et al. 2003,
HUTORAN et al. 2005).
2.1.1.2 Physikalische Eigenschaften
Bei Temperaturen von 22 °C bleibt KHV in Teichwasser für mindestens 4 Stunden infektiös
(PERELBERG et al. 2003).
SHIMIZU et al. (2006) stellten fest, dass KHV im Vergleich zu anderen Fischherpesviren
und Rhabdoviren ein unstabiles Virus darstellt, da es in Fluss- oder Stauseewasser seine
Infektiosität innerhalb von wenigen Tagen verlor. Ihre Versuche legen nahe, dass in der
Umwelt ein bakterieller Abbau von KHV im Wasser stattfindet.
NEUKIRCH et al. (2003 a, b) stellten Daten vor, nach denen eine Inaktivierung von KHV
bei 60 °C und eine Zerstörung der Infektiosität nach 2 Tagen bei 35 °C, außerdem bei pHWerten unter 3 und über 11 erfolgt.
14
KHV wird von UV-Licht (4000 µWs/cm2) sowie bei Temperaturen über 50 °C für
mindestens
1
Minute
inaktiviert.
Bei
15
°C
können
zu
Inaktivierungs-
bzw.
Desinfektionszwecken eine Iodophorlösung (200 mg/l), Benzalkoniumchloridlösung (60mg/l)
oder Ethanollösung (30 %) jeweils mit 20minütiger Einwirkzeit sowie Natriumhypochlorid
(0,3mg/l) mit 30sekündiger Einwirkzeit verwendet werden. Die Daten wurden mittels
Zellkulturverfahren erhoben. Die Chloridkonzentration, die zu einer 100 %igen Inaktivierung
führte, wurde nach der Zugabe von Chlor gemessen. Dabei stellte sich heraus, dass die Gabe
von 200 mg/l Chlor durch das organische Material der Zellkultur zu 0,3mg/l abgebaut wird.
Für eine sichere Desinfektion in der Praxis empfehlen die Autoren eine 10-fach höhere
Konzentration anzusetzen, also eine Endkonzentration im zu desinfizierenden Gewässer von 3
mg/l Chlor. Mittels Fluss- und Teichwasser ermittelten sie, dass für eine Endkonzentration
von 3 mg/l Chlor eine Menge von 11,2 mg/l Hypochlorid eingesetzt werden muss (KASAI et
al. 2005).
2.1.1.3 Genomorganisation und Proteine
Bis 2006 wurden einzelne Genomabschnitte des KHV, die etwa 16 % des Genoms
ausmachen, sequenziert und in der Genbank veröffentlicht (ILOUZE et al. 2006 a). Anhand
der vorliegenden Daten wurden Sequenzen abgeleitet, die vermutlich virale Enzyme wie die
Thymidinkinase, Ribonukleotid-Reduktase, Tymidylat-Monophosphat-Kinase, Helikase und
DNA-Polymerase
sowie
verschiedene
Kapsid-
und
Membranproteine
kodieren
(BERCOVIER et al. 2005, WALTZEK et al. 2005, ILOUZE et al. 2006 b). 2007 wurden
dann von AOKI et al. erstmals vollständige Genomsequenzen von 3 Virusisolaten des KHV
publiziert. Es handelte sich hierbei um je ein Isolat aus Israel, Japan und den USA. Das
Genom aller 3 Isolate ist etwa 295 kbp groß und damit größer als alle bisher bekannten
Herpesvirusgenome (DAVISON et al. 2002, WALTZEK et al. 2005, AOKI et al. 2007). Nach
AOKI et al. (2007) birgt das KHV-Genom an jedem Terminus eine ca. 22 kbp-große direkte
Repetition und stellt daher ein Typ A Genom nach der Klassifizierung der herpesviralen
Genome (ROIZMANN et al. 1982, BORCHERS et al. 1994, VAN REGENMORTEL et al.
2000) dar. Sein G+C-Gehalt beträgt 59,2 %. Das Genom beinhaltet 156 Gene, von denen 8 in
den terminalen, direkten Repetitionen als Duplikat vorliegen. Das Genom kodiert demnach
insgesamt für 164 Gene (AOKI et al. 2007). 15 dieser Gene lassen klare Homologien zum
15
IcHV-1 Genom erkennen, was die von MC GEOCH et al. (2006) vorgeschlagene Einordnung
von KHV in die Familie der Fisch- und Amphibienherpesviren unterstützt. Es handelt sich um
konservierte Gene, die vorhergesagt für folgende Proteingruppen kodieren: Proteine mit
Beteiligung an der Morphogenese des Kapsides, Proteine des Nukleotid-Metabolismus, der
DNA-Replikation und der DNA-Verpackung, ein großes Glykoprotein der Membran und fünf
Proteine, denen bisher keine mögliche Funktion zugeordnet werden kann. Bei den restlichen
141 Genen handelt es sich um nicht konservierte Gene, deren vermutete Produkte
Homologien zu Proteinen bzw. Enzymen von anderen Viren wie Herpesviren der Säuger und
Pockenviren aufweisen (DAVISON 1992, DAVISON 2002, DAVISON u. DAVISON 1995,
AOKI et al 2007).
Vergleiche des Genoms von verschiedenen Isolaten von KHV aus unterschiedlichen
geographischen Regionen anhand von restriktionsenzymatischer Spaltung (GILAD et al.
2002, GRAY et al. 2002, AOKI et al. 2007) oder auf der Basis der Nukleotid-Sequenz
(ISHIOKA et al. 2005, AOKI et al. 2007) haben ergeben, dass alle bisher untersuchten und
miteinander verglichenen Isolate praktisch identisch sind. Untersuchungen der viralen
Polypeptide bestätigen diese Homogenität unterschiedlicher Isolate mit Ausnahme eines
israelische Isolates, dass 2 zusätzliche Polypeptide aufwies (GILAD et al. 2002, GILAD et al.
2003).
Somit wurden von AOKI et al. (2007) erstmals 3 verschiedene Isolate des KHV auf
genomischer
Ebene
vollständig
charakterisiert.
Einzelne
Genprodukte
sind
von
ROSENKRANZ et al. (2008) und COSTES et al. (2008) identifiziert und funktionell
charakterisiert worden.
In der Studie von ROSENKRANZ et al. (2008) konnte das Hüllprotein pORF81 (engl.
protein-encoding open reading frame; Protein-kodierender offener Leserahmen) von KHV
identifiziert werden. Das vorhergesagte Typ III Membranprotein vom Genlokus ORF81
(AOKI et al. 2007, DAVISON u. DAVISON 1995, KUCUKTAS et al. 1998) weist eine
Masse von 26 kDa auf und erscheint nicht-glykolysiert. Es konnte im Cytoplasma von
infizierten Zellen und in der viralen Hüllmembran gefunden werden. Mit einem Antiserum
gegen dieses Protein kann es im Kiemen-, Nieren- und Leber- bzw. Pankreasgewebe sowie in
der Haut von KHV-infizierten Karpfen nachgewiesen werden.
16
COSTES et al. (2008) gelangen Manipulationen des KHV-Genoms mit dem BAC-System
(engl.: bacterial artificial chromosome; bakterielles, artifizielles Chromosom). Es konnte
unter anderem eine infektiöse Virusmutante mit einer Unterbrechung im ORF55, dem
vorausgesagten Lokus der Tymidinkinase, generiert werden. Diese Mutante wies in vivo eine
partielle Attenuierung auf. Außerdem wurde dem in ORF55 manipulierten Virus nach dem
gleichen Prinzip ORF16 vollständig entfernt. Diese zusätzliche Deletion ergab jedoch keine
weitere signifikanten Änderungen der Virulenz in vivo.
2.1.2
Die Erkrankung
2.1.2.1 Wirtsspektrum
Die Erkrankung an KHV ist auf die Spezies Cyprinus carpio beschränkt (PERELBERG et al.
2003, WALSTER et al. 1999). Natürlich aufgetretene KHV-Infektionen konnten beim
Nutzkarpfen (Cyprinus carpio), dem Koi Karpfen (Cyprinus carpio) und dem ghost koi carp
(Cyprinus carpio) sowie Kreuzungen dieser Linien beobachtet werden (HAENEN et al.
2004). Es wurden unterschiedliche Resistenzen für den Ausbruch der KHV Erkrankung
zwischen Kreuzungen verschiedener Karpfenlinien festgestellt (SHAPIRA et al. 2005).
Bei KHV-Ausbrüchen in Polykulturen oder im Zuge von experimentellen Untersuchungen
konnten von den im Folgenden zitierten Autoren bei keiner der nachstehend aufgeführten
Fischspezies klinische Anzeichen für eine Erkrankung an KHV oder Mortalitäten festgestellt
werden. BRETZINGER et al. (1999), WALSTER et al. (1999), HEDRICK et al. (2000),
PERELBERG et al. (2003), BRÄUER u. HERMS (2004), TAKASHIMA et al. (2005) geben
dies für getüpfelte Gabelwelse (Ictalurus punctatus), Goldfische (Carrassius auratus),
Graskarpfen (Ctenopharyngodon idellus), Marmorkarpfen (Aristichthys nobilis), Schleie
(Tinca tinca), Silberbarsche (Bidyanus bidyanus), Silberkarpfen (Hypophthalmichthys
molitrix), Störe (Aciperser sp.) und Tilapien (Oreochromis niloticus) an.
In der Studie von PERELBERG et al. (2003) wurde experimentell bestätigt, dass bei
Kohabitation von Tilapien, Silberkarpfen, Silberbarschen, Goldfischen und Graskarpfen mit
infizierten oder erkrankten Koi Karpfen bzw. Nutzkarpfen keine Krankheitssymptomatik oder
Verluste bei den exponierten Fischen auftraten. Die exponierten Fische wurden danach mit
naiven Cyprinus carpio kohabitiert, auch hier traten keine Mortalitäten auf (PERELBERG et
al. 2003).
17
Von HEDRICK et al. (2006) wurde die Empfänglichkeit für CyHV-2 und CyHV-3 von
Nutzkarpfen, Goldfischen und Hybriden zwischen männlichen Goldfischen und weiblichen
Nutzkarpfen untersucht. Die Kreuzungen zeigten sich weniger empfänglich für eine Infektion
mit KHV, es wurde eine stark reduzierte Mortalität im Vergleich zu den untersuchten
Nutzkarpfen festgestellt. Anders als bei Nutzkarpfen und Hybriden konnten bei Goldfischen,
die mit KHV infiziert wurden, keine Anzeichen für eine Erkrankung an KHV und auch keine
Mortalität festgestellt werden.
Im Gegensatz zu den oben genannten Studien wurde von BERGMANN (in HAENEN u.
HEDRICK 2006) der Nachweis von KHV-DNA mittels PCR in Material von klinisch
unauffälligen Karauschen berichtet. Bei durch Kohabitation mit KHV infizierten Goldfischen
wurden KHV-DNA, mRNA und spezifische Proteine nachgewiesen, außerdem konnte das
Virus isoliert werden (in HAENEN u. HEDRICK 2006). Eine Übertragung von KHV auf
Goldfische, Orfen (Leuciscus idus) und Schleien konnte aber im Gegensatz dazu von DIXON
nicht bestätigt werden (in HAENEN u. HEDRICK 2006).
In einer Studie Von EL-MATBOULI et al. (2007) wurde KHV-DNA in Organen von
Goldfischen detektiert. Die Goldfische waren mit KHV-infizierten Koi Karpfen kohabitiert.
Alle Koi Karpfen starben während der Kohabitation und KHV konnte nachgewiesen werden.
Die Goldfische wurden 2 Wochen nach den Todesfällen mittels loop-mediated isothermal
amplification (LAMP) und PCR untersucht und waren zu diesem Zeitpunkt klinisch
unauffällig. 6 von 15 Sammelproben waren positiv. Die Autoren schlagen unterstützt durch
die Resultate von BERGMANN (in HAENEN u. HEDRICK 2006) vor, ihre Ergebnisse als
weiteren Beleg zu verwenden, dass Goldfische als potentielle Vektoren für die Verbreitung
von KHV dienen könnten.
Im Zusammenhang mit 2 unterschiedlichen KHV-Ausbrüchen bei Koi wurde von
SADLER et al. (2008) KHV-DNA in Goldfischen nachgewiesen. Die Goldfische standen
indirekt über gemeinsames und nicht zwischendesinfiziertes Aquariumzubehör als auch direkt
in Polykultur in Verbindung mit Koi Karpfen, bei denen ein KHV-Ausbruch festgestellt
wurde. Sowohl in klinisch auffälligen Goldfischen, bei denen verschiedene bakterielle
Infektionen nachgewiesen wurden, als auch in klinisch unauffälligen Goldfischen wurde
mittels quantitativer PCR KHV-DNA und Wirts-DNA nachgewiesen. Bei einem der beiden
zugrundeliegenden Ausbrüche erfolgte der Nachweis der KHV-DNA in Material von
18
Goldfischen, die 2 Monate nach dem Ausbruch bei den Koi Karpfen gestestet wurden. Dieser
Genomnachweis bestärkt die Autoren in der Vermutung, dass KHV in Goldfischen über einen
langen Zeitraum persistieren könnte. Die Autoren geben zu bedenken, dass der genomische
Nachweis nicht dem Nachweis von vermehrungsfähigem Virus entspricht und ihre
Untersuchungen nicht belegen können, dass infektiöses Virus von Carrier-Goldfischen
ausgeschieden wurde. Da aber KHV-Genom auch noch lange nach der Exposition in den
Goldfischen gefunden werden konnte, weisen die Autoren auf die Möglichkeit hin, dass
Goldfische einen potentiellen Vektor für KHV darstellen könnten.
2.1.2.2 Klinik und Pathologie
Bei einem Ausbruch der KHV Erkrankung sind erhöhte Mortalitätsraten von 50 bis zu 100 %
bei einem akuten bis peraktuen Verlauf besonders auffällig (WALSTER et al. 1999,
BRETZINGER et al. 1999, HOFFMANN et al. 2000). Insgesamt wurden aber keine
pathognomonischen Anzeichen für eine KHV-Erkrankung beschrieben.
Alle Altersstufen von Koi und Nutzkarpfen (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et al.
2000) lassen eine Vielzahl von Symptomen beobachten, die von Lethargie (BRETZINGER et
al. 1999, HEDRICK et al. 2000) und Absonderung vom Schwarm, abnormes Verhalten bis
hin zu Desorientiertheit (HEDRICK et al. 2000, WALSTER et al. 1999), plötzlicher
Hyperaktivität (HEDRICK et al. 2000) und Aufhalten an der Wasseroberfläche mit
Schnappen nach Luft (PERELBERG et al. 2003) reichen. Ein typischer Verlauf der
Erkrankung im Karpfen ist gekennzeichnet durch plötzlich auftretendes lethargisches
Verhalten, bis das Tier einige Stunden nach Beginn der Klinik stirbt (BRETZINGER et al.
1999). Anorexie und pumpende Atmung kamen vor (BRETZINGER et al. 1999). Nach
lethargischem und hyperaktiven Verhalten konnte kurz vor dem Tod der komplette Verlust
des Gleichgewichtssinnes beobachtet werden (HEDRICK et al. 2000).
Bei makroskopischer, näherer Betrachtung können klinisch erkrankte Karpfen blasse,
entfärbte Haut (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et al. 2000), blasse Hautflecken
(PERELBERG et al. 2003), den Verlust der Schleimhaut (BRETZINGER et al. 1999), eine
raue
Hautoberfläche
(BRETZINGER
et
al.
1999),
Rötungen
der
Läsionsränder
(BRETZINGER et al. 1999) sowie Über- oder Unterproduktion von Kiemen- (BRETZINGER
et al. 1999) und Hautschleim (HEDRICK et al. 2000, PERELBERG et al. 2003) aufweisen.
19
Außerdem wurden eingesunkene Augen (Enophthalmus, BRETZINGER et al. 1999,
HEDRICK et al. 2000, PERELBERG et al. 2003), Blutungen am Flossenansatz (HEDRICK
et al. 2000) sowie Erosionen (BRETZINGER et al. 1999) an den Flossen beschrieben. In der
Haut
wurden
großflächige
(Hämorrhagien),
kleinflächige
(Ecchymosen)
und
stecknadelkopfgroße (Petechien) Blutungen beobachtet (WALSTER et al. 1999).
Ein häufiger zu beobachtender pathologischer Befund ist eine Veränderung der Kiemen.
Blasse, nekrotische Flecken (HEDRICK et al. 2000), großflächige Verfärbungen (HEDRICK
et al. 2000), Nekrosen und Entzündungen (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et al. 2000,
PERELBERG et al. 2003) werden makroskopisch im Kiemengewebe beschrieben. Die
Nekrosen reichen von einzelnen nekrotischen Bezirken (HEDRICK et al. 2000) bis hin zum
Verlust von Sekundärlamellen (BRETZINGER et al. 1999). Veränderungen innerer Organe
sind sehr variabel (HEDRICK et al. 2000), sie können auch vollständig fehlen oder nur
vereinzelt ausgeprägt sein (HEDRICK et al. 2000). Es werden Verklebungen im Bauchraum
(HEDRICK et al. 2000) mit oder ohne veränderter Farbe innerer Organe (BRETZINGER et
al. 1999), Leber- (PERELBERG et al. 2003) und Nierenvergrößerungen (BRETZINGER et
al. 1999) mit petechialen oder fokalen Blutungen als weitere pathologische Befunde
aufgeführt.
Oftmals konnte bei erkrankten Karpfen ein zusätzlicher Befall von Ekto- oder
Endoparasiten sowie Bakterien beobachtet werden (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et
al. 2000). Die mit KHV infizierten, erkrankten Karpfen scheinen demnach empfänglicher für
eine bakterielle oder parasitäre Sekundärinfektion zu sein (PERELBERG et al. 2003).
Histopathologische Untersuchungen ergeben ein variables Bild, wobei eine Entzündung
und Nekrosen (HEDRICK et al. 2000) von Kiemengewebe regelmäßige Befunde darstellten
(BRETZINGER et al. 1999). Auch in der Niere können regelmäßig und besonders ausgeprägt
pathologische Veränderungen festgestellt werden. In den Kiemen können Hyperplasien
(HEDRICK et al. 2000, PERELBERG et al. 2003) oder Hypertrophien (HEDRICK et al.
2000) des branchialen Epithels, Erosionen und Fusionen von Sekundär- und Primärlamellen
(HEDRICK et al. 2000) sowie Verklebungen der Kiemenfilamente (PERELBERG et al.
2003) gefunden werden, in denen sich Bakterien ansiedeln (HEDRICK et al. 2000). Neben
dem Anschwellen der Spitzen von Sekundär- und Primärlamellen konnten in den Spitzen
ebenfalls Nekrosen und eine bakterielle Besiedlung festgestellt werden (BRETZINGER et al.
20
1999). Die Kiemenbogenepithelzellen können Kernschwellungen und eine Verdrängung des
Chromatins an den Rand (HEDRICK et al. 2000) aufweisen, außerdem wurden vereinzelt
eosinophile bzw. diffuse, blasse intranukleäre Einschlüsse beschrieben (BRETZINGER et al.
1999 bzw. HEDRICK et al. 2000). Die oben genannten zellulären Veränderungen finden auch
in infiltrierten Lymphozyten statt (HEDRICK et al. 2000). Die Einwanderung von
Lymphozyten in die Primärlamellen (BRETZINGER et al. 1999) kann als weiteres Anzeichen
einer Entzündung gefunden werden. Eosinophile Granulozyten finden sich im Epithel der
Primärlamellen aber auch im respiratorischen Epithel der Sekundärlamellen. Die Epidermis
der Haut ist von der Basalmembran abgelöst, funktionale Zellen erscheinen balloniert
(BRETZINGER et al. 1999).
Entzündungen, Nekrosen und Kerneinschlüsse konnten besonders in der Niere
(interstitielle Nephritis, HEDRICK et al. 2000, PERELBERG et al. 2003), aber auch
zusätzlich oder einzeln in Milz (Splenitis, HEDRICK et al. 2000), Haut (HEDRICK et al.
2000), Pankreas (BRETZINGER et al. 1999), Leber (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK
et al. 2000, PERELBERG et al. 2003), Gehirn (WALSTER et al. 1999), Darm
(BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et al. 2000) und der Maulschleimhaut (HEDRICK et
al. 2000) gefunden werden.
Elektronenmikroskopische
Ultradünnschnitt
Untersuchungen
Virus-ähnliche
Partikel
von
Kiemengewebe
intranukleär
und
im
zeigten
im
Cytoplasma
von
respiratorischen, epithelialen Zellen. Die Partikel im Cytoplasma befanden sich meistens in
Membran-gebundenen Vakuolen. Die Nukleokapside waren sowohl voll als auch leer
(BRETZINGER et al. 1999).
Gewebe von infizierten Koi Karpfen wiesen hexagonale Nukleokapside mit einem
Durchmesser von 110 nm auf, die weit im Zellkern verteilt oder in Aggregaten in
Zellkernnähe vorlagen (HEDRICK et al. 2000). Virionen wurden in den untersuchten
Kiemen- und Nierenzellen gefunden, kamen aber auch in Lymphozyten-ähnlichen Zellen in
den Blutkapillaren dieser Gewebe vor (HEDRICK et al. 2000).
Die elektronenmikroskopische Morphologie der Partikel und deren Lokalisation weisen
auf ein Herpesvirus hin (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et al. 2000).
21
2.1.2.3 Pathogenese
Die Morbidität der KHV-Infektion wird mit bis zu 80 - 100 % in betroffenen Populationen
angegeben, wobei die Mortalität 50 - 100 % betragen kann (BETZINGER et al. 1999,
WALSTER et al. 1999, HEDRICK et al. 2000, TU et al. 2004).
1998 und 1999 wurden von verschiedenen israelischen Farmen Verluste unter Nutz- und
Koi Karpfen berichtet. Die Mortalität betrug hier 50 % innerhalb von 10 Tagen (HEDRICK et
al. 2000). Während einer 21 Tage andauernden Periode betrug die Mortalität bei einem
Einzelhändler in den USA bis zu 90 % (HEDRICK et al. 2000). WALSTER et al. (1999)
beobachteten, dass Mortalitäten 48 Stunden nach auftretenden Kiemenläsion zu verzeichnen
waren. In Studien zur Pathogenese der KHV-Infektion wurde von PIKARSKY et al. (2004)
eine Mortalität von 85 – 100 % innerhalb von 7 - 21 Tagen ermittelt. Dabei wurden Koi und
Nutzkarpfen sowohl durch intraperitoneale Injektion als auch im Bad infiziert.
Es wurde eine Reihe unterschiedlicher Inkubationszeiten dokumentiert. Das Auftreten der
Erkrankung konnte meist kurz nach erfolgtem Besatz mit neuen Fischen in einen alten
Bestand beobachtet werden, wobei die Infektion vermutlich von mindestens einem Fisch nach
einer bestimmten Inkubationszeit ausgeht (WALSTER et al. 1999). Nachdem naive Fische in
einen infizierten Bestand eingesetzt wurden, konnten WALSTER et al. (1999) auch schon
nach 3 Tagen eine Manifestation der Erkrankung feststellen. Die typische Inkubationszeit
gaben sie aber mit 14 - 21 Tagen an. 10 - 14 Tage nach dem Besuch einer Koiausstellung
erkrankten diverse Koi Karpfen bei einem Einzelhändler und bei privaten Züchtern
(HEDRICK et al. 2000). In anderen Fällen konnten 8 - 21 Tage nach Zusetzen von Fischen
ohne eingehaltene Quarantänezeiten klinische Symptome im Bestand beobachtet werden
(BRETZINGER et al. 1999). Aber auch Monate nach zusätzlichem Besatz neuer Fische
erkrankte eine Teichpopulation, nachdem das Wasser von 8 - 12 °C auf 21 °C aufgeheizt
wurde (BRETZINGER et al. 1999).
Der Ausbruch und der Grad der KHV-Erkrankung sind stark temperaturabhängig. Die
Wassertemperatur hat ebenso einen signifikanten Einfluss auf die Überlebenschancen im
Falle einer Infektion (GILAD et al. 2003). In der Teichwirtschaft und im Zierfischhandel sind
Ausbrüche im Temperaturbereich zwischen 15 und 28 °C berichtet worden (WALSTER et al.
1999), die meisten Ausbrüche fanden bei 20 - 23 °C statt. HEDRICK et al. (2000) geben 22 24 °C für die beobachteten Ausbrüche an. BRETZINGER et al. (1999) dokumentierten
22
Mortalitäten bis zu 78 % bei 16 - 17 °C und Mortalitäten bis zu 100 % bei
Wassertemperaturen über 20 °C. Auch bei WALSTER et al. (1999) wird angegeben, dass die
Erkrankungen bei niedrigen Temperaturen langsamer verläuft und dass sie bei sehr hohen
oder sehr niedrigen Temperaturen in eine Latenzphase überzugehen scheint. GILAD et al.
(2003) beobachteten bei Gruppen experimentell infizierter Koi Karpfen sowohl ein
Ausbleiben als auch eine einsetzende hohe Mortalität, wenn die Temperatur von 13 auf 23 °C
erhöht wurde.
Unter experimentellen Bedingungen konnte von GILAD et al. (2003) bei 28 °C die
schnellste Entwicklung von Mortalität beobachtete werden, dicht gefolgt von der Entwicklung
bei 23 °C. Bei 18 °C setzte das Sterben wesentlich später ein. Außerdem konnten bei 18, 23
und 28 °C ähnlich hohe Mortalitätsraten festgestellt werden. Bei 13 °C starben keine
infizierten Karpfen, es wurde aber virale DNA im Gewebe der Fische detektiert. Nach 30
Tagen wurde die Hälterungstemperatur bei einigen Gruppen von 13 °C auf 23 °C erhöht,
daraufhin entwickelte sich Mortalität. Wurde die gleiche Erhöhung der Temperatur nach 64
Tagen vorgenommen, ließ sich jedoch keine Mortalität erzeugen. Karpfen konnten bei 13 °C
erfolgreich mit KHV infiziert werden. Aber erst bei einer Temperaturerhöhung brach die
Erkrankung aus. Die Autoren schlossen daraus, dass die Temperatur ein entscheidender
Faktor für den generellen Ausbruch und das Ausmaß der KHV-Erkrankung ist. Außerdem
wurde vermutet, dass infizierte Fische bei niedrigen Temperaturen überleben und als
Reservoir dienen könnten.
ADKINSON et al. (2005) diskutieren, dass KHV bei niedrigen Temperaturen von 13 °C
im Fisch persistiert und dass sich die Krankheit bei höheren Temperaturen mit dem Wechsel
der Jahreszeit manifestiert. Dafür scheint eher eine temperaturbedingt geringere
Virusreplikation im Fisch verantwortlich zu sein als eine gesteigerte Immunantwort, da diese
bei niedrigen Temperaturen nicht zu erwarten sei.
ST-HILAIRE et al. (2005) stellten in experimentellen Studien den Zusammenhang
zwischen Temperatur und initialer Mortalität dar. Außerdem zeigten die Experimente die
Möglichkeit der latenten bzw. persistenten Infektion, die reaktiviert werden kann. Dafür
wurden Nutzkarpfen verschiedenen Alters initial mit der gleichen Infektionsdosis von ca. 104
plaque-forming units (dt. Plaque bildende Einheiten, pfu) ml-1 für 2 h bei 21 °C infiziert.
Danach
erfolgte
die
Hälterung
bei
2
verschiedenen
Temperaturprofilen.
23
Hälterungstemperaturen nach der Infektion von 13 °C erzeugten eine niedrige Mortalität,
während Hälterungstemperaturen von 21 °C nach der Infektion eine hohe Mortalität
verursachten. Nach der ersten aufgetretenen Mortalität wurden überlebende Fische bei 13 °C
gehältert. Einige dieser Gruppen wurden Wochen nach Abklingen der initialen Mortalität
zusätzlich mit naiven Karpfen zusammen gehältert. Nach Monaten wurde versucht, das Virus
durch eine deutliche Temperaturerhöhung zu reaktivieren. In 3 von 5 Gruppen war die
Reaktivierung erfolgreich, überlebende Karpfen erkrankten erneut und starben. In einer von 3
Kohabitationsgruppen starben 100 % der naiven Karpfen. Demnach konnte das Virus nach
Monaten aus den initial überlebenden Karpfen reaktiviert werden. Die Reaktivierung erfolgte
sowohl mit als auch ohne Kohabitation naiver Fische. Sowohl die initiale Mortalität als auch
eine Reaktivierung erscheint temperaturabhängig.
Klinisch gesunde, aber persistent oder latent infizierte Tiere scheinen Überträger und
Carrier zu sein und könnten auch unter natürlichen Bedingungen als Reservoir für das Virus
dienen. Schon von BRETZINGER et al. (1999) und WALSTER et al. (1999) wurde
beschrieben, dass Ausbrüche auch noch Monate oder sogar Jahre nach Einsetzen neuer Fische
in einen Altbestand auftraten. Im Allgemeinen konnte aber nach 3 bis 21 Tagen ein Ausbruch
im Altbestand von mit KHV infizierten Koi beobachtet werden, nachdem klinisch gesunde
Neuzugänge eingesetzt wurden.
Neben Wassertemperatur und Immunstatus können auch Virulenz und Infektionsdosis des
Virus, Alter der betroffenen Fische, Bestandsdichte (WALSTER et al. 1999) und andere
Faktoren beim Ausbruch der KHV-Erkrankung eine Rolle spielen.
GILAD et al. (2003) untersuchten den Einfluss der Infektionsdosis auf den Ausbruch der
KHV-Erkrankung. Das Infektionsvirus, ein Isolat aus Israel (HEDRICK et al. 2000), wurde
nach 4 Passagen in der KF-1-Zelllinie für diesen Versuch verwendet. Bei der eingestellten
Infektionsdosis im Bad von 1,2 und 12 KID50/ml wurden sehr ähnliche Mortalitätsraten bei
Koi Karpfen festgestellt. Die Infektion erfolgte über 1 Stunde mit den oben genannten
Infektionsdosen bei angehaltener Wasserzirkulation und unter Sauerstoffzufuhr. Es konnte
keine signifikante Bedeutung der Infektionsdosis für die Wahrscheinlichkeit des Überlebens
von KHV-infizierten Koi Karpfen festgestellt werden. Es wurde aber dokumentiert, dass der
mittlere Todeszeitpunkt bei allen untersuchten Temperaturen in den Gruppen der höher
24
infizierten Koi Karpfen früher eintrat als bei den niedriger infizierten Koi Karpfen. Initial
höher infizierte Koi Karpfen starben schneller.
Die Beobachtung, dass alle Altersgruppen von Cyprinus carpio für die Erkrankung
empfänglich zu sein scheinen (BRETZINGER et al. 1999, SANO et al. 2004, TERHUNE et
al. 2004) wurde unter experimentellen Bedingungen weiterführend untersucht.
In der Studie von ITO et al. (2007) wurden Nutzkarpfen im Larvenstadium sowie im
juvenilen Stadium der Entwicklung untersucht. Im Alter von 3 bzw. 4 Tagen nach dem
Schlupf (7,5 bzw. 8,7 mm) wurden Larven mit KHV infiziert. Während eines
Beobachtungszeitraums von 21 Tagen starb keiner der infizierten Karpfen. Geschwistertiere
dieser Karpfen wiesen bei einer Infektion mit KHV im juvenilen Stadium (13 bzw. 18 Tagen
nach dem Schlupf, 13,8 bzw. 29,2 mm) hohe Mortalitäten (69 - 100 %) auf. In derselben
Studie wurden Larven 1 Tag nach dem Schlupf (6,9 mm) mit KHV infiziert, auch hier starb
keine der Larven. Nach Reinfektion der Individuen im Alter von 2 Monaten, nun als juvenile
Karpfen (48,5 mm), erreichte die Mortalität der mit KHV infizierten Fische 100 %. Die
Autoren folgerten, dass Karpfen im larvalen Stadium nicht empfänglich sind für KHV und
dass sich erst mit dem Wachstum die Empfänglichkeit ausbildet.
Hinweise auf die Ausbildung einer altersbedingten Resistenz von adulten Karpfen im
Vergleich zu juvenilen Karpfen wurden schon 2003 von PERELBERG et al. gefunden. Sie
untersuchten juvenile und adulte Nutzkarpfen. Während infizierte Karpfen im juvenilen
Stadium (2,5 und 6 g) zu 92,5 % verstarben, konnte bei infizierten adulten Karpfen (230 g)
nur eine Mortalität von 56 % festgestellt werden. Auf der Basis der Mortalitätsrate konnte
hier beobachtet werden, dass juvenile Nutzkarpfen empfänglicher für KHV sind als adulte
Karpfen (PERELBERG et al. 2003).
Infizierte Karpfen produzieren Antikörper gegen das Virus. Hohe Titer wurden schon 3
Wochen bis 51 Tage p.i. (RONEN et al. 2003) und auch 1 Jahr nach natürlicher Infektion
(ADKINSON et al. 2005) im Serum gefunden werden. Die passive Verabreichung von Serum
mit hohem Anti-KHV-Antikörpertiter i.p. bewirkte jedoch keinen adäquaten Schutz vor
Mortalität nach einer KHV-Infektion (ADKINSON et al. 2005). Daher schlossen die Autoren,
dass für eine mögliche Immunität gegen KHV sowohl die humorale als auch die zelluläre
Immunantwort im Fisch benötigt wird. Aber selbst ein optimal arbeitendes Immunsystem
erscheint unzureichend, da die Erkrankung über 18 °C besonders ausgeprägt ist, also in einem
25
Temperaturbereich, der eine optimale Immunantwort des Wirtes ermöglicht. Bei 29 °C oder
30 °C konnte im Gegensatz zu 28 °C oder etwas niedrigeren Temperaturen keine Mortalität
mehr festgestellt werden (GILAD et al. 2003, ST-HILAIRE et al. 2005, PERELBERG et al.
2005).
Bei Sekundär- oder begleitenden Infektionen mit Bakterien oder Parasiten (BRETZINGER
et al. 1999) kann nicht ausgeschlossen werde, dass die Mortalitätsrate oder die Ausprägung
der klinischen Anzeichen der Erkrankung beeinflusst wird.
PIKARSKY et al. (2004) stellten mittels semiquantitativer PCR fest, dass virale DNA im
Nierengewebe und im Blut in den ersten Tagen nach einer KHV-Infektion in geringen
Mengen detektiert werden kann und der Titer innerhalb der ersten Woche ansteigt. Karpfen,
die im Bad infiziert wurden, wiesen früher virale DNA auf (Tag 1 p.i.) als Karpfen, die über
Kohabitation (Tag 3 bzw. 5 p.i.) infiziert wurden. Außerdem wurde in der Niere zu gleichen
Probenzeitpunkten mehr und im Fall der Kohabitation auch früher virale DNA detektiert als
im Blut. In der selben Studie wurde mittels Immunhistochemie und PCR detektiert, dass in
der Niere kranker Fischen große Mengen an Virus und verglichen damit kleinere Mengen in
Leber und Gehirn gefunden werden können.
GILAD et al. (2004) bestimmten die Virusverteilung in den Organen von infizierten Koi zu
unterschiedlichen Zeitpunkten und Temperaturen mittels quantitativer real-time PCR. Sie
infizierten Koi Karpfen mit 12 KID50 /ml KHV-I (KHV-Isolat aus Israel, HEDRICK et al.
2000) für eine Stunde bei ausgeschalteter Wasserzirkulation und hälterten die Fische weiter
bei 13, 18, 23 und 28 °C. Die Koi waren zum Zeitpunkt der Infektion etwa 2 Jahre alt, im
Schnitt 274 g schwer und bis zu 23 cm lang. Die Probenentnahmen erfolgten zu
unterschiedlichen Zeitpunkten vom 1. bis zum 10. Tag p.i. und dann zum Ende des Versuchs
am 62. oder 64. Tag p.i.. Außerdem wurden zwischen dem 8. und 15. Tag gestorbene Koi
registriert. Im Einzelnen wurden die Proben nach 1, 2, 3, 6, 10 und 62 oder 64 Tagen p.i. oder
bei Todesfällen zusätzlich am 8., 9. und 15. Tag p.i. genommen und quantitativ mittels realtime TaqMan PCR ausgewertet. Nur bei 18, 23 und 28 °C kam es zu Todesfällen. Die
Konzentration der Genomäquivalente in Hautschleim, Kieme, Darm, Leber, Milz, Niere und
Gehirn wiesen bereits am 1. Tag p.i. bei Koi, die bei 18, 23 und 28 °C gehalten wurden, fast
ausnahmslos hohe Werte auf, die sich je Organ bis zum 10. bzw. 15 Tage p.i. noch steigerten.
Die höchsten Werte wurden in Kieme, Niere und Milz mit 108 - 109 Genomäquivalente pro
26
106 Wirtszellen gefunden. Nach 62 oder 64 Tagen p.i. konnte bei 18, 23 und 28 °C gehaltenen
Koi in den Organen oftmals gar kein Virus oder höchstens bis zu 1,99 x 102
Genomäquivalente pro 106 Wirtszellen in Kieme, Niere oder Gehirn gefunden werden.
Verglichen mit den höheren Temperaturen wurde bei 13 °C gehaltenen Koi zu jedem
vergleichbaren Zeitpunkt in jedem Organ die kleinste Menge Virus-DNA detektiert. Es
konnte in allen untersuchten Organen an Tag 1 gar kein Virus und an Tag 64 p.i. höchstens 5
Genomäquivalente pro 106 Wirtszellen gefunden werden. Einige Organe wurden allerdings
nicht überprüft. An Tag 10 p.i. schwankten die Werte zwischen 1 Genomäquivalent in der
Leber und 103 - 106 Genomäquivalenten pro 106 Wirtszellen in den übrigen Organen. Alle
Karpfen, die die Infektion 62 - 64 Tage überlebten, wirkten gesund. Frisch gestorbene Koi
Karpfen wiesen in Kieme, Leber, Darm, Milz und Niere 109 - 1011 KHV DNA Kopien auf,
was generell mehr war, als in den getöteten Fischen gefunden werden konnte. Für diese
Organe wird mehrfach dokumentiert (2.1.2.2), dass sie pathologische Veränderungen bei
Karpfen aufweisen, die unter natürlichen oder experimentellen Bedingungen an KHV sterben.
Nach Meinung der Autoren könnten an dieser Stelle die hohe Kopienzahl in den
beschriebenen Organen auf einen Verlust der Osmoregulation in Kieme, Darm und Niere
hinweisen, die zum Tod während einer akuten Infektion mit KHV führen. Die Autoren
GILAD et al. (2004) fanden weiterhin kein klares Bild von der Virusverteilung im Einzeltier
über die Zeit hinweg, so dass nicht von Primär- oder Sekundärorganen gesprochen werden
konnte. Sie fassten aber zusammen, dass die Virusmenge im Gewebe mit der Temperatur und
der Zeit nach der Infektion ansteigt. Schon nach einem Tag kommt es nach diesen
Untersuchungen zu einer erstaunlichen, systemischen Streuung des Virus im Fisch. Fische,
die die Infektion überstanden, wiesen ausnahmslos wenig oder gar keine KHV-DNA mehr im
Gewebe auf. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die Virusreplikation in diesen Fischen
verringert ist oder gar nicht mehr stattfindet. Die Autoren diskutieren, dass diese Fische
potentielle Carrier darstellen könnten, wobei sie betonen, dass der alleinige Nachweis von
DNA für diese Schlussfolgerung nicht ausreicht. Die Infektion naiver, zugesetzter Fische oder
die Reaktivierung durch Stressoren wäre nach der Meinung der Autoren der Beweis, um
belegen zu können, dass die Fische echte Carrier sind.
27
HEDRICK et al. (2000) wiesen in Kieme, Nieren-Milz-Homogenat, aber auch gelegentlich
in Gehirn und Darm infektiöses Virus nach. DISHON et al. (2005) konnten infektiöses Virus
ebenfalls in Darm und Kot nachweisen.
In den Kiemen, Nieren, Gehirn und Darm lassen sich neben infektiösem Material
quantitativ auch große Mengen an Virus-DNA (GILAD et al. 2004) nachweisen. Die großen
Mengen an Virus-DNA im Hautschleim (GILAD et al. 2004) könnten darauf hinweisen, dass
infektiöses Virus auch von der Haut über den Hautschleim in die Umwelt abgegeben werden
könnte.
Es ist noch unklar, auf welchem Weg sich Karpfen unter natürlichen Bedingungen
infizieren. Die Kiemen und der Darm werden als Eintrittspforte diskutiert (HEDRICK et al.
2000, PERELBERG et al. 2003, PIKARSKY et al. 2004, ILOUZE et al. 2006 a). Die
Untersuchungen von PIKARSKY et al. (2004) unterstützen die Theorie, dass primär die
Kiemen befallen werden und dass das Virus dort unter Schädigung des Gewebes repliziert.
Auf diesem Wege gelangt der von PIKARSKY et al. (2004) entwickelten Vorstellung nach
sowohl infektiöses Virus erneut in die Umwelt als auch über das Blut systemisch in alle
anderen Organe des Fisches. Die Autoren sehen die Möglichkeit, dass Kiemenverletzungen
die Erkrankungswahrscheinlichtkeit erhöht. Ferner finden PIKARSKY et al. (2004) in der
schnellen und effizienten Verbreitung der Erkrankung ein weiteres Argument für die
Replikation und Ausscheidung von KHV durch die Kiemen. Mit einem gentechnisch
veränderten, bioluminiszierenden KHV-Klon wurde von COSTES et al. (2009) dokumentiert,
dass die Haut als Haupteintrittspforte für KHV in den Wirtsorganismus eine wichtige Rolle
spielt.
Die Übertragung von KHV erscheint horizontal, wobei eine über das Ei erfolgende
vertikale Infektion bisher noch nicht ausgeschlossen werden konnte. Bei der horizontalen
Übertragung spielen die direkte Route von Fisch-zu-Fisch sowie die Übertragung über das
Wasser wohl die größte Rolle. Schon in einer der ersten experimentellen Untersuchung
wurden von BRETZINGER et al. (1999) 2 lebende, aber stark an KHV erkrankte Koi zu 6
naiven Koi und Nutzkarpfen gesetzt. Nach 7 - 10 Tagen erkrankten 5 der 6 naiven Fische und
starben oder wurden mit ausgeprägten Krankheitssymptomen euthanasiert.
Bei der horizontalen Übertragung durch Vektoren wurde von gemeinsam genutztem
Aquarium- und Teichzubehör sowie von der direkten, manuellen Übertragung durch den
28
Menschen (WALSTER et al. 1999) berichtet. Genauso wurde die Rolle von tierischen
Vektoren wie Parasiten (WALSTER et al. 1999) oder fischfressenden Prädatoren (BRÄUER
u. HERMS 2004) als Überträger der Fischseuche diskutiert, die das Virus bzw. infizierte
Beute rein mechanisch verschleppen könnten. An dieser Stelle könnten auch Angler eine
Rolle spielen, die ohne Zwischendesinfektion ihre Angelgerätschaften in verschiedenen
Teichen benutzen (WALSTER et al. 1999).
2.1.2.4 Vorkommen und Epidemiologie
Ausbrüche der KHV-Erkrankung wurden erstmals für die Jahre 1998 und 1999 in Israel, den
USA und Deutschland dokumentiert (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et al. 2000,
PERELBERG et al. 2003). WALSTER et al. (1999) datiert die Erkrankung, basierend auf der
Klinik in den USA für das Jahr 1999 und vermutete, dass sie dem Erscheinungsbild nach
schon mindestens seit 1996 im Vereinigten Königreich vorkommt. Das „spring mortality of
carp syndrome“ (dt. Syndrom der Frühlingsmortalität der Karpfen) wurde mit hohen
Mortalitäten unter Angelkarpfen im Vereinigten Königreich schon seit 20 Jahren beobachtet.
Das mysteriös auftretende Syndrom wurde mit unklarer Pathologie und abhängig von
steigenden
Wassertemperaturen
beobachtet
und
mit
abgewandelter
Klinik
und
Temperaturentwicklung aber ähnlich hohen Mortalitäten ebenso bei Koi Karpfen beobachtet
(WALSTER et al. 1999).
Nach den ersten Veröffentlichungen wurden in vielen Ländern in Europa, Asien und
Nordamerika Ausbrüche von KHV gemeldet. Als Fischimporte aus diesen Ländern oder als
Ausbrüche direkt im Land wurde die Erkrankung noch mindestens in Österreich, Belgien,
Dänemark, Frankreich, Italien, Luxemburg, Niederlande, Polen, Tschechien, Vereinigtes
Königreich (England und Wales), der Schweiz, China (Hong Kong), Indonesien, Japan,
Korea, Malaysia, Singapur, Südafrika, Taiwan und Thailand festgestellt (WALSTER et al.
1999, HEDRICK et al. 2000, HEDRICK et al. 2005, OH et al. 2001, MIYAKAZI et al. 2000,
HAENEN et al. 2004, SANO et al. 2004, POKOROVA et al. 2007).
Klinisch unauffällige, latent oder persistent infizierte Karpfen stellen eine der
Hauptursachen dar, die zur massiven Verbreitung des Virus beitragen. Es wurde vielfach
beschrieben, dass die Seuche nach Neuzugängen klinisch gesunder Fische nach Tagen aber
auch nach Monaten oder Jahren im Altbestand ausbrechen kann (BRETZINGER et al. 1999,
29
WALSTER et al. 1999). ST-HILAIRE et al. (2005) wiesen die Möglichkeit der Latenz von
KHV experimentell nach. Der Besatz von klinisch gesunden, infizierten Fischen, aber auch in
Polykultur gehaltene erkrankte Koi Karpfen sowie die Verschleppung von Teich zu Teich
durch Prädatoren wurden von BRÄUER u. HERMS (2004) als mögliche epidemiologische
Ursachen der Verbreitung der Infektion angeführt.
Weitere Ursachen für die schnelle Verbreitung des Virus stehen vermutlich mit dem
weltweiten Handel sowie Zierfischausstellungen in Verbindung, da hier vor dem Transport
oder der Ausstellung meistens keine Gesundheitsüberprüfung erfolgt oder gefordert wird
(GILAD et al. 2002). Außerdem erhöht die kommerziell betriebene, intensive Fischhaltung
(GILAD et al. 2003) den Infektionsdruck von Krankheiten innerhalb einer Population.
Exemplarisch beschreibt PERELBERG et al. (2003) für Israel, dass der Nutz- und
Zierkarpfenindustrie durch die KHV-Erkrankung ein großer wirtschaftlicher Schaden
entsteht. Zwischen 1999 und 2003 wurden die Verluste in Israel auf jährlich 3 Millionen US $
geschätzt.
BRÄUER u. HERMS (2004) berichten von 3 großen Betrieben in Deutschland (Sachsen),
die im Sommer 2003 von 7 KHV-Ausbrüchen betroffen waren. Es wurden Verluste von etwa
48 t Nutzkarpfen verzeichneten. Die Autoren schätzen den Schaden durch den bloßen Verlust
der Karpfen auf 130.000 €. Daneben werden die Kosten für Desinfektionsmaßnahmen,
vorübergehende Flächenstilllegungen und der Verlust von Besatzfischen für das Folgejahr mit
200.000 € bemessen.
2.1.2.5
Bekämpfung und Impfung
Wie auch für andere Herpesviren beschrieben, kann nicht ausgeschlossen werden, dass
Karpfen durch einmalige Infektion das Koi-Herpesvirus lebenslang tragen (ROLLE u. MAYR
1993). Außerdem kann es unter bestimmten Bedingungen in klinisch gesund erscheinenden,
infizierten Karpfen reaktiviert und ausgeschieden werden (ST-HILAIRE et al. 2005). Es
sollten daher größtmögliche Anstrengungen auf die Vermeidung des Kontakts der Bestände
mit infektiösem Virus verwendet werden. Das kommt in der seit Dezember 2005 bestehenden
Anzeigepflicht für die Koi-Herpesvirus-Infektion in Deutschland (ANONYMUS 2004 2008) zum Ausdruck.
30
Eine Maßnahme, die erfolgreich zur Vermeidung der Ausbreitung durchgeführt wurde, ist die
Einhaltung einer Quarantänezeit vor dem Besatz eines Altbestands (PERELBERG et al.
2003). Bei permissiven Temperaturen für KHV könnten in dieser Weise latent oder persistent
infizierten Karpfen erkannt werden, wie die Versuche von GILAD et al. (2003) und STHILAIRE et al. (2005) zeigten. Würden diese Karpfen unbekannten Status noch zusätzlich
mit empfänglichen, naiven Karpfen in Quarantäne gehältert, könnten außerdem Carriertiere
erkannt werden, die trotz Virusausscheidung selber nicht mehr oder noch nicht erkranken
(PERELBERG et al. 2003, ST-HILAIRE et al. 2005, HAENEN et al. 2004).
Ist die Seuche bereits ausgebrochen, so ist es möglich, eine Keulung zu veranlassen oder
aber der Bestand kontrolliert der Vermarktung zu zuführen (BRÄUER u. HERMS 2004).
Eine Senkung der Wassertemperatur kann das klinische Erkrankungsbild zum Erliegen
bringen (WALSTER et al. 1999). Mit der möglichen Latenz des Virus (WALSTER et al.
1999, GILAD et al. 2003, ST-HILAIRE et al. 2005) und einem ersten oder erneuten Ausbruch
bei Temperaturerhöhungen (WALSTER et al. 1999, GILAD et al. 2003) kann eine Erhöhung
der Temperatur als Maßnahme nur bedingt zur Bekämpfung sondern eher zur Ausbreitung der
Krankheit beitragen. Falls also eine Temperatursenkung im Betrieb möglich ist, könnte sie bei
behördlich angeordneter, kontrollierter Räumung und anschließender Verwertung des
Bestandes (BRÄUER u. HERMS 2004) zur Verlangsamung des Krankheitsgeschehens
genutzt werden (WALSTER et al. 1999), ohne dass latent oder persistent infizierte Tiere noch
lebend auf den Markt gelangen.
Außerdem haben Transportrestriktionen von Karpfen bisher dazu beigetragen, die
Ausbreitung des Virus aufzuhalten (PERELBERG et al. 2003).
Die Verbesserung der Haltungsbedingungen und in Folge dessen ein geringerer
Infektionsdruck und dadurch eine geringere Ausbreitung des Virus kann durch
kontinuierlichen Wasserwechsel, regelmäßiges Entfernen von Schlamm aus den Teichen und
andere hygienische Maßnahmen geleistet werden (WALSTER et al. 1999).
HEDRICK et al. (2006) untersuchten Kreuzungen aus Nutzkarpfen und Goldfischen, bei
deren Hybride keine Mortalität nach einer Infektion mit KHV festgestellt wurde. Da in 50 %
der Hybriden 25 Tage nach der Infektion mit KHV noch virale DNA detektiert wurde,
müssten nach Meinung der Autoren noch weitere Untersuchungen zur Virusreplikation und
zum potentiellen Carrierstatus durchgeführt werden. Solche Hybride könnten jedoch nach
31
HEDRICK et a. (2006) eine Möglichkeit darstellen, die durch die Krankheit verursachten
schweren Verluste zu vermeiden.
SHAPIRA et al. (2005) untersuchten die Empfänglichkeit für KHV von unterschiedlichen
Karpfenlinien von Cyprinus carpio und deren Kreuzungen. Die Kreuzung zwischen D
(domestizierte Nutzkarpfenlinie „Dor-70“) x S (Wildkarpfenlinie „Sassan“) erwiesen sich mit
60,7 % Überlebenden als am resistentesten. Die Kreuzungen N (domestizierter Nutzkarpfen
„Našice“) x S, D x D und D x N waren mit 33,7, 27,0 und 17,7 % Überlebenden weniger
resistent gegen die Infektion mit KHV und darauf folgender Ausprägung von Mortalität. Die
Kreuzungen N x N war am empfänglichsten, es gab nur 8,0 % überlebende Tiere.
HAENEN et al. (2004) empfehlen zum Umgang mit der Erkrankung den diagnostischen
Laboratorien in Europa, ihre technischen und diagnostischen Möglichkeiten zu verbessern,
um die Bestrebungen zu unterstützen, einen Betrieb so sicher wie möglich als frei von KHV
erklären zu können.
RONEN et al. (2003) versuchten „natürlich resistente“ Karpfen zu erzeugen. Zunächst
wurden Karpfen über Kohabitation bei permissiven Temperaturen (22 - 23 °C) infiziert.
Danach wurden sie 30 Tage bei der nicht-permissiven Temperatur von 30 °C gehältert. Die
Autoren stellten vor, dass auf diese Weise natürlich resistente Fische entstanden seien, da
nach einer erneuten Infektion und Hälterung bei permissiven Temperaturen nur noch eine
Mortalität von 39 % im Vergleich zu einer Mortalität von 82 % bei der unbehandelten,
einmalig infizierten Kontrollgruppe auftrat. Mit dieser Methode wurden große Populationen
dieser „natürlich resistent“ genannten Fische erzeugt. Den Verlust von 30 - 40 % der
behandelten Fische, die Kostenintensität der Methode sowie das ernst zu nehmende Risiko
der Reaktivierung des verwendeten, pathogenen Immunisierungsvirus im Fisch mit
einhergehender Ansteckung von naiven Fischbeständen werden von den Autoren als Nachteil
der Methode aufgeführt.
Diese Beobachtungen führten RONEN et al. (2003) zu Bestrebungen, einen durch
Zellpassagen attenuierten Virusstamm herzustellen. Dafür wurden naive Karpfen sowohl i.p.
als auch über das Bad mit Virus infiziert, das einer 3. und einer 20. Passage in der Zellkultur
entstammte. Die Mortalitätsraten, die durch die Infektion mit der 20. Passage erreicht wurden,
waren signifikant geringer. In einem weiteren Schritt entnahmen die Autoren einem Plaque
einer 26. Passage infektiöses Material, vermehrten das Virus in der Zellkultur und infizierten
32
erneut i.p.. Innerhalb von 25 Tagen starben wenige Fische, alle restlichen wurden mittels
Kohabitation erneut infiziert. Es konnten im Gegensatz zu der Kontrollgruppe keine
klinischen Anzeichen einer Erkrankung oder Mortalität festgestellt werden. Die Autoren
schlussfolgerten daraus, eine effiziente Vakzine hergestellt zu haben. Mittels AntikörperELISA wurde im Serum von 5 der infizierten Karpfen verfolgt, dass nach Tag 21 p.i. ein
hoher Titer von gegen KHV gerichteten Antikörpern vorlag und bis Tag 56 p.i. erhalten blieb.
Diese Fische überlebten die erneute Infektion. Daraus schlossen die Autoren eine Korrelation
zwischen dem Anstieg eines Antikörpertiter und der Überlebensrate von infizierten Fischen.
Sie postulierten, dass das hergestellte attenuierte Virus eine humorale Immunantwort und
einen Schutz gegen erneute Infektion bietet. Neben allen weiteren Vorteilen, die ein
attenuierter Lebendimpfstoff im Allgemeinen bietet, räumen die Autoren ein, dass der Vorteil
der möglichen Ausscheidung und damit lang anhaltende Existenz und Ausbreitung des Virus
in einer großen Population ebenfalls einen Nachteil darstellen könnte, falls das Virus auf diese
Weise rückmutiert und erneut Virulenz ausbildet. Erfahrungen, ob ausgeschiedenes
attenuierte Virus in nicht-immunisierten Fischen apathogen bleibt, konnten nicht dargestellt
werden. Statt eine Elimination des Virus anzustreben erhofften
die Autoren, mit dem
lebenden, attenuierten Virus zumindest den Schaden, den die KHV-Infektion in Israel und der
Welt anrichtet, reduzieren zu können.
PERELBERG et al. (2005) setzten die Versuche zur Entwicklung einer Vakzine durch ein
attenuiertes Virus von RONEN et al. (2003) fort. Sie beschrieben in ihren Arbeiten die ersten
Grundbedingungen, die für eine ausreichende Immunisierung der Fische erfüllt werden
müssten. Sie diskutierten, dass sich das attenuierte Virus im Wirt vermehren muss, um einen
ausreichenden Schutz zu erreichen. Der Erfolg der Immunisierung ist außerdem stark
temperaturabhängig. Nach 25 Tagen bei 27 °C und 23 °C wurden alle Gruppen bei 23 - 24 °C
zusammen mit erkrankten Karpfen gehältert. Die bei 23 °C immunisierten Karpfen zeigten
keine, die bei 27 °C immunisierten Karpfen eine 70 %ige Mortalität. Wurden Karpfen nach
der Immunisierung mit einem attenuierten Virus bei 27 statt bei 23 °C gehältert, so konnte
keine Immunität erreicht werden. Die Arbeitsgruppe weist daraufhin, dass attenuiertes KHV
nicht so stabil ist wie der Wildtyp. Der Klärungsbedarf zur Sicherheit, Anwendung, Stabilität
und Gefahr der virulenten Rückmutation einer attenuierten Virusvakzine, der aus der Studie
von RONEN et al. 2003 hervorging, konnte von PERELBERG et al. (2005) nur teilweise
33
behoben werden. Die Frage, ob Überlebende einer Infektion, „natürlich resistente“ Fische
nach RONEN et al. 2003 oder immunisierte Karpfen permanent infiziert sind, konnte nicht
beantwortet werden. Die Autoren stellen fest, dass die Gefahr der Rückmutation zu einem
virulenten Virus bei jeder Lebendvakzine gegeben sei, dieses Risiko müsse, auch bei
durchgeführten Verhinderungsmaßnahmen wie Bestrahlung der Vakzine, immer mit
eingeplant werden. Neben der Abhängigkeit von Dauer der Vakzineexposition und
Hälterungstemperatur während der Vakzination muss ebenfalls mit einer Rückmutation des
attenuierten Vakzinevirus zugunsten von Virulenz gerechnet werden.
PERELBERG et al. (2005) erwähnen, dass Versuche zur Immunisierung mit inaktiviertem
Virus bisher fehlschlugen. Diese Variante der Vakzination habe sich als ineffizient erwiesen.
YASUMOTO et al. (2006) forschten weiter im Bereich der Totimpfstoffe, indem sie eine
Liposomenvakzine herstellten, die formalininaktiviertes KHV enthielt. Sie vakzinierten
Nutzkarpfen mehrfach oral und konnten 22 Tage nach der letzten Vakzination einen
signifikant erhöhten Titer neutralisierender Antikörper im Serum der vakzinierten Fische
feststellen. Die Arbeitsgruppe gab an, dass die Kontrollkarpfen bereits einen niedrigen, aber
messbaren KHV-Antikörpertiter im Serum hatten, die sie als Kreuzreaktion von natürlich
vorkommenden Anti-CyHV-1-Antikörpern im Karpfen (ADKINSON et al. (2005) erklärten.
Zum Zeitpunkt der Antikörperuntersuchung wurden die Karpfen mit KHV infiziert. Die zuvor
vakzinierten Karpfen entwickelten eine kumulative Mortalität von 23,1 und 23,3 %, während
vergleichbar infizierte, nicht vakzinierte Kontrollgruppen kumulative Mortalitäten von 66,7
und 90 % entwickelten. KHV war in geringem Maße mittels konventioneller PCR (YUASA
et al. 2005) im immunisierten Fisch detektierbar. Die Autoren schlussfolgerten eine Effizienz
der inaktivierten Vakzine, die eine Immunantwort im Karpfen hervorruft. Die Autoren geben
zu bedenken, dass ihre effiziente, aber noch Mortalität induzierende Totvakzine gegenüber
einer attenuierten Lebendvakzine nach RONEN et al. (2003) den Vorteil der Sicherheit vor
dem Risiko der Rückmutation bietet.
Es gibt in Deutschland bisher keine zugelassene Vakzine gegen KHV.
Bei amtlicher Feststellung der KHV-Infektion in einem Fischhaltungsbetrieb in
Deutschland sind die seuchenkranken oder seuchenverdächtigen Fische zu töten und
unschädlich zu beseitigen. Es werden Sperr- und Beobachtungsgebiete festgelegt und
Maßnahmen zur Tilgung des Seuchenherdes erlassen (ANONYMUS (2010).
34
2.1.2.6 Die Diagnose der Koi-Herpesvirus-Infektion
2.1.2.6.1 Allgemeines und Differentialdiagnose
Das klinische Bild der KHV-Erkrankung liefert erste Hinweise zur Diagnose von KHV.
BRETZINGER et al. (1999) dokumentierten, dass sich die epidermalen Läsionen infolge
einer KHV-Infektion stark vom Erscheinungsbild der Erythrodermatitis oder Hautulzeration
bakteriellen Ursprungs im Fisch unterscheidet. Extreme pH-Werte und Ammoniumgehalte im
Wasser können zu sandpapierartigen Hautveränderungen mit einhergehendem Verlust von
Hautbezirken führen, wie sie bei der Infektion mit KHV beobachtet werden können
(BRETZINGER et al. 1999). Daher muss die Wasserqualität differentialdiagnostisch in
Betracht gezogen werden. Fische, die sehr stark von Ektoparasiten befallen sind, können
dieselben epidermalen Symptome aufweisen (BRETZINGER et. al 1999).
Da die KHV-Erkrankung im Fischbestand eine Vielzahl von Symptomen ausprägen kann
(2.1.2.2) und außerdem Sekundär- oder Begleitinfektionen möglich sind, ist die klinische
Diagnose von KHV nur nach Ausschluss parasitäter, bakterieller, mykologischer oder viraler
Primärinfektionen zu stellen (BRETZINGER et al. 1999, WALSTER et al. 1999,
PERELBERG et al. 2003). KHV verursacht andere klinische Symptome als das andere
cyprinide Herpesvirus der Koi und Nutzkarpfen: das CyHV-1. CyHV-1 verursacht
hauptsächlich Hauttumore und typische Karpfenpockenläsionen der Haut (SANO et al 1985a,
b). Bei Karpfen, die jünger als 2 Monate waren, wurden jedoch auch letale und systemische
Infektionen mit CyHV-1 dokumentiert (SANO et al. 1991, CALLE et. al. 1999). Mittels PCR,
die nur CyHV-1 (GILAD et al. 2002) bzw. nur KHV (z.B. GILAD et al. 2002, GILAD et al.
2004, BERCOVIER et al. 2005) detektiert, kann KHV von CyHV-1 zusätzlich abgegrenzt
werden. HEDRICK et al. (2000) gaben an, dass im Fluoreszenztest von virusinfizierter
Zellkultur mit polyklonalem Antiserum vom Kaninchen keine Kreuzreaktionen zwischen
KHV und CyHV-1 zu verzeichnen waren, während jedoch im Antikörper ELISA (2.1.2.6.2)
Kreuzreaktionen festgestellt wurden. Unter 2.1.2.6.2 und 2.1.2.6.3 werden die Möglichkeiten
der Laboratoriumsdiagnose aufgeführt, mit denen KHV nachgewiesen werden kann.
35
2.1.2.6.2 Indirekter Erregernachweis
Anti-KHV-Antikörper lassen sich mittels indirektem enzyme linked immunosorbent assay
(ELISA) im Serum von infizierten Karpfen nachweisen (RONEN et al. 2003, DISHON et al.
2005, ADKINSON et al. 2005). In experimentellen Studien zeigten RONEN et al. (2003),
dass bis Tag 51 p.i. nach einer Erstinfektion mit KHV hohe Antikörpertiter gegen KHV
vorlagen. Die Seren infizierter Karpfen, die 1 Jahr nach dem Ausbruch in virusfreier
Umgebung gehältert wurden, enthielten bis zu einer Verdünnung von 1:62500 Anti-KHVAntikörper (ADKINSON et al. 2005).
DISHON et al. (2005) konnten im verwendeten ELISA weder zwischen CyHV-1infizierten Zellen und Anti-CNGV-Serum noch zwischen CNGV-infizierten Zellen und AntiCyHV-1-Serum Kreuzreaktivität feststellen. Im reziproken Antikörper-ELISA sowie in
Westernblot-Analysen von ADKINSON et al (2005) zeigte Serum von mit CyHV-1- oder
KHV-infizierten Koi jedoch Kreuzreaktionen. Die Kreuzreaktionen im ELISA waren
verringert oder eliminiert bei 1:2500 oder höheren Verdünnungen.
2.1.2.6.3 Direkter Erregernachweis
Beim direkten Erregernachweis erfolgt der Nachweis des Virus oder dessen Nukleinsäure.
Für die Isolierung des Virus aus Gewebe können die Karpfenzelllinien KF-1 (engl. koi fin 1,
Karpfenflosse, HEDRICK et al. 2000, RONEN et al. 2003), CCG (engl. common carp gill,
NEUKIRCH et. al 1999), EPC (engl. epithelioma papulosum cyprini, NEUKIRCH et al.
1999) und CCB (engl. common carp brain, NEUKIRCH u. KUNZ 2001) verwendet werden.
Das Virus konnte unter experimentellen Bedingungen besonders gut aus Kieme, Niere und
Milz aber auch aus Leber, Darm und Gehirn reisoliert werden (HEDRICK et al. 2000). Erste
Hinweise auf KHV können mittels lichtmikroskopisch festgestellten Einschlusskörperchen im
Kern von Zellen in Kieme, Darm und Niere erfolgen (HAENEN et al.2004). Außerdem kann
das Virus mittels Elektronenmikroskopie (BRETZINGER et al. 1999, HEDRICK et al. 2000),
In situ-Hybridisierung (ISH) (LE DEUFF et al. 2001 (Poster), zitiert in HAENEN et al. 2004)
und Immunfluoreszenztest (HEDRICK et al. 2000, DISHON et al. 2005, HAENEN et al.
2004) nachgewiesen werden. KHV wurde mittels indirektem Immunfluoreszenztest
(PIKARSKY et al. 2004) in Leber, Niere und Gehirn kranker Fische angezeigt.
36
Vor den Analysen von AOKI et al. (2007) wurden einzelne Teile der Sequenz von KHV
publiziert, auf deren Basis viele konventionelle und nested PCR-Verfahren zum genomischen
Nachweis von KHV entwickelt wurden (GILAD et al. 2002, GRAY et al. 2002, YUASA et
al. 2005, PIKARSKY et al 2004, BERCOVIER et al. 2005, BERGMANN et al. 2006,
BERGMANN et al. 2010). Für die PCR von GILAD et al. (2002) wird angegeben, dass sie 1
pg KHV DNA in 100 ng Wirts-DNA nachweist. Die PCR von GRAY et al. (2002) (BAMHI6 und SphI-5), deren SphI-5-reverse-Primer von YUASA et al. (2005) verbessert wurde, wird
mit einer Sensitivität von detektierten 100 fg oder ca. 600 DNA Kopien genomischer DNA
angegeben. YUASA et al. (2005) stellten fest, dass das drittletzte Nukleotid vor dem 3´-Ende
des SphI-5-reverse-Primer von GRAY et al. (2002) nicht entsprechend komplementär zum
KHV-Genom angegeben war und dass bei entsprechender Korrektur keine Schmierbanden
mehr entstehen sowie die Reaktionszeit der PCR verkürzt werden kann. Für die im Bereich
des mutmaßlichen Tymidinkinasegens detektierende PCR von BERCOVIER et al. (2005)
wird ein Detektionsminimum von 10 fg KHV-DNA oder 30 Virion angegeben.
Bei einem Vergleich zwischen Virusisolierung mittels Zellkultur, der PCR nach GILAD et
al. (2002) und GRAY et al. (2002) detektierte die PCR von BERCOVIER et al. (2005) KHVDNA 10 - 1000 mal sensitiver als die beiden anderen PCR-Verfahren (BERCOVIER et al.
2005). Anders als die übrigen PCR-Nachweismethoden konnte nach BERVOVIER et al.
(2005) KHV-DNA in Karpfen detektiert werden, die 2 Monate zuvor infiziert wurden.
Einen weiteren genomischen Nachweis stellen GUNIMALADEVI et al. (2004),
SOLIMAN et al. (2005) und SOLIMAN u. EL-MATBOULI (2009) als loop-mediated
isothermal amplification (LAMP) vor.
Mittels einer TaqMan PCR entwickelten GILAD et al. (2004) erstmals eine real-time PCR
zum quantitativen Nachweis von KHV. Das Produkt der Amplifikation ist 78 bp groß.
Anhand einer log10-Verdünnungsreihe wurde für die analytische Sensitivität 10 bis 107
Genomkopien angegeben. Die real-time PCR detektiert KHV spezifisch. Bei einem Cut-off
von einem Ct bei 40 wird weder CyHV-1, CyHV-2, IcHV-1 noch Kontrolltiergewebe oder
nicht infizierte KF-1 Zellen detektiert. Anhand eines 2. assays wird mit der
Glucokinasesequenz, einem single copy gene für Nutzkarpfenzellen (PANSERAT et al.
2000), gleichzeitig eine Kontrolle der DNA-Extraktion und eine Quantifizierung der Zahl der
Wirtszellen in der Probe durchgeführt. GILAD et al. (2004) geben die Ergebnisse der PCR
37
entsprechend in der Kopienzahl KHV-Genom pro 106 Wirtszellen an. Mit diesem Verfahren
konnte Virus-DNA in symptomlosen Koi Karpfen 64 Tage nach der Infektion nachgewiesen
werden. Beim Vergleich der konventionellen PCR nach GILAD et al. (2002) mit der realtime PCR nach GILAD (2004) erwies sich die real-time PCR als sensitiver. Die Autoren
schlossen daraus, dass ein weiterer Teil der diagnostischen Lücke geschlossen werden könnte,
da mittels der sensitiveren Methode noch geringe Mengen an Virus-DNA in Gewebe
detektiert werden kann.
KAMIMURA et al. (2007) stellen einen weiteren real-time PCR-assay zur Quantifizierung
von KHV vor. Sie verwenden eine quenching probe (QProbe) als Sonde, deren Sequenz nach
der Amplifikation nicht zerstört wird. Stattdessen erfolgt am Ende der PCR eine
Schmelzkurvenanalyse, um falsch-positive amplifizierte Produkte zu identifizieren. Die
Autoren ermittelten 2 Sonden, die KHV-DNA auf der Basis von SphI-5 und der
Tymidinkinase KHV erfolgreich detektieren. Die Fluoreszenz der QProbe entsteht auf der
Basis eines Fluoreszenz-modifizierten Cytosins am 3’- oder 5’-Ende der Sonde. Wenn die
Sonde mit der Zielsequenz hybridisiert, wird die Fluoreszenz von der entsprechenden
Guaninbase unterdrückt. Die Amplifikation der PCR wird dementsprechend mit der
quenching ratio (Anteil der unterdrückten Fluoreszenz) dargestellt, also mit dem Verhältnis
zwischen unterdrückter Fluoreszenz der hybridisierenden Sonde zur freien, fluoreszierenden
Sonde dargestellt. Bei erfolgreicher Amplifikation kann eine abnehmende Fluoreszenz zum
Zeitpunkt der Sondenhybridisierung gemessen werden. Auf diese Weise kann eine
Quantifizierung erfolgen. Mittels komplementären Oligonukleotiden wurden die speziellen
Schmelzkurven der entwickelten Sonden evaluiert. Dafür wurde die quenching ratio bezogen
auf den Temperaturverlauf evaluiert. Mit dieser Schmelzkurvenanalyse soll bestätigt werden,
dass das amplifizierte Produkt die Zielsequenz enthält. Eine abweichende Schmelzkurve soll
falsch-positiv amplifizierte Reaktionen erkennbar machen. Beim Vergleich zwischen der
TaqMan real-time PCR nach GILAD et al. (2004) und Q-Probe real-time PCR hatte die QProbe real-time PCR bei 5 Wiederholungen eine etwas geringere Standardabweichung,
während die TaqMan real-time PCR sich als etwas sensitiver erwies.
38
2.2
2.2.1
Die quantitative real-time Polymerasekettenreaktion
Grundprinzip und Detektionssysteme
Die Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) ist eine in-vitro
Technik zur gezielten Vervielfältigung (Amplifikation) eines spezifischen DNA-Fragmentes.
Die Technik wurde in den 1980er Jahren (MULLIS et al. 1986, MULLIS u. FALOONA
1987, SAIKI et al. 1988) veröffentlicht und ist seitdem zu einer wichtigen Methode in der
Diagnostik und der Forschung geworden (MACKAY et al. 2002, HOFFMANN et al. 2008).
Das zu amplifiziernde Fragment liegt zwischen zwei DNA-Regionen mit bekannter
Nukleotidsequenz, welche von komplementär bindenden Oligonukleotiden, den so genannten
Primern, erkannt werden. Die DNA-Synthese entlang der Primer erfolgt anhand eines
hitzestabilen Enzyms bakteriellen Ursprungs. Meist wird eine so genannte Taq-DNAPolymerase verwendet, die vom Bakterium Thermus aquaticus stammt. Primer, Enzym,
MgCl2, Wasser und gegebenenfalls weitere Zusätze müssen zu einem Reaktionsansatz
vermischt werden, dem in einem 2. Schritt die zu untersuchende DNA, das template (dt.
Matrize),
hinzugefügt
wird.
Die
Amplifikationsreaktion
erfolgt
durch
gerichtete
Schwankungen der Temperatur in mehreren Zyklen (CHIEN et al. 1976, SAIKI et al. 1988).
Jeder Zyklus kann in 3 Schritte unterteilt werden: In der Denaturierungsphase bei
Temperaturen über 90 °C wird doppelsträngige DNA in Einzelstränge getrennt. In der
Annealingphase bei Temperaturen zwischen 50 und 75 °C lagern sich die Primer an
komplementäre DNA-Sequenzen der template-DNA an. In der abschließenden Extensionsoder Elongationsphase bei 72 - 78 °C erfolgt die Amplifikation des neuen Einzelstranges im
Anschluss an den Primer. Die Temperatur während der Elongationsphase richtet sich dabei
nach der optimalen Temperatur der verwendeten DNA-Polymerase (MACKAY et al. 2002).
Die Untersuchung mittels so genannter konventioneller (MACKAY et al. 2002) PCR stellt
einen gewissen Arbeitsaufwand dar. Nach der PCR muss das Produkt mit erneutem Zeit- und
Materialaufwand in einer Gelelektrophorese dargestellt werden. Bei der Detektion über
Agarosegele wird außerdem lediglich eine Endpunktanalyse durchgeführt. Es kommt nur die
Bandenstärke am Ende des Amplifikationsprozesses zur Auswertung, die je nach Effizienz
der PCR variieren kann (MCKILLIP u. DRAKE 2004). Außerdem besteht durch das
zwingend
offene
handling
(dt.
Umgang)
der
Amplifikate
das
Risiko
von
39
Kreuzkontaminationen und somit falsch-positiven Ergebnissen (MCKILLIP u. DRAKE 2004,
MACKAY et al. 2002, HOFFMANN et al. 2008).
Aufwand und Kontaminationsrisiko gelten im verstärkten Maße für eine nested PCR (dt.
verschachtelte PCR), bei der das Produkt erneut als template für eine weitere PCR mit
innerhalb des ersten Amplifikats liegenden Primern verwendet wird (MCKILLIP u. DRAKE
2004, HOFFMANN et al. 2008).
Die Verwendung von mit doppelsträngiger DNA interkalierenden Farbstoffen wie
Ethidiumbromid (HIGUCHI et al. 1992, 1993) oder SYBR®Green I (Molecular Probes Inc.,
WITTWER et al. 1997a, b) waren erste Schritte zur Analyse der Amplifikatbildung zum
Zeitpunkt ihrer Entstehung. Die Farbstoffe binden unspezifisch und markieren allgemein
doppelsträngige DNA.
Weiterhin wurden modifizierte Primer entwickelt, deren Fluoreszenzsignal spezifischer als
bei den interkalierenden Farbstoffen entsteht. Sie haben jedoch keinen Zuwachs an Spezifität
gegenüber einer konventionellen PCR. NAZARENKO et al. (1997) nutzten beispielsweise
fluoreszenzmarkierte Primer, die der Form entsprechend als hairpin-Primer (dt. Haarnadel)
benannt werden. Bei ihrem Einbau in das Amplifikat emittieren sie Licht, dessen Emission
vorher durch die Tertiärstruktur des Primer verhindert wird. Die Fluoreszenzintensität
korrelierte mit der Menge der eingebauten Primer und damit der Menge an gebildetem
Amplifikat. Diese Technik ermöglichte die Quantifizierungen des amplifizierten Produktes
durch spektrophotometrische Messung nach der PCR.
Diesen Entwicklungen folgte der Einsatz von sequenzspezifischen Sonden. Sie werden
fluoreszenzmarkiert und zusammen mit den Primern in der real-time PCR eingesetzt.
Die Grundlage für die Fluoreszenz von markierten Primern oder Sonden bildet der
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) (CARDULLO et al. 1988), nach dessen
Prinzip ein Reporter-/Donorfluorochrom in räumliche Nähe zu einem Quencher- (engl. to
quench, unterdrücken)/Akzeptorfluorochrom gebracht wird. Die beiden Fluorochrome sind so
gewählt, dass sich Anregungs- und Emissionsspektrum überschneiden. Das Reporter- oder
Donorfluorochrom wird künstlich angeregt und überträgt bei räumlicher Nähe Energie in
Form von emittiertem Licht, das dem Quencher-/Akzeptorfluorochrom zur Anregung dient.
Die Benennung der Farbstoffe erfolgt nach der jeweils gemessenen Emission. Wird während
der PCR das emittierte Licht vom künstlich angeregten Fluorochrom (Reporter) gemessen, so
40
nennt sich das Gegenstück Quencher, da er die Reporterfluoreszenz bei räumlicher Nähe
schluckt und dessen eigene Emission nicht gemessen oder lediglich in Form von Wärme
abgegeben wird. Wird die emittierte Wellenlänge des zweiten Fluorochrom gemessen, so
entspricht das primär künstlich angeregte Fluorochrom einem Donor und das daraufhin durch
räumliche Nähe angeregte und emittierende Fluorochrom einem Akzeptor (HOFFMANN et
al. 2008).
Viele Vorteile der real-time PCR gegenüber den
bisher erwähnten anderen
Detektionssystemen können zusammengefasst werden. Anhand der real-time PCR kann der
Amplifikationsprozess sichtbar gemacht werden, eine Untersuchung der Kinetik der PCR ist
damit möglich und stellte eine höchst willkommene Weiterentwicklung dar (MACKAY et al.
2002). Nur die Kombination aus hybridisierendem Primer und Sonde mit der Zielsequenz
erbringt den erwünschten Nachweis in Form eines Lichtsignals (Abbildung 2). Um die
Amplifikation mittels Fluoreszenz messen zu können, muss also im Fall der real-time PCR
eine zusätzliche Sequenzabfolge spezifisch passen, wodurch ein Zuwachs an Spezifität
gegenüber den anderen bisher vorgestellten Detektionssystemen entsteht (BUSTIN 2000).
Schnellerer und höherer Probendurchsatz, hohe Sensitivität, Reproduzierbarkeit und die
Reduktion von Kontaminationen durch das geschlossene System lässt der real-time PCR
außerdem den Vorzug vor der konventionellen PCR (MACKAY et al. 2002). Die in der Regel
höhere Sensitivität gegenüber der konventionellen PCR basiert auf der Amplifizierung sehr
kurzer Fragmente (TOOULI et al. 2000), außerdem kann mittels real-time PCR das gesuchte
DNA-Fragment quantifiziert werden (HEID et al. 1996, BUSTIN 2000, HOFFMANN et al.
2008).
Nach einer Reihe von Entwicklungsschritten werden mittlerweile kommerzielle real-time
PCR-Systeme angeboten (z.B. von Applied Biosystems, Roche, Stratagene, Bio-Rad, Corbett
Research), die den Thermocycler für die PCR, die Lichtquelle zur Anregung der
Fluorochrome und das Detektionssystem des emittierten Lichts in einem Gerät kombinieren.
Sie messen Wellenlängen zwischen 350 und 750 nm und können bis zu 384 Proben
vollautomatisiert parallel analysieren (HOFFMANN et al. 2008).
Die real-time-Detektionssysteme mit Zuwachs an Spezifität verwenden hydrolysierende
Sonden oder aber hybridisierende Sonden, die nicht abgebaut werden (STORDEUR et al.
2002). An Hybridisierungssonden werden FRET- oder Hybridisierungssonden („HybProbe“,
41
Roche Diagnostics GmbH, WITTWER et al. 1997 a, b), minor groove binder (MGB)-Sonden
(MGB EclipseTM Probes, Epoch Bioscience; QuantiProbeTM, Qiagen, KUMAR et al. 1998,
KUTYAVIN et al. 2000, AFONIA et al. 2002), molecular beacons (GIESENDORF et al.
1998, THYAGI et al. 1998) und das „primer-probe energy transfer system“ (PriProET,
RASMUSSEN et al. 2003) verwendet.
Außerdem können so genannte ScorpionsTM (DxS Ltd., WHITCOMBE et al. 1999,
THELWELL et al. 2000) als Sonden genutzt werden, die irreversibel in das PCR-Produkt
eingebaut werden.
Eine TaqMan®-Sonde (Applied Biosystems/Genetech) ist eine hydrolysierende Sonde und
stellt ein lineares Oligonukleotid dar, welches zusätzlich zu den Primern sequenzspezifisch
hybridisiert. Der Reporterfarbstoff (z.B. FAM, TET, JOE, HEX, Cy3, Cy3.5, ROX, Texas
Red, Cy5 oder Cy5.5) befindet sich am 5’-Ende. Der Quencher (z.B. Dabcyl, TAMRA, BHQ1, QS-7 oder BHQ-2) ist normalerweise am 3’-Ende oder innerhalb der Sequenz angehängt
(Abbildung 2, A). Während der Elongationsphase der PCR wird die Sonde von der
eingesetzten Taq-Polymerase mit 5’-3’-Exonuklease-Aktivität abgebaut, so dass Quencher
und Reporter voneinander getrennt werden (Abbildung 2, B). Als Ergebnis erhält man bei
passend gewähltem Reporterfarbstoff und Quencher eine messbare Fluoreszenz, die
proportional zur Menge des entstehenden PCR-Produkts ansteigt (LIVAK et al. 1995,
GIBSON et al. 1996, HEID et al. 1996).
42
Abbildung 2 Funktionsprinzip der TaqMan®-Sonde A = Primer und Sonde hybridisieren mit der Zielsequenz.
B = Die DNA-Polymerase verlängert den Primer und baut dabei die Sonde ab. Reporterfarbstoff und Quencher
werden durch den Abbau räumlich getrennt, woraufhin Fluoreszenz (emittiertes Licht) messbar wird. Excitation
= anregendes Licht, emission = emittiertes Licht, Fluorphore = Reporterfarbstoff, Cleaved nucleotides =
abgespaltene Nukleotide (aus: QuantiTect Multiplex PCR NoROX Handbook 11/2004)
Einen guten Überblick über die Entwicklung, Technik und Anwendungsmöglichkeiten der
real-time PCR bieten BUSTIN (2000), MACKAY et al. (2002), NIESTERS et al. (2004) und
HOFFMANN et al. (2008).
2.2.2
Anwendung
Die Vorteile und Möglichkeiten (2.2.1) der real-time PCR-Technik führen zu verschiedenster
Anwendung in Diagnostik und Forschung. Bei der Untersuchung auf Pathogene mit hohem
Probendurchsatz trägt sie zur schnellen und sensitiven Diagnostik bei (DE WIT et al. 2000,
DROSTEN et al. 2001, HOFFMANN et al. 2008). DE WIT et al. (2000) konnten mittels
quantitativer real-time PCR die Biosicherheit für Humanpräparate erhöhen. Sie untersuchten
Zellkulturen zur rekombinanten Protein-Herstellung auf die ausreichende Entfernung von
Retroviren aus dem System. Das bisherige elektronenmikroskopische Verfahren detektierte
erst bei mindestens 1 x 106 Partikel/ml, mittels real-time PCR wurde das Detektionslimit auf
6 x 102 Partikel/ml gesenkt. DROSTEN et al. (2001) entwickelten ein Protokoll zum
sensitiven Nachweis des humanen Immundefizienz Virus Typ 1 (HIV-1), das im
Hochdurchsatz zum Screening von Blutproben verwendet werden kann.
43
Zur Bestimmung der Virusgenomlast, für prognostische Aussagen (RYAN et al. 2003,
BRUNBORG et al. 2004, OLIVERA et al. 2004, TOWNER et al. 2004, GILAD et al. 2004)
aber auch zur Messungen der Genexpression verschiedener Zytokine (STORDEUR et al.
2002) wird die Möglichkeit der Quantifizierung der Nukleinsäuremenge genutzt
(HOFFMANN et al. 2008). Beispielsweise bestimmten RYAN et al. (2003) die Viruslast des
felinen Immundefizienz Virus (FIV) in verschiedenen Geweben innerhalb der ersten 23
Wochen nach experimenteller Infektion, um Aussagen zur Virusverteilung in der akuten
Phase der Infektion treffen zu können.
BRUNBORG et al. (2004) stellen fest, dass die meisten Schweinebestände in Norwegen
mit dem porzinen Circovirus Typ 2 (PCV2) durchseucht sind. Das postweaning multisystemic
wasting syndrom (dt. Krankheitsbild des seuchenhaften Kümmerns nach dem Absetzen,
PMWS) wird mit diesem Virus ursächlich in engem Zusammenhang gesehen. Sie stellen in
ihrer Arbeit vor, dass die Quantifizierung der Virusmenge mittels TaqMan real-time PCR
nützlich sein könnte, um gesunde Schweine von PMWS-Schweinen zu unterscheiden.
Außerdem kann die real-time PCR genutzt werden, um Punktmutationen (engl. single
nucleotide polymorphisms, SNPs) zu detektieren, also zur allelen Diskriminierung
(GIESENDORF et al. 1998, TYAGI et al. 1998, THELWELL et al. 2000, PICKERING et al.
2002, HOFFMANN et al. 2008). GIESENDORF et al. (1998) verfolgten dieses Ziel und
verwendeten molecular beacons zur Analyse von Punktmutationen in einem Reduktasegen
des Menschen. Mittels real-time PCR konnten sie durch ein einzelnes, unterschiedliches
Nukleotid in den verschiedenen Sonden das mutierte Gen vom Wildtypgen unterscheiden.
2.2.3
Auswertung der Daten
In welcher Form die Darstellung der Daten einer real-time PCR computergestützt erfolgt,
wird in Abbildung 3 gezeigt. Zur Auswertung wird eine Amplifikationsgraphik (engl.
amplification
plot)
erstellt,
in
der
die
Fluoreszenzstärke
(y-Achse)
gegen
den
Amplifikationszyklus (x-Achse) aufgetragen wird. Als Graph erhält man bei positiven Proben
eine sigmoidal verlaufende Kurve. Diese Kurve hat eine Basislinie, steigt bei der
Amplifikation der Zielsequenz an, verläuft dann in der exponentiellen Amplifikationsphase
linear und erreicht eine Plateauphase, wenn alle Sonden in der Reaktion abgebaut sind und
folglich auch kein Anstieg der Fluoreszenz mehr erzeugt werden kann.
44
Abbildung 3 Graphische Auswertung einer real-time PCR Auf der y-Achse wird die gemessene Fluoreszenz
(engl. fluorescence) gegen die Amplifikationszyklen (engl. cycle number, Zykluszahl) der real-time PCR auf der
x-Achse aufgetragen. Die gestrichelte Linie markiert den Schwellenwert (engl. treshold) einer signifikant
erhöhten Fluoreszenz in den Proben. sample (engl.): Probe, CT A, B = Ct-Wert von Probe A und B, baseline
(engl.): Basislinie; Basisfluoreszenz, log-linear phase (engl.): exponentiellen Amplifikationsphase. (aus:
QuantiTect Multiplex PCR NoROX Handbook 11/2004, www.QIAGEN.com)
Bei der real-time PCR wird bereits zu Beginn der exponentiellen Vervielfältigungsphase der
so genannte Ct-Wert (engl. threshold cycle, Zyklus des Schwellenwertes) ermittelt. Er stellt
den Zyklus dar, in dem die erste signifikante Erhöhung der Fluoreszenz gegenüber der
Basislinie messbar ist. In diesem Zyklus erreicht die Fluoreszenz der Probe den
Schwellenwert. Die Basislinie entsteht durch die Hintergrundfluoreszenz jeder intakten
Sonde, weil der Quencher die Fluoreszenz des Reporters nicht vollständig unterdrückt
(HOFFMANN et al. 2008).
Wann der Ct-Wert erreicht wird, korreliert mit der Ausgangsmenge an Ziel-DNA in der
Probe, daher wird der Ct-Wert zur Quantifizierung genutzt. Je kleiner der Ct-Wert ist, desto
größer ist die Ausgangsmenge der Ziel-DNA in der Probe (HEID et al. 1996).
45
Wird die naive Fluoreszenz R um den Fluoreszenzwert der Basislinie korrigiert, erhält man
dR (HOFFMANN et al. 2008), (Abbildung 4, A, y-Achse). Der korrigierte Graph jeder
positiven Probe beginnt daher in dieser Darstellung mit der Basislinie bei 0 (y-Achse) und
endet in der Plateauphase mit der Fluoreszenz, die sich aus der Differenz der naiven
Fluoreszenz von Plateauphase und Basisfluoreszenz ergibt. Diese Rechnung wird für jede
Probe einzeln durchgeführt. Alle gemessenen Proben lassen sich in dieser Form vergleichbar
abbilden, wie in Abbildung 4, A für 5 Proben exemplarisch dargestellt ist.
2.2.4
Quantifizierung
Die absolute und die relative Quantifizierung stellen die häufigsten Methoden dar, um die
Daten einer real-time PCR zu analysieren (LIVAK u. SCHMITTGEN 2001).
Bei der relativen Quantifizierung wird die Menge bzw. der Ct-Wert der Zielsequenz in der
Probe mit einer Referenzprobe, dem Kalibrator, ins Verhältnis gesetzt. Das resultierende
Ergebnis hat folglich keine Einheit sondern wird als Zahl relativ zur Referenz angegeben. So
wird beispielsweise die Menge der Zielsequenz in Proben von einer behandelten Gruppe mit
der Kontrollgruppe verglichen und ins Verhältnis gesetzt. In dieser Form kann beispielsweise
von der Menge an gemessener mRNA (engl. messenger RNA, Boten-RNA) auf
Veränderungen in der Menge des Proteins geschlossen werden (BUSTIN 2000, HEID et al.
1996, LIVAK u. SCHMITTGEN 2001, HOFFMANN et al. 2008).
Bei der absoluten Quantifizierung wird die absolute Menge an Zielsequenz in einer
unbekannten Probe bestimmt und z.B. als Kopienzahl pro Reaktion angegeben. Dieses
Verfahren wird u.a. genutzt, um die Virusgenomlast im Gewebe zu bestimmen (2.2.2).
Die absolute Quantifizierung erfolgt anhand von mehreren externen Standards (LIVAK u.
SCHMITTGEN 2001). Die absolute Kopienzahl der externen Standards ist bekannt und wird
in der Auswertungssoftware angegeben. Als externe DNA-Standards werden für gewöhnlich
Plasmide mit klonierter Zielsequenz verwendet (BUSTIN 2000, FRONHOFFS et al. (2002),
es können aber auch alternativ genomische DNA oder PCR-Produkte genutzt werden
(HOFFMANN et al. 2008).
Die externen Standards werden im gleichen PCR-Lauf wie die unbekannte Probe separat
mitgeführt, um bei gleichen Grundbedingungen beide Reaktionen miteinander vergleichen zu
können. Es wird eine Standardkurve (HEID et al. 1996) erstellt, indem die Ct-Werte der
46
Standards gegen die initiale Menge der Zielsequenz (logarithmische Werte) aufgetragen
werden (Abbildung 4, B). Wie aus Abbildung 4 ersichtlich, wird der Ct-Wert von der
unbekannten Probe mit den Ct-Werten der Standards verglichen, wobei die Probe in den
Mengenbereich fallen sollte, der durch die mitgeführten Standards abgedeckt wird (BUSTIN
2000, HOFFMANN et al. 2008).
Für jede Standardkurve zur absoluten Quantifizierung werden Parameter ausgerechnet, die
über den Verlauf der PCR und die Eignung des verwendeten Standards Aufschluss geben
(Abbildung 4, D). HOFFMANN et al. (2008) fassen zusammen, dass die optimale PCREffizienz bei 100 % liegt, die sich auch in einer Steigung der Standardkurve von -3,322
widerspiegelt. In diesem Fall wird die Amplifikatmenge pro Zyklus exakt verdoppelt. Der
Korrelationskoeffizient RSq beschreibt die Qualität der Standards, wobei der optimale Wert 1
beträgt. Ferner ist die korrekte Bestimmung der Kopienzahl der Zielsequenz in den Standards
die Voraussetzung einer korrekten Quantifizierung. Sie erfolgt durch Umrechnung aus
Molekulargewicht des verwendeten Standards und der photometrischen Bestimmung der
Absorption bei 260 nm (A260nm). Weiterhin müssen für Standard und Probe die identischen
Oligonukleotide und eine möglichst ähnliche Sequenz zur Amplifizierung und Detektion
verwendet werden, um eine äquivalente Effizienz der Amplifizierung zu erreichen
(NIESTERS 2004).
47
A
C
B
Dye
FAM
FAM
FAM
FAM
FAM
W ell Type Ct (dR) Quantity (copies)
Standard
16,82
1,00E+07
Standard
23,2
1,00E+05
Standard
29,56
1,00E+03
Standard
36,8
1,00E+01
Unknown
26,72
9,19E+03
D
Abbildung 4 Auswertung einer quantitativen real-time PCR A Amplifikationsgraphen von 4 externen
Standards mit bekannter Kopienzahl (schwarz) und einer unbekannten Probe (grau). Der Pfeil (durchgezogene
Linie) kennzeichnet den Ct-Wert der unbekannten Probe, die sich in Graphik B und in Tabelle C quantifiziert
wiederfindet B Durch die errechnete Standardkurve (engl. standard curve) aus den Ct-Werten der 4 verwendeten
externen Standards kann anhand des Ct-Wertes (y-Achse) der unbekannten Probe die Kopienzahl (x-Achse)
ermittelt werden (gestrichelte Pfeile). Die Gerade stellt die verbundenen Werte des externen Standards dar. C Die
Rohdaten können von der Auswertungssoftware auch als Tabelle dargestellt werden. Neben dem betreffenden
Fluorochrom (engl. dye) und der Probenart (engl. well type, Standard = externer Standard, Unknown (dt.
unbekannt) = unbekannte Probe) finden sich u. a. die Ct-Werte und die berechneten bzw. angegebenen Menge an
DNA in Kopien der Probe (engl. quantity (copies)) wieder. D Legende zur Standardkurve. Die letzte Zeile
beschreibt die Funktion der Geraden, nach der die Kopienzahl (x) bzw. der Ct-Wert (y) berechnet werden kann.
Eff. = PCR-Effizienz RSq = Korrelationskoeffizient
2.2.5
Multiplex real-time PCR
Die Verwendung von mehreren Primerpaaren zur Amplifikation von mehreren Zielsequenzen
innerhalb von einer konventionellen PCR nannten CHAMBERLAIN et al. (1988) multiplexe
DNA-Amplifikation, MACKAY et al. (2002) fassten es als „multiplexing“ zusammen. Die
multiplex PCR stellt nach PERSSON et al. (2005) eine simultane Amplifikation von 2 oder
mehr Zielsequenzen in einem Reaktionsgefäß dar.
48
Die Arbeitsgruppe von CHAMBERLAIN et al. (1988) verwendete eine konventionelle
multiplex PCR, um für ein Screening (dt. Auswahlprüfverfahren) mehrere weit entfernte
Sequenzabschnitte innerhalb von genomischer DNA simultan zu amplifizieren. Dieses
Verfahren wurde zur prä- und postnatalen Diagnose von DMD (Duchenne Muskeldystrophie
des Menschen) genutzt.
Unter einer multiplex real-time PCR versteht man folgerichtig die simultane Detektion und
Differenzierung verschiedener Amplikons anhand von unterschiedlich fluoreszierenden
Sonden (MACKAY et al. 2002). Zunächst gestaltete sich die Übertragung des „multiplexing“
auf die real-time PCR als schwierig, da wenige Fluorochrome zur Verfügung standen und nur
monochromatisches Licht verwendet werden konnte. Mit der Entwicklung der hairpinPrimer, den hairpin- und
den hydrolysierenden Sonden, den „light-up“-Sonden (dt.
aufflammend) (SVANVIK et al. 2000) sowie der Möglichkeit zur Doppelmarkierung einer
Sonde, konnte die Zahl der gleichzeitig zu detektierenden Zielsequenzen schon erhöht
werden. Ein weiterer Durchbruch entstand durch die Entwicklung nicht-fluoreszierender
Quencher. Sie machten es möglich, Reporterfarbstoffe mit Emissionswellenlängen zu nutzen,
die bisher durch die Eigenfluoreszenz von früher verwendeten Quenchern belegt war. Indem
multiples Licht emittierende Dioden (engl. light emitting diodes, sog. LEDs), Halogenlampen
oder Laser in real-time PCR-Systeme integriert wurden, wurde ermöglicht, ein größeres
Lichtspektrum zu nutzen. Die Emissionsspektren der Reporterfarbstoffe dürfen sich trotz
allem nicht überlagern, daher ist die Anzahl der Zielsequenzen, die gleichzeitig detektiert
werden können, dennoch limitiert. Bis zu 4 Fluorochrome lassen sich multiplex in einer
Reaktion unterscheiden und simultan detektieren (KREUZER et al. 2001, MACKAY et al.
2002, PERSSON et al. 2005). Bei der multiplex PCR besteht die Möglichkeit, dass die
Amplifikation der Zielsequenz, die in der geringsten Menge vorliegt, inhibiert wird
(HOFFMANN et al. 2008). Als große Vorteile der multiplex PCR werde die reduzierte
Probenmengen, Zeitersparnis, niedrigere Kosten im Vergleich zur „singleplex“ (engl. single,
einfach) Reaktion und geringerer Arbeitsaufwand genannt (PERSSON et al. 2005,
HOFFMANN et al. 2008).
49
2.2.6
Interne Kontrollen
Die Reste von DNA-Extraktionskomponenten wie Detergentien, Lysozym, Natriumhydroxid
(NaOH), Alkohole oder EDTA können die PCR inhibieren. Aber auch gewebespezifische,
organische Stoffe wie beispielsweise Hämoglobin, Urin, Heparin, Glycogen oder Fette
können zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Ferner kann es zu partiellen Inhibition der
Reaktion kommen, die mit einem Verlust von Sensitivität einhergeht (ROSSEN et al. 1992,
WILSON et al. 1997).
Die Verwendung von internen Kontrollen (engl. internal control, IC) bietet eine
Überprüfungsmöglichkeit der Probenaufarbeitung und der PCR. Je nachdem wann eine
interne Kontrolle im Arbeitsablauf von Probenaufarbeitung oder PCR System verwendet
wird, können Funktionalität und Effizienz der Zell- (GILAD et al. 2004) bzw. Virionenlyse
(NIESTERS 2004), der DNA-Extraktion (HOFFMANN et al. 2006) oder der PCR (GIBSON
et al. 1996) jeder einzelnen Probe überprüft werden. Sie dient zum Ausschluss falschnegativer Ergebnisse (HOFFMANN et al. 2008). Für die Quantifizierung unbekannter
Nukleinsäuremengen mittels real-time PCR sind interne Kontrollen außerdem von größter
Wichtigkeit,
da
die
Vergleichbarkeit
der
Ergebnisse
gewährleistet
sein
muss.
Nukleinsäureextraktion und PCR müssen zur Quantifizierung bzw. zur Vergleichbarkeit
verschiedener Proben mit jeweils vergleichbarer Effizienz erfolgen, was mit der Verwendung
und Detektion einer IC überprüft werden kann (HOFFMANN et al. 2008).
Mögliche interne Kontrollen sind „Housekeeping genes“ beziehungsweise „single copy
genes“, sie sind Teil des Wirtsgenoms der zu untersuchenden Spezies (HEID et al. 1996,
GILAD et al. 2004). Mit der Detektion der Sequenz dieser Gene kann nachgewiesen werden,
dass das Gewebe für die PCR erfolgreich aufgeschlossen und die Nukleinsäuren integer
extrahiert wurden. Problematisch beim Einsatz dieser Gene als interne Kontrollen ist, dass
alle Gewebe unterschiedliche Mengen an Zellen und demnach auch unterschiedliche Mengen
an „housekeeping genes“ beherbergen und ihre Konzentration vorher nicht bekannt ist. Liegt
die DNA der housekeeping genes in großen Mengen vor, kann das zur Inhibition in der
Vermehrung der anderen Zielsequenz führen. Außerdem können in dieser Weise zellfreie
Proben (z.B. Serum) nicht untersucht werden. Wenn Viren als Kontrollsystem zur
Virionenlyse verwendet werden, besteht die Problematik des Arbeitens mit infektiösem
Material (HOFFMANN et al. 2008).
50
Es kann aber auch eine künstlich hergestellte Nukleinsäure mit bekannter Sequenz als
interne Kontrolle verwendet werden (HOFFMANN et al. 2006). Die Amplifikation der IC
kann in einem separaten Reaktionsansatz (single assay) oder zusammen mit der Zielsequenz
(multiplex assay) erfolgen. Wenn die extern hinzugefügte IC in einem multiplex assay
amplifiziert werden soll, kann dies in einem heterologen oder einem homologen System
erfolgen (HOFFMANN et al. 2008). Das homologe System verwendet eine abgeleitete
Kontrollsequenz, die mit den gleichen Primern wie die Zielsequenz vermehrt wird, aber über
eine andere Sondensequenz erkannt wird. Dabei soll die größtmögliche Nähe und damit
Vergleichbarkeit zur Amplifizierung der Zielsequenz gewährleistet sein. Bei einem solchen
System muss jedoch für jedes Zielgen auch die IC und die Sonde neu konstruiert werden
(GIBSON et al. 1996, DROSTEN et al. 2001). Ein heterologes System besteht aus einer
komplett heterologen Kontrollsequenz und demnach auch aus eigenen Primern und eigener
Sonde (HOFMANN et al. 2003, HOFFMANN et al. 2006). Dieses System hat den großen
Vorteil, dass es nicht spezies- oder erregerspezifisch ist und folglich universell in
unterschiedlichen PCRs zur internen Kontrolle eingesetzt werden kann. Über die Größe des
zu amplifizierten IC-Fragmentes als auch über die Limitierung der Primerkonzentration kann
die Optimierung des jeweils gewünschten multiplex assays erfolgen (HOFFMANN et al.
2006, HOFFMANN et al. 2008).
51
3
MATERIAL UND METHODEN
3.1
Virusisolate
In dieser Arbeit wurden 4 englische, ein deutsches und ein israelisches KHV-Isolat
verwendet. Außerdem wurden für den Spezifitätstest noch ein CyHV-1 (Cyprinid herpesvirus
1, Karpfenpocken) und ein Aalherpesvirusisolat (Anguillid herpesvirus 1, AHV) verwendet.
Alle Einzelheiten finden sich in Tabelle 6 (9.1.1). Die Isolate wurden als infizierte
Zellkulturen erhalten und in dieser Form als Ausgangsmaterial für alle weiteren
Untersuchungen genutzt.
Alle
im
Weiteren
verwendeten
Materialien,
Geräte,
Gebrauchsgegenstände,
Verbrauchsmaterialien sowie Software und Herstellerangaben sind im Anhang aufgeführt.
3.2
DNA-Extraktion
3.2.1
Allgemeines
Für die DNA-Extraktion wurde eine strikte Raumtrennung vorgenommen. Außerdem fand die
DNA-Extraktion in einem Raum statt, der dem alleinigen Zweck der Nukleinsäure-Extraktion
diente. Das Abfüllen jeglicher Reagenzien für die DNA-Extraktion wurde unter einer nur zu
diesem Zweck verwendeten Sterilbank vorgenommen. Die zur internen Kontrolle verwendete
IC2-DNA (2x 105 Kopien/µl, Einsatz je Extraktion: 5 µl, HOFFMANN et al. 2006) wurde an
einer UV-Bestrahlungsbox aliquotiert, mittels multiplex real-time PCR auf KHVFluoreszenz-Freiheit überprüft, bei –20 °C gelagert und je nach Bedarf in kleinen Mengen
aufgetaut. Reste dieser IC2-Aliquots wurden verworfen.
Stahlkugeln zur Homogenisierung von Gewebe mit dem Tissue Lyser wurden autoklaviert
(180 °C, 3h), einzeln steril in 2,0 ml-Reaktionsgefäße abgefüllt und verschlossen bis zum
Gebrauch gelagert. Jede Stahlkugel wurde nach einmaligem Gebrauch verworfen.
Für die Extraktion der DNA aus Organmaterial, Gewebehomogenat, Kiemenabstrichen,
PBL und Virusmaterial infizierter Zellkulturen wurde das QIAamp® DNA Mini Kit
verwendet,
alle
Lösungen
wurden
laut
Herstellerangaben
vorbereitet.
Alle
Zentrifugationsschritte erfolgten bei Raumtemperatur (RT) und in der BIOFUGE fresco
(Rotor
75003328).
Bei
jeder
Extraktion
wurden
zur
Detektion
von
möglichen
Kreuzkontaminationen 100 µl A. dest. als „Wasserkontrolle“ mitgeführt (DNA-
52
Extraktionskontrolle). Nach der Zugabe einzelner Lösungen wurde die zu extrahierende Probe
immer durch vortexen gemischt und kurz abzentrifugiert, um die Bestandteile vom
Reaktionsgefäßrand zu entfernen. Erhaltene DNA wurde bei –20 °C gelagert. Alle Flächen,
Pipetten und Zentrifugen wurden in regelmäßigen Abständen und nach Bedarf desinfiziert
(Mikrozid) und dekontaminiert (DNA-Remover).
3.2.2
DNA-Extraktion mit dem QIAamp® DNA Mini Kit
3.2.2.1 Protokoll für Gewebe
Vom Organmaterial wurden 20mg +/- 0,2 mg in ein 2,0 ml-Reaktionsgefäß mit Stahlkugel
(5mm Durchmesser) abgewogen und mit 80µl PBS aufgefüllt. Mit dem Tissue Lyser wurde
das Gewebe bei 20 Hertz 2 Minuten (min) homogenisiert. Von 10 %igem Kiemen- und
Nierenhomogenat wurden 100 µl Homogenat weiter aufgearbeitet (3.12.3.1). Im Anschluss
wurde in einzelnen Schritten 20 µl Proteinase K, 100 µl ATL-Puffer und 5 µl IC2-DNA
hinzugefügt. Zur vollständigen Lyse der Zellen wurde die Suspension dann für 2 h bei 56 °C
auf einem Thermoschüttler inkubiert. Nachdem 200 µl AL-Puffer hinzugefügt wurden,
folgten noch einmal 10 min Inkubationszeit bei 70 °C auf dem Thermoschüttler. Nach der
Zugabe von 200 µl Ethanol (99 %) wurde die gut vermengte gesamte Suspension auf die
QIAmp Spinsäule gegeben und für 1 min bei 8000 rpm zentrifugiert. Der Durchfluss wurde
verworfen und die Säule ein neues 2,0 ml-Reaktionsgefäß (vom Hersteller) gegeben. Dann
wurde die Säule 1 min mit 500 µl Puffer AW1 bei 8000 rpm gewaschen, in ein neues 2,0 mlReaktionsgefäß (Kit) überführt und erneut für 3 min mit 500 µl Puffer AW2 bei 13.000 rpm
gewaschen. Der Durchfluss aus den beiden Waschschritten wurde verworfen. Nach dem
letzten Waschschritt wurde die DNA in der Säule mit 50 µl A. dest. für 1 min bei RT
inkubiert und dann für 1 min bei 8000 rpm in ein 1,5 ml-Reaktionsgefäß eluiert.
3.2.2.2 Protokoll für Kiemenabstriche und PBL
Das Kiemenabstrichmaterial wurde als Zellpellet in 200 µl Pellet-Überstand (3.12.3.2) zur
DNA-Extraktion verwendet. Das Zellpellet der PBL (1 x 107 Leukozyten) wurde mit 200 µl
PBS aufgefüllt und anschließend zur DNA-Extraktion weiterverwendet. Anders als nach
Herstellerprotokoll für Blut- und Körperflüssigkeiten wurden höhere Volumina der
53
Extraktionslösungen verwendet, da auf diese Weise eine höhere DNA-Extraktionseffizienz
aus diesen Proben erzielt werden konnte. Diese Vorgehensweise beruhte auf Beobachtungen
aus nicht gezeigten Vorversuchen. Nach der Homogenisierung des Probenmaterials in einem
2 ml-Reaktionsgefäß mit einer Stahlkugel (5 mm Durchmesser) im Tissue Lyser bei 20 Hertz
für 2 min wurden nacheinander 40 µl Proteinase K, 200 µl ATL und 5 µl IC2-DNA
zugegeben und dann für 2 h bei 56 °C auf einem Thermoschüttler inkubiert. Nachdem 400 µl
AL-Puffer hinzugefügt wurde, inkubierte der Ansatz für 10 min bei 70 °C auf einem
Thermoschüttler. Zur Fällung der DNA wurden 400 µl Ethanol (99 %) hinzu gegeben, dann
wurde die QIAmp Spinsäule mit der Hälfte der Suspension beladen (ca. 620 µl) und für 1 min
bei 8000 rpm zentrifugiert. Danach wurde die andere Hälfte auf die Säule gegeben und wie
oben zentrifugiert. Der Durchfluss wurde jeweils unter Verwendung eines 2,0 mlReaktionsgefäßes verworfen. Die nun folgenden Waschschritte mit AW1- und AW2-Puffer
sowie die Elution der DNA erfolgte mit gleichen Volumina sowie in gleicher Weise wie im
Gewebeprotokoll beschrieben (3.2.2.1).
3.2.2.3 Protokoll für Virusmaterial aus infizierter Zellkultur
100 µl der mit Virus infizierten Zellkultur dienten als Ausgangsmaterial und wurden in einem
2 ml-Reaktionsgefäß mit PBS auf 200 µl aufgefüllt. Es wurden nacheinander 20 µl Proteinase
K, 200 µl AL und 5 µl IC2-DNA zugegeben und für 10 min bei 56 °C auf dem
Thermoschüttler inkubiert. Danach wurde die DNA durch Zugabe von 200 µl Ethanol (99 %)
gefällt und die gesamte Suspension in die QIAmp Spinsäule überführt und für 1 min bei 8000
rpm zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen. Die nun folgenden Waschschritte mit
AW1- und AW2-Puffer erfolgte mit gleichen Volumina sowie in gleicher Weise wie im
Protokoll für Gewebe beschrieben (3.2.2.1). Danach wurde die QIAmp Spinsäule in einem
neuen 1,5 ml-Reaktionsgefäß mit 200 µl AE-Puffer befüllt, 1 min bei RT inkubiert und die
DNA schließlich für 1 min bei 8000 rpm eluiert.
54
3.3
Konventionelle (single round) PCR und nested PCR
Die Sensitivität der multiplex real-time PCR wurde mit 5 konventionellen PCRs und einer
nested PCR verschiedener Autoren verglichen (Tabelle 1). Dabei wurden 4 verschiedene
KHV-Isolate verwendet, die in log10-Stufen verdünnt eingesetzt wurden. Es handelte sich um
zwei englische, ein israelisches und ein deutsches Isolat aus dem NRL für KHV. Die PCRs
wurden nach den unten aufgeführten Reaktionsbedingungen und Temperaturprofilen
durchgeführt, die mit geringen Modifikationen in dieser Form am FLI bestehen. Basis des
Vergleiches bildeten die Sequenzen der Primer (Tabelle 7, Zusatzinformationen Tabelle 8,
Anhang, 9.1.3) und die publizierte Annealing-Temperatur des jeweiligen Primerpaares
(Tabelle 1). Diese wurde gemäß der Angaben der Autoren folgendermaßen eingestellt:
Tabelle 1 Publizierte Annealing-Temperaturen der verwendeten Primerpaare
PCR
Fragmentgröße
Referenz
Bercovier-TK-PCR
AnnealingTemperatur
52 °C
409 bp
BERCOVIER et al. (2005)
CNGV-PCR
60 °C
109 bp
PIKARSKY et al (2004)
Gilad-PCR
68 °C
484 bp
GILAD et al. (2002)
nested-PCR
68 °C
392 bp
BERGMANN et al. (2006)
Gray-Bam-HI-PCR
55 °C
365 bp
GRAY et al. (2002)
Gray-SphI-
63 °C
290 bp
GRAY et al. (2002)
improved-PCR
modifiziert nach
YUASA et al. (2005)
Außerdem wurde ein Nukleotid-Alignment (dt. Abgleich) aller verwendeten Primersequenzen
mit den 3 vollständig sequenzierten KHV-Referenzgenomen von AOKI et al. (2007) anhand
der nucletide blast-Software der NCBI (National Center for Biotechnology Information)
vorgenommen.
Der Mastermix, also das Gemisch aller PCR-Reagenzien ohne template-DNA wurde
räumlich getrennt vom template erstellt (mindestens im 10x Ansatz) und pipettiert, wie es
unten
für die real-time PCR beschrieben wird (3.6.2). Um die real-time PCR mit den
konventionellen PCRs (single round PCRs) vergleichen zu können, erfolgte die Reaktion
55
immer in einem Endvolumen von 25 µl zusammengesetzt aus 5 µl template und 20 µl
Mastermix, außerdem wurde das template mit 40 Zyklen amplifiziert.
Für die nested PCR erfolgte zunächst eine konventionelle PCR mit den Primern nach
GILAD et al. (2002) nach dem single round Reaktionsansatz und dem entsprechenden single
round Temperaturprofil (s. u.). Nach dieser ersten PCR wurden dann 2,5 µl des Produktes als
template für die nested PCR verwendet.
Alle Reaktionen wurden mit dem Go Taq® Flexi DNA Polymerase-Kit durchgeführt,
außerdem erfolgten die konventionellen PCRs und die nested PCR in 0,2 mlReaktionsgefäßen (PCR-8-Strip-tubes) und im Mastercycler gradient 5311 von Eppendorf.
Die PCR wurde der Fragmentgröße entsprechend (Tabelle 1) im 1,5 %igen bzw. im Fall der
CNGV-PCR im 2,5 %igen Agarosegel in der Elektrophorese überprüft.
Reaktionsansatz single round PCR:
A. dest.
9,625 µl
5x Colorless Go Taq® Flexi Buffer
MgCl2 Solution des Kit (25mM)
5 µl
2,5 µl
1
dNTPs-Mix (25mM each dNTP; 25nmol/µl each dNTP) 0,25 µl
Primermix F und R (je Primer 50 pmol/µl)
Go Taq® DNA Polymerase
2,5 µl
0,125µl
template
5 µl
Endvolumen
25 µl
Temperaturprofil single round PCR:
2 min bei 95 °C
(initiale Denaturierung)
40 Zyklen mit:
1 min 95 °C
(Denaturierung)
1 min primerspezifisch °C
(Annealing)
1 min 72 °C
(Elongation)
dann
1
Der dNTP-Mix wurde aus Einzelkomponenten (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) hergestellt.
56
7 min bei 72 °C
(finale Elongation)
4 °C halten bis zur Probenentnahme
Reaktionsansatz nested PCR:
A. dest.
12,125µl
®
5x Colorless Go Taq Flexi Buffer
MgCl2 Solution des Kit (25mM)
5 µl
2,5 µl
dNTP-Mix1 (25mM each dNTP; 25nmol/µl each dNTP) 0,25 µl
Bergmann-nested-1Fn und -1Rn-Mix (je Primer 50 pmol/µl) 2,5 µl
Go Taq® DNA Polymerase (Promega):
0,125µl
template
2,5 µl
Endvolumen
25 µl
Temperaturprofil nested PCR:
2 min bei 95 °C
(initiale Denaturierung)
25 Zyklen mit:
1 min 95 °C
(Denaturierung)
1 min 68 °C
(Annealing)
1 min 72 °C
(Elongation)
dann
7 min bei 72 °C
(finale Elongation)
4 °C halten bis zur Probenentnahme
3.4
Agarosegelelektrophorese
Die Agarosegelelektrophorese diente zur Darstellung von konventionellen, nested und realtime PCR-Produkten. Außerdem wurde in dieser Form die Spaltung des Reaktionsprodukts
durch Restriktionsenzyme überprüft. Je nach erwarteter Fragmentgröße wurde ein 1,5 oder
2,5 %iges (w/v) Gel hergestellt (9.1.5.1). Für ein großes, 1,5 %iges Gel wurden 1,2 g Agarose
auf 80 ml mit TAE-Puffer aufgefüllt. Nachdem sich unter Hitzezufuhr in der Mikrowelle die
Agarose vollständig gelöst hatte, wurde verdampftes Wasser mit A. dest. auf 80 ml aufgefüllt.
57
Um DNA in PCR-Produkten sichtbar zu machen, wurde dann 10 µl EthidiumbromidStammlösung zugegeben. Die Masse wurde nach geringgradigem Abkühlen in eine
Gelkammer mit Kamm gegossen. Nachdem das Gel erstarrt und gänzlich abgekühlt war,
wurden der Kamm entfernt und die entstandenen Geltaschen mit 10µl PCR-Produkt,
vermengt mit 2 µl Loading-Dye, befüllt. Als Maßstab für die Größe des entstandenen
Fragmentes wurden 1 µl Längenstandard (100 - 1000 bp) vermengt mit 2 µl Loading-Dye in
regelmäßigen Abständen im Gel aufgetragen. Die Auftrennung der Fragmente erfolgte in der
mit TAE-Puffer gefüllten Gelelektrophoresekammer bei 60 V für 60 min. Das Gel wurde
danach mittels UV-Licht eines Transilluminators beurteilt und fotografiert.
3.5
3.5.1
Herstellung einer positiven Kontrolle
Allgemeines
Zur Herstellung einer positiven KHV-DNA-Kontrolle (engl. positive control, KHV-PC-DNA)
für die real-time PCR wurde ein 484 bp großes Fragment (GenBank accession number
AF411803, GILAD et al. 2004) verwendet. Das Fragment wurde mittels PCR amplifiziert und
in den Vektor pGEM®-T Easy kloniert. Diese KHV-PC-DNA diente außerdem zur
Herstellung des externen Standards und damit zur absoluten Quantifizierung einer Probe. Die
interne Kontroll-DNA (IC2-DNA) wurde vergleichbar der KHV-PC-DNA hergestellt, bei der
ein Fragment (712 bp) des Standardklonierungsvektors pEGFP-1 (BD Biosciences Clontech,
accession number U55761) in pGEM®-Teasy kloniert wurde (HOFFMANN et al. (2006).
3.5.2
Amplifizierung mittels PCR und Aufreinigung
Das 484 bp große Fragment zur Herstellung der positiven Kontrolle beinhaltete die 79 bp
große Sequenz, die mit der real-time PCR nachgewiesen wird. Es wurde zunächst mit dem
Primerpaar nach GILAD (2002) in einer konventionellen PCR amplifiziert. Ein PCR-Ansatz
mit einem Endvolumen von 25 µl setzte sich aus 22,5 µl Mastermix und 2,5 µl template
zusammen. Als template wurde DNA verwendet, die aus virusinfizierter Zellkultur (CCB) mit
dem israelischen KHV-Isolat (Tabelle 1, Anhang, 9.1.1) gewonnen wurde. Die PCR erfolgte
im Mastercycler gradient 5311 und wurde nach folgendem Reaktionsansatz und
Temperaturprofil durchgeführt:
58
Reaktionsansatz der Amplifizierung für die Klonierung:
A. dest.
13 µl
10x Pfx Amplifikationspuffer
2,5 µl
10x Enhancer
2,5 µl
MgSO4 (50mM)
1 µl
dNTPs-Mix2 (25mM each dNTP; 25nmol/µl each dNTP)
1 µl
Gilad KHV-9/5F (50 pmol/µl)
1 µl
Gilad KHV-9/5R (50 pmol/µl)
®
Platinum Pfx DNA Polymerase
1 µl
3
0,5 µl
template
2,5 µl
Endvolumen
25 µl
Temperaturprofil:
2 min bei 95 °C
(initiale Denaturierung)
35 Zyklen mit:
15 sek 94 °C
(Denaturierung)
30 sek 60 °C
(Annealing)
1 min 68 °C
(Elongation)
dann
10 min bei 68 °C
(finale Elongation)
4 °C halten bis zur Probenentnahme
Vom entstandenen PCR-Produkt wurden 15 µl mit 3 µl Ladepuffer (farblos) vermengt und in
einem 1,5 %igen Agarose-TAE-Gel gelelektrophoretrisch bei 80V für ca. 45 min aufgetrennt.
Das entstandene PCR-Produkt wurde unter UV-Kontrolle ausgeschnitten. Die Aufreinigung
2
Der dNTP-Mix wurde aus Einzelkomponenten (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) hergestellt.
Diese DNA Polymerase besitzt eine korrekturlesende 3´-5´ Exonukleaseaktivität und damit eine hohe
Genauigkeit während der Amplifikationsreaktion. Die Ligationsrate bei der anschließenden Klonierung des
produzierten Fragmentes (3.5.3) war gering und in dieser Form zu erwarten. Um die Effizienz der Ligation ggf.
zu erhöhen, standen Alternativprotokolle nach Empfehlungen des Herstellers (pGEM®-T and pGEM®-T Easy
Vector Systems von Promega) zur Verfügung.
3
59
des DNA-Fragmentes erfolgte nach Angaben des Herstellers mit dem QIAquick Gel
Extraction Kit.
3.5.3
Klonierung und Überprüfung der Sequenz
3.5.3.1 Ligation
Das amplifizierte und gereinigte Fragment (3.5.2) wurde zunächst als insert in einem 5 µlLigationsansatz in den Standard-Klonierungsvektor pGEM®-T Easy verbracht. Dazu werden
1,5 µl des amplifizierten inserts mit 0,5 µl Vektor (50 ng/µl), 2,5 µl Ligationspuffer und 0,5
µl T4-DNA-Ligase (-20 °C) miteinander vermengt und zur Ligationsreaktion über Nacht bei
4 °C inkubiert. Am selben Tag wurde eine Vorkultur von E. coli Bakterien des Stammes
XL1blue MRF` angelegt, indem 5 - 6 ml LB-Medium (ohne Antibiotikum) steril mit einer
Einzelkolonie beimpft und bei 37 °C über Nacht im Schüttelinkubator bebrütet wurde. Die
Einzelkolonie entstammte aus einem Verdünnungsausstrich dieser Bakterien, der bei 37 °C
auf einer LB-Agarplatte (12,5 µg/ml Tetrazyklin) angelegt war.
3.5.3.2 Herstellung von transformationskompetenten Bakterien
Am Tag nach der Ligation erfolgte die Herstellung der transformationskompetenten Bakterien
und die Transformation des Plasmides in die Zellen. Die Zentrifugationsschritte erfolgten in
der Megafuge 1.0 R (Rotor 75003360). Die tags zuvor angelegte Suspensionskultur der E.
coli Bakterien wurde dafür 1:100 weiterverimpft (300 µl Kultur auf 30 ml LB-Medium ohne
Antibiotikum) und etwa 1,5 h bei 37° inkubiert. Bei einer optischen Dichte bei 550 nm von
0,3 - 0,45, was etwa 4 - 7 x 107 Bakterien pro ml Lösung entsprach, wurde die gesamte, trübe
Kultur für 15 min bei 3000 rpm und 4 °C zentrifugiert. Nachdem der Überstand verworfen
wurde, wurde das Bakterienpellet schonend in 30 ml 0,1 M Calciumchlorid (CaCl2) bei 4 °C
aufgenommen und für 30 min, maximal 1 h auf Eis gelagert. Danach wurde das Pellet
vorsichtig für 15 min bei 1700 rpm und 4 °C abzentrifugiert und nach dem Abgießen des
Überstands erneut in 1,5 ml 0,1 M CaCl2 (4 °C) aufgenommen und mindestens 1h auf Eis
gelagert. Die so erhaltenen kompetenten Zellen wurden direkt verwendet oder für eine
Retransformation höchstens 1 - 2 Wochen im Kühlschrank haltbar gelagert.
60
3.5.3.3 Transformation
Zur Transformation des Plasmides in die Bakterienzellen wurden 5 µl des Ligationsansatzes
in 100 µl der vorgelegten Lösung mit transformationskompetenten Bakterienzellen für 30 min
auf Eis, dann für 5 min bei 37 °C und erneut für 10 min auf Eis gelagert. Danach wurden dem
Transformationsansatz 200 µl LB-Medium (ohne Antibiotikum) hinzugefügt und für 30 min
bei 37 °C im Thermoschüttler leicht geschüttelt. Währenddessen wurden vorbereitete LBAgar-Platten (50 µg Ampicillin/ml) unter der Laminarbox vom Kondenswasser getrocknet
und beschriftet. Der komplette Ansatz (305 µl) wurde nun auf der Agarplatte ausgestrichen
und über Nacht bei 37 °C über Kopf inkubiert. Alle gewachsenen Kolonien wurden einzeln
mit sterilen Filterspitzen in 4 ml steril abgefülltes LB-Medium (50 µg Ampicillin/ml)
verbracht. Diese Vorkultur wurde über Nacht bei 37 °C inkubiert.
3.5.3.4 DNA-Präparation (Mini)
Zur schnellen Aufreinigung der Plasmid-DNA aus den transformierten Bakterien wurde eine
Mini-Präparation (Lösungen 1, 2 und 3 vom Qiagen-Plasmid-DNA-Maxi-Präparationskit)
durchgeführt. Alle Zentrifugationsschritte der Mini-Präparation wurden in der Biofuge pico
(Rotor 75003328) bei 13000 rpm und RT durchgeführt. Es wurden 1,5 ml von jeder
inkubierten Kolonie 2 - 5 min zentrifugiert, das Medium wurde gründlich verworfen und zum
Pellet wurden 150 µl Lösung 1 gegeben und gründlich gemischt. Danach wurden 150 µl von
Lösung 2 hinzugefügt, vermischt und auf Eis oder bei RT 5 min gelagert. Nach Zugabe von
Lösung 3 und Vermengen des Ansatzes wurde das denaturierte, weißliche Protein sichtbar
ausgefällt. Nach einer Lagerung von mindestens 15 min auf Eis wurde der Inhalt des
Reaktionsgefäßes für 5 min zentrifugiert und 400 µl der wässrigen Phase in ein mit 400 µl
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol befülltes, neues Reaktionsgefäß übertragen. Nachdem der
Inhalt gemischt und 5 Minuten zentrifugiert wurde, wurden bis zu 350 µl Volumen der
oberen, wässrigen Phase entnommen (auch nur geringe Mengen der unteren, phenolischen
Phase würden die weiteren Reaktionen inhibieren) und in ein mit 900 µl vergälltem 96 %
Ethanol befülltes, neues Reaktionsgefäß gegeben, vermengt und 10 - 15 min auf Eis gelagert
und dann erneut 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde
vorsichtig mit 70 - 75 % Ethanol gewaschen. Nach 5 min Zentrifugation wurde der Alkohol
vorsichtig unter Wahrung des Pellets abgenommen und ggf. bei 37 °C zur Entfernung von
61
Rest-Alkohol im Thermoschüttler ohne zu schütteln inkubiert. Das durchsichtige, nicht
ausgetrocknete Pellet wurde in 50 µl RNAse-Wasser (oder TE-Puffer) kontrolliert
aufgenommen. Nach gründlichem Mischen (Vortexer) wurden etwa 1 h bei 37 °C im
Thermoschüttler RNA-Reste verdaut. Diese Mini-Präparations-DNA wurde für eine erneute
Transformation oder eine Sequenzierung bei –20 °C gelagert.
3.5.3.5 DNA-Kontrollspaltung
Die
Plasmid-DNA
wurde
mit
dem
Restriktionsenzym
EcoR1
überprüft.
Der
Spaltreaktionsansatz mit einem Endvolumen von 10 µl setzte sich aus 2 µl Mini-PräparationsDNA (ca. 1µg/µl), 2 Units EcoR1= 0,2 µl EcoR1 (10U/µl, 1 Unit je Spaltstelle und µg DNA),
1 µl Reaktionspuffer (REact® 3, 10x) und A. dest. ad 10 µl zusammen. Der Enzymmix
(Spaltreaktionsansatz ohne die DNA, 8 µl je Probe) wurde je nach Probenanzahl angefertigt
und direkt zu der vorher abgefüllten Mini-Präparations-DNA (2 µl) gegeben, gemischt und
1,5 – 2 h bei 37 °C inkubiert. Zur Kontrolle wurden der leere Vektor pGEM®-T Easy
(1µg/µl) ebenso gespalten wie die DNA der Mini-Präparation. Dazu wurde 1 µl Vektor und 1
µl A. dest. ebenso wie die Proben mit 8 µl des Enzymmixes inkubiert. Nach der Spaltreaktion
wurde zur Proben-DNA 2 µl Ladepuffer (blau) gegeben, gemischt und kurz anzentrifugiert.
Der gesamte Inhalt von 12 µl wurde für die gelelektrophoretrische Auftrennung
weiterverwendet. Nach der Spaltreaktion des leeren Vektors wurde diese Kontrollspaltung
mit 10 µl A. dest. und 5 µl Ladepuffer (blau) aufgefüllt, ebenfalls gemischt und kurz
anzentrifugiert. Hiervon wurden 5 µl (ca. 200ng DNA) weiterverwendet. Als Längenstandard
wurden 1 µl von einem 1 kbp Marker (75 bp - 12,216 kbp) verwendet und mit 2 µl Ladepuffer
(blau) und 9 µl A. dest. vermischt ins Gel aufgetragen. In der Agarosegelelektrophorese
wurden die Proben nun in einem 1,5 %igen TAE-Agarosegel bei 80 Volt und ca. 60 min (vgl.
3.8) überprüft. Bei erfolgreicher Ligation, Transformation und DNA-Extraktion der MiniPräparation wurde eine Bande bei ca. 3,1 kbp auf Höhe der Vektorkontrolle sowie eine Bande
bei ca. 500 bp erwartet.
3.5.3.6 Sequenzierung
Für die Sequenzierung wurde das Thermo Sequenase Fluorescent Labelled Primer Cycle
Sequencing-Kit verwendet, welches die Möglichkeit der Sequenzierung nach SANGER et al.
62
(1977) anhand der Kettenabbruchsynthese bietet. Sie erfolgte nach einer DNAKontrollspaltung (3.5.3.5). Durch einen forward- und einen reverse-Primer wurden hier beide
Stränge des inserts und ein Stück des Vektors nach dem Kettenabbruch-Prinzip amplifiziert.
Es wurden zwei Mastermixe (je Probe) mit je einem Endvolumen von 10,5 µl aus 2 µl DNA
(ca. 130 ng Plasmid-DNA), 1 µl des Primer sq-40for bzw. sq-48rev (2 pmol/µl; Tabelle 7,
Anhang, 9.1.3), 0,35 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) ad 10,5 µl mit A. dest. hergestellt. Von
jedem Mastermix wurden dann je 2,3 µl in vorgelegte 0,8 µl von G-, A-, T- und C-Reagenz
gegeben. Die Reaktion fand im Mastercycler gradient 5311 statt: 95 °C 5 min (initiale
Denaturierung) gefolgt von 30 Zyklen mit 30 sek 95 °C (Denaturierung), 30 sek 63 °C
(Annealing) und 30 sek 70 °C (Elongation). Im Anschluss wurden 3 µl jedes Ansatzes in 15
µl 96 % Ethanol (vergällt) gegeben und 5 min bei 95 °C verdampft. Anschließend wurden 5,7
µl Sequenzstoplösung zugegeben und bei 95 °C 3 min im Thermoschüttler geschüttelt und
schließlich bei 4 °C bis zur Weiterverwendung gelagert.
Die Proben zur Sequenzierung wurden im Labor von Dipl.-Chem. G. Strebelow auf ein
Polyacrylamid-Harnstoffgel aufgetragen und die Auswertung erfolgte mit dem LI-Cor DNAAnalyzer GENE READER 4200.
3.5.4
Retransformation
Die Retransformation erfolgte analog zur Transformation und mit größeren Mengen. Dazu
wurde die überprüfte KHV-PC-DNA verwendet und wie oben eine plasmidtransfizierte 4 mlBakteriensuspensionskultur (aus einer einzelnen Kolonie) hergestellt. Die gesamte
Bakteriensuspensionskultur wurde in 100 ml LB-Medium (ohne Antibiotikum) gegeben, eine
weitere Nacht bei 37 °C inkubiert und dann für 30 min und 5000 rpm bei 4 °C in der
Megafuge 1.0 R (Rotor 75003360) pelletiert. Danach wurde eine DNA-Präparation (3.5.5)
durchgeführt.
3.5.5
DNA-Präparation (Maxi)
Die Maxi-Präparation der Plasmid-DNA erfolgte nach Angaben des Herstellers mit dem
QiafilterTM
Plasmid
Maxi
Kit.
Die
Konzentration
der
KHV-PC-DNA
wurde
spektrophotometrisch bestimmt und bei -20 °C gelagert. Die Anzahl der Moleküle wurde
63
nach der Formel (x g/µl DNA / [Plasmidlänge in bp x 660]) x 6.022 x 1023 = y Moleküle/µl
berechnet.
3.6
3.6.1
Real-time PCR
Primer und Sonden
Zur Detektion von KHV wurden die veröffentlichten Sequenzen von GILAD et al. (2004)
verwendet. Es wurde ein Nukleotid-Alignment (dt. Abgleich) der Primer- und der
Sondensequenz mit den 3 vollständig sequenzierten KHV-Referenzgenomen von AOKI et al.
(2007) anhand der nucletide blast-Software der NCBI (National Center for Biotechnologie
Information) vorgenommen. Primer und Sonden zur Detektion der IC wurden basierend auf
HOFFMANN et al. (2006) ausgewählt. Bei der IC handelt es sich um eine externe
Nukleinsäurepräparation, die basierend auf dem EGFP (enhanced green fluorescent protein)Gen konstruiert wurde (3.5). Dieses DNA-Konstrukt zur internen Kontrolle wurde wie oben
beschrieben jeder Probe während der DNA-Extraktion in einer Menge von 1 x 106 Kopien
zugesetzt. (3.2.1) Alle verwendeten Oligonukleotide sind in der Tabelle 7 und Tabelle 8
(Anhang, 9.1.3) aufgeführt.
3.6.2
Reaktionsbedingungen, Durchführung und Auswertung
Die real-time PCR zum Nachweis von KHV-Genom wurde unter Verwendung des
QuantiTect® Multiplex PCR NoRox Kits durchgeführt. Die Reaktionsansätze von single bzw.
im multiplex assay hatten jeweils ein Endvolumen von 25 µl, bestehend aus 20 µl Mastermix
und 5 µl template-DNA. Beide Reaktionsansätze sowie das Temperaturprofil für die
Reaktionen sind unten angegeben. Wenn mehr template als 5 µl (4.1.3.2: + 2,5 µl IC2-DNA)
verwendet wurde, wurde der Mastermix um das entsprechende Volumen an A. dest.
verringert. Beim Ansetzen einer real-time PCR wurde in 2 getrennten Schritten vorgegangen.
Im ersten Schritt wurden für die benötigte Anzahl von Reaktionsansätzen alle Reagentien
ohne die template-DNA in der unten genannten Reihenfolge zu einem Mastermix
zusammengegeben. Dies erfolgte in einer UV-Bestrahlungsbox auf Eis und unter
Verwendung der Tischzentrifuge FUGE-VORTEX 2400. Danach wurde der Mastermix in der
Box in 20 µl-Aliquots in Vertiefungen einer 96-well-Platte (0,2 ml, Thermo-Fast® 96, Non
64
Skirted; mit Ultra Clear Cap Strips) verteilt. Dabei befand sich die Platte in einem Kühlblock,
der vorher bei –20 °C gelagert wurde. Anschließend wurden in die Vertiefungen der Platte
jeweils 5 µl template hinzu pipettiert. Dies erfolgte als zweiter Schritt in einem anderen Raum
und in einem anderen Kühlblock, nur die 96well-Platte wechselte mit in den anderen Raum
hinüber. Nach Zugabe des templates wurde die Platte verschlossen und kurz bei 2000 rpm
und RT zentrifugiert (UNIVERSAL 30 RF, Rotor 1422). Nach Beendigung der Arbeit in der
UV-Bestrahlungsbox wurde das UV-Licht für mindestens 40 Minuten eingeschaltet. Der
Arbeitsplatz im DNA-Bestückungsraum und der Kühlblock wurden regelmäßig und bei
Bedarf desinfiziert und dekontaminiert (Mikrozid und DNA-remover). Die PCRs wurden in
Mx 3000PTM und Mx 3005PTM real-time PCR Systemen durchgeführt.
Reaktionsansatz single assay (ohne Koamplifizierung der IC):
A. bidest.
5,5 µl
2x Reaktionsmix (QMMM)
12,5µl
KHV-spezifischer Primer-Sonden-Mix4
2 µl
template-DNA
5 µl
Endvolumen
25 µl
Reaktionsansatz multiplex assay (mit Koamplifizierung der IC):
A. bidest.
3,5 µl
2x Reaktionsmix (QMMM)
KHV-spezifischer Primer-Sonden-Mix
12,5µl
4
IC2-spezifischer Primer-Sonden-Mix5
2 µl
template-DNA
5 µl
Endvolumen
4
5
2 µl
10 pmol/µl von KHV-86-F und KHV-163-R, 1,25pmol/µl von KHV-109-p-FAM
2,5 pmol/µl von EGFP-1-F und EGFP-2-R, 1,5 pmol/µl von EGFP-HEX
25 µl
65
Temperaturprofil single und multiplex assay
(Aktivierung der HotStarTaq® DNA Polymerase,
15 min bei 95 °C
initiale Denaturierung)
42 Zyklen mit:
1 min 95 °C
(Denaturierung)
30 sek 60 °C
(Annealing, Ende: Messung der Fluoreszenzdaten)
30 sek 72 °C
(Elongation)
Jeder Lauf enthielt eine positive Kontrolle, bei der als template 5 µl DNA eingesetzt wurde,
sowie 2 Wasserkontrollen, bei der 5 µl A. bidest. als template Verwendung fand. Von den
DNA-Extraktionskontrollen wurden ebenfalls in Duplikaten 5 µl DNA eingesetzt.
Alle Proben aus dem Infektionsversuch, bei denen absolute Kopienzahlen an KHVspezifischer DNA bestimmt wurden, wurden ebenfalls in Duplikaten im multiplex assay
untersucht, wobei jeweils wieder 5 µl DNA als template diente. Dabei wurden in jedem Lauf
mindestens 4 externe DNA-Standards mitgeführt, die gleichzeitig als positive Kontrolle
dienten. Die von der Computersoftware basierend auf der abgeleiteten Standardkurve
berechneten Ergebnisse wurden vom Gerät in Kopien pro Reaktion (Kopien/Reaktion)
angegeben. In der Auswertung wurde diese Angabe beibehalten.
Da in jeder PCR-Untersuchung nur ein Zehntel (5 µl) des aus der ursprünglichen
Gewebeprobe erhaltenen DNA-Extraktionseluats von 50 µl als template in der real-time PCR
eingesetzt wurde, handelt es sich bei diesen Angaben um die absolute Kopienbelastung an
KHV-DNA eines Zehntels der jeweiligen Ausgangsmenge der verarbeiteten Probenmenge:
Beim Nieren- und Kiemengewebe der adulten Spiegelkarpfen handelt es sich um die absolute
Kopienbelastung/2mg,
bei
den
Kiemenabstrichen
entsprechend
um
die
absolute
Kopienbelastung in einem Zehntel des verarbeiteten Kiemenabstrichvolumens und bei den
PBL um die absolute Kopienbelastung/106 Leukozyten.
Die von der Computersoftware errechneten Ergebnisse pro Reaktion entsprachen bei den
juvenilen Karpfen einem Wert von einer absoluten Kopienbelastung/1mg Gewebe.
66
3.7
Zellen und Zellkulturtechnik und Virusvermehrung
Die KHV-Isolate wurden auf der Karpfenzelllinie „common carp brain“ (CCB, CCLV
RIE816, erhalten aus der Zellbank, FLI) vermehrt. AHV wurde in Form einer infizierten
Aalzelllinie „eel kidney 1“ (EK-1, CCLV RIE809) und das CyHV-1-Isolat wurde in Form
von der infizierten Karpfenzelllinie „koi fin 1“ (KF-1, CCLV RIE 843) erhalten und
weiterverwendet.
Die Vermehrung und Kultivierung der CCB-Zellen wurden im geschlossenen System der
Zellkulturflasche (T12,5, T25, T75 bzw. T162 mit je 5, 10, 30 bzw. 100ml Zellkulturmedium
ZB 4g) oder im offenen System der Zellkulturplatte (24- bzw. 96-Well-Platten mit 1ml bzw.
100 µl Zellkulturmedium ZB 5 je Plattenkavität) vorgenommen. Die Zellen wurden alle 3 – 5
Tage mit dem Zellkulturmedium, das 50 U Penicillin/ml, 50 µg Streptomycin/ml enthielt,
umgesetzt. Dazu wurde der einschichtige Zellrasen (Monolayer) mit ATV („Alsevers´s
Trypsin Versen“) überschichtet und 1 - 3 Minuten inkubiert. Das ATV wurde abgegossen und
der gelockerte Zellrasen der Flasche wurde durch leichtes Klopfen zur Suspension vereinzelt.
Danach wurde die Zellsuspension mit einer Rate von 1:3 oder 1:4 mit Zellkulturmedium
aufgefüllt und auf neue Zellkulturflaschen oder Zellkulturplatten verteilt und bei 26 °C im
Brutschrank (CO2-Brutschrank beim offenen System, 2,5 % CO2) inkubiert.
Zur Virusvermehrung wurden frisch umgesetzte Zellen (ca. 24 h alt) verwendet. Das
Virusmaterial (Virus-Zell-Suspension) war vorher bei -80 °C gelagert, wurde aufgetaut und in
einer bestimmten Menge (T25 = 1ml, T75 = 3ml, T162 = 5ml) auf den Monolayer der
Zellkulturflasche gegeben, von dem zuvor das Zellkulturmedium abgegossen wurde. Nach
einer Inkubation von 2 Stunden bei 20 °C wurde die Virus-Zell-Suspension abgegossen, mit
der gleichen Menge Zellkulturmedium gespült und mit Zellkulturmedium entsprechend der
Größe der Zellkulturflasche (s. o.) aufgefüllt. Die Zellen wurden 1 - 2 Wochen p.i. nach
Auftreten eines generalisierten cytopathogenen Effekts (cpE) in Form von Riesenzellbildung,
Vakuolisierung und großflächiger Ablösung der Zellen vollständig mit einem Zellabkratzer
(Cell Scraper 25cm) vom Boden der Zellkulturflaschen entfernt und in Aliquots abgefüllt bei
–80 °C gelagert.
Alle Arbeiten mit Zellkulturen und Virusmaterial zur Virusvermehrung wurden steril an
einer Sterilbank (VFR 1206 GS) durchgeführt.
67
3.8
Virustitration
Anhand einer Virustitration wurde die mittlere kulturinfektiöse Dosis pro ml (KID50/ml) des
Virusmaterials bestimmt. Dies erfolgte in 96-Well-Platten modifiziert nach der Methode von
SPAERMAN und KAERBER (1931). Die etwa 24 h alten Monolayer aus CCB-Zellen (3.2)
wurden an einer Sterilbank (VFR 1206 GS) mit 100 µl einer log10-Verdünnungsreihe des
Virusmaterials beimpft (4 Plattenkavitäten je Verdünnungsstufe) und für 14 Tage bei 20 °C
im CO2-Brutschrank (2,5 %) inkubiert. Nach 14 Tagen wurden alle Verdünnungsstufen
untersucht und es wurde protokolliert, welche Verdünnungsstufen positiv für einen KHVtypischen cpE in Form von Riesenzellbildung und Vakuolisierung mit oder ohne Ablösung
der Zellen waren und welche Verdünnungsstufen negativ waren. Die jeweils vorletzte
Verdünnungsstufe der noch positiven Kavitäten zeigte dabei immer 4 von 4 Kavitäten mit
cpE. Die KID50 wurde nach der Originalformel von SPAERMAN und KÄRBER (1931)
vereinfacht bestimmt6. Die vereinfachte Bestimmung gilt nur bei log10-Verdünnungsreihen,
die vierfach titriert ausgewertet werden. Bei anderen Verdünnungsschritten oder Kavitäten je
Verdünnungsstufe muss nach der Originalformel von SPAERMAN und KÄRBER (1931)
berechnet werden. Mit dem Faktor 10 wurden die Werte in die KID50/ml umgerechnet. Bei
jeder Titration wurden Kontrollen mitgeführt und deren Zellmorphologie verglichen, die mit
100 µl Zellkulturmedium beimpft wurden.
3.9
Virusreisolierung
Die Virusreisolierungsversuche wurden mit etwa 24 h alten CCB-Zellen auf 24-Well-Platten
durchgeführt (vgl. 3.7). Es wurde sowohl von jedem infizierten als auch von jedem
6
Bei vierfacher Titration von log10-Verdünnungsreihe in einer 96-well-Platte kann die KID50/0,1ml direkt durch
Ablesen des cpEs angegeben werden. Dabei wird die letzte, höchste Verdünnungstufe bewertet, die noch 1-4
positive Kavitäten zeigt. Die vorletzte Verdünnungstufe zeigt dabei in allen 4 Kavitäten einen cpE. Einer
mittleren kulturinfektiöse Dosis von beispielsweise 105, 105,25 105,5 oder 105,75/0,1ml entspricht folgender cpE:
Sind 2 von 4 Kavitäten der Verdünnungsstufe 1:105 positiv, entspricht das genau einer KID50 von 105
KID50/0,1ml. Sind 3 von 4 Kavitäten der Verdünnungsstufe 1:105 positiv, entspricht das einer KID50 von 105,25
KID50/0,1ml und sind 4 von 4 Kavitäten der Verdünnungsstufe 1:105 positiv, dann entspricht das einer KID50
von 105,5 KID50/0,1ml. Wenn nur 1 von 4 Kavitäten der Verdünnungsstufe 1:106 mit positivem Ergebnis
entspricht dies einer KID50 von 105,75 KID50/0,1ml. In 3 Fällen entspricht die ganze Zahl vor dem bzw. im
Exponenten der jeweiligen Verdünnungsstufe mit den letzten noch positiven Kavitäten. Außer bei nur einer
positiven Kavität, hier entspricht die ganze Zahl vor und im Exponenten immer der nächst niedrigere
Verdünnungsstufe, also der geringeren Verdünnung. Die Dezimalstellen des Exponenten entsprechen immer der
bestimmten Anzahl der positiven Kavitäten. Für 2, 3 oder 4 von 4 positiven Kavitäten der Verdünnungsstufe 1:
104 gilt entsprechend 104 , 104,25 bzw. 104,5 KID50/0,1ml. Aber erst 1 von 4 positiven Kavitäten der nächst
höheren Verdünnungsstufe (1: 105) entspricht einer KID50 von 104,75/0,1ml.
68
Kontrolltier Gewebe verarbeitet. Außerdem wurden bei jeder Passage Kontrollen mitgeführt,
die mit Zellkulturmedium beimpft wurden. Von den adulten Karpfen wurde Nierengewebe
und von den juvenilen Karpfen wurde gepooltes Kiemen- und Nierengewebe 10 %ig (w/v) in
antibiotikumhaltigem Zellkulturmedium (Amphotericin B 2,5 µg/ml/Gentamicin 50 µg/ml)
homogenisiert (Tissue Lyser, 20 Hertz, 2 min). Das verwendete Gewebe war zuvor bei -80 °C
gelagert. Das Homogenat wurde 1 h bei 4 °C inkubiert und im Original sowie in einer 1:10
Verdünnung auf die Zellen verimpft, wobei vor diesem Schritt in der ersten Passage alle
Zelltrümmer aus dem Homogenat bei 3000 rpm für 10 Minuten bei 4 °C abzentrifugiert
wurden (UNIVERSAL 32 R, Rotor 1653). Es wurden drei Zellpassagen durchgeführt. Die
zweite und dritte Passage wurde mit der Suspension aus Zelltrümmern und Zellkulturmedium
einer Kavität durchgeführt. Kavitäten mit bakterieller Kontamination wurden vor dem
Verimpfen durch einen 0,22µm-Filter gegeben. Bei jeder Passage wurden 300 µl Inokulat je
Plattenkavität für 2 h bei 20 °C inkubiert, abgenommen, mit 1ml Zellkulturmedium gespült,
erneut mit 1ml Zellkulturmedium überschichtet und für weitere 14 Tage bei 20 °C im
Brutschrank (2,5 % CO2) belassen. Die Passagen wurden regelmäßig auf Veränderungen der
Zellmorphologie hin kontrolliert. Nach der vierzehntägigen Inkubationszeit wurden die
Platten bei –80 °C abgefroren und bis zur nächsten Passagierung gelagert.
3.10 Indirekter Immunfluoreszenztest
Mit dem indirekten Immunfluoreszenztest sollte das Antigen des KHV an fixierten
Zellkulturen nachgewiesen werden. Dazu wurde parallel zu den Virusreisolierungsversuchen
(3.9) eine zweite Passage aller adulten und juvenilen infizierten Karpfen und der
Kontrollkarpfen in 96-Well-Platten angelegt. Es wurden 100 µl Inokulat der vorherigen
Passage für 2 h bei 20 °C auf etwa 24 h alte CCB-Zellen gegeben. Danach wurden weitere
100 µl Zellkulturmedium zugefügt und für 1 Woche bei 20 °C im CO2-Brutschrank (2,5 %)
inkubiert. In gleicher Weise wurden mehrere Kulturen mit einer log10-Verdünnungsreihe des
Infektionsvirus aus dem Infektionsversuch als Positivkontrolle beimpft und Zellen, die nur
mit Medium inokuliert wurden als Zell-Negativkontrolle hergestellt.
Alle Kulturen wurden nach der Inkubation für 3 min bei 1200 rpm und RT zentrifugiert
(UNIVERSAL 30 RF, Rotor 1422), der Überstand entfernt und für ca. 20 min bei RT und
Luftzufuhr (Ventilator) getrocknet. Danach wurden die Zellen durch die Zugabe von 100 µl
69
kaltem Ethanol-Aceton-Gemisch (1:1) in jede Kavität für 10 min bei –20 °C fixiert. Nachdem
das Gemisch abgekippt und die Platten erneut unter Luftzufuhr getrocknet wurden, lagerten
sie bei –20 °C bis zur weiteren Verwendung. Nach einem Auftauschritt bei RT und
geschlossenem Deckel wurden die Zellen mit PBS rehydriert, das PBS abgenommen und mit
50 µl gegen KHV gerichtetem monoklonalen Antikörper (mAK) (KHV10A9, 1:10 mit PBS)
je Kavität für 1 h bei RT überschichtet. Nach dreimaligem Waschen mit PBS- wurden 50 µl
Konjugat (FITC-markiert, Ziege-Anti-Maus, 1:100 mit PBS) je Kavität für 1 h bei RT
inkubiert und erneut wie oben dreimal gewaschen. Zur Erhaltung der Fluoreszenz und zum
Anfärben
der
Zellkerne
wurde
dann
der
Diazobicyclooctan
(DABCO)-
Fluoreszenzerhaltungspuffer (mit Propidiumiodid) zu jeweils 100 µl je Kavität zugegeben und
die Fluoreszenz schließlich mit einem UV-Mikroskop beurteilt.
3.11 Elektronenmikroskopie
Im Rahmen von Arbeiten zur Virusreisolierung (3.9) aus Geweben infizierter Karpfen standen
10
%ige
Homogenate
einzelner
Gewebe
für
die
elektronenmikroskopische
Negativkontrastuntersuchung zur Verfügung. Dazu wurde von adulten, infizierten Karpfen
der Überstand des Nierengewebes von 2 Karpfen zu gleichen Teilen in einer Probe
zusammengefasst (50 µl je Fisch, 100 µl je Probe). Die Überstände von Geweben (Nierenund Kiemenhomogenat) der juvenilen, infizierten Karpfen wurden beckenweise zu gleichen
Teilen zusammengefasst, indem jeweils eine Probe der gestorbenen / moribund getöteten
Karpfen und eine Probe der überlebenden Karpfen hergestellt wurde (50 µl je Fisch, variables
Volumen je Probe). Die Proben der juvenilen Karpfen wurden nach eintägiger Lagerung bei 4
°C untersucht, die Proben der adulten Karpfen wurden bis zur elektronenmikroskopischen
Präparation und Untersuchung bei –80 °C gelagert.
Die
elektronenmikroskopische
Präparation
(Negativkontrastierung
mit
Phosphorwolframat) und die entsprechenden Auswertungen am Elektronenmikroskop wurden
im Laboratorium für Elektronenmikroskopie des FLI, Insel Riems, von P. Meyer und Dr. rer.
nat. habil. H. Granzow durchgeführt.
70
3.12 Untersuchungen zur Pathogenese der Koi-Herpesvirus-Infektion bei experimentell
infizierten Spiegelkarpfen
3.12.1 Infektionsversuchsaufbau
Für den Infektionsversuch zur Untersuchung der Pathogenese der Koi-Herpesvirus-Infektion
im Spiegelkarpfen wurden juvenile und adulte Spiegelkarpfen mit KHV infiziert (Versuche
zur Koi-Herpesvirus-Infektion, LALLF MV-/TSD/7221.3.-1.1-020/06).
Neben der Verteilung des viralen Genoms in Nieren- und Kiemenmaterial sowie
Kiemenabstrichen und PBL (periphere Blutleukozyten) im adulten Einzelfisch sollten Daten
zu möglichen Zusammenhängen von der Höhe der Virusgenomlast und des klinischen
Verlaufes der Erkrankung in Abhängigkeit von Alter und Infektionsdosis erhoben werden.
3.12.1.1 Versuchstiere
Es wurden 36 adulte Spiegelkarpfen der Zuchtlinie R3F10 und 36 juvenile Spiegelkarpfen der
Zuchtlinie R8F10 x R3F10 für den Infektionsversuch verwendet. Bei beiden Linien handelt es
sich um Spezifisch-Pathogen-freie (SPF) Spiegelkarpfen von der Wageningen Agricultural
University (Animal Science: „De Haar-Vissen“; Fish Culture & Fisheries Group: Dr. ir. J.
Komen) in Holland. Die adulten Karpfen waren zum Zeitpunkt der Infektion 2 Jahre und 4
Monate alt mit einem Gewicht von durchschnittlich 250 g, die juvenilen Karpfen waren zum
Zeitpunkt der Infektion 5 Monate alt und wogen durchschnittlich 3 g.
3.12.1.2 Hälterung der Infektions- und Kontrollgruppen
Die Karpfen wurden in 6 Gruppen aufgeteilt: 2 Kontrollgruppen und 4 Infektionsgruppen (
Abbildung 5, 3.12.1.3), von denen immer 2 Gruppen mit der gleichen Virusdosis infiziert
wurden. Dementsprechend wurde die Reihenfolge der Beckenbetreuung gestaltet: Zunächst
wurden die Kontrollgruppen versorgt, dann die mit niedriger Viruslast infizierten und zum
Schluss die mit höherer Viruslast infizierten Gruppen. Die beiden Kontrollgruppen waren von
den Becken der infizierten Karpfen räumlich getrennt. Jede Gruppe in einem Becken bestand
aus 6 adulten und 6 juvenilen Karpfen. Die juvenilen Karpfen in jedem Becken wurden in
einen wasserdurchlässigen Gitternetzkäfig im selben Becken, aber abgetrennt von den adulten
71
Karpfen gehältert. Die Hälterung der Karpfen erfolgte in allen Becken über den gesamten
Zeitraum des Versuches von 56 Tagen bei 23 °C. Die Temperatur wurde täglich kontrolliert.
Die Fütterung der Karpfen erfolgte täglich restriktiv mit pelletiertem Karpfenfutter. Die
beiden Altersgruppen erhielten ihrer Größe entsprechend unterschiedliches Futter. Das
Allgemeinbefinden
der
Versuchskarpfen
wurde
täglich
überprüft.
Die
Kreislaufbeckensysteme des Typs Riems 97 hatten ein Fassungsvermögen von etwa 420 l
(300 l im Glasaquarium, 40 l im Schlammabsatzbecken, 80 l im Filterbecken), von denen
etwa 120 l Wasser täglich bei der Reinigung des Schlammabsatz- und des Filterbeckens
ausgewechselt wurden.
3.12.1.3 Infektion
Die Infektion der Karpfen erfolgte eine Stunde lang im separaten Bad unter Sauerstoffzufuhr.
Bei dem Infektionsvirus handelt es sich um ein israelisches Isolat, erhalten von Hedrick,
USA, 2002 in der 12. Zellkulturpassage in der Zelllinie CCB (Common Carp Brain). Zwei
Gruppen von Karpfen wurden in einem separaten Behältnis mit 5 x 103 KID50 KHV pro ml
Badwasser infiziert (Becken 17 und 18), 2 Gruppen wurden mit 5 x 104 KID50 KHV pro ml
Badwasser infiziert (Becken 19 und 20) und die beiden Kontrollgruppen wurden mit
Zellkulturmedium 4g ebenso wie die Infektionsgruppen behandelt (Becken 11 und 12).
72
Kontrollen
5 x 103 KID50/ml
5 x 104 KID50/ml
Becken 11, 12
Becken 17, 18
Becken 19, 20
Abbildung 5 Schematische Darstellung der Hälterung der Infektions- und Kontrollgruppen
Jede Gruppe in einem Becken bestand aus 6 adulten und 6 juvenilen Karpfen. Die juvenilen Karpfen wurden in
einem wasserdurchlässigen Gitternetzkäfig im selben Becken wie die adulten Karpfen gehältert.
Die Infektion der juvenilen und der adulten Karpfen erfolgten getrennt voneinander. Je 6
Spiegelkarpfen desselben Alters wurden im selben Bad infiziert. Für jede Badinfektion wurde
eine neue Badlösung hergestellt. Am Tag 0 des Infektionsversuches wurden zunächst die
Kontrollkarpfen behandelt. Außerdem wurden zunächst die juvenilen Spiegelkarpfen
behandelt bzw. infiziert, bevor jeweils direkt im Anschluss die adulten Karpfen folgten. Nach
der Infektion der adulten Karpfen wurde die separate Badlösung in das jeweilige Becken
verbracht, was dort zu einer 1 x 102 KID50/ml KHV in Becken 17 und 18 sowie einer 1 x 103
KID50/ml KHV in Becken 19 und 20 führte, die durch den täglichen Wasseraustausch
sukzessive verdünnt wurden. Mit der Badlösung der Kontrollkarpfen wurde in gleicher Weise
verfahren.
3.12.2 Beprobung, Narkose und Tötung
Zur Beprobung bzw. zum Töten wurden alle Karpfen einzeln im separaten Bad zunächst
narkotisiert und nach Beprobung bzw. im Fall der juvenilen Karpfen sofort mit einem Schlag
auf den Kopf und anschließender Rückenmarksdurchtrennung getötet. Die Narkose erfolgte
im Benzokain-Wasserbad. Vor jeder Beprobung waren die Karpfen ca. 24 Stunden nüchtern,
73
die Fütterung der übrigen Karpfen erfolgte nach der Entnahme der Beprobungsfische. Die im
Infektionsversuch verwendeten Lösungen zur Probenentnahme wurden vor Beginn des
Infektionsversuchs aliquotiert und bei RT (Benzokain), 4 °C (Percoll) bzw. bei -20 °C
(aliquotiertes Zellkulturmedium für die PBL-Separation und für die Kiemenabstriche) bis zum
Gebrauch gelagert.
Die juvenilen Karpfen wurden bis zum Tod, in einem Fall bis zur moribunden Klinik oder
bis zum Versuchsende beobachtet. Gestorbene bzw. moribund getötete, juvenile Karpfen
wurden bei –80 °C bis zur weiteren Aufarbeitung gelagert. Alle überlebenden juvenilen
Karpfen wurden zum Versuchsende getötet und ebenfalls bei –80 °C gelagert.
Die adulten Karpfen wurden an Tag 7, 14, 21, 28, 42 und 56 p.i. beprobt. An jedem der 6
Beprobungstage wurden 6 adulte Karpfen beprobt und danach getötet, je ein Karpfen aus
jedem Becken. Somit wurden je Infektionsdosis 2 Karpfen aufgearbeitet und ebenso 2
Kontrollkarpfen. Die Kontrollkarpfen wurden zuerst beprobt.
3.12.3 Untersuchungsmaterial
3.12.3.1 Kiemen- und Nierengewebe
Nach Versuchsende wurden alle gestorbenen und getöteten juvenilen Karpfen aufgetaut und
es wurden Kiemen- und Nierenmaterial entnommen. Aus einem Organpool dieser beiden
Organe wurden pro Tier ein 10 %iges (w/v) Homogenat hergestellt (Tissue Lyser, 20 Hertz, 2
min). Die Homogenate wurden zur Weiterverarbeitung in der DNA-Extraktion in Aliquots
von 100 µl abgefüllt und erneut bei -80 °C gelagert, somit wurden pro juvenilen Fisch 10 mg
Gewebe aufgearbeitet. Für die Virusreisolierung und die elektronenmikroskopische
Untersuchung wurde das hergestellte Homogenat wie unter Punkt 3.9 und 3.11 beschrieben
weiterverarbeitet.
Jedem
adulten
Karpfen
wurde
am
Beprobungstag
Kiemenabstriche,
agglutinationsgehemmtes, heparinisiertes Vollblut, Nieren- und Kiemengewebe entnommen.
Die Kiemenabstriche und das Vollblut wurden unter Betäubung gewonnen und bis zur unten
beschriebenen Weiterverarbeitung auf Eis gekühlt gelagert. Danach wurden die Karpfen
getötet. Die Organe wurden am selben Tag steril an einer Laminarbox entnommen und
anschließend bei -80 °C bis zur weiteren Aufarbeitung gelagert.
74
3.12.3.2 Kiemenabstriche
Die Kiemenabstriche wurden mit einem autoklavierten (121 °C, 20 min), beidseitig
benutzbarem Wattestäbchen entnommen. Je Karpfen wurde ein Wattestäbchen beidseitig
verwendet, geknickt und in 1 ml antibiotikumhaltiges Medium ZB 4g verbracht. Nach ca. 4stündiger Einwirkzeit bei 4 °C wurden die Kiemenabstriche im Medium gründlich
durchmischt.
Danach
wurde
die
gesamte
Flüssigkeit
steril
abgenommen.
Die
Kiemenabstrichflüssikeit wurde für 10 Minuten mit 4000 rpm bei 4 °C zentrifugiert
(Centrifuge 5417 R, Rotor F-45-30-11). Der Überstand wurde steril und separat abgenommen
und das Pellet wurde mit 200 µl des Überstandes resuspendiert. Die in dieser Weise
aufgearbeiteten Kiemenabstriche wurden bei –80 °C bis zur weiteren Verarbeitung gelagert.
3.12.3.3 PBL
Das agglutinationsgehemmte, heparinisierte Vollblut wurde zur Gewinnung von peripheren
Blutleukozyten (PBL) aus der Schwanzvene (V. caudalis) der Karpfen gewonnen. Zur
Separierung der PBL aus dem Blut wurden sofort nach der Entnahme 0,5 - 1,0 ml Blut in 5ml
serumfreies Zellkulturmedium ZB 28 gegeben und bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis
gekühlt. Mit diesem Blut-Mediumgemisch wurden 3 ml Percol1 der Dichte 1,077 der Firma
Biochrom überschichtet. In der vorgekühlten Zentrifuge wurden dann die beiden Phasen bei 4
°C und 1800 rpm für 40 Minuten zentrifugiert (UNIVERSAL 30 RF, Rotor 1424A). Der
weiße Leukozytenring im Überstand wurde abgenommen und mit Zellkulturmedium auf 10ml
aufgefüllt. Von diesen 10 ml wurden dann 50 µl zur Zellzählung (3.12.3.3.1) abgenommen
und in 50 µl Trypanblau-Lösung verbracht. Die Zellzahl dieser 50 µl wurde in der Thoma
Zählkammer bestimmt und auf die Gesamtzellzahl des 10 ml Leukozyten-MediumGemisches hochgerechnet. Die gezählten Zellen enthielten als Bestandteile der peripheren
Blutleukozyten: Lymphozyten, Monozyten, neutrophile Granulozyten und Thrombozyten
sowie außer diesen Zellpopulationen noch gelegentlich vereinzelt Erythrozyten und einige
tote Zellen.
Der Rest der 10 ml Leukozytensuspension wurde währenddessen für 10 Minuten bei 4 °C
und 1200 rpm (UNIVERSAL 30 RF, Rotor 1424A) abzentrifugiert. Das entstandene Pellet
wurde dann seiner Gesamtzellzahl entsprechend mit dem Medium ZB 5 oder 28 auf 107
Zellen (PBL) pro ml eingestellt (Gesamtzellzahl/
1 x 107 = Auffüllvolumen in ml),
75
resuspendiert und in 1ml-Aliquots abgefüllt. Alle Aliquots wurden erneut für 5 Minuten bei
1200 rpm und 4 °C zentrifugiert (UNIVERSAL 30 RF, Rotor 1412). Der Überstand wurde
verworfen und das Pellet von 107 Zellen (PBL) wurde bis zur weiteren Verarbeitung bei -80
°C gelagert.
3.12.3.3.1 Zellzählung
Die Leukozyten wurden in der Thoma Zählkammer unter dem Phasenkontrastmikroskop
gezählt, in die das 1:2 verdünnte Leukozytensuspension (50 µl Leukozyten-MediumGemisch, 50 µl Trypanblau-Lösung) gegeben wurde. Es wurden immer 5 Quadrate
ausgezählt. Dann musste auf die Zellzahl/ml bzw. die Gesamtzellzahl hochgerechnet werden.
Auf einer Thoma Zählkammer befinden sich 16 Gruppenquadrate mit einem Flächeninhalt
von jeweils 0,04mm2. Die Kammertiefe beträgt 0,1mm. Daraus ergibt sich ein Rauminhalt
von 0,004mm3 je Gruppenquadrat. Die 5 ausgezählten Gruppenquadrate entsprechen
zusammen einem Rauminhalt von 0,02mm3. Um auf einen Rauminhalt von 1 cm3 (1ml =
1cm3 = 1000mm3), also dem Rauminhalt von 1 ml hochzurechnen, musste diese Zellzahl
folglich mit 50.000 multipliziert werden. Da die Zählsuspension 1:2 mit dem Trypanblau
vorverdünnt wurde, musste die erhaltene Zellzahl noch mit dem Faktor 2 multipliziert
werden.
Die Trypanblau-Vorverdünnung und die Kammervolumina der Thoma Zählkammer mit
einberechnet, kann also vereinfacht nach folgender Formel die Konzentration an Zellen pro
ml Leukozyten-Medium-Gemisch berechnet werden:
Zellzahl/ml = Zellzahl aus 5 Quadraten x 105
Berechnung der Gesamtzellzahl an PBL des Leukozyten-Medium-Gemisches:
Gesamtzellzahl =
Zellzahl/ml x Volumen der Probe in ml (in diesem Fall 10 ml Leukozyten-Medium-Gemisch)
76
4
ERGEBNISSE
4.1
Entwicklung und Validierung eines multiplex real-time PCR Protokolls zum
Nachweis von Koi-Herpesvirus
4.1.1
Herstellung einer positiven Kontrolle und externer DNA-Standards
Durch eine PCR mit den Primern Gilad-KHV-9/5F und Gilad-KHV-9/5R wurde ein 484bp
großes Fragment vom israelischen KHV-Isolat amplifiziert, das in den Vektor pGEM®-Teasy
kloniert wurde. Mittels Sequenzierung wurde die Nukleotidabfolge in der KHV-PC-DNA
überprüft und bestätigt. Mittels Retransformation und anschließender Maxipräparation wurde
eine größere Menge der KHV-PC-DNA hergestellt. Nach spektrometrischer Messung des
3499 bp-großen Konstruktes wurde eine Anzahl von 1,638 x 1011 Molekülen (Kopien)/µl
berechnet und als positive Kontrolle in Form von definierten Standards eingesetzt. Dazu
wurde die positive Kontrolle in RNA safe buffer auf 2 x 109 Kopien/µl eingestellt und eine
log10-Verdünnungsreihe bis zu 2 x 10-1 Moleküle/µl im gleichen Puffer hergestellt. Je 5 µl der
einzelnen Verdünnungsstufe wurden als template in der real-time PCR eingesetzt und dienten
in dieser Weise als externe Standards zur absoluten Quantifizierung der Menge an viraler
DNA in zu untersuchenden Proben.
4.1.2
Wahl der Primer und Sonden, Reaktionsbedingungen
Mit der Entwicklung eines multiplex real-time PCR Protokolls sollte neben der sensitiven
Detektion von KHV im selben Ansatz die DNA-Extraktion überprüft werden. Für die
Detektion von KHV wurden die Primer Gilad-real-KHV-86-F und Gilad-real-KHV-163-R
sowie die Sonde Gilad-real-KHV-109p-FAM von GILAD et al. (2004) verwendet. Die Primer
amplifizieren ein 78 bp großes Fragment (Abbildung 6). Die Sonde ist am 5´-Ende mit dem
Reporterfarbstoff FAM (6-Carboxyfluorescein) und am 3´-Ende mit dem Quencher TAMRA
(Tetramethyl-6-Carboxyrhodamin) markiert.
Bei dem internen Kontrollsystem von HOFFMANN et al. (2006) handelt es sich um eine
universell einsetzbare Kontrolle der DNA-Extraktion, die sowohl in zellarmen oder zellfreien
Proben einsetzbar ist, als auch die Möglichkeit bietet, mit Protokollen anderer real-time PCRs
kombiniert zu werden. Das zu amplifizierende, 132 bp große Fragment der IC (Abbildung 6)
77
wurde größer gewählt als das KHV-Fragment, damit bei gleicher Amplifikationsrate das
KHV-Fragment in höherer Stückzahl amplifiziert wird.
1000 bp
500 bp
Abbildung 6 Gelelektrophoretrische
Darstellung der Produkte der multiplex realtime PCR
M=
100 - 1000 bp-Marker, 1 = IC2-DNA-Fragment
(132 bp), 2 = KHV-Fragment (78 bp), 3 =
multiplex amplifiziertes KHV und IC2-Fragment.
Im Laufe der Amplifikation dieser Fragmente
entsteht die jeweils spezifische Fluoreszenz, die
während der real-time PCR gemessen wird.
100 bp
M
1
2
M
3
M
Dafür wurden die Primer EGFP-1-F und EGFP-2-R ausgewählt. Es wurde die passende
Sonde EGFP-HEX-IC2 verwendet, die am 5´-Ende den Reporterfarbstoff HEX (Hexachloro6-Carboxyfluorescein) und am 3´-Ende den Quencher BHQ1 (black hole quencher 1) trägt.
Ferner wurde eine geringere Konzentration des IC2-Primermixes gewählt, um ebenfalls auf
der Basis der Primerverfügbarkeit abzusichern, dass die Sensitivität des KHV-Nachweises
durch die gleichzeitige Vervielfältigung des IC-Fragmentes nicht vermindert wird. Die
Reaktionsansätze und die Temperaturprofile für single und multiplex assay sind in 3.6.2
beschrieben. Die Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide befinden sich in Tabelle 7
(Anhang, 9.1.3).
4.1.3
Sensitivität
4.1.3.1 Analytische Sensitivität
Durch Verwendung von DNA-Standards mit 100 bis 1010 Molekülen positiver KontrollDNA/Reaktion wurde eine analytische Sensitivität von 10 Kopien positiver KontrollDNA/Reaktion bestimmt, wobei der assay Linearität über einen Bereich von 10 log10-Stufen
zeigte. Es wurde eine PCR-Effizienz von 107,1 % nachgewiesen, die von der Steigung -3,162
der Standardkurve widergespiegelt wird. Der Korrelationskoeffizient RSq betrug 1,0
78
(Abbildung
7).
Wiederholt
untersuchte
Standardverdünnungsreihen
wiesen
gering
schwankende PCR-Effizienzen von 99,3 bis 107,1 % mit Steigungen von -3,162 bis -3,338
und bei Korrelationskoeffizienten RSq von 0,997 bis 1,000. Der eingestellte positive Standard
von 1 Kopie/Reaktion wurde nicht in jeder Wiederholung detektiert.
79
Abbildung 7 Analytische Sensitivität der real-time PCR für KHV Amplifikationsgraphen (oberes Bild) und
Standardkurve (unteres Bild) nach real-time PCR einer log10-Verdünnungsreihe positiver Kontroll-DNA von
1010 bis 100 Kopien/Reaktion. Im oberen Bild sind die Zyklen des real-time PCR-Laufes (x-Achse) gegen
gemessene Fluoreszenz (y-Achse) aufgetragen. Im unteren Bild sind die absolute Kopienzahlen (x-Achse) gegen
den von der jeweiligen Probe erreichten Schwellenwert = Ct-Wert (y-Achse) aufgetragen, woraus eine
Standardkurve mit entsprechenden Parametern errechnet wurde.
80
Die diagnostische Sensitivität der quantitativen multiplex real-time PCR wurde im
Zusammenhang mit dem Infektionsversuch (4.2.2) ausgewertet, außerdem wurde unter
4.1.3.3 die Sensitivität vergleichend mit konventionellen und nested PCRs untersucht.
4.1.3.2 Sensitivität des single und multiplex real-time PCR assays
Der single real-time PCR assay zur alleinigen Detektion von KHV wurde mit dem multiplex
real-time PCR assay (gleichzeitigen Detektion von KHV und der internen Kontroll-DNA)
verglichen, um festzustellen, ob die zusätzlichen Inhaltsstoffe der multiplex real-time PCR die
Reaktionen negativ beeinflussen und ob die Koamplifizierung der IC2-DNA die Sensitivität
der KHV-Detektion verringert. Außerdem wurde geprüft, ob große Mengen an KHV-DNA
ihrerseits die Amplifikation der IC2-DNA verhindern.
Dafür wurde zunächst die positive Kontroll-DNA (externe Standards) und die DNA aus
Nierengewebe von Spiegelkarpfen, die mit dem israelischen KHV-Isolat infiziert waren,
genutzt. Letztere wurde mit und ohne IC2 extrahiert. Die jeweilige IC2-freie DNA wurde in
log10-Verdünnungsstufen im single und multiplex assay eingesetzt. Single und multiplex assay
zeigten jeweils die in 4.1.3.1 beschriebene analytische Sensitivität von 10 Molekülen/
Reaktion (Abbildung 8), eine Kopie/Reaktion wurde mit beiden Methoden nicht in jeder
Wiederholung detektiert.
Abbildung 8 Sensitivität des single und multiplex real-time PCR assays ohne Koamplifikation von IC2DNA im multiplex assay
Dargestellt sind die Graphen von einer log10-Verdünnungsreihe der positiven Kontroll-DNA (1010 bis 101
Kopien/Reaktion) in der single (Quadrate) und multiplex (Kreise) real-time PCR.
81
Den Verdünnungsstufen der IC2-freien DNA wurden außerdem im single und im multiplex
assay als zusätzliches template 2,5 µl IC2-DNA (4 x 104 Kopien/µl) hinzugefügt, was der
maximalen Endkonzentration an IC2-DNA in den templates zu untersuchender Proben
entsprach. So wurde immer die selbe Menge IC2-DNA mit verschiedenen Mengen an KHVDNA im multiplex assay koamplifiziert, während im single assay nur KHV amplifiziert
wurde. Die Ct-Werte für die KHV-spezifische Fluoreszenz der jeweiligen Verdünnungsstufe
entsprachen einander im single und im multiplex assay, ebenso wurde mit Koamplifizierung
von IC2 im multiplex assay das selbe Detektionslimit für KHV-spezifische Fluoreszenz wie
im single assay bestimmt (Abbildung 9).
u
10-4
Abbildung 9 Sensitivität des single und multiplex real-time PCR assays mit Koamplifikation von IC2-DNA
im multiplex assay Amplifikationsgraphen für single und multiplex assay einer log10-Verdünnungsreihe KHVDNA (Niere, unverdünnt (u) bis 10-4). Jeder single und multiplex Reaktionsansatz enthielt als zusätzliches
template IC2-DNA (105 Kopien). In der jeweiligen Verdünnungstufe wird KHV in beiden assays sehr ähnlich
angezeigt und beide assays haben das gleiche Detektionsminimum. Im multiplex assay wurde IC2-DNA
koamplifiziert und in jeder Probe gleichmäßig detektiert. schwarze Graphen = Fluoreszenz für KHV (FAM);
Kreis = multiple assay, Quadrat = single assay; graue Graphen = Fluoreszenz für IC2 (HEX) im multiplex assay
Der multiplex Reaktionsansatz behindert die KHV-Amplifikation nicht, somit entsteht durch
die Koamplifizierung kein Sensitivitätsverlust der KHV-Detektion.
Andererseits konnte festgestellt werden, dass auch bei bis zu 1010 Molekülen/Reaktion des
positiven KHV Standards die zugefügte IC2-DNA stabil wie in den geringer belasteten
Proben des externen Standards und des Nierengewebes bei Ct-Werten von etwa 25 - 26
amplifiziert wurde (Abbildung 10).
82
Abbildung 10 Koamplifikation der internen Kontrolle bei hoher KHV-DNA-Last Die Graphen zeigen die
Koamplifizierung von log10-Verdünnungsstufen von positiver Kontroll-DNA (1010 bis 107 Kopien/Reaktion) und
jeweils 105 Kopien/Reaktion IC2-DNA. schwarze Graphen = Fluoreszenz für KHV (FAM); graue Graphen =
Fluoreszenz für IC2 (HEX)
4.1.3.3 Sensitivität im Vergleich zur konventionellen PCR bzw. nested PCR
Zur Überprüfung der diagnostischen Sensitivität der multiplex real-time PCR im Vergleich
zur konventionellen und zur nested PCR wurden 4 verschiedene Isolate mit 5 konventionellen
und einer nested PCR untersucht. Zwei englische (F1045, F1046), ein israelisches (X 270 D)
und ein deutsches (DF 29/03-1663) Isolat für KHV aus dem NRL für KHV wurden in log10Stufen verdünnt eingesetzt. Als template wurden jeweils 5 µl der gleichen 8
zusammenhängenden
Verdünnungsstufen eines Isolates verwendet. Die Ergebnisse der
Sensitivitätsüberprüfung sind in Tabelle 2 zusammenfassend dargestellt, in Abbildung 11 und
Abbildung 12 sind die agarosegelelektrophoretischen Darstellungen der konventionellen und
nested PCRs und die Graphen der multiplex real-time PCR für die KHV-spezifische
Fluoreszenz abgebildet.
Ein Alignment von allen verwendeten KHV-spezifischen Sequenzen (Tabelle 7, Anhang
9.1.3) mit den 3 vollständig sequenzierten KHV-Genomen ergab eine 100 %ige Homologie
aller real-time, nested und konventionellen PCR-Primer und der Sonde, mit Ausnahme des
CNGV-652-Primers, der mit jedem der 3 Isolate nur zu 80 % übereinstimmt, nämlich mit 17
von 21 Nukleotiden. Detaillierte Angaben zu dem Sequenz-Alignment der Primer und Sonden
mit den vollständig sequenzierten Isolaten KHV-U und KHV-I (AOKI et al. 2007) finden sich
in Tabelle 8 (Anhang 9.1.3) wieder.
83
4 PCRs detektierten die Isolate mit hoher Sensitivität. Sie zeigten von allen Isolaten die
höchste noch detektierte oder die nächst niedrigere Verdünnungsstufe an. Bei diesen PCRVerfahren handelte es sich um die multiplex real-time PCR, die Bercovier-TK-PCR, die
CNGV-PCR und die nested PCR. Die höchste, mit der multiplex real-time PCR noch
detektierte Verdünnungsstufe entsprach bei den Isolaten F1045, F1046 und DF 29/03-1663
dem Bereich von 1 - 3 Kopien/Reaktion, beim Isolat X 270 D wurden 11 Kopien/Reaktion in
der letzten noch detektierten Verdünnungsstufe gemessen.
In Tabelle 2 wird zusammenfassend dargestellt, welche Verdünnungsstufen noch detektiert
werden konnten. Das Isolat F1045 wurde nur von der multiplex real-time PCR in der höchsten
Verdünnung detektiert. Die Isolate F1046 und DF 29/03-1663 wurden von der multiplex realtime PCR, der Bercovier-TK-PCR, der CNGV-PCR und der nested PCR in der höchsten noch
detektierten Verdünnungsstufe erkannt. Das Isolat X 270 D wurde von der Bercovier-PCR
und der CNGV-PCR in der höchsten noch detektierten Verdünnungsstufe angezeigt. Alle
Isolate wurden ebenfalls unverdünnt als template eingesetzt und waren ebenfalls in allen
PCRs positiv. Die CNGV-PCR und die nested PCR amplifizieren eine zusätzliche
unspezifische Bande (Abbildung 11), wenn Konzentrationen an KHV-DNA eingesetzt
werden, die eine sehr hohe Amplifikatmenge zur Folge hatten.
In der multiplex real-time PCR wurde der jeweiligen Verdünnungsstufe entsprechend
ebenso Fluoreszenz für HEX, dem Signal für amplifizierte interne Kontrolle, gemessen.
Außerdem wurden als weitere Probe 5 µl der IC2-DNA (4 x 104 Kopien/µl) in jeder PCR als
template eingesetzt. Die Wasserkontrollen aller PCRs und auch IC2-DNA waren negativ für
KHV-spezifische Fluoreszenz in der real-time PCR bzw. es wurde keine Banden in erwarteter
KHV-spezifischer Höhe in den konventionellen und der nested PCR gefunden.
84
Tabelle 2 Sensitivität der unterschiedlichen PCR Verfahren im Vergleich (Zusammenfassung)
Isolat
F1045
F1046
X 270 D
DF
29/03 –
1663
PCR
Bercovier-TK
CNGV
Gilad
nested
Gray-Bam-HI- 6
Gray-SphI-improved
multiplex real-time
PCR
-5
-5
-2
-5
-3
-5
-6
-5
-5
-2
-5
-3
-4
-5
-7
-7
-4
-6
-5
-6
-6
-7
-7
-4
-7
-5
-6
-7
4 KHV-Isolate wurden in log10-Schritten verdünnt (-3 = Verdünnungsstufe 10-3 usw.) und in den verschiedenen
konventionellen PCRs, der nested PCR und der multiplex real-time PCR vergleichend untersucht. Es wurde
immer die Verdünnungsstufe angegeben, die mit dem entsprechenden PCR-Verfahren als Letzte positiv für
KHV erkannt wurde. Die ausführliche graphische Darstellung findet sich in Abbildung 11 und Abbildung 12
wieder.
85
Bercovier-TK PCR
CNGV-PCR
M -1 -2 -3 - 4 -5 -6 -7 -8 M -1 -2 - 3 - 4 -5 - 6 -7 - 8 M NTC
F1045
X 270 D
F1046
DF 29/03 –1663
M -1 -2 -3 - 4 -5 -6 -7 -8 M -1 -2 - 3 - 4 -5 - 6 -7 - 8 M NTC
F1045
F1046
X 270 D
DF 29/03 –1663
M -2 -3 -4 -5 - 6 -7 - 8 -9 M -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9-10 M IC2
M -2 -3 -4 -5 - 6 -7 - 8 -9 M -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10 M IC2
Gilad-PCR
nested-PCR
M -1 -2 -3 - 4 -5 -6 -7 -8 M -1 -2 - 3 - 4 -5 - 6 -7 - 8 M NTC
F1045
X 270 D
F1046
DF 29/03 –1663
M -2 -3 -4 -5 - 6 -7 - 8 -9 M -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9-10 M IC2
M -1 -2 -3 - 4 -5 -6 -7 -8 M -1 -2 - 3 - 4 -5 - 6 -7 - 8 M NTC
F1045
X 270 D
F1046
DF 29/03 –1663
M -2 -3 -4 -5 - 6 -7 -8 -9 M -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9-10 M IC2
Gray-BAM-HI-6-PCR
Gray-SphI-improved-PCR
M -1 -2 -3 - 4 -5 -6 -7 -8 M -1 -2 - 3 - 4 -5 - 6 -7 - 8 M NTC
M -1 -2 -3 - 4 -5 -6 -7 -8 M -1 -2 - 3 - 4 -5 - 6 -7 - 8 M NTC
F1045
X 270 D
F1046
DF 29/03 –1663
M -2 -3 -4 -5 - 6 -7 - 8 -9 M -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9-10 M IC2
F1045
X 270 D
F1046
DF 29/03 –1663
M -2 -3 -4 -5 - 6 -7 - 8 -9 M -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9-10 M IC2
Abbildung 11 Sensitivität der konventionellen und nested PCRs im PCR-Vergleich 4 Isolate (F1045,
F1046, X 270 D, DF 29/03-1663) wurden in 8 aufeinander folgenden log10-Verdünnungsstufen titriert eingesetzt.
Die jeweils niedrigste Verdünnungsstufe war 10-1, 10-2 bzw. 10-3 (-1, -2 bzw. -3). Verglichen wurden die
Bercovier-TK-PCR, die CNGV-PCR, die Gilad-PCR, die nested-PCR, die Gray-BAM-HI-6-PCR und die GraySphI-improved-PCR.
86
-1 -2 -3 -4 -5 -6
-2 -3 -4 -5 -6
-1 -2 -3 -4
-5
-3 -4 -5 -6 -7
Abbildung 12 Sensitivität der multiplex real-time PCR im PCR-Vergleich 4 Isolate (F2345, F2346, X 270
D, DF 29/03-1663) wurden in 8 aufeinander folgenden log10-Verdünnungsstufen titriert eingesetzt. Die jeweils
niedrigste Verdünnungsstufe war 10-1, 10-2 bzw. 10-3 (-1, -2 bzw. -3). Es werden die Graphen für die KHVspezifische Fluoreszenz in den Proben dargestellt.
4.1.4
Spezifität
Um die Spezifität der multiplex real-time PCR zu testen, wurde DNA aus verschiedenen
Proben isoliert und als template in der real-time PCR eingesetzt. Es konnte bestätigt werden,
dass die DNA aus Zellkulturen, die mit 4 englischen KHV Isolaten, einem deutschen und
einem israelisches KHV-Isolat infiziert waren, hoch mit KHV-Genom belastet waren. Alle
konnten mit Ct-Werten zwischen 14 und 20 erkannt werden. Infizierte Zellkulturen eines
Aalherpesvirus-Isolates und eines englischen CyHV-1-Isolats (Karpfenpocken) wurden in der
87
real-time PCR nicht erkannt. Einzelheiten zu den Viren finden sich in Tabelle 6 (Anhang,
9.1.1). Auch in der DNA von nicht infizierten Zellen (CCB) und in diversen Organ und
Körperflüssigkeiten (Nullproben des Infektionsversuches: Kieme, Niere, Gehirn, Darm, Haut,
Herz, Leber, Muskel, Serum, Kiemenabstrich und PBL bzw. Kieme, Niere, Milz, Darm und
Gehirn) von adulten bzw. juvenilen KHV-negativen SPF-Spiegelkarpfen wurde keine KHVGenom-spezifische Fluoreszenz gemessen. Wurde die IC2-DNA (1 x 106 und 1 x 105 Kopien)
als template im single assay für KHV verwendet, so konnte keine KHV-spezifische
Fluoreszenz gemessen werden.
4.2
Untersuchungen zum direkten Nachweis von Koi-Herpesvirus in akut erkrankten
sowie
rekonvaleszenten
juvenilen
und
adulten
experimentell
infizierten
Spiegelkarpfen
4.2.1
Klinik
4.2.1.1 Adulte Karpfen
Bei allen adulten Karpfen der infizierten Gruppen traten im Zeitraum vom 3. bis zum 28. Tag
p.i. klinische Symptome einer KHV-Infektion auf. 14 Tage nach der Infektion zeigten die
Karpfen eine abnehmende Symptomatik, welche bis zum 28. Tag vollständig ausheilte. Die
klinischen Anzeichen bestanden aus eingesprosste Gefäßen sowie flächigen Blutungen in der
Haut in zunehmendem Maße. Zudem wurde von den Karpfen vermehrt Schleim gebildet und
es entstanden Nekrosen am Flossensaum.
Gegen Ende des ersten Monats nach der Infektion hatten sich alle Symptome bei den
Karpfen wieder zurückgebildet, alle verbliebenen adulten Karpfen waren rekonvaleszent.
Die beiden Gruppen der 5 x 104 KID50-Infektionsdosis hatten stärker ausgeprägte
Symptome als die Gruppen der 5 x 103 KID50-Infektionsdosis. Der Verlauf und die
Symptomatik waren jedoch gleich. Fraß- und Schwimmverhalten der Karpfen war über den
gesamten Zeitraum der Infektion hinweg unauffällig. Es trat keine Mortalität auf.
Alle adulten Karpfen der beiden Kontrollgruppen zeigten keine klinischen Anzeichen einer
KHV-Infektion. Die Hautoberfläche der Karpfen war über den ganzen Versuch hinweg intakt
und ohne Blutungen. Schwimm- und Fraßverhalten waren unbeeinträchtigt. Es trat in keinem
der beiden Kontrollbecken Mortalität auf.
88
4.2.1.2 Juvenile Karpfen
Die juvenilen, infizierten Karpfen zeigten über den Versuchszeitraumzeitraum von 56 Tagen
hinweg vereinzelt Schleimhautschäden der Haut. Innerhalb jeder infizierten Gruppe
kümmerten einige Karpfen leicht. Alle Karpfen bis auf eine Ausnahme fraßen und
schwammen unauffällig und unbeeinträchtigt, auch in den 3 von 4 Becken, in denen es zu
Todesfällen kam, wurde bis zum Tod der betroffenen Individuen ein unbeeinträchtigtes
Verhalten beobachtet.
In Becken 17 (Infektionsdosis 5 x 103 KID50/ml) trat keine Mortalität auf. In Becken 18, in
dem ebenfalls mit 5 x 103 KID50/ml infizierte Karpfen gehältert wurden, starben 4 der 6
Karpfen an den Tagen 12, 28, 33 und 53 p.i.. Ein Karpfen dieses Beckens wurde an Tag 49
p.i. moribund getötet, nachdem sich über 3 Tage hinweg zentralnervöse Störungen in Form
von Schwimmen in Schieflage so entwickelten, dass der Karpfen an Tag 49 p.i. nichts mehr
fraß und sich nicht mehr gezielt fortbewegen konnte.
In beiden Becken der 5 x 104 KID50-Infektionsdosis kam es ebenfalls zu Todesfällen. In
Becken 19 starben 4 von 6 juvenilen Karpfen an Tag 12, 14, 15 und 16 p.i.. In Becken 20
starben ebenfalls 4 von 6 juvenilen Karpfen an Tag 12, 20, 21 und 23 p.i..
Mit Ausnahme des moribund getöteten Karpfens konnten bei allen gestorbenen Karpfen im
Vorhinein keine Beobachtung gemacht werden, die am Folgetag einen Todesfall hätte
vermuten lassen. Die Karpfen starben subakut und lediglich mit den oben beschriebenen,
vereinzelt aufgetretenen leichten Beeinträchtigungen der Hautoberfläche.
Alle juvenilen Karpfen der Kontrollgruppen zeigten keine klinischen Anzeichen einer
KHV-Infektion. Die Hautoberfläche der Karpfen war über den ganzen Versuch hinweg intakt.
Schwimm- und Fraßverhalten waren unbeeinträchtigt. Es trat in keinem der beiden
Kontrollbecken Mortalität auf.
89
4.2.2
Nachweis von Virusgenom - Diagnostische Sensitivität der multiplex real-time PCR
zum Nachweis von KHV im Infektionsversuch zur Untersuchung der Pathogenese der
Koi-Herpesvirus-Infektion
4.2.2.1 Adulte Spiegelkarpfen
Von den adulten Spiegelkarpfen wurden in regelmäßigen Abständen Proben genommen. Bei
allen adulten, infizierten Spiegelkarpfen wurden in mindestens einer Probe Virusgenom mit
der multiplex real-time PCR detektiert, wobei meist alle beprobten Organe und
Körperflüssigkeiten positiv waren, wie in Tabelle 3 zusammenfassend gezeigt wird.
10 von 96 Proben der adulten, infizierten Karpfen waren negativ. Dabei handelte es sich
entweder um ein Probenmaterial mit oftmals geringer Viruslast (Kiemenabstriche), um
Proben eines Tieres im Anfangsstadium der Infektion oder um Probenmaterial eines
rekonvaleszenten, also klinisch unauffälligen Tieres, bei dem in allen anderen untersuchten
Organen wenig oder gar kein KHV-Genom nachweisbar war (quantitative Auswertung unter
4.2.3). In den Proben der Karpfen mit der niedrigeren Infektionsdosis wurden mehr negative
Ergebnisse gefunden als in den Proben der Karpfen mit der höheren Infektionsdosis. Alle 48
Proben der 12 adulten Kontrollkarpfen waren in der quantitativen multiplex real-time PCR
negativ für KHV (4.2.3.4).
90
Tabelle 3 Diagnostische Sensitivität der multiplex real-time PCR adulte, infizierte Karpfen
adulte,
infizierte
Spiegelkarpfen
Tag 7 p.i.
Tag 14 p.i.
Tag 21 p.i.
Tag 28 p.i.
Tag 42 p.i.
Tag 56 p.i.
5 x 103 KID50
B 17 B18
B17
B18
B17
B18
B17
B18
B17
B18
B17
B18
Niere
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
Kieme
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
Kiemenabstrich
-
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
PBL
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
B19
B20
B19
B20
B19
B20
B19
B20
B19
B20
5 x 104 KID50
B19 B20
Niere
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Kieme
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Kiemenabstrich
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
PBL
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Der Nachweis von KHV-Genom in 4 Organen/Körperflüssigkeiten eines Spiegelkarpfens zu definierten
Beprobungszeitpunkten (Tag 7, 14, 21, 28, 42, 56 p.i.) bei 2 unterschiedlichen Infektionsdosen (1 h in 5 x 103
KID50 und 5 x 103 KID50/ml im Bad). Pro Tag wurden 4 infizierte Karpfen untersucht. B (17, 18, 19, 20) =
Beckenangabe, + = positiv für KHV in der multiplex real-time PCR, - = negativ für KHV in der multiplex realtime PCR
4.2.2.2 Juvenile Spiegelkarpfen
Die juvenilen Spiegelkarpfen wurden bis zu ihrem Tod oder bis zum Ende des
Infektionsversuchs gehältert. Ein infiziertes Tier musste vorzeitig moribund getötet. Die
überlebenden Karpfen wurden an Tag 56 p.i. getötet. Alle Ergebnisse der juvenilen,
infizierten Spiegelkarpfen werden in Tabelle 4 zusammenfassend dargestellt. Der moribund
getötete Spiegelkarpfen und alle vorzeitig gestorbenen juvenilen, infizierten Spiegelkarpfen
waren positiv für KHV in der multiplex real-time PCR. Von den überlebenden Spiegelkarpfen
waren alle Karpfen der höheren Infektionsdosis und 2 der niedrigeren Infektionsdosis positiv.
Die 5 negativen Ergebnisse, die gefunden wurden, waren alle von Proben der überlebenden,
infizierten Karpfen der niedrigeren Infektionsdosis.
Alle 12 Proben der 12 juvenilen Kontrollkarpfen waren in der quantitativen multiplex realtime PCR negativ für KHV (4.2.3.4).
91
Tabelle 4 Diagnostische Sensitivität der multiplex real-time PCR: juvenile, infizierte Karpfen
juvenile, infizierte Karpfen
5 x 103 KID50
Tag p.i.
Homogenat
B 17
B 18
ü
56
ü
56
ü
56
ü
56
ü
56
ü
56
tot
14
tot
28
tot
33
m
49
tot
53
ü
56
-
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
5 x 104 KID50
B 19
B 20
Tag p.i.
tot
12
tot
14
tot
15
tot
16
ü
56
ü
56
tot
12
tot
20
tot
21
tot
23
ü
56
ü
56
Homogenat
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Der Nachweis von KHV-Genom aus Kiemen- und Nierengewebs-Homogenat juveniler Spiegelkarpfen bei 2
unterschiedlichen Infektionsdosen (1 Stunde in 5 x 103 KID50 und 5 x 104 KID50/ml im Bad).
B (17, 18, 19, 20) = Beckenangabe, tot = gestorben an, ü = hat überlebt bis Versuchsende am Tag 56 p.i., m =
moribund getötet. + = positiv für KHV in der multiplex real-time PCR, - = negativ für KHV in der multiplex
real-time PCR
4.2.3
Quantitativer Nachweis und Verteilung der Virusgenomlast
4.2.3.1 Adulte infizierte Karpfen – alle Einzeltiere im Vergleich
Von den adulten infizierten Karpfen wurde Nieren- und Kiemenmaterial sowie
Kiemenabstriche und PBL untersucht. Die Verteilung der Genomlast aller 4 Proben im
Einzelkarpfen ist in Abbildung 13 und Abbildung 14 nach Infektionsdosen und Becken
getrennt dargestellt. Der Angabe Kopien/Reaktion (real-time PCR) entspricht beim Gewebe
einer absoluten Belastung von Kopien/2mg Gewebe. Analog dazu bedeutet die Angabe beim
Kiemenabstrich die absolute Kopienbelastung in einem Zehntel des Kiemenabstrichs und bei
den PBL die absolute Kopienbelastung von 1 x 106 Leukozyten (3.6.2).
Im gesamten Versuchszeitraum von 56 Tagen wurden in den Proben aller adulten
infizierten Karpfen Genomlasten von 0 Kopien/Reaktion bis hin zu 5,6 x 105
Kopien/Reaktion nachgewiesen. Die Genomlast der unterschiedlichen Probenmaterialien des
jeweiligen Einzeltiers schwankte fast immer innerhalb von 2 log10-Stufen oder weniger. Nur
in einem Karpfen der niedrigeren Infektionsdosis aus Becken 18 an Tag 7 p.i. schwanken die
Werte innerhalb von 4 log10-Stufen: der niedrigste Wert liegt bei 0 Kopien im Kiemenabstrich
92
und Werten bei 10 Kopien/Reaktion für Kieme und PBL verglichen mit dem Wert für das
Nierengewebe des selben Karpfens von 1,1 x 104 Kopien/Reaktion.
Die beiden Karpfen der niedriger infizierten Gruppen von Tag 7 p.i. enthielten mit
Ausnahme der Niere in allen Organen sehr wenig nachweisbare KHV-DNA: weniger als 42
Kopien/Reaktion. Im Nierengewebe dieser Karpfen sind dagegen 2,1 x 102 und die schon
genannten 1,1 x 104 Kopien/Reaktion gefunden worden. In den beiden höher infizierten
Karpfen enthielten die Proben von Tag 7 p.i. mindesten 87 Kopien/Reaktion und außerdem
den höchsten Wert aller Proben von 5,6 x 105 Kopien pro Reaktion in einem Kiemenabstrich.
An Tag 14 p.i. findet sich in den Geweben beider Infektionsgruppen eine ähnlich hohe
Genomlast an KHV-DNA. In allen 16 Proben der 4 untersuchten Karpfen wurden mindestens
86 Kopien/Reaktion und bis zu 5,03 x 104 Kopien/Reaktion detektiert.
Von der dritten Woche p.i. an konnte mit einer Ausnahme (Becken 17, Tag 28 p.i.) eine
Abnahme der nachgewiesenen Menge an KHV-DNA in allen Organen der Karpfen beider
Infektionsdosen festgestellt werden. Außer der genannten Ausnahme konnte in Proben aller
infizierten Karpfen vom 21. Tag p.i. an nie mehr als 3,97 x 102 Kopien KHV-DNA
nachgewiesen werden. Mit zunehmender Rekonvaleszenz ging ebenfalls einher, dass nur noch
geringe oder gar keinen Unterschiede mehr zwischen den Karpfen beider Infektionsdosen
festgestellt werden konnten. In allen Proben des zweiten Monats wurde in jedem Organ und
jeder Körperflüssigkeit nur noch deutlich weniger als 100 Kopien/Reaktion (70 Kopien oder
weniger) gefunden.
93
Abbildung 13 Genomlast der adulten Einzeltiere, 5 x 103 KID50-Infektionsdosis Becken, 17 (oberes Bild)
und Becken 18 (unteres Bild) Je Einzeltier werden 4 Proben (Niere, Kieme, Kiemenabstrich und PBL)
dargestellt. Jede Balkengruppe entspricht einem an Tag 7, 14, 21, 28, 42 oder 56 p.i. entnommenen Karpfen.
94
Abbildung 14 Genomlast der adulten Einzeltiere, 5 x 104 KID50-Infektionsdosis, Becken 19 (oberes Bild)
und Becken 20 (unteres Bild) Je Einzeltier werden 4 Proben (Niere, Kieme, Kiemenabstrich und PBL)
dargestellt. Jede Balkengruppe entspricht einem an Tag 7, 14, 21, 28, 42 oder 56 p.i. entnommenen adulten
Karpfen.
95
4.2.3.2 Adulte infizierte Karpfen - Genomlast der einzelnen Organe
In Abbildung 15 bis Abbildung 18 (4.2.3.2.1-4) sind die Genomlasten jedes einzelnen
Probenmaterials dargestellt. Je Beprobungstag werden die unterschiedlich hoch infizierten
Karpfen zusammen gezeigt. Diese Abbildungsvariante stellt deutlicher als die Übersichten
heraus, wie erfolgreich und zuverlässig jedes einzelne Probenmaterial im Nachweis für KHVDNA war.
Im ersten Monat der Infektion wurde im Nierengewebe am durchschnittlich höchsten und
kontinuierlichsten KHV-DNA in allen infizierten Karpfen nachgewiesen. Im zweiten Monat
konnte in allen Geweben nur noch wenig KHV-DNA nachgewiesen werden. Hier zeigten die
PBL den durchschnittlich höchsten Nachweis, der höchste aber auch der niedrigste Wert fand
sich im Nierengewebe mit 70 und 0 Kopien/Reaktion.
4.2.3.2.1 Niere
Wie in Abbildung 15 erkennbar, waren die Nieren beider Infektionsgruppen zu jeweils
gleichen Zeitpunkten ähnlich belastet. Es lässt sich keine höhere Belastung in den höher
infizierten Karpfen feststellen. Die Ausnahme bilden Tag 7 und Tag 56 p.i., wobei es sich an
Tag 56 nur um einen geringen Unterschied im Bereich von 20 Kopien handelt. Im Gegensatz
zu den anderen 3 Probenarten konnten an Tag 7 p.i. in den Becken der niedrigeren
Infektionsdosis mehr als 100 Kopien/Reaktion nachgewiesen werden (213 und 11030
Kopien/Reaktion). Die Belastung der Niere mit KHV-Genom nahm über die Zeit hinweg von
einer mittleren bis hohen Anfangsbelastung in den verschiedenen Karpfen kontinuierlich ab.
96
Abbildung 15 Genomlast des Nierengewebes aller adulten infizierten Spiegelkarpfen Von jedem Einzeltier
ist nur der Wert für das Nierengewebe aufgetragen. Eine Balkengruppe entspricht den Nierenwerten der je 4
entnommenen Karpfen pro Beprobungstag. B = Becken, B17 und B18 = 5 x 103 KID50-Infektionsdosis, B19 und
B20 = 5 x 104 KID50-Infektionsdosis
In den ersten beiden Wochen waren die Karpfen in einem Bereich von 2,13 x 102 bis 8,56 x
104 Kopien/Reaktion belastet. In der dritten und vierten Woche schwankten die Genomkopien
KHV mit einer Ausnahme an Tag 28 p.i. in Becken 17 zwischen 10 und 2,78 x 102
Kopien/Reaktion. Im 2. Monat war an Tag 56 p.i. eine Probe aus Becken 17 negativ. An Tag
42 und Tag 56 p.i. schwankten die Werte insgesamt zwischen 0 und 70 Kopien, die meisten
Werte liegen bei ca. 10 Kopien/Reaktion.
4.2.3.2.2 Kieme
In Abbildung 16 wird die Genomlast aller Kiemengewebe dargestellt. Es konnten an Tag 7
und an Tag 14 p.i. Unterschiede zwischen den Infektionsgruppen gemessen werden, die
besonders an Tag 7 sehr groß waren: Während sich im Gewebe der niedriger infizierten
Karpfen 0 und 10 Kopien nachweisen ließen, konnte in den höher infizierten Karpfen 3,2 x
102 und 5,65 x 103 Kopien/Reaktion gemessen werden. In der zweiten Woche waren die
Kiemen der Karpfen der niedrigeren Infektionsdosis beide mit über 2 x 103 Kopien/Reaktion
belastet, die Karpfen der höher infizierten Gruppen hatten Werte über 1 x 104
97
Kopien/Reaktion. Danach konnten ebenso wie in der Niere keine wesentlichen Unterschiede
in der Belastung des Gewebes zwischen den unterschiedlichen hoch infizierten Karpfen mehr
festgestellt werden.
Abbildung 16 Genomlast des Kiemengewebes aller adulten infizierten Spiegelkarpfen Von jedem Einzeltier
ist
nur der Wert
für das Kiemengewebe
aufgetragen.
Balkengruppe
entspricht
den Kiemenwertenwerten
der
Abbildung
16 Genomlast
des Kiemengewebes
allerEine
adulten
infizierten
Spiegelkarpfen
Von jedem Einzeltier
3
je
entnommenen
pro Beprobungstag.
B = Becken,
B17 und B18
= 5 x 10den
KID
ist4nur
der Wert fürKarpfen
das Kiemengewebe
aufgetragen.
Eine Balkengruppe
entspricht
Kiemenwertenwerten
der
50-Infektionsdosis, B19
je 4 B20
entnommenen
Karpfen
pro Beprobungstag. B = Becken, B17 und B18 = 5 x 103 KID50-Infektionsdosis, B19
und
= 5 x 104 KID
50-Infektionsdosis
und B20 = 5 x 104 KID50-Infektionsdosis
In der dritten und vierten Woche schwanken die Werte mit einer Ausnahme an Tag 28 p.i. in
Becken 17 nur noch von 0 bis 1,44 x 102 Kopien KHV-DNA. Im zweiten Monat an Tag 42
und Tag 56 p.i. schwanken die Werte zwischen 0 und 30 Kopien KHV-DNA im
Kiemengewebe, fast alle Werte liegen hier unter 10 Kopien KHV-DNA. 3 Proben des
Kiemengewebes der niedriger infizierten Karpfen waren an Tag 7, 28 und 56 p.i. negativ.
4.2.3.2.3 Kiemenabstriche
In den Kiemenabstrichen zeigte sich ein ähnliches Bild wie im Kiemengewebe, was in
Abbildung 17 dargestellt wird. Während beide Kiemenabstriche der niedriger infizierten
Karpfen an Tag 7 p.i. negativ waren, und der höher infizierte Karpfen an Tag 7 p.i. aus
Becken 20 nur einen Wert von 87 Kopien/Reaktion aufwies, ergab der Kiemenabstrich des
98
anderen höher infizierten Karpfen aus Becken 19 den höchsten Wert aller Proben der adulten
Karpfen von 5,6 x 105 Kopien. Am 14. Tag p.i. konnte in allen Karpfen KHV-DNA
nachgewiesen werden, die Werte schwanken zwischen 86 und 1,8 x 104 Kopien/Reaktion.
Abbildung 17 Genomlast der Kiemenabstriche aller adulten infizierten Spiegelkarpfen Von jedem
Einzeltier ist nur der Wert für den Kiemenabstrich aufgetragen. Eine Balkengruppe entspricht den
Kiemenabstrichwerten der je 4 entnommenen Karpfen pro Beprobungstag. B = Becken, B17 und B18 = 5 x 103
KID50-Infektionsdosis, B19 und B20 = 5 x 104 KID50-Infektionsdosis
Nach der 2. Woche konnte ein Abfallen der messbaren Kopienzahl KHV-DNA festgestellt
werden. Mit einer Ausnahme an Tag 28 p.i. in Becken 17 schwankten die Werte in der dritten
und vierten Woche zwischen 3 Kopien und 51 Kopien/Reaktion. Im zweiten Monat waren 4
Proben negativ, in den anderen 4 Proben konnten nie mehr als 10 Kopien/Reaktion gefunden
werden. Insgesamt sind bei den Kiemenabstrichen 6 Proben verteilt auf die Tage 7, 42 und 56
p.i. negativ für KHV-DNA.
4.2.3.2.4 PBL
Außer an Tag 7 p.i. sind die peripheren Blutleukozyten beider Infektionsdosen ähnlich niedrig
belastet, wie aus Abbildung 18 hervorgeht.
99
Ab dem 21. Tag p.i. konnte nur eine leichte Abnahme der messbaren Kopienzahl KHV-DNA
festgestellt werden. Mit 3 Ausnahmen von höherer Belastung an Tag 7 in Becken 19, Tag 14
in Becken 20 und Tag 28 in Becken 17 konnte im Probenmaterial PBL eher eine
kontinuierliche, niedrige Kopienzahl an KHV-DNA über den gesamten Versuchszeitraum
hinweg gemessen werden. Dabei handelte es sich ohne die Ausnahmen immer um Werte
unter 500 Kopien/Reaktion.
Abbildung 18 Genomlast der PBL aller adulten infizierten Spiegelkarpfen Von jedem Einzeltier ist nur der
Wert für die PBL aufgetragen. Eine Balkengruppe entspricht den PBL-Werten der je 4 entnommenen Karpfen
pro Beprobungstag. B = Becken, B17 und B18 = 5 x 103 KID50-Infektionsdosis, B19 und B20 = 5 x 104 KID50Infektionsdosis
Der höchste Nachweis in PBL gelang an Tag 7 p.i. im höher infizierten Karpfen aus Becken
19 mit 1,11 x 105 Kopien KHV-DNA pro Reaktion. Dieser Karpfen wies auch in den anderen
Probenarten ähnliche oder höhere Belastungen auf. Mit Ausnahme dieser Probe konnten in
der ersten und zweiten Woche in allen untersuchten Karpfen nur 11 bis 1,23 x 103
Kopien/Reaktion nachgewiesen werden. In der dritten und vierten Woche waren mit der
Ausnahme des Karpfens aus Becken 17 an Tag 28 ähnlich der ersten beiden Wochen
zwischen 26 und 3,97 x 102 Kopien und im letzten Monat an Tag 42 und 56 schwanken die
Werte um 3 und 54 Kopien/Reaktion.
100
4.2.3.3 Juvenile infizierte Karpfen
Bei den juvenilen Karpfen wurde ein Homogenat aus Kiemen- und Nierengewebe untersucht.
Während bei den gestorbenen juvenilen Karpfen durchgehend hohe Genomlasten im Gewebe
messbar waren, konnten in den überlebenden juvenilen Karpfen überwiegend niedrige oder
gar keine Kopien KHV-DNA/Reaktion festgestellt werden.
In der Abbildung 19 wird die Genomlast der juvenilen Karpfen aus Becken 18 und 19 (5 x
3
10 KID50/ml-Infektionsdosis) sowie die Genomlast der Karpfen aus Becken 19 und 20 (5 x
104 KID50/ml-Infektionsdosis) zusammenfassend dargestellt. Die Angabe Kopien/Reaktion
(real-time PCR) entspricht einer absoluten Kopienbelastung/1mg Gewebe (3.6.2).
Alle Proben der gestorbenen juvenilen Spiegelkarpfen wiesen unabhängig von der
Infektionsdosis hohe Virusgenomlasten von 3,19 x 104 bis 2,29 x 106 Kopien/Reaktion auf.
Das Gewebe des moribund getöteten Karpfen war mit 1,54 x 103 Kopien/Reaktion belastet.
101
Abbildung 19 Genomlast der juvenilen infizierten Spiegelkarpfen Abgebildet ist die Belastung vom
Gewebehomogenat der juvenilen Karpfen getrennt nach der Infektionsdosis 5 x 103 KID50 (oberes Bild) und 5 x
104 KID50 (unteres Bild). Links befinden sich die Werte für die frühzeitig verstorbenen Karpfen, rechts die Last
der Karpfen, die bis zum Versuchsende überlebten. tot = gestorben, morib = moribund getötet, ü = überlebt
102
Bei den überlebenden Karpfen war nur bei dem juvenilen Karpfen aus Becken 18 (5 x 103
KID50/ml-Infektionsdosis) an Tag 56 p.i. eine sehr hohe Kopienzahl von 5,19 x 105
Kopien/Reaktion Gewebe messbar. In diesem Becken verstarb der letzte von 5 verstorbenen
juvenilen Karpfen an Tag 53 p.i.. Alle 6 juvenilen Karpfen aus Becken 17 (5 x 103 KID50/mlInfektionsdosis) überlebten bis Tag 56 p.i.. In dem Gewebe dieser Karpfen konnte nur in einer
Probe KHV-DNA nachgewiesen werden. Dabei handelt es sich um den Wert von 14,82
Kopien/Reaktion.
Jeweils 2 Karpfen überlebten in den Becken der höheren Infektionsdosis, diese wiesen in
Becken 19 eine Belastung von 6 Kopien und 1,23 x 103 Kopien/Reaktion sowie in Becken 20
eine Belastung von 9 Kopien und 73 Kopien/Reaktion auf.
4.2.3.4 Auswertung
Alle Extraktionskontrollen sämtlicher DNA-Extraktionen und alle Wasserkontrollen der realtime PCR-Läufe zeigten kein KHV-spezifisches, positives Fluoreszenzsignal. Alle Proben
wurden in einem duplizierten Ansatz untersucht.
Vor dem Infektionsversuch wurden diverse Organe und Körperflüssigkeiten von 2 adulten
Geschwistertieren und 2 juvenilen Geschwistertieren der im Versuch eingesetzten
Spiegelkarpfen untersucht. Alle diese Proben waren negativ für KHV. Das Probenmaterial der
12 juvenilen Kontrollkarpfen des Infektionsversuchs war in allen real-time PCR-Läufen
negativ
für
KHV-spezifische
Infektionsversuchs
in
Form
Fluoreszenz.
von
48
Alle
12
adulten
bearbeiteten
Kontrollkarpfen
Organmaterial-
des
bzw.
Körperflüssigkeitsproben waren negativ7, außerdem waren 15 Infektionsversuchsproben der
infizierten Spiegelkarpfen negativ für KHV8. Die Amplifikation der IC zeigte in allen Proben
und deren Extraktionskontrollen Ct-Werte für HEX zwischen 22,3 und 26,9.
7
Es wurden in 2 PBL-Proben von adulten Kontrolltieren schwach positive Ct-Werte über 38 gefunden (ein bzw.
beide Duplikate). Diese DNA-Extraktionen wurden wiederholt und waren in der Wiederholung negativ und
wurden als negativ befundet.
8
Infektionsversuchsproben der infizierten Karpfen, bei denen nur eines von zwei Duplikaten im Ansatz positiv
war, kamen in 6 Fällen bei adulten, infizierten Tieren vor. Hierbei handelte es sich um Ct-Werte von über 38.
Das Gewebe solcher schwach positiver Proben der infizierten Tiere wurde nicht erneut extrahiert sondern in der
Auswertung als negativ erklärt. Es handelte sich dabei um einen Nieren- (Tag 56 p.i. Becken 17), einen
Kiemenwert (Tag 7 p.i. Becken 17) sowie 4 Kiemenabstrichwerte (Tag 7 p.i. Becken 18, 2 x Tag 42 p.i. Becken
18 und 19 und Tag 56 p.i. Becken 19).
103
4.2.4
Elektronenmikroskopischer Virusnachweis
Nieren- und Kiemengewebe (10 %iges (w/v) Gewebehomogenat) wurde elektronenmikroskopisch untersucht (3.12.3.1). Die Ergebnisse des morphologischen Virusnachweises
sind in Tabelle 5 zusammenfassend dargestellt. Von den adulten Karpfen wurden Überstände
von je 2 Karpfen des gleichen Untersuchungstages und der gleichen Infektionsdosis gemischt
und untersucht, die Proben der juvenilen Karpfen wurden pro Becken nach toten und
überlebenden Karpfen zusammengestellt. In Homogenaten des Nierengewebes der adulten,
mit 5 x 104 KID50/ml infizierten Karpfen konnten elektronenmikroskopisch keine
Herpesvirionen nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu ließen sich im Überstand von
gepooltem Kiemen- und Nierenmaterial in einigen Proben der infizierten, juvenilen Karpfen
Herpesvirusnukleokapside nachgewiesen. Dieser morphologische Nachweis von einzelnen,
meist elektronenoptisch "leer" erscheinenden und für Herpesviren typischen Kapsidstrukturen
führte zur Befunderhebung "Herpesvirus" (Abbildung 20).
104
Tabelle 5 Elektronenmikroskopische Untersuchungen
Probe Ergebnis Ursprung
Probentag adulte Spiegelkarpfen, 5 x 104 KID50/ml (Becken)
A
(-)
Tag 7 p.i. (19 + 20)
B
(-)
Tag 14 p.i. (19 + 20)
C
(-)
Tag 21 p.i. (19 + 20)
D
(-)
Tag 28 p.i. (19 + 20)
E
(-)
Tag 42 p.i. (19 + 20)
F
(-)
Tag 56 p.i. (19 + 20)
Probentag juvenile Spiegelkarpfen, 5 x 103 KID50/ml (Becken)
G
(+)
Tag 56 p.i., (17), getötet
H
(+)
Tag 14, 28, 33, 49 (m), 53 p.i., (18), gestorben/ moribund getöteten (m)
I
(-)
Tag 56 p.i., (18), getötet
Probentag juvenile Spiegelkarpfen, 5 x 104 KID50/ml (Becken)
J
(-)
Tag 12, 14, 15 und 16 p.i., (19), gestorben
K
(+)
Tag 56 p.i., (19), getötet
L
(+)
Tag 12, 20, 21, 23 p.i., (20), gestorben
M
(-)
Tag 56 p.i., (20), getötet
(+) = Herpesvirusnukleokapside, (-) = es sind keine Herpesvirusnukleokapside nachweisbar, p.i. = post
infectionem, nach der Infektion
105
Abbildung 20 Herpesvirusnukleokapsid neben Gewebsresten im Negativkontrast (PWS pH 6,0).
Marker = 150 nm, Elektronenmikroskopie Dr. habil Granzow
106
4.2.5
Detektion von Antigen oder infektiösem Virus
Zur Virusreisolierung wurden von jedem adulten Tier Nierengewebe und von jedem juvenilen
Tier
gepooltes
Kiemen-
und
Nierengewebe
10
%ig
in
antibiotikumhaltigem
Zellkulturmedium homogenisiert. Der Überstand wurde im Original und 1:10 verdünnt auf
Zellen verimpft. Es wurden drei Zellpassagen auf CCB-Zellen durchgeführt, bei denen
sowohl bei den infizierten Geweben als auch bei den Geweben der Kontrollkarpfen kein
KHV-typischer CPE auftrat. Das KHV-Virus konnte weder von den adulten noch von den
juvenilen, infizierten Spiegelkarpfen reisoliert werden.
Mittels
indirektem
Immunfluoreszenztest
konnte
kein
KHV-Antigen
in
den
Virusreisolierungspassagen gefunden werden. Bei dem zur positiven Kontrolle verwendeten
Infektionsvirus konnte nur in den Kavitäten der unverdünnten, cpE-aufweisenden Passage
eindeutig Antigen nachgewiesen werden (Abbildung 21).
Abbildung 21 Indirekter Immunfluoreszenztest links: Positivkontrolle, unverdünntes Inokulum
(Infektionsvirus), 20x/0,40 rechts: Negativkontrolle, unverdünntes Inokulum (Organhomogenat von juvenilem
Kontrolltier), 20x/0,40
107
5
DISKUSSION
5.1
Entwicklung eines quantitativen multiplex real-time PCR-Protokolls zum Nachweis
von Koi-Herpesvirus
Die real-time PCR stellt eine Weiterentwicklung der konventionellen PCR dar (MACKAY et
al. 2002). Für den Nachweis von spezifischer KHV-DNA bestand bereits eine real-time PCR
nach GILAD et al. (2004). Mit der vorliegenden Arbeit wurden weitere Daten generiert, um
die Sensitivität und Spezifität der von GILAD et al. (2004) gewählten Sequenzen zu
evaluieren und validieren.
GILAD et al. (2004) verwendeten 2 single assays (dt. einzelne Untersuchungen/
Protokolle), um einerseits spezifisch KHV und andererseits eine Teilsequenz eines
veröffentlichten „single copy gene“ des Nutzkarpfens (PANSERAT et al. 2000)
nachzuweisen. Die Autoren nutzten den Nachweis des „single copy gene“ insofern als interne
Kontrolle, als dass sie die gemessene KHV-DNA-Konzentration in KHV-Genomäquivalente
pro zu 106 Wirtszellen angaben. Es erfolgen keine Angaben, wie viel mg Gewebe den 106
Wirtszellen entsprechen, ferner wurden 20 - 50 mg Ausgangsgewebe verwendet, um die
Daten zu generieren. Durch die Auswertung von GILAD werden die Gewebe untereinander
auf der Basis von gleichen „single copy gene“-Mengen, also gleichen Zellmengen ins
Verhältnis gesetzt. Es bleibt jedoch unklar, wie viel Gewebe für einen Nachweis genutzt
werden soll, wie oder ob eine Inhibition der DNA-Extraktion erkannt werden konnte und wie
groß der jeweilige Umrechnungsfaktor für die KHV-DNA jeder Probe war. Beide Sonden
wurden im Protokoll von GILAD et al. (2004) mit dem Fluoreszenzfarbstoff FAM markiert
und mussten daher in getrennten Reaktionsansätzen mit jeweils doppelt verwendeten template
untersucht werden. Dadurch besteht die Möglichkeit, dass sich die Effizienzen beider PCRLäufe unterscheiden.
Im vorliegenden Protokoll wurde zur internen Kontrolle des Systems eine externe
Nukleinsäure verwendet, die den Vorteil birgt, dass sie in der Routinediagnostik zur
Bestimmung der Effizienz von DNA-Extraktion und PCR universell einsetzbar ist
(HOFFMANN et al. 2006, HOFFMANN et al. 2008). Die IC2-DNA stellt ein nichtinfektiöses Plasmid mit kloniertem EGFP (engl.: enhanced green fluorescent protein)-GenFragment dar und wurde nach der mechanischen Lyse der Probe zugesetzt. An dieser Stelle
108
verwendet, kann im weiteren Verlauf die ausbleibende Amplifikation der IC2 eine
Degradation von DNA sowie inhibitorische Effekte in problematischen Proben aufzeigen. In
dieser Form bietet sie daher eine wichtige Vorraussetzung zur absoluten Quantifizierung und
zur Qualitätssicherung. Ein weiterer Vorteil der verwendeten IC2-DNA ist ihre bekannte
Konzentration, die der Anwender selbst bestimmt. Die Qualität der DNA-Extraktion kann
unabhängig von der Menge des Gewebes und auch in zellfreien Proben wie z.B. Serum
überprüft werden. Die IC2-Kontroll-DNA wurde in den vorliegenden Untersuchungen immer
in der gleichen Menge von 106 Kopien pro DNA-Extraktionsprobe eingesetzt. Orientiert an
der verwendeten Elutionsmenge während der DNA-Extraktion und im Vergleich mit der
DNA-Extraktionskontrolle wird mit dem vorhandenen Protokoll anhand der Ct-Werte der
internen Kontrolle (für HEX) auf einen Blick ersichtlich, ob die DNA-Extraktion der
einzelnen Probe erfolgreich war. In der vorliegenden Arbeit konnten demnach nicht
erfolgreiche DNA-Extraktionen sofort erkannt werden. Ferner ist anhand dieser Methode eine
Optimierung der DNA-Extraktion verschiedener Gewebe möglich. Wenn die Menge des
Gewebes bekannt ist, kann außerdem bei erfolgreicher DNA-Extraktion (IC2-DNA zeigt bei
erwartetem Ct-Wert spezifische Fluoreszenz) von Kopien/Reaktion in Kopien/mg o. ä.
umgerechnet werden. In den Analysen für die vorliegende Studie konnten alle beschriebenen
Vorteile der IC2 genutzt werden.
Das vorliegende multiplex real-time PCR-Protokoll wurde erstellt, um zeit- und
materialsparend die simultane Detektion von KHV- und IC2-Sequenz in einem
Reaktionsansatz zu ermöglichen. Damit die simultane Amplifikation der beiden Sequenzen
auch computergestützt gemessen werden konnte, wurden die Sonden der Sequenzen
unterschiedlich markiert. Die KHV-spezifische Sonde ist dafür am 5´-Ende mit dem
Fluoreszenzfarbstoff FAM und am 3´-Ende mit dem Quencher TAMRA versehen worden,
während die IC2-spezifische Sonde am 5´-Ende mit dem Fluorochrom HEX und am 3´-Ende
mit dem Quencher BHQ1 markiert war. Das KHV-spezifische Fragment ist 78 bp groß. Um
zu gewährleisten, dass es bei dem „multiplexing“ zu keinem Sensitivitätsverlust der KHVDetektion kommt, wurden die Sequenzen der IC2-Primer des zu amplifizierenden Fragmentes
(nach HOFFMANN et al. 2006) so gewählt, dass ein 132 bp großes Fragment entsteht. Aus
gleichem Grund wurde außerdem eine limitierte, geringere Menge an IC2-Primern verwendet.
Als ein Ergebnis der vorliegenden Studie konnte festgestellt werden, dass die Sensitivität, mit
109
der KHV im multiplex assay detektiert wird, durch die Koamplifikation von der eingesetzten
IC2-Menge nicht beeinflusst wird. Der entwickelte multiplex assay ist ebenso sensitiv wie der
single assay. Auf der anderen Seite konnte dargestellt werde, dass die Amplifikation der IC2DNA und damit die DNA-Extraktionskontrolle auch noch bei großen Mengen
koamplifizierter KHV-DNA stabil stattfindet.
Die Spezifität der real-time PCR nach GILAD et al. (2004) konnte bestätigt werden.
Außerdem wurden in der vorliegenden Studie in Proben von 6 verschiedenen KHV-Isolaten
KHV-spezifische
Fluoreszenz
detektiert.
Material
von
naiven
Karpfen
oder
der
Karpfenzelllinie CCB, ein CyHV-1-Isolat und ein HVA-Isolat waren negativ.
BERCOVIER et al. (2005) vermuteten in ihrer Arbeit, dass die Sensitivität der real-time
PCR nicht viel höher sei, als die Sensitivität der von ihnen entwickelten konventionellen
PCR, basierend auf dem mutmaßlichen Gen der Tymidinkinase. In den vorliegenden
Untersuchungen wurde dokumentiert, dass das entwickelte Protokoll der multiplex real-time
PCR (nach GILAD et al. 2004, HOFFMANN et al. 2006) vergleichbar sensitiv zur CNGVPCR (PIKARSKY et al. 2004), der Bercovier-TK-PCR (BERCOVIER et al. 2005) und der
nested PCR (BERGMANN et al. 2006) KHV-DNA detektiert. Als etwas weniger sensitiv
erwies sich die Gray-SphI-improved-PCR (GRAY et al. 2002, YUASA et al. 2005). Die
konventionelle PCR nach GILAD et al. (2002) und die Gray-BAM-PCR nach GRAY et al.
(2002) detektierten die KHV-DNA am wenigsten sensitiv.
Unterschiede in der Sensitivität können durch geringe Sequenzunterschiede innerhalb der
Primersequenz entstehen. Die Sequenzbereiche der verwendeten KHV-spezifischen Primer
aller PCRs scheinen jedoch innerhalb des KHV-Genoms konserviert zu sein, was zunächst
dadurch unterstützt wird, dass die verwendeten Isolate unverdünnt von den PCRs als positiv
erkannt werden. Außerdem variiert das Detektionslimit der jeweiligen PCR bei den
Verdünnungsstufen aller 4 Isolate regelmäßig; je nach PCR werden alle Isolate entweder in
hohen, mittleren oder niedrigen Verdünnungen erkannt.
Es scheint demnach lediglich an der Konzentration des KHV-Genoms und in diesem
Zusammenhang an den PCR-Konditionen zu liegen, wie sensitiv die höchsten
Verdünnungstufen erkannt werden. Diese These wird durch ein Alignment mit den
veröffentlichten, kompletten KHV-Genomen (AOKI et al. 2007) bekräftigt. Die KHVSondensequenz und alle bis auf einen verwendeten Primer stimmen zu 100 % mit den
110
veröffentlichten Isolaten überein. Für die unterschiedlichen Sensitivitäten der einzelnen PCRs
sind daher andere Gründe als Sequenzunterschiede denkbar, welche im Folgenden genannt
werden. Die real-time PCR stellt ein sensitiveres Detektionsverfahren als die konventionelle
PCR dar, außerdem basiert die KHV-spezifische real-time PCR nach GILAD et al. (2004) auf
der
Detektion
eines
kleinen
Fragmentes.
Die
verwendete
nested
PCR
hat
zusammengenommen fast doppelt so viele Amplifikationszyklen bei gleicher Länge eines
Zyklus wie die konventionellen, single round PCRs und hat daher eine höhere
Amplifikationsrate als die konventionellen PCRs. Die mögliche Annealingtemperatur ist
abhängig von der Nukleotidzusammensetzung der Primer, bzw. von Primer und Sonde. Für
alle PCRs gilt jedoch, dass mit steigender Temperatur die Annealingwahrscheinlichkeit und
damit die Ausbeute sinkt (MÜLHARDT 2002). Bei sehr kleinen zu amplifizierenden
Fragmenten kann von einer höheren Sensitivität der PCR ausgegangen werden (TOOULI et
al. 2000, HOFFMANN et al. 2008). Die unterschiedliche Sensitivität der einzelnen PCRs
könnte daher sowohl am Detektionverfahren selber, an der gewählten Sequenz und damit an
dem nahezu festgelegten, optimalen Annealing, an der gewählten Fragmentgröße oder einer
Kombination aus diesen Möglichkeiten liegen.
Bei
der
festgestellten
100
%igen
Homologie
der
verwendeten
Primer-
und
Sondensequenzen zu den veröffentlichten Sequenzen von AOKI et al. (2007) gibt es eine
Ausnahme. Der CNGV-652-Primer stimmt mit jedem der 3 Isolate nur zu 80 % überein,
nämlich mit 17 von 21 Nukleotiden. Die jeweiligen 5`-Enden beider Primer der CNGV-PCR
liegen komplementär 109 bp auseinander. Die 4 nicht-übereinstimmenden Nukleotide
befinden sich am 3´-Ende des Primers, also nicht am Ansatzpunkt der DNA-Polymerase bzw.
dem äußeren Ende der Fragmentmatrize sondern vom amplifizierten Fragment aus gesehen
im Inneren des Sequenzabschnitts. Dass die letzten 4 Nukleotide mit dem Fragment nicht
hybridisieren, scheint die Amplifikation nicht zu beeinflussen. In der ursprünglichen GraySphI-PCR (Gray et al. 2002) führte jedoch ein falsches Nukleotid 3 Nukleotide vor dem 3´Ende schon zu nicht-spezifischen Reaktionen wie Schmier- oder DNA-Leiter-artige Banden
und einer langen Reaktionszeit (YUASA et al. 2005) und folglich zu einer geringeren
Sensitivität, weswegen YUASA et al. (2005) eine korrigierte Sequenz veröffentlichten (GraySphI-improved-R-Primer
bzw.
Gray-SphI-improved-PCR
in
den
vorliegenden
Untersuchungen). Daher ist es verwunderlich, dass die CNGV-PCR nach PIKARSKY et al.
111
(2004) trotz Fehlpaarungen sehr sensitiv ist. Sie amplifiziert jedoch ebenso wie die nested
PCR eine unspezifische Bande, wenn Konzentrationen an KHV-DNA eingesetzt werden, die
eine sehr hohe Amplifikatmenge zur Folge haben. Da dieses Phänomen aber direkt mit der
Konzentration an KHV-DNA im template zusammenhängt, nur bei hohen Konzentrationen
auftritt und die Primer der nested PCR keine Homologieunterschiede zu den veröffentlichten
KHV-Genomen aufweist, ist es unwahrscheinlich, dass Sequenzunterschiede für die
Entstehung der zusätzlichen Bande verantwortlich sind. Es könnte sich lediglich um ein
Artefakt handeln. Daher besteht eine weitere Erklärung für die hohe Sensitivität der CNGVPCR trotz „missmatches“ im CNGV-652-Primer in der Möglichkeit der fehlerhaft
veröffentlichten Sequenzen von AOKI et al. (2007).
Zusammenfassend weist das entwickelte multiplex real-time PCR-Protokoll nach GILAD
et al. (2004) und HOFFMANN et al. (2006) mit vergleichbarer oder höherer Sensitivität als
die konventionellen und nested PCRs KHV-DNA spezifisch in einer Probe nach. Neben allen
schon diskutierten Vorteilen einer real-time PCR bietet sie außerdem als einzige aller
verglichenen PCRs die Möglichkeit zur Quantifizierung. Zu diesem Zweck wurde nicht
infektiöse, klonierte KHV-PC-DNA hergestellt. Die KHV-PC-DNA wird mit der
quantitativen real-time PCR sowohl im single als auch im multiplex assay in einer log10Verdünnungsreihe von 1010 bis 10 Kopien pro Reaktion wiederholbar und in regelmäßigen
Abständen zwischen den log10-Stufen nachgewiesen. Lediglich der eingestellte positive
Standard von 1 Kopie/Reaktion kann nicht in jeder Wiederholung detektiert werden.
Eine absolute Quantifizierung von unbekannten DNA-Mengen kann erfolgen, wenn
mehrere Verdünnungstufen der KHV-PC-DNA als externe Standards während einer
quantitativen multiplex real-time PCR eingesetzt werden. Die externen Standards dienen
dabei gleichzeitig immer auch als positive Kontrolle der PCR, also zur Funktionsprüfung der
PCR-Bestandteile. Da die absolute Kopienzahl der externen Standards bekannt ist, kann mit
der Computersoftware anhand der Ct-Werte dieser definierten, externen Standards eine
Standardkurve berechnet werden. Anhand des Ct-Wertes der unbekannten Proben kann dann
in dieser Standardkurve die jeweilige absolute Konzentration an KHV-Genomäquivalenten
pro Reaktion bestimmt werden. Mit dieser Anwendung können sowohl sehr hohe als auch
sehr niedrige Konzentrationen an KHV-DNA in untersuchten Geweben quantifiziert werden.
112
Das entwickelte Anwenderprotokoll für eine quantitative multiplex real-time PCR kann im
Routinelabor verwendet werden und verbindet einen sehr sensitiven, spezifischen KHV-DNA
Nachweis (nach GILAD et al. 2004) mit der simultanen Kontrolle von DNA-Extraktion und
PCR (nach HOFFMANN et al. 2006). Es handelt sich um eine arbeits-, material- und
zeitsparende Methode, die für einen Hochdurchsatz an Proben geeignet ist (DE WIT et al.
2000, DROSTEN et al. 2001, PERSSON et al. 2005, HOFFMANN et al. 2008). Neben einem
Zuwachs an Spezifität wird das Kontaminationsrisiko gegenüber der konventionellen und
besonders gegenüber der nested PCR gesenkt (BUSTIN 2000, GILAD et al. 2004,
HOFFMANN et al. 2008). Die Mengen an KHV im Gewebe können über eine absolute
Quantifizierung der enthaltenen KHV-DNA-Äquivalenten angegeben werden. Das Ergebnis
einer PCR wird durch das entwickelte Protokoll besser einschätzbar, da falsch-negative
Ergebnisse erkannt werden können, wenn sie durch problematisches Probenmaterial,
Probenaufarbeitungsfehler oder Inhibition der PCR entstehen (ROSSEN et al. 1992, WILSON
et al. 1997, HOFFMANN et al. 2008). Die Aufarbeitung jeder Probe kann einzeln kontrolliert
werden, außerdem wird die PCR zu jedem Amplifikationszyklus in jeder Probe einzeln
aufgezeichnet. Diese Transparenz und Zuverlässigkeit des vorgestellten Protokolls ist sehr
vorteilhaft für die Diagnostik und in diesem Zusammenhang geeignet zur Bestimmung der
Viruslast im Gewebe. Das entwickelte quantitative multiplex real-time PCR-Protokoll nach
GILAD et al. (2004) und HOFFMANN et al. (2006) stellt damit ein gutes Werkzeug für
Untersuchungen zur Pathogenese der KHV-Infektion dar.
5.2
Untersuchungen zur Pathogenese der Koi-Herpesvirusinfektion bei experimentell
infizierten Spiegelkarpfen
Anhand des entwickelten quantitativen multiplex real-time PCR-Protokolls kann KHV sehr
sensitiv und spezifisch nachgewiesen werden. In praktischer Anwendung wurde nun im
Infektionsversuch die Menge der KHV-DNA in verschiedenen Geweben von infizierten
Spiegelkarpfen quantifiziert. Die Karpfen wurden bei der für KHV permissiven Temperatur
von 23 °C (GILAD et al. 2003, 2004) gehältert. Bei adulten Spiegelkarpfen wurde zu
wöchentlichen bzw. zweiwöchentlichen Beprobungszeitpunkten eine Untersuchung von
Niere, Kieme, Kiemenabstrich und periphere Blutleukozyten (PBL) durchgeführt. Dadurch
wurden sowohl klinisch erkrankte als auch rekonvaleszente Karpfen erfasst. Parallel zu
113
adulten Karpfen wurden auch juvenile Spiegelkarpfen zum Vergleich der Empfänglichkeit
von verschiedenen Altersklassen mit KHV infiziert. Die juvenilen Karpfen wurden in der
jeweils selben Anzahl und bei gleicher Infektionsdosis zusammen mit den adulten Karpfen
gehältert. Zum quantitativen KHV-Genom-Nachweis wurde das von vielen Autoren klassisch
verwendete Organmaterial des Nieren- und des Kiemengewebes bei beiden Alterklassen
ausgewählt, welches nach GILAD et al. (2004) die höchsten Konzentrationen an KHV-DNA
aufweist. Zusätzlich wurden von den adulten Karpfen noch Kiemenabstriche und PBL zur
quantitativen Untersuchung entnommen, die einen Versuch darstellen, die Ausscheidung von
KHV über die Kiemen bzw. die Möglichkeit der systemischen Verteilung von KHV über
Zellen des Immunsystems zu beurteilen. Kiemenabstriche, PBL und das Kiemenmaterial
ergeben zusammen drei prinzipiell nicht-letal entnehmbare Proben gegenüber dem
homogenen Referenzorgan Niere, die letal entnommen werden muss. PBL und
Kiemenabstriche wurden in der vorliegenden Untersuchung erstmals quantitativ mittels realtime PCR zum Nachweis von KHV untersucht.
5.2.1
Verteilung der Viruslast über die Zeit, Virusnachweis in PBL und Virusausscheidung
GILAD et al. (2004) untersuchten im KHV-Infektionsversuch die Viruslast von Koi, die
bei 4 verschiedenen Temperaturen gehältert wurden (13 - 28 °C). Dabei wurde festgestellt,
dass die KHV-DNA schon 1 Tag p.i. fast ausnahmslos in hoher Konzentration in vielen
Geweben nachzuweisen war, woraus die Autoren schlossen, dass KHV schnell über das Blut
systemisch in allen Organsystemen verteilt wird, nachdem eine rasche Infektion und
Vermehrung in den primären Infektionsorganen stattfindet. Am Ende des Versuchs konnte
von GILAD et al. (2004) gar keine oder nur noch wenig KHV-DNA im Gewebe gefunden
werden, woraus GILAD et al. (2004) die Möglichkeit einer Latenz bzw. Persistenz des Virus
nach etwa 2 Monaten ableiteten. In der vorliegenden Untersuchung konnten über einen
kontinuierlicheren Beprobungszeitraum hinweg insgesamt ähnliche Ergebnisse erzielt
werden. Dabei wiesen das Nieren- und auch das Kiemengewebe im ersten Monat meist sehr
viel höhere Mengen an Genomäquivalenten auf, als im Kiemenabstrich und schließlich in den
PBL messbar waren. Neben der prinzipiellen Möglichkeit der systemischen Streuung durch
freie Viruspartikel im Blut wird in der vorliegenden Untersuchung belegt, dass die schnelle
Verbreitung mindestens zusätzlich durch PBL erfolgen könnte, da in dieser aufgereinigten
114
Fraktion des Blutes erstmals KHV-Genom nachgewiesen werden konnte. Da mit der PCRAnalyse nur Teile der Virus-DNA nachgewiesen werden, kann letztendlich keine sichere
Aussage getroffen werden, ob es sich um infektiöses Virus oder aber um zerstörte und
aufgenommene Virusbestandteile handelt. Letztere würden lediglich auf die Bekämpfung der
Virusinfektion durch verschiedene Zellfraktionen der PBL hinweisen. Die mögliche
Infektiosität des Materials könnte durch weitere Infektionsversuche überprüft werden, in
denen PBL als Infektionsmaterial für empfängliche Tiere dient. Dabei sollte aber Beachtung
finden, dass bis auf wenige Ausnahmen verhältnismäßig wenig KHV-DNA in jeweils 107
PBL enthalten war. Während der Aufreinigung könnte zusätzlich die Infektiosität des
Materials abnehmen. Aus diesen Gründen würde möglicherweise keine Infektionsdosis im
Fisch erreicht werden, die zur Infektion oder Mortalität führt.
PIKARSKY et al. (2004) schließen von der schnellen und effektiven Verbreitung der
kontatgiösen Erkrankung, darauf, dass sich das Virus in den Kiemen sowohl vermehrt als
auch von dort ins Wasser ausgeschieden wird. Der vorliegende Nachweis von größeren
Mengen an KHV-DNA im Kiemengewebe und erstmals auch im Kiemenschleim unterstützt
diese Theorie. Die Infektiosität des Kiemenschleims und damit die mögliche Ausscheidung
von intakten Viren müsste durch weitere Infektionsversuche bestätigt werden.
5.2.2
Latenz und Persistenz
GILAD et al. (2004) machen keine Angaben über die Viruslast der Gewebe zwischen der
3. und 8. Woche p.i.. Mit der Ausnahme eines Fisches konnte im hier vorliegenden
Infektionsversuch erstmals bestimmt werden, dass schon in der 3. und 4. Woche p.i. eine
deutliche Abnahme der KHV-DNA im Gewebe der adulten Karpfen zu verzeichnen ist.
Ferner wiesen alle beprobten, adulten Karpfen der 6. und 8. Woche p.i. als auch die
überlebenden, juvenilen Infizierten nur noch eine geringe Menge oder gar keine KHV-DNA
mehr im Probenmaterial auf. Solch geringe Mengen (unter 100 Kopien/Reaktion) sprechen
für eine abfallende oder nur noch minimale Virusreplikation, was auf eine Rekonvaleszenz
der Tiere oder möglicherweise auf die Ausprägung einer Latenzphase des Virus im Karpfen
hinweisen könnte, wie sie auch von GILAD et al. (2004) und ST-HILAIRE et al. (2005)
vermutet bzw. nachgewiesen wird. Insgesamt kann mit dem reinen Nachweis des DNAFragmentes keine Aussage darüber getroffen werden, ob es sich zu diesem Zeitpunkt um eine
115
persistente Infektion handelt oder ob sich das Virus in einem latenten Stadium der Infektion
befindet, in dem lediglich Virus-DNA in den Wirtszellen vorhanden ist. Im Infektionsversuch
könnte unterschieden werden, ob diese Karpfen durch bloßen Kontakt (persistente Infektion)
oder aber erst nach Einwirkung von Stress und einhergehender Virusreaktivierung (latente
Infektion) naive Karpfen infizieren.
5.2.3
Organe mit hoher Viruslast zum Zeitpunkt des Todes
12 von 24 infizierten juvenilen Karpfen verstarben während des Versuchzeitraumes des
vorliegenden Infektionsversuches. Vergleichbar behandelte und gehälterte Kontrolltiere
verstarben nicht. Ausnahmslos jeder Todesfall ging dabei mit einer hohen KHV-DNA-Menge
(3 x 104 bis 3 x 106 Kopien/Reaktion) im Nieren- und Kiemengewebe einher. Vergleichbar zu
diesen Daten fanden GILAD et al. (2004) immer in Kiemen und Niere und sehr häufig in
allen anderen untersuchten Geweben gestorbener, KHV-infizierter Koi sehr viel und generell
mehr Virusgenom als in Organen beprobter Karpfen. Dabei wird nach einer schnellen,
systemischen Streuung in die Gewebe (HEDRICK et. al. 2000, GILAD et al. 2004) von
GILAD et al. (2004) vermutet, dass der Verlust der osmoregulatorischen Funktion von Darm,
Niere und Kieme während der akuten Phase der Infektion zum Tod führen könnten, was in
der vorliegenden Studie durch die hohen Werte im Nieren- und Kiemenmaterial an dieser
Stelle unterstützt wird. Es lässt sich zusammen mit den Daten aus der Literatur (GILAD et al.
2004) in der Folge vermuten, dass hohe KHV-Genommengen im Kiemen- und Nierengewebe
von Karpfen mit unbekanntem Status sowohl für eine KHV-Infektion als auch deren
maßgebliche Beteiligung am Tod bzw. am Seuchengeschehen spricht. Welche Rolle eine
KHV-Infektion beim Tod eines Karpfens gespielt hat, könnte also anhand des entwickelten,
quantitativen real-time PCR Protokoll beurteilt werden.
5.2.4
Altersbedingte Resistenz
Juvenile Karpfen verstarben im Laufe des durchgeführten Infektionsversuches, während
bei den adulten Karpfen keine Todesfälle verzeichnet werden konnte. Dieses Ergebnis
entspricht PERELBERG et al. (2003), die eine höhere Empfänglichkeit für KHV von
juvenilen Karpfen beziehungsweise eine altersbedingte Resistenz von adulten Karpfen
nachwiesen haben. Beim Vergleich der Viruslast im Gewebe konnten nur an Tag 7 oder 14
116
p.i. in einigen Proben von vier adulten, infizierten Karpfen annähernd so hohe
Konzentrationen an KHV-DNA gefunden werden wie jeweils in allen verstorben, juvenilen
Karpfen. Die adulten Spiegelkarpfen wiesen also höchstens zum Zeitpunkt auftretender
klinischer Symptome die höchsten KHV-DNA-Gehalte im Gewebe auf. Mit dem Tod der
juvenilen Karpfen ging jedoch grundsätzlich sehr hoher KHV-DNA-Gehalt im Gewebe
einher. Daher könnte ein hoher Gehalt an KHV-DNA für eine starke Vermehrung des Virus
im Gewebe sprechen. Diese Daten könnten weiterhin darauf hinweisen, dass sich im Laufe
einer KHV-Infektion anhand der Empfänglichkeit des Wirtes zum Zeitpunkt der höchsten
Virusvermehrung von KHV entscheidet, ob das Virus vom Immunsystem soweit bekämpft
werden kann, dass der Wirt überlebt oder ob die Infektion einen letalen Ausgang hat, weil
zuviel Gewebe durch die Vermehrung des Virus geschädigt wurde.
5.2.5
Einfluss der Infektionsdosis auf die Mortalität
Da im vorliegenden Infektionsversuch juvenile Karpfen der niedrigeren Infektionsdosis in
geringerer Anzahl und im Verlauf langsamer verstarben als juvenile Karpfen der 10fach
höheren Infektionsdosis, scheint für den Verlauf einer KHV-Infektion neben dem Alter der
Tiere auch die Infektionsdosis des Virus und damit der Infektionsdruck eine Rolle zu spielen.
GILAD et al. (2003) untersuchten den Einfluss der Infektionsdosis auf den Ausbruch der
KHV-Erkrankung. Sie konnten bei Infektionsdosen von 1,2 und 12 KID50/ml für 1 Stunde im
Bad gleiche Mortalitätsraten feststellen, wobei die Koi, die mit der höheren Dosis infiziert
waren, im Mittel aber schneller starben. In der vorliegenden Untersuchung wurden die Tiere
mit 5 x 103 und 5 x 104 KID50/ml für 1 Stunde im Bad infiziert. Wie bei GILAD et al. (2003)
verstarben die juvenilen Karpfen, die mit der höheren Infektionsdosis infiziert wurden,
schneller. Die Mortalitätsraten verhielten sich jedoch unterschiedlich. In den beiden Gruppen
der vorliegenden Untersuchung, die mit der höheren Dosis KHV infiziert waren, starben
nahezu zusammenhängend jeweils 4 von 6 Karpfen zwischen Tag 12 und 23 p.i.. Dem
gegenüber verstarben in einer Gruppe der juvenilen Karpfen, die mit der geringeren Dosis
infiziert waren, von Tag 14 bis Tag 53 p.i. nach und nach 5 von 6 Karpfen, während in der
anderen Gruppe sogar gar keine Todesfälle auftraten. Beide Verläufe in den Gruppen der
juvenilen Karpfen, die mit der geringeren Dosis KHV infiziert waren, könnten auf eine
Infektionsdosis hinweisen, die an der Schwelle einer letalen Dosis liegt und weisen an dieser
117
Stelle darauf hin, dass die Infektionsdosis im Bad im Gegensatz zu den Daten von GILAD et
al. (2003) eine Rolle im Verlauf und der Entwicklung von Mortalität in infizierten Karpfen
haben könnte. Für eine statistische Absicherung dieser Beobachtungen ist ein Versuch mit
größerer Tierzahl notwendig.
5.2.6
Infektionsdosis
Die von GILAD et al. (2003) verwendeten, geringeren Infektionsdosen von 1,2 und 12
KID50/ml für 1 Stunde im Bad führten beide zu hohen Mortalitätsraten, während die hier
verwendeten niedrigere Infektionsdosis von 5 x 103 KID50/ml KHV schon zu einem
langsameren Mortalitätsverlauf beziehungsweise gar keiner Mortalität der juvenilen Karpfen
führten. Dieser Effekt könnte durch eine geringere Virulenz des verwendeten Infektionsvirus
oder durch eine Attenuierung des Virus während der Virusvermehrung verursacht worden
sein. Eine andere Möglichkeit stellen weniger empfängliche Versuchtiere dar. GILAD et al.
(2003) verwendeten Koi, während in der vorgestellten Untersuchung Spiegelkarpfen
verwendet wurden. Auch dieser Zusammenhang könnte in weiteren Infektionsversuchen
überprüft werden, in dem die Empfänglichkeit von Koi und Nutzkarpfen verglichen werden.
5.2.7
Elektronenmikroskopie
DE WIT et al. (2000) konnten mittels real-time PCR-Technik das bisherige
Detektionslimit für Retroviren um mehr als den Faktor 1000 senken. Die sensitivere und
spezifischere real-time PCR löste die elektronenmikroskopische Untersuchung als
Screeningsystem ab. Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Studie kann bestätigt werden,
dass KHV mittels real-time PCR ebenfalls sensitiver und außerdem zuverlässiger
nachgewiesen wird, als es mit einer elektronenmikroskopischen Untersuchung möglich ist. Da
sich eine elektronenmikroskopische Untersuchung als erheblich zeit- und arbeitsaufwendig
erweist, konnte nur ein Teil der Proben untersucht werden. Der elektronenmikroskopisch
positive Nachweis erfolgte nur in einigen Sammelproben der juvenilen, infizierten Karpfen,
jedoch in keiner der Sammelproben der hoch infizierten adulten Karpfen. Neben dem
bestätigten
Sensitivitätsverlust
der
Untersuchungsmethode
kann
ein
elektronenmikroskopischer Befund außerdem nur den Hinweis auf ein Herpesvirus geben,
118
während die quantitative multiplex real-time PCR KHV spezifisch anhand eines Virus-DNAFragmentes detektiert.
5.2.8
Das
Virusreisolierung und Immunfluoreszenztest
verwendete
KHV-Isolat
wurde
in
CCB-Zellen
mit
KHV-typischen
Zellkulturwachstumsraten vermehrt und dann im Infektionsversuch eingesetzt. Ferner wurde
das Infektionsvirus vor dem Einsatz im Infektionsversuch bei -80 °C gelagert. Es gelang
daraufhin mit diesem Virus im Infektionsversuch juvenile wie adulte Karpfen zu infizieren
und klinisch bis hin zur Ausprägung von Mortalität erkranken zu lassen. Zur
Virusreisolierung wurden wieder CCB-Zellen genutzt, wobei im Ergebnis aus keinem der
Karpfen KHV reisoliert werden konnte. Auch mittels Immunfluoreszenztest der
Virusreisolierungspassagen konnte kein Antigen detektiert werden. Anderen Arbeitsgruppen
gelang es mit CCB-Zellen (NEUKIRCH und KUNZ 2001) KHV aus Geweben infizierter
Karpfen zu isolieren. Bei der Virusisolierung mittels Zellkultur handelt es sich jedoch je nach
Autor um ein vergleichbares (BERCOVIER et al. 2005) oder aber weniger sensitives (GILAD
et al. 2002) Verfahren als der Nachweis mittels PCR-Technik. HAENEN et al. (2004)
berichteten, dass die Sensitivität der KHV-Isolierung mittels Zellkultur weit geringer ist als
die Detektion mittels PCR. Da das verwendete KHV-Isolat in CCB-Zellen vermehrt wurde
und andere Arbeitsgruppen mit CCB-Zellen KHV erfolgreich aus Gewebe isolieren konnten,
ist es unwahrscheinlich, dass eine einzelne Tierpassage das Virus so maßgeblich verändert
hat, dass die CCB-Zellen nicht mehr für das reisolierte Virus empfänglich wären. Vor
beziehungsweise während der Lagerung könnte sich natives Gewebe vom Karpfen (inklusive
Zellen der Immunabwehr) im Gegensatz zu Zellkulturzellen schädlicher auf intakte, infektiöse
Viren ausgewirkt haben, aber es ist eher unwahrscheinlich, dass die Lagerungstemperatur eine
Rolle im Hinblick auf die Infektiosität gespielt hat, da das Infektionsvirus vor der
Verwendung ebenfalls bei –80 °C gelagert wurde. Die Schlussfolgerung, dass weniger die
gewählte Zwischenlagerung als mehr das verwendete Protokoll zur Virusisolierung für den
mangelnden Erfolg verantwortlich ist, erscheint nahe liegend. Die Optimierung des Protokolls
stellt eine Möglichkeit dar, den Nachweis zu verbessern. Zu der in der Literatur berichteten
vergleichbaren oder schlechteren Sensitivität gegenüber der PCR-Technik schlägt aber auch
zu Buche, dass selbst bei einem optimierten Verfahren Tage bis Wochen vergehen, bis man
119
ein Ergebnis erhält (HAENEN et al. 2004). Und es ist zu bedenken, dass die Bereitstellung
und der Unterhalt von Zellkulturen zusätzlich negativ ins Gewicht des routinediagnostischen
KHV-Nachweises mittels Zellkultur fallen. Um jedoch Infektionsversuche durchführen zu
können, sind KHV-Isolate von größter Bedeutung, daher sollte weiter versucht werden, die
Virusisolierung von KHV zu verbessern.
5.2.9
Diagnostische Sensitivität
Anhand der vorliegenden Untersuchungen konnte die diagnostische Sensitivität des
entwickelten multiplex real-time PCR Protokolls dokumentiert werden. Der überwiegende
Teil der entnommenen Proben von KHV-infizierten Karpfen war auch positiv für KHV-DNA.
Außerdem waren alle 48 Proben der 12 adulten Kontrollkarpfen und die 12 Proben der
juvenilen Kontrolltiere in der quantitativen multiplex real-time PCR negativ für KHV
(4.2.3.4). 10 von 96 entnommenen Proben der adulten, infizierten Karpfen waren negativ für
KHV-DNA, außerdem waren 5 der 24 juvenilen, infizierten Karpfen negativ. Dabei wurden
die meisten negativen Ergebnisse in den Gruppen der geringeren Infektionsdosis gefunden.
Bei negativen Proben handelte es sich jeweils um ein weniger geeignetes Probenmaterial zum
Nachweis von KHV, um ein Tier im Anfangsstadium der Infektion, um ein rekonvaleszentes,
also klinisch unauffälliges Tier, bei dem in allen anderen untersuchten Organen wenig oder
auch gar kein KHV-Genom nachweisbar war (quantitative Auswertung unter 4.2.3) oder um
eine Kombination aus diesen drei Möglichkeiten. Alle negativen Proben von infizierten
Karpfen lassen sich demnach unter Berücksichtigung der pathogenetischen Zusammenhänge
erklären. Die vorgestellte Untersuchung anhand des entwickelten quantitativen multiplex realtime PCR-Protokolls stellt demnach ein verlässliches diagnostisches Verfahren mit hoher
diagnostischer Sensitivität dar. Sowohl die DNA-Extraktion als auch die PCR werden auf ihre
Effektivität hin kontrolliert, wodurch der Virusgehalt des Materials zuverlässig quantifiziert
werden kann. Trotzdem wäre es für eine statistische Auswertung und Aussage
wünschenswert, wenn der Infektionsversuch mit größerer Tierzahl wiederholt werden könnte.
5.2.10 Quantitative Bestimmung der Virus-DNA
Eine quantitative Bestimmung von Virus-DNA in verschiedenen Geweben wurde auch von
GILAD et al. (2004) durchgeführt, indem in 2 unterschiedlichen PCRs die KHV-DNA und
120
die DNA des Glucokinasegens des Karpfens nachgewiesen wurden. Dieses Verfahren
ermöglichte keine Überprüfung der DNA-Extraktion wie es in der vorliegenden Untersuchung
durch Zusatz der IC2-DNA gegeben war. Damit gehen die Daten dieser Studie über die von
GILAD et al. (2004) hinaus, da mit der vorliegenden Methode der DNA-Extraktionserfolg
und die PCR-Effizienz kontrolliert werden können. Nur mit dem hier entwickelten Protokoll
können außerdem auch zellfreie Proben quantitativ auf KHV-Genom untersucht werden. Ein
weiterer Vorteil des hier entwickelten Protokolls liegt in der simultanen Amplifikation von
Ziel- und Kontroll-DNA. Sie ist die Voraussetzung für die verlässliche Quantifizierung und
außerdem zeit- und materialsparend.
5.2.11 Geeignetes Probenmaterial für die KHV-Diagnostik
In dieser Studie wurden immer gleiche Mengen Probenmaterial (20 +/- 2 mg Kiemen- oder
Nierengewebe, 107 Leukozyten, 200µl Kiemenabstrich inklusive Pellet) nach einem
festgelegten Verfahren aufgearbeitet. Durch die immer gleiche Zugabe von 5µl mit 106
Kopien der internen Kontroll-DNA während der DNA-Extraktion und der gleichzeitigen
Messung von KHV- sowie Kontroll-DNA in einer multiplexen real-time PCR konnte anhand
der Ergebnisse direkt auf den Extraktionserfolg der jeweiligen Probe geschlossen werden.
Außer der Verteilung von KHV im Gewebe wird in der Angabe von Kopien/Reaktion in
dieser Form gleichermaßen ohne Umrechnung ersichtlich, welchen diagnostischen Erfolg die
jeweilige Probe verspricht. Auf diese Weise konnte neben den Angaben zur Verteilung der
KHV-DNA im Gewebe der infizierten Fische zu definierten Zeitpunkten gleichermaßen auch
Aussagen getroffen werden, welche Probenmaterialien sich für diagnostische Untersuchungen
zum Nachweis einer KHV-Infektion eignen.
Von den adulten Karpfen wurde der KHV-Genomgehalt von 4 verschiedenen
Probenmaterialien verglichen. In allen 24 PBL-Proben der infizierten, adulten Karpfen konnte
KHV-DNA gemessen werden. Die Mehrzahl der Proben ergaben niedrige KHV-KopienDNA-Gehalte von 54 bis unter 500 Kopien/Reaktion.
Im Kiemengewebe kann im Gegensatz zu den PBL in 6 Fällen weit mehr als 500 Kopien
pro Reaktion an KHV-Genomäquivalenten gemessen werden. Eine abnehmende Kopienzahl
im Gewebe mit zunehmender Dauer des Versuchs und einhergehender Rekonvaleszenz der
121
Karpfen ist zu erkennen. Es sind jedoch 3 negative Ergebnisse beim Kiemengewebe zu
verzeichnen.
Im Material des Kiemenabstriches zeigen sich die gleichen Tendenzen wie im
Kiemengewebe, allerdings ließ sich in 6 Proben keine KHV-DNA nachweisen.
Das Nierengewebe der infizierten Karpfen zeigte in 23 von 24 Karpfen einen positiven
Nachweis für KHV. Im Vergleich mit den anderen 3 Probenmaterialien zeigt das
Nierengewebe im ersten Monat p.i. mit Abstand den quantitativ höchsten KHV-DNA-Gehalt
im Gewebe. Hohe Kopienzahlen wurden auch bei Karpfen zu einem frühen Zeitpunkt der
Infektion gefunden, wo in den anderen Probenmaterialien nur geringe oder gar keine KHVDNA detektiert wurde.
Aus den oben genannten Gründen erscheint das Nierengewebe von den 4 überprüften
Probenmaterialien als am verlässlichsten und sensitivsten, wenn KHV sicher nachgewiesen
werden soll. Es handelt sich um ein homogenes Gewebe, das leicht zu entnehmen ist und
ohne weitere Aufreinigung weiterverarbeitet werden kann. Das Gewebe ist jedoch nur letal zu
entnehmen. Von den 3 nicht-letal entnehmbaren Proben war das Probenmaterial der PBL am
verlässlichsten, weil hier im Gegensatz zu Kiemenproben immer KHV-DNA nachzuweisen
war. Allerdings wurden in einigen Proben mit Kiemenmaterial deutlich höhere KHVKopienzahlen gemessen als in der Blutfraktion.
Beim Vergleich der nicht-letalen Probenentnahmen können Kiemengewebe und
Kiemenabstrich am einfachsten entnommen und weiterverarbeitet werden. PBL stellen neben
der notwendigen Zellzählung ein problematischeres Probenmaterial dar. Die vielen
zusätzlichen Handgriffe und Zentrifugationsschritte, das unabdingbare Zählen der Zellen
inklusive der Verwendung von Medium, Heparin, Eis zur Kühlung und die zwingend zeitnahe
Verarbeitung des heparinisierten Blutes fallen als zusätzliche Kontaminationsgefahr und
höheren Arbeitsaufwand ins Gewicht. In der Praxis sollte überprüft werden, inwieweit die
zwingende Fraktionierung und die Zellzahlbestimmung der PBL durchführbar sind und aus
dieser Sicht zur Routinediagnostik herangezogen werden können. Außerdem muss aber
bedacht werden, dass von sehr jungen Karpfen womöglich nicht ausreichend Blut zur
Aufreinigung der PBL gewonnen werden kann.
Kiemenabstrichmaterial wies mit 6 nicht erkannten von 24 infizierten Karpfen die
geringste Sensitivität auf, außerdem schwankte die nachgewiesene Kopienzahl sehr stark. Da
122
es aber sehr einfach entnommen und verarbeitet werden kann und eine nur gering invasive
Methode zur Probenentnahme darstellt, ist ihr Einsatz zu Routinediagnostik zu erwägen.
Dabei könnte die fehlende Sensitivität durch eine Erhöhung der Anzahl von Proben
ausgeglichen werden, um den Infektionsstatus einer Population zu erfassen. Als
Einzeltierbeprobung kann es aufgrund der geringen Sensitivität jedoch nicht empfohlen
werden.
Mit dieser Studie konnte gezeigt werden, dass eine stabile, sichere DNA-Extraktion und
ein validiertes quantitatives multiplex real-time PCR-Nachweisverfahren zu verlässlichen,
aussagekräftigen Werten einer Pathogenesestudie führen. Standardisierte Kontrollen bei
DNA-Extraktion und im PCR-Verfahren sind unabdingbar für reproduzierbare Ergebnisse.
Außerdem sollte die Wahl des Gewebes zum diagnostischen Nachweis von KHV im Hinblick
auf die Entnahme, Aufbewahrung, Verarbeitung und der zu erwartenden Viruslast
genauestens erwogen werden.
123
6
ZUSAMMENFASSUNG
Meike Riechardt:
Entwicklung eines multiplex real-time PCR-Protokolls zum Nachweis von Koi-Herpesvirus
(KHV)
und
Untersuchungen
zur
Pathogenese
der
Koi-Herpesvirus-Infektion
bei
experimentell infizierten Spiegelkarpfen (Cyprinus carpio)
Die Koi-Herpesvirus (KHV)-Infektion hat seit den 1990er Jahren große Schäden in der
Aquakultur von Nutzkarpfen und Koi verursacht. Der KHV-Nachweis konnte mit der
Entwicklung konventioneller PCRs gegenüber der Virusisolierung mittels Zellkultur und des
elektronenmikroskopischen Nachweises von Viruspartikeln entscheidend verbessert werden.
GILAD et al. (2004) entwickelten den genomischen Nachweis von KHV in Form eines realtime PCR-assays weiter.
In der vorliegenden Untersuchung wurde die real-time PCR von GILAD et al. (2004)
erstmals als multiplex real-time PCR-Protokoll verwendet, mit dem spezifisch und sensitiv
KHV-Genom simultan zu einer internen Kontroll-DNA nach HOFFMANN et al. (2006)
bestimmt werden kann. Das Detektionslimit von GILAD et al. (2004) von 10 Kopien KHVGenomäquivalenten konnte mit dem entwickelten multiplex real-time PCR-Protokoll bestätigt
werden. Mit dem vorliegenden Protokoll wurden fluktuierend 1 Kopie und verlässlich 10 bis
1010 Kopien KHV-Genomäquivalente gemessen. Die Verwendung und Koamplifikation einer
universell einsetzbaren internen Kontrolle, die während der DNA-Extraktion hinzugefügt
wird, ermöglicht die Qualitätskontrolle von DNA-Extraktion und PCR-Amplifikation. Mittels
Koamplifizierung der internen Kontrolle wird die Sicherheit der diagnostischen Aussage
erhöht, außerdem wird die schnelle und einfache absolute Quantifizierung der genomischen
KHV-DNA in Probenmaterial überhaupt erst ermöglicht. Das multiplex real-time PCRProtokoll stellte sich als vergleichbar sensitiv zu den Protokollen basierend auf BERCOVIER
et al. (2005) (konventionelle PCR), BERGMANN et al. (2006) (nested PCR) und
PIKARSKY et al. (2004) (konventionelle PCR) heraus. Die konventionellen PCRs nach
GRAY et al. (2002) modifiziert nach YUASA et al. (2005) und zuletzt die PCRs nach GRAY
et al. (2002) und GILAD et al. (2002) schnitten schlechter ab.
124
Zusätzlich wurden in der vorliegenden Arbeit Untersuchungen zur Pathogenese der KHVInfektion mit dem Ziel der Verbesserung der Diagnostik durchgeführt. Im Infektionsversuch
wurden dafür Spiegelkarpfen mit KHV infiziert und im Verlauf sowohl klinisch erkrankte als
auch rekonvaleszente Tiere untersucht. Parallel zu adulten Karpfen wurden juvenile
Spiegelkarpfen zum Vergleich der Empfänglichkeit von verschiedenen Altersklassen infiziert
und mit den adulten Karpfen zusammen gehältert. Die Karpfen wurden bei der für KHV
permissiven Temperatur von 23 °C gehältert und mit zwei verschiedenen Infektionsdosen im
Bad infiziert. Bei den adulten Spiegelkarpfen wurde zu regelmäßigen Beprobungszeitpunkten
eine Untersuchung von Niere, Kieme, Kiemenabstrich und peripheren Blutleukozyten (PBL)
durchgeführt. Mit dem entwickelten quantitativen multiplex real-time PCR-Protokoll nach
GILAD et al. (2004) und HOFFMANN et al. (2006) wurde die Höhe des spezifischen KHVDNA-Gehalts einer Probe bestimmt. Dabei ließ sich abhängig von Infektionsdosis, Klinik und
Mortalität unterschiedlich viel KHV-DNA in den Materialien und damit erstmals auch im
Kiemenabstrich und den peripheren Blutleukozyten (PBL) nachweisen. Die höhere
Infektionsdosis bewirkte eine stärkere Klinik und eine schnellere und höhere Mortalität, sie
hatte jedoch nur bedingt Einfluss auf den quantitativen Nachweis der KHV-DNA. Das Alter
der im Versuch infizierten Karpfen hatte entscheidenden Einfluss auf die Ausprägung der
Mortalität, nur juvenile Karpfen verstarben. Es konnte somit eine altersabhängige Resistenz
für KHV beobachtet werden. Dabei konnte festgestellt werden, dass durch KHV verursachte
Mortalität unabhängig vom Zeitpunkt nach der Infektion mit in einer sehr hohen Viruslast im
Gewebe der juvenilen Karpfen einhergeht. Während der klinischen Phase der Infektion
konnten die höchsten Konzentrationen an KHV-DNA der adulten Karpfen gemessen werden.
Insgesamt nahm der DNA-Gehalt in allen Probenmaterialien und demnach auch im Karpfen
über die Zeit hinweg ab. 6 und 8 Wochen nach der Infektion ist in den untersuchten Proben
rekonvaleszenter Tiere nur noch ein sehr geringer KHV-DNA-Gehalt nachzuweisen, was für
die Ausprägung einer latenten beziehungsweise persistenten Phase des Herpesvirus in diesen
Karpfen spricht. Der Nachweis von KHV-DNA in aufgereinigten PBL spricht für die
Möglichkeit der systemischen Verteilung des Virus durch diese Blutfraktion. Da es sich aber
lediglich um den Nachweis von DNA handelt, könnte es sich aber auch nur um Teile des
zerstörten Virus handeln, der von diesem Teil des Immunsystems bekämpft wurde. Der
Nachweis von KHV-DNA im Kiemenschleim konkretisiert die Vermutung der Ausscheidung
125
von infektiösem Virus durch die Kiemen und damit die kiemenvermittelte schnelle
Weiterverbreitung des Virus im Wasser.
Das Nierengewebe erscheint im Vergleich der untersuchten Materialien am verlässlichsten
zum Nachweis von KHV, da es quantitativ am stärksten belastet war und einen sensitiven
Nachweis von KHV-DNA aus den Proben erlaubte. Nachteilig stellt sich die ausschließlich
letale Entnahme dar. Von den nicht-letal zu entnehmenden Proben konnte KHV-DNA in den
PBL am verlässlichsten und sensitivsten nachgewiesen werden, wobei in dieser Probe fast
immer nur verhältnismäßig geringe Mengen gemessen werden konnten. Ferner schlägt der
hohe Aufwand der PBL-Probenentnahme und die PBL-Aufarbeitung negativ zu Buche. Das
Kiemengewebe erwies sich für die Diagnostik als etwas weniger sensitiv als die PBL.
Kiemengewebe kann jedoch leicht entnommen und verarbeitet werden. Bei den untersuchten
Kiemen fielen außerdem im Vergleich zu den PBL mehr hoch belastete Proben auf. Der
Kiemenabstrich stellt die am wenigsten invasive Methode zur nicht-letalen Probenentnahme
dar. Im Kiemenschleim gelang zwar der Nachweis von KHV-DNA, aber dieses Material wies
die geringste Sensitivität auf. Vereinzelt konnten hohe Mengen an KHV-DNA gefunden
werden. In der überwiegenden Anzahl der Kiemenschleimproben wurde jedoch nur eine
geringe Viruslast gefunden
Einige
Proben
des
Infektionsversuchs
konnten
vergleichend
mittels
Elektronenmikroskopie, der Virusreisolierung und anschließendem Immunfluoreszenztest der
Blindpassagen untersucht werden. In den Passagen des inokulierten Organmaterials konnten
weder cpE noch Immunfluoreszenz beobachtet werden.
Anhand der vorliegenden Ergebnisse wurde KHV mittels quantitativer multiplex real-time
PCR sensitiv, zuverlässig und spezifisch nachgewiesen.
126
7
SUMMARY
Meike Riechardt:
Development of a multiplex real-time PCR protocol for the detection of koi herpesvirus
(KHV) and investigations on the pathogenesis of the koi herpesvirus infection in
experimentally infected mirror carp (Cyprinus carpio)
The koi herpesvirus (KHV) disease has caused severe losses in the aquaculture of common
carp and koi since the 1990s. After virus isolation and electronic microscopy, KHV-diagnosis
methods have been improved substantially by the development of conventional KHV-PCR
assays. A further advancement of this specific genomic detection method was the
development of a real-time PCR assay by GILAD et al. (2004).
In the presented work GILAD's real-time PCR for the first time was used as a multiplex
real-time PCR protocol, which allows the specific and sensitive detection of KHV-genome
and an internal control-DNA according to HOFFMANN et al. (2006) simultaneously.
A limit of detection of 10 copies of KHV-genome equivalents for GILAD's PCR has been
confirmed for the multiplex real-time PCR protocol as well. 1 copy of KHV specific DNA
can be detected occasionally using this method and 10 to 1010 copies of KHV-DNA can be
detected reliable. An universal internal control DNA, which is added at the DNA extraction
process and co-amplificated during the multiplex PCR, was introduced as a quality control for
both, the DNA extraction procedure and the amplification process as well. Furthermore, the
multiplex PCR approach facilitates the fast and easy absolute quantification of target DNA in
the samples.
Comparative analyses of the sensitivity of different PCR assays revealed that the
developed multiplex real-time protocol performed as good as the protocols according to
BERCOVIER et al. (2005) (conventional PCR), BERGMANN et al. (2006) (nested PCR) and
PIKARSKY et al. (2004) (conventional PCR). Slightly less sensitive was the protocol
according to GRAY et al. (2002) modified by YUASA et al. (2005) (conventional PCR)
followed by the conventional PCR protocols according to GRAY al. (2002) and GILAD et al.
(2002).
127
In addition, the pathogenesis of the KHV infection was examined in order to improve the
diagnosis of the KHV disease. Clinical diseased carp as well as reconvalescent carp were
generated by laboratory infection of mirror carp. Both juvenile and adult carp were infected
and cohabitated in order to compare the susceptibility of different age groups. The carp were
kept at the permissive temperature of 23 °C and were treated with a bath infection using two
different infection doses of KHV. During the course of the infection, the amount of KHVDNA in periodically taken samples was determined by the quantitative multiplex real-time
PCR protocol according to GILAD et al. (2004) and HOFFMANN et al. (2006). Depending
on the infection dose, clinical signs and mortality different amounts of KHV-DNA were
found in kidney, gill tissue, and for the first time in gill mucus and peripheral blood
leucocytes (PBL). The higher infection dose induced stronger clinical signs and a faster and
higher mortality but had only little influence on the amount of KHV-specific DNA in the
samples. Only juvenile carp died, thus the age of infected carp is of vital importance. During
the infection experiment juvenile carp were more susceptible to KHV disease than adult carp.
Mortality always was associated with a very high virus load in fish tissue. In adult carp the
highest amount of KHV-specific DNA was found during the clinical phase of infection. Over
all, the DNA amount decreased in all tissue samples over the time. At 6 and 8 weeks post
infection all samples of reconvalescent carp contained only a small amount of KHV-DNA,
which indicates a latent or persistent stage of the herpesvirus in these fishes. The detection of
KHV-DNA in PBL could possibly mean a systemic spread of the virus via these cells. But
due to the fact that only DNA could be detected, this DNA might originate from virus which
was destroyed by the immune system and was therefore no longer infectious to cells. The
presence of KHV-DNA in gill mucus suggests a secretion of infectious virus into the water
and could indicate a gill related fast spreading of the KHV disease.
Since the kidney tissue showed the highest amount of KHV-specific DNA compared to the
other analysed organs, kidney samples have to be regarded as the most reliable material for
the KHV diagnosis using the specific genome detection. A disadvantage however was the
lethal procedure of sample collection. Of the non-lethal sampling procedures, KHV-DNA
could be detected in PBL in the most reliable and sensitive way. But in most PBL samples,
there was only a low amount of KHV-DNA detectable. Furthermore, the effort related with
PBL sampling and processing is high. The detection of KHV-DNA in gill tissue was found to
128
be slightly less sensitive than in PBL. Otherwise, there were more high loaded samples and
the gill tissue can be extracted and processed easily. The sampling of gill mucus is minimally
invasive but in respect of both sensitivity and quantitative detection this material always gave
the least accurate results compared to the other materials. Although singular gill mucus
samples revealed a remarkable amount of KHV-DNA, the virus load in that particular
material was found to be low in general.
For comparison a few tissue samples were analysed by electron microscopy and by virus
isolation and subsequent indirect immunofluorescence of blind passages. Neither the
formation of a cpE nor KHV-specific immunofluorescence could be detected.
In this study the quantitative multiplex real-time PCR detected KHV in a sensitive, specific
and reliable manner.
129
8
LITERATURVERZEICHNIS
ADKISON, M. A., GILAD, O. u. HEDRICK, R. P. (2005):
An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of antibodies to the koi
herpesvirus (KHV) in the serum of koi Cyprinus carpio.
Fish Path. 40 (2), 53 - 62.
AFONINA, I. A., REED, M. W., LUSBY, E., SHISHKINA, I. G. u. BELOUSOV, Y. S.
(2002):
Minor groove binder-conjugated DNA probes for quantitative DNA detection by
hybridization-triggered fluorescence.
Biotechniques 32, 940 - 949
ANONYMUS (1909 - 2007):
Tierseuchengesetz §§ 9 und 11, Ausfertigungsdatum: 26.06.1909, Neugefasst durch Bek. v.
22. 6.2004 I 1260; 3588; zuletzt geändert durch Art. 1 § 5 Abs. 3 G v. 13.12.2007 I 2930
ANONYMUS (2004 - 2008):
Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen vom 3. November 2004, zuletzt geändert
durch: Artikel 2 der Verordnung vom 24. November 2008 (BGBl. I S. 2315)
ANONYMUS (2010):
Amtliche Probensammlung, Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für
Tiergesundheit, Stand Juli 2010
AOKI, T., HIRONO I., KUROKAWA K., FUKUDA H., NAHARY, R., ELDAR, A.,
DAVISON, A. J., WALTZEK, T., B., BERCOVIER, H. u. HEDRICK R., P. (2007):
Genome sequences of three koi herpesvirus isolates representing the expanding distribution of
an emerging disease threatening koi and common carp worldwide.
J. Virol. 81 (10), 5058 - 5065
130
BERCOVIER, H., FISHMAN, Y., NAHARY, R., SINAI, S., ZLOTKIN, A., EYNGOR, M.,
GILAD, O., ELDAR, A. u. HEDRICK, P. (2005):
Cloning of the koi herpesvirus (KHV) gene encoding thymidine kinase and its use for a
highly sensitive PCR based diagnosis.
BMC Microbiology 5 (13), 1 - 9
BERGMANN, S.M., KEMPTER, J., SADOWSKI, J., u. FICHTNER, D. (2006):
First detection, confirmation and isolation of koi herpesvirus (KHV) in cultured common
carp (Cyprinus carpio L.) in Poland
Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 26, 97 - 104
BERGMANN, S.M., RIECHARDT, M., FICHTNER, D:, LEE, P. u. KEMPTER, J. (2010):
Investigation on the diagnostic sensitivity of molecular tools used for detection of koi
herpesvirus.
J Virol. Methods 163, 229 - 233
BORCHERS , K., GOLTZ, M., u. LUDWIG, H., (1994):
Genome organization of the herpesviruses: minireview.
Acta Vet. Hung. 42, 217 - 25
BRÄUER G., u. HERMS J. (2004):
Letter to the editor: Severe losses of common carp in Germany due to Koi Herpesvirus
(KHV)
Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 24 (5), 216
BRETZINGER, A., FISCHER-SCHERL, T., OUMOUNA, M., HOFFMAN, R. u. TRUYEN,
U. (1999):
Mass mortalities in koi, Cyprinus carpio, associated with gill and skin disease.
Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 19, 182 - 185.
131
BRUNBORG, I. M., MOLDAL, T. u. JONASSEN u. C. M. (2004):
Quantitation of porcine circovirus type 2 isolated from serum/plasma and tissue samples of
healthy pigs and pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome using a
TaqManbased real-time PCR.
J. Virol. Methods 122, 171 - 178
BUSTIN, S. A. (2000):
Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain
reaction assays.
J. Mol. Endocrinol. 25, 169 - 193
CALLE, P.P., MCNAMARA, T. u. KRESS, Y. (1999):
Herpesvirus-associated papillomas in koi carp (Cyprinus carpio).
J. Zoo Wildlife Med. 30, 165 - 169
CARDULLO, R. A., AGRAWAL, S., FLORES, C., ZAMECNIK, P. C. u. WOLF, D. E.
(1988):
Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy
transfer.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8790 - 8794
CHAMBERLAIN, J. S., GIBBS, R. A., RANIER, J. E., NGUYEN, P. N. u. CASKEY, C. T.
(1988):
Deletion screening of the Duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA
amplification.
Nucleic Acids Res. 16, 11141 - 11156
CHIEN, A., EDGAR, D. B. u. TRELA, J. M. (1976):
Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus.
J. Bacteriol. 127, 1550 - 1557
132
COSTES, B., FOURNIER, G., MICHEL, B., DELFORGE, C., STALIN RAJ, V., DEWALS,
B., GILLET, L., DRION, P., BODY, A., SCHYNTS, F., LIEFFRIG, F., u.
VANDERPLASSCHEN, A. (2008):
Cloning of the koi herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome
demonstrates that disruption of the thymidine kinase locus induces partial attenuation
in Cyprinus carpio koi.
J. Virol. 82, 4955 - 4964
COSTES, B., STALIN RAJ, V., MICHEL, B., FOURNIER, G., THIRION, M., GILLET,
L., MAST, J.,, LIEFFRIG, F., BREMONT, M., u. VANDERPLASSCHEN, A. (2009):
The major portal of entry of koi herpesvirus in Cyprinus carpio is the skin.
J. Virol. 83, 2819 - 2830
DAVISON, A. J., TRUS, B. L., CHENG, N., STEVEN, A. C., WATSON, M. S.,
CUNNINGHAM, C., LE DEUFF, R.-M. u. RENAULT (2005):
A novel class of herpesvirus with bivalve hosts.
J Gen Virol 86, 41 - 53
DAVISON, A. J. (2002):
Evolution of the herpesviruses.
Vet. Microbiol. 86, 69 - 88
DAVISON, A. J. u. DAVISON, M. D. (1995):
Identification of structural proteins of channel catfish virus by mass spectrometry.
Virology 206, 1035 - 1043
DAVISON, A. J. (1992):
Channel catfish virus: a new type of herpesvirus.
Virology 186, 9 - 14
133
DAVISON, A: J., EBERLE, R., EHLERS, B., HAYWARD, G.S., MCGEOCH, D.J.,
MINSON, A.C., PELLETT, P.E., ROIZMAN, B., STUDDERT, M.J. u. THIRY, E. (2009):
The order Herpesvirales.
Arch. Virol. 154, 171 - 177
DE WIT, C., FAUTZ, C. u. XU, Y. (2000):
Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture.
Biologicals 28, 137 - 148
DISHON, A., PERELBERG, A., BISHARA-SHIEBAN, J., ILOUZE, M., DAVIDOVICH,
M., WERKER, S. u. KOTLER, M. (2005):
Detection of carp interstitial nephritis and gill necrosis virus in fish droppings.
Appl. Environ. Microbiol. 71, 7285 - 7291
DROSTEN, C., SEIFRIED, E. u. ROTH, W. K. (2001):
TaqMan 5'-nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phage-packaged
competitive internal control for high-throughput blood donor screening.
J. Clin. Microbiol. 39, 4302 - 4308
EL-MATBOULI, M., SALEH, M. u. SOLIMAN, H. (2007):
Detection of cyprinid herpesvirus type 3 in goldfish cohabiting with CyHV-3-infected koi
carp (Cyprinus carpio koi).
Veterinary Record 161, 792 - 793
FRONHOFFS, S., TOTZKE, G., STIER, S., WERNERT, N., ROTHE, M., BRUNING, T.,
KOCH, B., SACHINIDIS, A., VETTER, H. u. KO, Y. (2002):
A method for the rapid construction of cRNA standard curves in quantitative real-time reverse
transcription polymerase chain reaction.
Mol. Cell. Probes 16, 99 - 110
134
GIBSON, U. E., HEID, C. A. u. WILLIAMS, P. M. (1996):
A novel method for real time quantitative RT-PCR.
Genome Res. 6, 995 - 1001
GIESENDORF, B. A. J., VET, J. A. M., TYAGI, S., MENSINK, E. J. M. G., TRIYBELS, F.
J. M. u. BLOM, H. J. (1998):
Molecular beacons: a new approach for semiautomated mutation analysis.
Clin. Chem. 44, 482 - 486
GILAD, O., YUN, S., ADKINSON, M. A., WAY, K., WILLITS, N. H., BERCOVIER, H. u.
HEDRICK, R. P. (2003):
Molecular comparison of isolates of an emerging fish pathogen, koi herpesvirus, and the
effect of water temperature on mortality of experimentally infected koi.
J. Gen. Virol. 84, 2661 - 2668
GILAD, O., YUN, S., ANDREE, K. B., ADKINSON, M. A., ZLOTKIN, A., BERCOVIER,
H., ELDAR, A. u. HEDRICK, R. P. (2002):
Initial characteristics of koi herpesvirus and development assay to detect the virus in koi,
Cyprinus carpio koi.
Dis. Aquat. Org. 48, 101 - 108
GILAD, O., YUN, S., ZAGMUTT-VERGARA, F. J., LEUTENEGGER, C. M.,
BERCOVIER, H. u. HEDRICK, R. (2004):
Concentrations of a koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected Cyprinus
carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR.
Dis. Aquat. Org. 60, 179 - 187
GINSBERG, H.S. (1988):
Herpesviruses.
In: DULBECCO, R., u. GINSBERG, H. S. (Hrsg.), Virology, J. B. Lippincott Company,
Philadelphia, 161 - 179
135
GRAY, W. L., MULLIS, L., PATRA, S. E. L., GROFF, J. M. u. GOODWIN, A. (2002):
Detection of koi herpesvirus DNA in tissues of infected fish.
J. Fish Dis. 25, 171 - 178
GUNIMALADEVI, I., VENUGOPAL, M. N. u. SAKAI, M. (2004):
Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated
isothermal amplification.
J. Fish Dis. 27, 583 - 589
HAENEN, O. u. HEDRICK, R. (2006):
Koi herpesvirus workshop.
Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 26, 26 - 37
HAENEN, O. L. M., WAY, K., BERGMANN, S. M. u. ARIEL, E. (2004):
The emergence of koi herpesvirus and its significance to European aquaculture.
Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 24, 293 - 307
HEDRICK, R. P., GILAD, O., YUN, S., SPANGENBERG, J., MARTY, G.,
NORDHAUSEN, R., KEBUS, M., BERCOVIER, H. u. ELDAR, A. (2000):
A herpesvirus associated with mass mortality of juvenile and adult koi, a strain of common
carp.
J. Aquat. Animal Health 12, 44 - 55
HEDRICK, R. P., GILAD, O., YUN, S. C., MCDOWELL, T. S., WALTZEK, T. B.,
KELLEY, G. O. u. ADKISON, M. A. (2005):
Initial isolation and characterization of a herpes-like virus (KHV) from koi and common carp.
Bull. Fish Res. Agency 2, 1 - 7
136
HEDRICK, R. P., WALTZEK, T. B. u. MCDOWELL, T. S. (2006):
Susceptibility of koi carp, common carp, goldfish, and goldfish x common carp hybrids to
cyprinid herpesvirus-2 and herpesvirus-3.
J. Aquat. Anim. Health 18, 26 - 34
HEID, C. A., STEVENS, J., LIVAK, K. J. u. WILLIAMS, P. M. (1996):
Real time quantitative PCR.
Genome Res. 6, 986 - 994
HIGUCHI, R., DOLLINGER, G., WALSH, P. S. u. GRIFFITH, R. (1992):
Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.
Biotechnology 10, 413 - 417
HIGUCHI, R., FOCKLER, C., DOLLINGER, G. u. WATSON, R. (1993):
Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions.
Biotechnology 11, 1026 - 1030
HOFFMANN, B., DEPNER, K., SCHIRRMEIER, H. u. BEER, M. (2006):
A universal heterologous internal control system for duplex real-time RT-PCR assays used in
a detection system for pestiviruses.
J. Virol. Methods 136, 200 - 209
HOFFMANN, B., GALL, A., SCHIRRMEIER, H. u. BEER, M. (2008):
Nukleinsäure-basierte diagnostische Untersuchungen zum Nachweis von Pestiviren.
Nova Acta Leopoldina NF 95, 350, 103 - 123
HOFMANN, M. A. (2003):
Construction of an infectious chimeric classical swine fever virus containing the 5'UTR of
bovine viral diarrhea virus, and its application as a universal internal positive control in realtime RT-PCR.
J. Virol. Methods 114, 77 - 90
137
HOFFMANN, R. (2000):
Koiseuche bedroht Karpfenteichwirtschaft.
Fischer Teichwirt 11, 432
HUTORAN, M., RONEN, A., PERELBERG, A., ILOUZE, M., DISHON, M., BEJERANO,
I., CHEN, N. u. KOTLER, M. (2005):
Description of an as yet unclassified DNA virus from diseased Cyprinus carpio species
J. Virol. 79, 1983 - 1991
ILOUZE, M., DISHON, A. u. KOTLER, M. (2006 a):
Characterization of a novel virus causing a lethal disease in carp and koi
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70 (1), 147 - 156
ILOUZE, M., DISHON, A., KAHANB, T. u. KOTLER, M. (2006 b):
Cyprinid herpes virus-3 (CyHV-3) bears genes of genetically distant
large DNA viruses
FEBS Letters 580, 4473 - 4478
ISHIOKA, T., YOSHIZUMI, M., IZUMI, S., SUZUKI, K., SUZUKI, H., KOZAWA, K.,
ARAI, M., NOBUASAWA, K., MORITA, Y., KATO, M., HOSHINO, T., IIDA, T.,
KOSUGE, K. u. KIMURA, H., (2005):
Detection and sequence analysis of DNA polymerase and major envelope protein genes in koi
herpesviruses derived from Cyprinus carpio in Gunma prefecture, Japan
Veterinary Microbiology 110, 27 - 33
ITO, T., SANO, M., KURITA, J., YUASA, K., u. IIDA, T. (2007):
Carp Larvae Are Not Susceptible to Koi Herpesvirus
Fish. Path. 42 (2), 107-109
138
JUNG, S. J. u. MIYAZAKI, T. (1995):
Herpesviral haematopoietic necrosis of goldfish, Carassius auratus (L.).
J. Fish Dis. 18, 211 - 220
KAMIMURA, S., HAGI T., KURATA, S., TAKATSU, K., SOGO, H., HOSHINO, T. u.
NAKAMURA, K., (2007):
Evaluation of quenching probe (QProbe) PCR assay for quantification of the koi herpes virus
(KHV).
Microbes Environ. 22, 223 - 231
KASAI, H., MUTO, Y. u. YOSHIMIZU, M. (2005):
Virucidal effects of ultraviolet, heat treatment and disinfectants against koi herpesvirus
(KHV).
Fish Path. 40, 137 - 138
KREUZER, K.-A., BOHN, A., LUPBERGER, J., SOLASSOL, J., LE COUTRE, P. u.
SCHMIDT, C. A. (2001):
Simultaneous absolute quantification of target and control templates by real-time fluorescence
reverse transcription-PCR using 4-(4´-dimethylaminophenylazo)benzoic acid as a dark
quencher dye.
Clin. Chem. 47, 486 - 490
KUCUKTAS, H., BRADY, Y. J. u. TUZUN, S. (1998):
Cloning and expression of a putative glycoprotein gene of channel catfish virus using
baculovirus expression system.
Dis. Aquat. Organ. 34, 231 - 237
KUMAR, S., REED, M. W., GAMPHER H. B. JR, GORN, V. V., LUKHTANOV, E. A.,
FOTI, M., WEST, J., MEYER, R. B. JR u. SCHWEITZER, B. I. (1998):
Solution structure of a highly stable DNA duplex conjugated to a minor groove binder.
Nucleic Acids Res. 26, 831 - 838
139
KUTYAVIN, I. V., AFONINA, I. A., MILLS, A., GORN, V. V., LUKHTANOV, E. A.,
BELOUSOV, E. S., SINGER, M. J., WALBURGER, D. K., LOKHOV, S. G., GALL, A. A.,
DEMPCY, R., REED M. W., MEYER, R. B. u. HEDGPETH, J. (2000):
3´-Minor groove binder-DNA probes increase sequence specificity at PCR extension
temperatures.
Nucleic Acids Res. 28, 655 - 661
LIVAK, K. J. u. SCHMITTGEN, T. D. (2001):
Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta
Delta C(T)) Method.
Methods 25, 402 - 408
LIVAK, K. J., FLOOD, S. J., MARMARO, J., GIUSTI, W. u. DEETZ, K. (1995):
Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system
useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization.
PCR Methods Appl. 4, 357 - 362
LE DEUFF, R. M., WAY, K., ECCLESTONE, L., DIXON, P. F., BETTS, A. M., STONE, D.
M., GILAD, O., u. HEDRICK, R. P. (2001):
Development and comparison of techniques for the diagnosis of koi herpesvirus (KHV).
Poster – 10th International Conference of the EAFP, Dublin, Sept. 2001
MACKAY, I. M., ARDEN, K. E. u. NITSCHE, A. (2002):
Real-time PCR in virology.
Nucleic Acids Res. 30, 1292 - 1305
MCGEOCH, D., J., RIXON, F., J. u. DAVISON, A., J. (2006):
Topics in herpesvirus genomics and evolution
Virus Research 117, 90 - 104
140
MCKILLIP, J. L. u. DRAKE, M. (2004):
Real-time nucleic acid-based detection methods for pathogenic bacteria in food.
J. Food Prot. 67, 823 - 832
MINSON, A. C., DAVISON, A., EBERLE, R., DESROSIERS, R. C., FLECKENSTEIN, B.,
GEOCH, J. M., PELLET, P. E., ROIZMANN, B. u. STUDDERT, M. J. (2000):
Family Herpesviridae.
In: Virus taxonomy: Seventh report of the international commitee on taxonomy of viruses.
Academic Press., San Diego, 203 - 225
MIYAKAZI, T., OKAMOTO, H., KAGEYAMA, T. u. KOBAYASHI, T. (2000):
Viremia-associated Ana-Aqki-Byo, a new viral disease in color carp Cyprinus carpio in
Japan.
Dis. Aquat. Organ. 39, 188 - 192
MÜLHARDT C. (2002):
Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics.
Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 3. Auflage
MULLIS, K. B. u. FALOONA, F. A. (1987):
Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction.
Methods Enzymol. 155, 335 - 350
MULLIS, K., FALOONA, F., SCHARF, S., SAIKI, R., HORN, G. u. ERLICH, H. (1986):
Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction.
Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 51 (1), 263 - 273
NAZARENKO, I. A., BHATNAGAR, S. K. u. HOHMAN, R. J. (1997):
A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer.
Nucleic Acids Res. 25, 2516 - 2521
141
NEUKIRCH, M. (2003 a):
Untersuchungen zur Stabilität von Koi-Virusisolaten.
1. Mitteilung: Einfluß der Temperatur auf die Vermehrungsfähigkeit.
KLAN Koi-Magazin 11, 41 - 47
NEUKIRCH, M. (2003 b):
Untersuchungen zur Stabilität von Koi-Virusisolaten.
2. Mitteilung: Einfluß verschiedener pH-Werte auf die Vermehrungsfähigkeit.
KLAN Koi-Magazin 11, 59 - 62
NEUKIRCH, M. (2001):
Virusinfektionen bei Koi.
KLAN Koi-Magazin 9, 47 - 53
NEUKIRCH, M., BOETTCHER, K. u. BUNNAJIRAKUL, S. (1999):
Isolation of a virus from koi with altered gills.
Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 19, 221 - 224
NEUKIRCH, M. u. KUNZ, U. (2001):
Isolation and preliminary characterization of several viruses from koi (Cyprinus carpio)
suffering gill necrosis and mortality.
Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 21, 125 - 135
NIESTERS, H. G. (2004):
Molecular and diagnostic clinical virology in real time.
Clin. Microbiol. Infect. 10, 5 - 11
OH, J. M., JUNG, S. J., CHOI, T. J., KIM, H. R., RAJENDRAN, K. V., KIM, Y. J., PARK,
M.-A. u. CHUN, S. K. (2001):
A viral disease occuring in cultured carp Cyprinus carpio in Korea.
Fish Path. 36, 147 - 151
142
OLVERA, A., SIBILA, M., CALSAMIGLIA, M., SEGALES, J. u. DOMINGO, M. (2004):
Comparison of porcine circovirus type 2 load in serum quantified by a real time PCR in
postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine dermatitis and nephropathy
syndrome naturally affected pigs.
J. Virol. Methods 117, 75 - 80
PANSERAT, S., BLIN, C. MEDALE, F., PLAGNES-JUAN, E., BREQUE, J.,
KRISHNAMOORTHY , J. u. KAUSHIK, S. (2000):
Molecular cloning, tissue distribution and sequence analysis of complete glucokinase
cDNAs from gilthead seabream (Sparus aurata), rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and
common carp (Cyprinus carpio).
Biochem Biophys Acta 1474, 61 - 69
PERELBERG, A., RONEN, A., HUTORAN, M., SMITH, Y. u. KOTLER, M. (2005):
Protection of cultured Cyprinus carpio against a lethal viral disease by an attenuated virus
vaccine.
Vaccine 23, 3396 - 3403
PERELBERG, A., SMIRNOV, M., HUTORAN, M., DIAMANT, A., BEJERANO, Y. u.
KOTLER, M. (2003):
Epidemiological description of an new viral disease afflicting cultured Cyprinus carpio in
Israel.
Isr. J. Aquaculture-Bamidgeh 55, 5 - 12
PERSSON, K., HAMBY, K. u. UGOZZOLI, L. A. (2005):
Four-color multiplex reverse transcription polymerase chain reaction-overcoming its
limitations.
Anal. Biochem. 344, 33 - 42
143
PICKERING, J., BAMFORD, A., GODBOLE, V., BRIGGS, J., SCOZZAFAVA, G., ROE,
P., WHEELER, C., GHOUZE, F. u. CUSS, S. (2002):
Integration of DNA ligation and rolling circle amplification for the homogeneous, end-point
detection of single nucleotide polymorphisms.
Nucleic Acids Res. 30, 1 - 7
PIKARSKY, E., RONEN, A., ABRAMOWITZ, J., LEVAVI-SIVAN, B., HUTORAN, M.,
SHAPIRA, Y., STEINITZ, M., PERELBERG, A., SOFFER, D. u. KOTLER, M. (2004):
The pathogenesis of the acute viral disease in fish induced by the carp interstitial nephritis
and gill necrosis virus (CNGV).
J. Virol. 78, 9544 - 9551
POKOROVA, D., PIACKOVA, V., CIZEK, A., RESCHOVAL, S., HULOVAL, J.,
VICENOVAL, M. u. T. VESELYL, T (2007):
Tests for the presence of koi herpesvirus (KHV) in common carp (Cyprinus carpio carpio)
and koi carp (Cyprinus carpio koi) in the Czech Republic.
Veterinarni Medicina 52, 562 - 568
QuantiTect ® Multiplex PCR NoROX Handbook 11/2004, QIAGEN®
RASMUSSEN, T. B., UTTENTHALL,Å., DE STRICKERL, K., BELÁK, S., u.
STORDAARD, T. (2003):
Development of a novel quantitative real-time RT-PCR assay for the simultaneous detection
of all serotypes of Foot-and-mouth disease virus.
Arch. Virol. 148, 2005 - 2021
ROIZMAN, B. (1982):
The family Herpesviridae: a general description, taxonomy and classification.
In: Roizman, B. (Hrg.), The Herpesviruses, Vol. 2, Plenum Press, London, 1 - 23
144
ROLLE, M. u. A. MAYR (1993):
Medizinische Mikrobiologie, Infektions- und Seuchenlehre. 6. Auflage.
Ferdinand Enke Verlag, Stuttgart
RONEN, A., PERELBERG, A., ABRAMOWITZ, J., HUTORAN, M., TINMAN, S.,
BEJERANO, I., STEINITZ, M. u. KOTLER, M. (2003):
Efficient vaccine against the virus causing a lethal disease in cultured Cyprinus carpio.
Vaccine 21, 4677 - 4684
ROSENKRANZ, D., KLUPP, B. G., TEIFKE, J. P., GRANZOW, H., FICHTNER, D.,
METTENLEITER, T. C. u. FUCHS, W. (2008):
Identification of envelope protein pORF81 of koi herpesvirus
J. Gen. Virol. 89, 896 - 900
ROSSEN, L., NORSKOV, P., HOLMSTROM, K. u. RASMUSSEN, O. F. (1992):
Inhibition of PCR by components of food samples, microbial diagnostic assays and DNAextraction solutions.
Int. J. Food Microbiol. 17, 37 - 45
RYAN, G., KLEIN, D., KNAPP, E., HOSIE, M. J., GRIMES, T., MABRUK, M. J.,
JARRETT, O. u. CALLANAN, J. J. (2003):
Dynamics of viral and proviral loads of feline immunodeficiency virus within the feline
central nervous system during the acute phase following intravenous infection.
J. Virol. 77, 7477 - 7485
SADLER, J., MARCAUX, E. u. GOODWIN, A., E. (2008):
Detection of koi herpes virus (CyHV-3) in goldfish, Carassius auratus (L.), exposed to
infected koi.
J. Fish Dis. 31, 71 - 72
145
SAIKI, R. K., GELFAND, D. H., STOFFEL, S., SCHARF, S. J., HIGUCHI, R., HORN, G.
T., MULLIS, K. B. u. ERLICH, H. A. (1988):
Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.
Science 239, 487 - 491
SANO, M., ITO, T., KURITA, J., YANAI, T., WATANABE, N., MIWA, S. u. IIDA, T.
(2004):
First Detection of Koi Herpesvirus in Cultured Common Carp Cyprinus carpio in Japan
Fish Path. 39 (3), 165 - 167
SANO, T., MORITA, N., SHIMA, N. u. AKIMOTO, M. (1991):
Herpesvirus cyprini: lethality and oncogenity.
J. Fish Dis. 14, 533 - 543
SANO, T., FUKUDA, H., FURUKAWA, M., HOSOYA, H. u. MORIYA, Y. (1985 a):
A herpesvirus isolated from carp papilloma in Japan.
Fish Shellfish Path. 32, 307 - 311
SANO, T., FUKUDA, H. u. FURUKAWA, M. (1985 b):
Herpesvirus cyprini: biological and oncogenic properties.
Fish Pathology 20, 381 - 388
SHAPIRA, Y., MAGEN, Y., ZAK, T., KOTLER, M., HULATA, G. u. LEVAVI-SIVAN, B.
(2005):
Differential resistance to koi herpes virus (KHV)/carp interstitial nephritis and gill necrosis
virus (CNGV) among common carp (Cyprinus carpio L.) strains and crossbreds.
Aquaculture 245, 1 - 11
SHIMIZU, T., YOSHIDA, N., KASAI, H. u. YOSHIMIZU, M. (2006):
Survival of koi herpesvirus (KHV) in environmental water.
Fish Path. 41, 153 - 157
146
SOLIMAN, H. u. EL-MATBOULI, M. (2005):
An inexpensive and rapid diagnostic method of koi herpesvirus (KHV) infection by loopmediated isothermal amplification.
Virol. J. 2, 83
SOLIMAN, H. u. EL-MATBOULI, M (2009):
Immunocapture and direct binding loop mediated isothermal amplification simplify molecular
diagnosis of Cyprinid herpesvirus-3.
J. Virol. Methods 162, 91 - 95
ST-HILAIRE, S., BEEVERS, N., WAY, K., DEUFF, R. M. L., MARTIN, P. u. JOINER, C.
(2005):
Reactivation of koi herpesvirus infections in common carp Cyprinus carpio.
Dis. Aquat. Org. 67, 15 - 23
STORDEUR, P., POULIN, L. F., CRACIUN, L., ZHOU, L., SCHANDENE, L., DE
LAVAREILLE, A., GORIELY, S. u. GOLDMAN, M. (2002):
Cytokine mRNA quantification by real-time PCR.
J. Immunol. Methods 259, 55 - 64
SVANVIK, N., STÅHLBERG, A., SEHLSTEDT, U., SJÖBACK, R. u. KUBISTA, M.
(2000):
Detection of PCR products in real time using light-up probes.
Anal. Biochem. 287, 179 - 182
TAKASHIMA, Y., WATANABE, N., YANAI, T., u. NAKAMURA, T. (2005):
The status of koi herpesvirus disease outbreaks in lake kasumigaura and kitaura
Bull. Fish. Res. Agen. 2, 65 - 71
147
TERHUNE, J.S., GRIZZLE, J.M., HAYDEN K. u. MCCLENAHAN, S.D. (2004):
First report of koi herpesvirus in wild common carp in the Western Hemisphere
Fish Health Newsletter. American Fisheries Society, Fish Health Section, 32, 8 - 9
THELWELL, N., MILLINGTON, S., SOLINAS, A., BOOTH, J. u. BROWN, T. (2000):
Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection.
Nucleic Acids Res. 28, 3752 - 3761
TOOULI, C. D., TURNER, D. R., GRIST, S. A. u. MORLEY, A. A. (2000):
The effect of cycle number and target size on polymerase chain reaction amplification of
polymorphic repetitive sequences.
Anal. Biochem. 280, 324 - 326
TOWNER, J. S., ROLLIN, P. E., BAUSCH, D. G., SANCHEZ, A., CRARY, S. M.,
VINCENT, M., LEE, W. F., SPIROPOULOU, C. F., KSIAZEK, T. G., LUKWIYA, M.,
KADUCU, F., DOWNING, R. u. NICHOL, S. T. (2004):
Rapid diagnosis of Ebola hemorrhagic fever by reverse transcription-PCR in an outbreak
setting and assessment of patient viral load as a predictor of outcome.
J. Virol. 78, 4330 - 4341
TU, C., WENG, M.C., SHIAU, J.R. u. LIN, S.Y. (2004):
Detection of koi herpesvirus in koi Cyprinus carpio in Taiwan.
Fish Pathol. 39, 109 - 110
TYAGI, S., BRATU, D. P. u. KRAMER, F. R. (1998):
Multicolor molecular beacons for allele discrimination.
Nat. Biotechnol. 16, 49 - 53
148
VAN REGENMORTEL, M. H. V., FAUQUET, C.M., BISHOP, D. H. L., CARSTENS, E.
B., ESTES, M. K., LEMON, S. M., MANILOFF, J., MAYO, M.A., MCGEOCH, D. J.,
PRINGLE, C.R. u. WICKNER, R. B. (2000):
Virus Taxonomy.
Seventh report of the International Committee of Taxonomy of Viruses, Academic Press,
New York
WALSTER, C. I. (1999):
Clinical observations of severe mortalities in koi carp, Cyprinus carpio, with gill disease.
Fish Vet. J. 3, 54 - 58
WALTZEK, T. B., KELLEY, G. O., STONE, D. M., WAY, K., HANSON, L., FUKUDA, H.,
HIRONO, I., AOKI, T., DAVISON, A. J. u. HEDRICK, R. P. (2005):
Koi herpesvirus represents a third cyprinid herpesvirus (CyHV-3) in the family
Herpesviridae.
J. Gen. Virol. 86, 1659 - 1667
WHITCOMBE, D., THEAKER, J., GUY, S. P., BROWN, T. u. LITTLE, S. (1999):
Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence.
Nat. Biotechnol. 17, 804 - 807
WILSON, I. G. (1997):
Inhibition and facilitation of nucleic acid amplification.
Appl. Environ. Microbiol. 63, 3741 - 3751
WITTWER, C. T., HERRMANN, M. G., MOSS, A. A. u. RASMUSSEN, R. P. (1997a):
Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.
Biotechniques 22, 130 - 138
149
WITTWER, C. T., RIRIE, K. M., ANDREW, R. V., DAVID, D. A., GUNDRY, R. A. u.
BALIS, U. J. (1997b):
The LightCycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control.
Biotechniques 22, 176 - 181
YASUMOTO, S., KUZUYA, Y., YASUDA, M., YOSHIMURA, T. u. MIYAZAKI, T.
(2006):
Oral immunization of common carp with a liposome vaccine fusing koi herpesvirus antigen.
Fish Path. 41, 141 - 145
YUASA, K., SANO, M., KURITA, J., ITO, T. u. IIDA, T., (2005):
Improvement of a PCR method with the Sph 1-5 primer set for the detection of koi
herpesvirus (KHV).
Fish Pathol. 40 (1), 37 - 39
150
9
ANHANG
9.1
9.1.1
Material
Virusisolate
Tabelle 6 Virusisolate
Virusisolat
KHV
F 1045
F 1046
F 1040
F 1047
DF 29/03 –1663
X 270 D
Karpfenpockenvirus
(CyHV-1)
Aalherpesvirus
(AHV)
9.1.2
Ursprung/Herkunft
englisches Isolat, NRL Fische, FLI
englisches Isolat, NRL Fische, FLI
englisches Isolat, NRL Fische, FLI
englisches Isolat, NRL Fische, FLI
deutsches Isolat (Stendal), NRL Fische, FLI
israelisches Isolat, ursprünglich freundlich überlassen von R.
Hedrick, USA, erhalten von Dr. M. Dauber durch das NRL für
Fische, FLI
UK G364 P2, freundlich überlassen von K. Way, CEFAS,
England
Isolat aus Glasaalen 2004 von einer Fischfarm in NRW, aus
dem RFL für Fische, FLI
Bakterienstämme
E. coli X1Lblue MRF’
Stratagene
151
9.1.3
Primer, Sonden, Nukleinsäuren und Längenstandards
Tabelle 7 Verwendete Oligonukleotide
Oligonukleotide
Primer
Gilad-KHV-9/5F
Gilad-KHV-9/5R
Bergmann-nested-1Fn
5´
3`, bp
GAC GAC GCC GGA GAC CTT GTG
CAC AAG TTC AGT CTG TTC CTC AAC
CTC GCC GAG CAG AGG AAG CGC
Referenz
21 bp
24 bp
21 bp
Bergmann-nested-1Rn
TCA TGC TCT CCG AGG CCA GCG G
22 bp
Gilad-real-KHV-86-F
Gilad-real-KHV-163-R
Gray-SphI-F
Gray-SphI-improved-R
Gray-Bam-HI-6-F
Gray-Bam-HI-6-R
Bercovier-TK-F
GAC GCC GGA GAC CTT GTG
CGG GTT CTT ATT TTT GTC CTT GTT
GAC ACC ACA TCT GCA AGG AG
GAC ACA TGT TAC AAT GGT CGC
TCG CAT GTG AGG GTT CAT GC
CAT CAG CGG CAT CAG CAT CG
GGG TTA CCT GTA CGA G
18 bp
24 bp
20 bp
21 bp
20 bp
20 bp
16 bp
Bercovier-TK-R
CAC CCA GTA GAT TAT GC
17 bp
CNGV-543
CNGV-652
EGFP-1-F
CGA CCG ACT TCG TCA TCA AAG
GGA CAT CAA TGG AGG AAC GGA
GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC
21 bp
21 bp
20 bp
EGFP-2-R
GAA CTC CAG CAG GAC CAT G
19 bp
sq-40for
sq-48rev
TAA CGC CAG GGT TTT CCC AGT
GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG G
21 bp
22 bp
Sonden
Gilad-real-KHV-109pFAM
EGFP-HEX-IC2
5´
3`, bp
FAM-CTT CCT CTG CTC GGC GAG CAC G-TAMRA GILAD et al. (2004)
22 bp
HEX-AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A-BHQ1
HOFFMANN et al.
22 bp (2006)
Oligonukleotide und
Vektoren
KHV-Standard:
positive Kontrolle
IC2:
interne Kontrolle
nähere Bezeichnung/Genbank-Nr.
Amplikon AF411803 im Plasmid pGEM®-Teasy
(Promega)
712 bp-Fragment des EGFP-1Standardklonierungsvektor (BD Biosciences Clontech,
accession number U55761) im Plasmid pGEM®-Teasy
GILAD et al. (2002)
GILAD et al. (2002)
BERGMANN et
al.(2006)
BERGMANN et
al.(2006)
GILAD et al. (2004)
GILAD et al. (2004)
YUASA et al. (2005)
YUASA et al. (2005)
Gray et al. (2002)
Gray et al. (2002)
BERCOVIER et al.
(2005)
BERCOVIER et al.
(2005)
PIKARSKY et al (2004)
PIKARSKY et al (2004)
HOFFMANN et al.
(2006)
HOFFMANN et al.
(2006)
Labor Dr. H. Schütze
Labor Dr. H. Schütze
GILAD et al. (2002)
HOFFMANN et al.
(2006)
152
Tabelle 8 Genlokus der Oligonukleotide in den Referenzviren KHV-U (Acc. nr. DQ657948.1), KHV-I
(Acc. nr. DQ177346.1) und der EGFP-Referenz (Acc. nr. U55761.1)
Oligonukleotide
KHV
Gilad-KHV-9/5F
Gilad-KHV-9/5R
Bergmann-nested-1Fn
Bergmann-nested-1Rn
Gilad-real-KHV-86-F
Gilad-real-KHV-163-R
Gilad-real-KHV-109pFAM Sonde
Gray-SphI-F
Gray-SphI-improved-R
Gray-Bam-HI-6-F
Gray-Bam-HI-6-R
Bercovier-TK-F
Bercovier-TK-R
CNGV-543
CNGV-652
Referenzvirus KHV-U
Referenzvirus KHV-I
Acc. nr. DQ657948.1
Acc. nr. DQ177346.1
ORF 89
ORF 90
ORF 89
ORF 90
ORF 89
ORF 89
ORF 89
hyp Prot
hyp Prot
hyp Prot
hyp Prot
hyp Prot
hyp Prot
hyp Prot
21/21
24/24
21/21
22/22
18/18
24/24
22/22
p/p
p/m
p/p
p/m
p/p
p/m
p/m
165399 - 165419
165882 - 165859
165429 - 165449
165842 - 165821
165402 - 165419
165479 - 165456
165446 - 165425
ORF 54 20/20 p/m 93895 - 93876
zwischen ORF 53 und 54
62 bp bis 5’ -Ende von ORF 53
57 bp bis 3`-Ende von ORF 54
21/21 p/p 93604- 93624
ORF 82 20/20 p/p 152061 - 152080
ORF 82 20/20 p/m 152427 - 152408
ORF 55 16/16 p/p 96054 - 96069
ORF 55 17/17 p/m 96463 - 96447
ORF 139 21/21 p/p 237636 - 237656
ORF 139 17/17* p/m 237746 - 237730
* 17/17 sind homolog, aber 21 bp
gesamt
IC2
EGFP-Referenz
Acc. nr. U55761.1
EGFP-1-F
20/20 p/p 637 - 656
EGFP-2-R
19/19 p/m 768 - 750
EGFP-HEX-IC2 Sonde 22/22 p/p 703 - 724
21/21
24/24
21/21
22/22
18/18
24/24
22/22
p/p
p/m
p/p
p/m
p/p
p/m
p/m
165435 - 165455
165918 - 165895
165465 - 165485
165878 - 165857
165438 - 165455
165515 - 165492
165482 - 16546
hyp Prot 20/20 p/m 93928 - 93909
zwischen 2 hyp Prot
62 bp bis 5`-Ende
57 bp bis 3`Ende
21/21 p/p 93637 - 936577
hyp Prot 20/20 p/p 52097 - 152116
hyp Prot 20/20 p/m 152463 - 152444
hyp Prot 16/16 p/p 96087 - 96102
hyp Prot 17/17 p/m 96496 - 96480
keine Angabe zum mutmaßlich kodierten
Protein, Verweis auf vergleichbare
Sequenz DQ177346.1, ORF 139 von
Pockenvirus,
21/21 p/p 237592- 237612
keine Angabe zum mutmaßlich kodierten
Protein, Verweis auf vergleichbare
Sequenz DQ177346.1 ORF 139 von
Pockenvirus,
17/17* p/m 237702 - 237686
* 17/17 sind homolog, aber 21 bp gesamt
-
ORF = open reading frame = offener Leserahmen, der für ein mutmaßliches Protein kodiert
erste Zahlenangabe z.B. 21/21 = n/n Nukleotide haben mit angegebenem Genlokus homolog übereingestimmt
p/p oder p/m = Orientierung im Genom, p = plus, m = minus
letzte Zahlenangabe z.B. 165399 – 165419 = Genlokus
hyp Prot = Genlokus eines hypothetischen Proteins, ein ORF wird nicht angegeben
IC2-DNA
FLI
Primer und Sonden
MWG Biotech AG, Operon
Längenstandard 1 kbp Marker (75 bp - 12,216 kbp)
GIBCO
Längenstandard (100 - 1000 bp)
Peqlab
153
9.1.4
Enzyme, Enzymkits und kommerziell erhältliche Systeme
EcoR1
Invitrogen
Go Taq® Flexi DNA Polymerase-Kit
Promega
(mit 5x Colorless Go Taq® Flexi Buffer, MgCl2 Solution (25mM))
Platinium® Pfx DNA Polymerase
Invitrogen
(mit 10x Pfx Amplification Buffer, 10x Enhancer, MgSO4 (50mM))
pGEM®-TEasy Vector Systems
Promega
QIAamp® DNA Mini Kit
QIAGEN
QIAfilterTM Plasmid Maxi Kit
QIAGEN
QIAquick Gel Extraction Kit
QIAGEN
QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit (200)
QIAGEN
T4-DNA-Ligase und Ligationspuffer (2x)
Promega
Thermo Sequenase Fluorescent Labelled Primer Cycle Sequencing Kit
Amersham Biosciences
9.1.5
Puffer, Lösungen, Nährmedien und Wasser
9.1.5.1 DNA-Extraktion, PCR, Agarosegelelektrophorese, Klonierung
Ampicillin (-Stammlösung 25 mg/ml, -20 °C)
Sigma
in A. dest.
Amphotericin B (-Stammlösung 250 µg/ml, -20°C)
Sigma
in A. dest.
Agarosegel (1x TAE)
1 x TAE-Puffer
1 - 2,5 % Agarose
InvitrogenTM
kochend lösen (Mikrowelle), verdunstetes Volumen ad A. dest. (nach Gewicht)
5 µl Ethidiumbromid-Stammlösung
für 40 ml
Roth
10 µl Ethidiumbromid-Stammlösung
für 80 ml
Roth
Calciumchlorid (CaCl2-Stammlösung 4 °C, 1M)
36,75 g Calciumchloriddihydrat (147,02 g/mol)
Scharlau
154
250 ml A. dest.
FLI
steril filtrieren, 0,22µm
(0,1 M CaCl2 entsprechend aus Stammlösung mit A. dest.)
Ethanol (70 - 75 %)
70 - 75 ml Ethanol (99,8 %)
Roth
30 - 25 ml A. dest.
FLI
Gentamicin (-sufat) (-Stammlösung 50mg/ml, -20°C)
Sigma
in A. dest.
Ladepuffer (10x) (Agarosegelelektrophorese für Klonierung, loading dye/buffer)
mit blau
0,4 % Bromphenolblau
Sigma
0,4 % Xylencyanolblau
Sigma
50 % Glycerin
Roth
1mM EDTA (ph 8,0)
Sigma-Aldrich
ad A. dest.
FLI
farblos
50 % steriles Glycerin
Roth
1mM EDTA (ph 8,0)
Sigma-Aldrich
ad A. dest.
FLI
LB-Broth Agar (1,5 %)
500 ml LB-Medium
7,5 g Agar-Agar
Difco
alles: autoklavieren (20 min, 121°C),
auf ca. 50 °C abkühlen lassen , erst dann ggf. Antibiotikumzusatz und danach Guss
LB-Broth Medium
5 g Natriumchlorid
Roth
5 g Bacto Tryptone
Difco
2,5 g Bacto Hefeextrakt
Difco
A. dest. ad 500 ml
FLI
alles: autoklavieren (20 min, 121 °C), bei Agarherstellung erst nach Agarzugabe,
155
falls Antibiotikumzusatz: immer vor Gebrauch und bei RT oder kälter
PBS (phosphate buffered saline; Phosphat gepufferte Kochsalzlösung)
8 g Natriumchlorid
Roth
1,44 g Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat
Roth
0,2 g Kaliumdihydrogenphosphat
Roth
0,2 g Kaliumchlorid
Roth
ad 1 l A. dest.; pH 7,2
FLI
RNA safe buffer
50 ng/µl Carrier RNA (poly A Homopolymer)
Amersham Biosciences
0.05 % Tween 20,
Serva
0.05 % Natriumcitrat
Roth
RNAse-Wasser (50µg/ml)
RNAse
USB®
A. dest.
FLI
TAE (Tris-Acetat-EDTA)-Puffer (50x-Stock)
242 g Tris
Invitrogen
57,1 ml absolute Essigsäure, > 95 % (Eisessig)
Roth
100 ml EDTA 0,5 M (pH 8,0)
Sigma-Aldrich
ad 1 l A. dest.
FLI
(TAE (1x): 20 ml TAE (50x) ad 1 l A. dest., autoklavieren, 121 °C, 20 min)
TE (Tris EDTA)-Puffer (1x)
Roti®stock 100x TE
Roth
ad A. dest.
FLI
Tetrazyklin (-Stammlösung 12,5 mg/ml, -20 °C)
Sigma
in Ethanol (99 %)
9.1.5.2 Zellkultur und Virusvermehrung
ATV (Alsever’s Trypsin Versene)
FLI
8,0 g Natriumchlorid
Roth
0,4 g Kaliumchlorid
Roth
156
1,0 g Dextrose
Roth
0,58 g Natriumhydrogencarbonat
Roth
0,2 g EDTA
Serva
0,5 g Trypsin
Invitrogen
A. dest. ad 1000 ml
FLI
gesamt: pH 7,1 - 7,3
Zellkulturmedium
FLI
MEM 4g (Minimal Essential Medium 4g)
MEM, HEPES (25 mM) mod. Earles’
Sigma
Zusätze je Liter:
0,328 g L-Glutamin (200mM)
Serva
11 ml NEAS
Biochrom
100 ml FKS
GIBCO
gesamt: pH 7,1
MEM 5
5,32 g MEM Hanks
SIGMA
4,76 g MEM Earle
GIBCO
1,52 g Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)
Roth
0,12 g Natriumpyruvat
Fluka
10 ml NEAS
Biochrom
100 ml FKS 10 %
GIBCO
A. dest. ad 1000 ml
FLI
gesamt: pH 7,2
bei Begasung mit CO2: 2,5 %
9.1.5.3 sonstige Lösungen
Benzokain-Betäubungslösung
10 % (w/v) Benzocaine
Sigma-Aldrich
in Ethanol (99,8 %)
Roth
(3ml Betäubungslösung auf 5l Wasser)
157
DABCO-Fluoreszenzerhaltungspuffer
Sigma-Aldrich
2,5 g 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octan (DABCO)
90 ml Glycerol
alles: im Wasserbad 37 °C lösen,
100 µl Propidiumiodid (2 mg/ml)
pH 8,6
Heparin-Lösung (5000U/ml)
Heparin (25.000 U)
Sigma
ad A. dest.
FLI
Propidium Iodide (2mg/ml)
SIGMA
ad A. dest.
9.1.6
Reagenzien, Chemikalien und Fertiglösungen
Aceton (99,8 %)
Roth
A. dest. distilled water ultraPURETM DNAse, RNAse Free GIBCOTM
DNA-Remover
Minerva Biolabs
dATP 100mM
Promega
dCTP 100mM
Promega
dGTP 100mM
Promega
dTTP 100mM
Promega
Ethanol (99,8 %)
Roth
Ethanol (96 %), vergällt (1 % MEK)
Roth
Ethidiumbromid-Stammlösung (1 %, 10mg/ml)
Roth
Isopropanol
Roth
Konjugat Polyclonal Goat Anti-Mouse Immunglobulins/FITC
Dako
Loading dye (Ladepuffer)
Peqlab
mAK KHV10A9 von der Maus, Dr. M. Dauber
FLI
Mikrozid® Liquid
S&M
Penicillin-Steptomycin 10000 Units und 10000µg/ml
Sigma-Aldrich
Percoll (1,077 g/ml, isoton)
Biochrom AG
®
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) Roti -Phenol
Reaktionspuffer (10x) REact® 3
Invitrogen
Roth
158
9.1.7
Verbrauchsmaterialien
Cell Scraper 25cm, 2-position blade
SARSTEDT
Einmalkanülen
TERUMO®, B BRAUN
Einmalspritzen
CODAN
Filter (0,22µm), steril, MILLEX® GP Syringe Driven Filter Unit
Handschuhe (Nitrile, Latex)
MILLIPORE
medical care & serve® industry,
Meditrade®
Kiemenabstrichgefäße (4,5ml) Nunc CryoTubeTM Vials
Nalge Nunc International
Petrischalen
Costar®
Pipettenspitzen
eppendorf
Reaktionsgefäße (0,5; 1,5; 2,0 ml)
eppendorf
Reagenzgläser (Glas, 20ml)
FLI
Stahlkugel (Ø 5mm)
FLI
Wattestäbchen
Pantos
Zellkulturflaschen (T12,5, T25, T75 und T162)
CORNIG®
Zellkulturplatten (24- und 96-Well-Platten)
COSTAR®
Zellstoff Kimberly-Clark® Professional
Kimtech Science
Zentrifugenröhrchen (15 ml, 50 ml)
SARSTEDT
96well-Platten für real-time PCR:
ABgene®
Thermo-Fast® 96, Non Skirted; mit Ultra Clear Cap Strips
9.1.8
Geräte und Gebrauchsgegenstände
Bakterienschüttler
New Brunswick Scientific
Brutschrank 20/26 °C
Esta/Jouan
CO2-Brutschrank 20 °C
Heraeus INSTRUMENTS
Gelelektrophoresekammer-System
Bio-Rad
Gelkammer WIDE MINI-SUB® CELL GT
Netzgerät Power Pac 200
Kühlschrank
LIEBHERR profi line
159
Kühltruhen
-20 °C
F® Bayer
-80 °C ULTRA LOW
SANYO
Janke&Kunkel, IKA®-
Magnetrührer
Labortechnik
Mehrkanalpipette
eppendorf Research
Mikrowelle
Privileg
Mikroskop (Phasenkontrast) TMS
Nikon
pH-Meter
HANNA instruments
Pipettierhilfe PIPETBOY acu
INTEGRA BIOSCIENCES
Pipetten
eppendorf Research
®
Photometer DU 640 Spectrophotometer
Beckman
Sterilbänke
BIOHIT-
ANTARES
HERA safe
Heraeus
LaminAir® HB 2448
Heraeus INSTRUMENTS
Model 1,2
Holten LaminAir
VFR 1206 GS
clan LAF®
Sequenzierautomat LI-Cor DNA-Analyzer GENE READER 4200 MWG Biotech AG
Thermocenter SWISS MADE
Salvis
Thermocycler
Mastercycler gradient 5311
eppendorf
Mx 3000P™ Real-Time PCR System
Stratagene
Mx 3005P™ Real-Time PCR System
Stratagene
Thermoschüttler Thermomixer 5436
eppendorf
Thoma Zählkammer
Roth
Tissue Lyser
Qiagen
Transilluminator
biostep
mit Foto-/Kameraeinrichtung
FK 7512-IQ-IR
PIEPER
UV-Bestrahlungsbox DNA/RNA UV-Cleaner UVC-T-M-AR
UV-Mikroskop IX50
Olympus
Kisker
160
Ventilator Typ QLII 7020.7
FLI
Vortexer VF2
Janke&Kunkel, IKA®Labortechnik
Waagen
Präzisionswaage Alt 100-5AM
KERN
Präzisionswaage
sartorius
ANALYTICAL Plus
OHAUS
Zentrifugen
BIOFUGE fresco
Heraeus
BIOFUGE pico
Heraeus
Centrifuge 5417 R
eppendorf
Megafuge 1.0 R
Heraeus
Tischzentrifuge FUGE-VORTEX 2400
BIOSAN
UNIVERSAL 32 R
Hettich ZENTRIFUGEN
UNIVERSAL 30 RF
Hettich ZENTRIFUGEN
9.2
Software
BLASTn; nukleotide blast
National Center für Biotechnology
Information (NCBI)
MxPro-Mx3000P v3.0 und v4.0
9.3
Stratagene
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Publizierte Annealing-Temperaturen der verwendeten Primerpaare ....................... 54
Tabelle 2 Sensitivität der unterschiedlichen PCR Verfahren im Vergleich (Zusammenfassung)
.......................................................................................................................................... 84
Tabelle 3 Diagnostische Sensitivität der multiplex real-time PCR adulte, infizierte Karpfen. 90
Tabelle 4 Diagnostische Sensitivität der multiplex real-time PCR: juvenile, infizierte Karpfen
.......................................................................................................................................... 91
Tabelle 5 Elektronenmikroskopische Untersuchungen.......................................................... 104
Tabelle 6 Virusisolate............................................................................................................. 150
Tabelle 7 Verwendete Oligonukleotide.................................................................................. 151
Tabelle 8 Genlokus der Oligonukleotide in den Referenzviren KHV-U
(Acc. nr. DQ657948.1), KHV-I (Acc. nr. DQ177346.1) und der EGFP-Referenz
(Acc. nr. U55761.1)............................................................................................... 152
161
9.4
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Ultrastruktur und schematische Darstellung des Koi-Herpesvirus ..................... 12
Abbildung 2 Funktionsprinzip der TaqMan®-Sonde .............................................................. 42
Abbildung 3 Graphische Auswertung einer real-time PCR..................................................... 44
Abbildung 4 Auswertung einer quantitativen real-time PCR .................................................. 47
Abbildung 5 Schematische Darstellung der Hälterung der Infektions- und Kontrollgruppen. 72
Abbildung 6 Gelelektrophoretrische Darstellung der Produkte der multiplex real-time PCR. 77
Abbildung 7 Analytische Sensitivität der real-time PCR für KHV ......................................... 79
Abbildung 8 Sensitivität des single und multiplex real-time PCR assays ohne Koamplifikation
von IC2-DNA im multiplex assay ..................................................................... 80
Abbildung 9 Sensitivität des single und multiplex real-time PCR assays mit Koamplifikation
von IC2-DNA im multiplex assay....................................................................... 81
Abbildung 10 Koamplifikation der internen Kontrolle bei hoher KHV-DNA-Last................ 82
Abbildung 11 Sensitivität der konventionellen und nested PCRs im PCR-Vergleich............. 85
Abbildung 12 Sensitivität der multiplex real-time PCR im PCR-Vergleich ........................... 86
Abbildung 13 Genomlast der adulten Einzeltiere, 5 x 103 KID50-Infektionsdosis .................. 93
Abbildung 14 Genomlast der adulten Einzeltiere, 5 x 104 KID50-Infektionsdosis ................. 94
Abbildung 15 Genomlast des Nierengewebes aller adulten infizierten Spiegelkarpfen ......... 96
Abbildung 16 Genomlast des Kiemengewebes aller adulten infizierten Spiegelkarpfen ....... 97
Abbildung 17 Genomlast der Kiemenabstriche aller adulten infizierten Spiegelkarpfen........ 98
Abbildung 18 Genomlast der PBL aller adulten infizierten Spiegelkarpfen .......................... 99
Abbildung 19 Genomlast der juvenilen infizierten Spiegelkarpfen ...................................... 101
Abbildung 20 Herpesvirusnukleokapsid neben Gewebsresten im Negativkontrast .............. 105
Abbildung 21 Indirekter Immunfluoreszenztest ................................................................... 106
162
9.5
Abkürzungsverzeichnis, Fachtermini
A. dest.
aqua destillata, destilliertes Wasser
A. bidest. aqua bidestillata, destilliertes Wasser
Allignment Abgleich
assay
Test, Reaktionsansatz
AHV
Aalherpesvirus 1, Anguillid herpesvirus 1, syn. Herpesvirus anguillae (HVA)
ATV
Alsevers´s Trypsine Versene, Trypsin
bp
basepairs, Basenpaare
BHQ
black hole quencher
bp
base pairs, Basenpaare
CCB
common carp brain, Nutzkarpfen Gehirn, Karpfenzelllinie aus Gehirngewebe
CCG
common carp gill, Nutzkarpfen Kieme, Karpfenzelllinie aus Kiemengewebe
CNGV
Carp (interstitial) Nephritis and Gill necrosis Virus, Synonym für KHV
Core
Kern
Ct
threshold cycle, Zyklus des Schwellenwertes
CyHV-1
cyprinides Herpesvirus-1, Herpesvirus cyprini, Virus der Karpfenpocken
CyHV-2
cyprinides Herpesvirus-2, Virus der hämatopoetischen Nekrose der Goldfische
CyHV-3
cyprinides Herpesvirus-3, Koi Herpesvirus
d
Tag(e)
DABCO
Diazobicyclooctan
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
desoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure
dNTP
desoxy-Nukleosidtriphosphate
each
jedes
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EGFP
enhanced green fluorescent protein
EK-1
eel kidney-1, Aal Niere, Aalzelllinie
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay, Enzym-gekoppelter Immuntest
E. coli
Escherichia coli
EPC
epithelioma papulosum cyprini, Karpfenzelllinie
F
forward
163
FAM
6-Carboxyfluorescein
FIV
felinen Immundefizienz Virus
FITC
Fluoreszeinisothiocyanat
FLI
Friedrich-Loeffler-Institut
for
forward
FRET
Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
g
Gramm, Erdbeschleunigung
ggf.
gegebenenfalls
h
Stunde(n)
HVA
Herpesvirus anguillae, Synonym für Aalherpesvirus 1, Anguillid herpesvirus 1
(AHV)
HEX
Hexachloro-6-carboxyfluorescein
IC
internal control, interne Kontrolle
IC-2-DNA internal control, interne Kontroll-DNA
IcHV-1
ictalurid herpesvirus-1, Synonym für channel catfish virus (CCV)
ISH
In situ-Hybridisierung
i.p.
intraperitoneal
kb
kilo basepairs, Kilobasenpaare
kDa
Kilodalton
KHV
Koi-Herpesvirus
KID
Zellkultur-infektiöse-Dosen
KF-1
koi fin 1, Karpfenflosse, Karpfenzelllinie
l
Liter
LED
light emitting diodes, Licht emittierende Diode
log
Logarithmus
(m)M
(milli) molar, (milli) mol/l
mAK
monoklonaler Antikörper
mg
Milligramm
MGB
minor groove binder
min
Minute(n)
ml
Milliliter
164
mm
Millimeter
(m)RNA (messenger) ribonucleic acid, (Boten-) Ribonukleinsäure
multiplex
vielfach
µl
Mikroliter
µm
Mikrometer
nested
verschachtelt
nm
Nanometer
nt
Nukleotid(e)
NTC
no template control, negative Kontrolle
ORF
open reading frame, offener Leserahmen
PBL
periphere Blutleukozyten
PBS
phosphate buffered saline, Phosphat gepufferte Salzlösung
PC
positive control, positive Kontrolle
PCR
polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion
pfu
plaque-forming units, Plaque bildende Einheiten
p.i.
post infectionem, nach der Infektion
pmol
Picomol
Quencher engl. to quench, unterdrücken
R
reverse
real-time
“echt Zeit”
rev
reverse
ROX
5-Carboxy-X-Rhodamin
rpm
rounds per minute, Umdrehungen pro Minute
RSq
Korrelationskoeffizient
sek
Sekunde(n)
single round
eine Runde
SNP
single nucleotide polymorphism, Punktmutation
SPF
Spezifisch-Pathogen-frei
TAE
Tris-Acetat-EDTA
TAMRA
Tetramethyl-6-Carboxyrhodamin
Taq
Thermus aquaticus
165
template
Matrize
treshold
Schwellenwert
U units
Enzymeinheit
UV
ultraviolett
V
Volt
V.
Vena, Vene
vgl.
vergleiche
w/v
weight per volume, Gewicht pro Volumen
166
Tagungsbeiträge auf wissenschaftlichen Kongressen:
RIECHARDT, M., FICHTNER, D., BERGMANN, S. M.:
Koi-Herpesvirus (KHV): Überblick über die veröffentlichten Sequenzen.
11. Gemeinschaftstagung der Deutschen, Österreichischen und Schweizer Sektion der EAFP
zum Thema Fischkrankheiten, Murten, Schweiz, 2006
RIECHARDT, M., FICHTNER, D., BERGMANN, S. M.:
Quantitativer Nachweis von Koi-Herpesvirus (KHV) mittels multiplex realtime PCR in
Spiegelkarpfen (Cyprinus carpio) nach experimenteller Infektion.
Arbeitskreis für veterinärmedizinische Infektionsdiagnostik (AVID): 27. Arbeits- und
Fortbildungstagung-Virologie, Bad Staffelstein/Kloster Banz, 2008
Posterbeiträge auf wissenschaftlichen Kongressen:
RIECHARDT, M., FICHTNER, D., BERGMANN, S. M.:
Untersuchungen zur Pathogenese und Diagnostik der Koi-Herpesvirus (KHV)-Infektion in
Spiegelkarpfen (Cyprinus carpio) nach experimenteller Infektion mittels quantitativer
multiplex realtime PCR.
12. Gemeinschaftstagung der Deutschen, Österreichischen und Schweizer Sektion der EAFP
zum Thema Fischkrankheiten, Jena, 2008
Ergebnisse dieser Arbeit trugen zu folgenden Publikationen bei:
BERGMANN, S. M., RIECHARDT, M., FICHTNER, D., LEE, P. u. KEMPTER, J. (2010):
Investigation on the diagnostic sensitivity of molecular tools used for detection of koi
herpesvirus (KHV).
J. Virol. Meth. 163, 229 - 233
BERGMANN, S. M., SCHÜTZE, H., FISCHER, U., FICHTNER, D., RIECHARDT, M.,
MEYER, K., SCHRUDDE, D. u. KEMPTER, J.,(2009):
Detection of koi herpes virus (KHV) genome in apparently healthy fish.
Bull. Eur. Assoc. Fish Path. 29, 145 - 152
167
Danksagung
Herr Dr. med. vet. Sven Michael Bergmann führte mich in die Welt des KHV und die
Methodik des PCR-Verfahrens ein. Ich danke ihm für die Überlassung des interessanten
Themas, seine wissenschaftliche Betreuung und Unterstützung, die es mir ermöglichte,
kreativ und eigenständig zu arbeiten.
Herrn Dr. med. vet. habil. Volker Kaden danke ich für die Möglichkeit in seinem Institut zu
arbeiten, für seine Unterstützung und die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit.
Thomas Vahlenkamp danke ich für die freundliche Unterstützung zum Ende hin und die
Möglichkeit, an seinem Institut meine Arbeit abzuschließen.
Herrn Prof. Dr. rer. nat. T. C. Mettenleiter danke ich für die Möglichkeit der Anfertigung
dieser Dissertation am Friedrich-Loeffler-Institut, Insel Riems.
Herrn Apl. Prof. Dr. rer. nat. Dieter Steinhagen danke ich herzlich für die wissenschaftliche
Betreuung meiner Arbeit und seine Unterstützung bis zum Schluss.
Dr. Grit Bräuer, Sächsische Tierseuchenkasse Dresden, danke ich für die gute
Zusammenarbeit.
Ich bedanke mich für die Unterstützung des Sächsischen Staatsministerium für Umwelt und
Landwirtschaft und die Förderung meiner Arbeit mit den Mitteln des Strukturfonds FIAF
gemäß Verordnung (EG) 2792/1999.
Ich
hatte
die
einmalige
Möglichkeit
in
den
verschiedensten
Laboren
auch
institutsübergreifend arbeiten zu dürfen und Hilfestellungen zu erhalten, dafür bin ich bis
heute sehr froh und dankbar. Den wissenschaftlichen Mitarbeitern, den technischen
Angestellten, den Tierpflegern, allen anderen Angestellten des Friedrich-Loeffler-Instituts
und insbesondere allen Menschen vom Fischflur danke ich für die freundliche Aufnahme und
die tolle Unterstützung auf meinem Weg. Besonders herzlicher Dank geht an Margitta Legien,
Irina Werner und Stefanie Franz.
Dr. Patrizia König danke ich sehr herzlich für Ihre räumliche Hilfe, die entscheidend zu
meiner praktischen Arbeit beigetragen hat.
Im Labor von Dr. Heike Schütze wurden einige Arbeiten zur Klonierung ausgeführt. Mein
Dank gilt daher Dr. Heike Schütze und Volker Hein.
Dr. Bernd Hoffmann und Dr. Astrid Gall unterstützten mich rund um die real-time PCRvielen lieben Dank!
168
Dr. Bernd Köllner und Sabine Weber danke ich sehr herzlich für die Bereitstellung von Hilfe
und Räumlichkeiten.
Dr. Uwe Fischer und Helga Noack danke ich sehr herzlich für die Hilfe bei einigen
praktischen Arbeiten und ein Schreib-Domizil.
Vielen lieben Dank an Günter Kotterba für Raum und Rat.
Besonders Herrn Dr. Dieter Fichtner danke ich für seine Unterstützung, seine Freundlichkeit
und seine Geduld mit mir.
Die lieben Doktoranden und Mitstreiter(innen) will ich nicht vergessen, vielen Dank für alles.
Besonders Doro, Claudia und Astrid haben mir jeden Tag aufs Neue ermöglicht. Siedler und
Gespräch sei Dank.
Meinen Freunden, meiner Familie und besonders Paul möchte ich speziell für die
Unterstützung in den dunklen Momenten danken. Das habe ich nur mit euch zusammen
geschafft. Und mal ganz im Ernst: was wäre das Leben ohne die Lieben?