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Aus dem Department Innere Medizin II, Schwerpunkt
Gastroenterologie, Hepatologie, Endokrinologie und Infektiologie
der Albert-Ludwigs Universität Freiburg
Selektionierung sowie genetische und
phänotypische Charakterisierung von
Euxpumpeninhibitor - resistenten
E. coli - Mutanten aus einer
AcrB - Mutantenbibliothek
INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert - Ludwigs - Universität
Freiburg i. Brsg.
vorgelegt 2013
von
Anna Sakaras
geboren in Berlin
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert E. Blum
1. Gutachter:
Prof. Dr. Winfried Kern
2. Gutachter:
Prof. Dr. Daniel Jonas
Jahr der Promotion:
2014
An all die Menschen, die mich in meinem Leben positiv beeinussten
und prägten, insbesondere an meine Eltern und meinen Partner.
Danksagung
Ich möchte all jenen danken, die während meiner Arbeit an dieser Promotion an
meiner Seite standen. Zunächst danke ich meinem Doktorvater
Professor Kern
für
die freundliche Überlassung des spannenden Themas und seine einussreichen Vorschlägen und Korrekturen. Dann gilt mein Dank
Professor Jonas für die Übernahme
des Zweitgutachtens.
Mein besonderer Dank gilt
Sabine Schuster
für die tatkräftige Unterstützung in
allen Phasen diser Arbeit- bei der Einführung in die Laborarbeit, während der Experimente, in den Pausen und auch noch lange Zeit danach beim Schreiben und der
Fertigstellung. Ohne ihre groÿe Erfahrung und Geduld, sowie freundlichen Erklärungen und vielen Korrekturen wäre dies Arbeit nicht, was sie heute ist.
Ebenfalls danke ich dem Laborteam der Infektiologie für die freundliche Zusammenarbeit, angenehme Stunden und den kleinen Tipps und Tricks. Insbesondere
sind hier zu erwähnen
Jürgen Bohnert
bei der Zusammenarbeit an den Euxassays
sowie informativer Unterstützung bei der Diskussion;
Magdalena Szymaniak-Vits
für das herzliche Lachen und vielen hilfreichen Kleinigkeiten; und all die anderen
Des Weiteren danke ich meiner Familie, Freunden und Lehrern, die alle dazu
beigetragen haben, dass ich dort hingelangt bin, wo ich stehe. Hier möchte ich insbesondere meinem Eltern danken für ihre bedingunglose Liebe und Unterstützung
auf meinem Lebensweg, exemplarisch meiner Freundin Katharina Glitz fürs Korrekturlesen dieser Arbeit und meinen Schwiegereltern, die mir in Freiburg eine zweite
Heimat gaben.
Zuletzt gilt mein Dank meinem geliebten Benjamin für seine Motivation, seine
Geduld, seine Unterstützung und Lebensfreude und die unzähligen schönen Stunden, die wir teilen.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
i
1 Einleitung
1
1.1
Antibiotikaentwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.2
Resistenzmechanismen
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.3
Euxpumpen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
6
1.3.1
Eux durch RND - Transporter
. . . . . . . . . . . . . . . .
8
1.3.2
Die AcrAB - TolC Euxpumpe
. . . . . . . . . . . . . . . .
9
1.4
Escherichia coli und Euxpumpen
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
1.5
Euxpumpeninhibitoren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
14
1.6
Zielsetzung
17
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2 Material und Methoden
19
2.1
Lösungen und Bakterienstämme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
2.2
Mikrobiologische Methoden
23
2.3
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.1
Kultivierung und Lagerung
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
23
2.2.2
Selektionierung eines AcrB - Mutantenpools . . . . . . . . . .
23
2.2.3
Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration . . . . . . .
24
2.2.4
Akkumulationsassay
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
28
2.2.5
Euxassay
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
29
Molekularbiologische Methoden
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.3.1
Extraktion genomischer DNA aus
2.3.2
Polymerase - Kettenreaktion
E. coli
31
. . . . . . . . . . .
31
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
31
2.3.3
Aufreinigung von PCR Produkten . . . . . . . . . . . . . . .
32
2.3.4
Sequenz - Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
33
2.3.5
Homologe Rekombination
35
2.3.6
Rekonstitution von Mutationen mit Hilfe der Homologen Re-
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
kombination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
i
3 Ergebnisse
39
3.1
Selektionierung
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2
Ertrag nach der Ausplattierung
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
3.3
Erste Auswahl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
41
3.4
MHK - Daten der ausgewählten Mutanten . . . . . . . . . . . . . . .
42
3.5
Akkumulationsassays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
3.6
Euxassays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
46
3.7
Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
48
3.8
Rekonstitution der Mutationen in den Ausgangsstamm
. . . . . . .
49
3.8.1
3AG100 - AcrB:OS1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51
3.8.2
3AG100 - AcrB:ÜLN15
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
52
3.8.3
3AG100 - AcrB:NP21
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
52
3.8.4
3AG100 - AcrB:F617S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
55
4 Diskussion
39
57
4.1
Selektionierung und Methodik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
57
4.2
Die Mutationen der Mutanten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
4.3
Phänotypen mit veränderter EPI - Ezienz . . . . . . . . . . . . . .
62
4.3.1
Verminderte EPI - Wirksamkeit von PABN
. . . . . . . . . .
63
4.3.2
Verminderte EPI - Wirksamkeit von NMP
. . . . . . . . . .
64
4.3.3
Verbesserte Wirksamkeit der EPIs . . . . . . . . . . . . . . .
65
4.4
Phänotypen mit veränderter Substratspezität . . . . . . . . . . . .
66
4.5
Phänotypen nach der Rekonstitution der Mutationen
. . . . . . . .
68
4.6
Fazit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
70
4.7
Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
71
5 Zusammenfassung
A Anhang
73
I
Liste der verwendeten Symbole und Abkürzungen
III
Referenzen
V
1 Einleitung
Infektionskrankheiten sind neben Herz - Kreislauf - Erkrankungen weltweit immer
noch die häugste Todesursache. Alte und neue Erreger von lebensbedrohlichen Erkrankungen stellen die Weltgemeinschaft dauerhaft vor die Aufgabe Strategien zur
Bekämpfung von Infektionskrankheiten zu nden und ihre Verbreitung zu verhindern. Antibiotikaresistente Erreger erschweren zunehmend die Behandlung, denn
ihr Anteil ist ansteigend. Für das Jahr 2011 gab die Weltgesundheitsorganisation
(WHO) das internationale Thema vor: Verhütung von antimikrobiellen Resistenzen
und ihrer Verbreitung . Auch in Deutschland stand der Weltgesundheitstag 2011
unter einem ähnlichen Motto [Weltgesundheitstag, 2011]. Infektionen mit resistenten Keimen verdoppeln die Krankenhausverweildauer, Mortalität und Morbidität,
steigern die damit verbundenen Ausgaben im Gesundheitssystem erheblich [Holmberg et al., 1987] und bedrohen viele medizinische Errungenschaften. Resistente
Pathogene verteilen sich noch dazu rasant durch eine mobile und internationale
Gesellschaft. Weiterhin stellen vor allem die Mehrfachresistenzen von Bakterien ein
groÿes Problem dar, die oftmals durch Multi - Drug - Resistance (MDR) Euxpumpen vermittelt werden [Lomovskaya et al., 2007]. Leider hält die Entwicklung neuer
antimikrobieller Substanzen nicht mit. Im Gegenteil gibt es kaum neue Entwicklungen in Vorbereitung und mit abnehmenden Investitionen in diesem Gebiet kann diesem Problem nicht begegnet werden. Die Welt steuert auf eine post - biotische Aera
zu [Chan, 2011].
1.1 Antibiotikaentwicklung
Als in den 1940er Jahren die ersten Antibiotika entwickelt wurden, galten sie als
Wundermedikamente. Dies ist verständlich, da sie Millionen von inzierten jedes
Jahr heilen konnten, triviale Infektionen keine Bedrohung mehr darstellten und die
Lebenserwartung einen Sprung nach oben nahm [Chan, 2011]. Sir Alexander Fleming entdeckte 1928 auf einer verschimmelten Petri - Schale das Penicillin, ein Anti-
1
1 Einleitung
biotikum gewonnen aus Pilzen der Gattung Penicillium. Bis zum klinischen Einsatz
vergingen noch 20 Jahre, doch begann eine Epoche, in der durch Antibiotika viele Menschenleben gerettet werden sollten. Von Mitte der dreiÿiger bis Anfang der
sechziger erfolgte eine rasante Entwicklung und die Entdeckung der meisten bekannten Antibiotika von Sulfonamiden (1936),
B - Laktamen
(1940), Tetracyclinen und
Chloramphenicol (1949) bis Aminoglycoside (1950), Makrolide (1952), Glycopeptide
(1958) sowie Streptogramine und Chinolone (1962). Seitdem entstanden Weiterentwicklungen und Verbesserung von bekannten Stoen. Es kamen die Fluorchinolone
(1985) und Ketolide (2000) auf den Markt [Holzgrabe, 2004]. Als einzige stellten
die Oxazolidinone (1999) eine Innovation dar. Besonders ihr Vertreter Linezolid
wird neben Daptomycin und dem Streptogramin Kombinationspräparat Dalfopristin/Quinopristin zur Behandlung von Infektionen mit methicillinresistenten Staphylokokken (MRSA) und vancomycinresistenten Enterokokken (VRE) eingesetzt
[Alekshun and Levy, 2007]. Wobei sich auch hier bereits resistente Stämme gegen
Linezolid und gegen das Kombinationspräparat heraus gebildet haben [Jones et al.,
1998], [Meka and Gold, 2004].
Ein besonderer Vorteil der Antibiotika besteht darin, dass sie selektiv auf eine
Struktur der Bakterienzelle ab zielen, die in der menschlichen Zelle nicht existiert.
Somit werden die Bakterienzellen toxisch geschädigt, doch die körpereigenen Zellen
in ihrer Integrität und Funktion nicht gestört. Die einzelnen Antibiotikaklassen nutzen verschiedene Zielstrukturen des Bakteriums aus. Der Wirkmechanismus kommt
durch die Störung der bakteriellen Zellwandsynthese, Proteinsynthese, Folsäuresynthese oder Störung der bakteriellen DNA - Struktur zustande. Weiterhin gibt
es Stoe, die Resistenzmechanismen inhibieren, wie die Betalaktamaseinhibitoren,
die das von den Bakterien gebildete
und somit den
B - lactamringzerstörende
Enzym ausschalten
B - Lactamantibiotika zur Wirkung verhelfen [Hof and Dörries, 2005].
Abbildung 1.1 veranschaulicht die Wirkmechanismen von Antibiotika.
1.2 Resistenzmechanismen
Die Resistenz eines Bakteriums wird darüber deniert, dass Bakterien in Anwesenheit therapeutisch relevanter Konzentrationen eines antimikrobiellen Chemotherapeutikums ihre Vermehrung nicht einstellen und gegenüber der Wirksubstanz unempndlich bleiben [Hof and Dörries, 2005]. Seit der Einführung der Antibiotika sind
2
1.2 Resistenzmechanismen
Abbildung 1.1: Darstellung der Angrispunkte von Antibiotikaklassen mit Beispielen ihrer
Vertreter, modiziert nach [Hof and Dörries, 2005]
Resistenzen zunehmend angestiegen [Kresken et al., 1999]. So verursachte schon in
den 1940er Jahren mit der Einführung des Penicillins ein penicillinresistenter
phylococcus aureus
Sta-
durch Penicillinasebildung Probleme in Londoner Krankenhäu-
sern [Barber and Rozwadowska Dowzenko, 1948].
Seit Millionen von Jahren haben Bakterien und Pilze chemische Substanzen produziert, die dem Schutz vor anderen Mikroorganismen dienen. Manche dieser antimikrobiellen Substanzen, wie das Penicillin, wurden in der Medizin übernommen.
Doch über die Jahrtausende haben Mikroben wiederum Mechanismen entwickelt
diesen toxischen Eekten zu entgehen. Resistenzen sind daher ein sehr altes Phänomen und über Bakteriengenerationen vererbbar [WHO, 2011]. Ein
E. coli
Stamm,
der 1946 gefriergetrocknet wurde, enthielt ein Plasmid mit Genen, die eine Resistenz gegen Tetracyclin und Streptomycin verliehen, obwohl diese Antibiotika erst
mehrere Jahre später in der klinischen Medizin verwendet wurden [Madigan et al.,
2001]. Vermutlich haben Resistenz - Plasmide schon vor dem Zeitalter der Antibiotika existiert, doch die Anwendung von Antibiotika erzeugte Selektionsvorteile für ihre
Ausbreitung. Resistenzen kommen durch den falschen Einsatz von Antibiotika in der
3
1 Einleitung
Medizin, der Veterinärmedizin und der Nahrungsmittelindustrie und dem dadurch
immer gröÿer werdenen Selektionsdruck auf Bakterien zustande. Inzwischen sind
Resistenzen nicht nur ein Problem der Krankenhäuser bei der Behandlung immunsupprimierter Patienten, sondern auch ein Problem der ambulanten Behandlung. In
Nepal korrelieren Resistenzraten eines Individiums mehr mit der Antibiotikabenutzung der gesamten Gemeinde, als mit der Nutzung des Individiums selbst [Walson
et al., 2001]. Antibiotika beeinussen als sogenannte gesellschaftliche Medikamente
die Umwelt durch individuellen Einsatz. So führt eine Aknebehandlung zu einer
MDR - Hautora des gesamten Haushalts und nicht nicht nur des Patienten [Eady et al., 1996]. Im Abwasser werden weitgehend intakte antimikrobielle Stoe mit
zunehmender Inzidenz beobachtet und dies trägt dazu bei, dass sich resistente Organismen durch einen fortbestehenden Selektionsdruck weiter ausbilden [Kümmerer
and Henninger, 2003]. Hingegen ist die Rückentwicklung von Resistenzen ein sehr
langsamer Prozess. Der Entwurf eines sich nach der Therapie selbst zerstörenden
Antibiotikums wäre ein Lösungsansatz [Levy and Marshall, 2004].
Es wird zwischen der natürlichen und der erworbenen Resistenz unterschieden.
Tabelle 1.1 führt die verschiedene Gründe für eine natürliche Resistenz von Mikroorganismen auf, die unter Selektionsdruck bis zu MDR führen können [Alekshun and
Levy, 2007]. Bei erworbenen Resistenzen gibt es primäre und sekundäre. Die primäre
Resistenz entsteht durch Mutationen im eigenen Genom des Mikroorganismus und
führt zu Selektionsvorteilen. Auf diesem Wege führt eine Mutation im Genom zu
einer veränderten Aminosäure im Ribosom von
E. coli, so dass Streptomycin nicht
mehr binden kann. Die sekundäre Resistenz kommt schneller über die Aufnahme von
Resistenzgenen anderer Bakterien durch horizontalen Gentransfer zu stande. Über
Konjugation, Transformation und Transduktion können zwischen Bakterien Plasmide, Transposons, nackte DNA und Bakteriophagen - DNA ausgetauscht werden. So
wird die Resistenzentwicklung durch die zwei Hauptkomponenten des genetischen
Potentials und des Selektionsdruckes bestimmt [Wiedemann, 2007].
Besonders gramnegative Bakterien entwickeln Antibiotikaresistenzen aufgrund
des dierenzierten Aufbaus der Zelle mit einem zwischen zwei Zellmembranen liegendem Periplasma. Viele amphiphile Substrate erreichen nicht den Wirkort im Zytoplasma, da sie bereits im Periplasma abgefangen werden [Mahamoud et al., 2007],
[Piddock, 2006]. Zwar wirken
4
B - Laktame bereits an der Zellwand, werden jedoch in-
1.2 Resistenzmechanismen
Tabelle 1.1: natürliche Resistenzmechanismen, modiziert nach [Madigan et al., 2001]
Resistenzmechanismus
Reduzierte
Beispiel
Penicillin G Resistenz gramnegativer Bakterien wegen
Permeabilität
Fehlende Zielstruktur
der schlechten Durchlässigkeit der äuÿeren Membran
Penicillinresistenz von Mycoplasmen aufgrund der
fehlenden Mureinschicht
Inaktivierung des
Antibiotikums
Hydrolisierung des
B - Lactamringes
von Penicillinen
durch Penicillinasen; auch Produktion von Methylasen,
Acetylasen und Phosphorylasen
Veränderung der
Zielstruktur
B - Lactamresistenz
aufgrund von Penicillin -
Bindeproteinen (PBP) mit verminderter Anität;
Chinolonresistenz durch Modizierung der
DNA - Gyrase
Entwicklung eines
resistenten
Sulfonamidresistenz durch Aufnahme von Folsäure aus
der Umwelt statt einer eigenen Produktion
Stowechselweges
Aktiver Eux
verschiedenste Resistenzen durch Herauspumpen des
Antibiotikums aus der Zelle
aktiviert durch
B - Lactamasen und ebenfalls euxiert [Nikaido and Normark, 1987],
[Li et al., 1994]. Auch der Inux von lipophilen Stoen wird durch die äuÿere Membran und dessen LPS - Schicht stark verlangsamt [Yu et al., 2003]. Die synergistische Kombination aus Undurchdringlichkeit der äusseren Membran, die Reduktion
der Poren in der äusseren Membran und die Hochregulation von MDR Euxpumpen sowie andere Resistenzmechanismen erlaubt eine hohe intrinsische Resistenz
[Nikaido, 1996]. Auch bei grampositiven Bakterien stellen MDR - Transporter ein
universelles Konzept dar und ermöglichen den Eux einer breiten Variation an
nichtverwandten Substanzen. Sie vereiteln die Bemühungen um neue antibiotische
Stoklassen [Alekshun and Levy, 2007]. Die Ausprägung einer Euxpumpe kann zur
Entwicklung von weiteren Resistenzmechanismen führen [Mahamoud et al., 2007],
so dass ihre Inhibition das Level der intrinsichen Resistenz und das Voranschreiten
von Resistenzentwicklung erheblich vermindern würde [Lomovskaya et al., 2001].
Einige der problematischsten MDR Organismen sind momentan
ruginosa, Escherichia coli
und
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas ae-
mit extended - spectrum
B-
Lactamasen (ESBL), aber auch Vancomycin - resistente Enterokokken (VRE), Methicillin - resistente
Staphylococcus aureus (MRSA) sowie extensively drug - resistant
5
1 Einleitung
(XDR)
Mycobacterium tuberculosis
[Alekshun and Levy, 2007].
1.3 Euxpumpen
Arzneimittelresistenzen während einer Infektion oder Tumortherapie sind häug
durch Überexpression von Euxpumpen verursacht, die zu einer verminderten Konzentration der Arzneimittel in der Zelle führen [Li and Nikaido, 2004]. Bakterien
können mehrere Pumpen enthalten [Lomovskaya and Watkins, 2001]. Zuerst wurde der Eux in
E. coli
als Resistenzmechanismus gegenüber Tetracyclin beschrie-
ben [McMurry et al., 1980], [Levy, 1992]. Phylogenetisch gibt es fünf Superfamilien
an bakteriellen Euxpumpen: ATP - Binding - Cassette (ABC) - Transporter, Major
Facilitator Superfamily (MFS), Multidrug and Toxic Compound Extrusion (MATE) - Transporter, Small Multidrug Resistance (SMR) - Transporter, und die Resistance - Nodulation - Division (RND) - Transporter (siehe Abb. 1.2).
Abbildung 1.2: Schematische Illustration der Transporterfamilien. Dargestellt sind NorA
(Staphylococcus aureus, MFS), EmrE (E.coli, SMR), NorM (Vibrio parahae-
molyticus, MATE), AcrAB - TolC (E. coli, RND) und LmrA (Lactococcus lactis, ABC). Alle Substrate werden unverändert und energieabhängig ausgepumpt. Bei der RND - Familie ist dies auch aus dem Periplasma möglich.
Modiziert nach [Kumar and Schweizer, 2005].
Die ABC - und MFS - Transporter stellen die zwei gröÿten Familien dar. Nur die
ABC Familie betreibt einen primären Transport durch ATP Hydrolyse, während
sonst der Antrieb über sekundären Transport durch Ionengradienten oder trans-
6
1.3 Euxpumpen
membranären Protonenüssen statt ndet. Die MFS und RND Familien sind in
der Natur am häugsten vertreten. MFS Transporter sind in grampositiven und
gramnegativen Bakterien zu nden, doch weisen sie ein enges Feld der Substraterkennung auf. RND Pumpen dagegen nden sich nur in gramnegativen Bakterien
und weisen ein polyselektives Substratspektrum auf [Poole, 2005]
ABC - Transporter
Die ABC - Transporter gehören einer groÿen Superfamilie mit 52 Subfamilien an.
Sie betreiben einen aktiven primären Transport durch Energiegewinnung aus ATP Hydrolyse und befördern Substrate wie Medikamente, Zucker, Aminosäuren, Metallionen, Peptide und Carboxylate [Paulsen et al., 2001]. Sie bilden Multiprotein Komplexe mit Membranproteinen, die vermutlich eine Pore bilden, und cytoplasmatischen Proteinen, die die ATPase Aktivität besitzen. In der Regel bestehen die
Membranproteine aus sechs Transmembransegmenten (TMS), die sich in Paaren organisieren und an denen sich wiederum zwei cytoplasmatische Proteine anhängen.
ABC - Transporter nden sich in 21 bekannten prokaryotischen Eux - Systemen
und eher selten in Bakterien. Die LmrA - Pumpe von
Lactococcus lactis
wurde al-
lerdings häug untersucht [Kumar and Schweizer, 2005].
MFS - Transporter
Auch die MFS - Transporter gehören einer sehr groÿen Familie an, die 30 verschiedene Subfamilien aufweist und mehr als 1000 sequenzierte Mitglieder zählt [Kumar
and Schweizer, 2005]. Zumeist bestehen diese Transporter aus nur einem transmembranem Bauteil mit entweder 12 oder 14 TMS [Li and Nikaido, 2004]. Es gibt
jedoch Vertreter, die mit Membranfusionsproteinen (MFP) und Proteinen der äuÿeren Membran (OMP) interagieren und damit eine Ausnahme bilden, wie EmrAB TolC von
E. coli
[Lomovskaya and Lewis, 1992]. Der Transport wird sowohl durch
Symport als auch Antiport von Protonen und Natriumionen angetrieben. Substrate
bilden Zucker, Medikamente, Neurotransmitter, Carboxylate, Aminosäuren, Siderophagen und Nucleoside. Besonders die Subfamilien DHA12 und DHA14 sind am
Eux von Medikamenten beteiligt [Paulsen et al., 2001]. Eine der am ausführlichsten charakterisierten Mitglieder der MFS Familie sind Tetracyclin - Euxpumpen.
SMR - Transporter
7
1 Einleitung
Die Proteine dieser Familie bestehen lediglich aus 110 Aminosäuren, die sich zu
vier TMS aneinanderfügen. Die Proteine bilden Tetramere und werden durch Protonengradienten angetrieben. So ndet der Transport von Zuckern, Purinen und
anderen Metaboliten statt [Paulsen et al., 2001]. Ein gut untersuchtes Beispiel stellt
die EmrE - Pumpe in
E. coli
dar.
MATE - Transporter
In dieser Familie nden sich Transporter von Bakterien, Hefen und Panzen [Paulsen et al., 2001]. Sie wurden bisher zur Familie der MFS gezählt, sind jedoch inzwischen als eigene Familie anerkannt, da sich die Gensequenzen unerscheiden. Die
Proteine sind in etwa 450 Aminosäuren lang und bilden 12 TMS. Ein Natriumgradient wird als Energiequelle für den Eux von kationischen Farbstoen und
Fluorchinolonen genutzt [Kumar and Schweizer, 2005]. Ein gut studierter Vertreter
ist das YDhE - Protein von
E.coli.
RND - Transporter
Proteine der RND Familie sind in Bakterien, Eukaryonten und Archaea zu nden
[Tseng and Saier, 1999]. Sie werden in sieben Subfamilien unterteilt. Typischerweise
werden sie über chromosomale Gene kodiert, doch gibt es inzwischen auch Berichte
über Plasmidkodierte RND Transporter [Hansen et al., 2004]. Alle Mitglieder ermöglichen den Transport über einen Substrat/H
+
Antiport und zeigen ein weites
Substratspektrum.
1.3.1 Eux durch RND - Transporter
Gramnegative Bakterien können Euxpumpen aus allen fünf Transporterfamilien
aufweisen, doch sind die RND - Transporter am häugsten. Die klinische Relevanz
dieser Euxsysteme besteht in der Vermittlung von Mehrfachresistenzen gegenüber
strukturell unterschiedlichsten Substanzen. Die am besten studierten Euxpumpen
sind AcrAB - Tolc von
E. coli
und MexAB - OprM von
P. aeruginosa. Typischerwei-
se zeigen RND - Pumpen einen dreiteiligen Aufbau. Die Komplexe setzen sich aus
einem in der zytoplasmatischen Membran sitzenden Transporter - Protein, einem
Protein der äuÿeren Membran (OMP) und einem Membranfusionsprotein (MFP)
zusammen. All bisher studierten Pumpen von
E. coli
dem OMP TolC ein [Kumar and Schweizer, 2005].
8
gingen einen Komplex mit
1.3 Euxpumpen
Die Regulationsmechanismen der Expression von RND - Pumpen sind vielseitig
und durch lokale und globale Faktoren beeinussbar. So können Mutationen im lokalen Repressor - Gen zu einer Überexpression von RND - Pumpen führen. In
E. coli
ist der Repressor AcrR dafür zuständig die Überexpression von AcrAB zu verhindern. Weiterhin können Mutationen in globalen Regulatorgenen, wie MarRAB oder
SoxRS sowie Mutationen in Transkriptionsaktivatoren wie MarA, SoxS und Rob
zu einer Überexprimierung des AcrAB - TolC Systems führen [Okusu et al., 1996].
Aber auch Mutationen in der Protomer Region von AcrB oder Insertionselemente
oberhalb des AcrB Genlokus führen zu Überexpressionen [Piddock, 2006]. Ebenso
induzieren Stressfaktoren und bestimmte Substrate in der Umgebung die Expression, wie erhöhte Konzentrationen von Gallensalzen oder Fettsäuren [Ma et al., 1995].
1.3.2 Die AcrAB - TolC Euxpumpe
AcrAB TolC ist das qualitativ und quantitativ vorherrschende Eux System in
coli
E.
[Sulavik et al., 2001] und ist bis heute die am besten untersuchte RND - Pumpe.
Das Spektrum der Substraterkennung reicht von Antibiotika verschiedenster Stoklassen, Farbstoen, Gallensalzen und organischen Lösungsmitteln bis zu Ionen und
Chemikalien sowie Substanzen lipophiler und amphiphiler Natur, die alle direkt
nach Auÿen transportiert werden [Zgurskaya and Nikaido, 1999]. Die ursprüngliche
Funktion des AcrAB - TolC Eux Systems bestand vermutlich darin die Zelle vor
toxischen Substanzen wie Gallensalze oder Fettsäuren im natürlichen Umfeld, dem
Darm, zu schützen [Ma et al., 1995], [Thanassi et al., 1997]. Die dreiteilige Pumpe
besteht aus einem Transporterprotein an der inneren Membran AcrB, zuständig für
die Substraterkennung und die Energietransduktion, einem porenbildenden Protein
in der äuÿeren Membran TolC und dem periplasmatischen Membranfusionsprotein
AcrA. Damit überspannt sie den periplasmatischen Raum von der Cytoplasmamembran zur äuÿeren Membran (siehe Abb. 1.3).
Das Trimer TolC bildet eine das Periplasma und die äuÿere Membran durchziehende Röhre. Das Ende des Tunnels ist durch gewundene Proteinschleifen verschlossen, die sich durch allosterische Proteininteraktion wie eine Iris aufdrehen und den
Weg aus der Zelle freigeben können [Koronakis et al., 2000]. Diese Proteininteraktion wird vermutlich durch AcrA vermittelt, das verbindend von Auÿen auf AcrB
und TolC sitzt [Mikolosko et al., 2006]. Womöglich registriert AcrA die Konforma-
9
1 Einleitung
Abbildung 1.3: Übersicht von AcrAB - TolC, modiziert nach [Seeger et al., 2008].
tionsänderung des AcrB an der Cleft und leitet diese an TolC weiter, um dort den
Kanal zu önen [Murakami et al., 2002], [Takatsuka and Nikaido, 2007]. Ohne AcrA
ist die Funktion der gesamten Pumpe gestört [Zgurskaya and Nikaido, 1999].
AcrB besteht aus drei Monomeren, jedes 1049 Aminosäuren lang. Es besitzt eine Transmembranregion und periplasmatisch eine Porterdomäne sowie ein TolC Andockungselement, dass die Verbindung zu TolC herstellt. Die Transmembranregion besteht aus 12
α - Helices
(TM1-TM12). Zwischen der ersten und zweiten und
der siebten und achten Helix nden sich zwei sehr groÿe periplasmatische Schleifen,
an denen die auschlaggebende Komponente für die Determinierung der Substratspezität sitzt [Elkins and Nikaido, 2002], [Mao et al., 2002]. Der funktionell wichtige
Teil der Porterdomäne besteht aus drei
α - Helices,
die PN1 Subdomänen eines je-
den Monomers (siehe Abb. 1.4). Substrate können von AcrB aus dem Periplasma
wie auch aus dem Cytoplasma transportiert werden [Nikaido, 1996]. Die Vestibules (siehe Abb. 1.4) stellen drei Eingänge aus dem Periplasma dar [Husain et al.,
2011]. Auch an der Cleft (siehe Abb. 1.4) wurden Substratbindungen bewiesen [Takatsuka and Nikaido, 2007]. Die Substratbindungstasche in der Porterdomäne weist
viele aromatische Aminosäureseitenketten auf, die auf eine Substratbindung über
hydrophobe und aromatische Wechselwirkungen hinweisen [Bohnert et al., 2008].
Die Phenylalaninseitenketten der Stellen 136, 178, 610, 615, 617 und 628 sowie die
10
1.3 Euxpumpen
Aminosäuren Valin 61 und 139 neben Isoleucin 277 und 626 sind von zentraler Bedeutung. Polare Seitenketten, wie Asparagin 274, Glutamin 176 und Tyrosin 327
ermöglichen hydrophile Wasserstrobrückenbindungen [Murakami et al., 2006]. In
Abbildung 1.6 sind vermutliche Substrattransportwege dargestellt.
Abbildung 1.4: Proteinstrukturbilder von AcrB a) Seitenansicht mit farblicher Kennzeichnung
der Subdomänen. b) Ansicht der drei Monomere von oben und Darstellung
der Cleft, zwischen PC1 und PC2, der Vestibule und der drei funktionell
wichtigen
α - Helices
(PN1). Die Bindungsstasche entsteht zwischen PC1 und
PN2 [Eicher et al., 2009]. Modiziert nach [Murakami et al., 2002].
Anhand von Ko - Kristallisationsdaten [Seeger et al., 2006], [Murakami et al., 2006]
sowie Studien mit DARPin Inhibitoren [Sennhauser et al., 2006] ist davon auszugehen, dass der Substrattransport in AcrB funktional dreischrittig verläuft. Die drei
Monomere des Homotrimers von AcrB können drei verschieden Konformationen annehmen, die Stadien in einem rotierenden Zyklus darstellen. Vergleichbar ist dieser
Ablauf mit dem Mechanismus der ATP-Synthase [Boyer, 1989]. Die einzelnen Monomere rotieren in ihrer Konformation durch die drei Zustände loose (L), tight (T)
und open (O), die sich auf das Verhalten gegenüber dem Substrat beziehen. Im L Zustand haben die Substrate Zugang zur Bindungstasche. Im T - Zustand vergrössert sich die Bindungstasche, um den Substraten Platz zu geben für die Bindung.
Hierbei ist der Ausgang zum Trichter noch durch die
verschlossen. In der O - Konformation neigt sich diese
α - Helix
α - Helix
des O - Protomers
zur Seite und das
Gate önet sich zum Trichter der TolC - Andockdomäne. Dagegen ist nun der Eingang vom Perisplasma her verschlossen. Die Bindungstasche verkleinert sich und
11
1 Einleitung
quetscht dadurch das Substrat Richtung TolC hinaus, wie eine peristaltische Pumpe (siehe Abb. 1.5). Mit dem Zusammenrücken der Phenylalaninseitenketten ist eine
Substratbindung nun unmöglich, doch wird dadurch das Molekül ohne Substratbindung stabilisiert [Murakami et al., 2006]. Bei hohen Substratkonzentration sind die
Konformationen TTT und bei niedrigen Konzentrationen die Konformationen LLL
und LLT möglich [Seeger et al., 2008]. Dieses Modell eines assymmetrischen AcrB
mit einem peristaltischen Rotationsmechanismus lässt sich durch das Einbringen
von Disuldbrücken in die Subdomänen bestätigen, wodurch ihre Drehbeweglichkeit
arretiert wird. Es zeigt sich dadurch einen deutlich verminderten Eux [Takatsuka
and Nikaido, 2007], [Seeger et al., 2008]. Bei der energieliefernden Protonentranslokation sind geladene Aminosäureseitenketten, Aspartat 407 und 408 sowie Lysin
940, an den Schleifen TM4 und TM10 ausschlaggebend und bewirken eine Konformationsänderung bei Protonierung [Thanassi et al., 1997], [Guan and Nakae, 2001].
Das Loslassen des Substrates bei der Änderung von O zu L benötigt Energie und
geht einher mit dem Binden eines Protons [Seeger et al., 2006], [Eicher et al., 2009].
Abbildung 1.5: Schemazeichnung des funktionellen Rotationsmechanismus von AcrB. a) Seitansicht und b) Ansicht von oben, aus [Seeger et al., 2006]
12
1.4 Escherichia coli und Euxpumpen
Abbildung 1.6: Substrattunnel in AcrB. Die drei Monomer - Konformation sind farblich gekennzeichnet; L blau, T gelb und O rot. Die Tunnel, in Kristallstrukturen
entdeckt [Sennhauser et al., 2006], sind als grüne Strukturen hervor gehoben. Tunnel eins beginnt an der Groove - Struktur (in TMS acht und neun)
für den Transport von Substraten aus der Membran und Tunnel zwei an der
Cleft. Beide sind im O - Zustand geschlossen. In dieser Konformation (rot)
ist dagegen Tunnel drei geönet, um das Substrat durch TolC nach auÿen
zu lassen [Pos, 2009]. Im Kasten: die hydrophobische Bindungstasche, die im
T - Zustand (gelb) am Ende von Tunnel eins und zwei entsteht. a) und b)
repräsentieren eine drittel Rotation im LTO Zyklus. Modiziert nach [Seeger
et al., 2008].
1.4 Escherichia coli und Euxpumpen
E. coli
ist ein gramnegatives, sporenloses und bewegliches Stäbchen und gehört zur
Familie der Enterobacteriaceae. Es vergärt unter Gasbildung Glukose, Laktose und
Mannitol. In der Natur kommt es im Darm von Warmblütern vor und ist deshalb
der klassische Fäkalindikator [Hof and Dörries, 2005]. Pathogene Stämme von E. coli
stellen den häugsten Grund nosokomialer und ambulant erworbener gramnegativer
Infektionen dar. Sie sind für die Mehrheit von unkomplizierten Harnwegsinfekten,
neonatalen Meningitiden bei einem von 2,000 - 4,000 Säuglingen und Gastroenteritiden bei Kindern und Reisenden verantwortlich. Dabei sind ihnen verschiedene
Virulenzfaktoren wie Adhesine, Invasine, Toxine und Resistenzmechanismen behilflich. Unter den Gastroenteritiden werden die Erreger in serologische Subgruppen
eingeteilt und weisen spezische pathogene Merkmale auf: enterotoxische
(ETEC), enteroinvasive
teropathogene
E. coli
(EIEC), enterohämorrhagische
E. coli
E. coli
(EHEC), en-
E. coli (EPEC) und enteroaggregative E. coli (EAEC) [Todar, 2011].
13
1 Einleitung
E. coli
gehört zu den weltweit am besten untersuchten Spezies und wird deshalb
häug zu Forschungszwecken eingesetzt.
Für
E. coli
sind 37 Euxpumpensysteme bekannt, die den fünf beschriebenen
Transporterfamilien angehören. Das wichtigste und am besten erforschte System
stellt die bereits vorgestellte AcrAB-TolC - Pumpe dar (siehe Kap. 1.3.2). Weiterhin
der RND Familie angehörend wurden AcrEF, AcrD, YhiUV und MdtABC identiziert, die alle ebenfalls mit TolC interagieren [Nishino and Yamaguchi, 2001]. Jedoch
scheinen AcrEF, YhiUV und MdtABC keine wesentliche Rolle bei Antibiotikaresistenzen zu spielen [Sulavik et al., 2001]. Hingegen konnte gezeigt werden, dass andere
Euxpumpen, wie AcrEF, als Ersatz fungieren, wenn die Haupteuxpumpe AcrAB
ausgeschalten sein sollte [Jellen-Ritter and Kern, 2001], [Pagès and Amaral, 2009].
1.5 Euxpumpeninhibitoren
Dem Problem der zunehmenden Eux - vermittelten Resistenz muss entgegnet werden. Die Möglichkeiten der Euxreduktion umfassen: I) Die Veränderung des molekularen Designs bekannter Antibiotika wie den Einbau neuer Seitenketten, um die
Anität an die Bindungstasche zu reduzieren oder den Eux zu blockieren. II) Die
direkte Modikation der äuÿeren Membran mit einer seifenähnlichen Substanz für
eine erhöhte Permeabilität oder die Entwicklung eines Kanalblockers von TolC. Damit wäre eine verbesserte Aufnahme oder eine höhere intrazelluläre Konzentration
eines Antibiotikums erreicht. III) Abwandlung der Pumpfunktion durch kompetitive oder nicht - kompetitive Inhibition innerhalb der Pumpenhöhlen. IV) Die Erzielung eines Kollaps der energieverbrauchenden Mechanismen generell oder gezielt
am Antiporter [Mahamoud et al., 2007]. V) Veränderung von regulatorischen Expressionsmechanismen durch Antisense Oligonukleotide oder interferierende RNA.
VI) Inhibition der funktionalen Montage von AcrB durch Blockierung des Proteinexportes [Pagès and Amaral, 2009].
In den letzten Jahren wurden insbesondere zwei Strategien verfolgt. Die Erforschung bereits bekannter Antibiotika zur Herstellung von Derivaten, die nicht dem
Eux unterliegen, und die Entwicklung euxinhibierender Substanzen, die zur Wirkungsverbesserung von Antibiotika eingesetzt werden könnten [Lomovskaya and
Watkins, 2001]. Zu ersterem gelang die Neuentwicklung von Tigecyclin, einem Te-
14
1.5 Euxpumpeninhibitoren
tracyclinderivat [Someya, 1995], dass weitgehend gute Wirksamkeiten bewies. Auch
wurde gezeigt, dass der amphiphile Charakter von Antibiotika, der ihnen erlaubt
beide Membranen zu überqueren, eine Anfälligkeit für Eux erzeugt. So konnten
B - Laktam
Antibiotika ohne lipophile Seitenketten die AcrAB - Pumpe von
nella typhimurium
Salmo-
umgehen [Nikaido, 1998]. Andere Versuche mit Substanzen, wie
Polymixin - B, Carbonyl - Cyanide - m - Chlorophenylhydrazon (CCCP) oder Verapamil, die Membranpermeabilität zu beeinussen sind an der Toxizität in wirksamen
Dosen gescheitert [Mahamoud et al., 2007]. Der Entwicklung von kleinen organischen Molekülen, den Euxpumpeninhibitoren (EPIs), zur Kombinationstherapie
mit bereits bekannten Antibiotika kommt somit eine spezielle Aufmerksamkeit zu
[Lomovskaya et al., 2007]. Potentielle EPIs müssen hierbei gewissen Anforderungen
genügen [Lomovskaya et al., 2001]:
ˆ
Vermittlung einer verbesserten Wirksamkeit von gepumpten Antibiotika
ˆ
keine relevante Vermittlung einer verbesserten Wirksamkeit in pumpendezienten Stämmen
ˆ
fehlende Wirkungsverstärkung von Nicht - Substraten der Euxpumpe
ˆ
Vermittlung einer gesteigerten Akkumulation und verminderten Ausstoÿ des
Pumpensubstrates
ˆ
fehlende Beeinussung des Protonengradienten
Zudem muss ein putativer EPI in eektiven Dosen klinisch gut verträglich sein.
Entgegen den Bemühungen in der Krebstherapie sollte dies im Fall der EPIs von
RND - Pumpen aufgrund von häug fehlenden Homologien zu menschlichen Transportsystemen erreichbar sein. Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass die potentiellen
EPIs aufgrund der Substraterkennung durch Euxpumpen im Periplasma, nur die
Zellwand der Bakterienzelle überwinden müssen, um die periplasmatische Zielstruktur zu erreichen [Lomovskaya et al., 2007]. Die meisten potentiellen EPIs wurden
bisher durch Prüfungen von Stobibliotheken entdeckt.
In dieser Arbeit wurde vorwiegend mit zwei putativen EPIs gearbeitet, die sich
häug im Einsatz in der klinischen Forschung benden: Phenylalanin - Arginyl - B Naphtylamid (PABN) sowie 1 - (1 - Naphthyl - Methyl) - Piperazin (NMP).
15
1 Einleitung
Abbildung 1.7: Strukturformel der zwei EPIs a) (1 - Naphthyl - Methyl) - Piperazin (NMP)
und b) Phenylalanin - Arginyl - B - Naphtylamid (PABN).
In
E. coli
bewirkt die Zugabe von PABN eine Reduktion der minimalen Hemm-
konzentration (MHK) von Linezolid, Chloramphenicol, Rifampicin und Makroliden. PABN hat jedoch einen geringen Eekt auf Fluorchinolonresistenz [Kern et al.,
2006]. PABN ist selbst ein Pumpensubstrat [Lomovskaya et al., 2001] und kann so
möglicherweise über kompetitive Inhibition [Yu et al., 2003] oder auch über sterische
Hinderung wirken [Mahamoud et al., 2007]. Zusätzlich bewirkt es eine Inhibition
des Ketolite - Euxes unabhängig vom AcrAB - TolC System [Chollet et al., 2004].
Ebenfalls wirkt PABN in höheren Konzentrationen als Permeabilisierer der äuÿeren
Membran in Pumpenknockout - Stämmen [Lomovskaya et al., 2001].
NMP bewirkt in MHK - Testungen eine Zunahme der Empndlichkeit von
li
E. co-
gegenüber vielen Substanzen, darunter Fluorchinolone, besonders Levooxacin,
sowie Chloramphenicol, Ethidium - Bromid (EtBr), Clindamycin, Novobiocin, Linezolid und weniger stark Oxacillin [Bohnert and Kern, 2005]. Besonders bewies es
eine EPI - Aktivität bei uorchinolonresistenten Stämmen [Kern et al., 2006]. Der
Wirkmechanismus für NMP ist nicht geklärt, jedoch zeigt es die Grundvoraussetzung von einer fehlenden EPI - Wirkung in pumpendezienten Laborstämmen, um
von einer selektiven Beeinussung der Euxpumpen durch die Substanz auszugehen. Dabei sind die Wechselwirkungen zwischen dem EPI und dem Antibiotikum an
der Bindungsstelle oder auch davor sehr spezisch [Lomovskaya et al., 2001]. Auch
in anderen Studien bewirkt NMP eine Aufhebung der MDR Aktivität durch Inhibition der AcrAB und AcrEF Euxpumpen [Bohnert and Kern, 2005]. Ein völlig
unabhängiger Wirkmechanismus wird diskutiert [Mahamoud et al., 2007], [Bohnert
et al., 2010]. Besonders deutlich werden die Unterschiede in der Substratpräferenz
16
1.6 Zielsetzung
der beiden EPIs bei EtBr, Pyronin Y, Clarithromycin und Rifampicin. Daher ist
davon aus zu gehen, dass die Angrispunkte der EPIs verschieden sind [Kern et al.,
2006]. Beide EPIs sind jedoch aufgrund ihres toxischen Potentials bei relevanten
Dosen nicht im klinischen Gebrauch.
1.6 Zielsetzung
Ein Ziel dieser Arbeit ist die Selektion von AcrB - Mutanten, an denen die EPIs
PABN und NMP ihre Wirkung einer MHK - Reduzierung von Antibiotika aufgrund
der Mutationen in AcrB vermindert oder gar nicht entfalten können. Für diese
Eigenschaft der Bakterien wird der Begri EPI - Resistenz verwendet. Die verwendeten
E. coli
Bakterien stammen aus einer Bibliothek von Mutanten, deren AcrB
einer in - vitro Random Mutagenese unterworfen wurde. Der Groÿteil der verwendeten AcrB - Mutanten wurde zusätzlich einer Selektionierung mit einem EPI in
Kombination mit einem Antibiotikum und somit einer dabei stattndenen in - vivo
Random Mutagenese zugeführt. Damit soll gleichzeitig die geeignete Methode zur
Herstellung der EPI - resistenten Phänotypen getestet und gefunden werden. Nach
der Auswahl einiger Mutanten anhand ihrer MHK - Daten sollen diese phänotypisch
weiter dierenziert und die Mutationen der zu untersuchenden Mutanten durch die
Sequenzierung von AcrB dargestellt werden. Ein weiteres Ziel ist daraufhin die Zurückführung des Phänotyps auf die gefundenen Mutationen, indem diese in den
Ausgangsstamm 3AG100 eingefügt werden.
Das Fehlen von klinisch einsetzbaren EPIs macht deutlich wie wichtig weitere
Forschungen auf diesem Gebiet sind. Die Analyse der Eekte von Mutationen in
der AcrAB - TolC Euxpumpe tragen zukünftig zur Entwicklung von lokalisiert angreifenden Substraten und zielgerichteten Molekülen mit EPI - Charakter bei, um
so einen Beitrag zur Verbesserung der Antibiotikawirksamkeit im klinischen Alltag
zu leisten.
17
1 Einleitung
18
2 Material und Methoden
2.1 Lösungen und Bakterienstämme
Die in dieser Arbeit verwendeten Lösungen sind in Tabelle 2.1 aufgeführt. Alle
1
Nährmedien, Lösungen und Puer wurden nach der Herstellung autoklaviert
oder
sterilltriert. Der Agar wurde nach der eventuellen Zugabe von Antibiotika und
2 in Petrischalen gegos-
Euxpumpeninhibitoren (EPIs) unter sterilen Bedingungen
sen und im Kühlschrank gelagert. Die Konzentrationen der Stammlösungen der
Antibiotika, EPIs und Farbstoe und deren Lösungsmittel gibt Tabelle 2.2 wieder.
In dieser Arbeit wurde durchweg mit
Escherichia coli
Stämmen gearbeitet. Ei-
ne Übersicht der verwendeten Laborstämme ndet sich in Tabelle 2.3. Der Stamm
3AG100 stammt von dem K-12 Laborstamm AG100 ab [Okusu et al., 1996] und
überexprimiert AcrAB. Er wird in dieser Arbeit als Ausgangsstamm bezeichnet,
da die aus den Versuchen gewonnen Mutanten von ihm abstammen. 3AG100 ist
zwar ein Laborstamm, doch das AcrB - Gen, dass er enthält entpricht dem Wildtyp - AcrB - Gen. Die Stämme mit der laborinternen Nummerierung 513 und 320
sind 3AG100 - AcrB Knockout - Stämme, die eine Rpsl - Neo Kassette in einem Teil
oder an Stelle von AcrB enthalten (siehe Kap. 2.3.5).
Die Mutanten, mit denen in dieser Arbeit geforscht wurde, stammten aus einer
AcrB - Mutantenbibliothek, die durch die Vorarbeit der Arbeitsgruppe bestand [Biegert, 2011]. Die Bibliothek wurde in einem Gefriermedium mit 50 µg/ml Streptomycin und Glycerin (siehe Tab. 2.1) aufbewahrt. Zur Herstellung des mutagenisierten
AcrB der Mutanten wurde das GeneMorph
®
Die Mutazyme
®
Random Mutagenesis Kit
3 verwendet.
II DNA Polymerase ist eine Mischung aus zwei bei der Transkrip-
tion fehlereinbauenden Enzymen, durch die Random Mutationen mit minimalem
1 FP 30/0,2 CA-S, Schleicher & Schuell, Dassel
2 Bench von Hera Safe, Kendro, Laboratory Products
3 von Stratagene® , USA
19
2 Material und Methoden
Tabelle 2.1: Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen
Lösung
LB - Medium (Luria/Miller)
pH = 7,0
±0,2
LB - Agar (Luria/Miller)
pH = 7,0
±0,2
PBS (1Ö)
Phosphate Buered Saline
pH = 7,4
PBS + 0,4% Glucose
Menge/l H O
Hersteller
Trypton
10 g
Roth
Hefeextrakt
5g
NaCl
10 g
Trypton
10 g
Hefeextrakt
5g
NaCl
10 g
Agar
15 g
2 4
Na2 HPO4 Ö7 H2 O
2,31 g
Cambrex
13,94 g
(10Ö Lsg.)
NaCl
87,7 g
KH PO
2
2
4
KH PO
Na HPO
0,9% NaCl
TBE - Puer (1Ö)
pH = 8,0
L - Arabinose - Lsg (10%)
3 M Na - Acetat Lsg. (pH = 5,3)
2
Bestandteile
4 Ö7
2
H O
Roth
2,31 g
Cambrex
13,94 g
(10Ö Lsg.)
NaCl
87,7 g
Glucose-Lsg (25%)
16 ml
Fluka
NaCl
9g
Merck
Tris-Base
10,8 g
Sigma
Borsäure
5,5 g
Bio-Rad
EDTA
0,93 g
Roth
L-Arabinose
100 g
Sigma
408,24 g
Merck
2
Na-Acetat x 3H O
Essigsäure
Merck
zur pH - Einstellung
TE - Puer
10 mM
Tris-HCL
1,576 g
Merck
0,29 g
Roth
1g
Roth
(pH = 8)
1 mM EDTA
1,0% Agarose-Gel
Gefrier - Medium
2
ad 800 ml H O
ad 80 µl MgSO
4
zu je 200ml Lösung
nach dem Autoklavieren
20
Roti
® garose
TBE Puer
100 ml
EtBr (1% Lsg 1:120)
2 Tropfen
LB
20 g
KH PO
2 4
2 4
Na3 C6 H5 O7 x 2 H2 0
(NH4 )2 SO4
5,02 g
KH PO
1,44 g
Glycerol
35,2 ml
0,4 g
0,72 g
2.1 Lösungen und Bakterienstämme
Tabelle 2.2: Farbsto - und Antibiotikalösungen
Sto
Konzentration
Lösungsmittel
Hersteller
der Stammlösung
CCCP
20 mM
0,1 M NaOH
NMP
10 mg/ml
100 mg in
Sigma
Chess GmbH
2 ml DMSO,
2 ml 0,25 M
HCl, 6 ml
2
H O
PABN
10 mg/ml
H O
2
Sigma
Ethidiumbromid
10 mg/ml (=1%)
H O
2
Merck
Pyronin Y
10 mg/ml
H O
2
Sigma
Chloramphenicol
50 mg/ml
Ethanol
Kanamycin
50 mg/ml
H O
Linezolid
2 mg/ml
fertige
2
Roth
Sigma
Pzer Inc.
Infusionslsg
Minocyclin
1 mg/ml
Ethanol
Sigma
Novobiocin
10 mg/ml
H O
2
Sigma
Streptomycin
0,1 g/ml
H O
2
Sigma
Tetracyclin
10 mg/ml
Ethanol
USB
21
2 Material und Methoden
Tabelle 2.3: in diser Arbeit verwendete E. coli Laborstämme aus der Stammsammlung Labor
AG Kern
Name
Anzucht -
Beschreibung
Bedingungen
3AG100
MDR Mutante, gewonnen aus dem K - 12
Laborstamm AG100 durch sequentielle
Selektion mit Ooxacin, überexprimiert
AcrAB [Kern et al., 2000]
3AG100
3 µg/ml
mit Rpsl - Neo
Tetrazyklin,
in AcrB615-628
15 µg/ml
= Nr 320
Kanamycin
30
3 µg/ml
mit
Tetrazyklin,
= Nr 513
Kanamycin,
15 µg/ml
30
AcrB - Aminosäurenbereich 615-628 in
3AG100, pSc101-BAD-gbaA
(Red/ET-Plasmid) vorhanden
‰
3AG100
acrB::neo-rpsL
Rpsl - Neo - Kassette in
RpsL - Neo - Kassette ersetzt Gesamt - AcrB in
3AG100, pSc101-BAD-gbaA
(Red/ET-Plasmid) vorhanden
‰
Mutations - Bias entstehen. Die Mutationsrate kann gesteuert werden durch eine
unterschiedliche Templatemenge und der Anzahl der PCR - Cyclen, denn je geringer der DNA - Einsatz, um so mehr Verdoppelungen durchläuft eine PCR und desto
mehr Fehler werden eingebaut. In dieser Arbeit wurde mit einer mittleren Mutageneserate von viereinhalb bis neun Mutationen pro 1000 Basen gearbeitet. Dafür
wurden 500 ng Template eingesetzt und 30 Zyklen im Mastercycler durchlaufen
[Stratagene, 2006]. Da das eingesetzte Template eine Gröÿe von 3000 Basen besaÿ,
ist von einer geringeren Mutageneserate aus zu gehen. Das AcrB - Gen wurde nach
dieser ausgewogenen in - vitro Random Mutagenese per Homologer Rekombination (siehe Kap. 2.3.5) erneut in den Ausgangsstamm eingefügt. Die entstandenen
Mutanten waren somit bis auf ein zufällig mutiertes AcrB dem Ausgangsstamm
3AG100 gleich zu setzen.
22
2.2 Mikrobiologische Methoden
2.2 Mikrobiologische Methoden
2.2.1 Kultivierung und Lagerung
Die verwendeten Bakterienstämme wurden in Luria - Bertani - Lösung (LB) oder auf
LB - Agarplatten angezüchtet, gegebenenfalls mit den nötigen Antibiotika in verschiedenen Konzentrationen versetzt. Die Inkubation erfolgte als Übernachtkultur
4
im Brutschrank
bei 37 ‰ oder 30 ‰ für solche Stämme, die ihr Red/ET-Plasmid
nicht verlieren sollten (siehe Kap. 2.3.5 und Tab. 2.3). Handelte es sich um Flü-
5
ÿigkulturen wurden sie über Nacht im Schüttelinkubator
6
Zum Lagern der Stämme wurde das Cryobank—System
bei 225 rpm kultiviert.
verwendet. Bakterien kön-
nen an die poröse Oberäche der Cryoperlen binden, die nach dem Abpipettieren
7
der Gefrierlösung bei - 80 ‰ eingefroren wurden . Um ein Bakterienstamm neu zu
überimpfen, wurde eine Cryoperle auf eine Agarplatte gebracht, verrieben und über
Nacht kultiviert. Alle Bakterienstämme wurden vor der Durchführung der Versuche
mindestens ein weiteres mal überimpft.
2.2.2 Selektionierung eines AcrB - Mutantenpools
Die AcrB - Mutanten aus der Mutantenbibliothek wurden eine Selektionierung und
einer dabei stattndenen zusätzlichen in - vivo Random Mutagenese unterworfen. Zu
dem Pool an AcrB - Mutationen aus der in - vitro Random Mutagenese konnten somit noch weitere zufällige in - vivo Mutationen hin zu kommen, die in ihrer Gesamtheit zu einer Phänotypveränderung führen könnten. Dabei meint in dieser Arbeit
der Begri Selektionierung die sequentielle Anzucht von Bakterien in einem LB Gemisch mit ansteigenden Konzentrationen von Antibiotika und einer gleichbleibenden Konzentration der EPIs. Sie wurde in dieser Arbeit einschrittig durch geführt.
Von Bedeutung war die Kombination eines EPIs mit einem Antibiotikum, um die
Selektionierung durch diesen Selektionsdruck auf einen EPI - resistenten Phänotyp
hin zu steuern. EPI - Resistenz wiederum meinte die verminderte oder nicht mehr
vorhandene Wirkung einer MHK - Reduktion der zugesetzten Antibiotika durch den
EPI. Der Begri Selektion dagegen bedeutet, dass EPI - resistente Eigenschaften
der Mutanten selektiert wurden durch deren Ausplattierung auf einer Agarplatte,
4 Brutschrank Typ B5050E, Heraeus
5 Aerotron, Infors HAT, Schweiz
6 MAST Diagnostica GmbH, Reinfeld
7 HERA freeze, Heraeus
23
2 Material und Methoden
die eine bestimmte Antibiotika - und EPI - Konzentration enthielt. Die Selektionierung wurde dabei immer vor der Selektion durchgeführt.
Zur Selektionierung wurden die Bakterien entweder mit einer Öse oder einem
Replikatorstempel in 25 ml LB Lösung gebracht, die mit dem erwünschten Antibiotikum und EPI versehen war (siehe Tab. 3.1). Die Konzentrationen der Antibiotika
wurden dabei so gewählt, dass sie mindestens eine Stufe über der MHK des Ausgangsstammes 3AG100 mit diesem Antibiotikum und EPI lagen. Die EPIs wurden
in der für eine MHK - Reduktion bei 3AG100 bekannten Dosierung von 25 µg/ml für
PABN und 100 µg/ml für NMP dazu gegeben. Die Suspension wurde 18 Stunden im
Schüttelinkubator bei 37
‰ und 225
rpm herangezogen. Danach wurden sie fünf Mi-
8
nuten bei Raumtemperatur mit 4000 rpm zentrifugiert . Das Pellet wurde in 400 µl
einer 0,9 % -igen NaCl - Lösung resuspendiert. Je 50 µl, 100 µl und 100 µl einer 1:10
sowie 1:100 Verdünnung wurden auf die entsprechenenden Antibiotikaplatten mit
einem Trigalskispatel ausplattiert und über Nacht bebrütet. Die Auswahl der Antibiotika und EPIs korrespondierte dabei mit der aus der Anzucht. Die Konzentration
wurden jedoch ein bis zwei Stufen darüber und steigend gewählt, um resistente Mutanten hervor zu heben. Waren am folgenden Tag Kolonien gewachsen, wurden
diese mit einem Zahnstocher gepickt, nummeriert und für weitere Testungen aufbewahrt. Gepickt wurde dabei auf Agarplatten mit der gleichen Konzentration der
Antibiotika und EPIs wie die Platte, von der der Mutant stammte. Von den 1:100
Verdünnungen konnten die meisten Mutanten gepickt werden. Weiterhin brachten
die Platten mit der geringeren Konzentration den höheren Ertrag an Mutanten.
2.2.3 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration
Die Minimale Hemmkonzentration (MHK) eines Antibiotikums wird mithilfe des
Reihenverdünnungstest bestimmt, um die Resistenzprole einzelner Bakterienstämme zu charakterisieren. Sie wird deniert als die niedrigste Konzentration (µg/ml)
einer antibakteriellen Substanz, die unter denierten Bedingungen ( 18 h
±
2 h Be-
brütung) die Vermehrung eines Bakterienstammes verhindert. Die Tests basieren
auf den Richtlinien des National Committee for Clinical Laboratory Standards
9
für Mikrodilutionsverfahren .
8 Eppendorf 5810R
9 NCCLS, 2004
24
2.2 Mikrobiologische Methoden
Standard - MHK
Zur Reihenverdünnung, und um mehrere Antibiotika gleichzeitig testen zu können,
10 . Diese wurden industriell her-
wurden Standard 96 - Well MHK - Platten verwendet
gestellt
11
und waren mit gefriergetrockneten Antibiotika in steigenden Konzentra-
tionen versehen, die durch die Zugabe der Bakteriensuspension rehydriert wurden.
Für diese Arbeit wurden die A und B Platte verwendet. Folgend die Abkürzungen
der verwendeten Antibiotika und in Tabelle 2.4 sowie 2.5 ein Schema der Verteilung
der Antibiotika in den jeweiligen Konzentrationen auf die 96 - Well Platte.
A - Platte:
LEVO = Levooxacin
TET = Tetracyclin
CHA = Chloramphenicol
RIF = Rifampicin
OXA = Oxacillin
STR = Streptomycin
LIZO = Linezolid
CLR = Clarithromycin
GC = Wachstumskontrolle
Tabelle 2.4: Schema der Standard A - Platte (Konzentration in
µg/ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
LEVO
0,016
0,031
0,063
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
32
TET
0,063
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
CHA
0,063
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
RIF
0,063
0,125
0,25
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
OXA
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1024
STR
GC
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1024
LIZO
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1024
CLR
0,5
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1024
B - Platte:
ERY = Erythromycin
AZM = Azithromycin
CLI = Clindamycin
NOV = Novobiocin
SPT = Spectinomycin
GEN = Gentamicin
MNO = Minocyclin
CIP = Ciprooxacin
GC = Wachstumskontrolle
RIF = Rifampicin
STR = Streptomycin
LIZO = Linezolid
CLR = Clarithromycin
MOX = Moxioxacin
10 Micronaut-S
11 Merlin Diagnostika GmbH, Bornheim-Hersel
25
2 Material und Methoden
Tabelle 2.5: Schema der Standard B - Platte (Konzentration in
A
B
C
D
E
F
G
H
9
µg/ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
ERY
ERY
AZM
CLI
NOV
NOV
GEN
MNO CIP
RAM STR
MOX
0,125
32
2
2
0,25
64
0,25
0,063
0,016
0,016
ERY
ERY
AZM
CLI
NOV
NOV
GEN
MNO CIP
RAM LIZO MOX
0,25
64
4
4
0,5
128
0,5
0,125
0,031
ERY
ERY
AZM
CLI
NOV
NOV
GEN
MNO CIP
RAM LIZO MOX
0,5
128
8
8
1
256
1
0,25
0,063
0,125
ERY
ERY
AZM
CLI
NOV
NOV
GEN
MNO CIP
STR
LIZO MOX
1
256
16
16
2
512
2
0,5
0,016
0,25
ERY
ERY
AZM
CLI
NOV
SPT
GEN
MNO CIP
STR
LIZO MOX
2
512
32
32
4
4
4
1
0,031
0,5
0,25
ERY
AZM
AZM
CLI
NOV
SPT
GEN
MNO CIP
STR
CLR
MOX
4
0,25
64
64
8
8
8
2
0,063
0,063
0,5
ERY
AZM
AZM
CLI
NOV
SPT
GEN
MNO CIP
STR
CLR
MOX
8
0,5
128
128
16
16
16
4
0,125
0,125
1
ERY
AZM
CLI
CLI
NOV
SPT
GEN
MNO GC
STR
CLR
MOX
16
1
1
256
32
32
32
8
0,25
0,25
2
0,031
0,063
0,125
0,25
0,5
1
2
10
11
0,5
0,063
12
0,031
0,063
0,125
Zur Herstellung des Inokulums für die Mikrotitrationsplatten wurden mithilfe einer Öse einige Bakterien von einer frisch überimpften Agarplatte genommen und
in 5 ml NaCl (0,9%) resuspendiert bis die Trübung einen Mc-Farland von 0,5 ent-
12 . Dies entspricht einer Bakterienzahl von ca 107 Zellen/ml. Für eine Mikroti-
sprach
trationsplatte wurden 13 ml LB mit 13 µl des oben hergestellten Inokulums beimpft.
Um die Wirkung von EPIs zu testen, wurden zusätzlich 32,5 µl PABN (Endkonzentration: 25 µg/ml) beziehungsweise 130 µl NMP (Endkonzentration: 100 µg/ml) zu
dem LB mit Inokulum gegeben. Wurden vom selben Stamm die A und B Platte
gleichzeitig getestet, so wurde von allen Bestandteilen das doppelte genommen.
Es wurden mit einer Mehrkanalpipette
13 100 µl der LB - Inokulum - EPI Mischung
in die Wells pippetiert. Die Platten wurden mit einem Deckel verschlossen und für ca
20 h bei 37 ‰ im Brutschrank inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte die Auswertung
visuell mit Hilfe eines Spiegels (siehe Abb. 2.1), wobei die Antibiotikakonzentration
12 gemessen mit ATB 1550, api BioMérieux, Nürtingen
13 Research pro, Eppendorf, Hamburg
26
2.2 Mikrobiologische Methoden
Abbildung 2.1: Ablesung der Mikrotitrationsplatten von unten mit Hilfe einer Spiegelkonstruktion.
des Wells, in dem kein Wachstum mehr sichtbar war, als MHK gewertet wurde. Die
Ergebnisse wurden auf einem Plattenbelegungsplan protokolliert. Ein Unterschied
zum Ausgangsstamm 3AG100 wurde ab zwei Titerstufen als signikant gewertet;
also einer 4 - fach veränderten Antibiotikakonzentration. Abbildung 2.2 zeigt beispielhaft zwei MHK - Platten.
Eigen - MHK
Um andere Stoe, als die der Standard - MHK Platte, auf ihre wachstumsinhibierenden Eigenschaften zu überprüfen, wurden sogenannte Eigen - MHK - Tests mit
dem jeweiligen Sto durchgeführt - in dieser Arbeit mit Ethidium - Bromid (EtBr) und PABN. Dabei wurden die Verdünnungsreihen auf Mikrotiterplatten selbst
hergestellt. Auch hier wurden die Testungen ohne und mit EPIs durchgeführt. Die
getesteten Verdünnungsreihen für EtBr reichten von 512 bis 0,25 µg/ml und für
PABN von 400 bis 0,192 µg/ml, jeweils in halbierenden Schritten. Zur Herstellung
der Verdünnungsreihe wurden in die Wells zwei bis zwölf 50 µl LB vorgelegt. In
Well eins wurden 100 µl eine LB Lösung des zu testenden Stoes in doppelter Konzentration pippetiert. Anschlieÿend wurden mit einer Mehrkanalpippette 50 µl aus
dem ersten Well in den zweiten Well gegeben, dreimalig gemischt und dann weitere
50 µl in den nächsten Well gegeben bis zum letzten Well. Die letzten 50 µl wurden
27
2 Material und Methoden
(a)
(b)
Abbildung 2.2: (a) A-Platte (b) B-Platte. Die Konzentration desjenigen Wells, in dem kein
milchiges/punktförmiges Wachstum mehr zu verzeichnen ist, wird als die Minimale Hemmkonzentration (MHK) gewertet. Bei der A-Platte beispielsweise
würde man in Zeile A die MHK bei Spalte 7 setzen, was einer Levooxacinkonzentration von 1
µg/ml entspräche.
verworfen. Dann wurden wie für den Standard - MHK - Test die Bakterien in NaCl Lösung gebracht, auf einen McFarland von 0,5 eingestellt und 2 µl zu je einem ml
LB gegeben. Davon wurden jeweils 50 µl auf die Wells verteilt. Am Ende befanden
sich in jedem Well 100 µl Lösung.
2.2.4 Akkumulationsassay
Zur weiteren phänotypischen Testung ausgewählter Stämme, wurden Akkumulationsassays mit den Fluoreszenzfarbstoen Ethidium - Bromid, Pyronin Y und PABN
durchgeführt. Alle Farbstoe sind Substrate der AcrB Pumpe. Das Wirkprinzip beruht darauf, dass EtBr und Pyronin mit Nukleinsäuren interkalieren, wobei sich
ihre Fluoreszenz verändert, die auf unterschiedlichen Wellenlängen gemessen werden kann. Die Fluoreszenzintensität von EtBr verstärkt sich, durch dessen Einbau in
DNA [Lambert and Le Pecq, 1984], während die von Pyronin durch dessen Einbau
in RNA gequencht, d.h. vermindert wird [Crissman et al., 1985]. Auch der Einuÿvon EPIs kann durch deren Zugabe untersucht werden. Weiterhin wurde CCCP, als
Entkoppler des Protonengradienten der Zellmembran gegeben, um die maximale
Akkumulation im Vergleich darzustellen. Aus den Messwerten lassen sich Kurven
erstellen, die im Vergleich zu 3AG100 eine veränderte Akkumulation, gemessen in
RFU, aufweisen.
28
2.2 Mikrobiologische Methoden
Tabelle 2.6: Tecan - Einstellungen
Einstellung
EtBr
Betriebsart
PABN
Pyronin
Fluorescence Top
Wellenlänge der Exzitation
518nm
320nm
545nm
Wellenlänge der Emission
605nm
460nm
570nm
Verstärkung (Gain)
130
130
110
Anzahl der Blitze
10
8000µm
Z-Position
Anzahl/Dauer der Zyklen
60/60s
31/102s
Schütteln vor der Messung
5s
2s
10s
Schütteln zwischen den Messungen
5s
2s
60s
Temperatur
37
‰
Die zu untersuchenden Stämme wurden auf einer frischen Agar - Platte ausgestrichen und über Nacht im Brutschrank bei 37 ‰ inkubiert, um dann in 2,5 ml 0,4 % iger-Glucose - PBS Lösung (siehe Tab. 2.1) resuspendiert zu werden. Die Suspension
wurde auf eine Bakteriendichte von OD (600nm) = 1,00 eingestellt. Je 200 µl der
homogenisierten Lösung wurden in die Wells der 96 - Well Platte
14
gegeben. Zur
Untersuchung der Wirkung von EPIs und CCCP wurden diese mit einer Endkonzentration von 200 µM hinzu pippetiert. Unmittelbar vor Beginn der Messung wurde der Fluoreszenzfarbsto dazugegeben mit einer Endkonzentration von 2,5 µM
für EtBr und Pyronin Y und 200 µM für PABN. Alle Werte wurden dreifach erhoben und dann der Durchschnitt errechnet. Tabelle 2.6 listet die Einstellungen des
15
Microplatten - Readers
in Abhängigkeit von dem verwendeten Farbsto auf.
2.2.5 Euxassay
Der Assay stellt einen Versuchsaufbau dar, der in Echtzeit den Eux an Bakterienzellen misst [Bohnert et al., 2010]. Die Mutanten wurden mit unterschiedlichen
Farbstoen beladen, wobei CCCP als Entkoppler des Protonengradienten diente,
um die Zellen zu deenergetisieren und die Farbstoanreicherung zu ermöglichen.
Die Zugabe von Glukose energetisierte die Zellen erneut. Dadurch wurde der Eux
des Farbstoes ausgelöst und anhand seiner Fluoreszenz gemessen.
14 schwarz, acher Boden, Greiner BioOne, Frickenhausen
15 Sare, Tecan, Crailsheim
29
2 Material und Methoden
Die Bakterien wurden aus dem Gefrierstock in 20 ml LB gebracht und 15 Stunden über Nacht bei 37
‰
und bei 220 rpm angezüchtet. 10 ml dieser Flüssigkultur
wurden 5 min bei 4000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das
2
Pellet in 20 ml Kaliumphosphatpuer (20 mM, pH = 7,0 mit 1mM MgCl ) resuspendiert. Dann wurde die Suspension erneut 5 min bei 4000 rpm zentrifugiert. Dieses
Pellet wurde wiederrum in Kaliumphosphatpuer resuspendiert bis eine OD (bei
600nm) von 0,25 erreicht wurde.
Farbsto: 1,2 DNA
16
Wurde mit dem Farbsto 1,2 Dinaphthylamin (1,2 DNA)
gearbeitet, so wurden
nun 30 µl CCCP dazu gemischt, entsprechend einer Endkonzentration von 3 µM.
Nach 5 min Wartezeit wurde 50 µl 1,2 DNA dazu gegeben, entsprechend einer Endkonzentration von 5 µM. Die Bakterien wurden zum Beladen mit dem Farbsto unter gelegentlichem Schütteln 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Für den Versuch werden 2 ml der Suspension in eine Quarzglasküvette
Spektrumuorimeter
18
17 pipettiert und dann im
die Fluoreszenzintensität über die Zeit aufgezeichnet. Ein-
gestellt wurde dabei eine Anregung von 370 nm, eine Emission von 810 nm und
eine Schlitzweite von 10 nm. Um die Wirkung eines putativen EPIs (PABN, NMP
oder Sertralin) zu testen, wurde 50 Sekunden nach dem Start des Fluorimeterlaufes die gewünschte Menge in die Küvette pippetiert. 100 Sekunden nach dem Start
wurden 100 µl einer 1 M Glucose Lösung (Endkonzentration 50 mM) in die Küvette
pipettiert, um die Zellen erneut zu energetisieren und den Eux zu triggern, der in
Echtzeit bis zu einem Plateau nach 500s gemessen wurde.
Farbsto: DASPEI
Wurde der Versuch mit 2-4-Dimethylamino-Styryl-N-Ethylpyridinium-Iodid (DASPEI) als Farbsto durchgeführt, so wurde gleich verfahren wie oben, jedoch DASPEI und CCCP erst zu Beginn der Messzeit, jeweils mit einer Endkonzentration von
10 µM dazu gegeben. Dabei wurden am Fluorimeter eine Anregung von 461 nm, eine
Emission von 589 nm und eine Schlitzweite von 10 nm eingestellt. Gemessen wurde
bis 1300s und die Glukosezugabe erfolgte erst nach 1000s.
16 von TCI Europe, Zwijndrecht, Belgien
17 Starna, Atascadero, CA
18 LS 55, Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA
30
2.3 Molekularbiologische Methoden
2.3 Molekularbiologische Methoden
2.3.1 Extraktion genomischer DNA aus
Die DNA Extraktion aus
E. coli
E. coli
erfolgte mit dem QIAamp DNA mini Kit
19 . Dabei
wurde dem Protokoll des Herstellers gefolgt. Eluiert wurde einmal mit 200 µl AE Puer, der gute Bedingungen zum Lagern bietet.
2.3.2 Polymerase - Kettenreaktion
Die Polymerase - Ketten - Reaktion (PCR) wurde 1985 von Kary B. Mullis [Saiki
et al., 1985] entwickelt und 1987 durch die Verwendung der thermostabilen Taq Polymerase deutlich verbessert [Saiki et al., 1988]. Bei dem Verfahren werden enzymatisch von Primern denierte DNA Sequenzen exponentiell ampliziert, um vorhandene DNA in gröÿeren Mengen her zu stellen oder, um zu überprüfen, ob Sequenzen in einem vorliegendem Genom nachweisbar sind. Alle Reaktionen wurden im
Mastercycler Gradient
20
durchgeführt. Als Enzyme wurden die Taq - Polymerase
22
die Phusion - Polymerase
und die Triple - Taq
23
21 ,
entsprechend den Herstelleranga-
ben eingesetzt. Der Reaktionsansatz wurde jeweils auf 50 µl mit Wasser aufgefüllt,
wobei der zum Enzym gehörige Reaktionspuer, die dNTPs, die Primer und das
Template neben der Polymerase enthalten waren. Vom Template wurden in der
Regel 10 - 100 ng eingesetzt. Als Template dienten isolierte DNA oder, bei der sogenannten Colony - PCR, im Reaktionsmix suspendierte Bakterienkolonien. Die PCR
wurde elektrophoretisch auf einem 1,5 % - igen EtBr - Agarose-Gel überprüft. Dafür
wurden 10 µl der PCR Reaktion und 3 µl Loading Dye in eine Geltasche gegeben
und mit einem geeigneten Marker
24
aufgetrennt (Spannung: 70 - 75 Volt).
Die Taq - Polymerase wurde in der Colony - PCR dazu verwendet, den Erfolg der
Homologen Rekombination zu überprüfen. Dazu wurde der Check - GesAcrB Primer
verwendet (siehe Tab. 2.7). Anhand der entstandenen Produktgröÿe, konnte AcrB
an Stelle der RpsL - Neo - Kassette im Genom der Bakterien nach gewiesen werden.
19 Qiagen, USA
20 Eppendorf, Hamburg
21 Eppendorf, Hamburg
22 Finnzymes, Espoo, Finnland
23 Qiagen, USA
24 1 kb DNA Ladder, New England Biolabs, Ipswich, MA, USA; GenLadder 100 bp, Genaxxon
BioScience, Biberach
31
2 Material und Methoden
Tabelle 2.7: Primer zur Überprüfung auf AcrB im Genom und Oligonukleotide für die Triple Taq Reaktion vor dem Einsatz bei der Homologen Rekombination
Primer/
Sequenz
Annealing
Oligonukleotid
Temperatur
Check-
5'-AGA
GesAcrB-fw
GTG TC-3'
Check-
5'-GAT
GesAcrB-rv
GTT CAA-3'
UpperOl -
5'-
Rand - AcrB
AAG
CCT
TGC
GTC
CTG
60
GAG
TTG
GTG
60
TGC TCA GCC TGA ACA
GTC CAA GTC TTA ACT TAA
60
ACA GGA GCC GTT AAG AC-3'
LowerOl Rand - AcrB
GTT ATG CAT AAA AAA
GGC CGC TTA CGC GGC CTT
5'-
60
AGT GAT TAC ACG TTG TA-3'
Abbildung 2.3 zeigt ein Gelphoto nach dem Lauf einer Colony PCR unter Einsatz
der Taq - Polymerase und den Check - GesAcrB Primern.
Die Proof - Reading Enzyme wurden eingesetzt, wenn eine Erhaltung der Sequenz
von Bedeutung war. Die Phusion - Polymerase wurde benutzt, um aus Mutanten
extrahierte genomische DNA zu vervielfältigen, um sie dann zu sequenzieren (siehe
Kap. 2.3.4). Die Triple - Taq wurde zur Amplizierung der genomischen DNA vor
dem Einsatz in der Homologen Rekombination (siehe Kap. 2.3.5) eingesetzt. Dabei
wurden Primer mit bereits anhaftenen Homologiearmen verwendet (siehe Tab. 2.7).
Tabelle 2.8 zeigt die Einstellungen der einzelnen PCR Programme des Mastercylcers
bei den verwendeten Enzymen. Die Annealing Temperaturen richteten sich nach
verwendeten Primern und die Elongation nach der Produktgröÿe, doch wurden die
Enzyme nach einem gleichbleibenden Schema in den Versuchen eingesetzt.
2.3.3 Aufreinigung von PCR Produkten
Zur Aufreinigung der PCR Produkte wurde das QIAquick PCR Purication Kit
25
gemäÿ den Herstellerangaben verwendet. Das Produkt wurde in 50 µl H O eluiert.
2
Zur Messung des DNA Gehaltes der Proben wurde ein Teil der DNA mit sterilem
Wasser 1:10 verdünnt. 80 µl wurden in eine Quarzküvette gegeben und im Photo-
25 QIAGEN, Hilden
32
2.3 Molekularbiologische Methoden
Abbildung 2.3: Photo eines Agarose - Gels nach einer Taq Colony PCR von gewonnenen Mutanten. Zu sehen sind zwei unterschiedlich groÿe Produkte: AcrB im Genom
der gewonnenen Mutanten und die kleinere Rpsl - Neo - Kassette im Ausgangstamm 513.
meter
26
gemessen.
Die Fällung eines PCR - Produktes erreichte eine erhöhte DNA - Konzentration,
wie sie zum Einsatz bei der Homologen Rekombination nötig war. Dazu wurde zum
PCR Produkt 10 % des PCR Volumens an Na - Acetat - Lösung (pH = 5,3) gegeben
und gleichzeitig das 3 - fache Volumen von 100 % - igem Ethanol. Nach dem Mischen
wurde 5 min bei -80 ‰ gefällt. Daraufhin wurde 10 min bei 4 ‰ und 13200 rpm
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen und mit dem 10 - fachen Volumen
an kaltem 70 % - igen Ethanol gewaschen, jedoch nicht resuspendiert. Wiederum
wurde 10 min zentrifugiert und das Pellet bei 37 ‰ ca 10 min im Heizblock getrocknet. Dann wurde es in EB Puer (10 mM Tris - Cl, pH = 8,5) aufgenommen und
bei Raumtemperatur rückgelöst. Der gemessene DNA Gehalt sollte mindesten bei
0,5 µg/µl liegen.
2.3.4 Sequenz - Analyse
Zur Sequenzierung von AcrB wurden acht Ansätze einer PCR mit der Phusion Polymerase (siehe Tab. 2.8) und den AcrB - Sequenzier - Primern in einer Konzentration von 20 pmol/µl (siehe Tabelle 2.9) vorbereitet. Auf einem Gel wurde der
PCR - Erfolg anhand der Gröÿe der Stücke überprüft. Die PCR Produkte wurden
26 Eppendorf Bio Photometer
33
2 Material und Methoden
Tabelle 2.8: PCR - Programme und deren Temperaturprole
PCR-Schritt
Taq-Polymerase
Phusion-Polymerase
Triple-Taq
Denaturierung
4 min bei 96 ‰
30 sec bei 98 ‰
2 min 94 ‰
30 sec bei 94 ‰
10 sec bei 98 ‰
20 sec bei 94 ‰
1 min/1kb bei 68 ‰
30 sec bei 72 ‰
3 min 30 sec bei
(10
min
Colony-
PCR)
30 Zyklen mit:
Denaturierung
Annealing
Elongation
Abschlieÿende
30 sec bei 48-60 ‰
8 min bei 68 ‰
30 sec bei 55-60 ‰
20 sec bei 60 ‰
72 ‰
10 min bei 72 ‰
Elongation
gereinigt (siehe Kap. 2.3.3) und der DNA Gehalt gemessen, um sie folgend bei der
Sequenzierreaktion als Template ein zu setzen. Durch die acht Primerpaare entstanden acht Teilstücke des AcrB. Für jedes wurde bei der Sequenzierreaktion ein
eigener Reaktionsansatz jeweils pro Forward und pro Reverse Primer hergestellt. Die
Menge an Template der Sequenzieransätze wurde so errechnet, dass 40 ng eingesetzt
wurden. Dann wurden 1 µl Primer hinzu gegeben, diesmal mit einer Konzentrati-
27 ,
on von 3,2 pmol/µl, und 4 µl eines Sequenzierreagens
eine Mischung aus Puer,
Polymerase und Fluoreszens dNTPs. Jeder Ansatz wurde auf 20 µl mit Wasser aufgefüllt. Die Sequenzierungsreaktion wurde im Mastercycler Gradient mit folgendem
Temperaturprol durchgeführt:
Denaturierung
1 min bei 96
‰
25 Zyklen mit:
Denaturierung
30 sec bei 96 ‰
Annealing
30 sec bei 54 ‰
Elongation
4 min bei 60 ‰
28 mit dem MegaBACE 500 Sequencer29 analysiert.
30 ausgewertet.
Erhaltenen Sequenzen wurden mit dem Computerprogramm BioEdit
Die Proben wurden hausintern
27 Big Dye, Version 2.0 Terminator Kit, Applied Biosystems
28 Labor Dr. Homann, Abteilung Klinische Chemie, Medizinische Klinik, Uniklinik Freiburg
29 Amersham Biosciences, Buckinghamshire
30 www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html
34
2.3 Molekularbiologische Methoden
Tabelle 2.9: Primer zur AcrB Sequenzierung
Teilstück
Primer
5'-Sequenz-3'
1.
EC acrB seq 1-F
ataaccagcaagccgcaag
EC acrB seq 1-R
tgttctgcacctgaacctg
check-fw-1
gtgcagatcaccctgacctt'
check-rv-1
cgttctgcgctttgatgg
EC acrB seq 3-F
gaaagatgccatcagccgta
acrB-S1-r
agacccgacgggaagaac
EC acrB seq 5-F
ggcaatccgtgctgaact
EC acrB seq 5-R
ccagtagaaccgccaaagaa
EC acrB seq 6-F
gtcggtatcgcgatggtact
EC acrB seq 6-R
ctgtgtacgttcctgcgttg
acrB-S5-f
ccttcttgccagatgaggac
acrB-S5-r
gcagtacccagttccacgat
EC acrB S3-f
aacgttgagtcggtgttcg
EC acrB S3-r
aacccaatggttgtgagcag
acrB-S4-f
gtcgattccgttctccgtta
acrB-S4-r
gagttggtggttcaattactcctt
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Produktgröÿe (bp)
400
373
476
480
438
345
997
500
2.3.5 Homologe Rekombination
Die Homologe Rekombination ist eine Methode, bei der genetisches Material unabhängig von seiner Gröÿe zwischen zwei DNA Molekülen in vivo ausgetauscht
werden kann; ermöglicht durch Homologiearme, die auf beiden DNA Molekülen mit
fast der gleichen Sequenz zu nden sind und daher durch Basenpaarung miteinander
rekombinieren können. So kann jede Position eines Zielmoleküls spezisch verändert
werden [Zhang et al., 1998], [Muyrers et al., 1999]. Mit dieser Methode konnten gezielt veränderte AcrB - Gensequenzen in den Ausgangstamm 3AG100 eingebracht
werden.
31 verwendet.
In dieser Arbeit wurde das Counter - Selection BAC Modication Kit
Es basiert auf dem
tet
BAD - gba
ń - Phagen - Red/ET—
System. Das Red/ET Plasmid pSC101 -
vermittelt eine Tetrazyklinresistenz und trägt das RedGBα Operon,
dass für die Gene
α, B und G des ń - Phagen kodiert. Redα ist eine 5' Exonucleasen -
31 Gene Bridges, Heidelberg
35
2 Material und Methoden
Protein und RedB ist ein DNA Annealing - Protein. Die Phagenproteine benötigen
nicht mehr als 42bp lange Homologiearme, um die Homologe Rekombination zwischen linearer DNA und zirkulärer DNA, wie einem Plasmid, einem BAC oder einem
E. coli
Chromosom zu vermitteln. Das Operon wiederum steht unter der Kontrol-
le des L - Arabinose induzierbaren pBAD Promoters [Guzman et al., 1995], durch
den mit der Zugabe von L - Arabinose und einem Temperatursprung auf 37 ‰ das
Rekombinationsfenster auf die vorübergehende Expression der Phagenproteine limitiert wird. Aufgrund des temperatursensitiven Origins müssen die Zellen zum Erhalt
des Plasmids bei 30 ‰ kultiviert werden (siehe Tab. 2.3).
In der Stammsammlung des Labors (siehe Tab. 2.3) befanden sich
E. coli Stämme,
die bereits eine Rpsl - Neo - Kassette an der Stelle des AcrB enthielten, sowie das
Red/ET Plasmid trugen. So konnten die zu untersuchenden Oligonukleotide oder
PCR - Produkte direkt gegen die Kassette ausgetauscht werden. In dieser Arbeit
wurde Linezolid als Selektionskriterium gewählt, um den erfolgreichen Austausch
zu überprüfen. Linezolid stellt ein gesichertes Pumpensubstrat dar und weist somit
auf eine funktionierende AcrB - Pumpe im Genom an Stelle der Kassette hin. Ein
weitere Kontrolle stellte die Streptomycinresistenz des Ausgangstammes dar. Die
eingeführte Rpsl - Neo Kassette führt zu einer Streptomycinsensitivität, die nach
dem Austausch der Kassette mit der mutagenisierten DNA zu Gunsten der wieder
erlangten Streptomycinresistenz verloren geht.
Ersatz der Rpsl - Neo Kassette durch lineare DNA
Frische, bei 30 ‰ auf LB - Agarplatten mit Tetrazyklin (Tet3 µg/ml) ausgestrichene
Kolonien des Stammes 513 (siehe Tab. 2.3) wurden gepickt und in 100 µl warme
LB - Tet3 Lösung gebracht und zwei Stunden bei 30 ‰ und 1100 rpm angezogen.
Die Temperatur und das Tetrazyklin Medium sichern den Erhalt des Red/ET Plasmids. Dann wurden weitere 400 µl LB - Tet3 Lösung hinzugegeben und wiederum
über Nacht bei 30 ‰ im Schüttler
32
inkubiert. Am nächsten Tag wurden 30 µl ent-
nommen und in 1,4 ml frisches Tet3 - LB Medium gebracht. Die Bakterien wurden
wieder ca zwei Stunden angezogen, bis sie eine Dichte (OD=600) von maximal 0,2
erreichten. Dann wurden 30 µl L - Arabinose zugesetzt und wiederum für 45 Minuten, aber bei 37 ‰ im Schüttler wachsen gelassen. Dadurch wurde induziert.
32 Eppendorf, Thermomixer comfort
36
2.3 Molekularbiologische Methoden
Um elektrokompetente Zellen herzustellen wurde auf Eis gearbeitet. Die Proben
aus dem Schüttler wurden bei 2 ‰ für 30 Sekunden bei 1100 rpm zentrifugiert
33 . Der
Überstand wurde verworfen und die Zellen mit 1 ml eiskaltem destilierten Wasser
gespühlt. Dabei wurden jeweils zwei Proben gepoolt. Dieser Waschschritt erfolgte
drei Mal. Dann wurden zu 30 µl der Suspension 1 µl der linearen DNA hinzugegeben.
Nach einer Minute wurde die Suspension in Elektroporationsküvetten gegeben und
mit 1,8 kV elektroporiert
34 .
Sofort danach wurde 1 ml frisches LB hinzugegeben
und die Bakterien für 70 Minuten im Schüttler bei 37 ‰ inkubiert. Zum Schluss
wurden 150 µl der Bakteriensuspension mit einem Trigalski-Spatel auf Linezolid16
(16 µg/ml) sowie Streptomycin50 (50 µg/ml) enthaltenen Agar - Platten ausgestrichen und über Nacht bei 37 ‰ bebrütet. Einzelne Mutanten konnten per PCR auf
den erfolgten Austausch überprüft werden (siehe Kap. 2.3.2 und Abbildung 2.3).
2.3.6 Rekonstitution von Mutationen mit Hilfe der
Homologen Rekombination
Die Mutation F617S des Mutanten ChN4.5 wurde mit Hilfe eines Oligos in den Aus-
35
gangsstamm transformiert. Das Oligo
war von der AcrB - Aminosäurenstelle 615
bis 628 lang und enthielt an der Stelle 617 den Code für eine Serin - Aminosäure, an
Stelle einer Phenylalanin - Aminosäure. Auÿerdem enthielt es die nötigen Homologiearme, um das Oligo per Homologer Rekombination in den Ausgangsstammstamm
einzufügen. Als Ausgangsstamm wurde der AcrB - Knockoutstamm von 3AG100 mit
der internen Labornummer 320 gewählt (siehe Tab. 2.3), da dieser im Bereich der
Aminosäuren 615 bis 628 bereits eine Rspl - Neo Kassette enthielt. Es wurde 1 µg/µl
des Oligos eingesetzt und 4 ms mit 1,8 kV transformiert und 150 µl auf Linezolid
16 µg/ml haltigen Agarplatten ausplattiert. Das Oligo wurde anstatt der Aminosäuren 615 bis 628 ins AcrB eingefügt und hatte folgende Sequenz:
5'-gaacaacgttgagtcggtgttcgccgttaacggcttcggctctgcgggacgtggtcagaataccggtattg
cgttcgtttccttgaaggactgggccgatcgtccgggcg-3'
Zur Überprüfung des Ergebnisses wurde eine Colony PCR gemacht mit dem S5-f
und S5-r Primerpaar, das an den Aminosäurenbereich des Oligos andockte und eine
33 Eppendorf Centrifuge 5415 R
34 Bio Rad E-coli Pulser
35 der Firma Thermo Fisher Scientic, Ulm
37
2 Material und Methoden
Annealing - Temperatur von 52
‰
und eine Extension - Zeit von 3 min benötigte.
Auf einem Gel, war der Erfolg des Austausches anhand der Produktgröÿenunterschiede sichtbar und der gewonnene Mutant wurde sequenziert.
Auch die Mutationen des Mutanten OS1 wurden überprüft, indem sein gesamtes
AcrB - Gen in den Ausgangsstamm übertragen wurde. Zuerst wurde die AcrB - DNA
aus dem OS1 Stamm extrahiert (siehe Kap. 2.3.1). Die Messung ergab eine DNA
Menge von 19 ng/µl. Um eine höhere Ausbeute zu erhalten wurde diese DNA gefällt, so dass eine DNA Menge von 360 ng/µl erreicht wurde. Davon wurde 1 µl in
einer Triple - Taq Reaktion mit Hot Start (siehe Kap. 2.3.2) eingesetzt. Die vier erhaltenen Proben wurden gepoolt und erneut gefällt (mit 16 µl Natriumacetat und
480 µl Ethanol), dann mit 1400 ml Ethanol kalt gewaschen und in 15 µl EB Puer
36
über Nacht rückgelöst. Die entgültige Konzentration des Templates aus genomischer
DNA des OS1 lag bei 1,38 ng/µl. Davon wurde 1 µl bei der Homologen Rekombination mit einer Zeitkonstante von 5,4 ms eingesetzt. Von den gewachsenen Klonen
wurden 17 gepickt und 11 per PCR auf ihr AcrB Genprodukt überprüft. Sie enthielten AcrB und die ersten fünf Klone wurden daraufhin MHK getestet.
36 Qiagen, USA
38
3 Ergebnisse
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Selektionierung von AcrB - Mutanten,
an denen die EPIs NMP und PABN ihre Wirkung einer MHK - Reduzierung vermindert oder gar nicht entfalten konnten. Mittels MHK - Testungen, Akkumulations und Euxassays wurden die Mutanten phänotypisch dierenziert. Ihre Mutationen
in AcrB wurden per Sequenzierung dargestellt und zum Teil durch die Wiedereinfügung in den Ausgangstamm rekonstituiert.
3.1 Selektionierung
Die verwendeten AcrB - Mutanten entstammten einer Klonbibliothek aus in - vitro
Random Mutagenese Mutanten (siehe Kap. 2.1). Sie wurden zur Selektionierung mit
einem EPI in Kombination mit einem Antibiotikum angezogen (siehe Kap. 2.2.2).
Einige Chargen wurden jedoch nicht selektioniert, sondern unterlagen einer Anzucht
in nicht selektiver LB - Lösung, wie die Mutanten der OS und ÜLN Gruppen. Nach
der Anzucht wiederum wurden alle Mutanten auf LB - Agarplatten mit steigenden
Konzentrationen an Antibiotika und einer gleichbleibenden Konzentration der EPIs
ausplattiert (siehe Kap. 2.2.2). Tabelle 3.1 listet die verschiedenen Anzuchtmedien,
die Ausplattierungen und die dadurch entstandene Benennung der Gruppen auf. Für
die Anzucht der Mutanten der MN - und ChN - Benennung wurden 95 Mutanten aus
der Bibliothek verwendet, für die Mutanten der ÜLN - Benennung 27 und für alle
anderen jeweils 570. Somit wurden etwa 600 verschiedene Mutanten in die Versuche
eingebracht. Groÿe und gut erkennbare Einzelkolonien wurden gepickt, nummeriert
und weiteren Testungen zugeführt.
1 mit 50 µg/ml Streptomycin, gegen welches die Ausgangsstämme resistent waren
39
3 Ergebnisse
Tabelle 3.1: Klonselektionierung (Angaben in
Klon Gruppe
Flüssiganzucht über
µg/ml)
Ausplattierung auf
Nacht mit
MNb
Minocyclin 0,5 und
NMP 100
ChN
OS
Minocyclin 2, 4 jeweils in
Kombination mit NMP 100
Chloramphenicol 2 und
Chloramphenicol 8, 16 jeweils
NMP 100
in Kombination mit NMP 100
nur LB
1
Novobiocin 32, 64, 128 jeweils
in Kombination mit PABN 25
NP
ÜLN
Novobiocin 8 und
Novobiocin 32, 64, 128 jeweils
PABN 25
in Kombination mit PABN 25
nur LB
1
Linezolid 64, 128 jeweils in
Kombination mit NMP 100
LN
Linezolid 32 und NMP
Linezolid 64, 128 jeweils in
100
Kombination mit NMP 100
3.2 Ertrag nach der Ausplattierung
Es wurden je 50 und 100 µl der Flüssiganzucht von Minocyclin und Chloramphenicol in Kombination mit NMP ausplattiert. Danach wuchsen die Kolonien sehr dicht,
so dass geschätzt über 1000 pro Platte vorhanden waren. Etwa 15 Kolonien wurden gepickt und zum Vereinzeln erneut ausgestrichen, um Mischkolonien zu trennen.
Aus der Anzucht von Novobiocin in Kombination mit PABN wurden 50 µl auf
Platten mit 32, 64 und 128 µg/ml Novobiocin sowie 100 µl auf 128 µg/ml Novobiocin, jeweils mit 25 µg/ml PABN, ausplattiert. Eine 1:10 Verdünnung wurde auf 32, 64
und 128 µg/ml Novobiocin mit 25 µg/ml PABN ausplattiert. Auch hier wuchsen die
Klone sehr dicht und waren sehr klein, so dass wiederum über 1000 Klone pro Platte schätzbar waren. Es wurden wiederum Kolonien zum Vereinzeln ausgestrichen.
So konnten die Klone NP10 und NP15 von einer unverdünnten Ausplattierung auf
64 µg/ml Novobiocin mit 25 µg/ml PABN, Klon NP18 von einer unverdünnten Ausplattierung auf 128 µg/ml Novobiocin mit 25 µg/mlPABN und die Klone NP20 und
NP24 von einer verdünnten Ausplattierung auf 128 µg/ml Novobiocin mit 25 µg/ml
PABN gepickt werden. Aufgrund des zu dichten Wachstums wurde noch eine 1:100
Verdünnung der Anzucht hergestellt und wiederum auf 32, 64, 128 µg/ml Novobiocin
40
3.3 Erste Auswahl
jeweils in Kombination mit PABN ausplattiert. Von der 64 µg/ml Platte konnte nur
der Klon NP23 gepickt werden, doch auf der Agarplatte mit 32 µg/ml Novobiocin
wuchsen gut erkennbare Einzelkolonien, wovon 20 gepickt wurden - wie Mutanten
NP1 bis NP9, NP11 bis NP14, NP16, NP17, NP21 und NP22.
In der OS - Gruppe wurden in drei einzelnen Ansätzen je etwa 190 Mutanten in
LB - Lösung über Nacht angezogen. Je 50 µl davon wurden auf Platten mit 32, 64,
128 µg/ml Novobiocin in Kombination mit 25 µg/ml PABN ausplattiert. Hier waren
die Agarplatten mit etwa zehn bis 20 gut erkennbaren Einzelkolonien bewachsen.
Es wurden 29 Mutanten von den Platten mit einer Konzentration von 32 µg/ml
Novobiocin gepickt.
Von der LN - Anzucht wurden je 50 µl der Lösung und 50 µl einer 1:10 Verdünnung auf Platten mit 64 und 128 µg/ml Linezolid in Kombination mit 100 µg/ml
NMP ausplattiert. Auf der höheren Konzentration wuchsen keine Kolonien und auf
der niedrigeren Konzentration wuchsen die Kolonien sehr dicht und klein. Die Ausplattierung wurde mit nur 5 und 10 µl der Lösungen wiederholt, doch es zeigte sich
das gleiche Bild. Daraufhin wurden jeweils 50 und 100 µl einer 1:100 Verdünnung
auf 64 µg/ml Linezolid mit 100 µg/ml NMP ausplattiert. Diesmal wuchsen gut erkennbare Einzelkolonien mit etwa 40 Stück pro Platte. Davon wurden 38 Mutanten
gepickt. Später wuchsen auch auf der Linezolid 128 µg/ml Platten noch Kolonien,
die gepickt wurden und die Nummern LN29 bis 47 erhielten.
Ganz gleich verhielten sich die ÜLN - Mutanten auf den unterschiedlich konzentrierten Platten von Linezolid in Kombination mit NMP. Hier wurden 17 Klone
von der 64 µg/ml Linezolid - Konzentration gepickt, die mit einer 1:100 Verdünnung
ausplattiert wurden.
3.3 Erste Auswahl
Zur ersten phänotypischen Klassizierung der gepickten Mutanten wurden diese
durch die Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (siehe Kap. 2.2.3) auf
ihre Empndlichkeit gegenüber verschiedener Antibiotika getestet. Es wurden 81
Mutanten untersucht, darunter neun NM-, fünf ChN-, 23 NP -, acht OS -, 23 LN und 13 ÜLN - Mutanten. Danach wurden Mutanten herausgesucht, bei denen sich
41
3 Ergebnisse
Veränderungen in erster Linie in Bezug auf die Wirkung der EPIs, aber auch der
Antibiotika, ergaben. Durch erneute MHK - Testungen und Akkumulationsassays
wurden diese Mutanten weitergehend dierenziert. Beispielsweise zeigte sich bei
Mutant NP4 eine 8 - fache Reduktion der MHK von Novobiocin durch PABN, statt
einer bei 3AG100 erreichten 128 - fachen Reduktion. Auch bei Mutant LN2 erzielte
NMP mit Linezolid eine 4 - fache Reduktion der MHK, statt einer 32 - fachen bei
3AG100. Im EtBr Akkumulationsassay hingegen konnte diese Eigenschaft der EPI Resistenz nicht nachgewiesen werden. Beide Klone akkumulierten zusammen mit
den EPIs jeweils mehr EtBr als der Ausgangsstamm. Dem gegenüber standen Klone,
die im MHK eine EPI - Resistenz zeigten und auch im Akkumulationsassay diese
Eigenschaft beibehielten. Durch solche und ähnliche Abwägungen el die Wahl auf
fünf Klone, die bis zur Sequenzierung weiter verfolgt wurden und auf die sich im
Folgenden diese Arbeit konzentriert: ChN4.5, OS1, ÜLN3, ÜLN15, NP21.
3.4 MHK - Daten der ausgewählten Mutanten
In den folgenden Tabellen sind die MHK - Daten der ausgewählten Klone aufgelistet, jeweils im Vergleich zu 3AG100. Selektiert wurde der Mutant ChN4.5 auf einer
Agarplatte mit 16 µg/ml Chloramphenicol in Kombination mit 100 µg/ml NMP. OS1
wurde auf einer Agarplatte mit 32 µg/ml Novobiocin in Kombination mit 25 µg/ml
PABN und ÜLN3, ÜLN15 und NP21 jeweils auf einer Agarplatte mit 64 µg/ml Linezolid in Kombination mit 100 µg/ml NMP selektiert.
In den Tabellen nicht dargestellt sind die Ergebnisse der Eigen - MHK Testungen.
Die Eigen - MHKs der ausgewählten Mutanten mit PABN lagen wie bei 3AG100 alle
bei 800 µg/ml. Im Eigen - MHK mit EtBr verhielten sich die Mutanten weitgehend
wie 3AG100, mit höchstens einer Titerstufe Unterschied. Nur bei dem Mutanten
ÜLN15 erzielte NMP eine 8 - fache Reduktion des MHK - Wertes von 512 µg/ml auf
64 µg/ml.
42
3.4 MHK - Daten der ausgewählten Mutanten
Tabelle 3.2: Ergebnisse des Standard - MHK - Tests. Im Vergleich zu 3AG100 zeigte ChN4.5: 4 fach erhöhte Chloramphenicolresistenz und 8 - fache Novobiocinsensitivität, OS1:
4 - fach erhöhte Chloramphenicolresistenz und ÜLN15: 4 - fach erhöhte Chloramphenicol - und Rifampicin - Resistenz und 8 - fache Gentamycinsensitivität (nicht
in Tabelle). (Konzentrationsangaben in
µg/ml; zu den Abkürzungen der Antibio-
tika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
2
8
16
512
1024
256
1024
64
512
1024
4
1
ChN4.5
1
32
8
256
1024
256
512
32
512
128
8
1
OS1
1
32
16
512
1024
256
1024
96
512
1024
8
1
NP21
1
16
16
512
1024
256
1024
64
512
1024
8
0.5
ÜLN3
2
16
32
512
1024
512
1024
64
512
1024
4
1
ÜLN15
2
32
64
512
1024
256
1024
32
512
1024
4
1
Tabelle 3.3: Ergebnisse der x - fachen MHK - Reduktion durch PABN. PABN Wirksamkeit im
Vergleich zu 3AG100 bei ChN4.5: 8 - fach verringert mit Novobiocin und 4 - fach
erhöht mit Minocyclin sowie 6 - fach mit Chloramphenicol, OS1: 6 - fach verringert
mit Novobiocin, 4 - fach mit Levooxacin und Clarithromycin und 3 - fach erhöht
mit Chloramphenicol, NP21: 8 - fach verringert mit Novobiocin, ÜLN15: 6 - fach
verringert mit Novobiocin, 3 - fach erhöht mit Chloramphenicol und 4 - fach erhöht mit Rifampicin. (Konzentrationsangaben in
µg/ml;
zu den Abkürzungen
der Antibiotika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
8
2.7
64
4
8
32
21
16
8
128
8
1
ChN4.5
4
16
32
4
16
64
32
32
8
16
32
2
OS1
2
8
64
4
4
10.7
16
12
5.3
21.3
8
1
NP21
4
4
64
4
8
16
16
16
8
16
4
1
ÜLN3
4
4
128
4
8
64
32
21.3
8
256
3.2
1.3
ÜLN15
8
8
256
8
8
64
64
32
8
16
16
2
43
3 Ergebnisse
Tabelle 3.4: Ergebnisse der x - fachen MHK - Reduktion durch NMP. NMP Wirksamkeit im
Vergleich zu 3AG100 bei ChN4.5: 4 - fach verringert mit Linezolid, OS1: 8 - fach
verringert mit Novobiocin und 4 - fach verringert mit Linezolid, Oxacillin und
Clindamycin, NP21: 8 - fach verringert mit Novobiocin und 10,7 - fach mit Linezolid, ÜLN15: 4 - fach verringert mit Linezolid und Novobiocin (Konzentrationsangaben in
µg/ml; zu den
Abkürzungen der Antibiotika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
8
4
2
8
32
2
2
4
8
8
8
4
ChN4.5
5.3
8
1
4
8
2
1
2
4
4
16
4
OS1
4
8
1
2
8
1
1
3
2
1
4
4
NP21
4
4
2
4
10.7
1.3
1
2
4
1
4
1.3
ÜLN3
8
4
2
4
16
1
1
2
8
4
4
2
ÜLN15
8
8
4
8
8
2
2
4
8
2
4
4
3.5 Akkumulationsassays
Ethidiumbromid - Akkumulation
Zur weiteren Charakterisierung der Stämme wurden EtBr - Akkumulationsassays
durchgeführt (siehe Kap. 2.2.4). Zur besseren Vergleichbarkeit der Akkumulationskurven wurden die durchschnittlichen Werte der 30 - igsten Minute der Akkumulation ermittelt und in Vergleich zu 3AG100 gesetzt. Tabelle 3.5 listet die Ergebnisse
auf.
Erstens zeigte sich, dass nur die Klone ChN4.5 und ÜLN15 eine geringere Akkumulation im Vergleich zu 3AG100 aufwiesen, also den Farbsto EtBr schneller
aus der Zelle auspumpten. Dies wird deutlich durch einen Wert unter eins. Zweitens
bewirkte PABN bei allen Klonen eine höhere Akkumulation, was sich durch Werte
über eins verdeutlicht. Doch bei allen Klonen auÿer ÜLN15 liegen die Werte der EtBr - Akkumulation mit PABN unter dem Wert von 3AG100 mit PABN. Diese Klone
zeigten demnach eine partielle PABN Resistenz. Bei Klon ÜLN15 dagegen zeigte
PABN eine stärkere Wirkung als bei 3AG100, denn PABN bewirkte eine 2,6 - fache
Akkumulation von EtBr bei Klon ÜLN15 statt einer 2,08 - fachen bei 3AG100. Als
letztes wird deutlich, dass sich die NMP - Werte der Stämme nahe an eins bewegen,
was keiner Wirkung von NMP entsprechen würde und so auch vom Ausgansstamm
3AG100 gezeigt wurde.
44
3.5 Akkumulationsassays
Tabelle 3.5: Ergebnisse des EtBr Akkumulationsassays bei Minute 30. Der Ausgangsstamm
3AG100 wurde als Wert von eins gesetzt. Die x - fache Reduktion eines EPIs wurde
deniert als die x - fache Akkumulation von EtBr im Vergleich zu dem EtBr Akkumulationswert des jeweiligen Klons. Ein Wert über eins bedeutet also eine
EPI Wirkung und kann in Bezug gesetzt werden zu der Wirkung bei 3AG100.
Stamm
Akkumulation
x - fache
im Vergleich zu
Reduktion mit
x - fache Reduktion
3AG100
PABN
3AG100
1,00
2,08
1,08
ChN4.5
0,89
2,03
1,09
OS1
1,02
1,80
0,91
ÜLN3
1,32
1,80
0,89
ÜLN15
0,95
2,60
1,09
NP21
1,26
1,80
1,10
mit NMP
PABN - Akkumulation
Bei der Akkumulation mit PABN (siehe Tab. 3.6) zeigte ChN4.5 eine geringere
Akkumulation von PABN im Vergleich zu 3AG100, also eine bessere Pumpleistung
gegenüber PABN. Ebenso fand sich bei OS1 eine geringere Akkumulation als bei
3AG100 mit einem Wert unter eins. NMP zeigte im Zusammenspiel mit PABN eine
Wirkung, denn die Werte zeigten eine gröÿere Variation. Insbesondere bei ÜLN15
steigerte es die Akkumulation von PABN um ein 1,69 - faches.
Tabelle 3.6: PABN Akkumulationsassay bei Minute 60
Stamm
Akkumulation
im Vergleich zu
x - fache Reduktion
mit NMP
3AG100
3AG100
1,00
1,29
ChN4.5
0,69
1,24
OS1
0,95
1,00
ÜLN3
1,19
0,98
ÜLN15
1,56
1,69
NP21
1,42
0,95
45
3 Ergebnisse
Pyronin - Akkumulation
Tabelle 3.7: Ergebnisse des Pyronin Akkumulationsassays bei Minute 12. Bei der Bewertung
der Ergebnisse muss das Phänomen des Quenching beachtet werden. Die Absorptionsenergie von Pyronin geht verloren, wenn es an RNA bindet, so dass eine
geringere Fluoreszenz, ausgedrückt in RFU, messbar ist. Je höher also der Wert
der RFU Messung, desto weniger wird akkumuliert, denn Pyronin wird nicht in
der Zelle gebunden, sondern wieder ausgepumpt (siehe Kap. 2.2.4).
Stamm
RFU im Vergleich zu
3AG100
3AG100
1,00
ChN4.5
3.51
OS1
4.09
ÜLN3
3.69
ÜLN15
3.46
NP21
2.61
Die Werte aus der Tabelle 3.7 zeigen, dass alle Klone weniger Pyronin akkumulierten als 3AG100. Darunter akkumulierte der Mutant OS1 am wenigsten und der
Mutant NP21 am meisten Pyronin.
3.6 Euxassays
Von den Mutanten wurde der Eux in Echtzeit von zwei Farbstoen gemessen (sie-
2
he Kap. 2.2.5). In Abbildung 3.1 sind zwei Kurven dargestellt ; Stamm 3AG100
und Mutant F617S, jeweils mit dem EPI PABN. Bei Sekunde 50 wurde Glukose
zum Triggern des Euxes hinzu gegeben. Der Eux führte zu einer verminderten
RFU des Farbstoes und die Kurven elen ab.
Die Bestimmung der Zeit bis zur Hälfte des Euxes sollte die Vergleichbarkeit
der Werte ermöglichen und wurde in t - Eux50% ausgedrückt. Dafür wurde die
Zeit bis zur halbierten Fluoreszenz zwischen der Energetisierung durch die Glukosezugabe bis zum Plateau der Kurve abgelesen. Daraufhin wurde der Quotient aus
t - Eux50% vom Mutanten durch t - Eux50% von 3AG100 gebildet. Werte kleiner als eins bedeuten, dass der Mutant den Farbsto schneller aus der Zelle heraus
2 mit Hilfe des Programmes FL Winlab— , Perkin Elmer Inc., USA
46
3.6 Euxassays
173,7
160
150
140
130
120
Int
3AG100 mit P AßN25µM
110
100
90
F617S m it PAßN25µM
80
70
55,2
1,0
50
100
150
200
250
s
300
350
400
450
501,0
Abbildung 3.1: Vergleich des Echtzeit-Euxes von 3AG100 und F617S mit dem Farbsto 1,2
DNA, jeweils unter Zugabe von PABN als EPI. Die RFU von F617S sank
früher und auf ein tieferes Niveau ab, als die von 3AG100.
pumpen kann als 3AG100. Den Farbsto allein konnte kein Mutant schneller als
3AG100 aus der Zelle pumpen. Zum Teil wurde jedoch mit der Zugabe eines EPIs
der jeweilige Farbsto besser aus der Zelle gepumpt, als 3AG100 das mit demselben
EPI konnte, so dass im Vergleich diese EPIs bei diesen Mutanten und mit diesem
Farbsto schlechter wirkten. Vermehrt war PABN von diesem Eekt betroen. Diese
Mutanten sind hier mit ihren Werten aufgeführt:
mit 1,2 DNA als Farbsto
Mutant:
NP21
mit EPI:
NMP 400 µM
lag der Quotient bei:
0,53
mit DASPEI als Farbsto
Mutant:
mit EPI:
lag der Quotient bei:
ChN4.5
Sertralin 25 µM
0,85
OS1
PABN 50 µM
0,12
47
3 Ergebnisse
3.7 Sequenzierung
Die erwähnten fünf Mutanten wurden sequenziert, um die Mutationen im AcrB Genom der Mutanten zu untersuchen. Die gefundenen Mutationen wurden durch
3
Nachsequenzierungen jeweils überprüft. Es fanden sich folgende Mutationen :
ChN4.5
Position in AcrB:
Mutation:
Aminosäureveränderung:
1.
536
CGC zu GAG
R zu E
2.
617
TTT zu TCT
F zu S
Position in AcrB:
Mutation:
Aminosäureveränderung:
1.
210
CAG zu CTG
Q zu L
2.
506
GGG zu GCG
G zu A
3.
522
AAG zu GAG
K zu E
4.
572
TTT zu TCT
F zu S
5.
647
ATT zu GTT
I zu V
6.
999
GCG zu GCT
A zu A (stille Mutation)
Position in AcrB:
Mutation:
Aminosäureveränderung:
1.
369
ACC zu TCC
T zu S
2.
448
GTA zu GTC
V zu V (stille Mutation)
3.
510
AAA zu GAA
K zu E
4.
574
ACC zu ATC
T zu I
5.
576
GCT zu GTT
V zu A
6.
601
AAA zu AGA
K zu R
7.
722
GAA zu AAA
E zu K
8.
792
CGT zu CGC
R zu R (stille Mutation)
9.
850
AAA zu GAA
K zu E
10.
961
ATT zu ATC
I zu I
OS1
NP21
3 Für eine Erläuterung des Aminosäure - Kodes siehe Anhang
48
(stille Mutation)
3.8 Rekonstitution der Mutationen in den Ausgangsstamm
ÜLN3
Position in AcrB:
Mutation:
Aminosäureveränderung:
1.
599
CTG zu CCG
L zu P
2.
770
AAA zu AAG
K zu K (stille Mutation)
Position in AcrB:
Mutation:
Aminosäureveränderung:
1.
795
GAT zu AAT
D zu N
2.
842
GAG zu GGG
E zu G
3.
990
GTT zu GTA
V zu V (stille Mutation)
ÜLN15
An den unterschiedlichsten Stellen und in unterschiedlichster Anzahl sind Muta-
4
tionen in AcrB zu nden. Mit dem Programm Pymol
konnten die Positionen der
gefundenen Mutationen in AcrB in einer dreidimensionalen Struktur dargestellt werden. Abbildung 3.2 zeigt das substratbindene Protomer von AcrB
5
und macht die
Mutationen und ihre Positionen kenntlich. Die meisten Mutationen befanden sich
in der Porterdomäne des Proteins, in der Abbildung erkennbar als obere rundliche
Struktur aus
B - Faltblättern
und
α - Spiralen.
Die zwei Mutationen Q210L (OS1)
und D795N (ÜLN15) befanden sich am TolC - Verbindungstück. Mutationen wie
K522E und G506A (beide OS1) oder K510E und T369S (beide NP21) sowie R536E
(ChN4.5) fanden sich im Transmembrananteil des Proteins.
3.8 Rekonstitution der Mutationen in den
Ausgangsstamm
Um heraus zu nden, in wie fern die gefundenen Mutationen ausschlaggebend für
den Phänotyp waren, wurden einzelne oder mehrere Mutationen in das AcrB des
Ausgangsstammes eingebracht. Dies wurde mit Hilfe der Homologen Rekombination
ermöglicht (siehe Kap.2.3.5). Dann konnten diese neuen Stämme auf ihre phänotypischen Eigenschaften getestet und mit denen des Mutanten, von dem die Mutation
stammte, verglichen werden.
4 PyMOL— Evaluation Product - Copyright© 2008 DeLano Scientic LLC
5 2HRT Chain B [Seeger et al., 2006]
49
3 Ergebnisse
Abbildung 3.2: AcrB - Protomer
5 als Proteinstruktur in der Binding Konformation mit
Markierung der Aminosäurepositionen der einzelnen Mutationen, gefunden
bei den Mutanten: ChN4.5 in blau, OS1 in rot, ÜLN3 in grau, ÜLN15 in pink
und NP21 in orange.
50
3.8 Rekonstitution der Mutationen in den Ausgangsstamm
3.8.1 3AG100 - AcrB:OS1
Die Mutationen des Mutanten OS1 wurden überprüft, indem sein gesamtes AcrB Gen in den Ausgangsstamm übertragen wurde (siehe Tab. 3.8, 3.9 und 3.10).
Tabelle 3.8: Ergebnisse der MHK - Testung von 3AG100 - AcrB:OS1: Chloramphenicol - sowie
Clarithromycin
und
Rifampicinresistenz,
(Konzentrationsangaben in
µg/ml;
Sensitivität
gegenüber
Novobiocin.
zu den Abkürzungen der Antibiotika siehe
Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
2
8
16
512
1024
256
1024
64
512
1024
4
1
3AG100 -
1
12
24
512
1024
384 1024
64
512
768
8
1
1
32
16
512
1024
256
96
512
1024
8
1
AcrB:OS1
OS1
1024
Tabelle 3.9: Ergebnisse der x - fachen MHK - Reduktion durch PABN bei 3AG100 - AcrB:OS1:
verbesserte Wirkung zusammen mit Chloramphenicol und verschlechterte mit
Levooxacin. Zu 3AG100 ebenfalls verbesserte Wirkung mit Clarithromycin, Erythromycin, Rifampicin und Novobiocin. (Konzentrationsangaben in
µg/ml; zu den
Abkürzungen der Antibiotika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
8
2.7
64
4
8
32
21
16
8
128
8
1
3AG100 -
4
6
96
4
7
48
32
16
7
192
16
2
2
8
64
4
4
10.7
16
12
5.3
21.3
8
1
AcrB:OS1
OS1
51
3 Ergebnisse
Tabelle 3.10: Ergebnisse der x - fachen MHK - Reduktion durch NMP bei 3AG100 - AcrB:OS1:
verringerte Wirkung mit Novobiocin, Linezolid, Oxacillin und Clindamycin.
(Konzentrationsangaben in
µg/ml;
zu den Abkürzungen der Antibiotika siehe
Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
8
4
2
8
32
2
2
4
8
8
8
4
3AG100 -
4
6
3
5.3
16
2
1.3
4
5.3
3
8
4
4
8
1
2
8
1
1
3
2
1
4
4
AcrB:OS1
OS1
3.8.2 3AG100 - AcrB:ÜLN15
Es gelang ebenfalls das AcrB - Gen von ÜLN15 in den Ausgangsstamm ein zu fügen.
Tabellen 3.11, 3.12 und 3.13 führen die Ergebnisse auf.
Tabelle 3.11: Ergebnisse der MHK - Testung von 3AG100 - AcrB:ÜLN15: erhöhte Chloramphenicol - und Rifampicinresistenz, sowie Novobiocinsensitivität. (Konzentrationsangaben in
µg/ml; zu den
Abkürzungen der Antibiotika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
2
8
16
512
1024
256
1024
64
512
1024
4
1
3AG100 -
2
16
32
512
1024
256
1024
64
512
512
8
1
2
32
64
512
1024
256
1024
32
512
1024
4
1
AcrB:
ÜLN15
ÜLN15
3.8.3 3AG100 - AcrB:NP21
Auch das AcrB - Gen des Mutanten NP21 konnte in den Ausgangsstamm eingefügt
werden. Die Ergebnisse sind in Tabellen 3.14, 3.15 und 3.16 zu sehen. Dabei konnte
die 8 - fach reduzierte PABN und NMP Wirksamkeit zusammen mit Novobiocin nicht
bestätigt werden. Stattdessen erreichte PABN eine 256 - fache Reduktion der MHK.
Dieser Wert lag somit höher als der Wert bei 3AG100, bei dem PABN eine 128 - fache
Reduktion der Novobiocin MHK erzielte.
52
3.8 Rekonstitution der Mutationen in den Ausgangsstamm
Tabelle 3.12: Ergebnisse
der
x - fachen
MHK - Reduktion
durch
PABN
bei
3AG100 -
AcrB:ÜLN15: verbesserte Wirkung mit Novobiocin, verschlechterte zusammen
mit Rifampicin und Chloramphenicol. (Konzentrationsangaben in
µg/ml; zu den
Abkürzungen der Antibiotika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
8
2.7
64
4
8
32
21
16
8
128
8
1
3AG100 -
8
4
128 4
8
32
32
16
8
64
16
1
8
8
256 8
8
64
64
32
8
16
16
2
AcrB:
ÜLN15
ÜLN15
Tabelle 3.13: Ergebnisse
der
x - fachen
MHK - Reduktion
durch
NMP
bei
3AG100 -
AcrB:ÜLN15: verringerte Wirkung mit Linezolid und Novobiocin. (Konzentrationsangaben in
µg/ml; zu den
Abkürzungen der Antibiotika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
8
4
2
8
32
2
2
4
8
8
8
4
3AG100 -
8
8
4
4
16
1
2
2
4
2
8
4
8
8
4
8
8
2
2
4
8
2
4
4
AcrB:
ÜLN15
ÜLN15
53
3 Ergebnisse
Tabelle 3.14: Ergebnisse der MHK - Testung von 3AG100 - AcrB:NP21: Sensitivität gegenüber
Oxacillin und Linezolid, Resistenz gegenüber Rifampicin und Minocyclin. (Konzentrationsangaben in
µg/ml;
zu den Abkürzungen der Antibiotika siehe Kap.
2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
2
8
16
512
1024
256
1024
64
512
1024
4
1
3AG100 -
1
8
32
256
512
512
1024
64
512
1024
8
0.5
1
16
16
512
1024
256
1024
64
512
1024
8
0.5
AcrB:NP21
NP21
Tabelle 3.15: Ergebnisse
der
x - fachen
MHK - Reduktion
durch
PABN
bei
3AG100 -
AcrB:NP21: verschlechterte Wirkung mit Oxacillin, verbesserte mit Rifampicin,
Clarithromycin, Erythromycin, Clindamycin und Novobiocin. (Konzentrationsangaben in
µg/ml; zu den
Abkürzungen der Antibiotika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
8
2.7
64
4
8
32
21
16
8
128
8
1
3AG100 -
4
4
128 2
8
64
32
16
16
256
16
1
4
4
64
8
16
16
16
8
16
4
1
AcrB:NP21
NP21
Tabelle 3.16: Ergebnisse
4
der
x - fachen
MHK - Reduktion
durch
NMP
bei
3AG100 -
AcrB:NP21: verschlechterte Wirkung zusammen mit Linezolid und Ciprooxacin, verbesserte mit Rifampicin, Clarithromycin und Minocyclin. (Konzentrationsangaben in
µg/ml; zu den
Abkürzungen der Antibiotika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
8
4
2
8
32
2
2
4
8
8
8
4
3AG100 -
4
4
4
4
8
4
1
4
8
8
16
2
4
4
2
4
10.7
1.3
1
2
4
1
4
1.3
AcrB:NP21
NP21
54
3.8 Rekonstitution der Mutationen in den Ausgangsstamm
3.8.4 3AG100 - AcrB:F617S
Eine der zwei Mutationen von ChN4.5 war F617S. Diese Mutation wurde in 3AG100
eingefügt, wodurch der Mutant 3AG100 - AcrB:F617S entstand. In den folgenden
Tabellen (3.17, 3.18 und 3.19) sind die Ergebnisse seiner MHK - Testungen aufgeführt. Ebenso wie ChN4.5 zeigte 3AG100 - AcrB:F617S eine Novobiocinsensitivität
und eine verschlechterte PABN Wirkung zusammen mit Novobiocin.
Tabelle 3.17: Ergebnisse der MHK - Testung von 3AG100 - AcrB:F617S. Im Vergleich zu
3AG100 zeigte er sich 10,6 - fach sensitiver gegenüber Novobiocin. (Konzentrationsangaben in
µg/ml; zu den
Abkürzungen der Antibiotika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
2
8
16
512
1024
256
1024
64
512
1024
4
1
3AG100 -
1
16
16
256
1024
256
1024
32
512
96
4
1
1
32
8
256
1024
256
512
32
512
128
8
1
AcrB:F617S
ChN4.5
Tabelle 3.18: Ergebnisse
der
x - fachen
MHK - Reduktion
PABN
durch
bei
3AG100 -
AcrB:F617S. Im Vergleich zu 3AG100 war die PABN Wirksamkeit 5 - fach verringert mit Novobiocin und 3 - fach erhöht mit Chloramphenicol. (Konzentrationsangaben in
µg/ml; zu den
Abkürzungen der Antibiotika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
8
2.7
64
4
8
32
21
16
8
128
8
1
3AG100 -
4
8
64
4
10.7
32
32
32
8
24
8
1.33
4
16
32
4
16
64
32
32
8
16
32
2
AcrB:F617S
ChN4.5
Tabelle 3.20 stellt die Werte der Akkumulationsassays von 3AG100 - AcrB:F617S
dar. Der Mutant 3AG100 - AcrB:F617S zeigte im EtBr - Akkumulationsassay eine höhere Akkumulation als 3AG100. Auÿerdem zeigte er eine partielle Resistenz gegenüber PABN und NMP mit einer geringeren Reduktion der Akkumulation
durch die EPIs im Vergleich zu 3AG100. Im PABN Akkumulationsassay pumpte
3AG100 - AcrB:F617S mit einer 0,79 - fachen Akkumulation das Substrat besser aus
als 3AG100. Auch im Euxassay zeigte 3AG100 - AcrB:F617S ein besseres Euxverhalten bei der Zugabe von PABN als 3AG100. Mit einer PABN - Konzentration
55
3 Ergebnisse
Tabelle 3.19: Ergebnisse
der
x - fachen
MHK - Reduktion
durch
NMP
bei
3AG100 -
AcrB:F617S. Im Vergleich zu 3AG100 war die NMP Wirksamkeit 2,6 - fach verringert mit Novobiocin. (Konzentrationsangaben in
µg/ml; zu den Abkürzungen
der Antibiotika siehe Kap. 2.2.3.)
Stamm
Levo
Cha
Rif
Oxa
Lizo
Clr
Ery
Azm Cli
Nov
Mno Cip
3AG100
8
4
2
8
32
2
2
4
8
8
8
4
3AG100 -
4
4
2
4
16
2
2
2
4
3
4
2
5.3
8
1
4
8
2
1
2
4
4
16
4
AcrB:F617S
ChN4.5
von 25µM erreichte er einen t - Eux50% - Quotient von 0,67 und mit einer PABN Konzentration von 50 µM einen Quotienten von 0,91.
Tabelle 3.20: Akkumulationsassays von 3AG100 - AcrB:F617S im Vergleich zu 3AG100 und
ChN4.5
Stamm
EtBr
x - fache
x - fache
PABN
x - fache
Akkumu-
Redukti-
Redukti-
Akkumu-
Redukti-
lation
on mit
on mit
lation
on mit
PABN
NMP
Pyronin
Akkumulation
NMP
3AG100
1,00
2,08
1,08
1,00
1,29
1,00
3AG100 -
1,26
1,84
0,93
0,79
1,16
4.05
0,89
2,03
1,09
0,69
1,24
3.51
AcrB:F617S
ChN4.5
56
4 Diskussion
Ein wesentlicher Mechanismus der bakteriellen Antibiotikaresistenz ist der Eux
von Antiinfektiva durch Systeme wie AcrAB - TolC, die unter physiologischen Bedingungen eine hohe Expression erreichen können, ein breites Spektrum an Substratspezität zeigen und so zu einem multi - resistenten Pathogen führen können [Nikaido,
1998]. Bereits vorhandene Antibiotika zu modizieren oder die Entwicklung neuer
EPIs stellen zwei Optionen zur Lösung dieses Problemes dar. Dafür ist das Verständnis über die Struktur der Pumpe sowie den Mechanismus der Substratbindung und
Ausschleusung essentiell. Doch lassen die Spezität der Substratbindung und die
exakten Wirkungsmechanismen von putativen EPIs noch viele Fragen oen [Mahamoud et al., 2007]. Zum besseren Aufschluÿ über die Interaktion von AcrB und
EPIs wurden in dieser Arbeit AcrB - Mutanten einer in - vitro Random Mutagenese
Bibliothek mit einer EPI - Antibiotikum - Kombination selektioniert, um Mutanten
mit einem EPI - resistenten Phänotyp für weiteren Testungen her zu stellen.
4.1 Selektionierung und Methodik
Es stand eine AcrB - Mutantenbibliothek für diese Arbeit zur Verfügung. Die Mutanten dieser Bibliothek entstanden durch eine in - vitro Random Mutagenese, bei
der zufällig Mutationen in AcrB auftraten. Mit dem Einsatz von 500 ng DNA wurde mit einer mittleren Mutationsfrequenz von viereinhalb bis neun Mutationen pro
Tausend Basen gearbeitet [Stratagene, 2006] (siehe Kap. 2.1). Da jedoch ein 3 kb
groÿes Template eingesetzt wurde, ist mit einer geringeren Mutageneserate von etwa drei Mutationen pro Mutant zu rechnen. Insgesamt wurden bereits 22 Mutanten
der AcrB - Mutantenbibliothek sequenziert, wobei im Durchschnitt fünf Mutationen pro Mutant gefunden wurden, darunter regelmäÿig ein bis zwei stille Mutationen. Die errechneten Werte liesen sich somit empirischen bestätigen. Bisher wurden
hauptsächlich Mutanten mit einem veränderten Phänotyp sequenziert, so dass die
eigentliche Mutageneserate womöglich noch etwas tiefer lag. Bei etwa zwei bis drei
57
4 Diskussion
Mutationen pro Mutant und einem Einsatz in dieser Arbeit von 600 Mutanten aus
der Bibliothek standen somit etwa 1500 Mutationen im Mutantenpool für die Selektionierung zur Verfügung.
Dieser Pool an Mutanten mit den verschiedenen Varianten von AcrB wurde in
die Selektionierung eingebracht. Mittelst der Vermehrung der Bakterien stellt die
Selektionierung eine in - vivo Mutagenese dar. Mit ihrem Ablauf erhöhte sich die
Wahrscheinlichkeit, dass sich eine weitere Mutation ausbildete, die zusammen mit
den bereits vorhandenen aus der in - vitro Random Mutagenese zu einer Phänotypveränderung des jeweiligen Mutanten führt. Die Selektionierung ist eine sequentielle
Anzucht von Bakterien mit einer ansteigenden Konzentration eines Antibiotikums
in Kombination mit einer gleichbleibenden Konzentration eines EPIs. Durch die Anwesenheit eines EPIs in Kombination mit einem Antibiotikum wurde ein Selektionsdruck ausgeübt. Er selektierte auf Eigenschaften, die das Überleben des Bakteriums
in dem gegebenen Milieu sicherten, und selektierte somit zielgerichtet auf die Ausprägung einer EPI - Resistenz hin. EPI - Resistenz meinte die verminderte oder
nicht mehr vorhandene Wirkung der MHK - Reduktion von Antibiotika durch den
EPI. Die Annahme war, dass diese EPI - Resistenz aufgrund der Mutationen in
AcrB zustande kam.
In unveröentlichen Ergebnissen der Arbeitsgruppe zeigten sich nach der Durchführung mehrerer Selektionierungsschritte, dass sich durch einen stärkeren Selektionsdruck die Wahrscheinlichkeit erhöhte, dass die entstandenen Eigenschaften nicht
auf AcrB zurück zu führen waren. Durch die Selektionierung erhöhte sich vielmehr
das Risiko, dass Mutanten zwar den gesuchten Phänotyp aufwiesen, jedoch nicht
aufgrund eines Eektes in AcrB. Daher wurde für diese Arbeit keine sequentielle Anzucht, sondern eine einschrittige Selektionierung ausgeführt, denn mit einer
geringeren Anzahl an Selektionierungsschritten sinkt das Risiko einer Mutationsentstehung an anderer Stelle als in AcrB. Um jedoch die Wahrscheinlichkeit zu
erhöhen, dass sich Mutationen in AcrB nden, wurde daher der in - vitro Random
Mutagenese Schritt voran gestellt, um einen Pool an AcrB - Varianten bereit zu stellen.
Doch selbst bei einem einzigen Selektionierungsschritt herrschen Selektionsdrücke,
die Überlebensstrategien und Resistenzen fördern, die nicht durch eine Mutation
58
4.1 Selektionierung und Methodik
in AcrB herbei geführt wurden. Denkbar wäre eine veränderte Lipopolysaccharid (LPS) Struktur, die aufgrund der verringerten Membrandurchlässigkeit einen
Überlebensvorteil bietet, indem für das Bakterium schädliche Substanzen nicht ihre
Zielstrukturen in der Zelle erreichen können. Somit sind permeabilisierende Eekte
von EPIs als problematisch ein zu schätzen, da ihr Selektionsdruck zu LPS Veränderungen führen kann. Dies wurde bereits bei einigen kationischen antimikrobiellen
Peptiden und Polymyxinen, die über permeabilisierende Eekte ihre antimikrobielle
Wirkung entfalten, beobachtet [Pagès et al., 2005]. Auch für PABN konnten permeabilisierende Eekte bei Pumpenknockout - Stämmen gezeigt werden [Lomovskaya
et al., 2001]. Folglich könnte PABN die Entwicklung pumpenunabhängiger Resistenzentwicklung durch eine Beeinussung der Membranintegrität fördern. Beispielweise
wurde der Mutant NP21 mit PABN selektioniert. Seine Eigenschaften einer 8 - fach
verringerten Wirkung von PABN und NMP zusammen mit Novobiocin konnten nach
der Rekonstitution der Mutationen in den Ausgangsstamm nicht mehr nachgewiesen werden. Er zeigte nach der Rekonstitution hingegen eine einschrittig verbesserte
Wirkung von PABN zusammen mit Novobiocin. Es lässt sich daraufhin schlieÿen,
dass sich Mutationen bei NP21 ereignet haben müssen, die nicht AcrB betreen
und womöglich durch PABN begünstigt wurden.
Die Mutanten mit der ÜLN und OS Benennung hingegen wurden keiner Selektionierung und somit keiner in - vivo Random Mutagenese unterworfen, stammten
jedoch ebenfalls aus dem Mutantenpool. Sie wurden in einem nicht selektivem Medium angezogen und dann selektiert ausplattiert. Mit ÜLN15, OS1 und ÜLN3 ergaben
sich auch daraus Mutanten mit EPI - resistenten Phänotypen, die nach der Rekonstitution der Mutationen teilweise bestätigt werden konnten (siehe Kap. 4.5). Die
Mutanten der ÜLN und OS Anzucht bewiesen, dass auch ohne Selektionierung Mutanten gefunden werden können, die dem Ziel eines EPI - resistenten Phänotyps
entsprechen. Die Selektionierung sollte hingegen weitere Mutationen in AcrB entstehen lassen, um die Wahrscheinlichkeit der Entstehung eines EPI - resistenten Phänotyps zu erhöhen. Sie war somit eine indirekte Erweiterung des Pools. Ihre Durchführung wurde jedoch aufgrund dieser Ergebnisse und der Möglichkeit von Mutationsausbildungen auÿerhalb von AcrB fragwürdig. Die Wahrscheinlichkeit Mutanten
mit den gewünschten Eigenschaften zu nden steigt vielmehr mit der Vergröÿerung
des Mutantenpools.
59
4 Diskussion
Durch die Ausplattierung aller Mutanten auf mit EPIs und Antibiotika versetzten
Agarplatten, ergab sich eine zielgerichtete Selektion auf bestimmten Eigenschaften
hin, die sich aus dem Pool und der Selektionierung ergaben. Hierbei ist die Wahrscheinlichkeit der Mutationsentstehung wesentlich geringer. Bei jedem wachsenden
Mutant, konnte es einen anderen Grund geben für sein gutes Wachstum, auch wenn
Phänotypen Ähnlichkeiten zeigten. Es ist nicht gegeben, dass die hier gefundenen
Mutanten besonders resistent gegen die EPIs ihrer Anzuchts - Agarplatte sind, sondern bei einer zunehmenden Resistenz gegen die Antibiotika könnten die EPIs in Relation geringer wirken. Auÿerdem zeigten beide EPIs zusammen mit dem Antibiotikum Novobiocin häug eine verringerte Wirksamkeit. Jedoch gestalten sich Schwierigkeiten bei der Beurteilung der Wirksamkeit, da der Ausgangsstamm 3AG100
bereits bis zu einer Novobiocinkonzentration von 1024 µg/ml wächst und dies auch
die höchste Konzentration auf der Standard - MHK Platte ist. Eventuell weitergehend resistente Klone wurden daher mit der Standard - Platte nicht mehr erfasst.
Die x - fache MHK Reduktion des EPIs ist damit nicht feststellbar und die verminderte EPI - Wirksamkeit nicht beurteilbar. Ebenso kann nicht die Schlussfolgerung
gezogen werden, dass die Mutanten jeweils gegen die EPIs und Antibiotika aus ihrer
Anzucht resistent werden. So wurde der Mutant ChN4.5 mit NMP und Chloramphenicol selektioniert, zeigte aber neben einer Resistenz gegenüber NMP zusammen
mit Linezolid auch eine Resistenz gegenüber PABN zusammen mit Novobiocin. Auch
wuchs der Mutant OS1 auf einer Agarplatte mit 25 µg/ml PABN, obwohl er nicht
mit PABN oder einem anderen EPI selektioniert wurde.
Im Übrigen konnten bei der Auswertung der MHK Daten Veränderungen in den
Tetrazyklin Werten nicht berücksichtigt werden. Eine bestehende Resistenz könnte
weiterhin von einem Red/ET Plasmid vermittelt werden, das nach der Homologen Rekombination eventuell nicht verloren ging (siehe Kap. 2.3.5). Auch wurden
veränderte Werte bei Gentamycin nicht beurteilt, da Aminoglykoside aus dem Cyto - und Periplasma nicht durch AcrB, sondern durch AcrD gepumpt werden [Aires
and Nikaido, 2005]. Die Auswertung der Ergebnisse der EtBr - Akkumulationsassays
zusammen mit NMP als EPI wurde durch die geringe Wirkung von NMP in diesen
Versuchen bereits beim Ausgangsstamm 3AG100 limitiert. Hier bewirkte NMP eine
1,08 - fachen Akkumulation von 3AG100 im Vergleich zum alleinigen EtBr - Wert.
So bewegten sich die NMP - Werte der Stämme durchschnittlich nicht mehr als ein
Zehntel um eins herum. Dieser Umstand zeigte sich nicht in früheren Versuchen
60
4.2 Die Mutationen der Mutanten
der Arbeitsgruppe. Da für diese schlechte Wirkung von NMP noch keine Erklärung
gefunden wurde, konnten die EtBr - Akkumulationswerte zusammen mit NMP nicht
in der Diskussion verwertet werden.
4.2 Die Mutationen der Mutanten
In dieser Arbeit wurden insgesamt 23 verschiedene Mutationen im AcrB der Mutanten gefunden, darunter sechs stille Mutationen. Anhand der Abbildung 3.2 mit
den Proteinstrukturdaten von [Seeger et al., 2006] und Veröentlichungen zu Substratbindungsstellen [Husain and Nikaido, 2010] konnte auf die Lokalisationen der
Mutationen geschlussfolgert und sie somit funktionell eingeordnet werden. Die meisten der Mutationen lagen im periplasmatischen Anteil von AcrB. Dies war zu erwarten, da hier ein Groÿteil der Substratbindung und des Transportes statt ndet
[Murakami et al., 2002], [Yu et al., 2005], [Bohnert et al., 2008]. Die Mutation F617S
befand sich direkt in der Bindungstasche [Seeger et al., 2006]. Ebenfalls darin oder
in ihrer unmittelbaren Nähe [Husain and Nikaido, 2010] befanden sich viele weitere
Mutationen: F572S (OS1), T574I und V576A (beide NP21), L599P (ÜLN3), K601R
(NP21) und I647V (OS1). Die Mutation E722K (NP21) befand sich an einer Wand
der periplasmatischen Bindungstasche [Yu et al., 2005]. Zwei Mutationen befanden
sich im Einschleusebereich von AcrB, in der Nähe der Cleft [Husain and Nikaido,
2010]: Mutationen K850E (NP21) und E842G (ÜLN15). Zwei weitere Mutationen
befanden sich im Bereich des Gates: Q210L (OS1) und D795N (ÜLN15). Zudem fanden sich Mutationen im transmembranösen Anteils des Proteins, wie K522E und
G506A (beide OS1), K510E und T369S (beide NP21) und R536E (ChN4.5). Besonders sechs der Mutationen sind hervor zu heben, da an betroener Stelle durch
den Aminosäurewechsel die chemischen Bindungseigenschaften bedeutend verändert
wurden: E842G (ÜLN15) an der Cleft, F617S (ChN4.5) und F572S (OS1), beides
Phenylalanine aus der Bindungstasche, sowie T574I (NP21) ebenfalls aus der Bindungstasche, und Q210L (OS1) und D795N (ÜLN15) aus dem Gate Bereich. Diese
genannten Bereiche sind alle entscheidend am Transport von Substraten beteiligt
(siehe Kap. 1.3.2).
Anhand von mit Minocyclin und Doxorubicin in Kristallisationsversuchen gewonnenen Erkenntnissen wurde gezeigt, dass Substrate multiple, sehr spezische Bindungsstellen auf weisen und sich ein breites Substratbindungsspektrum von AcrB
61
4 Diskussion
erkennen lässt. Dies wird möglich durch exible Interaktion der Liganden mit verschiedensten Aminosäureseitenketten, zumeist hydrophobische Phenylalaninseitenketten, teilweise auch polare Seitenketten. So interagiert das Substrat Minocyclin
mit den Aminosäuren F178, N274 sowie F615 und Doxorubicin wiederum mit Q176,
F615 und F617 [Murakami et al., 2006]. Aus weiteren Ko - Kristallisationsstudien
sowie Mutations - und Kristallstrukturanalysen ist bekannt, dass Mutationen in der
Bindungsstasche oder der periplasmatischen Schleife das Substratbindungsverhalten
von RND - Pumpen durch Modulationen der tertiären Struktur, Protein - Protein Interaktionen innerhalb der Euxpumpe sowie durch die Entstehung neuer Substratbindungsstellen beeinussen können [Bohnert et al., 2007], [Elkins and Nikaido, 2002]. Im Allgemeinen bedeutet weiterhin verminderter Transport nicht immer
verminderte Bindungsanität [Vargiu et al., 2011]. Eine Mutation könnte das Bindungsverhalten von Substraten an die Pumpe verbessern, indem die Interaktionen
zwischen den Bindungspartnern in AcrB verfestigt werden. Auf dem Weg der funktionalen Rotation könnten daraufhin durch dynamische Veränderungen Substrate
in eine Sackgasse geführt und nicht euxiert werden, genauso wie die Verstärkung
der Anität einer Bindung den Eux verbessern kann. Es ist davon aus zu gehen,
dass auch die gefunden Mutationen der Mutanten ähnlich dierenzierte Interaktionen eingehen und somit spezische Veränderungen in der Substratbindung hervor
rufen können.
4.3 Phänotypen mit veränderter EPI - Ezienz
In erster Linie wurde nach Phänotypen gesucht, an denen die EPIs in ihrer MHK Reduktion von Antibiotika verändert wirkten im Vergleich zu 3AG100. Dabei wurden vor allem PABN und NMP als EPIs untersucht. In den Euxversuchen kamen
jedoch auch andere Stoe, wie Sertralin, zum Einsatz. So zeigte ChN4.5 im Echtzeit Euxassay mit DASPEI einen schnelleren Eux als 3AG100 unter der Zugabe von
Sertralin und bewies sich somit resistenter gegenüber Sertralin als 3AG100 mit einem t - Eux50% - Quotienten von 0,85. Eine Möglichkeit der Entwicklung von EPIs
besteht in der Ausnutzung von antimikrobiellen Nebeneekten von bereits klinisch
eingesetzten Medikamenten, deren Hauptwirkung jedoch nicht antibiotischer Natur
sind. Das SSRI Sertralin beweist EPI Eigenschaften und gilt als AcrAB - TolC Substrat. Im MHK zeigte es jedoch eine limitierte MHK - reduzierende Wirkung zusammen mit Antibiotika, wahrscheinlich aufgrund einer Induktion der Euxpumpenex-
62
4.3 Phänotypen mit veränderter EPI - Ezienz
pression [Bohnert et al., 2011]. Die Resistenz von ChN4.5 gegenüber Sertralin legt
nahe, dass auch Sertralin mit seinen Bindungspartnern auf sehr spezische Weise
interagiert und somit durch eine der Mutationen von ChN4.5 beeinusst wurde.
Im Vergleich sollte 3AG100 - AcrB:F617S ebenfalls mit Sertralin untersucht werden.
Dies ist von Interesse bei der weiteren Erforschung von Sertralin als EPI.
4.3.1 Verminderte EPI - Wirksamkeit von PABN
Im EtBr - Akkumulationsassay zeigten alle untersuchten Mutanten bis auf ÜLN15
eine partielle PABN - Resistenz im Vergleich zu 3AG100. Somit wurde überhaupt
eine Wirkung von PABN auch bei 3AG100 gezeigt. Bisher galt, dass PABN die
MHK von EtBr nicht beeinusst [Lomovskaya et al., 2001]. Im EtBr - Eigen - MHK Test verhielten sich dementsprechend die Mutanten wie 3AG100 und PABN als
EPI zeigte keine Wirkung, wie bisher zu erwarten war [Kern et al., 2006]. Im Eigen - MHK - Test mit PABN indessen waren alle Mutanten gleich resistent gegenüber PABN wie 3AG100. Dies zeigte, dass die PABN - Wirksamkeit in den durchgeführten Akkumulationsassays nicht an einer Sensitivität gegenüber PABN lag. Im
Echtzeit - Euxassay mit dem Farbsto 1,2 DNA erwies sich der Mutant 3AG100 AcrB:F617S erneut als resistenter gegenüber PABN als 3AG100. Mit einer PABN
Konzentration von 25µM erreichte er einen t - Eux50% - Quotient von 0,67. Ein
Quotient unter eins bedeutete, dass der Eux schneller verlief als bei 3AG100 unter der Zugabe von PABN, so dass PABN eine geringere Wirkung zeigte als bei
3AG100. Neben der partiellen PABN - Resistenz im EtBr - Akkumulationsassay
zeigte auch der Mutant OS1 besonders im Eux - Assay mit dem Farbsto DASPEI eine starke PABN - Resistenz mit einem t - Eux50% - Quotienten von 0,12.
Beide, 3AG100 - AcrB:F617S sowie OS1, besaÿen als Gemeinsamkeit eine Mutation
in der Bindungstasche: Die Mutation F617S von ChN4.5 und die Mutation F572S
von OS1, die in direkter Nachbarschaft zu der bekanntlich in der Bindungstasche
lokalisierten Aminosäure M573 lag [Husain and Nikaido, 2010]. Beide Mutationen
führten zu dem Austausch einer Phenylalanin - Aminosäurenseitenkette mit Serin.
Durch den Verlust einer Phenylalaninseitenkette kommt es zur Minimierung von
aromatischen Wechselwirkungen, wichtig für die Substratbindung [Bohnert et al.,
2008]. So könnte in Folge PABN seine vermutliche Wirkung über Substratinteraktionen in der Bindungstasche nicht mehr korrekt entfalten. Daraufhin wird es aus
der Zelle befördert, ähnlich wie im reinen PABN - Akkumulationsassay, bei dem die
63
4 Diskussion
Mutanten 3AG100 - AcrB:F617S, ChN4.5 und OS1 im Übrigen geringer als 3AG100
akkumulierten. Hierbei wurde PABN als Substrat ausgepumpt, denn PABN ist als
aromatische Verbindung selbst ein Substrat der AcrB - Pumpe [Lomovskaya et al.,
2001].
4.3.2 Verminderte EPI - Wirksamkeit von NMP
NMP zeigte eine abgeschwächte EPI - Wirkung zusammen mit Linezolid bei den
Mutanten ChN4.5, NP21, ÜLN15 und OS1. Sonst zeigt es mit dieser Substanz eine gute Wirksamkeit [Bohnert and Kern, 2005] und diese Mutanten entsprechen
daher den gesuchten Kriterien eines EPI - resistenten Phänotyps. Dieser Eekt
konnte auch nach der Rekonstitution der Mutation nachgewiesen werden, so dass
die jeweiligen Mutationen für diese Eigenschaft verantwortlich sein mussten. So
bewirkte NMP bei 3AG100 - AcrB:NP21 eine 8 - fache Reduktion der MHK von Linezolid und bei den Mutanten 3AG100 - AcrB:F617S und 3AG100 - AcrB:OS1 und
3AG100 - AcrB:ÜLN15 eine 16 - fache Reduktion der MHK von Linezolid, statt einer
32 - fachen bei 3AG100. Bei den ursprünglich NMP - resistenten Mutanten ChN4.5,
OS1 und ÜLN15 konnte hingegen eine 8 - fache Reduktion der MHK von Linezolid
erreicht werden.
Der Mutant ÜLN3 besaÿ als einzige Mutation L599P, aufgrund der Nähe zu
E607 somit wie diese ebenfalls in der Bindungstasche lokalisiert [Husain and Nikaido, 2010]. Die beiden Aminosäuren Leucin und Prolin besitzen beide eine hydrophobe Seitenkette, so dass entstehende Eigenschaftsveränderungen subtil sind. So
zeigten sich in den MHK - Testungen von ÜLN3 keine Besonderheiten. Im PABN Akkumulationsassay dagegen zeigte sich eine NMP - Resistenz bei dem Mutanten
ÜLN3, daneben auch bei NP21, OS1 und 3AG100 - AcrB:F617S. ÜLN3 wie OS1
wurden keiner Selektionierung mit einem Antibiotikum in Kombination mit einem
EPI unterworfen. ÜLN3 stammte jedoch von einer Agarplatte mit 64 µg/ml Linezolid und 100 µg/ml NMP als EPI. Die NMP - Resistenz lieÿe sich in diesem Fall
auf die einzige Mutation in der Bindungstasche von ÜLN3 zurückführen. Es spräche
dafür, dass die Bindungstasche im Wirkmechanismus von NMP eine Rolle spielt.
Ob über kompetitive Hemmung, allosterische Anlagerung oder einen anderen Mechanismus, die mutmaÿliche Interaktion von NMP mit einem Substrat scheint sehr
sensibel auf leichte Konformationsveränderungen.
64
4.3 Phänotypen mit veränderter EPI - Ezienz
4.3.3 Verbesserte Wirksamkeit der EPIs
NMP besaÿ im PABN - Akkumulationsassay eine EPI - Wirkung gegenüber ÜLN15,
so dass eine 1,69 - fache Akkumulation im Vergleich zu dem alleinigen EtBr - Wert
erreicht wurde. Im Eigen - MHK - Test mit EtBr erzielte NMP sogar eine 8 - fache
Reduktion des MHK Wertes, was dem Wissen entspricht, dass es als EPI mit EtBr
zusammen gut wirkt [Bohnert and Kern, 2005]. ÜLN15 besaÿ keine Mutation in
der Bindungstasche, hingegen zwei Mutationen an anderer Lokalisation, die dort
zu einer Eigenschaftsveränderung der betroenen Aminosäurenseitenketten führten: D795N, am Gate, führte vom sauren Aspartat zum basischen Asparagin und
E842G, an der Cleft, wechselte von der groÿen, geladenen, hydrophilen Seitenkette
Glutamat zur hydrophoben, kleinen Seitenkette Glycin. Die verbesserte Wirkung
von NMP als EPI im Vergleich zu 3AG100 lässt vermuten, dass die zwei Mutationen in der Cleft und am Gate auch eine Rolle bei der Wirkung von NMP spielen; eventuell durch eine Interaktion von NMP mit dem TolC Verbindungsstück.
Es wurde bereits vermutet, dass NMP über eine nicht - kompetitive Hemmung der
Euxpumpen wirkt und sich allosterisch am Pumpenprotein anlagert. Eine hierdurch bedingte Konformationsänderung des Proteins könnte dann für die schlechtere
Bindung und Ausschleusung mancher Pumpensubstrate ursächlich sein [Wehmeier,
2007]. Dies steht im vermeintlichen Widerspruch zu den Ergebnissen, bei denen
NMP - resistente Mutanten alle eine Mutation in der Bindungstasche aufwiesen.
Doch könnten eventuell auch Konformationsänderungen durch Mutationen in der
Bindungstasche zu einer schlechteren Bindung von NMP bei einer allosterischen
Anlagerung führen und so beide Ergebnisse in Einklang bringen. Ebenso kann ein
Einuss der Pumpenumgebung auf die NMP - Wirksamkeit vermutet werden.
PABN zeigte als EPI zusammen mit Chloramphenicol eine 6 - fach erhöhte Wirksamkeit bei dem Mutanten ChN4.5 und eine 3 - fach verbesserte Wirksamkeit bei
OS1 und ÜLN15. Es wäre denkbar, dass ein EPI die stärkste Wirkung an einem
resistenten Stamm entfaltet. Dies spricht für die Ergebnisse, die in
aeruginosa
Pseudomonas
dargestellt wurden, dass die Gröÿe des inhibierenden Eektes durch das
Level der Expression der Euxpumpe bestimmt wird [Lomovskaya et al., 2001].
Da diese Klone ein 4 - fache Chloramphenicolresistenz im Standard - MHK aufwiesen, könnte der Eekt des EPIs stärker hervorgehoben werden. Umgekehrt könnte
eine zunehmende Sensitivität der Klone eine verminderte Wirkung von EPIs erklären, so wie es bei PABN zusammen mit Novobiocin bei den Mutanten ChN4.5 und
65
4 Diskussion
3AG100 - AcrB:F617S der Fall war.
Weiterhin wirkte PABN bei dem Mutanten ChN4.5 zusammen mit Minocyclin
4 - fach verbessert. Da 3AG100 - AcrB:F617S dies nicht zeigte, musste die zweite
Mutation R536E diese Eigenschaft beeinussen, vorausgesetzt sie kam nicht durch
eine nicht überprüfte zusätzliche Mutation auÿerhalb der Pumpengene zustande.
R536E lag im unteren TM - Anteil von AcrB, worin ebenfalls die Protonentranslokation stattndet [Sennhauser et al., 2006] und sich die Central Cavity bendet.
Bei der Substratausschleusung gegen Protonen nden auch in TM - Anteil Konformationsänderungen statt [Yu et al., 2003], die durch eine Mutation wie R536E
beeinusst werden könnten. Diese Annahme wird unterstützt durch die Dierenz
der beiden Mutanten im EtBr - Akkumulationsassay. Anhand des Vergleichs von
3AG100 - AcrB:F617S und ChN4.5, der die beste Pumpleistung aufwies, könnte die
Mutation R536E oder wiederum eine Mutation auÿerhalb der Pumpengene an der
guten Pumpleistung gegenüber EtBr beteiligt sein. EtBr ist ebenso wie Novobiocin
ein aromatisches Molekül, das hydrophobische Wechselwirkungen eingehen kann.
Es wurde gezeigt, dass Ethidium in der groÿen Central Cavity des TM - Anteils gebunden wird. Da die Central Cavity eine groÿe Bindungstasche darstellt, geschieht
auch dies hauptsächlich über hydrophobe Wechselwirkungen [Yu et al., 2003]. Somit könnte die Mutation R536E durch eine Konformationsänderung daran beteiligt
sein.
4.4 Phänotypen mit veränderter Substratspezität
Es zeigten sich neben der veränderten EPI - Ezienz auch Veränderungen in der Antibiotikaspezität der Mutanten. So zeigten 60% der untersuchten Mutanten eine
4 - fach erhöhte Chloramphenicolresistenz im Vergleich zu der Chloramphenicolresistenz von 3AG100. Chloramphenicol, als eines der kleinsten Moleküle unter den Antibiotika, wird in seiner Funktion gering durch eventuell mutationsbedingte Strukturveränderungen sterisch beeinträchtigt. Studien zeigen, dass TolC eine Bedeutung
hat in Stämmen mit einer Chloramphenicolresistenz [Chollet et al., 2004]. Weiterhin
kann TolC auch unabhängig von AcrA und AcrB aktiv sein [Sulavik et al., 2001].
So könnte die Chloramphenicolresistenz unabhänging von den gefundenen Mutationen in AcrB durch Veränderungen von TolC bedingt sein. Diese Überlegung wird
jedoch widerlegt von den Ergebnissen nach der Rekonstitution der Mutationen, in
66
4.4 Phänotypen mit veränderter Substratspezität
denen die Chloramphenicolresistenz weiterhin vorhanden war, wenn auch nicht so
stark ausgeprägt. Mutationen in AcrB scheinen daher schnell eine Veränderung in
der Wirkung von Chloramphenicol hervor rufen zu können und das sehr häug.
ÜLN15 zeigte eine 4 - fach erhöhte Rifampicinresistenz im Vergleich zu 3AG100.
Das sehr groÿe Molekül Rifampicin kann schlecht durch die äuÿere Membran gramnegativer Bakterien gelangen und seine Wirkung ist daher empndlich gegenüber
Membranveränderungen. Defekte der äuÿeren Membran durch veränderte Lipopolysaccharide führen demnach zu einer Empndlichkeitszunahme gegenüber Rifampicin [Nikaido, 2005]. Auch gibt es nur geringe Unterschiede in der Rifampicin - MHK
zwischen pumpendezienten und pumpen - überexprimierenden Stämmen [Sulavik
et al., 2001], so dass eine andere Ursache als ein verändertes AcrB für die Rifampicinresistenz von ÜLN15 vermutet werden könnte. In diesem Zusammenhang ist
auch die 4 - fach verbesserte PABN Wirkung zusammen mit Rifampicin interessant.
Sie könnte durch eine pumpenunabhängige, permeabilisierende Wirkung des EPIs
hervorgerufen werden; wie bereits mehrfach vermutet [Kern et al., 2006]; [Lomovskaya et al., 2001]. Vermutlich fällt sie hier jedoch aufgrund der erhöhten Resistenz
stärker aus als beim Ausgangsstamm 3AG100 (siehe Kap. 4.3.3). Es ist zu beachten,
dass ÜLN15 keiner Selektionierung mit PABN unterworfen und auf NMP - haltigen
Agarplatten ausplattiert wurde, so dass LPS - Veränderungen durch einen Selektionsdruck von PABN unwahrscheinlich sind. Auch Makrolide stellen groÿe Moleküle
dar, deren Wirkung durch Membranveränderungen stark beeinusst werden. Für
Makrolide ergeben sich jedoch keine MHK - Veränderungen bei ÜLN15. Deshalb ist
insgesamt davon auszugehen, dass die Rifampicinresistenz von ÜLN15 nicht durch
Membranveränderungen, sondern durch seine Mutationen zustande kam. Besonders
da die Rifampicinresistenz nach der Rekonstitution der Mutationen weiterhin bestand, wenn auch nur 2 - fach statt 4 - fach ausgeprägt.
Der Mutant ChN4.5 zeigte in MHK - Testungen eine 8 - fache Sensitivitätszunahme gegenüber Novobiocin. Anhand des Mutanten 3AG100 - AcrB:F617S, der eine
10,6 - fache Sensitivität gegenüber Novobiocin zeigte, konnte der Nachweis erbracht
werden, dass die Mutation F617S für diese Eigenschaft ausschlaggebend war. Vorausgehende Ergebnisse aus unserem Labor zeigen, dass bei Mutanten mit gezielt
eingebrachten Alanin -
statt Phenylalanin - Aminosäuren an den Stellen F136A,
F178A, F615A, F617A, F628A die MHK von Novobiocin ebenfalls deutlich re-
67
4 Diskussion
duziert war [Bohnert et al., 2008]. Es lieÿen sich jedoch keine gröÿeren MHK Veränderungen mit Minocyclin oder Doxorubicin feststellen, trotz der Ergebnisse von Kokristallisationsstudien mit diesen Substraten, die wie erwähnt F178 und
F617 als Bindungspartner darstellten [Murakami et al., 2006]. Mittels dieser nicht
vorhandene Korrelation zwischen den Kokristallisationsversuchen und den gefundenen MHK - Daten wurde geschlussfolgert, dass eine Redundanz der Phenylalaninseitenketten besteht. Deletion oder Mutation nur einzelener Phenylalaninseitenketten
führen meistens zu einer leichten Reorientierung des Substrates und zur Nutzung
anderer Phenylalaninseitenketten als hydrophobische Bindungspartner, so dass eine
Substratbindung trotzdem stattndet. Jedoch könnten gröÿere Substrate wie Novobiocin oder Makrolide sich in dem veränderten Umfeld der Bindungstasche weniger
gut adaptieren und daher von einer einzelnen Mutation beeinusst werden [Bohnert
et al., 2008]. Die Ergebnisse in dieser Arbeit zeigten damit, dass schon die Mutation
F617S ausreicht, um die MHK von Novobiocin zu reduzieren. Serin ist wie Alanin
eine kleine, nicht aromatische Aminosäure, die zudem eine hydrophile Seitenkette
aufweist und somit ein anderes Bindungsverhalten als das hydrophobe Phenylalanin
zeigt.
4.5 Phänotypen nach der Rekonstitution der
Mutationen
Um die erste Auswahl anhand der MHK - Ergebnisse treen zu können, wurde in
dieser Arbeit eine Signikanz der Ergebnisse ab einer 4 - fachen MHK - Veränderung
festgelegt. Dabei wurden die Ergebnisse mindestens dreifach wiederholt und der
Median genommen. Im Vergleich der Ergebnisse nach der Rekonstitution der Mutationen fällt auf, dass diese Signikanzstufe zum Teil nicht mehr erreicht wurde,
doch die rekonstituierten Mutanten auch nicht mit 3AG100 gleich zu setzen waren.
Stattdessen waren kleinere Stufen in den MHK - Werten vorhanden, die somit auch
einen deutlichen Unterschied zu 3AG100 bildeten und von den gefunden Mutationen her rührten. Gerade im oberen Bereich einer Verdünnungsreihe stellen diese
Stufen groÿe Sprünge in den Antibiotikakonzentrationen dar. Manche Ergebnisse
zeigten jedoch statt einer verminderten Resistenz eine zunehmende Sensitivität, die
sich vorher nicht zeigte. Dies war besonders mit Minocylcin häug der Fall. Hier
mussten also noch andere Mechanismen eine Rolle gespielt haben, die vermutlich
bei der Selektionierung entstehen konnten. Für eine genaue Darstellung aller Er-
68
4.5 Phänotypen nach der Rekonstitution der Mutationen
gebnisse siehe Kapitel 3.8:
Bei der Rekonstitution der Mutationen von NP21 in den Ausgangsstamm konnte
dessen Phänotyp einer 8 - fach verringerten Wirksamkeit von NMP und PABN zusammen mit Novobiocin nicht reproduziert werden. Vielmehr entstand ein Mutant,
der sich zum Teil sensitiver als der Ausgangsstamm darstellte vor allem in Bezug auf
Oxacillin und Linezolid, zum Teil aber auch resistenter in Bezug auf Rifampicin und
Minocyclin beispielsweise. Auch die EPIs wirkten unterschiedlich. So erreicht PABN
eine 2 - fache, statt wie bei 3AG100 und NP21 4 - fachen Reduktion der MHK von
Oxacillin. NMP erreichte eine 8 - fache Reduktion der MHK von Linezolid statt einer
32 - fachen bei 3AG100 und lag somit nahe an der 10,7 - fachen Reduktion bei NP21.
Anhand des Mutanten 3AG100 - AcrB:ÜLN15 konnten die Eigenschaften einer erhöhten Chloramphenicol - und Rifampicinresistenz von ÜLN15 auf die Mutationen
zurück geführt werden. Doch auch hier wurde nach der Rekonstitution keine 4 fache, sondern eine 2 - fache Resistenz nachgewiesen. Auch war 3AG100 - AcrB:ÜLN15
eine Stufe sensitiver für Novobiocin. Die verbesserte Wirkung von PABN zusammen
mit Novobiocin und die verschlechterte PABN - Wirkung zusammen mit Rifampicin und Chloramphenicol konnten nachgewiesen werden, wenn auch erneut nicht
im vollen Ausmaÿ. Ebenso konnte die verringerte Wirkung von NMP mit Linezolid
und Novobiocin nachgewiesen werden; bei letzterem im vollem Ausmaÿ. Die Mutationen von ÜLN15 sind demnach gröÿtenteils ausschlaggebend für seinen Phänotyp
im MHK - Test.
Nach der Rekonstitution der Mutationen konnte auch für OS1 die Chloramphenicolresistenz in geringerem Ausmaÿ nach voll zogen werden. Jedoch gestaltete
3AG100 - AcrB:OS1 sich ebenfalls sensitiver gegenüber Novobiocin und resistenter
gegenüber Clarithromycin und Rifampicin im Vergleich zu OS1 sowie dem Ausgangsstamm 3AG100. Mit den MHK - Werten ohne EPI verhielt er sich sonst wie
OS1. Mit PABN ergab sich erneut eine verbesserte Wirkung zusammen mit Chloramphenicol und erneut eine verschlechterte mit Levooxacin, jedoch beides im
geringeren Ausmaÿ. Hingegen war die Wirkung mit Clarithromycin, Erythromycin,
Rifampicin und Novobiocin jeweils verbessert, ebenfalls im Vergleich zu 3AG100.
Auch die verringerte Wirkung von NMP mit Novobiocin, Linezolid, Oxacillin und
Clindamycin lieÿ sich bestätigen, wenn auch nicht im vollen Ausmaÿ. Viele der Eigenschaften von OS1 lieÿen sich demnach auf die Mutationen zurück führen.
69
4 Diskussion
Für die Mutante ChN4.5 wurde nur die Mutation F617S in den Ausgangsstamm
eingefügt. Damit konnte die Novobiocinsensitivität belegt werden. Ebenso war in geringerer Ausprägung die Chloramphenicolresistenz nachweisbar. Die erhöhte Wirksamkeit von PABN mit Chloramphenicol konnte im geringeren Ausmaÿ ebenso festgestellt werden, wie die verringerte Wirksamkeit mit Novobiocin. Die erhöhte Wirksamkeit mit Minocyclin konnte dagegen nicht belegt werden und so eventuell von
der Mutation R536E her rühren. Geringer konnte auch die verringerte Wirksamkeit
von NMP zusammen mit Linezolid nachgewiesen werden.
4.6 Fazit
Ein Ziel dieser Arbeit war es Mutanten zu nden die eine Phänotypveränderung
aufwiesen im Vergleich zu 3AG100, besonders in Hinblick auf eine verminderte EPI Wirksamkeit in der MHK - Reduktion von Antibiotika. Dieses Ziel wurde erreicht
und die Phänotypen wurden in Kap. 4.3 und 4.4 erläutert. Ein zweites Ziel war
es zu zeigen, dass die Mutationen in AcrB für den Phänotyp ausschlaggebend waren, indem diese Mutationen erneut in den Ausgangsstamm eingefügt wurden. Hier
zeigte sich, dass die erzielten Eekte der Phänotypveränderung partiell auf die Mutationen in AcrB zurück zu führen waren. Gröÿtenteils waren die Eigenschaften in
einem geringeren Ausmaÿ nachweisbar.
Einen Selektionierungsschritt durch zu führen war nicht sinnvoll. Aufgrund der Selektionierung konnten an anderer Stelle als in AcrB ebenfalls Mutationen entstehen,
die ohne einen Eekt in AcrB einen EPI - resistenten Phänotyp hervorbrachten, der
somit nach der Rekonstitution der Mutationen in AcrB nicht nach vollziehbar war.
Anhand der ÜLN und OS Mutanten wurde ersichtlich, dass der Mutantenpool aus
der in - vitro Random Mutagenese ohne Selektionierung als Grundlage ausreichte,
um den gewünschten EPI - resistenten Phänotypen zu erhalten. Mit der Ausplattierung wurden auf Eigenschaften aus dem Pool selektiert. Dass sich ohne groÿen
Unterschiede aus den selektionierten und nicht - selektioniertem Anzuchtverfahren
EPI - resistente Phänotypen ergeben haben, kann an der geringen Gröÿe des Mutantenpools liegen. Die Wahrscheinlichkeit von EPI - resistenten Phänotypen steigt
mit einem gröÿeren Pool. Statt einer Selektionierung sollte in Zukunft der Pool erweitert werden.
70
4.7 Ausblick
4.7 Ausblick
Antibiotikaresistenzen aufgrund von Euxpumpen sind weiterhin zunehmend ein
klinisches Problem, das deutlich macht wie wichtig die Weiterentwicklung von Antiinfektiva und EPIs sind. So stellt die Forschung zur Gewinnung von Informationen
über die Struktur und Wirkweisen von Euxpumpen ein wichtiges Gebiet dar.
In Bezug auf diese Arbeit sollten mehr Mutanten untersucht werden, so dass
sich eine höhere Anzahl mit signikanten Veränderungen ndet. Dafür sollte die
Mutantenbibliothek erweitert werden. Bei mehreren Mutanten mit einem ähnlichen
Phänotyp könnten Häufungen von Mutationen in bestimmten AcrB - Bereichen Hinweise auf mögliche Bindungsstellen von EPIs liefern. Weiterhin wiesen die Mutanten
meist mehrere Mutationen auf. Wurden die Mutationen zusammen als ausschlaggebend für den Phänotyp nach gewiesen, so könnten diese einzeln in das Genom
des Ausgangsstammes eingebracht werden, um ihre alleinige Auswirkung zu überprüfen. Jede Mutation müsste auf ihre Funktion zurück geführt werden, wie es hier
für F617S geschehen ist. Ein weiterer Ansatzpunkt wäre die Untersuchung der Mutationen auf ihre tertiären Strukturveränderungen hin für ein besseres Verständnis
über die Wirkung einer einzelnen Mutation. Zum Beispiel könnte anhand von Ko Kristallisationsstudien Novobiocin in Bindung mit 3AG100 - AcrB:F617S dargestellt
werden. Ein Ersatz eines Novobiocin - Euxassays zum Beispiel anhand einer radioaktiven Markierung von Novobiocin könnte mehr Aufschluss bringen.
Neben der Untersuchung von höheren Anzahlen von Mutanten, sollten auch die
phänotypischen Testungen vervollständigt und auf alle Mutanten erweitert werden.
So sollten die Pyroninassays zusammen mit EPIs durch geführt werden. Weiterhin sollte der Eux Assay mit allen zu untersuchenden Mutanten jeweils mit den
Farbstoen 1,2DNA und DASPEI durchgeführt werden. So wäre auch die Sequenzierung von LN - Mutanten, die von der niedriger konzentrierten Agarplatte mit
64 µg/ml Linezolid gepickt wurden, ein Ansatzpunkt in weiteren Versuchen. Denn
diese zeigten häug eine Sensitivität in den MHK - Testungen gegenüber Makroliden, die gesicherte RND - Pumpensubstrate darstellen [Chollet et al., 2004]. An den
fünf sequenzierten Mutanten dieser Arbeit ergaben sich keine Auälligkeiten in den
MHK - Daten mit Makroliden und somit keine Erkentnisse dazu.
71
4 Diskussion
In den vorliegenden Versuchen konzentrierten sich die Untersuchungen auf AcrB.
Letztendlich sind jedoch die Angrispunkte und Wirkweisen von EPIs noch nicht
hinreichend geklärt. So besitzen AcrA und TolC möglicherweise ebenfalls wichtige
Angrispunkte für EPIs. Es wurde gezeigt, dass die MP - Domäne von AcrA ein Nadelöhr in der Montage der dreiteiligen Pumpe darstellt und somit als Angrispunkt
für neue EPIs dienen könnte [Tikhonova et al., 2011]. So müssen in Zukunft die Untersuchungen eventuell auf TolC und AcrA oder sogar auf verschiedene LPS - Gene
erweitert werden.
72
5 Zusammenfassung
Erworbene oder intrinsische Antibiotikaresistenzen bilden ein zunehmendes Problem im
stationären wie im ambulanten Bereich und verursachen dem Gesundheitssystem hohe
Kosten. Neben der Degradierung von Antibiotika und der Veränderung ihrer Zielstrukturen ist ein Hauptmechanismus der Resistenzentwicklung eines Bakteriums die Expression
von Euxpumpen. Besonders Multi - Drug - Resistance (MDR) Euxpumpen stellen ein
groÿes Problem dar. Eines der am besten untersuchten Beispiele ist die AcrAB - TolC Pumpe in E. coli, die im Fokus dieser Arbeit steht. Zusammen mit der äuÿeren Membran als
Permeabilitätsbarriere stellt diese konstitutiv exprimierte und das Periplasma überspannende Pumpe einen entscheidenden Resistenzmechanismus in E. coli dar.
Ein Ziel dieser Arbeit ist es AcrB - Mutanten mit einem Euxpumpeninhibitor (EPI) resistenten Phänotyp zu nden. Der Begri EPI - Resistenz meint dabei die verminderte oder gar nicht vorhandene Wirkung einer MHK - Reduzierung von Antibiotika durch
die EPIs PABN und NMP aufgrund der Mutationen in AcrB. Die verwendeten E. coli
Bakterien stammen aus einer Bibliothek von Mutanten, deren AcrB einer in - vitro Random Mutagenese unterworfen wurden. Zusätzlich wurde der Groÿteil der Mutanten einer
Selektionierung mit einem EPI in Kombination mit einem Antibiotikum und somit einer
in - vivo Random Mutagenese zugeführt. Nach phänotypischen Testungen und Sequenzierung der Mutationen ist es ein zweites Ziel zu zeigen, dass die gefundenen Mutationen
ausschlaggebend waren für den EPI - resistenten Phänotyp. Dafür wurden diese in den
Ausgangsstamm 3AG100 eingefügt.
In der Betrachtung der Ergebnisse zeigten sich phänotypisch veränderte Mutanten in
Hinblick auf EPI - Resistenz und Substratspezität, womit das erste Ziel erfüllt wurde.
Nach der Rekonstitution der Mutationen in den Ausgangsstamm zeigte sich, dass die erzielten Eekte der Phänotypveränderung partiell auf die Mutationen in AcrB zurück zu
führen waren. Gröÿtenteils waren die Eigenschaften in einem geringeren Ausmaÿ nachweisbar, womit auch das zweite Ziel zum Teil erreicht wurde. Nebenbei zeigte sich, dass es
nicht sinnvoll war einen Selektionierungsschritt mit einem EPI in Kombination mit einem
Antibiotikum durch zu führen. Aufgrund der Selektionierung konnten an anderer Stelle
als in AcrB ebenfalls Mutationen entstehen, die ohne einen Eekt in AcrB einen EPI resistenten Phänotyp hervorbrachten, der somit nach der Rekonstitution der Mutationen
in AcrB nicht nachvollziehbar war. Es wurde ersichtlich, dass der Mutantenpool aus der
in - vitro Random Mutagenese ohne Selektionierung als Grundlage ausreichte, um EPI resistente Phänotypen zu erhalten. Die Wahrscheinlichkeit von EPI - resistenten Phänotypen steigt jedoch mit einem gröÿeren Pool. Statt einer Selektionierung sollte in Zukunft
der Pool erweitert werden.
Bei weiterführenden Arbeiten sollten eine höhere Anzahl von Mutanten untersucht werden, denn Häufungen von Mutationen in bestimmten AcrB - Bereichen könnten Hinweise
auf mögliche Bindungsstellen von EPIs liefern. Auch dafür sollte die Mutantenbibliothek
erweitert werden. Weiterhin könnten Kristallisationsstudien die tertiären Strukturveränderungen durch die Mutationen der Mutanten dieser Arbeit beleuchten. Letztendlich muss
auf dem Gebiet der Angrispunkte und Wirkweisen von EPIs in AcrB weitergehend geforscht werden, um klinisch einsetzbare EPIs zu erhalten.
73
5 Zusammenfassung
74
A Anhang
Abbildung A.1: Der Aminosäure - Code I. Aminosäuren mit hydrophoben Seitenketten [Krüger, 2009]
I
Abbildung A.2: Der Aminosäure - Code II. Aminosäuren mit ungeladenen, hydrophilen Seitenketten [Krüger, 2009]
Abbildung A.3: Der Aminosäure - Code III. Aminosäuren mit geladenen, hydrophilen Seitenketten: dunkelgrau hinterlegt: sauer, hellgrau hinterlegt: basisch [Krüger,
2009]
Liste der verwendeten Symbole
und Abkürzungen
1,2 DNA
1,2 Di - Napthyl - Amin
BAC
Bacterial Articial Chromosome
bp
Basen - Paare
CCCP
Carbonyl Cyanid m - Chloro Phenylhydrazon
DASPEI
2-4-Dimethyl Amino Styryl-N-ethyl-Pyridinium Iodid
dNTP
Desoxyribo - Nukleosid - Tri - Phosphate
EPI
Eux -Pumpen -Inhibitor
EtBr
Ethidium - Bromid
LB
Luria - Bertani Lösung nach Miller
LPS
Lipo -Poly -Saccharid
MDR
Multi Drug Resistance
MFP
Membran -Fusions -Protein
MHK
Minimale Hemm -Konzentration
NMP
1-Naphtyl - Methyl - Piperazin
OMP
Outer Membrane Protein
PABN
Phe - Arg -
PBS
Phosphate Buered Saline
B - Naphthylamid
III
PCR
Polymerase Chain Reaction
RFU
Relative Fluorescence Unit
RND
Resistance Nodulation Division
rpm
revolutions per minute; Umdrehungen pro Minute
SSRI
Selektiver -Serotonin -Reuptake -Inhibitor
TBE
Tris - Borat - EDTA-Puer
TE
Tris - EDTA-Puer
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