V 23 Lichtmikroskop, Köhlersches Beleuch
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V 23 A) Lichtmikroskop, Köhlersches Beleuchtungsprinzip Stichworte zur Vorbereitung Geometrische Optik, Mikroskop, Fernrohr, Lupe, Vergrößerungsdefinition bei Mikroskop und Fernrohr, Auflösungsgrenze des Mikroskops. B) Literatur Trautwein, Kreibig, Oberhausen: Physik für Mediziner, Biologen, Pharmazeuten Harten: Physik für Mediziner Ludwig Bergmann, Clemens Schaefer: Lehrbuch der Experimentalphysik. Bd. 3: Heinz Niedrig (Hrsg.): Optik. Berlin: de Gruyter, 9. Aufl. 1993. Kurt Michel: Die Mikrophotographie. Wien: Springer, 1967. (UB: Allg. Lesesaal) Kurt Michel: Die Grundzüge der Theorie des Mikroskops in elementarer Darstellung. Stuttgart: Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, 3. Aufl. 1981. (UB: Lehrbuchsammlung, Allg. Lesesaal) C) Motivation Der vorliegende Versuch behandelt die geometrisch-optische Funktionsweise des Mikroskops und die durch die Welleneigenschaften des Lichts bedingte Auflösungsgrenze dieses Geräts. Der Versuch soll demonstrieren, welche Bedingungen zu erfüllen sind, um mit einem Mikroskop Bilder mit hoher Auflösung und gutem Kontrast zu erzielen. D) 1. Grundlagen Prinzipieller Aufbau des Mikroskops Abb. 1 zeigt eine Schemazeichnung des im Praktikum verwendeten Mikroskops, Abb. 3 den dazugehörigen Strahlengang. Aus der Abbildung ist ersichtlich, daß das Mikroskop im wesentlichen aus 2 Baugruppen zusammengesetzt ist: 1. Beleuchtungseinrichtung bestehend aus Lichtquelle, Kollektor, Leuchtfeldblende (LfB), Aperturblende (ApB) und Kondensor. Zwischen LfB und ApB befindet sich ein Umlenkspiegel. 2. Abbildungssäule bestehend aus Objektiv und Okular. Den Abstand t zwischen den Brennpunkten von Okular und Objektiv nennt man Tubuslänge. In Abb. 3 sind speziell herausgegriffene Strahlen eingezeichnet, mit Hilfe derer zu ersehen ist, wohin die Lichtquelle (❀ Beleuchtungsstrahlengang) und das Objekt (❀ Abbbildungsstrahlengang) abgebildet werden. 96 Abb. 1: Schematischer Aufbau des im Praktikum verwendeten Mikroskops 2. Abbildungsstrahlengang Abb. 2: Abbildender Strahlengang im Lichtmikroskop 97 Bild des Objekts auf der Netzhaut = Brennebene des Linsensystems des entspannten Auges Auge Iris Linsensystem des Auges (schematisch) Okular Zwischenbild in Okular-Brennebene hintere Objektiv-Brennebene: Bild der Lichtquelle, Beugungsbild des Objekts Objektiv αObj Objekt in Objektebene := Bildebene der LfB αKond Kondensor Aperturblende (ApB) in Kondensor-Brennebene = Bildebene der Lichtquelle Leuchtfeldblende (LfB) in Kollektor-Brennebene Kollektor Lichtquelle Abb. 3: Abbildungs- (durchgezogene Linien) und Beleuchtungsstrahlengang (gestrichelt) im Lichtmikroskop bei Köhlerscher Beleuchtung mit αObj = αKond 98 Abb. 2 sowie die durchgezogenen Linien in Abb. 3 zeigen den Abbildungsstrahlengang im Mikroskop. Der Gegenstand befindet sich zwischen der einfachen und doppelten Brennweite des Mikroskopobjektivs. Dieses entwirft in der Zwischenbildebene ein reelles vergrößertes Zwischenbild. Das Zwischenbild liegt in der Brennebene des Okulars, so daß es durch das als Lupe arbeitende Okular vergrößert ins Unendliche abgebildet wird. Durch das Linsensystem des auf Unendlich eingestellten (d.h. völlig entspannten) Auges wird dieses vom Okular erzeugte virtuelle Bild auf die Netzhaut reell abgebildet. Die Gesamtvergrößerung VMikroskop des Mikroskops ist das Produkt aus dem Abbildungsmaßstab βObjektiv des Objektivs und der Vergrößerung VOkular des Okulars: VMikroskop = βObjektiv · VOkular . (1) Der Abbildungsmaßstab des Objektivs ist gegeben durch βObjektiv = t fObjektiv , (2) wobei t die Tubuslänge, also der Abstand der Brennpunkte von Okular und Objektiv, und fObjektiv die Brennweite des Objektivs ist. Das im Praktikum verwendete Mikroskop besitzt 3 verschiedene Objektive und 2 auswechselbare Okulare. Durch Kombination verschiedener Objektive und Okulare können Vergrößerungen zwischen ca. 50fach und 1500fach realisiert werden. Die Objektive unterscheiden sich in ihrer Brennweite und ihrer numerischen Apertur (siehe unten). Die Objektive, die die beiden kleinen Vergrößerungen liefern, sind sog. Trockensysteme, während das Objektiv, das die höchste Vergrößerung liefert, ein sog. Immersionsobjektiv ist. Bei der Verwendung dieses Objektivs sollte der Raum zwischen dem Objektiv und dem zu beobachtenden Präparat mit Immersionsöl angefüllt sein. 3. Die Auflösungsgrenze des Lichtmikroskops Definition: Unter der Auflösungsgrenze eines optischen Geräts, hier des Lichtmikroskops, versteht man den Abstand zweier Gegenstandspunkte, die gerade noch getrennt wahrgenommen werden können. Das Auflösungsvermögen ist der Kehrwert der Auflösungsgrenze. Die geometrische Optik kann keine Aussagen über die Auflösungsgrenze machen, da diese Grenze durch die Welleneigenschaft des Lichts bedingt ist. Wie in Versuch 22 gezeigt wurde, können gemäß der Abbeschen Theorie Objektstrukturen mit einem Abstand d nur dann abgebildet werden, wenn neben dem Maximum 0. Ordnung mindestens das Maximum 1. Ordnung, das bei der Beugung an diesen Stukturen entsteht, durch das optische Gerät durchgelassen wird. Das Zusammenwirken des gebeugten und des ungebeugten Lichts (0. Ordnung M0 ) ist in Abb. 4a nochmals dargestellt: 99 M−1 M0 M+1 M0 αObj M+1 2 αObj a) b) Abb. 4: Zur Ableitung der Formel für die Auflösungsgrenze a) bei achsenparalleler und b) bei schräger Beleuchtung des Objekts 3.1 Achsenparallele Beleuchtung Das Objekt wird parallel zur optischen Achse beleuchtet (Abb. 4a). Die unter dem Winkel αObj an den Objektstrukturen der Größe g gebeugten Strahlen fallen gerade noch in das Mikroskopobjektiv. In der hinteren Brennebene des Objektivs werden parallele Strahlen in den Beugungsbildern M−1 , M0 und M+1 vereinigt. Das reelle Zwischenbild entsteht durch Interferenz der von diesen Beugungsbildern ausgehenden Lichtwellen. Nach der Abbeschen Theorie muß mindestens das Beugungsmaximum 1. Ordnung (M+1 bzw. M−1 ) durch das Objektiv durchgelassen werden. Der Objektiv-Aperturwinkel αObj , das ist der halbe Öffnungswinkel des Objektivs, muß also größer oder gleich demjenigen Winkel sein, unter dem das Beugungsmaximum 1. Ordnung entsteht, also größer oder gleich arcsin λg . Daher ist die Auflösungsgrenze g des Mikroskops bei achsenparalleler Beleuchtung des Objekts gegeben durch g= λ . sin αObj (3) Der hierbei im Nenner auftretende Ausdruck sin αObj , also der Sinus des Aperturwinkels, wird Apertur genannt. Befindet sich zwischen Objekt und Objektiv nicht Luft mit dem Brechungsindex n = 1, sondern Immersionsflüssigkeit mit einem anderen Brechungsindex n (z.B. Immersionsöl mit typischerweise n = 1,5), so ist die Auflösungsgrenze auf g= λ λ = n · sin αObj AObj 100 (4) verbessert. Den Ausdruck AObj := n · sin αObj nennt man numerische Apertur. Die Verbesserung der Auflösungsgrenze durch Einbringen von Immersionsflüssigkeit zwischen Objekt und Objektiv beruht darauf, daß vom Objekt ausgehende Strahlen, die in die Immersionsflüssigkeit mit einem Brechungsindex größer 1 eindringen, zum Einfallslot hin gebrochen werden. Der Öffnungswinkel derjenigen vom Objekt ausgehenden Strahlen, die in das Objektiv fallen, ist also bei Verwendung von Immersionsflüssigkeit größer. Für den Fall der Beleuchtung mit einem Lichtkegel ist dies in Abb. 6 dargestellt. 3.2 Schräge Beleuchtung In Versuch 22 wurde gezeigt, daß es zur Bilderzeugung ausreicht, wenn nur 2 Beugungsordnungen, beispielsweise M0 und M+1 , durch Ausblenden zugelassen werden. Es kann also darauf verzichtet werden, daß auch das Beugungsmaximum -1. Ordnung, M−1 , durch das Objektiv durchgelassen wird. Wenn man nun die Einfallsrichtung des parallelen Lichtbündels aus 3.1 verändert, so daß es nicht mehr achsenparallel ist, dann fällt das Beugungsmaximum 0. Ordnung nicht mehr auf der optischen Achse in das Objektiv ein, sondern näher am Rand des Objektivs. Daher wandern auch die Strahlen, die von den Maxima +1. und -1. Ordnung kommen, zur Seite, und zwar trifft das eine nun nicht mehr auf die Linse, während das andere vom Rand der Linse in Richtung auf ihre Mitte hin wandert. Der Winkel zwischen den zu einer Objektstruktur gehörigen Strahlen 0. und 1. Ordnung darf nun also größer sein, damit diese Strahlen noch durch die Linse gehen und die Struktur somit noch aufgelöst wird. Wir erreichen mit der schrägen Beleuchtung also eine Verbesserung der Auflösung gegenüber der achsenparallelen Beleuchtung. Aus Abb. 4b kann man ersehen, daß man bei extrem schräger Beleuchtung des Objekts den Aperturwinkel zwischen dem einfallenden Licht 0. Ordnung und dem abgebeugten Licht 1. Ordnung, verglichen mit der Beleuchtung parallel zur optischen Achse (Abb. 4a), verdoppeln kann. Dies bewirkt, wie wir gleich nachrechnen werden, daß man im Grenzfall extrem schräger Beleuchtung für die Auflösungsgrenze g= λ λ = 2 · n · sin αObj 2 · AObj (5) erhält, also ein doppelt so hohes Auflösungsvermögen wie bei achsenparalleler Beleuchtung. Wenn wir den Einfallswinkel des beleuchtenden Lichtbündels noch stärker vergrößern, geht der Strahl 0. Ordnung nicht mehr durch die Linse, nur noch der Strahl 1. Ordnung. Dies ist, wie wir in Versuch 22 gesehen haben, nach der Abbeschen Theorie genauso wenig ausreichend, um eine Objektstruktur abzubilden, wie wenn nur das Maximum 0. Ordnung durch die Linse geht. 101 für Interessierte: Herleitung der Auflösungsgrenze bei schräger Beleuchtung:19 Objektebene einfallende zum Maximum Strahlen 1. Ordnung d αEinfall αObj δ1 δ2 αEinfall zum Maximum 0. Ordnung Abb. 5: Auflösungsgrenze g bei schräger Beleuchtung Wir wollen aufgrund des soeben Gesagten nun annehmen, daß der Einfallswinkel αEinfall des Lichts gegen die optische Achse kleiner oder gleich dem Aperturwinkel des Objektivs ist. Der Winkel, unter dem das Maximum 1. Ordnung eines Gitters mit der Gitterkonstante d erscheint, ist dadurch definiert, daß hierfür die von zwei im Abstand d befindlichen Punkten ausgehenden Strahlen einen Gangunterschied von λ aufweisen. Bei schräger Beleuchtung ergibt sich dieser Gangunterschied aber nicht allein aus der Weglängendifferenz δ2 nach dem Gitter, sondern die beiden Strahlen haben schon, wenn sie am Gitter ankommen, einen Gangunterschied δ1 (siehe Abb. 5). Die beiden Gangunterschiede δ1 = d · sin αEinfall und δ2 addieren sich auf. Der maximal erlaubte Winkel, unter dem die Strahlen 1. Ordnung das Gitter verlassen dürfen, um noch in die Objektivlinse zu gelangen, ist αObj ; in diesem Fall ist δ2 = d · sin αObj . Wir erhalten somit aus der Beziehung λ = δ1 + δ2 für die gerade noch auflösbare Gitterkonstante d, welche wir als Auflösungsgrenze g bezeichnen: g= λ . sin αObj + sin αEinfall (6) Diese Formel gilt, solange αEinfall ≤ αObj ist. Wir wenden uns nun dem Fall zu, daß Immersionsflüssigkeit verwendet wird. Der Brechungsindex des zwischen Objekt und Objektiv gebrachten Immersionsöls sei n. Um auch den – sehr ungebräuchlichen – Fall der Verwendung von Immersionsflüssigkeit zwischen Kondensor und Objekt mit einzubeziehen, bezeichnen wir den Brechungsindex dort mit n′ (üblicherweise eben n′ = 1). Nun berechnet sich der Gangunterschied nicht mehr einfach aus den geometrischen Weglängendifferenzen, sondern man muß die sogenannte optische Weglänge verwenden, welche das Produkt aus Brechungsindex und Weg ist.20 19 Diesen Abschnitt können Sie auch überspringen und direkt in 3.3 weiterlesen! Dies liegt daran, daß die Wellenlänge in einem Medium mit Brechungsindex n gleich nλ ist, wobei λ die Wellenlänge in Vakuum bzw. Luft bezeichnet. 20 102 Wir haben dann im Grenzfall, daß d gleich der Auflösungsgrenze g ist, die Gangunterschiede δ1 = n′ · g · sin αEinfall und δ2 = n · g · sin αObj , woraus sich die Auflösungsgrenze zu λ λ = (7) g= n · sin αObj + n′ · sin αEinfall AObj + AEinfall ergibt. Hierbei wurde die einer numerischen Apertur gleichende Abkürzung AEinfall := n′ ·sin αEinfall mit dem Brechungsindex n′ des Mediums zwischen Kondensor und Objekt und dem Einfallswinkel αEinfall eingeführt. Gleichung (7) gilt, solange auch noch der Strahl 0. Ordnung durch das Objektiv hindurchtritt. Dies ist aufgrund des SnelαEinfall liusschen Brechungsgesetzes gewährleistet, solange sin ≤ nn′ , d.h. also solange sin αObj AEinfall ≤ AObj ist. Hieraus ergibt sich, daß die bei maximal schräger Beleuchtung erreichbare Auflösungsgrenze gleich λ λ g= = (8) 2 · n · sin αObj 2 · AObj ist, wie oben behauptet.21 3.3 Beleuchtung mit einem Lichtkegel Die Überlegungen in 3.2 für den Fall der schrägen Beleuchtung helfen uns, schnell die Auflösungsgrenze für den Fall der Beleuchtung mit einem Lichtkegel, dessen Achse mit der optischen Achse zusammenfällt, herzuleiten. In einem Beleuchtungskegel haben wir Strahlen aller Einfallswinkel αEinfall von 0 bis zu einem maximalen Einfallswinkel, dem sog. Beleuchtungs-Aperturwinkel oder Kondensor-Aperturwinkel αKond . Dieser bestimmt direkt die Auflösungsgrenze, welche wir einfach aus 3.2 übernehmen können. Wir erhalten also nach Gleichung (7) g= λ λ = , ′ n · sin αObj + n · sin αKond AObj + AKond (9) wobei die numerische Apertur der Kondensors, AKond := n′ · sin αKond mit dem Brechungsindex n′ des zwischen Kondensor und Objekt befindlichen Mediums (üblicherweise Luft mit n′ = 1) eingeführt wurde. Auch diese Gleichung gilt nur, solange AKond ≤ AObj ist.22 21 Die Formeln (7) und (8) gelten unabhängig davon, ob das Objekt auf einem Objektträger aus Glas, welches ja auch einen von 1 verschiedenen Brechungsindex hat, liegt bzw. sich unter einem Deckglas befindet. Denn beidesmal haben die von verschiedenen Gitterpunkten ausgehenden Strahlen, welche in den Beugungsmaxima konstruktiv interferieren, die gleichen optischen Wege durch das Glas, so daß sich hierdurch kein zusätzlicher Gangunterschied ergibt. 22 Zwar gelangen nun aufgrund der anderen im Strahlenkegel enthaltenen Strahlen (z.B. dem auf der optischen Achse verlaufenden Zentralstrahl) auf jeden Fall Strahlen 0. Ordnung in das Objektiv, doch sind diese nicht kohärent zu dem durchgelassenen Strahl 1. Ordnung. Damit zwei Strahlen miteinander interferieren können, müssen diese zueinander kohärent sein, d.h. es muß eine feste (d.h. zeitlich konstante) Phasenbeziehung zwischen ihnen bestehen. Dies ist aber hier nicht der Fall, da schon die aus unterschiedlichen Richtungen am Objekt ankommenden Strahlen nicht zueinander kohärent sind, weil sie von unterschiedlichen Punkten auf der Lichtquelle ausgehen, d.h. die zugehörigen Wellenzüge wurden von unterschiedlichen Atomen unabhängig voneinander emittiert. 103 Die optimale Auflösung erhält man nach Gleichung (9) also, wenn AObj = AKond ist: g= λ λ . = 2 · n · sin αObj 2 · AObj (10) Dies ist natürlich die gleiche optimale Auflösungsgrenze wie in Gleichung (5). Allerdings werden mit wachsender Beleuchtungsapertur der Kontrast und die Tiefenschärfe ( Abbildungstiefe“) geringer, weshalb man in der Praxis häufig auf die ” maximal erreichbare Auflösung verzichtet und eine Kondensorapertur wählt, die kleiner als die Objektivapertur ist. Abb. 6 veranschaulicht die Wirkungsweise des Immersionsöls bei der Verbesserung der Auflösungsgrenze des Mikroskops. Objektiv ohne Immersionsöl mit Immersionsöl Deckglas Objektebene Objektträger Abb. 6: Strahlengang mit/ohne Immersionsöl 3.4 Förderliche und leere Vergrößerung Als förderliche Vergrößerung bei einem Lichtmikroskop bezeichnet man diejenige Gesamtvergrößerung (also Produkt aus Abbildungsmaßstab des Objektivs und Okularvergrößerung), bei der die vom Objektiv gerade noch aufgelösten Strukturen (also Strukturen von der Größe der Auflösungsgrenze) so vergrößert werden, daß sie vom Auge gerade noch als getrennte Punkte wahrgenommen werden können. Eine darüber hinausgehende Vergrößerung (leere Vergrößerung) hat keinen Nutzen, durch sie kann keine zusätzliche Information über das Objekt gewonnen werden. Die förderliche Vergrößerung liegt bei guten Mikroskopen bei etwa 1500fach. 4. Die Beleuchtungseinrichtung im Lichtmikroskop – das Köhlersche Beleuchtungsprinzip Aus den Überlegungen des vorangehenden Abschnitts geht hervor, daß man die beste mit dem Mikroskop erreichbare Auflösungsgrenze g dann erreicht, wenn man die Apertur AKondensor des beleuchtenden Lichtkegels, die sogenannte Beleuchtungsapertur, der Apertur des Objektivs anpaßt, d.h. wenn gilt: AKondensor = AObjektiv . 104 (11) Für die Auflösungsgrenze gilt dann g= 4.1 λ λ = . AObjektiv + AKondensor 2 · AObjektiv (12) Anforderungen an das Mikroskop An das Mikroskop werden folgende Anforderungen gestellt: Hohe Apertur: Hochauflösende mikroskopische Objektive haben numerische Aperturen bis 1,4 (mit Ölimmersion). Derartig große Aperturen können nicht mit einem einfachen Spiegel oder Hohlspiegel ausgeleuchtet werden.23 Es ist auch nicht möglich, mit der Lichtquelle sehr nahe an das mikroskopische Objekt heranzugehen und dadurch eine große Beleuchtungsapertur zu erreichen. Ein zu kleiner Abstand der Lichtquelle würde das Objekt durch Hitzeeinwirkung zerstören. Man benutzt deshalb bei guten Mikroskopen besondere optische Vorrichtungen, die eine starke Vergrößerung der Lichtquelle bewirken und eine entsprechend große Beleuchtungsapertur zur Folge haben. Teilobjektausleuchtung: Nur der Bereich des Objekts soll ausgeleuchtet werden, der durch das Objektiv vergrößert abgebildet wird. Würde man einen größeren Bereich beleuchten, so fällt unnötiges Streulicht in das Mikroskopobjektiv und setzt den Bildkontrast herab. Außerdem ist das Objekt größerer Hitzeeinwirkung ausgesetzt als unbedingt notwendig. Gleichmäßige Objektausleuchtung: Der beobachtete Kontrast soll ausschließlich vom Objekt herkommen und nicht von der unzulänglichen Ausleuchtung. 4.2 Köhlersches Beleuchtungsprinzip Eine Beleuchtungseinrichtung, die alle diese Gesichtspunkte berücksichtigt, wurde bereits 1893 von A. Köhler angegeben. Sie ist unter der Bezeichnung Köhlersches ” Beleuchtungsverfahren“ bekannt und wird heute in der Mikroskopie allgemein angewendet. Das Schema einer Beleuchtungsanordnung nach dem Köhlerschen Prinzip ist in Abb. 3 sowie in der folgenden Abbildung 7 dargestellt: 23 Beleuchtungsaperturen größer als 1 sind ohnehin sehr schwer zu realisieren, eine Möglichkeit ist in K. Michel, Die Mikrophotographie, Kapitel XIII. C. 3. a) beschrieben. 105 Abb. 7: Schema einer Beleuchtungsanordnung nach dem Köhlerschen Prinzip: 1 Lichtquelle, 2 Kollektorlinse, 3 Leuchtfeldblende, 4 Bild der Glühwendel in der Aperturblende, 5 Kondensor, 6 Bild der Leuchtfeldblende im Objekt Die Lichtquelle (1) wird durch den Kollektor (2) in die Aperturblendenebene (4) abgebildet. Da die Aperturblende in der Brennebene des Kondensors liegt, wird der Objektbereich gleichmäßig ausgeleuchtet, denn so kommt von jedem Punkt der Lichtquelle an jedem Punkt des Objekts ein Strahl an. Der Abbildungsmaßstab des Kollektors ist hierbei so zu wählen, daß die zum Erreichen der größten benötigten Beleuchtungsapertur erforderliche Aperturblendenöffnung, die sich nach dem Objektiv mit der höchsten Apertur richtet, vollständig von dem Lichtquellenbild ausgefüllt ist. Eine Verkleinerung der Beleuchtungsapertur kann dann jederzeit durch entsprechendes Schließen der Kondensoraperturblende erzielt werden. Der Kondensor (5) ist so eingestellt, daß er von der hinter dem Kollektor (2) stehenden – möglichst in der Kollektorbrennebene befindlichen – Leuchtfeldblende (3) (durch einen Pfeil angedeutet) ein scharfes Bild (durch Pfeil angedeutet) in der Ebene des Präparats (6) entwirft. Das Köhlersche Beleuchtungsprinzip ist damit durch die folgenden Vorteile gekennzeichnet: • geringe Erwärmung des Objekts bei gleichzeitig genügend hoher Helligkeit und großer erzielbarer Beleuchtungsapertur; wird erreicht durch großen Abstand der Lichtquelle vom Objekt und Vergrößerung der Lichtquelle mit Hilfe des Kollektors • gleichmäßige, strukturlose Ausleuchtung des Objekts; wird dadurch erreicht, daß sich das Bild der Lichtquelle in der Brennebene des Kondensors befindet • variable Leuchtfeldgröße, dadurch kann die Größe des ausgeleuchteten Flecks gleich der des abgebildeten Objektausschnitts gewählt werden, so daß Streulicht und auch eine unnötige Objekterwärmung vermieden werden; wird erreicht durch die Leuchtfeldblende • variable Beleuchtungsapertur, dadurch kann die Beleuchtungsapertur gleich der Objektivapertur gewählt werden, was eine maximale Auflösung ermöglicht; wird erreicht durch die Kondensoraperturblende 106 • Leuchtfeldgröße und Beleuchtungsapertur können unabhängig voneinander gewählt und verändert werden, so daß sich beide Bedingungen (Leuchtfeldgröße = Objektausschnitt und AKondensor = AObjektiv ) erfüllen lassen und ein Ändern der einen Größe kein Nachjustieren der anderen Blende erfordert; wird dadurch erreicht, daß sich die Leuchtfeldblende in der Kollektorbrennebene und die Kondensoraperturblende in der Kondensorbrennebene befindet Hier noch zusammenfassend, was sich mit den einzelnen Elementen verändern läßt: • Leuchtfeldblende: Leuchtfeldgröße, Beleuchtungsleistung24 • Kondensoraperturblende: Beleuchtungsapertur → Auflösung, Kontrast, Tiefenschärfe, Beleuchtungsintensität25 , Beleuchtungsleistung25 • Lichtquelle: Beleuchtungsintensität26 , Beleuchtungsleistung26 24 über die Größe des maximalen Emissionswinkels (auf der Lichtquelle) der verwendeten Strahlen über die Größe des verwendeten Teils der Lichtquelle 26 über die Lichtstärke der Lichtquelle 25 107 E) Versuchsdurchführung und -auswertung Achtung: Der Tubus des Mikroskops darf auf keinen Fall gesenkt werden ohne gleichzeitige seitliche Beobachtung des Abstandes von Objektiv zu Objekt. Wenn Sie in das Okular blicken, darf der Tubus nur nach oben bewegt werden. 1. Einstellen des Köhlerschen Beleuchtungsstrahlenganges Zunächst: • Beleuchtung einschalten • Alle Blenden öffnen • Kondensor an den oberen Anschlag stellen • Diatomeenpräparat einlegen • mit Objektiv I (kleinste Vergrößerung) und Okular 7 x“ scharfstellen ” • Objektiv II einschwenken und erneut scharfstellen Abbildungsstrahlengang einstellen: • Leuchtfeldblende (LfB) ganz zuziehen • Rand der LfB durch Senken des Kondensors scharfstellen. Möglicherweise müssen Sie den Spiegel verkippen, um die LfB auf die Bildmitte zu zentrieren. Lassen Sie gegebenenfalls Ihren Assistenten überprüfen, ob die LfB korrekt scharfgestellt wurde. • LfB gerade so weit öffnen, daß sie das Bild nicht mehr begrenzt Beleuchtungsstrahlengang einstellen: • Okular durch Hilfsfernrohr ersetzen (ist mit CT“ markiert) ” • Kondensoraperturblende (ApB) schließen und mit dem Hilfsfernrohr den Blendenrand scharfstellen (damit ist das Hilfsfernrohr auf die hintere Brennebene des Objektivs eingestellt). Zum Scharfstellen halten Sie die Okularhalterung fest und drehen Sie das Fernrohr heraus, bis Sie die ApB scharf sehen. Am Mikroskop selbst nichts verändern. Lassen Sie gegebenenfalls Ihren Assistenten überprüfen, ob Sie richtig scharfgestellt haben. • Lichtquelle verschieben, so daß die Leuchtwendel zusammen mit der ApB im Hilfsfernrohr scharf erscheint; evtl. ApB leicht öffnen, damit die Leuchtwendel besser sichtbar wird. • ApB wieder öffnen und Hilfsfernrohr durch das Okular ersetzen. Damit ist der Köhlersche Beleuchtungsstrahlengang für Objektiv II exakt eingestellt. Diese Einstellung kann auch bei Verwendung von Objektiv III belassen werden. 108 2. Allgemeine Übungen zur Mikroskopie 2.1 Bestimmung des Abbildungsmaßstabs der Objektive II und III: Legen Sie das Kupfernetzchen (seine Gitterkonstante ist auf dem Objektträger angegeben) auf den Objekttisch, und beobachten Sie das Bild zunächst mit dem Okular. Dann wird das Okular durch eine Mattscheibe in der Zwischenbildebene ersetzt. Die Mattscheibe wird mit einer Lupe betrachtet. Auf der Mattscheibe erscheint das reelle, vergrößerte Zwischenbild. Durch Vergleich der Gitterabstände im Zwischenbild mit der Millimeterteilung der Mattscheibe ist der Abbildungsmaßstab des Objektivs zu bestimmen. 2.2 Kalibrierung des Okularmikrometers: Kupfernetzchen und Okularmikrometer ( 15 x“) werden hierzu parallel und einander überdeckend eingestellt. Beide ” werden untereinander über einen möglichst großen Bereich verglichen. Führen Sie den Vergleich bei Objektiv II und III durch. Sollten Sie hier bei Objektiv III Scharfstellschwierigkeiten haben, so können Sie diese durch Anwendung von Ölimmersion beheben. a) Geben Sie bei der Auswertung an, welcher Länge auf dem Objekt bei Verwendung von Objektiv II bzw. III ein Teilstrichabstand des Okularmikrometers entspricht. b) Bestimmen Sie außerdem den tatsächlichen Abstand der Teilstriche auf der in der Zwischenbildebene befindlichen Skala des Okularmikrometers; bilden Sie den Mittelwert der beiden Ergebnisse für Objektiv II und III. 2.3 Ausmessen eines Präparats: Beobachten Sie das Diatomeenpräparat mit Objektiv II. Zeichnen Sie eine Diatomee, und tragen Sie in diese Zeichnung ihre Längs– und Querausdehnung ein. 3. Einfluß der Beleuchtungsapertur und des Immersionsöls auf die erreichbare Auflösungsgrenze im Mikroskop 3.1 Variation der Beleuchtungsapertur: Arbeiten Sie mit dem Trockensystem (Objektiv II) und mit dem Diatomeenpräparat sowie dem Okular 15 x“. ” Schließen Sie die Leuchtfeldblende so weit, daß sie gerade das Bildfeld nicht mehr begrenzt. Bringen Sie mit Hilfe des Kreuztisches eine Diatomee in die Mitte des Bildfeldes und stellen Sie mit dem Feintrieb scharf, bis die feinen punktförmigen Strukturen sichtbar werden. Schließen Sie jetzt die Kondensoraperturblende, d.h. verringern Sie die Beleuchtungsapertur. Sie werden feststellen, daß das Punktmuster ab einer sehr gut definierten Blendenstellung nicht mehr aufgelöst wird. 3.2 Einfluß des Immersionsöls (Objektiv III): Ersetzen Sie bei voll geöffneter Kondensoraperturblende das Objektiv II durch das Immersionsobjektiv III (nur Objektiv III ist für Ölimmersion ausgelegt, nicht dagegen Objektiv II). Bringen Sie einen Tropfen Immersionsöl (n = 1,5) zwischen Objekt und Objektiv und stellen Sie mit dem Feintrieb wieder scharf. Die punktförmigen Strukturen der Diatomee werden jetzt besser aufgelöst als bei Verwendung von Objektiv II. 109 Aufgabe: Geben Sie die Abstände der beobachteten feinen Punkte an (in μm). Achtung: Nach dem Arbeiten mit Ölimmersion das Immersionsobjektiv mit einem mit Alkohol befeuchteten Papiertuch abwischen. Objektträgergläschen durch vorsichtiges Abtupfen mit einem, ebenfalls mit Alkohol befeuchteten, Papiertuch reinigen. 4. Beugungserscheinungen bei der Abbildung feiner Lichtpunkte Dieser Versuch wird unter Verwendung von Objektiv II und dem Okular mit 15facher Vergrößerung durchgeführt. Als Präparat findet eine Metallaufdampfschicht mit Löchern von einem Durchmesser bis unter 1 μm Verwendung. Das Mikroskop bildet diese scharf begrenzten Löcher nicht als exakt begrenzte Strukturen ab, sondern man beobachtet – auch wenn auf die Oberfläche der Aufdampfschicht scharfgestellt ist – kreisrunde Beugungsscheibchen, d.h. ein zentrales Intensitätsmaximum, das von Beugungsringen umgeben ist. 4.1 Frage: In welcher Weise ändert sich die Abbildung, wenn die Kondensorapertur verkleinert wird? 4.2 Aufgabe: Zeichnen Sie qualitativ den in radialer Richtung des Beugungsscheibchens beobachteten Intensitätsverlauf (also Intensität in Abhängigkeit vom Abstand zum Lochmittelpunkt) bei großer und kleiner Kondensorapertur auf. 4.3 Frage: Wie würde dieser Intensitätsverlauf aussehen, wenn eine ideale Abbildung ohne Beugung des Lichts vorliegen würde? 5. Berechnung der Brennweiten der Objektive II und III Berechnen Sie die Brennweiten von Objektiv II und III aus der Beziehung f= b βObjektiv + 1 . (13) βObjektiv ist der von Ihnen bestimmte Abbildungsmaßstab des Objektivs und b = 170 mm die Bildweite. 110 F) Fragen 23.1 Konstruieren Sie den Strahlengang im Mikroskop mit Gegenstandsweite g = 1,5 · fObjektiv . 23.2 Leiten Sie Gleichung (2) aus der Definition des Abbildungsmaßstabs, der Linsengleichung sowie der geometrischen Beziehung zwischen Bildweite und Tubuslänge her. 23.3 Leiten Sie Gleichung (13) aus der Definition des Abbildungsmaßstabs und der geometrischen Beziehung zwischen Bildweite und Tubuslänge her. 23.4 In welcher Weise wird die Auflösungsgrenze des Mikroskops beeinflußt durch: – – – – – die die die die die Wellenlänge des Mikroskopierlichtes numerische Apertur des Mikroskopobjektivs Vergrößerung des Okulars Beleuchtungsapertur Ölimmersion 23.5 Was sind die Vorteile bei der Verwendung von Immersionsöl? Erklären Sie dazu den Strahlenverlauf zwischen Objekt und Objektiv mit und ohne Immersionsöl. 23.6 Was versteht man unter Tiefenschärfe? 23.7 Entwirft das Mikroskop-Okular ein relles oder ein virtuelles Bild? Begründung! 23.8 Wann benutzt man das Zernike-Phasenkontrastverfahren? 23.9 Vergleichen Sie den Aufbau eines Licht- und Elektronenmikroskops. 23.10 Erläutern Sie deren Vor- und Nachteile im Hinblick auf Untersuchungen biologischer Präparate. 111
