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Aus dem Department of Molecular and Cell Biology
University of California, Berkeley
und dem Institut für Pathologie
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Charakterisierung des deubiquitinierenden
Enzyms USP4
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Vorgelegt 2011
von Jakob Neubauer
geboren in Berlin
1
Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. mult. Hubert Blum
Erstgutachter: Prof. Dr. med. Martin Werner
Zweitgutachter: Prof. Dr. med. Ralph Wäsch
Jahr der Promotion: 2011
2
Inhaltsverzeichnis:
1. Einleitung
8
1.1. Ubiquitin
8
1.2. Ubiquitinierung
8
1.3. Deubiquitinierung
11
1.4. Spliceosom
15
1.5. Zellzyklus
16
1.6. Zielsetzung der Arbeit
20
2. Materialien
22
2.1. Geräte
22
2.2. Software
23
2.3. Chemikalien
23
2.4. Proteine
24
2.4.1. Proteine
24
2.4.2. Primärantikörper
25
2.4.3. Sekundärantikörper
25
2.5. DNA
25
2.6. Zellen
25
2.6.1. Bakterienstämme
25
2.6.2. Humane Zelllinien
25
2.6.3. Insektenzelllinien
25
2.7. Kits
25
2.8. Puffer
26
2.9. Verbrauchsmaterialien
27
3. Methoden
28
3.1. Molekularbiologische Methoden
28
3.1.1. Herstellung chemisch kompetenter E. coli
28
3.1.2. Transformation chemisch kompetenter E. coli
28
3.1.3. Plasmidpräparation
29
3.1.4. DNA Konzentrationsmessung
29
3
3.1.5. Polymerase Kettenreaktion
30
3.1.6. Mutations-PCR
31
3.1.7. Agarosegelelektrophorese
31
3.1.8. Sequenzierung
32
3.1.9. Klonieren
32
3.2. Proteinbiochemische Methoden
33
3.2.1. Natriumdodecylsulfat-PolyacrylamidGelelektrophorese (SDS-PAGE)
33
3.2.2. Coomassie-Färbung
34
3.2.3. Silberfärbung
35
3.2.4. Western Blot
35
3.2.5. Autoradiographie
36
3.2.6. Aufreinigung von MBP-markierten Proteinen aus
Bakterien
36
3.2.7. Aufreinigung von His6-markierten Proteinen aus
Bakterien
37
3.2.8. Expression und Aufreinigung von Proteinen aus
Insektenzellen
38
3.2.9. In vitro Transkription und Translation
39
3.2.10. Immunpräzipitation
39
3.2.11. Pulldown
39
3.2.12. Herstellung von Zelllysaten
40
3.2.13. Deubiquitinierungsassay
40
3.2.14. Ubiquitinierungsassay
41
3.2.15. Degradationsassay
41
3.2.16. Massenspektrometrie
41
3.3. Zellbiologische Methoden
42
3.3.1. Immunfluoreszenz
42
3.3.2. Proteinextraktion
42
3.3.3. Zellkultur
43
4. Ergebnisse
44
4.1. Bindungspartner von USP4
44
4.2. Katalytische Aktivität von USP4
52
4.3. Lokalisation von USP4
58
4
4.4. Degradation von USP4
62
5. Diskussion
64
5.1. Bindungspartner von USP4
64
5.2. Katalytische Aktivität von USP4
66
5.3. Funktionen von USP4 im Zellzyklus
67
5.4. Lokalisation von USP4
70
6. Zusammenfassung
72
7. Literaturverzeichnis
73
8. Danksagung
78
5
Abkürzungen
APC/C
anaphase promoting complex/cyclosome
APS
Ammoniumpersulfat
ATM
Ataxia teleangiectasia mutated protein
ATR
ATM und Rad3 related
BubR1
Budding uninhibited by benzimidazoles 1
Cdh
Cadherin
Cdc20
Cell-division cycle protein
Cdk
Cyclin dependent kinase
Chk
Check protein
CYLD
Cylindromatosis protein
ddH2O
Doppelt destilliertes H20
DMEM
Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DPBS
Dulbecco's phosphate buffered saline
DUB
Deubiquitinierendes Enzym
EDTA
Ethylenglykol-bis(aminoethylether)-N,N,N’N’-Tetraessigsäure
Emi1
Early mitotic inhibitor 1
FANCD2
Fanconi anemia, complementation group D2
FBS
fetales Rinderserum
HA
Hämagglutinin Anker
HeLa
Zervixcarzinomzelllinie der Patientin Henrietta Lacks
HEPES
N-(2-Hydroxyethyl)piperazin- N'-(2-ethansulfonsäure)
His6
Histidin (6 aufeinanderfolgende Histidine)
IP
Immunpräzipitation
IPTG
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid
JAMM
Jab1/MPN Domäne des Metalloenzymmotifs
kbp
Kilo Basen Paare
Mad2
Mitotic arrest deficient 2
MBP
Maltose bindendes Protein
MJD
Machado-Joseph Disease
mM
milli Mol
mRNA
Messenger RNA
6
NEM
N-Ethylmaleinimid
NF-κB
nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
OTU
Ovarian tumor Domäne
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
PRP3
Pre mRNA processing factor 3
PRP4
Pre mRNA processing factor 4
PRP4B
Pre mRNA processing factor 4 homolog B/ Serin-Threonin Kinase
Rb
Retinoblastom-Protein
RT
Raumtemperatur
SAP
Shrimp alkaline Phosphatase
SART3
Squamous cell carcinoma antigen recognized by T-cells 3
SDS
Natriumdodecylsulfat
siRNA
small interfering Ribonukleinsäure
snRNA
small nuclear Ribonukleinsäure
snRNP
small nuclear Ribonukleoprotein
TEMED
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine
TRIM21
Tripartite motiv containing 21
TRIS
2-Amino-2-(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol
UAF1
Usp1-associated factor 1
UBA
Ubiquitin associated
UbcH10
E2 Enzym
UCH
Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase
UIM
Ubiqutin interacting motif
USP4
Ubiquitin specific protease 4
WB
Western Blot
Wnt
Wingless integration site 1
7
1. Einleitung
Die Erforschung molekularbiologischer Mechanismen wie der Mitose oder der
Proteinbiosynthese hat einen entscheidenden Beitrag zum Verständnis der
Pathogenese vieler Erkrankungen geleistet. Dadurch konnte unter anderem in
der Onkologie die Therapie von Erkrankungen weiterentwickelt werden. Auch in
Bezug auf das Protein Ubiquitin wurden pathogenetisch relevante Daten gesammelt (Hershko & Ciechanover, 1998; Nakayama & Nakayama, 2006). So ist
Ubiquitin zum Beispiel ein wichtiger Regulator im Bereich der DNA-Reparatur,
die eine pathogenetische Bedeutung für die Fanconi Anämie und familliären
Brustkrebs hat (Kennedy & D'Andrea, 2005).
1.1. Ubiquitin
Ubiquitin ist ein Protein mit 76 Aminosäuren, das ubiquitär in allen eukaryoten
Zellen vorkommt. Nach seiner Entdeckung 1975 erkannte man in den frühen
1980er Jahren, dass die kovalente Verbindung von Ubiquitin mit anderen
Proteinen ein Proteolysesignal darstellt. Seither konnte in vielen Gebieten der
Molekularbiologie eine Bedeutung von Ubiquitin als Regulationssignal nachgewiesen werden.
1.2. Ubiquitinierung
Die kovalente Konjugation von Ubiquitin an Zielproteine wird als Ubiquitinierung
bezeichnet. Diese posttranslationelle Modifikation stellt für die Zelle ein Signal
dar, das bei Proteindegradation, Zellzyklusregulation, DNA-Reparatur, Endozytose oder Signalkaskaden eine wichtige Rolle spielt. Ubiquitinierung kann die
Stabilität, Funktion und Lokalisation eines anderen Proteins verändern. Der Vorgang der Ubiquitinierung beinhaltet mehrere nacheinander geschaltete enzymatische Reaktionen (Abb 1-1 A). Mindestens drei Enzymklassen sind an der
Katalyse beteiligt: Ein Ubiquitin aktivierendes Enzym E1, ein Ubiquitin konjugierendes Enzym E2 und eine Ubiquitinligase E3 (Hershko & Ciechanover, 1998;
8
Hicke, 2001). Fakultativ können auch Kettenelongationsfaktoren (E4) an der
Synthese beteiligt sein. Das humane Genom kodiert für zwei Ubiquitin-spezifische E1-, 38 E2- (Ye & Rape, 2009) und etwa 600 bis1000 E3-Enzyme (Jin et
al, 2008).
Zuerst kommt es zu einer Aktivierung des freien Ubiquitins durch das E1-Enzym.
In einer ATP-abhängigen Reaktion wird ein Thioester zwischen dem Cterminalen Glycin des Ubiquitins und dem aktiven Cystein des E1 gebildet.
Dadurch wird die Aminosäure für einen nukleophilen Angriff präpariert. Im
zweiten Schritt wird das derart aktivierte Ubiquitin auf das Cystein des aktiven
Zentrums eines E2-Enzyms übertragen. E1 ist in den Zellen geringer konzentriert
als alle E2-Enzyme zusammen. Da die Aktivierungsreaktion im Vergleich zur
Ubiquitinierung der Substrate schneller abläuft, ist die Verfügbarkeit von
aktiviertem Ubiquitin trotzdem gesichert. Das für beladenes E1 hochaffine E2Enzym kann nach Aufnahme von Ubiquitin mit mehreren unterschiedlichen E3Ligasen in einer Kaskade reagieren. Mit Hilfe der E3-Ligase kommt es dann zur
kovalenten Übertragung des Ubiquitins auf das Substratprotein (Pickart, 2001).
Der Mechanismus der Übertragung von Ubiquitin unterscheidet sich bei den
einzelnen E3-Klassen (Hochstrasser, 2006). Die E3-Ligasen mit einer RingFinger-Domäne stellen lediglich den Kontakt zwischen E2 und dem Substrat her
(Vander Kooi et al, 2006), was den Wechsel des Ubiquitins vom E2 direkt auf das
Zielprotein zur Folge hat. Bei Ligasen mit einer HECT-Domäne hingegen wird
das Ubiquitin auf ein in der Sequenz konserviertes Cystein übertragen und von
dort aus weitergegeben. In den meisten Fällen wird das Ubiquitin mit seinem Cterminalen Glycin auf die ε-Aminogruppe eines Lysins im Substrat übertragen
(Kerscher et al, 2006).
9
Abbildung 1-1: Schematische Darstellung der Ubiquitinierung: A. Ubiquitin (Ubi) wird unter
Verbrauch von ATP durch das E1-Enzym aktiviert und auf ein E2-Enzym übertragen. Mit Hilfe
von Ring-E3-Ligasen erfolgt dann die Übertragung des Ubiqutins auf das Substrat (S). E2Enzyme können das Ubi auch auf HECT-E3-Ligasen übertragen, die dann die Übertragung auf
das Substrat vornehmen.
E3-Ligasen katalysieren die Bindung des Substrates über bestimmte
Erkennungssignale, sogenannte Degrons, und vermitteln so die Substratspezifität. Degrons stellen Aminosäureabfolgen in den Polypeptidsequenzen der
Substrate dar. Beispiele dafür sind D-Box, KEN-Box und TEK-Box, die ein
Degron für die E3-Ligase APC/C darstellen (Jin et al, 2008; Pfleger & Kirschner,
2000). Degrons können durch Phosphorylierung entstehen oder maskiert werden
(Hershko & Ciechanover, 1998).
Bei der Ubiquitinierung wird das Substrat entweder mit einem oder mehreren
Ubiquitinmoleküle verbunden. Werden mehrere übertragen, so kann dies durch
Monoubiquitinierung verschiedener Orte des Substrats oder durch Konjugation
von Ubiquitinketten erfolgen (Hochstrasser, 2006). Die Monoubiquitinierung spielt
eine Rolle bei der Ubiquitinierung von Histonen und damit auch bei der
Regulation der Transkription (Hicke, 2001). Monoubiquitinierung ist für viele
membranständige Proteine ein Signal zur Endozytose (Mosesson et al, 2008)
und reguliert die DNA-Reparatur, was der entscheidende pathogenetische Faktor
bei der Fanconi Anämie und dem familiären Brustkrebs ist (Kennedy & D'Andrea,
2005).
10
Das Ubiquitinmolekül besitzt in der eigenen Polypeptidsequenz sieben Lysine
(K), die potentiell zur Bildung von Ketten genutzt werden können. Dadurch
entstehen Ubiquitinketten unterschiedlicher Konformation. In Hefe konnten alle
Verbindungen in vivo nachgewiesen werden (Peng et al, 2003). In humanen
Zellen wurde diese Vielfalt bis jetzt nicht beobachtet. Hier vermitteln über K48
verbundene Ketten mit einer Länge von mindestens vier Ubiquitinen den Abbau
des jeweiligen Proteins durch das Proteasom (Thrower et al, 2000). Auch K11Ketten, übertragen durch die E3-Ligase APC/C, führen zur Degradation der
Substrate (Jin et al, 2008). K63 verbundene Ketten hingegen haben eine
Bedeutung in der Vermittlung von Bindungspartnern (Adhikary et al, 2005).
Ubiquitinketten können nach der Anheftung an das Substrat durch weitere
Proteine verändert und so verlängert werden. In der Zelle existieren
Kettenelongationsfaktoren, die auch als E4 bezeichnet werden. Diese Enzyme
besitzen oft eine U-Box-Domäne, die eine strukturelle Ähnlichkeit zur RingFinger-Domäne aufweist. Es ist also vorstellbar, dass E4-Kettenelongationsfaktoren mit E3-Enzymen wie E3-Enzyme mit E2-Enzymen funktionieren und so
lange Ubiquitinketten katalysieren können (Hochstrasser, 2006).
Ubiquitinierung bedeutet die kovalente Bindung von Ubiquitin an andere Proteine
und wird durch ein komplexes System von Enzymen katalysiert. Das übertragene
Ubiquitin stellt ein Signal dar, das Einfluss auf den Abbau oder auch auf
Bindungspartner des ubiquitinierten Proteins hat. Ubiquitinierung ist damit ein
Werkzeug der Zelle, um wichtige zelluläre Prozesse zu regulieren.
1.3. Deubiquinierung
Neben der Verknüpfung von Ubiquitin und Proteinen über die oben beschriebene
Proteinkaskade gibt es auch Enzyme, die an Proteine gebundenes Ubiquitin
abspalten können. Diese deubiquitinierenden Enzyme (DUBs) sind Proteasen
und katalysieren die Spaltung der Isopeptidbindung zwischen Ubiquitin und
dessen Substrat (Abb. 1-2 A.). Die Reaktion wird als Deubiquitinierung
bezeichnet.
11
Ubiquitin wird in den Zellen als lineares Polyubiquitin oder in Verbindung mit
einem ribosomalen Protein (Proubiquitine) translatiert. DUBs spalten das
Polymer und das Konstrukt und generieren auf diese Weise überhaupt erst das
frei verfügbare Ubiquitinmonomer. Sie regulieren den zellulären Pool an freiem
Ubiquitin ebenfalls durch Spaltung von freien Ubiquitinketten und von unspezifischen Ubiquitinverbindung mit kleinen zellulären Nukleophilen (Reyes-Turcu et
al, 2009).
Eine weitere Funktion von DUBs ist es, durch katalytische Spaltung konjugierter
Ketten oder Monomere eine Ubiquitinierung von Zielproteinen rückgängig zu
machen. Auf diese Weise können sie z.B. die Degradation von Proteinen durch
das Proteasom verhindern. Im menschlichen Genom finden sich Gene für
ungefähr 100 DUBs (Nijman et al, 2005). Die unterschiedlichen Enzyme lassen
sich nach der Ähnlichkeit ihrer katalytischen Domänen in fünf Gruppen einteilen,
wobei vier Gruppen Papain-ähnliche Cystein-Proteasen sind: Es gibt vier Ubiqitin
C-terminale Hydrolasen (UCH), 58 Ubiquitin spezifische Proteasen (USP), 14
ovarian tumor domain (OTU) und fünf Josephin domain (MJD) DUBs. Die fünfte
Gruppe beinhaltet 14 Metalloproteasen mit einer Zink komplexierenden Domäne,
die auch als JAMM-Domäne bezeichnet wird (Nijman et al, 2005).
Die meisten deubiquitinierenden Enzyme besitzen einen negativ geladenen
Bereich in ihrer katalytischen Domäne, um den C-terminalen Teil des Ubiquitin zu
binden. Auch weisen viele DUBs weitere Ubiquitin bindende Bereiche auf (UBA;
UIM), die eine Erklärung für die unterschiedliche Spezifität der Enzyme auf
verschiedene Ubiquitinketten bieten können. Die Bindung von Ubiquitin an das
DUB hat in jedem Fall eine Ummodellierung der Proteinstruktur zur Folge,
wodurch das DUB erst seine katalytische Aktivität erhält (Hu et al, 2002).
12
Abbildung 1-2: Schematische Darstellung der Deubiquitinierung: A. Das ubiquitinierte
Substrat (S) wird an das DUB oft über ein Adaptorprotein (z.B. UAF1) gebunden. Das DUB
spaltet Ubiquitin (Ubi) von dem Substrat ab und entlässt die beiden Bindungspartner.
Die große Anzahl der DUBs macht eine hohe Substratspezifität der Enzyme
wahrscheinlich. Diese wird zum einen durch die Ubiquitinbindung (s.o.) aber
auch durch die Erkennung von Teilen des ubiquitinbeladenen Substrats
sichergestellt. Darüber hinaus sind DUBs oft erst im Komplex mit anderen
Proteinen aktiv, die auch zur Substratbindung beitragen (Ventii & Wilkinson,
2008). Dies trifft z.B. auf USP1 zu, das erst UAF1 (USP1 associated factor 1)
binden muss, um FANCD2 zu deubiquitinieren und so in den DNA Reparatur
Signalweg der Fanconi Anämie eingreifen zu können (Cohn et al, 2007).
Posttranslationelle Modifikationen wie die Phosphorylierung, Sumoylierung und
Ubiquitinierung können die Aktivität der DUBs regulieren. Dies ist z.B. der Fall bei
USP34, das nach ionisierender Bestrahlung von Zellen durch ATM (Ataxia
teleangiectatica mutated) phosphoryliert wird und so an der Regulation des G1Arrests beteiligt ist (Mu et al, 2007). Nicht selten binden DUBs auch E3-Ligasen
und regulieren sich gegenseitig (Song & Rape, 2008). Auch USP4 bindet das E3Enzym TRIM21, das auch als Sjörgren Syndrom Antigen A/ SSA/ Ro52 bekannt
ist, und deubiquitiniert es. Daneben wird USP4 durch TRIM21 ubiquitiniert. Die
beiden Enzyme regulieren so gegenseitig ihren Ubiquitinierungsstatus (Wada &
Kamitani, 2006; Wada et al, 2006).
13
Die Deubiquitinierung stellt also wie auch die Ubiquitinierung eine komplex
gesteuerte Reaktion dar. Diese Reaktion greift in viele zelluläre Prozesse ein.
Das beinhaltet unter anderem Proteintransport, Kinaseaktivierung, Proteindegradation, DNA Reparatur und Regulation des Zellzyklus (Song & Rape,
2008). Interessant ist auch, dass Mikroorganismen Gene für DUBs besitzen. Da
Prokaryoten über das Ubiquitin-System aber nicht verfügen, könnten diese DUBs
folglich eine Bedeutung als Pathogenitätsfaktoren haben (Chen et al, 2009; Le
Negrate et al, 2008).
Mutationen und Veränderungen im Expressionsmuster von DUBs konnten im
Rahmen von mehreren Krankheiten beobachtet werden. So wurden in dem DUB
UCHL1 Mutationen nachgewiesen, die entweder für Morbus Parkinson
prädestinieren oder gegen diesen protektiv wirken. Eine Überexpression von
USP6 durch Translokationen mit Vorschaltung fremder Promotoren konnte in
aneurysmatischen Knochenzysten und selten auch in Sarkomen (Ewing Sarkom,
Osteoblastom, Myofibrom) nachgewiesen werden (Singhal et al, 2008).
Mutationen des Tumorsuppressors CYLD, der als DUB den NF-κB Signalweg
inhibiert, führen zum Krankheitsbild der familiäre Zylindromatose. Die Patienten
entwickeln multiple Hauttumoren an Kopf und Hals (Stegmeier et al, 2007).
Auch USP4 besitzt onkogene Eigenschaften. Überexpression von USP4 bewirkte
eine tumorigene Transformation von NIH3T3-Zellen (Gupta et al, 1994). Sein
Expressionsmuster in Tumoren weist auf eine Rolle von USP4 bei der
Tumorentstehung hin. Daten zu drei Tumorentitäten liegen vor: In Adenokarzinomen der Lunge und Nebenniere konnte eine erhöhte Expression von
USP4 nachgewiesen werden (Gray et al, 1995; Velazquez-Fernandez et al,
2005). Für kleinzellige Bronchialkarzinome ist die Publikationslage widersprüchlich. Eine Arbeitsgruppe berichtet über erhöhte mRNA Expression von
USP4 in Gewebeproben aus kleinzelligen Bronchialkarzinomen (Gray et al,
1995). Dagegen wurde von anderer Seite eine erniedrigte Konzentration von
USP4-mRNA und Protein in Zelllinien des kleinzelligen Bronchialkarzinoms
festgestellt (Frederick et al, 1998).
14
Es gibt Daten, dass USP4 an Proteine aus der Retinoblastom-Proteinfamilie
bindet (Blanchette et al, 2001). Bis jetzt konnte jedoch keine funktionelle
Relevanz dieser Bindung nachgewiesen werden. In einer weiteren Publikation
wurde USP4 als Spieler im Wnt Signalweg identifiziert (Zhao et al, 2009).
Auf der Suche nach relevanten Bindungspartnern konnten in USP4-PulldownVersuchen mit HeLa Micha Zellextrakten die Proteine SART3 und PRP3
detektiert werden. Beide Proteine binden an das Spliceosom und sind wichtig für
korrektes Splicing (Trede et al, 2007; Wang et al, 1997). SART3 hat darüber
hinaus eine Funktion als Recyclingfaktor der snRNPs (small nuclear
ribonucleoprotein) U4/U6 (Damianov et al, 2004; Trede et al, 2007). Die Bindung
des deubiquitinierenden Enzyms USP4 an Komponenten des Spliceosoms ist
sehr interessant, da es Daten gibt, nach denen Ubiquitin für den Aufbau des
Spliceosoms wichtig ist (Bellare et al, 2008).
1.4. Spliceosom
Die meisten Vorläufer-Transkripte in eukaryoten Zellen enthalten Introns
(intervening sequences) und Exons (expressed sequences), wobei nur Exons die
Grundlage für die Translation durch das Ribosom darstellen. Die VorläuferTranskripte werden im Zellkern modifiziert, was unter anderem das Anhängen
eines 5´-Cap, eines poly-A-Schwanzes und das Entfernen der Introns durch
Splicing beinhaltet (Epstein, 2003).
Splicing wird im Zellkern durch einen großen Komplex aus snRNAs (small
nuclear RNAs) und deren assoziierte Proteine, small nuclear Ribonucleoprotein
particles (snRNPs), durchgeführt. Dieser Komplex aus fünf snRNPs wird als
Spliceosom bezeichnet. Die Interaktionen zwischen snRNPs untereinander und
zwischen snRNPs und Introns sind komplex und verändern sich im Verlauf des
Splicingprozesses. Diese dynamischen Veränderungen, die vor allem
redundante und multiple Intron-Erkennungsereignisse beinhalten, werden durch
RNA-abhängige ATPasen ermöglicht (Brow, 2002).
15
Splicing wird eingeleitet durch die Bindung des U1-snRNP an das konservierte
5´-Ende des Introns. U2-snRNP bindet im Intron an die weiter 3´-liegende
Verzweigungsstelle, welche ein Adenosinnukleotid beinhaltet (branch point
recognition). Erst danach werden auch U4/U6-U5 snRNPs hinzugefügt, wobei U4
und U6 über Basenpaarung fest aneinander gebunden sind. Nun folgt die
Umformung des inaktiven Komplexes in den aktiven Komplex, welcher den
ersten Phosphoryl-Transfer auf das Adenosinnukleotid in der Verzweigungsstelle
katalysiert. Danach kommt es zur Trennung von U4 und U6 snRNPs, wobei U6snRNP das U1-snRNP vom 5´-Ende verdrängt und den zweiten PhosphorylTransfer vermittelt. Danach fällt das Spliceosom auseinander, und die so
entstandene mRNA wird entlassen. Das Intron bleibt in Lassogestalt zurück
(Epstein, 2003; Wahl et al, 2009).
Die geordnete Umformung der einzelnen Komponenten des Spliceosomes
während des Splicings ist komplex und wird hauptsächlich von den Interaktionen
zwischen den snRNA assoziierten Proteinen angetrieben. Die Steuerung dieser
Interaktionen erfolgt auch durch Phosphorylierung, Azetylierung und Ubiquitinierung (Bellare et al, 2008; Wahl et al, 2009).
Die Bedeutung des Splicings für die Herstellung von translationsfähigen
Transkripten macht auch seine Rolle bei der Zellzykluskontrolle deutlich. Wie das
Ubiquitin-System z.B. für den Abbau von Cyclinen von Bedeutung ist, so ist
Splicing für die Produktion von Cyclinen essentiell. Damit ist es ein Mechanismus, der den reibungslosen Ablauf des Zellzyklus gewährleistet.
1.5. Zellzyklus
Zellen entstehen durch Zellteilung. Für diesen Vorgang vollzieht die Zelle eine
streng geordnete Reihe von Prozessen, welche die Verdopplung ihrer Bestandteile und die anschließende Teilung in zwei Tochterzellen zur Folge hat. Die
wichtigste Aufgabe des Zellzyklus ist die Weitergabe der genetischen Information
an die nächste Zellgeneration. Um die genetische Identität bei der mitotischen
16
Teilung zu gewährleisten, muss die DNA der Zellen möglichst fehlerlos dupliziert
und verteilt werden.
Der Zellzyklus wird in vier Phasen eingeteilt (Abb. 1-3 A). Die Zelle befindet sich
nach der Zellteilung in der G1-Phase (Gap1). Von dort aus kann sie in einen
Ruhezustand übergehen, der als G0-Phase bezeichnet wird. Alternativ tritt sie in
die S-Phase (Synthese) ein, in welcher die Verdopplung der Chromosomen
erfolgt. Zwölf Stunden benötigt die Säugerzelle für die S-Phase. Dann folgt die
G2-Phase, nach der letztendlich die M-Phase (Mitose) eintritt. Hier vollzieht sich
die Verteilung der Chromosomen auf die Tochterzellen und die Teilung des
Zytoplasmas, die auch als Zytokinese bezeichnet wird. Für die Mitose benötigt
die Zelle ungefähr eine Stunde.
Abbildung 1-3: Schematische Darstellung des Zellzyklus: A. Eine Zelle durchläuft den Zyklus
von der G1-Phase (Gap) über die S-Phase (Synthese) und die G2-Phase (Gap) bis zur M-Phase
(Mitose). Dabei passiert sie mehrere Check- und Restriktionspunkte, die einen geordneten Ablauf
des Zellzyklus gewährleisten.
Die M-Phase lässt sich in mehrere Abschnitte einteilen: Während der Prophase
kommt es zur Kondensation der Chromosomen, die mit ihren SchwesterChromatiden über Cohesin-Komplexe verbunden sind. Die Kernmembran löst
sich in der Prometaphase auf, und die Chromatiden werden an ihren Kinetochoren mit dem Spindelapparat verbunden. In der Metaphase werden die
Schwester-Chromatiden jeweils von Mikrotubuli gegenüberliegender Zentromere
17
des bipolaren Spindelapparates gebunden und in der Äquatorialebene angeordnet. Nach der Spaltung einer Cohesin-Untereinheit in der Anaphase kommt es
zur Trennung der Schwesterchromatiden, die zu entgegengesetzten Spindelpolen gezogen werden. In der Telophase vollzieht sich dann die Zytokinese und
die Bildung zweier neuer Zellkerne.
Für die Produktion ihrer Proteine und Organellen benötigen die Zellen weitere
Zeit. Dafür existieren im Zellzyklus die G1-Phase zwischen M- und S-Phase und
die G2-Phase zwischen S- und M-Phase. Die G1-, S- und G2-Phasen werden
zusammen auch als Interphase bezeichnet und der Mitose als Phase der Zellteilung gegenübergestellt.
Der komplexe Ablauf des Zellzyklus wird streng reguliert. Dies geschieht
hauptsächlich durch Kontroll-Hürden, sogenannte Check- und Restriktionspunkte. Der erste Restriktionspunkt befindet sich am Ende der G1-Phase und ist
für die Initiierung der Chromosomenverdopplung verantwortlich. Nur wenn die
intra- und extrazellulären Bedingungen es zulassen, wird der Start für die
Zellteilung freigegeben. Dafür wird das Rb-Protein hyperphosphoryliert und gibt
dadurch E2F aus seiner Bindung frei. E2F wirkt als Transkriptionsfaktor und führt
zur Expression von Proteinen wie cyclinE und cyclinA, die für den Eintritt in die SPhase nötig sind.
Vom Beginn der S-Phase bis zum G2/M-Checkpunkt erfolgt die Regulation des
Zellzyklus auch durch Cyclin-abhängige Kinasen (Cyclin dependent kinases
[Cdks]), die während des Zellzyklus konstant exprimiert werden. Ihre Aktivität
oszilliert während des Zellzyklus jedoch stark, da Cdks nur aktiv sind, wenn sie
an Cycline gebunden vorliegen. Cycline sind Proteine, die während jedes
Zellzyklus zu bestimmten Zeitpunkten synthetisiert und proteasomal degradiert
werden. So kommt es zur zyklischen Änderung der Phosphorylierung von
Proteinen, die wichtige Ereignisse des Zellzyklus regulieren (Alberts B., 2008;
Malumbres & Barbacid, 2009).
Zusätzlich gibt es im Zellzyklus Checkpunkte, die sensitiv auf DNA-Schäden
reagieren. Diese befinden sich am Ende der G1-Phase (G1/S-Checkpunkt), in
18
der S-Phase (Intra-S-Checkpunkt) und am Übergang von G2- zu M-Phase
(G2/M-Checkpunkt). DNA-Schäden verursachen die Bindung und Phosphorylierung von ATM und ATR, deren nachgeschaltete Signalkaskaden unter
anderem über Chk1 einen Zellzyklusarrest verursachen (Seiler et al, 2007).
Ein weiterer Checkpunkt befindet sich in der Mitose zwischen Meta- und
Anaphase. Hier wird die Trennung der Chromatiden durch den Spindelcheckpunkt inhibiert, solange nicht alle Chromosomen über ihre Kinetochore mit
Mikrotubuli verbunden sind. Die Regulation des Checkpunktes ist komplex: Die
Proteine BubR1, Mad2 und Bub3 werden ab der Prometaphase an den
Kinetochoren aktiviert und halten die Ring-Finger E3-Ligase Cdc20-APC/C
(anaphase promoting complex or cyclosome) in einer inaktiven Konfiguration
(Herzog et al, 2009). Erst wenn auch das letzte Kinetochore durch Mikrotubuli
gebunden ist und eine Spannung zwischen den Spindelpolen aufgebaut werden
kann, wird der Checkpunkt abgeschaltet und Cdc20-APC/C im Gegenzug
aktiviert (Logarinho & Bousbaa, 2008).
Cdc20-APC/C katalysiert die Ubiquitinierung und damit den proteasomalen
Abbau von Securin, einem Inhibitor der Separase. Die Separase spaltet
daraufhin Cohesin, das die Schwester-Chromatiden verbindet, und ermöglicht so
die Trennung der Chromatiden und deren Verteilung auf zwei Tochterzellen.
APC/C führt auch zum Abbau mitotischer Cycline (cyclinB), wodurch der Zellzyklus mit Aufbau der Kernmembran, Dekondensation der Chromosomen, Zytokinese und Zerfall der Spindel fortgeführt und die M-Phase abgeschlossen wird
(Cleveland et al, 2003). Dysregulation des Spindelcheckpunktes hat die genomische Instabilität der Zellen zur Folge (Engelbert et al, 2008; Wasch &
Engelbert, 2005).
Um katalytisch aktiv zu sein und seine Substrate zu erkennen, benötigt APC/C
die Cofaktoren Cdc20 oder Cdh1. APC/C kann immer nur einen der beiden
Cofaktoren binden, was im Zellzyklus streng reguliert wird. Eine Phosphorylierung von APC/C durch Cdk1 führt zur Bindung von Cdc20. Andererseits wird
die Bindung von Cdh1 an APC/C durch Phosphorylierung mit Cdk2-cyclinA
verhindert. Durch Dephosphorylierung zerfällt Cdc20-APC/C in der späten M19
Phase, und Cdc20 wird durch Cdh1-APC/C abgebaut. So ist Cdc20-APC/C in der
frühen M-Phase und Cdh1-APC/C in der späten M-Phase und der G1-Phase
aktiv (Meyer, 2008). Eine Hemmung von Cdh1-APC/C am Ende der G1-Phase
erfolgt dann wieder durch Phosphorylierung von Cdh1. Dies wird über cyclinA
vermittelt, das als Substrat des Cdh1-APC/C durch Anwesenheit des APC/C
Inhibitors Emi1 und der Degradation eines mit APC/C interagierenden E2
UbcH10 akkumulieren kann (Reimann et al, 2001).
1.6. Zielsetzung der Arbeit
Ausgehend von der Idee, dass es DUBs geben könnte, welche den
Spindelcheckpunkt regulieren, führte Michael Rape ein siRNA-screen gegen alle
humanen DUBs durch. Der Screen wurde in HeLa-Zellen (Zervixkarzinom)
ausgeführt, die mit dem Inhibitor des Mikrotubiliabbaus Paclitaxel, dem Inbibitor
der Mibrotubulipolymerisation Nocodazol oder dem Kinesininhibitor Monastrol
behandelt wurden. Auf diese Weise wurde der Aufbau des Spindelapparates
gestört und der Spindelcheckpunkt aktiviert. Man erwartet einen Arrest der Zellen
in der Metaphase. Fällt nun durch siRNA ein wichtiger Regulator des Spindelcheckpunktes weg, so ist davon auszugehen, dass die Zellen trotz Inhibition der
Mikrotubuli in die Interphase übertreten, was als Spindelcheckpunkt-Bypass
bezeichnet wird. Für die siRNA gegen USP4 konnte ein solcher Bypass
beobachtet werden.
Es war also wahrscheinlich, dass USP4 in die Regulation des Spindelcheckpunktes eingreift. Wir wollten herausfinden, auf welche Art und Weise USP4 auf
den Zellzyklus Einfluss nimmt. Dafür interessierten uns die Bindungspartner von
USP4. Mit SART3 und PRP3 hatten wir zwei interessante Kandidaten gefunden.
Wir wollten die genauen Bindungsverhältnisse untersuchen und nach weiteren
Partnern suchen.
Der nächste wichtige Punkt war die deubiquitinierende Aktivität von USP4. Unser
Ziel war es, die Aktivität von USP4 in vitro nachzuweisen und zu analysieren.
Uns interessierte, ob USP4 seine Aktivität autark oder nur unter Bindung von
20
weiteren Partnern erlangt. Wir wollten auch wissen, ob USP4 eine Präferenz für
Ubiquitinketten einer bestimmten Lysinverbindung hat.
Als entscheidend für das Verständnis der Regulation des Spindelcheckpunktes
durch USP4 schien es uns, Substrate von USP4 zu finden. Die im Pulldown
entdeckten Bindungspartner SART3 und PRP3 waren hierfür erste Anhaltspunkte. Weiter interessierte uns die Lokalisation von USP4 in der Zelle. In der
Literatur gab es kontroverse Daten. Wir wollten verstehen, welche Faktoren
Einfluss auf die Lokalisation von USP4 nehmen.
Von der Untersuchung dieser Fragen erhofften wir uns Aufschlüsse über die
regulatorische Rolle von USP4 im Zellzyklus und über seine mögliche Bedeutung
für die Tumorentstehung.
21
2. Materialien
2.1. Geräte
Autoklav
Blotkammer
Eismaschine
Filmentwickler
Consolidate Ind. MK2
Mini Trans-Blot cell
Stills and Sterilizers
Biorad
Hoshizaki
Konica SRX-101
Diagnostic Imaging
Inc.
Fluoreszensmikroskop
MZ FL 2
Leica
Geltrockner
Model 583
Biorad
Heizblock
Thermomixer
Eppendorf
Inkubator
NAPCO 8000 DH
Thermo Electron
Corp.
Inverses Mikroskop
Invertoskop 40 C
Zeiss
Kondensator
Model 494
Isco
TM
Power Pac HC
Biorad
Magnetrührer
Fisher Stirrer
Fisher Scientific
PCR- Maschienen
PTC-200
MJ-Research
TM
MyCycler
Biorad
pH-Meter
SevenEasy
Mettler Toledo
Rotator
Mini Rotator
Glas-Col
Scanner
Epson Perfection V700 Epson
Schwenker
Orbital Shaker
Bellco Biotech.
Rocker BioModell 110A Denville Scientific Inc.
SDS-Gelelektrophoresekammer Vertical unit
R. Shadel Inc.
Mini Protean 2
Biorad
Spektrometer
Untraspec 3
Pharmacia
Nanodrop
Thermo Scientific
Sterile Zellkulturbank
Logic
Labconco
Storage-Phosphor-Scanner
Typhoon 9400
Molecular Dynamics
Storage-Phosphor-Screen
PhosphorImager
Biorad
Ultraschall
Modell W185D
Ultrasonic
TM
Vakuummaschine
HydroTech
Biorad
Waage
Mettler P1200
VWR
AB104
Mettler Toledo
Wasseraufbereiter
Milli Q Synthesis A10
Millipore
Wasserbad
Isotemp 220/202
Fisher Scientific
Zentrifuge
5415C/ 5417C/ 5415R Eppendorf
Sorvall Legend Micro
Thermo Scientific
21R
RC-3B
Sorvall Instruments
22
2.2. Software:
DNA Absorptionsmessung
Datenbanken
Sequenzvergleich
Bildbearbeitung
Textverarbeitung
Nanodrop Software
Pubmed (www.pubmed.com)
BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)
ClustalW2 (www.ebi.ac.uk/clustalw)
Adobe Photoshop 7.0.1
Adobe Illustrator 10.0.3
ImageJ
Microsoft Word X for Mac
2.3. Chemikalien
Acrylamide (Ultra Pure Proto Gel)
National Diagnostics
Adenosintriphosphat
Agar
Agarose (Low-EEO/MultiPurpose/Molecular Biology Grade)
Ampicillin
Amylose Resin
APS
Borsäure
Calciumchlorid
Cellfectin
Chemilumineszens Luminol
Chloramphenicol
Coomassie Brilliant Blue R-250
DMEM
DMSO
DTT
dNTPs
DPBS
Essigsäure
Ethanol
Ethidiumbromid
EDTA
FBS
FBS Tetrazyklin depletiert
Glycerol
Glycin
Hefeextrakt
HEPES
Imidazol
IPTG
Isopropanol
Kaliumacetat
Kaliumchlorid
Kaliumhydrogenphosphat
Sigma
Fisher Scientific
Fisher Scientific
Fisher Scientific
NEB
EMD Chemicals
EMD Chemicals
Fisher Scientific
Invitrogen
Immobilon
Fisher Scientific
Pierce Biotechnology
Gibco
Sigma
Invitrogen
NEB
Gibco
Fisher Scientific
Gold Shield Chemical Corp.
Fisher Scientific
Fisher Scientific
HyClone
HyClone
Fisher Scientific
MP Biomedicals
EMD Chemicals
Fisher Scientific
Fisher Scientific
Apex
Fisher Scientific
Fisher Scientific
Fisher Scientific
Fisher Scientific
23
Kanamycin
Magnesiumchlorid
Maganchlorid
Methanol
Milchpulver
Natriumchlorid
Natriumhydrogenphosphat
Natriumhydroxid
Nickel-Nitrilotriacetat-Agarose
Nocodazol
Ponceau S
Precision Plus Protein Standard
Protease Inhibitor (Pallets)
Rubidiumchlorid
S35-Methionin
SDS
Thymidin
Triton X-100
Trypsin/EDTA 0,5%
Trypton
Shrimp alkalische Phospatase
TEMED
TRIS
Tween 20
Fisher Scientific
EMD Chemicals
Sigma
Ficher Scientific
Nestle
Fisher Scientific
Fisher Scientific
Fisher Scientific
Qiagen
Sigma
Sigma
Biorad
Roche
Alfa Aesar
MP Biomedicals
Fisher Scientific
Sigma
Fisher Scientific
Gibco
BD
USB Corp.
Biorad
Fisher Scientific
Fisher Scientific
2.4. Proteine
2.4.1. Proteine allgemein
His
APC10
AscI
DpnI
His
E1 (aus Insektenzellen)
FseI
His
Importin alpha C-terminal
Lysozym
NotI
PfuUltra™ High Fidelity DNA Polymerase
His
p31
SalI
SAP
Taq-Polymerase
T4-Ligase
His
UbcH5c
Ubiquitin
XbaI
XhoI
24
Michael Rape, UC Berkeley
NEB
NEB
Adam Williamson, UC Berkeley
NEB
Ling Song, UC Berkeley
Sigma
NEB
Stratagene/ Agilent
Ling Song, UC Berkeley
NEB
VWR Scientific
Fisher Scientific
NEB
Hermann-Josef Meyer, UC Berkeley
Boston Biochem
Roche
NEB
2.4.2. Primärantikörper
Kaninchen polyklonal Anti-myc (NEQKLISEEDL-C)
Maus monoklonal Anti-HA
Maus monoklonal Anti-Ubiquitin FL
Santa Cruz
Roche
Santa Cruz
2.4.3. Sekundärantikörper
Ziege anti Maus mit Peroxidase
Ziege anti Kaninchen mit Peroxidase
Ziege anti Maus mit Alexa488
Ziege anti Kaninchen mit Cy3
Sigma
Amersham
Molecular Probes
Molecular Probes
2.5. DNA
1kb-DNA-ladder
Oligonucleotide
Invitrogen
Operon
2.6. Zellen
2.6.1. Bakterienstämme
DH5alpha
XL1-blue
BL21
Rosetta
2.6.2. Humane Zelllinien
HeLa Micha
HeLa S3
U2OS host cell line
2.6.3. Insektenzelllinien
SF9
2.7. Kits
TNT SP6 Quick Coupled Transcription/ Translation System Promega
QIAGEN Miniprep Kit Qiagen
QIAGEN Midiprep Kit Qiagen
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen
Flp-InTM T-RExTM Core Kit Invitrogen
25
2.8. Puffer
LB-Medium
10g Typton
5g yeast extract
10 g NaCl
in 1 l ddH2O
TBF1
70 mM KAc
100 mM RbCl2
10 mM CaCl2
50 mM MnCl2
15% Glycerol
pH 6,5
TBF2
10 mM MOPS
75 mM CaCl2
10 mM RbCl2
15% Glycerol
pH 6,5
Isolationslösung 1
15 mM Tris
10 mM EDTA
100 ng/ml RNase A
pH 8,0
Isolationslösung 2
0,2 N NaOH
1% SDS
10x TBE
108 g Tris
55 g Borsäure
40 ml 500 mM EDTA
1l ddH2O
pH 8,0
5x Ladepuffer
TBE Puffer
20% Glycerol
0,01% Bromphenolblau
2x SDS-Ladepuffer
62,5 mM Tris pH 6,8
2% SDS
25% Glycerol
0,01% Bromphenolblau
5% beta-Mercaptoethanol
SDS-Laufpuffer
25 mM Tris
193 mM Glycin
0,1% SDS
Transferpuffer
25 mM Tris
193 mM Glycin
20% Methanol
26
2.9. Verbrauchsmaterialien
Blotpapier
Dialysekammern
Film
Kulturschalen
Nitrocellulosemembran
Proteinaufreinigungssäulen
Schreibwaren
Biorad
Thermo Scientific
Kodak
Greiner
GE
Biorad
Barker Hall Storeroom
27
3. Methoden
3.1. Molekularbiologische Methoden
3.1.1. Herstellung chemisch kompetenter E. coli
Die Aufnahme von freier DNA durch E. coli wird als Transformation bezeichnet.
Für diese Transformation werden Bakterien benötigt, die in der Lage sind, DNA
in größerem Ausmaß aus ihrer Umgebung aufzunehmen. Solche Bakterien
werden als kompetent bezeichnet.
Die Herstellung kompetenter Bakterien erfolgte mit einer Übernachtkultur des
jeweiligen Stammes. Danach wurden 1,5 l LB-Medium (1% Trypton, 0,5% yeast
extract, 1% NaCl) angeimpft und bis zu einer OD600 von 0,4 bis 0,6 bei 37ºC mit
180 U/min geschwenkt. Die Suspension wurde 5 min auf Eis gelagert und 10 min
bei 4000 U/min und 4ºC zentrifugiert. Das Pellet wurde in TBF1-Puffer (70 mM
KAc, 100 mM RbCl2, 10 mM CaCl2, 50 mM MnCl2, 15% Glycerol, pH 6,5)
resuspendiert und 90 min auf Eis inkubiert. Danach wurde 5 min bei 4000 U/min
und 4ºC zentrifugiert, und die Bakterien wurden in TBF2-Puffer (10 mM MOPS,
75 mM CaCl2, 10 mM RbCl2, 15% Glycerol, pH 6,5) aufgenommen. Aliquots
wurden mit flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80ºC gelagert.
3.1.2. Transformation chemisch kompetenter E. coli
Die Übertragung freier DNA auf kompetente Bakterien erfolgte mit Hilfe eines
Hitzeschocks (Hanahan, 1983). 25 µl Bakteriensuspension und 1 µl PlasmidDNA wurden zuerst 30 min bei 4ºC, anschließend 1 min bei 42ºC und dann 5 min
auf Eis inkubiert. Danach wurden 250 µl LB-Medium dazugegeben und die Probe
2 Stunden in dem 37ºC Wasserbad gelagert. Die Suspension konnte mit
autoklavierten Glaskugeln auf selektivem Nährboden (1% Typton, 0,5% yeast
extract, 1% NaCl, 1,5% Agar mit unterschiedlichen Antibiotika in folgenden
Konzentrationen: 100 µg/ml Ampicillin, 25 µl/mg Kanamycin, 34 µg/ml
28
Chloramphenicol) ausplattiert oder für das Animpfen von Flüssigkulturen genutzt
werden.
3.1.3. Plasmidpräparation
Mit dem QIAGEN Miniprep Kit und dem QIAGEN Midiprep Kit wurden Plasmide
<10 kbp aus Übernachtkulturen transformierter Bakterien aufgereinigt. Dabei
wurden zelluläre Bestandteile und bakterielle DNA ausgefällt und die PlasmidDNA auf Anionenaustauschersäulen gegeben. Wegen der Phosphatgruppen
bindet hier die DNA, kann gereinigt und eluiert werden. Die Aufreinigung fand
gemäß Herstellervorgaben statt.
Für die Aufreinigung größerer Plasmide >10 kbp wurde das Zellpellett von 5 ml
Übernachtkultur transformierter Bakterien in 1 ml Isolationslösung 1 (15 mM Tris,
10 mM EDTA, 100 ng/ml RNase A, pH 8,0) aufgenommen und gevortext.
Danach wurde 1 ml Isolationslösung 2 (0,2 N NaOH, 1% SDS) dazu gegeben, 5
min bei RT inkubiert und schließlich 250 µl 3 M KAc (pH 5,5) ergänzt. Die Probe
wurde 10 min auf Eis gelagert, 10 min bei 14000 U/min zentrifugiert, und der
Überstand mit 750 µl Isopropanol gemischt. Eine erneute Zentrifugation (10 min
bei 14000 U/min) wurde durchgeführt, der Überstand durch 500 µl Ethanol
ausgetauscht und ein letztes Mal zentrifugiert (10 min bei 14000 U/min). Der
Alkohol wurde abgenommen, und das Pellet getrocknet. Die Auflösung erfolgte in
EB-Buffer der QIAGEN Kits.
3.1.4. DNA Konzentrationsmessung
Die Konzentration von DNA in wässriger Lösung wurde durch Lichtabsorption bei
einer Wellelänge von 260 nm an dem Gerät Nanodrop durchgeführt. Nach dem
Lambert Beer Gesetz lässt sich mit dem Absorptionskoeffizienten e so die
Konzentration von DNA in der jeweiligen Flüssigkeit errechnen. Die Errechnung
erfolgte durch die zugehörige Software.
29
3.1.5. Polymerase Kettenreaktion
Die Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction = PCR) ist eine
Methode zur exponentiellen Vervielfältigung von DNA-Fragmenten durch eine
Polymerase. Für die Reaktion benötigt das Enzym Oligonukleotide, welche spezifisch an die Anfangs- und komplementäre Endsequenz des Fragments binden.
Die Oligonukleotide werden als Primer bezeichnet und bilden den jeweiligen
Anfang der zu synthetisierenden Sequenz. Die Amplifikation erfordert drei verschiedene Schritte. Bei der
1) Denaturierung wird die doppelsträngige DNA durch Erhitzen in Einzelstränge getrennt, so dass die Primer beim
2) Annealing das DNA-template binden können und so die
3) Elongation der Sequenz katalysiert werden kann.
Dieser Zyklus wird wiederholt und hat die exponentielle Amplifikation der von den
Primern umschlossenen Sequenz zu Folge.
Bei dem Design der Primer wurden folgende Kriterien beachtet:
-
mehr als 18 bp lang
-
T Annealing [=2x(A/T)+4x(G/C)-4] zwischen 57ºC und 60ºC
-
GC-Anteil der Sequenz über 40%
Danach wurde den Primern am 5´-Ende die Erkennungssequenz des jeweils
gewünschten Restriktionsenzyms angehängt.
Die Reaktionen wurden in 50 µl Ansätzen mit dem Pfu-Puffer (Stratagene)
durchgeführt. Wir nahmen 100 ng Ausgangsplasmid und ergänzten dieses mit
Desoxynukleotidmix (0,5 mM) und Primern (0,5 µM). Der Reaktion wurden
zeitweise auch DMSO (10%) und BSA (0,1 mg/ml Endkonzentration im Mix)
zugegeben. Nach Hinzufügen von 5 U Pfu-Ultra-Polymerase wurde die Reaktion
in einer PCR-Maschine gestartet. In bestimmten Fällen wurde Pfu-UltraPolymerase durch die Taq-Polymerase ergänzt.
Die Denaturierung wurde initial 1 min und bei jedem folgenden Zyklus 30 s bei
94ºC durchgeführt. Dann folgte das Annealing 30 s bei 48-58ºC abhängig von
dem jeweiligen Primerpaar. Die Elongation wurde 1 min pro 1 kbp bei 68ºC
30
durchgeführt. Nach 25 Zyklen wurde auf 4ºC abgekühlt und das Amplifikationsprodukt mit Gelelektrophorese analysiert.
3.1.6. Mutations-PCR
Das Einbringen von spezifischen Mutationen in ein kloniertes Gen wurde mit
Primern durchgeführt, welche diese Mutation enthielten und bei der PCR als
Ausgangspunkt für die Amplifikation des gesamten Plasmides genutzt wurden.
Für das Primerdesign wurde auf folgende Punkte geachtet:
-
Anzahl (n) der bp 25-45
-
GC-Gehalt von über 40%
-
3´-Ende auf C oder G
-
Tm [=81,5+0,41x(%G/C)–(675/n)-%mismatch] über 78ºC
Der 20 µl PCR-Mix in Pfu-Puffer setzte sich aus 50 ng Ausgangsplasmid, 0,5 mM
Desoxynukleotidmix, 0,25 µM Primer und 5 U Pfu-Ultra-Polymerase zusammen.
Nach 2 min Denaturierung bei 94ºC wurden 20 PCR-Zyklen durchgeführt von
jeweils 30 s bei 94ºC, 30 s bei 50-55ºC (abhängig von den jeweiligen Primern)
und 1 min pro 1 kbp bei 68ºC. Anschließend wurden die PCR-Produkte 90 min
bei 37ºC mit 20 U Dpn1 inkubiert, um die Ausgangsplasmide zu verdauen. 25 µl
kompetente XL1-blue E. coli wurden mit 5 µl PCR-Produkt transformiert und auf
selektivem Nährboden ausplattiert. Aus hier gewachsenen Kolonien wurden die
Plasmide extrahiert und mittels Sequenzierung auf die gewünschte Mutation hin
überprüft.
3.1.7. Agarosegelelektrophorese
Zur Trennung von in der Größe differierenden DNA-Fragmenten wurde die
Elektrophorese in dem Galactosepolymer Agarose durchgeführt. Durch die
negative Ladung der Phosphordiester-Zucker-Kette wandert die DNA in einem
angelegten elektrischen Feld durch die Trennmatrix. Dabei wandern kleinere
31
Fragmente schneller als größere, wodurch eine Auftrennung der Größe nach
erfolgt.
Agarose wurde in 0,5 bis 1,5 Gewichtprozent in 1x TBE-Puffer (10x TBE-Puffer:
108 g Tris, 55 g Borsäure, 40 ml 500 mM EDTA, 1 l ddH2O, pH 8,0) aufgelöst
und in einer Mikrowelle aufgekocht. Danach wurde 0,5 µg/ml Ethidiumbromid
hinzugegeben und abgekühlt. Die DNA wurde 5:1 mit dem 5x Ladepuffer (1x
TBE-Puffer, 20% Glycerol, 0,01% Bromphenolblau) gemischt und in die
Geltaschen pipettiert. Für die Elektrophorese wurde Gleichstrom mit 100-150 V
(8 V / cm Elektrodenabstand) angelegt. Die Analyse erfolgte unter Ultraviolettlicht
der Wellenlänge 366 nm, welches das an die DNA bindende Ethidiumbromid
sichtbar macht. Die Extraktion von DNA aus dem Gel erfolgte mit dem QIAquick
Gel Extraction Kit nach den Angaben des Herstellers.
3.1.8. Sequenzierung
Plasmid-DNA wurde durch die University of California Berkeley DNA Sequencing
Facility 303 Barker Hall (http://mcb.berkeley.edu/barker/dnaseq/index.html)
sequenziert. Die Proben wurden mit 0,5 µg DNA und 3,2 pmol Primer in 13 µl
Gesamtvolumen angesetzt. Als Primer wurden unter anderem für den SP6
Promoter: 5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' und für den T7 Promoter: 5'TAATACGACTCACTATAGGG-3' verwendet.
3.1.9. Klonieren
Um ein DNA-Fragment in einen Vektor einzusetzen, wurde mit Restriktionsverdau und Ligation gearbeitet. Die Technik wird als Klonieren bezeichnet.
Restriktionsendonukleasen schneiden DNA spezifisch an den für das jeweilige
Enzym charakteristischen, meist palindromischen Sequenzen. Plasmid-DNA und
PCR-Produkte wurden im Rahmen der für die jeweiligen Enzyme vom Hersteller
empfohlenen Bedingungen verdaut. Danach erfolgte entweder eine Gelelektro32
phorese plus Gelextraktion oder einfach nur eine PCR-Aufreinigung. Für die
PCR-Aufreinigung wurde das QIAquick Gel Extraction Kit verwendet. Die
Religation linearisierter Vektor-DNA wurde durch Dephosphorylierung bei 90 min
und 37ºC mit SAP verhindert.
Die Ligation oder Verbindung von Insert und Vektor wurde durch Inkubation mit
der Ligase des Bakteriophagen T4 durchgeführt. Unter ATP-Verbrauch katalysiert das Enzym die Phosphordiesterverbindung zwischen der 3´OH-Gruppe des
Zuckers und der 5´OH-Gruppe des Phosphatendes. Dabei wurden Vektor und
Insert in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 bis 1:5 eingesetzt und
zwischen 3 Stunden und bis über Nacht bei RT mit T4-Ligase inkubiert. 3 µl des
Ansatzes wurden zur Transformation von 25 µl DH5alpha-Bakterien verwendet.
Der Selektion auf Agar folgte die Kultivierung in LB-Medium und die Extraktion
der Plasmid-DNA. Die Plasmide wurden verdaut und bei erwartetem Bandenmuster in der Gelelektrophorese sequenziert.
3.2. Proteinbiochemische Methoden
3.2.1. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
PAGE trennt Moleküle abhängig von deren Ladung und molarer Masse im
Trennmedium Polyacrylamid auf. SDS-PAGE wird verwendet, um Proteine nur
ihrer molaren Masse nach aufzutrennen. Dabei werden Sekundär- und Tertiärstruktur der Proteine durch Anlagerung von SDS und Spaltung der Thioesterund Disulfidgruppen mit beta-Mercaptoethanol zerstört. Durch die stark negative
Ladung der im Überschuss zugegebenen SDS-Moleküle wird die Eigenladung
der Proteine irrelevant in Bezug auf Wandereigenschaften in einem elektrischen
Feld. So erfolgt die Auftrennung allein aufgrund der unterschiedlichen molaren
Masse der jeweiligen Proteine. Diese kann mit Hilfe von Markern abgeschätzt
werden.
Die Polyacrylamidgele wurden in eindimensionalen Minigel- oder Maxigelformaten der Firma Biorad hergestellt. Die Polymerisation erfolgte zwischen
Acrylamid und N,N´-Methylenbisacrylamid unter Zugabe des Radikalstarters
33
Ammoniumpersulfat und des Elektronenüberträgers TEMED. Mit einer
Acrylamidkonzentration von 8-15% wurde zuerst das Trenngel gegossen, dessen
glatte Überfläche durch Überspritzen mit Ethanol sichergestellt wurde. Darüber
wurde das Sammelgel infundiert und mit einem Gelkamm modelliert. Beispiele
für die Zusammensetzung von Trenngel und Sammelgel sind:
Trenngel 8%
Sammelgel
ddH2O
6,9 ml
3,4 ml
30% Acrylamidmix
4,0 ml
0,83 ml
1,5 M Tris
3,8 ml (pH 8,8)
0,63 ml (pH 6,8)
10% SDS
0,15 ml
0,05ml
10% APS
0,15 ml
0,05 ml
TEMED
0,009
0,05 ml
Die Proteinproben wurden 1:1 mit 2x SDS-Ladepuffer (62,5 mM Tris pH 6,8, 2%
SDS, 25% Glycerol, 0,01% Bromphenolblau, 5% beta-Mercaptoethanol)
vermischt, 5 min bei 95ºC inkubiert und in die Geltaschen pipettiert. Die
Elektrophorese wurde bei 100 V (Mini) beziehungsweise 300 V (Maxi) mit SDSLaufpuffer (25 mM Tris, 193 mM Glycin, 0,1% SDS) durchgeführt.
3.2.2. Coomassie-Färbung
Zum Nachweis von Proteinen wurde das SDS-Gel 2 Stunden in 0,05%
Coomassie Blue Stain (0,5 g Coomassie Blue R250, 250 ml Isopropanol, 100 ml
Essigsäure, mit ddH2O auf 1 l) geschwenkt und anschließend in 10% Essigsäure
bis zum gewünschten Grad entfärbt. Coomassie Blue detektiert unspezifisch alle
Proteine.
34
3.2.3. Silberfärbung
Zuerst wurde das Gel 10 min in SF-Lösung 1 (40 ml Methanol, 13,5 ml
Formaldehyd, 46,5 ml ddH2O) fixiert. Danach wurde es zweimal 5 min in ddH2O
gewaschen. Anschließend wurde es 1 min in SF-Lösung 2 (0,02 g Na2S2O3, 100
ml ddH2O) inkubiert, um danach 20 s mit ddH2O abgespült zu werden. Die
Färbung erfolgte 10 min in der SF-Lösung 3 (0,1 g Silbernitrat, 100 ml ddH2O),
die Entwicklung bis zum gewünschten Färbegrad in der SF-Lösung 4 (3 g
Na2CO3, 50 µl Formaldehyd, 2 ml SF Lösung 2, 98 ml ddH2. Die Reaktion wurde
mit kristalliner Zitronensäure gestoppt.
3.2.4. Western Blot
Die in dem Gel durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteine wurden mit einem
elektrischen Feld auf Nitrocellulose- oder PVDF-Membran transferiert. Der
Nachweis erfolgte über selektive Primärantikörper und Peroxidase gekoppelte
Sekundärantikörper.
Der Transfer wurde im Nasstankverfahren bei Kühlung auf 4ºC im Eisbad mit
Transferpuffer (25 mM Tris, 193 mM Glycin, 20% Methanol) durchgeführt. PVDFMembranen wurden 1 min in reinem Methanol präinkubiert. Der Aufbau von der
Anode zur Kathode erfolgte auf diese Art:
Schwamm – 2 Whatman Papiere – Membran – Gel – 2 Whatman Papiere
– Schwamm.
Über 2 Stunden wurde eine Spannung von 70V angelegt.
Zur Kontrolle der erfolgreichen Übertragung der Proteine auf die Membran wurde
eine Färbung mit Ponceau S über wenige Minuten durchgeführt. Anschließend
wurde mit ddH2O entfärbt. Für die Detektion mittels Immunoblot wurden die
Membranen zuerst mit 5% Milchpulver TBS/T (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM
NaCl, 2 mM KCL, 0,05% TritonX100) für eine Stunde geblockt und dann bei 4ºC
über Nacht mit dem in 5% Milchpulver TBS/T verdünntem Primärantikörper
inkubiert. Nach Waschen mit TBS/T wurde der Sekundärantikörper bei RT für 90
min hinzugegeben. Die Membran wurde noch einmal gewaschen und die
35
Chemilumineszenz-Reaktion wurde mit Luminol durchgeführt. Luminol wird an
der Peroxidase des Sekundärantikörpers zum Luminolperoxid umgewandelt, das
beim Zerfall durch Film detektierbares Licht absondert.
Für die Detektion von Ubiquitin wurden die Membranen nach dem Transfer
zwischen Whatman Papier in ddH2O gelagert und autoklaviert. Dies erfolgte 30
min im Flüssig-Modus und danach 15 min im Trocken-Modus. Die Blockierung
der Membran und die Verdünnung der Antikörper erfolgten in 20% FBS TBS/T.
3.2.5. Autoradiographie
Gele mit 35S-markierten Proteinen wurden über Nacht in Fixierlösung (20%
Ethanol, 6% Essigsäure) geschwenkt. Nach dem Trocknen der Gele 2 Stunden
bei 76ºC unter Vakuum wurden diese einem Storage-Phosphor-Image-Screen
exponiert. Die radioaktive Strahlung regte lokal die Metallsalze des Screens an.
Eine Stimulation mit niederenergetischem Licht der Wellenlänge 600 nm führte
zur Emission der Energie in Form von Licht, welches mit einem Typhoon-Gerät
detektiert werden konnte.
3.2.6. Aufreinigung von MBP-markierten Proteinen aus Bakterien
Zuerst klonierten wir Gene in pMAL, was eine n-terminale Markierung der
resultierenden Proteine mit dem 42 kDa großen Maltose bindenden Protein zur
Folge hatte. Wir transformierten E. coli der Stämme Rosetta (DE3) oder BL-21
mit den klonierten Konstrukten für eine selektive Übernachtkultur.
1,5-6 l LB-Medium wurden mit dieser Kultur angeimpft und bis zum Erreichen
einer OD600 von 0,4-0,6 bei RT oder 37ºC geschüttelt. 0,5 mM IPTG wurde
dazugegeben und die Kultur über Nacht bei RT inkubiert.
Die Zellen wurden 20 min bei 4000 U/min und 4ºC zentrifugiert und mit PBS
gewaschen. Nach erneutem zehnminütigen Zentrifugieren wurde 12,5 bis 50 ml
36
Lyse-Puffer (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,2 mg/ml Lysozym)
hinzugegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Mit Ultraschall wurden die Bakterien
lysiert und anschließend 30 min bei 10000 U/min und 4ºC zentrifugiert. Der Überstand wurde auf mit 0,5-2 ml MBP-Puffer (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl)
gewaschenen Amylose-Resin gegeben und zusammen 3 Stunden bei 4ºC rotiert.
Anschließend wurde 1 min bei 1000 U/min und 4ºC zentrifugiert, zweimal mit
Waschpuffer 1 (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 0,01% TritonX
100) gewaschen, die Suspension in eine Säule übertragen und mit Waschpuffer
2 (20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT) übergossen. Die Elution der an
Agarose gebundenen Proteine wurde in 0,5 ml Schritten mit dem Elutionspuffer
(20 mM Tris pH 7,5, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 10 mM Maltose) durchgeführt.
Die Proteinkonzentration der einzelnen Proben wurde mittels Bradford-Reagenz
und SDS-PAGE mit nachfolgender Coomassie-Färbung abgeschätzt. Gepoolte
Dialyse wurde über Nacht bei 4ºC gegen 2 mM DTT PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM
KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 pH7,4) durchgeführt.
3.2.7. Aufreinigung von His6-markierten Proteinen aus Bakterien
Zur Aufreinigung wurden die Gene der Proteine in pET28 und pETduet kloniert,
was eine n-terminale Markierung mit sechs Histidin Aminosäuren zur Folge hatte.
Wir transformierten E.coli der Stämme Rosetta (DE3) oder BL-21 mit den
klonierten Konstrukten für eine selektive Übernachtkultur.
1,5-6 l LB-Medium wurde mit dieser Kultur angeimpft und bis zum Erreichen
einer OD600 von 0,4-0,6 bei RT oder 37ºC geschüttelt. 0,5mM IPTG wurde
dazugegeben und die Kultur über Nacht bei RT inkubiert.
Die Zellen wurden 20 min bei 4000 U/min und 4ºC zentrifugiert und mit PBS
gewaschen. Nach erneutem zehnminütigen Zentrifugieren wurde 12,5 bis 50 ml
Lyse-Puffer (50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 0,2 mg/ml
Lysozym, pH 8,0) hinzugegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Nach der Lyse der
Zellen mit Ultraschall wurde der Suspension TritonX 100 auf 0,01% (v/v)
hinzugefügt. Anschließend wurde 30 min bei 10000 U/min und 4ºC zentrifugiert.
37
Der Überstand wurde auf 1-4 ml Ni-NTA Agarose pipettiert und zusammen 3
Stunden bei 4ºC rotiert.
Anschließend wurde 2 min bei 2000 U/min und 4ºC zentrifugiert, zweimal mit
Lysepuffer mit 0,01% TritonX 100 gewaschen, die Suspension in eine Säule
gegossen und erneut mit Lysepuffer ohne Triton übergossen. Die Elution erfolgte
in 0,5 ml Schritten in 1,5 ml Tubes die jeweils mit 1 µl 1M DTT versehen worden
waren (Elutionspuffer: 50 mM NaH2PO4, 500 mM NaCl, 200 mM Imidazol). Die
Proteinkonzentration der einzelnen Proben wurde mittels Bradford-Reagenz und
SDS-PAGE mit nachfolgender Coomassie-Färbung abgeschätzt. Gepoolte
Dialyse wurde über Nacht bei 4ºC gegen 2mM DTT PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM
KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4 pH 7,4) durchgeführt.
3.2.8. Expression und Aufreinigung von Proteinen aus Insektenzellen
Um Proteine in eukaryoten Zellen zu exprimieren und danach aufzureinigen,
wurden Insektenzellen mit Baculoviren infiziert, wobei die Viren die genetische
Information für das jeweils entsprechende Gen trugen.
Zuerst wurde die cDNA des Proteins in den Vektor pFastBac kloniert, was eine
Kombination mit His6- und Flag-Tags zur Folge hatte. Mit dem Konstrukt wurden
E. coli vom Stamm DH10Bac transformiert. In den Zellen fand die Einfügung des
Vektors in eine 135 kbp Bacmid DNA statt, die wiederum für die Transfektion von
SF9 Insektenzellen mit Cellfectin verwendet wurde. Die Bacmid DNA enthielt die
Information für ein Baculovirus, das nach Transfektion in den Insektenzellen
hergestellt wurde und mit der darauf folgenden Lyse der jeweiligen Zelle in das
Nährmedium abgegeben wurde. So wurden alle weiteren Insektenzellen mit dem
infektiösen Überstand der transfizierten Kultur 4-6 Tage inkubiert.
Nach 5 min Zentrifugation bei 1500 U/min wurden die Zellen mit PBS (137 mM
NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) gewaschen und mit
dem doppelten Eigenvolumen Lysepuffer (20 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1%
NP40) übergossen. Anschließend wurden sie 20 Mal in einem Glaszylinder
gestampft und 15 min bei 10000 U/min und 4ºC zentrifugiert. Der Überstand
wurde auf mit PBS gewaschene Ni-NTA-Agarose gegeben und nach Zugabe der
gleichen Menge Waschpuffer (50 mM NaPO4, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol) 3
38
Stunden bei 4ºC inkubiert. Danach wurde die Agarose dreimal mit Waschpuffer
gewaschen und auf eine Säule gegeben. Die Elution erfolgte mit Elutionspuffer
(50 mM NaPO4, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazol) in 500 µl Schritten. Gepoolte
Dialyse erfolgte über Nacht bei 4ºC gegen 2 mM DTT PBS.
3.2.9. In vitro Transkription und Translation
Das TNT SP6 Quick Coupled Transcription/ Translation System enthält neben
Retikulozytenlysat auch noch eine RNA-Polymerase, einen Ribonukleaseinhibitor
und alle Aminosäuren bis auf Methionin. Die Zugabe von
35
S-Methionin zu dem
Reaktionsmix macht die Produktion von radioaktiv markierten Proteinen möglich.
Dazu wurden 4 µl 35S-Methionin (10 mCi/ml) und 21 µl TNT Quick Master Mix mit
2,5 µg DNA in Form von pCS2 Vektoren mit SP6 Promotoren zusammen
pipettiert und 90 min bei 30ºC inkubiert.
3.2.10. Immunpräzipitation
Um bestimmte Proteine aus Proteingemischen oder Zellextrakten aufzureinigen,
wurden auch Antikörper benutzt. Die Zellen wurden gesammelt und in IP-Puffer
(50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 5 mM KCl, 0.1% Tween
20, 2 mM DTT, Protease Inhibitor Cocktail von Roche) lysiert. Die Lysate wurden
mit myc-Agarose (SantaCruz), Flag-Agarose (Sigma) oder HA-Matrix (Roche) 4
Stunden bei 4ºC inkubiert. Danach wurden die Körnchen gewaschen, eluiert oder
in weiteren Assays verwendet.
3.2.11. Pulldown
Die Bindung von Proteinen in vitro wurde mit Pulldown-Versuchen untersucht.
MBP- oder His6-markierte Proteine wurden mit 20 µl Körner (Amylose Resin
bzw. Ni-NTA-Agarose) und 300 µl MBP Bindungspuffer (20 mM HEPES pH 7,5,
5 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% Tween20, 1x BSA, 45 mM NaCl) bzw. His39
Bindungspuffer (20 mM HEPES pH7,5, 5 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1%
Tween20, 1x BSA, 45 mM NaCl, 5 mM Imidazol) 2 Stunden bei 4ºC rotiert.
Danach wurde der Überstand abgesaugt und mit SB (20 mM HEPES pH 7,5, 5
mM KCl, 1,5 mM MgCl2) gewaschen. Nach erneuter zweistündiger Inkubation der
beladenen Körner auf dem Rotator in MBP Bindungspuffer mit einem weiteren
Protein wurde erneut mit SB gewaschen und mit 2xSDS-Ladepuffer eluiert. Als
Negativkontrolle diente für MBP-Versuche solitäres MBP und für die HisVersuche His6-markiertes APC10. Die Analyse erfolgte über SDS-PAGE und
weitere Nachweisverfahren für Proteine (s.o.).
3.2.12. Herstellung von Zelllysaten
HeLa S3 Zellen wurden in Drehinkubatoren kultiviert und unter Einfluss von
Thymidin (24 Stunden) und Nocodazol (12 Stunden) in der Prometaphase
synchronisiert. Für G1-Extrakte wurden die Zellen ohne Nocodazol vier weitere
Stunden kultiviert. Die Zellen wurden in Lysepuffer (20 mM HEPES pH 7,5, 5 mM
KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1,3 mM ATP, 15 mM Kreatinphosphat, 1
Tablette Protease Inhibitor auf 10 ml) zweimal schockgefroren, wieder aufgetaut
und anschließend zehnmal durch eine Nadel der Stärke 25 G 5/8 gepresst. Nach
Zentrifugation wurde der Überstand aliquotiert und bei –80ºC eingefroren
(Williamson et al, 2009).
3.2.13. Deubiquitinierungsassay
Für die Untersuchung der deubiquitinierenden Eigenschaften von USP4 verwendeten wir aus Insektenzellen aufgereinigtes His6-USP4 und aus E. coli
(Rosetta) gewonnenes His6-USP4. Als Substrate standen verschiedene Ubiquitinketten und zuvor ubiquitinierte Proteine zur Verfügung.
Die Reaktionen erfolgten unter Zugabe von 1,3 mM ATP, 10 mM DTT in UBABPuffer (25 mM Tris, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2). Für die Negativkontrolle wurde
NEM (N-Ethylmaleimid) verwendet, welches die Cysteinprotease USP4 inhibiert.
40
Die Auswertung wurde durch anti-Ubiquitin Western Blot oder Autoradiographie
vorgenommen.
3.2.14. Ubiquitinierungsassay
In 1,3 mM ATP, 1 mg/ml Ubiquitin, 10 mM DTT UBAB-Puffer (25 mM Tris, 50 mM
NaCl, 10 mM MgCl2) wurde unter Zugabe von
His
E1 (aus Insektenzellen),
unterschiedlichen E2s (aus E. coli) und E3s die Ubiquitinierung von in vitro
hergestellten Substraten bei 30ºC untersucht.
3.2.15. Degradationsassay
Mitotische Zellextrakte wurden mit UbcH10 und p31 versetzt und mit radioaktiv
gelabelten Proteinen inkubiert. Die Reaktion wurde für jedes Protein bei 0 min,
nach 120 min und nach 120 min unter Hinzufügung von Emi1 und Securin gestoppt. Die Analyse erfolgte über SDS-Gelelektrophorese und Autoradiographie.
3.2.16. Massenspektrometrie
Proteingemische wurden von unserem Labor auf Eis gelagert an das University
of California Berkeley Proteomics and Mass Spectrometry Laboratory
(http://qb3.berkeley.edu/pmsl/home.htm) ausgehändigt. Dort wurden die Proben
verdaut und massenspektrometrisch analysiert.
3.3. Zellbiologische Methoden
3.3.1. Immunfluoreszenz
Die auf Glasträgern (zuvor 30 min im Trockenmodus autoklaviert) bis zu 80%
Konfluenz kultivierten HeLa Micha Zellen wurden mit TBS (50 mM Tris, pH 7,4,
41
150 mM NaCl, 2 mM KCl) gewaschen. Nach der 20 minütigen Behandlung mit
dem Fixierpuffer (890 µl TBS, 10 µl 10% TritonX 100, 100 µl Fomaldehyd [37%])
wurden die Zellen erneut mit TBS gewaschen und 10 min mit dem
Permeabilitätspuffer (960 µl Abdil, 40 µl 10% TritonX 100) inkubiert. Danach
wurden sie 30 min mit Abdil (TBS, 2% BSA) blockiert und 2 Stunden mit 1:100
Primärantikörper (anti-myc oder anti-HA) in Abdil benetzt. Es folgte fünfmaliges
Waschen mit Abdil und erneute Inkubation mit 1:150 Sekundärantikörper (Ziegeanti-Maus oder Ziege-anti-Kaninchen) in Abdil. Schließlich wurde dreimal in Abdil
gewaschen, 10 min mit Dapi (5 µl DAPI in 1 ml Abdil) inkubiert, zweimal mit TBS
gewaschen und der Objekträger fixiert. Die Objektträger wurden auf dem
Mikroskop Olympus IX71 mit einem 63-fach vergrößernden Öl-Objektiv mikroskopiert. Es wurden auf jedem Objektträger mindestens 3 unabhängige areale
analysiert. Repräsentative Bereiche wurden abgelichtet.
3.3.2. Proteinextraktion
Die Zellen eines Wells mit 3 cm Durchmesser wurden mit 0,5 ml 1xTrypsin von
der Kulturschale abgelöst und mit 0,5 ml Medium in 1,5 ml Behältern 5 min bei
5000 U/min zentrifugiert. Es wurde mit PBS gewaschen und danach 50 µl
2xSDS-Ladepuffer (62,5 mM Tris pH 6,8, 2% SDS, 25% Glycerol, 0,01%
Bromphenolblau, 5% beta-Mercaptoethanol) hinzugegeben. Nach 10 min
Inkubation bei 95ºC wurde 1 min bei 13000 U/min zentrifugiert und der
Überstand abpipettiert.
3.3.3. Zellkultur
HeLa Micha Zellen wurden in DMEM mit 10% FBS ohne Antibiotoka kultiviert.
Transfektionen wurden mit TransIT-LT1 nach Herstellerangaben durchgeführt.
Mit dem Flp-InTM T-RExTM Core Kit der Firma Invitrogen wurden mit vorhandenen
U2OS host cells stabil transfizierte und durch Tetracyclin induzierbar
exprimierende U2OS stable cell lines hergestellt. U2OS host cells wurden in
DMEM mit 10% Tetracyclin depletiertem FBS und den Antibiotika Zeocin und
42
Blasticidin kultiviert. U2OS stable cell lines wurden in DMEM mit 10% Tetracyclin
depletiertem FBS und den Antibiotika Hygromycin B und Blasticidin kultiviert. Die
Expression wurde mit 0,2 ng/µl Doxycyclin induziert.
43
4. Ergebnisse
4.1. Bindungspartner von USP4
Um mehr über die Funktion von USP4 in der Zellzyklusregulation zu erfahren,
wollten wir Proteine finden, die mit USP4 interagieren. Dafür hatte Eun Joo Song
ein N-terminal mit MBP markiertes ∆297-963 USP4 aus E. coli Kulturen aufgereinigt und mit Zellextrakten aus HeLa-Zellen inkubiert. ∆297-963 USP4 ist der
Teil des Proteins ohne die katalytische UCH-Domäne (Ubiquitin carboxyl-terminal
hydrolase). Die an ∆297-963 USP4 gebundenen Proteine wurden gelelektrophoretisch getrennt. Es konnten zwei spezifische Banden identifiziert werden, die
sich in der Massenspektroskopie als SART3 und PRP3 erwiesen. Es war aber
unklar, ob USP4 diese Kandidaten direkt bindet oder die Bindung über andere
Partner vermittelt wird.
Um zu erfahren, wie SART3 und PRP3 mit USP4 interagieren, wurde die
Bindung dieser Proteine in vitro in Pulldown-Versuchen nachgestellt. Dafür
wurden die cDNA von USP4, SART3 und PRP3 in pMAL- und pET28-Vektoren
kloniert und die jeweiligen Proteine aus transformierten E. coli Kulturen aufgereinigt. Die so entstandenen Proteine weisen am N-Terminus entweder ein
Maltose bindendes Protein (MBP des pMAL-Vektors) oder eine Kette von sechs
Histidinen (His6 des pET28-Vektors) auf. Das MBP bindet an Amylosekörnchen
die aus einer Suspension durch Zentrifugation abgetrennt werden können. Für
die Versuche inkubiert man das MBP-gekoppelte Protein „A“ mit den Amylosekörnchen. Danach wird der potentielle Bindungspartner „B“ dazugegeben. Man
wäscht die Körnchen und eluiert die MBP-Proteine von den Körnchen.
Anschließend trennt man das Eluat durch SDS-PAGE und analysiert es durch
Coomassie-Färbung. Hat der Bindungspartner „B“ gebunden, so sieht man eine
Bande in der Positivprobe. Um unspezifische Bindungen der anderen Proteine
an MBP auszuschließen, wird für jeden Ansatz auch eine Negativkontrolle mit
MBP allein pipettiert.
44
Wir konnten zeigen, dass MBP-USP4 direkt an SART3 bindet (Abb. 4-1 A. lanes
2+6/ B.). Jedoch war keine Bindung zwischen MBP-USP4 und PRP3 detektierbar
(Abb. 4-1 B. lane 6). MBP-SART3 hingegen bindet sowohl His6-USP4 als auch
His6-PRP3 (Abb. 4-1 C. lanes 2+4). MBP-PRP3 wiederum bindet nur an His6SART3, nicht aber an His6-USP4 (Abb. 4-1 D). Aufgrund dieser Ergebnisse
gehen wir davon aus, dass USP4 direkt mit SART3 interagiert. PRP3 bindet nicht
an USP4. PRP3 bindet jedoch an SART3 und wird so in den Komplex integriert.
Abb. 1 E stellt diese Bindungsverhältnisse schematisch dar.
Unsere Experimente geben keine Hinweise dafür, dass USP4 und PRP3 um die
gleichen Bindungsareale auf SART3 konkurrieren. Die Bindung beider Partner an
SART3 ist sowohl getrennt als auch in Kombination etwa gleich stark (Abb. 4-1
C. lanes 2+4 verglichen mit lane 6). Gegen eine konkurrierende Bindung spricht
auch, dass His6-USP4 in Anwesenheit von His6-SART3 an MBP-PRP3 gebunden wird (Abb. 4-1 D. lane 6).
Wenn man von diesem Modell ausgeht, stellt sich als nächste Frage, welche
Abschnitte der Proteine miteinander interagieren. Dafür wurden mittels PCR
Deletionsmutanten der beteiligten Proteine hergestellt und in Vektoren kloniert.
Beim Design der Mutanten haben wir uns an der Proteindomänenstruktur der
Bindungspartner orientiert. USP4 besitzt drei konservierte Domänen. Die DUSP(domain in ubiquitin specific proteases), die DUF- (domain of unknown function)
und die UCH- (ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase) Domäne (Abb. 4-2 B). Wir
erstellten Deletionsmutanten, denen jeweils eine der oben genannten Domänen
fehlte und untersuchten das Bindeverhalten dieser Mutanten in PulldownVersuchen.
45
Abbildung 4-1: USP4 bindet PRP3 über SART3 in vitro (MBP-Pulldown). A. USP4 bindet
SART3: MBP/ MBP-USP4 wurde mit Histidin-markierten SART3 und PRP3 inkubiert. Proteine
wurden mit Coomassie-Färbung sichtbar gemacht. SART3 aber nicht PRP3 bindet direkt an
USP4. Bei Inkubation mit SART3 und PRP3 zusammen kann PRP3 (auf gleicher Höhe wie das
Degradationsprodukt von SART3) nachgewiesen werden (lane 6). Die Bindung von PRP3 an
USP4 wird also über SART3 vermittelt. B. USP4 bindet PRP3 über SART3: MBP/ MBP-USP4
wurden abwechselnd mit Histidin- und radioaktiv markierten SART3 und PRP3 inkubiert. Proteine
wurden mit Autoradiographie und Coomassie-Färbung nachgewiesen. Die Bindung von PRP3 an
USP4 wird über SART3 vermittelt (lane 8). C. SART3 bindet USP4 und PRP3: MBP/ MBPSART3 wurden mit Histidin-markierten USP4 und PRP3 inkubiert. Proteine wurden mittels
Coomassie-Färbung dargestellt. SART3 kann USP4 und PRP3 gleichzeitig binden. D. PRP3
bindet SART3: MBP/ MBP-PRP3 wurde mit Histidin-markierten SART3 und USP4 inkubiert.
Proteine wurden mit Coomassie-Färbung detektiert. Da MBP-PRP3 und His6-SART3 die gleiche
Größe haben, erkennt man die Bindung nur durch die Verstärkung der Bande in Lane 2 und 6.
USP4 wird nur in Anwesenheit von SART3 gebunden. E. Schematische Darstellung:
Bindungsverhältnisse zwischen USP4, SART3 und PRP3. (Teile der Grafik von smart.emblheidelberg.de)
46
Mit den Vektoren stellten wir durch in vitro Transkription und Translation
radioaktiv markierte USP4-Mutanten her. Diese wurden in Pulldown-Experimenten mit MBP-SART3 inkubiert. Das Eluat der Amylasekörnchen wurde mittels
SDS-PAGE und Autoradiographie ausgewertet. Wir konnten zeigen, dass die
UCH-Domäne keinen Einfluss auf das Bindeverhalten von USP4 zu SART3
nimmt. Verglichen mit dem Wildtyp USP4 sahen wir bei ∆287-963 USP4 in vitro
keine Einschränkung der Interaktion (Daten nicht gezeigt). Anders jedoch führt
die Entfernung der DUSP- oder DUF-Domäne zu einer starken Abschwächung
der Interaktion zwischen USP4 und SART3. USP4-Deletionsmutanten ∆216-310
USP4 wiederum zeigt ein ungestörtes Bindeverhalten (Abb. 4-2 A.). Wir gehen
also davon aus, dass Abschnitte innerhalb der sich überschneidenden DUSPund DUF-Domänen von USP4 die Bindung zu SART3 herstellen.
Abbildung 4-2: USP4 bindet SART3 über DUF- und DUSP-Domänen in vitro. A. M B P Pulldown: MBP/ MBP-SART3 wurden mit mehreren Mutanten von radioaktiv markiertem USP4
inkubiert. Starke Bindung konnte nur für Mutanten (∆287-963) USP4 und (∆216-310) USP4
gezeigt werden. Die Bindung der USP4-Mutanten mit Deletion der DUF- oder DUSP-Domänen
war deutlich abgeschwächt. B. Schematische Darstellung von USP4 und seine Bindung zu
SART3: Neben der DUF- (domain of unknown function) und DUSP- (domain in ubiquitin specific
proteases) Domäne besitzt USP4 auch die katalytische UCH- (ubiquitin carboxyl-terminal
hydrolase) Domäne. USP4 bindet SART3 im Bereich der DUF- und DUSP-Domäne. (Teile der
Grafik von smart.embl-heidelberg.de)
47
Den gleichen experimentellen Ansatz wie bei USP4 verwendeten wir auch bei
SART3. SART3 hat eine Vielzahl von Proteindomänen (Abb. 4-3 B). Die RRM(RNA recognition motiv) als auch die HAT- (half a tetratricopeptide repeat)
Domäne kommen in vielen RNA-bindenden Proteinen vor. Wir generierten
Deletionsmutanten von SART3 für bestimmte Domänengruppen. Die Mutanten
wurden radioaktiv in vitro hergestellt und ihr Bindeverhalten an MBP-USP4 und
MBP-PRP3 in Pulldown-Experimenten untersucht. Die Analyse erfolgte über
SDS-PAGE und Autoradiographie.
Eine Deletion innerhalb des Aminosäurenabschnittes 287-704 (HAT 4-6-, HAT 7und coiled coil-Domäne) verhindert die Interaktion der SART3-Mutanten mit
USP4 (Abb. 4-3 A.). Nur die SART3-Mutanten, welche den Abschnitt 287-704
erhalten haben, können USP4 binden. Das lässt darauf schließen, dass dieser
Bereich für die Bindung von SART3 an USP4 benötigt wird. Die Entfernung der
Domänen HAT 1-3 oder HAT 4-6 führt zur Unterbrechung der Bindung von
SART3-Mutanten an PRP3 (Abb. 4-3 A). Für die Bindung von SART3 an PRP3
sind also die Aminosäuren 121-520 wichtig.
Obwohl unsere Experimente (Abb. 4-1 C + D und 4-4 A) keinen Hinweis auf eine
konkurrierende Bindung von USP4 und PRP3 an SART3 liefern konnten, sind die
Bindungsbereiche der beiden Proteine auf SART3 offensichtlich überlappend.
Wahrscheinlich erfolgt die tatsächliche Bindung über kleinere Bereiche, die für
eine korrekte Faltung jedoch eine größere Proteinstruktur benötigen. Es wäre
auch vorstellbar, dass die Bindungsstellen von SART3 von auf Ebene der
Primärstruktur auseinanderliegenden Abschnitten geformt werden
48
Abbildung 4-3: Bindung von deletiertem SART3 an PRP3 und USP4 in vitro. A. MBPPulldown, daneben schematische Darstellung der SART3-Deletionsmutanten: Die Bindung von
rekombinantem MBP/ MBP-PRP3/ MBP-USP4 an verschiedenen Mutanten von radioaktiv
markiertem SART3 wurde in vitro untersucht und mit Autoradiographie detektiert. Für die Bindung
von PRP3 an SART3 ist ∆1-120; ∆521-963 SART3 suffizient, für die Bindung an USP4 ist es ∆1286; ∆705-963 SART3. B. Schematische Darstellung von SART3 und seiner Bindung zu USP4
und PRP3: SART3 besitzt sieben HAT- (half a tetratricopeptide repeat) Domänen und zwei RRM(RNA recognition motiv) Domänen, die an RNA binden können. SART3 bindet mit den ersten
sechs HAT-Domänen an PRP3. Über den Bereich der Aminosäuren 287-704 wird die Bindung zu
USP4 vermittelt. (Teile der Grafik von smart.embl-heidelberg.de)
49
PRP3 verfügt über eine PWI- (Domäne in Splicing Faktoren) und eine PRP3Domäne (Abb. 4-4 C). Wir stellten Deletionsmutanten von PRP3 her, die jeweils
nur eine dieser Domäne beinhalten. Die entsprechenden Proteine wurden MBPmarkiert aus transformierten Bakterienkulturen aufgereinigt. In MBP-PulldownVersuchen inkubierten wir diese PRP3-Mutanten mit in vitro translatierten und
radioaktiv markierten SART3 und PRP4B. Das Eluat wurde mit SDS-PAGE und
Autoradiographie analysiert.
Nur die PRP3-Mutante mit PRP3-Domäne bindet an SART3 (Abb. 4-4 B. lane
10). Auch die Bindung an den Splicing Faktor PRP4B wird über diesen Teil des
Proteins hergestellt (Abb. 4-4 B. lane 11). Darüber hinaus bindet PRP4B auch an
SART3 (Abb. 4-4 A). PRP4B ist eine Kinase. Die Bindungen von PRP4B an
SART3 und PRP3 sind nicht abhängig von der Kinaseaktivität des Proteins, da
eine katalytisch inaktive Variante des Proteins (K893M)PRP4B in vitro das
gleiche Bindeverhalten zeigt (Daten nicht gezeigt).
Sowohl für SART3 als auch für PRP3 sind Mutationen beschrieben, die mit
bestimmten Erkrankungen assoziiert sind. Für die Mutation V519M in SART3
wurde ein Zusammenhang mit Aktinischer Keratose aufgezeigt (Zhang et al,
2005). In PRP3 scheinen zwei Mutationen in Verbindung mit der Retinitis
pigmentosa aufzutreten (Gonzalez-Santos et al, 2008). Es interessierte uns, ob
diese Mutationen veränderte Bindungseigenschaften der Proteine zur Folge
haben. Mittels Mutagenese-PCR etablierten wir die Mutationen in Vektoren,
welche die Gene trugen. Wir stellten die Proteine radioaktiv markiert in vitro her
und inkubierten sie mit MBP-USP4 und MBP-PRP3 bzw. MBP-SART3. Das Eluat
der Pulldown-Versuche wurde mit SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert.
Die Mutanten unterschieden sich in ihrem Bindeverhalten grundsätzlich nicht von
den Wildtypen (Abb. 4-5 A + B). Lediglich die Bindung von (V519M)SART3 an
USP4 scheint in diesem Versuch latent abgeschwächt (Abb. 4-5 B. lane 5).
50
Abbildung 4-4: PRP3 bindet SART3 und PRP4B über PRP3-Domäne in vitro. A. MBPPulldown: MBP/ MBP-USP4 inkubiert mit radioaktiv markiertem PRP3 und 4B alternierend mit
und ohne Zugabe von His6-SART3. Detektion der radioaktiven Proteine erfolgte mit
Autoradiographie. PRP3/4B binden über SART3 an USP4. B. MBP-Pulldown: MBP/ MBP-PRP3
(N-90)/ MBP-PRP3 (91-300)/ MBP-PRP3 (301-C) wurden mit radioaktiv markiertem SART3 und
PRP4B inkubiert. Detektion der radioaktiven Proteine erfolgte mit Autoradiographie. Bindung
konnte nur für MBP-PRP3 (301-C) gezeigt werden. C. Schematische Darstellung von PRP3 und
seiner Bindung zu SART mit Domänenlegende: PRP3 bindet SART über seine PRP3-Domäne.
(Teile der Grafik von smart.embl-heidelberg.de) D. Schematische Darstellung der
Bindungsverhältnisse zwischen SART3, PRP3, PRP4B und USP4.
51
Abbildung 4-5: Bindung von PRP3 und SART3-Mutanten in vitro. A. MBP-Pulldown: MBP
und MBP-SART3 wurden mit radioaktiv markiertem PRP3-Wildtyp und PRP3-Mutanten inkubiert.
Gebundene Proteine wurden mit Autoradiographie detektiert. Es wurde kein Unterschied im
Bindeverhalten der PRP3-Mutanten zu SART3 zu detektiert. B. MBP-Pulldown: MBP, MBP-USP4
und MBP-PRP3 wurden mit radioaktiv markiertem SART3 und (V591M)SART3 inkubiert.
Radioaktive Proteine wurden mit Autoradiographie dargestellt. Es liegt kein relevanter
Unterschied im Bindeverhalten von (V591M)SART3 im Vergleich zum Wildtyp vor.
4.2. Katalytische Aktivität von USP4
Um die katalytische Aktivität von USP4 in vitro analysieren zu können, benutzten
wir unterschiedliche kommerziell erworbene Ubiquitinketten und ubiquitinierte
Proteine. Eine Kette von mit sechs Histidinen markiertem USP4 wurde aus
Baculovirus-infizierten Insektenzellen aufgereinigt. Die Ubiquitinketten wurden
mit USP4 in unterschiedlichen Konzentrationen in UBAB-Puffer inkubiert. Um
einen unspezifischen Abbau der Ubiquitinketten auszuschließen, wurde eine
Negativkontrolle mit NEM (N-Ethylmaleinimid) durchgeführt. NEM inhibiert
spezifisch Cysteinproteasen wie USP4. Die Reaktion wurde mit SDS gestoppt
und die Probe mit SDS-PAGE aufgetrennt. Die weitere Analyse erfolgte mit
Western Blot, wobei die Nitrozellulosemembranen nach dem Transfer wegen
Antikörperspezifität autoklaviert werden mussten.
52
Abbildung 4-6: USP4
schneidet K48 und K63
verknüpfte Ubiquitinketten.
A.-F.
Unterschiedliche
Ubiquitinketten wurden 30
Minuten bei Raumtemperatur
ohne und mit ansteigenden
Mengen von aus Insektenzellen aufgereinigtem His6USP4 und der höchsten
Konzentration von His6USP4 mit NEM inkubiert. Die
Ubiquitinketten wurden mit
Western Blot analysiert. A.
Ubiquitinketten mit 3-7
Monomeren über Lysin 48
verbunden (K48-Ubi(3-7))
verdaut durch USP4. B .
Ubiquitinketten mit 3-7
Monomeren über Lysin 63
verknüpft (K63-Ubi(3-7))
wurden von USP4 verdaut.
C . Ubiquitinketten mit 5
Monomeren über Lysin 48
verknüpft (K48-Ubi(5)) wurden mit USP4 verdaut. D .
Ubiquitinketten mit 5
Monomeren über Lysin 63
verknüpft (K63-Ubi(5)) durch
USP4 verdaut. E. + F.
Alternierend über Lysin 48
und 63 verknüpfte Ubiquitinketten mit 4 Monomeren
(K63-K48-K63-Ubi(4) und
K48-K63-K48-Ubi(4)) wurden
durch USP4 verdaut. G .
Input von USP4 entsprechend der Versuche A.-F.
Proteine
wurden
mit
Coomassie-Färbung
analysiert.
53
In der linken Spalte der Western Blots erkennt man den Input an Ubiquitinketten.
Der Nachweis von Fragmenten zeigt sich korrespondierend mit einem Verlust
des Inputs in den rechts folgenden Spalten. Das bedeutet, dass die Ketten hier
verdaut werden. Wir konnten so nachweisen, dass USP4 in vitro sowohl K48 als
auch K63 verknüpfte Ubiquitinketten spaltet (Abb. 4-6 A + B). Dabei fällt auf,
dass die K63 verknüpften Ketten von USP4 insgesamt besser abgebaut werden
können als K48 verknüpfte Ketten. Eine Ausnahme stellen K48-Ubi (4 + 2) dar,
die von USP4 offensichtlich sehr gut verdaut werden können. Während man in
Abb. 4-6 B bei K63 Ketten einen ungefähr vergleichbaren Verdau aller Kettengrößen sieht, so kann man in Abb. 4-6 A praktisch keinen Abbau der Ketten K48Ubi(5 + 6) erkennen.
Die Präferenz für K63 Ketten wird auch in den Versuchen mit Ubiquitinpentameren sichtbar (Abb. 4-6 C + D). USP4 katalysiert bereits bei einer
Konzentration von ca. 2 mg/ml den kompletten Verdau der K63 Ketten (Abb. 4-6
D. lane 4), wohingegen die K48 Ketten nur teilweise verdaut werden (Abb. 4-6 C.
lane 4). Bei den Experimenten mit Ubiquitinketten, die abwechselnd über K48
und K68 verknüpft sind, spaltet USP4 sowohl K48- als auch K63-Verknüpfungen
(Abb. 4-6 E + F). Aus diesen in vitro Versuchen lässt sich ableiten, dass USP4 in
der Lage ist, sowohl K48 als auch K63 Ubiquitinketten zu verdauen, wobei es
eine Präferenz für K63 verknüpfte Ketten besitzt.
Wir wussten, dass USP4 an SART3 und TRIM21 bindet. Uns interessierte, ob die
Bindung dieser Proteine an USP4 einen Einfluss auf seine Aktivität hat. Wir
inkubierten Ubiquitinketten mit USP4 in unterschiedlichen Konzentrationen.
Dabei wurde jedem zweiten Ansatz TRIM21, SART3 oder SART3 und PRP3
hinzugefügt. Die Proben wurden mit SDS-PAGE aufgetrennt und mit Western
Blots analysiert. In jeder Konzentration war der Verdau der Ubiquitinketten mit
und ohne Bindungspartner etwa gleich stark. Auf die katalytische Aktivität von
USP4 gegen freie Ubiquitinketten hat die Bindung von TRIM21, SART3 oder
SART3 und PRP3 also keinen Einfluss (für K63-Ubi(3-7): Abb. 4-7 A; für K48Ubi(3-7): nicht gezeigt).
54
Abbildung 4-7: Bindungspartner von USP4 haben keinen
Einfluss auf katalytische Aktivität. A. Ubiquitinketten mit 3-7
Monomeren über Lysin 63 verknüpft wurden mit aus
Insektenzellen gewonnenem His6-USP4 in unterschiedlichen
Konzentrationen verdaut. Jeder zweiten Probe wurden
Bindungspartner von USP4 zugegeben (TRIM21, SART3 oder
SART3+PRP3). Negativkontrolle wurde mit NEM durchgeführt.
Die Analyse erfolgte mit Western Blot gegen Ubiquitin. Mit und
ohne Bindungspartner zeigt USP4 die gleiche katalytische
Aktivität.
B. Ubiquitinketten mit 3-7 Monomeren über Lysin 48 und 63 verknüpft wurden mit aus
transfizierten Bakterien aufgereinigten His6-USP4 Mutanten verdaut. Ubiquitin wurde mit
Western Blot detektiert. His6-USP4 und Mutanten wurden mit Coomassie-Färbung sichtbar
gemacht. Während die Mutanten ∆DUSP(∆27-125) und ∆DUF(∆82-216) ähnliche Aktivität wie
der Wildtyp aufweisen, zeigt die ∆ND(∆216-310) Mutante keine katalytische Aktivität. C. An
SART3 gebundene deubiquitinierende Aktivität schneidet präferentiell K63 verknüpfte
Ubiquitinketten. Stabil Flag-SART3 exprimierende Zelllinie wurde zu einem Teil mit- und zum
anderen Teil ohne Nocodazol inkubiert. In den Zelllysaten beider Ansätze wurde eine IP gegen
Flag durchgeführt. Die gewaschenen Körnchen wurden bei Raumtemperatur 15 Minuten mit
Ubiquitinketten und wahlweise NEM inkubiert. Reaktion wurde mit SDS Puffer gestoppt.
Ubiquitin wurde im Western Blot analysiert. Die an SART3 gebundene deubiquitinierende
Aktivität spaltet eher K63 verknüpfte Ketten.
55
Uns interessierte nun, ob die deubiquitinierende Aktivität von USP4 zellzyklusabhängig reguliert wird. Dafür benutzten wir eine Zelllinie, die stabil Flag-SART3
exprimiert. Einen Teil der Zellen arretierten wir mit Nocodazol in der Mitose. In
Extrakten der nicht-arretierten und arretierten Zelllinie führten wir eine Immunpräzipitation gegen Flag durch, um die an Flag-SART3 gebundene deubiquitinierende Aktivität von USP4 zu untersuchen. Wir inkubierten das Eluat der IP mit
K48- und K63-verknüpften Ubiquitinketten.
Es ließ sich eine spezifische deubiquitinierende Aktivität nachweisen, die
präferentiell K63-verknüpfte Ubiquitinketten schneidet (Abb. 4-7 C. lanes 5 + 7
verglichen mit lanes 1 + 3). Die Aktivität unterscheidet sich nicht wesentlich
zwischen den mit Nocodazol arretierten und den nicht-arretierten Zellen (Abb. 47 C. lane 5 verglichen mit lane 7). In diesem Versuch lässt sich also kein Hinweis
auf eine zellzyklusabhängige Regulation der deubiquinierenden Aktivität von
USP4 finden.
Um zu erfahren, welche USP4-Domänen für die Katalyse notwendig sind,
reinigten wir auch Deletionsmutanten von USP4 aus transformierten E. coli auf,
und führten Deubiquitinierungsassays durch. Wir inkubierten K48- und K63verknüpfte Ubiquitinketten mit den Deletionsmutanten. Wir detektierten mittels
SDS-PAGE und Western Blot. Sowohl die ∆DUSP (∆27-125 USP4) als auch die
∆DUF (∆82-216 USP4) Mutanten waren katalytisch vergleichbar aktiv mit dem
Wildtyp USP4. Allein die ∆ND (∆216-310 USP4/ ∆no domain) Form zeigte keine
enzymatische Aktivität (Abb. 4-7 B). Es könnte also sein, dass der Abschnitt ND
für die Aktivität von USP4 von Bedeutung ist. Die Domänen DUF und DUSP sind
für diese Aktivität jedenfalls nicht essentiell.
Wir waren auch sehr interessiert daran, mögliche Substrate von USP4 zu finden.
Um zu sehen, ob USP4 PRP3 oder an PRP3 gebundene Proteine deubiquitiniert,
überexprimierten wir mit Hämagglutinin (HA)-Epitop verbundenes PRP3 in HeLaZellen und führten eine IP gegen HA durch. Auf den IP-Beads führten wir dann
ein Deubiquitinierungsexperiment durch. Wir eluierten mit SDS, trennten das
Proteingemisch mit SDS-PAGE auf und analysierten mit Western Blot gegen
Ubiquitin und das HA-Antigen (Abb. 4-8 A.).
56
In den Spalten, denen aktives USP4 zugefügt wurde, sehen wir eine
Abschwächung im Ubiquitinsignal der oberen Produkte und dafür monomeres
Ubiquitin (Abb. 4-8 A. lanes 2+4). Dies lässt darauf schließen, dass USP4
Ubiquitin von den in der IP detektierten Proteinen abschneidet. USP4
deubiquiniert also Proteine, die in der IP an HA-PRP3 gebunden haben und
wahrscheinlich auch HA-PRP3 selber (Abb. 4-8 A). Die Deubiquitinierung erfolgte
auch in Abwesenheit von rekombinantem SART3 (Abb. 4-8 A. lane 2). Dies lässt
sich vielleicht damit erklären, dass HA-PRP3 in der IP bereits mit SART3 beladen
war. In parallelen Experimenten konnte in HeLa-Zellen nachgewiesen werden,
dass USP4 PRP3 in vivo deubiquitiniert. Dahingegen wurde SART3 in den
Versuchen nicht durch USP4 deubiquitiniert (Daten von Eun Joo Song, Postdoc
in der Arbeitsgruppe von Michael Rape, UC Berkeley).
Abbildung 4-8: USP4 deubiquitiniert in vivo und in vitro ubiquitinierte Proteine: A. Mit einem
HA-Anker verbundenes PRP3 wurde in HELA Zellen überexprimiert. 48 Stunden nach
Transfektion wurden die Zellen geerntet. In dem Zelllysat wurde eine IP gegen HA-Anker
durchgeführt. Die IP-Körnchen wurden gewaschen und in Puffer mit aus Insektenzellen
aufgereinigtem His6-USP4, wahlweise NEM und His6-SART3 inkubiert. Im Western Blot wurden
Ubiquitin und HA detektiert. USP4 spaltet (mit und ohne SART3) an PRP3 direkt oder indirekt
gebundenes Ubiquitin ab. B. Radioaktives TRIM 21 und Mutanten wurden im Ubi-Mix
autoubiquitiniert und dann wahlweise mit USP4 und USP4+NEM inkubiert. Ein Nachweis erfolgte
mit Autoradiographie. USP4 deubiquitiniert autoubiquitiniertes Wildtyp TRIM21. TRIM21 ∆bbox
wird von USP4 nicht deubiquitiniert. TRIM21 ∆pry und ∆spry werden von USP4 nur schwach
deubiquitiniert.
57
Der USP4-Bindungspartner TRIM21 ist eine E3-Ligase und ubiquitiniert sich
selbst. USP4 deubiquitiniert Wildtyp TRIM21. Uns interessierte, ob bestimmte
Abschnitte in TRIM21 für eine Deubiquitinierung durch USP4 wichtig sind. Wir
stellten TRIM21 und Deletionsmutanten radioaktiv her, induzierten Autoubiquitinierung und inkubierten mit USP4. In der ersten Spalte erkennt man den
Input des radioaktiv markierten TRIM21. In der zweiten Spalte dann das
autoubiquitinierte TRIM21, das wesentlich größer ist. Die dritte Spalte zeigt das
deubiquitinierte TRIM21 und die vierte ist eine Negativkontrolle mit NEM. Dieses
Schema wurde für den Wildtyp und alle Mutanten durchgeführt (Abb. 4-8 B).
Es ist gut zu erkennen, dass eigentlich nur der Wildtyp stark deubiquitiniert wird.
Die Deletion der pry- und spry-Domänen führen zu einer Abschwächung der
deubiquitinierenden Wirkung von USP4. Die Deletion der bbox-Domäne unterbindet die Deubiquitinierung durch USP4 (Abb. 4-8 B. lane 7). Die Bindungen
von TRIM21 und ∆bboxTRIM21 an USP4 sind in vitro ähnlich stark (Daten nicht
gezeigt). Es könnte sein, dass die bbox für eine korrekte Interaktion zwischen
USP4 und TRIM21 wichtig ist. Sie könnte auch eine Funktion für die korrekte
Faltung des Proteins besitzen.
4.3. Lokalisation von USP4
Um weitere Bindungspartner von SART3 und damit eventuell weitere Substrate
von USP4 oder andere für die Funktion von USP4 wichtige Proteine finden zu
können, stellten wir eine induzierbar stabil Flag-SART3 exprimierende Zelllinie in
U2OS Zellen (Osteosarkom) her. Wir züchteten mehr als 120 große Petrischalen
der Zelllinie und führten in dem Lysat der Zellen eine IP gegen Flag durch (Abb.
4-9 A.). Nach detergenzfreiem Waschen wurden die Bindepartner durch
Massenspektrometrie bestimmt (Abb. 4-9 B.). Das Ergebnis zeigte viele
unpezifische Bindungspartner des Zellgerüsts. Interessant fanden wir in dieser
Liste aber das Importin alpha, da es uns Aufschlüsse über die Zelllokalisation
von USP4 geben konnte.
58
Abbildung 4-9: SART3 bindet an Importin alpha: A. anti-Flag IP im Zelllysat von U2OS Zellen
und U2OS Zellen, die Flag-SART3 stabil exprimieren. Stabil Flag-SART3 exprimierende Zelllinie
und Kontrollzelllinie U2OS host cells wurden in jeweils 120 großen Petrischalen herangezüchtet
und lysiert. In dem Lysat wurde die IP gegen Flag durchgeführt. 10% des Eluats wurden auf
dieses 10%-SDS-Gel geladen und mit Silberfärbung sichtbar gemacht. B. Mögliche
Bindungspartner von SART3: 90% des Eluats der IP wurde zur massenspektrometrischen
Analyse verwendet. Proteine, die mit mehr als 2 Fragmenten nachgewiesen werden konnten,
wurden an uns übermittelt. Diese sind hier aufgelistet absteigend nach dem Grad der
Sequenzerkennung. C. SART3 und PRP3 binden an Importin alpha C-terminal in vitro: MBP
Pulldown: MBP/ MBP-PRP3/ MBP-USP4/ MBP-SART3 wurden mit Importin alpha CT inkubiert
und gewaschen. Proteine wurden mit Coomassie gefärbt. Bindung an Importin alpha CT konnte
für PRP3 und SART3 nachgewiesen werden. D. Bindung von Importin alpha an SART3 inhibiert
die Bindung von USP4 an SART3 nicht: MBP Pulldown: MBP/ MBP-SART3 wurden mit und ohne
Importin alpha CT und danach mit radioaktivem USP4 inkubiert. Proteine wurden mit CoomassieFärbung und radioaktives USP4 mit Autoradiographie sichtbar gemacht. Bindung von USP4 an
Importin alpha CT
SART3 ist vergleichbar mit der Bindung von USP4 an SART3
.
59
Für die in vitro Versuche benutzten wir den C-terminalen Teil von Importin alpha
(Importin alpha CT), da der N-terminale Abschnitt die Bindung von Importin alpha
an andere Proteine in Abwesenheit von Importin beta inhibiert (Lange et al,
2007). Wir untersuchten die Bindung von Importin alpha CT an die MBPmarkierten SART3, PRP3 und USP4 in MBP-Pulldown-Versuchen. Das Eluat
wurde mit SDS-PAGE und Coomassie-Färbung analysiert. Eine relevante
Bindung von Importin alpha CT konnten wir für MBP-PRP3 und MBP-SART3 an
Importin alpha CT in vitro zeigen (Abb. 4-9 C. lanes 2 + 4). Für MBP-USP4 war
keine Bindung detektierbar (Abb. 4-9 C. lane 3). Als Nächstes interessierte uns,
ob USP4 an SART3 binden kann, auch wenn SART3 an Importin alpha gebunden ist. Dazu inkubierten wir radioaktiv markiertes USP4 mit MBP-SART3 und
mit MBP-SART3, das zuvor mit Importin alpha CT beladen worden war. Die
Bindung von USP4 an MBP-SART3 und MBP-SART3Importin
alpha CT
ist in vitro
äquivalent (Abb. 4-9 D. lane 3+4).
Die nächste Frage war, ob USP4 über SART3 an Importin alpha gebunden
werden kann. Dazu nahmen wir MBP-Importin alpha CT und inkubierten es mit
radioaktivem USP4 und wahlweise His6-SART3. Wir konnten zeigen, dass USP4
über SART3 an Importin alpha CT in vitro gebunden werden kann (Abb. 4-10 A).
Aus dem Versuch geht auch hervor, dass His6-USP4 die Bindung von SART3 an
Importin alpha nicht beeinflusst. SART3 bindet in und ohne Anwesenheit von
His6-USP4 gleich stark an Importin alpha (Abb. 4-10 A. lanes 7+8). Die in vitro
Versuche legen also nahe, dass USP4 über SART3 an Importin alpha gebunden
werden könnte und so in den Nukleus gelangt.
Uns interessierte nun, ob diese Bindung auch in vivo eine Relevanz hat. Dazu
exprimierten wir USP4 in HeLa-Zellen in verschiedenen Kombinationen und
analysierten die Lokalisation des Proteins mit Immunfluoreszenz. Wir exprimierten in einem weiteren Ansatz HA-NLS-USP4, das N-terminal die Nukleuslokalisations-Sequenz des Semian-Virus 40 trägt, in HeLa-Zellen. Darüber hinaus
coexprimierten wir HA-USP4 und myc-SART3 in einem dritten Ansatz. Die Zellen
wurden 48 Stunden nach der Transfektion fixiert. Primärantikörper gegen HA und
myc, Alexa-488- und Cy3- gekoppelte Sekundärantikörper sowie DAPI für die
60
Kerngegenfärbung wurden für die Immunfluoreszenz verwendet. Die Abbildung
4-10.B zeigt Färbungen von repräsentativen Zellen.
USP4 ist in Abwesenheit von SART3 in der gesamten Zelle und vorwiegend im
Zytoplasma lokalisiert. Dagegen sehen wir für das mit einer artifiziellen NLS
ausgestattete USP4 eine klare nukleäre Lokalisation des Proteins. Das legt den
Schluss nahe, dass der Transport von USP4 nicht über eigene NLS vermittelt
wird, da sonst auch der Wildtyp im Zellkern lokalisiert sein müsste. Bei der
Coexpression von HA-USP4 und myc-SART3 kommt es zur Colokalisation der
beiden Proteine im Zellkern mit Betonung der Kernmembran (Abb. 4-10 B).
Abbildung 4-10: USP4 wird durch Bindung an SART3 in den Zellkern transportiert: A.
USP4 bindet Importin alpha CT über SART3: MBP-Pulldown: MBP und MBP-Importin alpha CT
wurden mit His6-SART3 und radioaktivem USP4 inkubiert. Proteine wurden mit CommassieFärbung und Autoradiographie detektiert. Bindung von USP4 konnte nur in Anwesenheit von
SART3 aufgezeigt werden. Ebenso wurden MBP und MBP-Importin alpha CT mit His6-USP4 und
radioaktivem SART3 inkubiert. Proteine wurden mit Commassie-Färbung und Autoradiographie
detektiert. Die Bindung von SART3 an Importin alpha scheint durch die Anwesenheit von USP4
sogar noch verstärkt zu werden. B. Lokalisation von USP4 in vivo abhängig von SART3.
Immunfluoreszenz: obere Reihe: Überexpression von HA-USP4 in HeLa-Zellen: Zytoplasmatische Lokalisation von USP4. mittlere Reihe: Überexpression von HA-NLS-USP4 (mit der
Nukleus-lokalisations-Sequenz von SV40 Virus) in HeLa Zellen: klare nukleäre Lokalisation von
HA-NLS-USP4. Untere Reihen: Co-Überexpression von HA-USP4 und myc-SART3 in HeLaZellen: deutliche nukleäre Lokalisation von SART3 und auch USP4.
61
Wir vermuten also, dass USP4 gekoppelt an SART3 in den Zellkern transferiert
wird. Wildtyp USP4 allein wird nicht in den Zellkern gebracht, da die endogene
SART3 Konzentration wahrscheinlich nicht dafür ausreicht. Die in vitro Ergebnisse werden also durch die Daten in vivo unterstützt, dass USP4 über die
Bindung an SART3 in den Zellkern transportiert werden kann.
4.4. Degradation von USP4
Um zu erfahren, ob USP4 oder mit USP4 assoziierte Proteine Substrate von
APC/C sind, führten wir in vitro Degradationsversuche durch. Dafür wurden die
radioaktiven Proteine für zwei Stunden in mitotischen Extrakten unter Zugabe
von UbcH10 und p31 bei 30ºC inkubiert. Wir führten jeweils drei Reaktionen
durch, wobei die erste Reaktion sofort gestoppt wurde. Die Zweite wurde nach
zwei Stunden gestoppt. Der dritten Reaktion wurden zu Beginn Emi1 und
Securin zugegeben, um spezifisch die Aktivität von APC/C gegen das potentielle
Substrat zu vermindern. Diese Reaktion wurde ebenfalls nach zwei Stunden
gestoppt (Williamson et al, 2009).
Wie bereits erwähnt, hatten wir eine Assoziation von PRP3 und PRP4B an USP4
über SART3 zeigen können. Wir vermuteten eine Assoziation von USP4 mit
Rae1, Lsm2 und Nup98. Für Rae1 und Nup98 konnte gezeigt werden, dass sie
für den Aufbau des Spindelapparates wichtig sind (Blower et al, 2005). Wir
testeten alle diese Proteine auf Degradation in mitotischen Extrakten. Keiner der
Kandidaten wurde in den mitotischen Extrakten (Abb. 4-11 A.) und G1-Extrakten
degradiert. Die veränderte Bandenhöhe von Nup98 lässt sich am ehesten durch
eine Phosphorylierung erklären, wobei die verantwortliche Kinase wahrscheinlich
Substrat des APC/C ist (Abb. 4-11 A. right blot lane 7-9). Weder USP4 noch
eines der assoziierten Proteine wurde in vitro durch APC/C reguliert. TRIM21 ist
die einzige bekannte E3-Ligase, die USP4 ubiquitiniert und damit seine Stabilität
beeinflusst (Wada & Kamitani, 2006).
62
Abbildung 4-11: USP4 wird nicht degradiert in mitotischen Zellextrakten: A.
Degradationsversuch: Radioaktiv markiert wurden Proteine 0h, 2h und 2h unter Zugabe von
Emi1 und Securin bei 30ºC in mitotischen Extrakten inkubiert. Die Reaktion wurde unter Zugabe
von SDS gestoppt, und die Proteine wurden mit Autoradiographie analysiert. APC/C spezifische
Degradation kann nur für die Positivkontrolle Cyclin A detektiert werden.
63
5. Diskussion
Michael Rape und Mitarbeiter konnten in einem siRNA Screen gegen
deubiquitinierende Enzyme zeigen, dass der Wegfall von USP4 eine Dysregulation des Zellzyklus zur Folge hat.
Die Zellen, denen durch Inhibition des Spindelapparates eine korrekte Mitose
nicht möglich war, konnten bei siRNA-Depletion von USP4 den physiologischen
Spindelcheckpunkt passieren (Song et al, 2010). Sie zeigten den dafür typischen
Phänotyp von multinukleären Zellen und lobulierten Zellkernen. USP4 wird also
für die Regulation des Spindelcheckpunktes benötigt. Bei Transfektion in Zelllinien zeigte USP4 onkogene Eigenschaften, was eine Rolle von USP4 bei der
Tumorigenese wahrscheinlich macht (Gray et al, 1995). Es stellte sich also nun
die Frage, wie USP4 in die Regulation des Zellzyklus eingreift.
5.1. Bindungspartner von USP4
Deubiquitinierende Enzyme benötigen oft andere Proteine als Bindungspartner,
um katalytisch aktiv zu sein, Substrate zu binden und auch die zelluläre Lokalisation zu verändern (Reyes-Turcu et al, 2009). Deshalb haben wir zuerst nach
neuen Bindungspartnern von USP4 gesucht. Dabei stießen wir auf SART3, das
in Zellen mit dem Spliceosom assoziiert ist und für das Spliceosom die Funktion
eines Recyclingfaktors hat (Medenbach et al, 2004). Wir konnten zeigen, dass
USP4 in vitro eine starke Bindung zu SART3 eingeht (Abb. 4-1). Eun Joo Song,
Postdoc in der Arbeitsgruppe von Michael Rape an der UC Berkeley, konnte in
IP-Versuchen mit Zelllysaten von HeLa-Zellen eine Bindung von USP4 an
SART3 nachweisen (Song et al, 2010). USP4 und SART3 weisen in der Immunfluoreszenz eine Colokalisation im Kern der Interphasezellen auf (Abb. 4-10 B).
Die Redundanz des Ergebnisses in den unterschiedlichen Systemen lässt auf
eine hohe Signifikanz der Daten schließen. Zusammenfassend scheint SART3
ein fester Bindungspartner von USP4 zu sein.
In vitro konnten wir mit Mutanten von USP4 und SART die Bindungsabschnitte
der beiden Proteine füreinander ermitteln. USP4 bindet SART3 in seinem N64
terminalen Bereich im Abschnitt der DUSP- und DUB-Domänen (Abb. 4-3 A).
Diese Teile des Proteins unterscheiden USP4 grundlegend von anderen deubiquitinierenden Enzymen. Wir können also annehmen, dass SART3 nicht unspezifisch an viele unterschiedliche DUBs bindet. Das Protein SART3 besteht wie
USP4 aus 963 Aminosäuren. Es benötigt für die Bindung an USP4 die Aminosäuren 287 bis 704. Dieser mittlere Teil des Proteins bindet an USP4 (Abb. 4-2
A). In einer chinesischen Familie wurde ein Zusammenhang zwischen der
Aktinischen Keratose und der Mutation V519M in SART3 festgestellt (Zhang et
al, 2005). Diese Mutation liegt in dem Bereich von SART3, der an USP4 bindet.
Wir konnten in vitro zeigen, dass diese Mutation die Bindung von SART zu USP4
nicht wesentlich abschwächt und also kein molekularbiologisches Korrelat der
Erkrankung darstellt (Abb 4-5 A).
Auf der Suche nach Bindungspartnern von USP4 war initial auch PRP3 als
Kandidat gefunden worden. PRP3 bindet USP4 aber nicht direkt, sondern nur
über SART3 (Abb. 4-1). SART3 bindet mit einem weiter N-terminal liegenden
Abschnitt (Aminosäuren 121-486) an PRP3 (Abb. 4-2 A). Die Bindungsareale von
SART3 für USP4 und PRP3 überschneiden sich. Trotzdem zeigt sich in den
Experimenten keine konkurrierende Bindung der beiden Proteine an SART3
(Abb. 4-1 C). Es ist also wahrscheinlich, dass die tatsächlichen Bindungsareale
wesentlich kleiner sind. Eine Erklärungsmöglichkeit wäre, dass die primärstrukturelle Integrität der größeren Proteinabschnitte für die korrekte Faltung und
damit Funktion von SART3 wichtig ist. Möglich wäre aber auch, dass die
Bindungsflächen von mehreren Abschnitten des Proteins gebildet werden, die in
der Aminosäurensequenz nicht nebeneinander liegen.
PRP3 ist wie SART3 auch ein Protein, das mit dem Spliceosom assoziiert ist.
PRP3 bindet an SART3 über seine C-terminale PRP3-Domäne. Auch diese
Domäne ist im Menschen nur in PRP3 vertreten, was die Spezifität der Bindung
zwischen SART3 und PRP3 wahrscheinlich macht. Abbildung 5-1 A veranschaulicht schematisch die infolge der in vitro Versuche angenommenen Bindungsverhältnisse zwischen den Proteinen USP4, SART3 und PRP3 (Abb. 5-1 A). Eun
Joo Song konnte diese Bindungsverhältnisse auch mit IP-Experimenten in HeLaZellextrakten nachweisen.
65
Abbildung 5-1: Schematische Darstellung der Bindungsverhältnisse zwischen USP4,
SART3 und PRP3: A. Markiert sind die Bereiche der Proteine, die in in vitro Versuchen essentiell
für die Bindung zwischen den Partnern sind. (Teile der Grafik von smart.embl-heidelberg.de)
5.2. Katalytische Aktivität von USP4
Neben den Bindungsverhältnissen von USP4 interessierte uns auch seine
katalytische Aktivität, um mehr über die Funktionen von USP4 zu erfahren. Wir
exprimierten humanes USP4 in eukaryoten SF9 Insektenzellen und reinigten
dieses Protein für unsere in vitro Experimente auf. Wir konnten zeigen, dass
USP4 effektiv K48 und K63 verknüpfte Ubiquitinketten spaltet (Abb. 4-6 A + B).
Dabei ließ sich eine Präferenz für K63 verknüpfte Ketten feststellen (Abb. 4-7 C).
K48 verknüpfte Ubiquitinketten mit fünf oder sechs Monomeren wurden von
USP4 kaum verdaut (Abb. 4-6 A + C). Die Bindungspartner SART3 und TRIM21
haben in vivo keinen Einfluss auf die katalytischen Eigenschaften von USP4
(Abb. 4-7 A).
Allerdings scheint der Proteinabschnitt mit den Aminosäuren 216-310 (ND) für
die katalytische Aktivität von USP4 von Bedeutung zu sein. ND ist jedoch kein
Teil der konservierten UCH-Domäne, die in anderen Proteinen für die deubiquitinierende Aktivität verantwortlich ist. Dafür enthält sie Bereiche mit low
complexity und intrinsic disorder, welche die Bindung an andere Faktoren
vermitteln können. Wir konnten allerdings keinen Bindungsfaktor finden, der die
Aktivität von USP4 beeinflusst. Es wäre möglich, dass dieser Bereich für die
korrekte Faltung der UCH-Domäne wichtig ist. Der Wegfall dieser Sequenz
66
könnte so eine Fehlfaltung der UCH-Domäne zur Folge haben, die ihre Funktion
dann nicht mehr korrekt wahrnehmen könnte.
Über K48 verknüpfte Ubiquitinketten haben in der Zelle vor allem die Aufgabe,
Proteine für die Degradation durch das Proteasom zu markieren. K63-Ketten
wiederum haben unterschiedliche regulatorische Funktionen vor allem in der
Signaltransduktion (vgl. Einleitung). K48-Ketten weisen eine eher geschlossene
Konformation auf, wohingegen K63-Ketten offen konformiert sind und so z.B.
andere Proteine an das markierte Protein koppeln können (Datta et al, 2009). Die
in vivo Ergebnisse machen aber klar, dass USP4 die Regulation im Zellzyklus
nicht als Gegenspieler einer Degradationsubiquitinierung durchführen muss,
sondern auch in regulatorische Systeme eingebunden sein kann.
5.3. Funktionen von USP4 im Zellzyklus
In siRNA Experimenten zeigte sich, dass USP4 an der Regulation des Spindelcheckpunktes beteiligt ist. Der Spindelcheckpunkt wird durch die Aktivität der E3Ligase APC/C vermittelt. Wir wollten also herausfinden, ob USP4 ein Substrat
von APC/C ist und auf diese Weise an der Regulation des Checkpunktes beteiligt
ist. Wir untersuchten die Ubiquitinierung von USP4 als auch anderer mit USP4
assoziierter Proteine in vitro. USP4 und seine Partner sind keine Substrate von
APC/C (Abb. 4-11 A). Wir mussten also weitere Möglichkeiten erwägen, welche
Funktion USP4 in der Zelle hat.
Spannend war nun, dass die von uns gefundenen Bindungspartner von USP4
Teile des Spliceosoms darstellen. Für das katalytisch inaktive DUB USP39 gibt
es bereits Daten, dass es mit dem Spliceosom interagiert und den Zellzyklus
über korrekt gesplicete mRNA von Aurora B reguliert (van Leuken et al, 2008).
Darüber hinaus gibt es auch Hinweise dafür, dass Ubiquitin eine Rolle in der
Regulation des Spicings spielt. Ubiquitin wurde zusammen mit Komponenten des
Spliceosoms aufgereinigt. Splicingfaktoren wurden ubiquitiniert vorgefunden
(Bellare et al, 2008). Außerdem besitzt der Splicingfaktor PRP19 eine UboxDomäne, was ihn als potentielles E3-Enzym denkbar macht.
67
Um herauszufinden, ob USP4 eine Funktion auf das Spliceosom ausübt interessierte uns, ob USP4 Komponenten des Spliceosoms deubiquitiniert. Wir überexprimierten HA-PRP3 in HeLa-Zellen und führten eine IP gegen HA durch. Auf
den Beads führten wir in vitro Deubiquitinierungsversuche durch. Wir konnten
zeigen, dass USP4 Proteine deubiquitiniert, die in dieser IP aufgereinigt wurden
(Abb. 4-8 A). Dabei handelt es sich sicher um PRP3 und wahrscheinlich auch um
weitere Proteine des Spliceosoms. Die Deubiquitinierung fand auch ohne
Zugabe von SART3 statt, das den Kontakt zwischen USP4 und PRP3 herstellt.
Auch dies lässt vermuten, dass abgesehen von PRP3 in der IP auch andere
Proteine (in jedem Fall SART3) aufgereinigt wurden. Die Arbeitsgruppe von Eric
Sontheimer konnte zeigen, dass auch PRPF8, ein weiterer Splicingfaktor (U5
snRNP), ubiquitiniert wird (Bellare et al, 2008). Es könnte also sein, dass auch
PRPF8 durch USP4 deubiquitiniert wird.
Eun Joo Song führte in vivo den Beweis der Deubiquitinierung von PRP3 durch
USP4 durch. USP4, eine katalytisch inaktive Variante von USP4 und HA-PRP3
wurden in HeLa-Zellen alternierend überexprimiert, und die Zellextrakte wurden
mit Western Blot gegen HA analysiert. Hier zeigte sich, dass PRP3 in HeLaZellen ubiquitiniert wird und dass USP4 PRP3 spezifisch deubiquitiniert (Song et
al, 2010). Während meiner Zeit im Labor von Michael Rape an der UC Berkeley
hatte ich versucht, PRP3 auf die unterschiedlichsten Weisen in vitro zu ubiquitinieren, ohne dass sich das erwartete Ergebnis zeigte. Dies gelang Eun Joo
Song schließlich mit PRPF19, das mittels IP aus HeLa-Zellextrakten gewonnen
wurde. Sie konnte in vitro zeigen, dass PRP3 von PRPF19 ubiquitiniert und von
USP4 deubiquitiniert wird. Dabei katalysiert PRPF19 K63 verknüpfte Ubiquitinketten (Song et al, 2010). Dieses stimmt mit der katalytische Präferenz von USP4
für diese Kettenform überein (Diskussion s.o.).
In Hefeextrakten konnte gezeigt werden, dass Ubiquitin für die Funktion des
Spliceosoms notwendig ist. Bei Hemmung der Ubiquitinierung durch die
Ubiquitinmutante I44A erlag das Splicing in den Extrakten, und die U4/U6.U5 tri
snRNP wurden destabilisiert (Bellare et al, 2008). Es ist durchaus denkbar, dass
die Ubiquitinierung von PRP3 für die Stabilität der U4/U6.U5 tri snRNP wichtig
ist. USP4 wird durch SART3 in den Komplex eingebracht (Abb. 4-1). SART3 hat
68
die Funktion eines Recyclingfaktors für das Spliceosom (Medenbach et al, 2004).
Die nahe liegende Schlussfolgerung wäre, dass die von PRPF19 und USP4
regulierte Ubiquitinierung von PRP3 den Aufbau des Spliceosoms beeinflusst
und zum regelhaften Ablauf der Konformationsänderungen während des
Splicings beiträgt.
PRPF8 ist Teil der U5 snRNP und hat eine JAMM-Domäne, die bekanntlicherweise Ubiquitin bindet (Bellare et al, 2008). PRP3 ist Teil der U4 snRNP im
Spliceosom. Während des Splicings liegen U4 und U5 snRNPs teilweise aneinander gebunden vor. Es wäre nun denkbar, dass durch Ubiquitinierung von
PRP3 die Affinität von PRPF8 zu PRP3 verstärkt wird. Eun Joo Song konnte
Daten generieren, die dieses Konzept nahe legen (Song et al, 2010).
Mit Proteinen, die von mir aus SF9 Insektenzellen und E. coli aufgereinigt
wurden, konnte Julie Aspen, Postdoc in dem Labor von Donald Rio an der UC
Berkeley, in vitro Splicingexperimente durchführen. Sie gab USP4 zusammen mit
SART3 zu nukleären Zellextrakten und untersuchte die Aktivität des Splicings.
Dabei konnte sie zeigen, dass die Aktivität des Spliceosoms durch einen
Überschuss an USP4 und SART3 inhibiert wird (Song et al, 2010). Auch diese
Daten legen eine entscheidende Rolle von USP4 in der Regulation des Splicings
nahe.
Es ist also wahrscheinlich, dass USP4 an der Regulation des Spindelcheckpunktes über das Splicing beteiligt ist. USP4 könnte für das korrekte Splicen von
mRNAs, deren Genprodukte für den Spindelcheckpunkt wichtig sind, benötigt
werden. Shannon Werner, Postdoc in der Arbeitsgruppe von Michael Rape an
der UC Berkeley, konnte in Experimenten zeigen, dass die mRNAs von alphaTubulin und Bub1 bei Hemmung von USP4 in viel geringerer Zahl gesplicet
werden. Wenn aber das Monomer der Spindel alpha-Tubulin und das für die
Regulation des Spindelcheckpunktes wichtige Bub1 nicht adäquat hergestellt
werden kann, dann wird klar, warum das Ausschalten von USP4 zum Spindelcheckpunkt-Bypass führen kann.
69
5.4. Lokalisation von USP4
Da USP4 mit dem Spliceosom interagiert würde man eine nukleäre Lokalisation
von USP4 in den Zellen vermuten. Tatsächlich ist das Protein in verschiedenen
Zelllinien aber unterschiedlich verteilt. Während HeLa-Zellen (Zervixkarzinom)
eine rein nukleäre Lokalisation von USP4 zeigen, weisen HepG2 Zellen (Hepatozelluläres Karzinom) eine zytoplasmatische Lokalisation auf. Saos-2 (Osteosarkom) und MDA-MB-231 (Mammakarzinom) zeigen sowohl nukleäre als auch
zytoplasmatische Verteilung für USP4 (Soboleva et al, 2005). USP4, das in
HeLa-Zellen überexprimiert wurde, lokalisierte sich zytoplasmatisch (Abb. 4-10
B). Erst die Anheftung eines artifiziellen nukleären Importsignales (SV40) an
USP4 führte zum Transport von USP4 in den Nukleus. Denselben Effekt hatte
auch die Co-Überexpression von SART3 (Abb. 4-10 B.).
Es wurde berichtet, dass USP4 ein nukleäres Import- (NLS) und ein nukleäres
Exportsignal (NES) besitzt. Der nukleäre Import von USP4 sei über die Bindung
von Importin alpha/beta vermittelt (Soboleva et al, 2005). Die Bindung von
Importin alpha an die NLS sei stark, die Bindung an das gesamte Protein jedoch
ausgesprochen schwach (Soboleva et al, 2005). Die Bindung von USP4 an
Importin beta oder alpha konnten wir in vitro nicht nachweisen. Dagegen bindet
SART3 gut an Importin alpha (Abb. 4-9 C). Eine Rekrutierung von USP4 an
Importin alpha über SART3 ist möglich (Abb. 4-10 A). Auf der anderen Seite liegt
das mögliche NES (Aminosäuren 133-141) von USP4 im Bereich der Bindungsstelle zu SART3.
Es wäre also denkbar, dass SART3 für den nukleären Transport von USP4
verantwortlich ist (Abb. 5-2 A). Eventuell kommt es durch die Bindung von
SART3 an USP4 zur Maskierung der NES von USP4, was die Akkumulation von
USP4 im Zellkern ermöglichen würde. Die Unterschiede in der zellulären
Verteilung von USP4 bei den einzelnen Zelllinien könnten sich eventuell aus der
unterschiedlichen Expressionsrate von SART3 in diesen Zellen erklären. Auch
die Aktivität der Nemo like Kinase soll zur nukleären Lokalisation von USP4
beitragen (Zhao et al, 2009). Es gibt bis jetzt keine Daten, die dieses Phänomen
erklären könnten.
70
Abbildung 5-2: Modellzeichnung des angenommenen nukleären Transportes von USP4: A.
USP4 bindet im Zytosol an SART3, das über seine Bindung an Importin alpha in den Zellkern
transportiert wird. Hier kann USP4 an SART3 gebunden seine Funktion im Splicing wahrnehmen.
Es wurde gezeigt, dass USP4 in unterschiedlichen Tumorentitäten über- und
unterexprimiert vorliegt. Bei einigen dieser Erkrankungen werden Spindelgifte wie
Taxane therapeutisch eingesetzt. Es wäre sehr interessant zu erfahren, ob das
Ansprechen auf die Therapie mit der Expression von USP4 korreliert. Nach
unserem Konzept müssten Patienten mit deletiertem USP4 schlecht auf Chemotherapie mit Taxanen ansprechen, da sie den Spindelcheckpunkt umgehen
können. Diesen Patienten könnte man eine nebenwirkungsreiche Therapie
ersparen und anderen Patienten eine molekularbiologisch begründete, zielgerichtete Therapie anbieten.
Darüber hinaus sollten die genauen Auswirkungen der Ubiquitinierung und
Deubiquitinierung von PRP3 und deren Bedeutung für den Ablauf des Splicings
untersucht werden. Die Suche nach neuen Substraten von USP4 muss auch
weiterhin fortgesetzt werden.
71
6. Zusammenfassung
In einem siRNA-Screen gegen deubiquitinierende Enzyme konnten Michael
Rape und Mitarbeiter nachweisen, dass USP4 an der Regulation des Zellzyklus
beteiligt ist. Zellen, die mit Spindelgiften behandelt worden waren, verloren bei
Hemmung von USP4 die Fähigkeit, den Spindelcheckpunkt zu aktivieren.
Wir konnten nachweisen, dass USP4 allein und ohne Bindungspartner eine
deubiquitinierende Aktivität aufweist. USP4 verdaut als Protease K48- und K63Ubiquitinketten, wobei eine Präferenz für K63-Ubiquitinverbindungen besteht. Die
USP4-Bindungspartner TRIM21 und SART3 haben keinen Einfluss auf diese
katalytische Aktivität.
USP4 bindet an SART3, das ein Protein des Spliceosoms ist. SART3 bindet an
Importin alpha und vermittelt so den nukleären Transport von USP4. Über
SART3 stellt USP4 auch die Verbindung zu PRP3 her. PRP3 ist ein Substrat von
USP4. Es ist sehr wahrscheinlich, dass die Deubiquitinierung von PRP3 und
anderen Proteinen des Spliceosoms die komplexen Proteininteraktionen
während des Splicings beeinflusst.
Unser Erklärungsmodell sagt aus, dass eine siRNA Hemmung von USP4 zu
einer Dysregulation des Splicings führt. Die daraus folgenden geringeren
Konzentrationen korrekt gespliceter mRNAs und entsprechender Genprodukte
könnten im Verlust des Spindelcheckpunktes resultieren. Experimente von
Shannon Werner unterstützen diese These (Song et al, 2010).
Es ist also wahrscheinlich, dass USP4 das Ansprechen von Tumoren auf eine
Therapie mit Spindelgifte verändert. Die klinische Relevanz dieses Effektes sollte
erforscht werden. Die Ergebnisse dieser Dissertation sind teilweise in die
Publikation „The Prp19 complex and the Usp4Sart3 deubiquitinating enzyme
control reversible ubiquitination at the spliceosome“ in der Zeitschrift Genes and
Development eingeflossen.
72
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8. Danksagung
Mein herzlicher Dank richtet sich an Herrn Professor Dr. Martin Werner für die
Betreuung der Doktorarbeit an der Universität Freiburg. Bei Herrn Professor Dr.
Ralph Wäsch bedanke ich mich herzlich für die Übernahme des Zweitgutachtens
dieser Doktorarbeit.
Besonders möchte ich mich bei Herrn Professor Dr. Michael Rape bedanken,
dass er mir die Möglichkeit gegeben hat, in seiner Arbeitsgruppe an der
University of California Berkeley so viel zu lernen. Seine Ratschläge, Ideen und
sein Verständnis haben mir bei der Arbeit sehr geholfen. Den Mitarbeitern in dem
Labor möchte ich für Ihre unschätzbare Unterstützung danken. Adam Williamson,
Herrmann-Josef Meyer, Kate Wickliffe, Ling Song, Lingyan Jin, Sudeep
Banerjee, Xining Zhu und vor allem Eun Joo Song haben die Forschung
überhaupt erst möglich gemacht.
Sehr herzlich möchte ich mich auch bei Frau PD Dr. Silke Lassmann für Ihre
Geduld und große Hilfe in vielen Schritten der Promotion bedanken. Den
Mitarbeitern im Labor der Pathologie Freiburg, Anja Schöpflin und Corinna Herz,
bin ich ebenfalls zu Dank verpflichtet.
Des Weiteren möchte ich mich noch bei der Studienstiftung des deutschen
Volkes bedanken, ohne deren großzügige finanzielle und ideelle Unterstützung
der Aufenthalt in Berkeley, CA, nicht möglich gewesen wäre.
Meiner Familie danke ich für die erfahrene Unterstützung und
Motivationsspende.
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