Dissertation fertig2 - TiHo Bibliothek elib

Aus dem Institut für Parasitologie
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Serologische Untersuchungen zur Toxoplasmose
nicht humaner Primaten
INAUGURAL-DISSERTATION
Zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Anna Katharina Brandt
aus Cuxhaven
Hannover 2006
Wissenschaftliche Betreuung: Apl.-Prof. Dr. Astrid M. Tenter
1. Gutachterin:
Apl.-Prof. Dr. Astrid M. Tenter
2. Gutachter:
Prof. Dr. F.-J. Kaup
Tag der mündlichen Prüfung: 7. Juni 2006
meiner Familie
INHALTSVERZEICHNIS
1.
EINLEITUNG
11
2.
LITERATURÜBERSICHT
12
3.
2.1.
Der Parasit Toxoplasma gondii
12
2.2.
Historischer Überblick
13
2.3.
Biologie von T. gondii
2.3.1. Entwicklungszyklus
2.3.2. Wirtsspektrum
2.3.3. Übertragungswege von T. gondii und Epidemiologie der Toxoplasmose
14
14
18
18
2.4.
21
21
23
Risikogruppen
2.4.1. Risikogruppen innerhalb der Humanmedizin
2.4.2. Risikogruppen innerhalb der Veterinärmedizin
2.5.
Infektionen mit T. gondii bei nicht humanen Primaten
2.5.1. Dokumentierte T.-gondii-Infektionen bei verschiedenen Primatenspezies
2.5.2. Seropositivität
2.5.2.1. Serologische Untersuchungen an Altweltaffen im natürlichen Habitat
2.5.2.2. Serologische Untersuchungen an Neuweltaffen im natürlichen Habitat
2.5.2.3. Serologische Untersuchungen an nicht humanen Primaten in Gefangenschaft
2.5.3. Übertragungswege und Epidemiologie bei nicht humanen Primaten
2.5.4. Fallberichte
2.5.4.1. Klinische Toxoplasmosen bei Altweltaffen
2.5.5. Klinische Symptome und Verlauf der Erkrankung
2.5.6. Pathologie und Pathogenese
2.5.7. Therapie
25
25
31
31
34
35
40
43
45
51
55
59
2.6.
Diagnostik von T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen Primaten
2.6.1. Indirekte Nachweismethoden
2.6.1.1. SFT
2.6.1.2. IFAT
2.6.1.3. Agglutinationstests
2.6.1.4. KBR
2.6.1.5. ELISA
2.6.1.6. Immunoblot
2.6.2. Sonstige Nachweismethoden
2.6.2.1. Mikroskopischer und immunhistologischer Nachweis im Gewebe
2.6.2.2. PCR
2.6.2.3. Biologische Verfahren
62
63
63
64
65
66
67
68
68
68
69
70
MATERIAL UND METHODEN
71
4.
3.1.
Material
3.1.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien
3.1.2. Reagenzien und Lösungen
3.1.3. Seren von nicht humanen Primaten
3.1.4. Toxoplasma gondii
3.1.5. Mäuse
71
71
71
71
74
75
3.2.
Methoden
3.2.1. Serumgewinnung und -lagerung
3.2.2. SFT
3.2.2.1. Untersuchungsgut
3.2.2.2. Antigengewinnung für den SFT
3.2.2.3. Aktivatorserum
3.2.2.4. Testdurchführung
3.2.2.4.1. Vorversuch
3.2.2.4.2. Hauptversuch
3.2.2.4.3. Auswertung
3.2.2.5. Ergebnisse aus dem SFT
3.2.3. ELISA
3.2.3.1. Kontrollseren zur Optimierung der ELISAs
3.2.3.2. Antigengewinnung für den ELISA
3.2.3.3. Bestimmung der Proteinkonzentration des Tachyzoitenantigens
3.2.3.4. Konjugate
3.2.3.5. IgG-ELISA
3.2.3.5.1. Testdurchführung
3.2.3.5.2. Festlegung der Grenzwerte für den IgG-ELISA
3.2.3.5.3. Festlegung der Titer und Auswertung des IgG-ELISAs
3.2.3.6. IgG-Aviditäts-ELISA
3.2.3.7. IgM-ELISA
3.2.3.8. Optimierung der ELISA-Formate
3.2.4. Mausinokulation
3.2.4.1. Aufbereitung des Gehirns
3.2.4.2. Infektion der Mäuse
3.2.4.3. Untersuchung des Mäuseserums im SFT
3.2.5. IFAT
3.2.5.1. Untersuchungsgut
3.2.5.2. Antigengewinnung für den IFAT
3.2.5.3. Konjugat
3.2.5.4. Kontrollseren
3.2.5.5. Testdurchführung
3.2.6. Histologische Untersuchung von Gewebeproben
75
75
76
76
76
77
77
77
78
78
79
81
81
82
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93
93
93
94
94
94
94
95
95
96
98
ERGEBNISSE
99
4.1.
Untersuchung von Serumproben nicht humaner Primaten im IgM-ELISA auf Antikörper
gegen T. gondii
99
4.2.
Untersuchung von Serumproben nicht humaner Primaten im IgG-ELISA auf Antikörper
gegen T. gondii und Vergleich mit den im SFT ermittelten Ergebnissen
99
4.2.1. Weißkopfmakis
100
4.2.2. Kattas
106
4.2.3. Totenkopfaffen
107
4.2.4. Andere Neuweltaffen
110
4.2.5. Rhesusaffen
111
4.3.
Untersuchung von Serumproben nicht humaner Primaten im IgG-Aviditäts-ELISA zur
Bestimmung des Infektionsstadiums der T.-gondii-Infektionen
112
4.3.1. Weißkopfmakis
113
4.3.2. Kattas
114
4.3.3. Totenkopfaffen
114
4.3.4. Andere Neuweltaffen
115
4.3.5. Rhesusaffen
115
5.
4.4.
Untersuchung der Serumprobe der Maus im SFT auf Antikörper gegen T. gondii
4.5.
Untersuchung von Serumproben der Mäuse im IFAT auf Antikörper gegen T. gondii 116
4.6.
Histologische Untersuchung von Gewebeproben eines verstorbenen Kattas
117
4.7.
Reproduzierbarkeit des IgG-ELISAs
118
DISKUSSION DER ERGEBNISSE
116
119
5.1.
Problematik von T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen Primaten und Zielsetzung
dieser Dissertation
119
5.2.
Untersuchung von Serumproben nicht humaner Primaten im SFT auf Antikörper gegen T.
gondii
122
5.3.
Untersuchung von Serumproben nicht humaner Primaten im ELISA auf Antikörper gegen
T. gondii
123
5.3.1. IgM-ELISA
123
5.3.2. IgG-ELISA
124
5.3.2.1. Weißkopfmakis
125
5.3.2.2. Kattas
126
5.3.2.3. Totenkopfaffen sowie weitere Neuweltaffen
126
5.3.2.4. Rhesusaffen
127
5.3.2.5. Prädispositionen im Zusammenhang mit T.-gondii-Infektionen
128
5.3.2.6. Festlegung der Grenzwerte für den IgG-ELISA
128
5.3.2.7. Reproduzierbarkeit des IgG-ELISAs
129
5.3.2.8. Abschließende Bewertung des IgG-ELISAs
129
5.3.3. IgG-Aviditäts-ELISA
130
5.4.
Untersuchung von Serumproben der Mäuse im IFAT und SFT auf Antikörper gegen T.
gondii
132
5.5.
Histologische Untersuchung von Gewebeproben des Kattas und der Maus
132
5.6.
Ausblick
133
6.
ZUSAMMENFASSUNG
135
7.
SUMMARY
136
8.
LITERATURVERZEICHNIS
137
9.
ANHANG
157
9.1.
Chemikalien und andere Reagenzien
157
9.2.
Lösungen
158
9.3.
Ergebnisse aus dem IgG-Aviditäts-ELISA
9.3.1. Weißkopfmakis
9.3.2. Kattas
9.3.3. Totenkopfaffen
9.3.4. Andere Neuweltaffen
9.3.5. Rhesusaffen
161
161
164
164
166
166
Abkürzungsverzeichnis
Abb.
BSA
°C
CITES
DAT
DEAE
DNA
ELISA
Fc
γ
g
H.&E.
H+L
IFAT
IgG
IgM
i. p.
IU
KBR
Kgw
LAT
mind.
ml
nm
µg
µl
O. D.
o. g.
PBS
PCR
p. i.
s. c.
SD
SFT
Abbildung
bovines Serumalbumin
Grad Celsius
Convention on International Trade in Endangered Species on
Wild Fauna and Flora (Washingtoner Artenschutzabkommen)
Direktagglutinationstest
Diethylaminoethyl
Desoxyribonukleinsäure
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
Fc-Fragment eines Immunglobulins
Gamma
Gravidationskonstante
Hämatoxylin und Eosin
schwere und leichte Ketten eines Immunglobulins
indirekter Immunfluoreszenzantikörpertest
Immunglobulin G
Immunglobulin M
intraperitoneal
international unit (internationale Einheit, I.E.)
Komplementbindungsreaktion
Körpergewicht
Latexagglutinationstest
mindestens
Milliliter
Nanometer
Mikrogramm
Mikroliter
optische Dichte
oben genannt
phosphate buffered saline (phophatgepufferte Kochsalzlösung)
polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion)
post infectionem
subcutan
Standardabweichung
Sabin-Feldman-Test
1. Einleitung
11
1. EINLEITUNG
Die Toxoplasmose ist eine parasitäre Zoonose und wird durch den Erreger Toxoplasma gondii
hervorgerufen. T. gondii gehört zu den so genannten zystenbildenden Kokzidien und besitzt einen
fakultativ heteroxenen Lebenszyklus. Während als Endwirte ausschließlich Angehörige der Feliden
dienen, zählen zu den Zwischenwirten des Parasiten vermutlich alle warmblütigen Lebewesen. Eine
Infektion mit T. gondii verläuft bei immunkompetenten Individuen in der Regel latent. Es gibt
jedoch Risikogruppen, bei denen es zu schwerwiegenden Erkrankungen durch T.-gondiiInfektionen kommen kann. Dazu zählen in der Humanmedizin schwangere Frauen sowie
immundefiziente Patienten und in der Veterinärmedizin einige hochempfängliche Spezies. Zu
letzteren gehören auch die nicht humanen Primaten, bei denen akute disseminierte Toxoplasmosen
beobachtet werden, die meistens mit dem Tod der Tiere enden. In Zoologischen Gärten verursacht
der Erreger immer wieder Tierverluste und Störungen innerhalb der Zuchtprogramme bei den
artgeschützten Tieren.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen serologischen Test zu etablieren, mit dem ein breites
Spektrum von Seren verschiedener Arten nicht humaner Primaten auf Antikörper gegen T. gondii
untersucht werden kann. Dieser Test soll es möglich machen, T.-gondii-Infektionen bei diesen
Spezies schnell und kostengünstig auch an lebenden Tieren zu diagnostizieren, da die Diagnose
bisher häufig erst bei der Sektion gestellt wird. Zudem soll durch diesen Test ermöglicht werden,
epidemiologische Untersuchungen in zoologischen Gärten durchzuführen und dadurch frühzeitig
festzustellen, ob der Parasit in den entsprechenden Beständen vorkommt. So können präventive
Maßnahmen ergriffen werden, um das Risiko eines seuchenhaften Ausbruchs der Toxoplasmose zu
minimieren.
12
2. Literaturübersicht
2. LITERATURÜBERSICHT
2.1. Der Parasit Toxoplasma gondii
Die Toxoplasmose ist eine parasitäre Zoonose mit einer weltweiten Verbreitung. Der Erreger,
Toxoplasma gondii (T. gondii), weist eine zum Teil hohe Prävalenz sowohl in der menschlichen
Bevölkerung als auch im Tierreich auf. Eine Infektion mit T. gondii verläuft bei
immunkompetenten Individuen in der Regel latent oder mit unspezifischen klinischen Symptomen
(EVANS 1992). Es gibt jedoch Risikogruppen (siehe Kap. 2.4.), bei denen der Parasit schwere
Erkrankungen hervorrufen kann, die nicht selten einen letalen Verlauf nehmen. Sowohl veterinärals auch humanmedizinisch ist der Parasit insbesondere bei der vertikalen Übertragung auf den
ungeborenen Fetus bedeutsam. Hier spielt T. gondii z. B. als Aborterreger bei Schafen oder als
Ursache von geistigen und körperlichen Behinderungen bei Menschen eine wichtige Rolle.
T. gondii gehört zu den so genannten zystenbildenden Kokzidien. Die Coccidea zählen zu den
Protozoen und stellen die artenreichste Klasse innerhalb des Unterstammes der Apicomplexa dar
(LEVINE 1988; LEE et al. 2000). Charakteristisch für diesen Unterstamm ist das Vorhandensein
eines apikalen Komplexes am Vorderende der invasiven Stadien (LEVINE 1985). Der
Apikalkomplex wird durch eine Reihe von Organellen gebildet, die am Eindringen des Parasiten in
die Wirtszelle beteiligt sind. Dazu zählen Polringe, Rhoptrien, Mikronemen, Konoid, subpellikuläre
Mikrotubuli sowie ein oder mehrere Mikroporen (LEVINE 1988). Weitere Charakteristika der
Apicomplexa
sind
ein
Generationswechsel
mit
geschlechtlicher
(Gamogonie)
und
ungeschlechtlicher Vielfachteilung (Merogonie) sowie die ausschließlich parasitäre Lebensweise
aller Arten (LEVINE 1985). Die Kokzidien zeichnen sich darüber hinaus durch die intrazelluläre
Lokalisation ihrer Entwicklungsstadien sowie durch einen Lebenszyklus aus, der in Sporogonie,
Merogonie und Gamogonie gegliedert ist und mit der Bildung von Oozysten endet (LEVINE 1988).
Der Entwicklungszyklus von T. gondii ist fakultativ heteroxen. Endwirte sind ausschließlich
Feliden, in denen die geschlechtliche Entwicklung des Parasiten mit der Bildung von Oozysten
erfolgt. Wie bei anderen Gattungen der Sarcocystidae, zu denen neben Toxoplasma auch Isospora,
Sarcocystis, Hammondia, Neospora und Besnoitia gehören (LEVINE 1988; LEE et al. 2000), sind
die sporulierten Oozysten vom so genannten Isospora-Typ und enthalten zwei Sporozysten mit je
2. Literaturübersicht
13
vier Sporozoiten. Zwischenwirte von T. gondii sind vermutlich alle warmblütigen Lebewesen
einschließlich des Menschen (DUBEY u. BEATTIE 1988). In den Zwischenwirten vollzieht der
Parasit die ungeschlechtliche Entwicklung, wobei eine große Vielfalt an kernhaltigen
Wirtszelltypen befallen wird und es zur Bildung von Gewebezysten kommt.
2.2. Historischer Überblick
Die erste umfassende Beschreibung von T.-gondii-Merozoiten erfolgte 1908 von NICOLLE u.
MANCEAUX (1908). Sie konnten den Erreger in Milz, Leber und Blut eines nordafrikanischen
Nagetiers, dem Gondi (Ctenodactylus gondi), nachweisen und bezeichneten ihn zunächst als
Leishmania gondii. Da sich diese Einordnung jedoch als falsch erwies, führten sie ein Jahr später
die Gattung Toxoplasma (nach dem griechischen Wort toxon = Bogen) ein und nannten die Art T.
gondii (NICOLLE u. MANCEAUX 1909). Während der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts wurden
mehrere Arten von T. gondii in der Regel nach den Wirtsspezies, in denen sie entdeckt wurden,
benannt. Erst 1939 wurde von SABIN (1939) durch biologische und immunologische Vergleiche
der Beweis erbracht, dass die zahlreichen Isolate tierischen und menschlichen Ursprungs alle zur
Art T. gondii gehörten.
Die Übertragungswege des Parasiten blieben lange ungeklärt. LEVADITI et al. (1928) beschrieben
erstmals eine Gewebezyste als Dauerstadium von T. gondii in den Zwischenwirten Kaninchen und
Maus. Mitte der 1950er Jahre wurden Gewebezysten in Schweinen nachgewiesen, woraufhin
erstmals ein möglicher Zusammenhang zwischen dem Auftreten einer Toxoplasmose beim
Menschen und der Aufnahme von zystenhaltigem Fleisch gesehen wurde. In nachfolgenden
Experimenten
erwiesen
sich
die
Gewebezysten
im
Vergleich
mit
Tachyzoiten
als
widerstandsfähiger gegenüber Temperatureinflüssen und proteolytischen Enzymen. Dies führte zu
der Hypothese, dass die Gewebezysten in der Epidemiologie der Toxoplasmose eine wichtige Rolle
spielen. Der Beweis für diese Hypothese wurde schließlich 1965 erbracht, als die horizontale
Übertragung von T. gondii auf den Menschen durch unvollständig gekochtes Fleisch nachgewiesen
wurde (referiert in ASHBURN 1992).
14
2. Literaturübersicht
Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen von T. gondii wurde Mitte der 1960er Jahre der
Beweis für die Zugehörigkeit des Parasiten zu den Kokzidien erbracht (SCHOLTYSECK u.
PIEKARSKI 1965). T. gondii wurde daraufhin dem Isospora-bigemina-Komplex zugeordnet. Der
heteroxene Lebenszyklus von T. gondii wurde erst Ende der 1960er Jahre aufgeklärt, nachdem man
infektiöse Stadien des Parasiten in Katzenkot fand. Diese konnten bei Ingestion eine T.-gondiiInfektion in Zwischenwirten hervorrufen. Die Erkenntnisse über den Lebenszyklus von T. gondii
wurden 1970 dadurch vervollständigt, dass sexuelle Entwicklungsformen des Parasiten im
Dünndarm von Katzen nachgewiesen wurden (referiert in TENTER et al. 2000).
Generell wurde T. gondii in den vergangenen drei Jahrzehnten trotz seines breiten Wirtsspektrums
als die einzige Art der Gattung Toxoplasma angesehen (referiert in TENTER et al. 2000). Es gibt
jedoch zahlreiche verschiedene Stämme von T. gondii, die durch den Grad ihrer Virulenz
charakterisiert werden (EVANS 1992). In neuerer Zeit wurde zudem der Beweis erbracht, dass es
mehrere klonale Linien von T. gondii gibt (JOHNSON 1997,1999).
2.3. Biologie von T. gondii
2.3.1. Entwicklungszyklus
Abb. 1: Entwicklungszyklus von T. gondii
2. Literaturübersicht
15
Eine infizierte Katze scheidet während der Patenz mit ihrem Kot unsporulierte Oozysten von T.
gondii aus, welche anschließend in der Umwelt sporulieren und dadurch infektiös werden. Während
der Sporulation (syn. Sporogonie) entstehen aus dem in der Oozyste enthaltenen Sporonten zwei
Sporoblasten, aus denen sich zwei Sporozysten entwickeln. In jeder dieser beiden Sporozysten
entstehen vier Sporozoiten. Kommt es zur oralen Aufnahme der sporulierten Oozysten durch einen
Zwischenwirt, werden die Oozystenwand und die Sporozystenhülle durch proteolytische
Verdauungssäfte aufgelöst und die Sporozoiten freigesetzt. Diese durchdringen daraufhin das
Darmepithel und werden hämatogen und lymphogen im gesamten Körper verteilt (JACKSON u.
HUTCHISON 1989). Anschließend durchläuft T. gondii im Zwischenwirt eine zweiphasige
ungeschlechtliche Vielfachteilung. In der ersten Phase teilt sich der Parasit sehr rasch in
verschiedenen Wirtszellen durch wiederholte Endodyogenien. Die Endodyogenie stellt die
einfachste Form der Merogonie dar, bei der aus einer Mutterzelle durch Zweiteilung jeweils zwei
Tochterzellen entstehen. Die im Verlauf dieser ersten Entwicklungsphase entstehenden Merozoiten
werden als Tachyzoiten (syn. Endozoiten) bezeichnet. Eine Wirtszelle füllt sich durch wiederholte
Teilungsvorgänge mit maximal 32 Tachyzoiten an (FRENKEL 2000). Anschließend geht sie
zugrunde, die Tachyzoiten werden freigesetzt und befallen neue Wirtszellen. Dabei kommt es
regelmäßig zu einer Parasitämie. Die mit Tachyzoiten angefüllten Wirtszellen werden auch als
Pseudozysten bezeichnet, bei denen sich der Parasit im Gegensatz zu echten Zysten innerhalb einer
parasitophoren Vakuole befindet. Diese ist flüssigkeitsgefüllt und wird durch eine Membran, die
aus der ehemaligen strukturell stark veränderten Wirtszellmembran besteht, zum Zytoplasma hin
abgeschlossen. Dadurch wird der Parasit vor einer Zerstörung durch die Lysosomen der Wirtszelle
geschützt (ASHBURN 1992).
Mit dem Einsetzen der Antikörperbildung sowie der Ausbildung einer zellvermittelten Immunität
durch den Zwischenwirt vollzieht T. gondii einen Wechsel des Entwicklungsstadiums (FRENKEL
2000). Anstelle von Tachyzoiten entstehen in der zweiten Entwicklungsphase durch fortgesetzte
Endodyogenien, die jetzt jedoch langsamer ablaufen, innerhalb von Gewebezysten die Bradyzoiten
(syn. Zystozoiten). Die Gewebezysten weisen eine hohe Affinität zu neuralen und muskulären
Geweben wie Gehirn, Auge, Skelett- und Herzmuskulatur auf, können jedoch auch in viszeralen
Organen wie Lunge, Leber und Niere beobachtet werden (DUBEY 1993, 1998c; DUBEY et al.
16
2. Literaturübersicht
1998a). Sie liegen dabei meist reaktionslos im Wirtsgewebe und der Parasit kann auf diese Weise in
einigen Wirtsspezies ein Leben lang persistieren (TENTER et al. 2000). Unter bestimmten
Bedingungen können diese latenten T.-gondii-Infektionen jedoch reaktiviert werden, z. B. durch
eine Immunsuppression.
Kommt es zu einer oralen Aufnahme von zystenhaltigem Fleisch durch einen Endwirt, so findet in
dessen Darmepithel die sexuelle Entwicklung von T. gondii statt, die mit der Bildung von Oozysten
endet (FRENKEL et al. 1970). Durch proteolytische Verdauungssäfte wird zuerst die Wand der T.gondii-Zysten aufgelöst. Die dadurch freigesetzten Bradyzoiten dringen in Epithelzellen der
Dünndarmzotten ein und vermehren sich zunächst ungeschlechtlich durch eine initiale
Endodyogenie und anschließend durch wiederholte Endopolygenien. Die Endopolygenie stellt eine
Form der Merogonie dar, bei der aus einer Mutterzelle mehrere Tochterindividuen entstehen. In der
Mutterzelle, dem Meronten, entwickelt sich ein polyploider, gelappter Zellkern, um dessen
Ausstülpungen die Merozoitenanlagen angeordnet sind. Diese inkorporieren während ihrer
Entwicklung den Inhalt der Mutterzelle, von der lediglich die Pellikula und ein Restkörper übrig
bleiben. Durch Ruptur der Mutterzellwand werden die Merozoiten frei und befallen weitere
Epithelzellen
(KRAHENBUHL
u.
REMINGTON
1982).
Nach
Bildung
mehrerer
Merontengenerationen entwickeln sich schließlich ab dem 3. Tag p. i. einige Merozoiten zu Makround Mikrogamonten. Die Gamonten (syn. Gametozyten) reifen in den Dünndarmepithelien zu
weiblichen Makro- oder männlichen Mikrogameten heran. Dieser Vorgang wird als Gamogonie
bezeichnet und stellt die geschlechtliche Entwicklungsphase von T. gondii dar. Die Mikrogameten
sind begeißelt und bewegen sich aktiv zu den sessilen Makrogameten, um diese zu befruchten. Die
dabei entstehenden Zygoten werden von einer festen, mehrschichtigen Wand umschlossen und
entwickeln sich so zu Oozysten. Durch Ruptur der Epithelzellen werden die Oozysten ins
Darmlumen abgegeben und mit dem Kot ausgeschieden.
Neben der geschlechtlichen Entwicklung im Darmepithel der Katze penetrieren in der Regel auch
einige Parasiten die Lamina propria des Dünndarms und vermehren sich in extraintestinalen
Organen. Dabei kommt es wie bei den Zwischenwirten zu einer zweiphasigen ungeschlechtlichen
Vermehrung mit der Bildung von Tachyzoiten und Gewebezysten (KRAHENBUHL u.
REMINGTON 1982).
2. Literaturübersicht
17
Die Dauer von Präpatenz und Patenz ist abhängig von der Art des aufgenommenen infektiösen
Stadiums. Bei fast allen Katzen, die sich bei einer Primärinfektion mit Gewebezysten infizieren,
kommt es nach einer Präpatenz von 3 bis 10 Tagen zu einer Ausscheidung von Oozysten mit dem
Kot. Die Patenz hält dann bis zu 20 Tage an (referiert in TENTER et al. 2000). Hingegen scheiden
etwa ein Drittel der Katzen, die sich bei einer Primärinfektion mit Oozysten infizieren, erst nach 18
bis 49 Tagen und nur bis zu 10 Tage lang Oozysten aus (FREYRE et al. 1989; DUBEY 1996). Bei
dem überwiegenden Teil der auf diese Weise infizierten Katzen unterbleibt die Patenz sogar ganz.
Die gegenüber einer Infektion mit Gewebezysten verlängerte Präpatenz ist dadurch zu erklären,
dass die Sporozoiten zunächst in extraintestinale Organe eindringen. Die Katze dient T. gondii
hierbei zunächst als Zwischenwirt und es erfolgt dementsprechend zunächst die ungeschlechtliche
Entwicklung. Die Gamogonie im Darm findet erst im Anschluss daran statt. Die Anzahl der dabei
ausgeschiedenen Oozysten ist deutlich niedriger als nach einer Infektion durch Gewebezysten
(DUBEY u. FRENKEL 1976).
Experimentell konnten T.-gondii-Infektionen bei Katzen auch durch die orale Verabreichung einer
großen Anzahl an Tachyzoiten (≥1000) induziert werden. Dabei kam es nach 15-19 Tagen zu einer
Oozystenausscheidung, die bis zu 7 Tage anhielt (DUBEY 1998b). Die Katzen dienten T. gondii
hier ebenfalls erst als Zwischen- und anschließend als Endwirt.
Zu einer Ausscheidung von Oozysten kommt es normalerweise nur nach einer Primärinfektion.
Eine zweite Patenz konnte jedoch experimentell bei Katzen erzeugt werden, die nach der
Erstinfektion 6 Jahre lang isoliert gehalten und anschließend erneut infiziert wurden (DUBEY 1995;
DUBEY et al. 1995). Dies lässt sich damit erklären, dass die Immunität, die durch eine T.-gondiiInfektion induziert wird, nicht das ganze Leben der Katze lang anhält, wenn eine Boosterung des
Antikörpertiters durch erneuten Kontakt mit dem Parasiten unterbleibt. Eine zweite Ausscheidung
konnte auch durch die Reaktivierung einer chronischen Infektion erzeugt werden. Dies gelang
sowohl durch eine Superinfektion mit Isospora sp. als auch durch die Applikation von
immunsupprimierenden Medikamenten (referiert in JACKSON u. HUTCHISON 1989). Ob und
unter welchen Umständen es unter natürlichen Bedingungen zum so genannten reshedding von
Oozysten kommt, ist bislang unbekannt (TENTER et al. 2000).
18
2. Literaturübersicht
2.3.2. Wirtsspektrum
T. gondii besitzt ein sehr breites Zwischenwirtsspektrum, das vermutlich alle warmblütigen
Lebewesen, also Vögel und Säugetiere einschließlich des Menschen, umfasst (DUBEY u.
BEATTIE 1988). Endwirte sind in Mitteleuropa im Wesentlichen nur Hauskatzen. Die
Ausscheidung von Oozysten wurde jedoch auch bei wenigstens 17 verschiedenen wilden Feliden
beschrieben. Dazu zählen laut LUKESOVA u. LITERAK (1998) die Europäische Wildkatze (Felis
silvestris), die Falbkatze (F. lybica), der Manul (F. manul), die Pampaskatze (F. colocolo), der
Rotluchs (F. rufus), die Amurkatze (F. euptilurus) die Bengalkatze (F. bengalensis), die
Iriomotekatze (F. iriomotensis), der Jaguarundi (F. yagouaroundi), der Ozelot (Leopardus
pardalis), die Salzkatze (Oncifelis geoffroyi), der Puma (Puma concolor), der Tiger (Panthera
tigris), der Leopard (P. pardus), der Jaguar (P. onca), der Löwe (P. leo) und der Gepard (Acinonyx
jubatus).
2.3.3. Übertragungswege von T. gondii und Epidemiologie der Toxoplasmose
Im Entwicklungszyklus von T. gondii gibt es drei infektiöse Stadien: die Tachyzoiten, die in den
Gewebezysten enthaltenen Bradyzoiten und die in den sporulierten Oozysten enthaltenden
Sporozoiten. Alle drei Stadien sind sowohl für die Zwischen- als auch für die Endwirte infektiös.
Eine horizontale Infektion mit T. gondii kann entweder durch die Ingestion von Gewebezysten beim
Verzehr von rohem Fleisch oder Innereien oder durch die orale Aufnahme von sporulierten
Oozysten erfolgen. Eine weitere Übertragungsmöglichkeit besteht in der vertikalen Infektion. Dabei
werden Tachyzoiten transplazentar und bei einigen Wirtsspezies auch über die Milch von der
Mutter auf die Nachkommen übertragen (referiert in TENTER et al 2000).
Die mit dem Katzenkot ausgeschiedenen Oozysten sind die Hauptansteckungsquelle für herbivore
Zwischenwirte. Unter geeigneten Umweltbedingungen sporulieren sie innerhalb von 1 bis 5 Tagen
und werden dadurch infektiös (DUBEY 1977). Zwar werden sie in der Regel nur nach einer
Primärinfektion ausgeschieden, eine einzige Katze kann jedoch während der Patenz über 100
Millionen Oozysten ausscheiden (referiert in TENTER et al. 2000). In Abhängigkeit von dem
jeweiligen T.-gondii-Stamm kann bereits die Ingestion von 10 sporulierten Oozysten eine Infektion
2. Literaturübersicht
19
bei Zwischenwirten (z. B. Schweinen) hervorrufen (DUBEY et al. 1996). Bei Feliden kann die orale
Aufnahme von 100 sporulierten Oozysten eine patente Infektion induzieren (DUBEY 1996).
Die
Oozysten
sind
im
sporulierten
Zustand
sehr
widerstandsfähig.
Bei
günstigen
Umweltbedingungen können sie über einen langen Zeitraum infektiös bleiben, wobei auch kurze
Trockenzeiten oder Kälteperioden überstanden werden. Unter experimentellen Bedingungen
überleben sporulierte Oozysten eine Lagerung bei 4 °C für 54 Monate sowie bei –10 °C für 106
Tage, während sie bei einem Erhitzen auf 55 und 60 °C nach 1 bis 2 Minuten absterben (DUBEY
1998a). Sporulierte Oozysten weisen eine hohe Impermeabilität auf und sind dadurch sehr resistent
gegenüber Desinfektionsmitteln (referiert in TENTER et al. 2000).
Eine Verbreitung der Oozysten in der Umwelt kann auf vielfältige Weise, z. B. durch Wind, Regen
oder mechanischen Transport geschehen. Bei Regen können die Oozysten aus dem Katzenkot
ausgeschwemmt und durch Transportwirte wie Regenwürmer und koprophage Insekten
aufgenommen und verbreitet werden (DUBEY u. BEATTIE 1988). Im Darm von Küchenschaben
bleiben Oozysten bis zu 19 Tage lang infektiös (CHINCHILLA et al. 1994). Oozysten können aus
Bodenproben in vielen unterschiedlichen Regionen der Welt isoliert werden (referiert in TENTER
et al. 2000). In den meisten Böden überleben sporulierte Oozysten über ein Jahr lang. In einer in
Kansas durchgeführten Studie waren sie sogar nach 18 Monaten noch infektiös, wobei zwei Winter
überstanden wurden (referiert in JACKSON u. HUTCHISON 1989).
Sowohl bei Menschen als auch bei Tieren kann es zu einer Aufnahme der Oozysten mit der
Nahrung kommen. So steigt das Risiko einer T.-gondii-Infektion z. B. durch den Verzehr von
rohem ungewaschenem Obst oder Gemüse (KAPPERUD et al. 1996). Bei Wiederkäuern (z. B.
Schafen) stellen mit Katzenkot verunreinigtes Heu und Kraftfutter sowie kontaminierte
Weideflächen eine Infektionsquelle dar (BUXTON 1998). In einigen Gebieten tritt der Parasit
endemisch auf, so dass Schafe sich bis zum Eintritt der Geschlechtsreife infizieren und
anschließend immun gegen T. gondii sind, d. h. nach einer Infektion nicht mehr erkranken. Werden
dann Schafe in die Herde integriert, die toxoplasmenfrei aufgewachsen sind, kann es während der
Trächtigkeit dieser Tiere zu Aborten kommen (BUXTON 1998). Bei Menschen wurden T.-gondiiInfektionen auch nach der Aufnahme von Trinkwasser nachgewiesen, das mit Oozysten
kontaminiert war (BENESON et al. 1982).
20
2. Literaturübersicht
Die Gewebezysten von T. gondii sind gegenüber äußeren Einflüssen weniger resistent als
sporulierte Oozysten. Temperaturänderungen gegenüber sind sie jedoch recht widerstandsfähig und
überleben eine Lagerung zwischen –1 °C und –8 °C über eine Woche. Bei –12 °C sterben die
meisten Zysten ab (KOTULA et al. 1991; KUTICIC u. WIKERHAUSER 1996), einige können
jedoch sogar ein Tiefgefrieren (–20 °C) überleben (DUBEY 2000). Es wird vermutet, dass
bestimmte Stämme von T. gondii gegenüber dem Tiefgefrieren resistent sind (KUTICIC u.
WIKERHAUSER 1996). Nach dem Erhitzen von Fleisch für 3 Minuten bei 67 °C sind die
Gewebezysten hingegen nicht mehr infektiös (DUBEY 2000).
Carnivore Zwischenwirte können sich durch den Verzehr von rohem oder nicht ausreichend
gekochtem zystenhaltigen Fleisch mit T. gondii infizieren. Die in den Gewebezysten enthaltenen
Bradyzoiten sind gegenüber Verdauungsenzymen relativ unempfindlich. Sie können bei einer
Inkubation in Verdauungsflüssigkeit bis zu 3 Stunden lang infektiös bleiben. Die orale Aufnahme
von Gewebezysten durch einen nicht immunen Wirt führt daher meistens auch zu einer Infektion
(referiert in TENTER et al. 2000). Eine weitere Möglichkeit, sich über Gewebezysten mit T. gondii
zu infizieren, besteht in der Transplantation von zystenhaltigen Organen (siehe Kap. 3.2.).
Die Anzahl der Gewebezysten, die in den Zwischenwirten gebildet wird, variiert mit der
Wirtsspezies. Am häufigsten werden Gewebezysten bei T.-gondii-infizierten Schweinen, Schafen
und Ziegen beobachtet, weniger häufig bei freilaufendem Geflügel, Hunden, Tauben, Kaninchen
sowie wildlebenden Hasen und Vögeln. Bei infizierten Pferden und kommerziell gehaltenem
Geflügel ist die Anzahl der Gewebezysten noch geringer. Bei Rindern und Büffeln werden sie am
seltensten beobachtet, obwohl die Seroprävalenz von T. gondii bei Rindern bis zu 92 % betragen
kann (referiert in TENTER et al. 2000). Schadnager wie Ratten und Mäuse können ebenfalls Träger
von Gewebezysten sein. Jagende Katzen sind daher häufiger infiziert als nicht jagende (SIMON
1995).
Tachyzoiten sind gegenüber Umweltbedingungen sehr empfindlich und sterben normalerweise
außerhalb des Wirtes schnell ab. Sie spielen die größte Rolle bei der vertikalen Übertragung von T.
gondii. Eine horizontale Übertragung von T. gondii durch Tachyzoiten kann in seltenen Fällen
vorkommen, ist epidemiologisch aber vermutlich unbedeutend (TENTER et al. 2000). So besteht
2. Literaturübersicht
21
u. a. die Möglichkeit einer Übertragung von Tachyzoiten während einer Transplantation oder durch
eine Bluttransfusion, wenn bei dem Spender eine Parasitämie besteht. Da diese jedoch nur für kurze
Zeit anhält, ist das Risiko, sich auf diese Weise zu infizieren, sehr gering (referiert in TENTER et
al. 2000).
Der genaue Mechanismus der vertikalen Übertragung von T. gondii ist noch nicht geklärt.
Vermutlich kommt es bei einer erstmaligen Infektion während einer Schwangerschaft oder einer
Trächtigkeit zu einer vorübergehenden Parasitämie und einer Invasion von Tachyzoiten in die
Zellen der Plazenta sowie zu einer dortigen Vermehrung des Parasiten. Einige der Tachyzoiten
passieren daraufhin die Plazentaschranke und dringen in den fetalen Blutkreislauf ein (referiert in
TENTER et al. 2000).
Während einer akuten Infektion kann es bei einigen Zwischenwirten (z. B. Ziegen) zu einer
Ausscheidung von Tachyzoiten über die Milch kommen. Bei Menschen konnte eine akute
Toxoplasmose nach dem Konsum von unpasteurisierter Ziegenmilch beobachtet werden (referiert in
EVANS 1992). Tachyzoiten sind gegenüber proteolytischen Enzymen empfindlich, so dass sie im
Magensaft normalerweise schnell zerstört werden. In einer Studie wurde jedoch ein Überleben der
Tachyzoiten nach einer Inkubation von bis zu 2 Stunden in einer sauren Pepsinlösung
nachgewiesen. Außerdem konnte experimentell die orale Applikation hoher Dosen an Tachyzoiten
Infektionen bei Mäusen und Katzen hervorrufen (DUBEY 1998b). Außer in Blut und Milch wurden
Tachyzoiten auch in anderen Körperflüssigkeiten wie Speichel, Urin, Tränen- und Samenflüssigkeit
nachgewiesen, wobei es beim Menschen bisher keinen Hinweis auf eine Übertragung durch einen
dieser Wege gibt (referiert in TENTER et al. 2000). Bei nicht humanen Primaten konnte dagegen
unter experimentellen Bedingungen eine horizontale Übertragung der Tachyzoiten nachgewiesen
werden (siehe Kap. 2.5.3.).
2.4. Risikogruppen
2.4.1.
Risikogruppen innerhalb der Humanmedizin
22
2. Literaturübersicht
Die meisten Fälle von T.-gondii-Infektionen nehmen bei immunkompetenten Menschen einen
latenten Verlauf. Klinische Erkrankungen beschränken sich größtenteils auf bestimmte
Risikogruppen, zu denen nicht immune schwangere Frauen und immundefiziente Personen zählen
(TENTER et al. 2000).
Frauen, die sich 4 bis 6 Monate vor einer Schwangerschaft oder zu einem früheren Zeitpunkt mit T.
gondii infizieren, bilden eine protektive Immunität aus, die im allgemeinen die vertikale
Übertragung auf den Fetus verhindert, falls die Frau während der Gravidität dem Parasiten erneut
ausgesetzt ist (TENTER et al. 2000). Infiziert sich eine Frau jedoch kurz vor oder während einer
Schwangerschaft zum ersten Mal mit T. gondii, so kann dies eine konnatale Toxoplasmose zur
Folge haben. Das Risiko einer intrauterinen Infektion des Kindes steigt dabei mit zunehmender
Graviditätsdauer an. Die Effekte auf den Fetus sind hingegen um so gravierender, je früher sich die
Mutter infiziert (CHATTERTON 1992). Etwa 10 % der pränatalen T.-gondii-Infektionen führen zu
Aborten oder neonatalem Tod. Weitere 10-23 % der pränatal infizierten Neugeborenen zeigen
klinische Symptome einer Toxoplasmose bei der Geburt, wobei bis zu 10 % dieser Neugeborenen
Leitsymptome einer konnatalen Toxoplasmose (so genannte klassische Triade bestehend aus
Retinochoroiditis, Hydrozephalus und Enzephalitis gefolgt von zerebraler Verkalkung) aufweisen
(referiert in TENTER et al. 2000). Eine Infektion im letzten Schwangerschaftsdrittel verläuft
dagegen in der Regel subklinisch (DESMONTS u. COUVREUR 1974a, b). Auch wenn infizierte
Säuglinge bei der Geburt gesund erscheinen, können sich im Kleinkindalter Augenleiden,
neurologische Störungen und Hörschäden entwickeln (referiert in TENTER et al. 2000).
Bei immundefizienten Personen kann es bei einer Erstinfektion mit T. gondii zu einer akuten
disseminierten Toxoplasmose und im Falle einer bereits vorhandenen latenten Infektion zu einer
reaktivierten Toxoplasmose mit Enzephalitis kommen. Solche T.-gondii-bedingten Enzephalitiden
und disseminierten Toxoplasmosen können bei AIDS-Patienten und immunsuppressiv behandelten
Personen wie Hodgkin- oder anderen Krebspatienten beobachtet werden. Bei AIDS-Patienten spielt
T. gondii als opportunistischer Krankheitserreger eine bedeutende Rolle. Der Parasit verursacht
weltweit bei bis zu 40 % der AIDS-Patienten hochgradige Enzephalitiden, an deren Folgen 10 bis
30 % der mit T. gondii infizierten Patienten sterben (LUFT u. REMINGTON 1992). Auch bei der
Transplantation von Organen oder Knochenmark kann es zu Komplikationen durch disseminierte
Toxoplasmosen kommen. Diese können entweder das Resultat eines mit dem Parasiten infizierten
2. Literaturübersicht
23
Transplantatspenders und eines nicht gegen T. gondii immunen Empfängers oder aber das Ergebnis
der Reaktivierung einer latenten T.-gondii-Infektion des Transplantatempfängers in Folge der
immunsuppressiven Behandlung sein (referiert in TENTER et al. 2000).
2.4.2.
Risikogruppen innerhalb der Veterinärmedizin
Zu den Risikogruppen innerhalb des Tierreichs gehören nicht immune trächtige Schafe und Ziegen
sowie einige andere Spezies, die hochempfänglich für eine T.-gondii-Infektion sind und unter dem
Bild einer akuten disseminierten Toxoplasmose erkranken. Dazu zählen neben Känguruhs,
Seeottern, Koalas und Pinguinen auch die Neuweltaffen und Lemuren (referiert in INNES 1996;
JUNGE 2003).
Bei Schafen und Ziegen, die vor einer Trächtigkeit keine Immunität gegen T. gondii entwickelt
haben, kann es zu einer vertikalen Übertragung des Parasiten auf die Lämmer kommen. Dabei
können beträchtliche Verluste unter den Lämmern entstehen. Infizieren sich nicht immune
Muttertiere während der Frühträchtigkeit, so führt dies oft zum fetalen Tod und zu einer Resorption
der Frucht. Typische klinische Symptome bei einer Infektion während der mittleren Trächtigkeit
sind Aborte sowie die Geburt toter, mumifizierter oder lebensschwacher Lämmer. Findet eine
Infektion erst in einem späten Trächtigkeitsstadium statt, wenn das Immunsystem des Fetus schon
relativ weit entwickelt ist, können die Lämmer bei der Geburt klinisch normal sein. Die Jungtiere
sind dann latent infiziert und gegen durch T. gondii hervorgerufene Erkrankungen immun (referiert
in BUXTON 1998). Das Muttertier ist in der Regel klinisch gesund, vereinzelt können jedoch eine
Lymphadenopathie sowie mildes Fieber beobachtet werden (BUXTON 1990).
Die akuten Toxoplasmosen bei hochempfänglichen Spezies wie den Neuweltaffen und Lemuren
enden meistens letal (siehe Kap. 2.5.4.). Die Gründe dafür, warum gerade diese Spezies so
empfindlich auf eine T.-gondii-Infektion reagieren, sind bislang nicht bekannt (BRACK et al.
1995b; INNES 1997; EPIPHANIO et al. 2003). Eine Hypothese ist der fehlende Kontakt zu Feliden
und deren Parasiten während der evolutionären Entwicklung (CUNNINGHAM et al. 1992; BRACK
et al. 1995b; INNES 1997). So lebten z. B. die Lemuren Madagaskars sowie die Beuteltiere
Australiens lange Zeit geographisch isoliert. Da es in beiden Gebieten keine wilden Feliden gab und
24
2. Literaturübersicht
Hauskatzen erst vor wenigen Jahrhunderten mit den ersten Siedlern in diese Länder gebracht
wurden, sind diese Tiere evolutions-immunologisch naiv für T. gondii (referiert in BRACK et al.
1995b). Obwohl es im südamerikanischen Regenwald u. a. mit dem Ozelot und dem Jaguar
durchaus Tiere gibt, die als Endwirte für T. gondii fungieren, trifft laut INNES (1997) ein fehlender
Kontakt zu Feliden und deren Parasiten während der evolutionären Entwicklung auch auf die
Neuweltaffen zu. Da sich die Neuweltaffen in ihrem natürlichen Habitat in den Baumwipfeln
aufhalten, kommen sie nicht mit dem Boden und somit auch nicht mit oozystenhaltigem Kot in
Kontakt (FRENKEL u. ESCAJADILLO 1987). BRACK et al. (1995b) teilen diese Ansicht nicht,
da es in dem Gebiet einige Kleinkatzenarten gibt, die Baumkletterer sind (z. B. Baumozelot) und in
nicht geringem Maße T.-gondii-Oozysten ausscheiden. Zudem kommt es vor, dass z. B.
Totenkopfaffen auch in ihrem natürlichen Habitat in Bodennähe kommen (THORINGTON 1968),
so dass die Aufnahme von sporulierten Oozysten mit dem Futter oder Wasser durchaus denkbar ist.
Bekräftigt wird diese Hypothese durch epidemiologische Studien, in denen T.-gondii-Infektionen
bei Neuweltaffen in ihrem natürlichen Habitat serologisch nachgewiesen werden konnten (siehe
Kap. 2.5.2.2.).
Eine weitere Erklärung für die besondere Empfänglichkeit der Neuweltaffen könnte ein generell
weniger leistungsfähiges Immunsystem sein (BRACK et al.1995b; INNES 1997). So besteht eine
Ähnlichkeit zwischen dem pathologischen Bild der akuten Toxoplasmose dieser Tiere mit dem von
immunsuppremierten Patienten mit einer gestörten T-Zell-Funktion und einer verminderten
Interferon-γ (INF-γ)-Produktion (INNES 1997). Die humorale Immunantwort in Form von
Antikörpern sowie das Komplementsystem wirken synergistisch, um extrazelluläre Parasiten zu
zerstören. Da die meisten Tachyzoiten jedoch intrazellulär liegen, kommt der zellvermittelten
Immunität bei der Bekämpfung einer T.-gondii-Infektion eine größere Bedeutung zu (INNES 1997).
Das Tachyzoitenstadium von T. gondii ist sehr immunogen und induziert neben einer
Serokonversion eine zellvermittelte Immunantwort mit der Produktion von INF-γ und
Tumornekrosefaktor-α (TNF-α). In-vitro-Versuche zeigten, dass diese Cytokine u. a. eine
bedeutende Rolle bei dem Wechsel von Tachyzoiten zu Bradyzoiten zu spielen scheinen (GROSS
et al. 2004). Da klinische Symptome in der Regel nur während der Vermehrung der Tachyzoiten
beobachtet werden, kommt dem Stadienwechsel somit eine große Bedeutung zu. Das INF-γ wird zu
einem sehr frühen Zeitpunkt der Infektion von Natürlichen Killerzellen gebildet und induziert neben
2. Literaturübersicht
25
einer Aktivierung von Makrophagen zusammen mit Interleukin-12 (IL-12) eine vermehrte
Produktion von sogenannten TH1-Zellen. Diese wiederum induzieren durch die Produktion von
Interleukin-2 (IL-2) die Bildung von cytotoxischen T-Zellen (ALEXANDER et al. 2000), welche
die Haupteffektorzellen gegen T. gondii darstellen. Daher spielt es möglicherweise eine Rolle, wie
schnell das Immunsystem der verschiedenen Spezies IFN-γ produzieren kann (INNES 1997).
Das Immunsystem der Neuweltaffen wird eventuell auch durch den bei allen Platyrrhini
(Neuweltaffen) sehr hohen Serumkortikosteroid-Spiegel negativ beeinflusst. Krallenaffen werden
wegen ihrer Ontogenese als dizygote hämatopoetische Chimären zusätzlich als vermindert
immunkompetent angesehen. Insbesondere Lisztaffen haben einen eingeschränkten MHC-IPolymorphismus und weisen ein im Vergleich zum Menschen verschobenes CD4+ : CD8+ Lymphozytenverhältnis auf. Weniger ausgeprägt, jedoch auch weniger eingehend untersucht, sind
Änderungen immunologischer Parameter bei Braunrückentamarinen, Weißbüscheläffchen und
Totenkopfaffen (referiert in BRACK et al. 1995b).
Disseminierte Toxoplasmosen konnten bei nicht humanen Primaten bislang nur in Gefangenschaft
und nicht im natürlichen Habitat beobachtet werden. Es ist möglich, dass chronische
Stresssituationen, denen die Tiere während der Gefangenschaft ausgesetzt sind, sich
prädisponierend auf die Ausbildung einer klinischen Toxoplasmose auswirken (WONG u. KOZEK
1974).
2.5. Infektionen mit T. gondii bei nicht humanen Primaten
2.5.1. Dokumentierte T.-gondii-Infektionen bei verschiedenen Primatenspezies
Der erste Fall einer Toxoplasmose bei einem nicht humanen Primaten wurde 1916 von THEZE
(1916) bei einem Brüllaffen (Alouatta seniculus) beschrieben. Eine Infektion mit T. gondii konnte
seitdem bei vielen nicht humanen Primaten nachgewiesen werden. Am häufigsten sind
Neuweltaffen betroffen, aber auch bei Altweltaffen einschließlich der Menschenaffen und bei
Halbaffen tritt der Erreger auf (BRACK et al. 1995a). Die Tab. 1 zeigt eine Übersicht über die
verschiedenen Affenspezies, bei denen in epidemiologischen Studien oder in Fallberichten eine T.-
26
2. Literaturübersicht
gondii-Infektion nachgewiesen wurde. In der Tabelle sind nur die Berichte zitiert, bei denen es sich
um eine natürliche und nicht um eine experimentell hervorgerufene Infektion handelte. Die
Speziesbezeichnungen richten sich dabei nach GEISSMANN (2003) und nicht nach dem
Kenntnisstand zum Zeitpunkt der jeweiligen Veröffentlichung. Gleichzeitig zeigt die Tabelle eine
systematische Einordnung dieser Arten, wobei die Systematik von GEISSMANN (2003) verwendet
wurde. Die Ordnung der Primaten gliedert sich dabei in die Unterordnung der Strepsirrhini, die
verschiedene Halbaffenspezies umfasst, und in die der Haplorrhini. In letzterer finden sich die
Neuwelt- und Altweltaffen einschließlich der Menschenaffen. Die Systematik ist nicht vollständig,
sondern beinhaltet nur diejenigen Infraordnungen und Familien, in denen bislang das Auftreten von
T.-gondii-Infektionen beobachtet werden konnte.
Referenzen
Strepsirrhini (Feuchtnasenprimaten)
-- Lemuriformes
(Lemuriforme)
Lemuroidea
(madagassische Lemuren)
HARING u. DAVIS (1998)
-- Lemuridae
Hapalemur (Kleine Bambus(„echte“ Lemuren) -- H. griseus
lemuren)
-- Indridae
(Indriartige)
-- Loriformes
(Loriforme)
Loroidea
(Loroiden)
-- Loridae
(Loris)
Lemur (Kattas)
-- L. catta
SUREAU et al. (1962); UILENBERG u. RIBOT
(1965); ITAKURA u. NIGI (1968); NIGI u.
ITAKURA (1968); ISENBÜGEL (1983); BORST u.
VAN KNAPEN (1984); DUBEY et al. (1985a);
BRACK et al. (1995b, 1998); WOHLSEIN et al.
(1999); ZHANG et al. (2000); SPENCER et al. (2004)
Varecia (Varis)
-- V. variegata
UILENBERG u. RIBOT (1965); BRITT et al. (2004)
Propithecus (Sifakas)
-- P. verreauxi
CHANG et al. (1980)
Nycticebus (Plumploris)
-- N. coucang
ZAMAN u. GOH (1968); ZAMAN u.
KRISHNAMURTI (1969)
Aotus (Nachtaffen)
-- A. lemurinus
-- A. trivirgatus
SEIBOLD u. WOLF (1971); BORST u. VAN
KNAPEN (1984); PERRI et al. (1992);
EPIPHANIO et al. (2003)
2. Literaturübersicht
Tab. 1: Vorkommen von T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen Primaten
Unterordnung
Überfamilie
Gattung
-- Infraordnung
-- Familie
-- Art
— Namenloser Rang
Haplorrhini (Trockennasenprimaten)
27
-- Anthropoidea
(eigentliche Affen)
— Platyrrhini
Ceboidea
(Neuweltaffen)
(Neuweltaffen)
-- Aotidae
(Nachtaffen)
-- Callitrichidae
(Krallenäffchen)
RATCLIFFE u. WORTH (1951); RATCLIFFE (1967)
zit. von SEIBOLD u. WOLF (1971); RIEMANN et al.
(1974); CHOI et al. (1987)
Lagothrix (Wollaffen)
-- L. lagotricha
STOLZ (1962); BENIRSCHKE u. LOW (1970);
HESSLER et al. (1971); BOUER et al. (1999);
EPIPHANIO et al. (2003)
Callithrix (Büscheläffchen)
-- C. jacchus
-- C. penicillata
-- C. pygmaea
HILGENFELD (1965a, b, 1966); DIETZ et al (1997);
JENSEN et al. (1998); BAULU et al. (2002);
EPIPHANIO et al. (2003)
Leontopithecus (Löwenäffchen)
-- L. chrysomelas
-- L. chrysopygus
-- L. rosalia
HILGENFELD (1966); RATCLIFFE (1967) zit. von
SEIBOLD u. WOLF (1971); MONTALI et al. (1995);
DIETZ et al. (1997); JUAN-SALLES et al. (1997,
1998); PERTZ et al. (1997); EPIPHANIO et al.
(1999b, 2000, 2001, 2003)
Saguinus (Tamarine)
-- S. fuscicollis
-- S. geoffroyi
-- S. imperator
-- S. labiatus
-- S. midas
-- S. oedipus
BENIRSCHKE u. RICHART (1960); RATCLIFFE
(1967) zit. von SEIBOLD u. WOLF (1971);
FRENKEL u. SOUSA (1983); GRINER (1983);
BRACK et al. (1995b); DIETZ et al. (1997);
WOHLSEIN et al. (1999); EPIPHANIO et al.
(1999a, b, 2000, 2003); LEONG et al. (2004)
Cebus (Kapuzineraffen)
-- C. albifrons
DE RODANICHE (1954a); NERY-GUIMARAES
et al. (1971); NERY-GUIMARAES u. FRANKEN
2. Literaturübersicht
-- Cebidae
(Kapuzinerartige)
Ateles (Klammeraffen)
-- A. geoffroyi
-- A. paniscus
28
Tab. 1: Vorkommen von T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen Primaten (Fortsetzung)
Unterordnung
Überfamilie
Gattung
Referenzen
-- Infraordnung
-- Familie
-- Art
— Namenloser Rang
-- Atelidae
Alouatta (Brüllaffen)
THEZE (1916); CARME et al. (2002); DE THOISY
(Greifschwanzaffen)
-- A. guariba
et al. (2001, 2003); EPIPHANIO et al. (2003)
-- A. seniculus
Saimiri (Totenkopfaffen)
-- S. boliviensis
-- S. sciureus
-- Pitheciidae
(Sakiartige)
2. Literaturübersicht
Tab. 1: Vorkommen von T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen Primaten (Fortsetzung)
Unterordnung
Überfamilie
Gattung
Referenzen
-- Infraordnung
-- Familie
-- Art
— Namenloser Rang
-- C. apella
(1971); CADAVID et al. (1991)
-- C. capucinus
-- C. libidinosus
RATCLIFFE u. WORTH (1951); RATCLIFFE
(1954); DÖBEREINER (1955); McKISSICK et al.
(1968); NERY-GUIMARAES u. FRANKEN (1971);
FERRARONI et al. (1980); ANDERSON u.
McCLURE (1982); WOOLF u. ANTHONEY (1982);
DICKSON et al. (1983); BORST u. VAN KNAPEN
(1984); ZWART et al. (1989); TUDGE (1991);
CUNNINGHAM et al. (1992); BRACK et al. (1995b,
1998); INOUE (1997); WOHLSEIN et al. (1999);
BACCIARINI et al. (2001a, b); BAULU et al. (2002);
EPIPHANIO et al. (2003); ANDRADE et al. (2004)
Cacajao (Uakaris)
-- C. calvus
RATCLIFFE (1954, 1961)
Callicebus (Springaffen)
-- C. moloch
SEIBOLD u. WOLF (1971)
Pithecia (Sakis)
-- P. pithecia
-- P. monachus
RATCLIFFE (1954); ZWART et al. (1989)
— Catarrhini
Cercopithecoidea
(Altweltaffen) (geschwänzte Altweltaffen)
-- Cercopithecidae Chlorocebus (Grünmeerkatzen) KASCHULA et al. (1978); BAULU et al. (2002)
(rezente geschwänzte
-- C. pygerythrus
Altweltaffen)
ZHANG et al. (2000)
29
Erythrocebus (Husarenaffen)
-- E. patas
30
Tab. 1: Vorkommen von T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen Primaten (Fortsetzung)
Unterordnung
Überfamilie
Gattung
Referenzen
-- Infraordnung
-- Familie
-- Art
— Namenloser Rang
Macaca (Makaken)
FELDMAN u. MILLER (1956); SERY et al. (1959);
-- M. arctoides
VAN DEN AKKER et al. (1959); UMINSKY u.
-- M. fascicularis
PIETRZYK (1961); POKORNY et al. (1961);
-- M. fuscata
REMINGTON et al. (1965); NERY-GUIMARAES et
-- M. mulatta
al. (1971); ARAUJO et al. (1973); WONG u. KOZEK
-- M. nemestrina
(1974); CHHABRA et al. (1976); DURFEE et al.
-- M. sinica
(1976); RAO BHAU et al. (1987); SULAIMAN et al.
-- M. sylvanus
(1989); ASAI et al. (1991); SASSEVILLE et al.
(1995); ZHANG et al. (2000); BAULU et al. (2002);
EKANAYAKE et al. (2004)
Papio (Paviane)
-- P. cynocephalus
-- P. ursinus
LEVADITI u. SCHOEN (1933); KUNTZ u. MYERS
(1967); DE ROEVER-BONNET (1972);
McCONNELL et al. (1973, 1974); MICHAELS et al.
(1994); BAULU et al. (2002)
Trachypithecus (Haubenlanguren) SULAIMAN et al. (1989)
-- T. cristatus
Hominoidea
(Menschenaffen & Mensch)
-- Hylobatidae
(Gibbons)
ZHANG et al. (2000)
Hylobates (Zwerggibbons)
-- H. lar
MURATA (1989)
-- Hominidae
Gorilla (Gorillas)
(Große Menschenaffen & Mensch) -- G. gorilla
Pan (Schimpansen)
-- P. troglodytes
PROWTEN et al. (1985); MURATA (1989);
FURLEY (1996)
KOPCIOWSKA u. NICOLAU (1938); SCHOBERT
(1970) zit. von McCLURE u. GUILLOUD (1971);
DRAPER et al. (1971); MURATA (1989)
2. Literaturübersicht
Bunopithecus (Hulocks)
-- B. hoolock
2. Literaturübersicht
31
2.5.2. Seropositivität
T.-gondii-Infektionen führen auch bei nicht humanen Primaten nicht grundsätzlich zu einer
Erkrankung. Insbesondere Altweltaffen sind häufig nur latent infiziert, wobei sich die Infektion in
der Regel serologisch nachweisen lässt (BRACK et al. 1995b). Auch bei Neuwelt- und
Halbaffenspezies konnten Antikörper gegen T. gondii nachgewiesen werden. Dabei wurden sowohl
epidemiologische Studien an wildlebenden Primaten durchgeführt, als auch an Tieren, die sich zum
Zeitpunkt der Untersuchung in Gefangenschaft befanden.
2.5.2.1. Serologische Untersuchungen an Altweltaffen im natürlichen Habitat
Durch Studien an wildlebenden Primaten konnten Infektionen mit T. gondii im natürlichen Habitat
eindeutig belegt werden. In der Tab. 2 sind diese Fälle zusammengestellt. Eine Aussage über die
tatsächliche Prävalenz des Parasiten in den Wildpopulationen der verschiedenen Affenarten lässt
sich anhand dieser wenigen Daten jedoch nicht treffen. Der überwiegende Teil der Studien wurde
an Altweltaffen, insbesondere an Makaken durchgeführt. Die von ZAMAN u. GOH (1968) und
McCONNELL et al. (1973) beschriebenen Fälle, in denen T. gondii auch histologisch
nachgewiesen wurde, sind in Kap. 2.5.4. dargestellt.
UMINSKI u. PIETRZYK (1961) untersuchten 155 aus Indien stammende Rhesusaffen und
16 Javaneraffen aus Malaysia in der KBR auf Antikörper gegen T. gondii. Die Tiere waren klinisch
gesund und sollten anschließend bei der Herstellung einer Polio-Vakzine eingesetzt werden. Bei 13
der Rhesusaffen wurde ein Titer von 1:2 und bei neun ein Titer von 1:4 festgestellt. Unter den
Javaneraffen hatten vier Tiere einen Titer von 1:2. Bei 28 Rhesus- und bei sechs Javaneraffen
wurden unspezifische Reaktionen festgestellt. Diese wurden insbesondere bei Tieren beobachtet,
denen zuvor Kortison verabreicht wurde. Alle Affen wurden zu einem späteren Zeitpunkt in einer
Sektion untersucht, die jedoch in keinem Fall charakteristische Befunde einer Toxoplasmose ergab.
Von den serologisch positiven Tieren wurde Organmaterial in Mäuse inokuliert, um den Parasiten
zu isolieren. Positive Ergebnisse wurden dabei nicht erzielt.
32
2. Literaturübersicht
REMINGTON et al. (1965) führten eine Studie an 164 Makaken durch. Dabei wurden 64
Rhesusaffen aus Nordindien, 50 Schweinsaffen aus Thailand und 50 Javaneraffen von den
Philippinen im SFT auf Antikörper gegen T. gondii untersucht. Alle Seren der Rhesusaffen hatten
einen Titer unter 1:2 und wurden damit als negativ beurteilt. Bei den Javaneraffen hatten zehn Tiere
einen Titer von 1:2 und eines einen Titer von 1:8. Bei den Schweinsaffen hatten 35 Tiere einen
Titer von 1:2 und sechs von 1:8. Nach Ansicht der Autoren lieferten damit 22 % der Javaner- und
82 % der Schweinsaffen ein positives Ergebnis. Auf Grund der niedrigen Titer war jedoch nicht
eindeutig klar, ob es sich um chronische T.-gondii-Infektionen handelte oder nur um unspezifische
Reaktionen, die bei einer Verdünnung von 1:32 nicht mehr auftraten. Alle Seren, die im SFT positiv
reagierten, wurden daher mit hitzeinaktiviertem Aktivatorserum getestet und waren bei dieser
Untersuchung negativ. Dies sprach für eine spezifische Antikörperreaktion. Im Gegensatz dazu
verlief eine anschließend durchgeführte Untersuchung in der Elektrophorese negativ. Dabei wurden
alle Seren, die einen Titer von 1:8 im SFT aufwiesen, im Vergleich mit einem positiven
Humanserum getestet. Es konnten keine Antikörper gegen T. gondii in den Affenseren
nachgewiesen werden. Eine histologische Untersuchung von Organmaterial, die bei positivem
Befund den Beweis für eine T.-gondii-Infektion hätte liefern können, war auf Grund des Wertes der
Tiere ausgeschlossen.
CHHABRA et al. (1976) führten eine Studie an Rhesusaffen in Nordindien durch. Es wurden 94
Tiere aus der Region unterhalb des Himalaya gefangen und ihnen unmittelbar danach eine
Blutprobe entnommen. Die Seren wurden mit dem IHAT auf Antikörper gegen T. gondii
untersucht, wobei 41 der Seren eine negative Reaktion zeigten. Bei 26 Tieren wurde ein Titer von
1:8 festgestellt, 11 Tiere hatten einen Titer von 1:32, zehn von 1:128, drei von 1:512 und drei von
1:2048 oder höher. Die Autoren beurteilten damit 53 (56,4 %) der Tiere als positiv. Als
Infektionsursache wurde eine Infektion mit dem Kot wilder Feliden vermutet.
In die von DE ROEVER-BONNET (1972) durchgeführte Studie zur Prävalenz von Infektionen mit
T. gondii in der Bevölkerung verschiedener afrikanischer Länder wurden auch einige wildlebende
Tiere einbezogen. Dabei wurden die Seren von 20 Pavianen im SFT ab einer Verdünnung von 1:16
untersucht. Bei drei Tieren wurde ein Titer von 1:16 festgestellt, die übrigen Seren zeigten keine
Reaktion.
2. Literaturübersicht
33
KASCHULA et al. (1978) untersuchten Grünmeerkatzen, die für eine Impfstoffproduktion und zur
Verwendung der Nieren in Zellkulturen in Südafrika gefangen wurden. Die Tiere wurden neben
zahlreichen anderen Krankheiten auch auf T. gondii untersucht. Dabei war von 47 Tieren eines im
IFAT und zwei von 55 in der KBR positiv. Im SFT waren 48 untersuchte Tiere negativ.
RAO BHAU et al. (1987) untersuchten 211 Rhesusaffen im IHAT auf Antikörper gegen T. gondii.
Die Tiere wurden in Nordindien gefangen, waren 1 bis 5 Jahre alt, 1,5 bis 3 kg schwer und zeigten
ein ungestörtes Allgemeinbefinden. Unmittelbar nach dem Fang wurde eine Blutprobe entnommen.
Bei 62 Tieren wurde ein Titer von 1:8 nachgewiesen, bei 41 ein Titer von 1:32 und bei acht Tieren
ein Titer von 1:128 oder höher. Von den Autoren wurden 111 Seren als positiv beurteilt. Als
Infektionsursache wurde der Kontakt zu Hauskatzen vermutet, da die Tiere in einer von Menschen
bewohnten Gegend gefangen wurden.
SULAIMAN et al. (1989) untersuchten die Seren von 33 Haubenlanguren, 30 Javaneraffen und 14
Schweinsaffen, die in Malaysia gefangen wurden, im IFAT und im ELISA. Im IFAT wurden Seren
mit einem Titer ≥ 1:64 als positiv beurteilt. Einer der Languren (3 %), fünf Javaner- (17 %) und
acht Schweinsaffen (57 %) lieferten hier positive Ergebnisse. Im ELISA wurden die optischen
Dichten bei einer Wellenlänge von 492 nm bestimmt und die Seren bei einem Wert ≥ 0,48 als
positiv angesehen. Dabei lieferten einer der Languren (3 %), drei Javaner- (10 %) und 10
Schweinsaffen (71 %) positive Ergebnisse. Bei einem Vergleich der Testergebnisse konnte eine
signifikante positive Korrelation zwischen dem IFAT und dem ELISA festgestellt werden. Die
unterschiedlich hohen Infektionsraten zwischen den drei untersuchten Spezies wurden damit erklärt,
dass die Schweinsaffen im Gegensatz zu den anderen beiden Arten bei der Futtersuche mehr Zeit
auf dem Boden verbringen und sich deshalb leichter mit Oozysten infizieren könnten.
EKANAYAKE et al. (2004) führten eine Studie an Ceylon-Hutaffen auf Sri Lanka durch. Es
wurden Blutproben von 170 Makaken unterschiedlichen Alters und Geschlechts gewonnen, die sich
auf acht verschiedene soziale Gruppen verteilten. Die Seren wurden im MAT auf Antikörper gegen
T. gondii getestet. Neun Tiere wiesen dabei einen Titer von 1:16, neun einen Titer von 1:32 und drei
von 1:256 auf. Da der MAT-Titer, der für Affen als spezifisch angesehen werden kann, nicht
bekannt war, werteten die Autoren alle in der Studie festgestellten Titer als positive Ergebnisse und
34
2. Literaturübersicht
beurteilten somit 21 Seren (12 %) als positiv. Keines der 21 infizierten Tiere starb im darauf
folgenden Jahr an einer Toxoplasmose. Zwischen den einzelnen Gruppen ergaben sich Unterschiede
in der Häufigkeit der T.-gondii-Infektionen. Je größer die Überschneidungen der Reviere mit
menschlichen Siedlungen waren, desto öfter wurden bei den Tieren Antikörper gegen T. gondii
gefunden. Dabei wurde eine Prävalenz von 19 % (21 von 112 Tieren) bei denjenigen Gruppen
festgestellt, die sich regelmäßig in menschlicher Umgebung aufhielten und somit auch Kontakt zu
Hauskatzen hatten. Bei den Gruppen, deren Revier sich ausschließlich auf den Urwald beschränkte,
war keines von 58 Tieren serologisch positiv. Um festzustellen, ob es zu einer signifikanten
konnatalen Übertragung des Parasiten kommt, wurden die Antikörpertiter von zehn Muttertieren
und ihren Nachkommen verglichen. Zwei positive Muttertiere hatten positive Nachkommen, bei
vier positiven Muttertieren wiesen die Jungtiere keine Antikörper gegen T. gondii auf. Auf Grund
des Befundes, dass vier Nachkommen nicht infizierter Muttertiere positiv waren, wurde die
Hypothese aufgestellt, dass eine Infektion mit T. gondii in den meisten Fällen postnatal stattfindet.
Es wurde vermutet, dass sich die Makaken bei ihrer Nahrungssuche in den von Menschen
besiedelten Gebieten infiziert hatten, indem sie mit Oozysten kontaminiertes Futter vom Boden
aufnahmen. Der Umstand, dass keines der Tiere in Folge der Infektion gestorben war, lässt laut den
Autoren darauf schließen, dass die Makaken während ihrer evolutionären Entwicklung lange dem
Parasiten ausgesetzt waren und dadurch eine immunologische Anpassung stattfand.
2.5.2.2. Serologische Untersuchungen an Neuweltaffen im natürlichen Habitat
Die bei Neuweltaffen im natürlichen Habitat festgestellte Prävalenz von T. gondii war sehr
unterschiedlich.
FERRARONI et al. (1980) führten eine epidemiologische Studie im Amazonasgebiet durch. Dabei
untersuchten sie neben Menschen und verschiedenen Haustieren auch einige wildlebende Spezies
im IHAT auf Antikörper gegen T. gondii. Die Seren wurden als positiv beurteilt, wenn eine
Agglutination bei einer Verdünnung von ≥1:128 stattfand. Die niedrigsten Infektionsraten wurden
bei Rindern (12 %) und bei Geflügel (22 %) gefunden, die höchsten bei Hauskatzen. Hier lieferten
26 von 32 Tieren (81 %) ein positives Ergebnis. Unter den untersuchten Wildtieren waren vier
Ozelots, von denen zwei positiv waren. Von 49 Totenkopfaffen waren 24 positiv. Die Affen hatten
2. Literaturübersicht
35
somit eine relativ hohe Prävalenz (49 %), obwohl sie auf Bäumen leben und sich überwiegend von
Früchten ernähren. Daraus wurde geschlossen, dass die Totenkopfaffen regelmäßig Kontakt zu
sporulierten Oozysten hatten.
FRENKEL u. SOUSA (1983) untersuchten bei einer in Panama durchgeführten Studie 22
verschiedene wildlebende Säugetierspezies auf Antikörper gegen T. gondii. Bei 11 Spezies wurden
im SFT ab einer Verdünnung von 1:2 positive Reaktionen nachgewiesen. Unter den untersuchten
Tierarten waren auch drei Primatenspezies: einer von 21 Tamarinen war positiv, 23 Nachtaffen und
acht Brüllaffen waren negativ.
Bei einer in Französisch Guayana durchgeführten Studie wurden verschiedene wildlebende
Säugetiere im MAT auf Antikörper gegen T. gondii untersucht (CARME et al. 2002; DE THOISY
2001, 2003). Seren, die bei einer Verdünnung von >1:40 eine Agglutination auslösten, wurden
dabei als positiv gewertet, die übrigen als negativ. Die Prävalenz von T. gondii bei den untersuchten
Spezies wurde unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Lebensweisen der Tiere verglichen.
Dabei wiesen terrestrisch lebende und fleischfressende Spezies, wie Pakas, Gürteltiere und Pekaris
eine signifikant höhere Infektionsrate auf als baumbewohnende sowie vegetarisch lebende Tiere. So
waren von 50 untersuchten Roten Brüllaffen nur zwei Tiere positiv, von 50 Gelbhand-Tamarinen
und 50 Faultieren waren alle negativ. Bei den vegetarisch lebenden Tieren wurde eine Infektion mit
sporulierten Oozysten vermutet. Da Hauskatzen in der Gegend nicht vorkamen, gingen die Autoren
von einer Übertragung durch wildlebende Feliden aus.
2.5.2.3. Serologische Untersuchungen an nicht humanen Primaten in Gefangenschaft
Es gibt auch zahlreiche epidemiologische Studien an nicht humanen Primaten, die auf Antikörper
gegen T. gondii untersucht wurden und sich zum Zeitpunkt der Probennahmen in Gefangenschaft
befanden. In Tab. 3 sind diese Fälle zusammengestellt. Die Seren wurden dabei in der Regel in
Zoologischen Gärten gewonnen. Die Fälle, in denen Antikörper gegen T. gondii im Zusammenhang
mit einer klinischen Toxoplasmose nachgewiesen wurden, sind in Kap. 2.5.4. ausführlich
dargestellt.
36
2. Literaturübersicht
FELDMAN u. MILLER (1956) untersuchten in einer Studie die Seren von 21 Javaneraffen von den
Philippinen und von 15 Rhesusaffen aus Indien im SFT auf Antikörper gegen T. gondii. Dabei
wiesen 16 der zu Versuchszwecken gehaltenen Javaneraffen und einer der Rhesusaffen einen Titer
von 1:4 auf. Die Ergebnisse wurden aber auf Grund der niedrigen Verdünnungsstufe als nicht
signifikant angesehen und daher alle Seren als negativ beurteilt.
KUNTZ u. MYERS (1967) untersuchten 25 aus einem Zoo in San Antonio (Texas, USA)
stammende Paviane im SFT auf Antikörper gegen T. gondii. Bei 18 Tieren wurde ein Titer von 1:4
und bei zwei ein Titer von 1:16 nachgewiesen. Die Autoren beurteilten diese Ergebnisse als positiv.
Die übrigen fünf Paviane lieferten negative Reaktionen.
YAMAMOTO et al. (1970) führten mit acht aus einem Zoo in Indonesien stammenden OrangUtans einen IHAT zum Nachweis von Antikörpern gegen T. gondii durch. Dabei wiesen drei Seren
einen Titer ≥1:1024 auf, die übrigen waren negativ.
NERY-GUIMARAES u. FRANKEN (1971) untersuchten die Seren von 54 Neuweltaffen, die aus
einem Institut und aus einem Zoo in Brasilien stammten, im SFT. Dabei wiesen von 17
Totenkopfaffen zwei einen Titer von 1:4 und einer einen Titer von 1:16 auf. Von 22 Gehaubten
Kapuzinern hatten vier einen Titer von 1:4. Alle übrigen Tiere zeigten negative Reaktionen. Die
Autoren bewerteten nur Titer von ≥ 1:16 als positiv.
In einer Studie von MURATA (1989) wurden insgesamt 360 Tiere aus einem Zoo in Kobe
untersucht. Die Blutproben wurden während tierärztlicher Behandlungen oder bei Sektionen über
einen Zeitraum von 8 Jahren gewonnen und im LAT auf Antikörper gegen T. gondii untersucht. Bei
den 189 von Säugetieren stammenden Proben waren 5 % positiv. Zu den untersuchten Spezies
zählten auch 56 Primaten. Von 13 Menschenaffen wurden drei Tiere als positiv beurteilt. Dabei
wiesen ein Gorilla und ein Gibbon einen Titer von 1:128 auf, bei einem Schimpansen wurde ein
Titer von 1:1024 festgestellt. Die übrigen Affen waren negativ.
ASAI et al. (1991) untersuchten die Seren von 443 Makaken im LAT auf Antikörper gegen T.
gondii. Die Seren wurden ab einem Titer >1:10 als positiv beurteilt. Die Tiere waren auf zwei
Institute verteilt. Eines diente dabei als Quarantänestation für Affen, die von den Philippinen neu
importiert wurden. Hier wurden 147 Javaneraffen untersucht, von denen vier Tiere positiv waren. In
2. Literaturübersicht
37
dem anderen Institut wurden die Tiere für experimentelle Zwecke und zur Abgabe an Zoologische
Gärten gehalten. Hier waren zehn von 234 Rotgesichts-Makaken, zwei von 54 Rhesusaffen, keiner
der fünf Hutaffen und keiner der drei Javaneraffen positiv. Damit ergab sich laut der Autoren
insgesamt eine Infektionsrate von 3,6 %.
CADAVID et al. (1991) untersuchten 47 aus einem Zoo in Medellin (Kolumbien) stammende
Kapuzineraffen im IFAT auf Antikörper gegen T. gondii. Die Seren wurden ab einer Verdünnung
von 1:64 als positiv beurteilt. Beim Nachweis von IgG-Antikörpern gegen T. gondii waren von 22
Weißstirn-Kapuzinern neun Tiere (41 %) und von 15 Weißschulter-Kapuzinern zwei Tiere (13 %)
positiv. Die zehn untersuchten Gehaubten Kapuziner waren alle negativ. Der IgM-Nachweis verlief
für alle 47 Tiere negativ. Es wurde daher eine chronische Infektion vermutet.
MONTALI et al. (1995) berichteten über ein Auswilderungsprojekt für Löwenäffchen in Brasilien.
Alle Tiere, die in das Programm integriert wurden, mussten zuvor zwei Quarantäneperioden
durchlaufen, in denen Impfungen der Tiere (z. B. gegen Tetanus und Tollwut) sowie zahlreiche
Routineuntersuchungen
vorgenommen
wurden.
Diese
beinhalteten
auch
serologische
Untersuchungen auf Hepatitis-Virus-, Herpes-Virus- und T.-gondii-Infektionen. Mehrere der Tiere
mussten aus dem Projekt ausgeschlossen werden, weil sie einen Antikörpertiter gegen T. gondii
aufwiesen.
ZHANG et al. (2000) untersuchten die Seren von 117 Tieren aus einem Zoo in China im MAT und
ELISA auf Antikörper gegen T. gondii. Der MAT wurde ab einem Titer von 1:20 als positiv
beurteilt. Von 16 untersuchten Primaten lieferten ein Katta, ein Hulock, ein Husarenaffe und ein
Bärenmakak in beiden Tests positive Ergebnisse. Die übrigen Affen waren negativ.
BRITT et al. (2004) berichteten von einem Projekt, in dem 13 Schwarzweiße Varis in Madagaskar
ausgewildert wurden. Diese durchliefen zuvor strenge Gesundheitskontrollen und es wurde neben
zahlreichen anderen Laboruntersuchungen auch ein ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen
T. gondii durchgeführt. Zwei Tiere wurden auf Grund hoher IgG-Antikörpertiter nicht ausgewildert.
Begründet wurde diese Entscheidung damit, dass eine Reaktivierung von latenten Infektionen nicht
ausgeschlossen werden konnte.
38
2. Literaturübersicht
Tab. 2: Untersuchungen auf Antikörper gegen T. gondii bei nicht humanen Primaten im
natürlichen Habitat
Gattung
Anzahl Anzahl Land
Testa
Referenz
unter- seroposuchter sitiver
Tiere Tiere
n
x (%)
Halbaffen
Nycticebus sp.
4
1 (25)
Malaysia
IHAT
ZAMAN u. GOH (1968)
Alouatta sp.
50
2 (4)
Frz. Guayana
MAT
CARME et al. (2002);
DE THOISY (2001, 2003)
Saimiri sp.
49
24 (49) Brasilien
IHAT
FERRARONI et al. (1980)
Saguinus sp.
21
1 (5)
Panama
SFT
FRENKEL u. SOUSA (1983)
Südafrika
?
2 (55)
1 (47)
15 (?)
KBR
IFAT
?
KASCHULA et al. (1978)
KASCHULA et al. (1978)
BAULU et al. (2002)
5
171
3 (60) Vietnam
?
26 (15) Indien, Malaysia KBR
164
94
211
44
170
52 (32) Philippinen,
SFT
Indien, Thailand
53 (56) Indien
IHAT
111 (53) Indien
IHAT
13 (30) Malaysia
IFAT, ELISA
21 (12) Sri Lanka
MAT
20
3 (15)
94
11 (12) Südafrika
7 (7)
IFAT, SFT
KBR
33
1 (3)
IFAT, ELISA SULAIMAN et al. (1989)
Neuweltaffen
Altweltaffen
Chlorocebus sp. ?
Macaca sp.
Papio sp.
Trachypithecus sp.
a
Barbados
Afrika
Malaysia
SFT
SERY et al. (1959)
UMINSKI u. PIETRZYK
(1961)
REMINGTON et al. (1965)
CHHABRA et al. (1976)
RAO BHAU et al. (1987)
SULAIMAN et al. (1989)
EKANAYAKE et al. (2004)
DE ROEVER-BONNET
(1972)
McCONNELL et al. (1973)
McCONNELL et al. (1973)
ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent Assay; IFAT, indirekter Fluoreszenzantikörpertest; IHAT,
indirekter
Hämagglutinationstest;
KBR,
Komplementbindungsreaktion;
MAT,
modifizierter
Agglutinationstest; SFT, Sabin-Feldman-Test; ?, unbekannt
2. Literaturübersicht
39
Tab. 3: Untersuchungen auf Antikörper gegen T. gondii bei nicht humanen Primaten nach
natürlicher Infektion in Gefangenschaft
Gattung
Anzahl Anzahl Testa
Referenz
unter- seroposuchter sitiver
Tiere Tiere
n
x (%)
Halbaffen
Lemur sp.
3
2
1
1 (33)
1 (50)
1 (100)
LAT
BORST u. VAN KNAPEN (1984)
ELISA, MAT ZHANG et al. (2000)
LAT, MAT SPENCER et al. (2004)
Varecia sp.
?
2 (?)
ELISA
BRITT et al. (2004)
Aotus sp.
40
3 (8)
?
PERRI et al. (1992)
Ateles sp.
1
1
1 (100)
1 (100)
IHAT
LAT
RIEMANN et al. (1974)
CHOI et al. (1987)
Cebus sp.
2
47
2 (100)
11 (23)
SFT
IFAT
NERY-GUIMARAES et al. (1971)
CADAVID et al. (1991)
Leontopithecus sp. ?
?
?
MONTALI et al. (1995)
Saimiri sp.
17
17
15 (88)
1 (6)
IFAT
SFT
CUNNINGHAM et al. (1992)
NERY-GUIMARAES u. FRANKEN (1971)
Erythrocebus sp.
2
1 (50)
ELISA, MAT ZHANG et al. (2000)
Macaca sp.
36
1
48
443
2
17 (47)
1 (100)
9 (19)
16 (4)
1 (50)
SFT
SFT, KBR
SFT
LAT
ELISA, MAT
FELDMAN u. MILLER (1956)
VAN DEN AKKER et al. (1959)
ARAUJO et al. (1973)
ASAI et al. (1991)
ZHANG et al. (2000)
Papio sp.
25
20 (80)
SFT
KUNTZ u. MYERS (1967)
Bunopithecus sp.
2
1 (50)
ELISA, MAT ZHANG et al. (2000)
Hylobates sp.
7
1 (14)
LAT
MURATA (1989)
Gorilla sp.
1
?
1 (50)
1 (?)
?
LAT
PROWTEN et al. (1985)
MURATA (1989)
Pan sp.
2
?
1 (50)
1 (?)
SFT
LAT
DRAPER et al. (1971)
MURATA (1989)
Pongo sp.
8
3 (38)
IHAT
YAMAMOTO et al. (1970)
Neuweltaffen
Altweltaffen
Menschenaffen
a
ELISA, Enzyme-linked Immunosorbent Assay; IFAT, indirekter Fluoreszenzantikörpertest; IHAT,
indirekter Hämagglutinationstest; KBR, Komplementbindungsreaktion; LAT, Latexagglutinationstest; MAT,
modifizierter Agglutinationstest; SFT, Sabin-Feldman-Test; ?, unbekannt
40
2. Literaturübersicht
2.5.3. Übertragungswege und Epidemiologie bei nicht humanen Primaten
Die Übertragungswege der bislang beobachteten spontanen T.-gondii-Infektionen bei nicht
humanen Primaten konnten meistens nicht geklärt werden (CHANG et al. 1980; WOOLF u.
ANTHONEY 1982; TUDGE 1991; DIETZ et al. 1997; INOUE 1997; EPIPHANIO et al. 1999a, b;
BACCIARINI et al. 2001a, b). Vermutlich stellen wie bei anderen herbivoren Zwischenwirten
sporulierte Oozysten die Hauptansteckungsquelle dar. Sowohl in Zoologischen Gärten als auch im
natürlichen Habitat kommen für die Ausscheidung von Oozysten nicht nur streunende Hauskatzen,
sondern auch zahlreiche wilde Feliden in Betracht (siehe Kap. 2.3.2.). Welche Rolle die wilden
Feliden in der Epidemiologie der Toxoplasmose spielen, ist jedoch unbekannt (LABELLE et al.
2001). In einer in Französisch Guayana durchgeführten Studie wurden T.-gondii-Infektionen bei
freilebenden Brüllaffen serologisch nachgewiesen. Bei den folivoren Tieren wurde eine Infektion
mit sporulierten Oozysten vermutet. Da Hauskatzen in der Gegend nicht vorkamen, nahm man an,
dass die Ooyzsten von wilden Feliden ausgeschieden wurden (CARME et al. 2002; DE THOISY
2001, 2003). In Zoologischen Gärten wurden bei Kattas und Neuweltaffen T.-gondii-Infektionen
beobachtet, nachdem sie engen Kontakt zu wilden Feliden hatten. Diese wurden entweder dauerhaft
in angrenzenden Käfigen gehalten oder konnten bei der Pflege kranker Tiere räumlich nicht von den
Affen getrennt werden (DUBEY et al. 1985a; CADAVID et al. 1991).
Eine Infektion mit T. gondii setzt allerdings keinen direkten Kontakt zu Katzen voraus, da die
Oozysten durch zahlreiche Vektoren verbreitet werden können (siehe auch Kap. 2.3.3.). Eine
Übertragung kann dabei durch kontaminiertes Trinkwasser oder mangelhaft gereinigtes Futter
erfolgen. Selbst durch das Waschen von Obst werden Oozysten unter Umständen nicht vollständig
entfernt (DUBEY et al. 1998b). Ein mit Oozysten verschmutzter Gehegeboden stellt ebenfalls eine
Infektionsquelle dar. Sägespäne, Blätter oder Sand, die als Einstreu nachträglich in die Käfige
verbracht werden, können bei unzureichender Lagerung als Katzentoilette dienen und auf diese
Weise kontaminiert werden (DIETZ et al. 1997). Dies wurde als Ursache für das massenhafte
Verenden von Kattas und Totenkopfaffen in einem Safaripark angesehen (BRACK et al. 1995b).
Bei freilebenden Primaten sind Tiere, die das Futter direkt vom Boden aufnehmen besonders
gefährdet, sich mit dem Parasiten zu infizieren (DE THOISY 2001, 2003). Eine Infektion kann
vermutlich auch durch die orale Aufnahme von Transportwirten wie Käfer und Schaben erfolgen
2. Literaturübersicht
41
(DIETZ et al. 1997; INOUE 1997). Im Falle eines infizierten Kattas vermuteten SPENCER et al.
(2004) den mechanischen Transport von Oozysten durch Stärlinge (Icteridae), die frei zwischen den
verschiedenen Gehegen hin und her fliegen konnten und daher als Vektor in Frage kamen. Die
Kattas wurden auf einer Insel isoliert von anderen Tieren gehalten, wodurch andere
Übertragungswege weitgehend ausgeschlossen werden konnten. Als Vektoren kommen nicht
zuletzt auch die Zoobesucher oder die Tierpfleger in Betracht, die Oozysten von der eigenen
Hauskatze oder von wilden Feliden in Affengehege transportieren können (CATAO-DIAS 2001).
BOUER et al. (1999) schilderten den Fall einer akuten Toxoplasmose bei Wollaffen, deren Pfleger
gleichzeitig für wilde Feliden zuständig war. Für gewöhnlich wurde das Katzengehege vor dem
Affengehege gereinigt und dabei dieselben Geräte und dieselbe Kleidung benutzt.
Beinhaltet die Ernährung der Affen eine Fleischkomponente, so kommt auch die Übertragung von
T. gondii durch die orale Aufnahme von Gewebezysten in Betracht. Es gibt einige Fallberichte, bei
denen die Quelle der T.-gondii-Infektionen in der Verfütterung von rohem oder nicht ausreichend
gekochtem Schaf-, Rind- oder Pferdefleisch gesehen wurde (McKISSICK et al. 1968;
BENIRSCHKE u. LOW 1970; HESSLER et al. 1971; DICKSON et al. 1983; BORST u. VAN
KNAPEN 1984; CUNNINGHAM et al. 1992). Durch den Verzehr von Schadnagern oder kleinen
Vögeln kann es bei nicht humanen Primaten ebenfalls zu einer Aufnahme der infektiösen
Gewebezysten kommen (HESSLER et al. 1971; GRINER 1983; CUNNINGHAM et al. 1992;
MONTALI u. BUSH 1999; BACCIARINI et al. 2001a, b). PERTZ et al. (1997) beschrieben das
Auftreten einer T.-gondii-Infektion bei vier Löwenäffchen, die zuvor dabei beobachtet wurden, wie
sie eine Maus gefangen und diese anschließend unter sich geteilt und gefressen haben. Ein Tier
wurde von dieser Futterteilung ausgeschlossen und war später das einzige, welches nicht erkrankte.
Eine Übertragung von T. gondii durch Tachyzoiten wurde bei nicht humanen Primaten bislang nur
experimentell nachgewiesen. SCHOONDERMARK-VAN DE VEN et al. (1993) erzeugten in einer
Studie an trächtigen Rhesusaffen eine vertikale Infektion mit T. gondii. Die Muttertiere wurden am
90. oder 130. Tag der Trächtigkeit intravenös mit Tachyzoiten infiziert. Zehn Tage nach der
Infektion wurde fetales Blut sowie Amnionflüssigkeit gewonnen und in Mäuse inokuliert sowie
eine PCR durchgeführt. Stimmten die Ergebnisse aus beiden Verfahren nicht überein, wurden
zusätzlich die Organe der Neonaten mikroskopisch auf T. gondii untersucht. Eine transplazentare
Übertragung wurde auf diese Weise bei vier von neun Feten nachgewiesen.
42
2. Literaturübersicht
Experimentell wurde auch eine horizontale Infektion mit T. gondii durch die Übertragung von
Tachyzoiten nachgewiesen. In einer Studie von ESCAJADILLO u. FRENKEL (1991) wurden
Nachtaffen zunächst subcutan mit Tachyzoiten und nach einigen Wochen oral oder subcutan mit
Gewebezysten infiziert. Zwei nicht experimentell infizierte Kontrolltiere starben daraufhin an einer
akuten Toxoplasmose. Es wurde vermutet, dass Tachyzoiten über Milch, Speichel, Urin oder Kot
von den experimentell infizierten Nachtaffen ausgeschieden und von den nicht experimentell
infizierten Tieren aufgenommen wurden.
In einer Studie von FURUTA et al. (2001) wurden oral mit T.-gondii-Gewebezysten infizierte
Totenkopfaffen mit nicht infizierten in einem Käfig gehalten. Bei den nicht experimentell
infizierten Tieren kam es zu einer Serokonversion, die durch einen Immunoblot festgestellt wurde,
und mittels PCR konnte DNA von T. gondii in Leber und Lunge der Tiere nachgewiesen werden.
Im Gegensatz zu den oral infizierten Affen waren jedoch weder klinische Symptome noch
histopathologische Veränderungen oder Tachyzoiten in den Geweben auszumachen. Da in der
bronchoalveolären Lavage der oral infizierten Totenkopfaffen eine große Menge an Tachyzoiten
nachgewiesen werden konnte, wurde eine Übertragung durch Aerosol vermutet.
Vereinzelt kann es sich bei den beobachteten Krankheitsfällen auch um reaktivierte latente
Infektionen handeln. Eine Reaktivierung kann z. B. durch Stresssituationen ausgelöst werden. Bei
Wildfängen kann die Übertragung von T. gondii dabei schon im natürlichen Habitat stattgefunden
haben (JUAN-SALLES et al. 1997).
Je nach Ansteckungsquelle kann sich eine Übertragung von T. gondii als Einzeltier- oder als
Gruppenerkrankung auswirken, sowie endemisch oder epidemisch in Erscheinung treten
(ANDERSON u. McCLURE 1993). Handelt es sich um sporadische Infektionen einzelner Tiere, so
ist als Übertragungsweg z. B. das Verzehren eines infizierten Schadnagers oder die Verbreitung von
Oozysten durch Vektoren wie Insekten denkbar. Ist in einem Bestand die Möglichkeit eines
derartigen Übertragungsweges gegeben, so können Infektionen zeitlich unbegrenzt stattfinden.
Kommt es daraufhin über einen längeren Zeitraum hinweg wiederholt zu Erkrankungen, kann man
von einem endemischen Auftreten der Infektion sprechen (JUAN-SALLES et al. 1997).
2. Literaturübersicht
43
Bei einem seuchenhaften Ausbruch der Erkrankung kann man hingegen davon ausgehen, dass die
Übertragung des Erregers zu einem bestimmten Zeitpunkt stattfand (CUNNINGHAM et al. 1992).
Gleichzeitig muss die Ansteckungsquelle eine ausreichende Anzahl von Parasiten enthalten, mit der
sich eine ganze Tiergruppe infizieren kann (Punktquelle). Denkbar wäre in einem solchen Fall die
Kontamination des Futters mit Oozysten oder die Verfütterung von rohem, zystenhaltigem Fleisch.
Ist ein solcher Ausbruch auf einen bestimmten Zeitraum begrenzt, kann von einem epidemischen
Auftreten gesprochen werden. T.-gondii-Epidemien sind bei Neuweltaffen in Gefangenschaft durch
eine hohe Mortalitätsrate von über 50 % charakterisiert (DIETZ et al. 1997).
2.5.4. Fallberichte
In der Tab. 4 sind Fallberichte über klinische Toxoplasmosen bei nicht humanen Primaten
zusammengestellt. Es sind dabei nur diejenigen klinischen Toxoplasmosen aufgeführt, die nicht
experimentell hervorgerufen wurden. Die Berichte beziehen sich auf Tiere, die zum Zeitpunkt der
Erkrankung in zoologischen Gärten, in Forschungseinrichtungen oder von Privatpersonen gehalten
wurden. Berichte über klinische Toxoplasmosen im natürlichen Habitat gibt es bisher keine. In
einer Studie von McCONNELL et al. (1973) konnte der Parasit zwar bei wildlebenden Pavianen
nachgewiesen werden, klinische Symptome einer Toxoplasmose wurden aber bei keinem der Affen
beobachtet. Die Tiere wurden in freier Wildbahn gefangen und anschließend euthanasiert, um sie
auf verschiedene Krankheitserreger hin zu untersuchen. Dabei wurden bei vier von 94 Pavianen T.gondii-Zysten im Gehirn sowie in der Herz- und Skelettmuskulatur gefunden. Von diesen vier
Pavianen zeigten alle ein positives Ergebnis im SFT, im IFAT und in der KBR. Sieben weitere der
94 untersuchten Tiere waren ebenfalls serologisch positiv.
Ein ähnlicher Fall wird von ZAMAN u. GOH (1968) beschrieben. Hier wurde bei vier Plumploris,
die in Malaysia gefangen wurden, eine serologische Untersuchung auf T. gondii im IHAT
durchgeführt, woraufhin das einzige positive Tier euthanasiert wurde. Bei der anschließenden
Sektion konnten Zysten im Gehirn des Halbaffen gefunden werden. Es handelte sich in diesem Fall
ebenfalls um eine latente Infektion.
44
2. Literaturübersicht
Bei den in der Tab. 4 aufgeführten Fallberichten mit unbekannter Gruppengröße und unbekannter
Anzahl erkrankter Tiere handelt es sich um die Schilderung von Sektionsbefunden, ohne dass die
jeweiligen Vorberichte erwähnt werden. Es gibt jedoch auch sehr detaillierte Fallberichte, in denen
neben den beobachteten klinischen Symptomen die genaue Anzahl der erkrankten und verendeten
Tiere angegeben wird. Dabei wird deutlich, dass sich eine Toxoplasmose bei nicht humanen
Primaten sowohl als Einzeltiererkrankung auswirken, aber auch eine ganze Gruppe von Tieren
betreffen kann. So trat laut ANDERSON u. McCLURE (1982) bei einer Gruppe von 15
Totenkopfaffen bei einem einzelnen Tier eine Toxoplasmose auf, während bei den von TUDGE
(1991) und CUNNINGHAM et al. (1992) geschilderten Berichten von 17 Totenkopfaffen sämtliche
Tiere betroffen waren.
In den meisten Fallberichten endeten die beschriebenen Toxoplasmosen letal. In Einzelfällen konnte
jedoch eine Rekonvaleszenz erkrankter Tiere beobachtet werden. Laut ISENBÜGEL (1983)
erkrankten in einem Bestand von 16 Kattas mehrere Tiere verschiedenen Alters und Geschlechts.
Die Tiere verweigerten die Nahrungsaufnahme und entwickelten neurologische Störungen.
Innerhalb eines Zeitraums von 3 Wochen verstarben sechs der Tiere und gelangten nacheinander
zur Sektion. Hier wurde bei jedem der Tiere eine disseminierte Toxoplasmose diagnostiziert. Beim
ersten Hinweis auf eine T.-gondii-Infektion wurde bei allen erkrankten Tieren eine spezifische
Therapie mit Sulfadiazin und Pyrimethamin eingeleitet. Zwei der erkrankten Tiere haben unter
dieser Therapie die Toxoplasmose überlebt.
CUNNINGHAM et al. (1992) beschrieben das Auftreten einer akuten disseminierten Toxoplasmose
in einer Gruppe von 17 Totenkopfaffen. Jedes der Tiere zeigte sich lethargisch, die meisten waren
inappetent und hatten Diarrhö. Innerhalb weniger Tage verstarben fünf Tiere. Anschließend konnte
bei den übrigen Affen eine Besserung der klinischen Symptome beobachtet werden, und eine
Woche nach dem ersten Todesfall schien sich das
Allgemeinbefinden der Kolonie zu
normalisieren. Drei Wochen später starb ein weiteres Tier, erneute Erkrankungen wurden nicht
beobachtet. Vier der sechs gestorbenen Tiere wurden im IFAT auf Antikörper gegen T. gondii
untersucht. Alle vier wiesen einen IgG-Titer und drei einen IgM-Titer gegen T. gondii auf. Auch
von den überlebenden Totenkopfaffen wurden 47 Tage nach dem ersten Todesfall Blutproben
entnommen und diese serologisch untersucht. Bei allen Tieren konnten IgG- und bei sechs Tieren
IgM-Antikörper gegen T. gondii nachgewiesen werden.
2. Literaturübersicht
45
In einem von TUDGE (1991) beschriebenen Fall erkrankten 17 Totenkopfaffen an einer
Toxoplasmose. Fünf der Tiere starben innerhalb von 3 Tagen, das dominante Männchen 3 Wochen
später. Bei der anschließenden Sektion konnte T. gondii immunhistochemisch nachgewiesen
werden. Aus den 11 überlebenden Tieren und einem neu integrierten dominanten Männchen wurde
eine neue Zuchtgruppe aufgebaut, doch nach einem Jahr brach die Krankheit erneut aus und es
verstarben weitere fünf Tiere. Die Infektionsquelle konnte nicht ermittelt werden.
T. gondii kann je nach Übertragungsweg (siehe Kap. 2.5.3.) zur gleichen Zeit in verschiedenen
Affenkolonien Erkrankungen hervorrufen. BORST u. VAN KNAPEN (1984) beschrieben einen
Fall, in dem innerhalb eines Zeitraumes von 4 Wochen sechs von 19 Kattas, sechs von 31
Totenkopfaffen und zwei von vier Nachtaffen an einer Toxoplasmose starben. Alle betroffenen
Tiere zeigten 2 bis 12 Tage lang unspezifische Krankheitssymptome. Als Infektionsquelle wurde
die Verfütterung von rohen Schafherzen etwa 2 Wochen vor dem Auftreten der ersten
Erkrankungen vermutet. Direkt nach dem Auftreten der ersten klinischen Symptome wurden
insgesamt 14 Tieren der verschiedenen Affenspezies Blutproben entnommen und im LAT auf
Antikörper gegen T. gondii untersucht. Diese waren alle negativ, wodurch ein früherer Kontakt zu
T. gondii ausgeschlossen wurde, mit der Schlussfolgerung, dass es sich um eine frische Infektion
handeln musste. Drei der erkrankten und später verstorbenen Kattas wurden ebenfalls serologisch
untersucht, wobei nur eines dieser Tiere einen Antikörpertiter gegen T. gondii aufwies. Dieser
Befund wurde mit dem akuten Verlauf der Erkrankung erklärt. Die überlebenden Tiere des KattaBestandes blieben auch 2 Monate nach den ersten Todesfällen serologisch negativ. Daraus wurde
der Schluss gezogen, dass sich innerhalb eines engen Zeitraums nur eine begrenzte Anzahl der
Tiere infizieren konnte.
2.5.4.1. Klinische Toxoplasmosen bei Altweltaffen
Aus der Tab. 4 wird deutlich, dass der überwiegende Teil der klinischen Toxoplasmosen bei
Neuweltaffen und Lemuren beobachtet wurde. Bei Altweltaffen einschließlich der Menschenaffen
lässt sich eine Infektion mit T. gondii zwar häufig serologisch nachweisen (BRACK et al. 1995a),
diese verläuft bei diesen Tieren aber in der Regel latent. Es gibt jedoch auch einzelne Berichte über
klinische Toxoplasmosen bei Altweltaffen.
46
2. Literaturübersicht
In einer Studie von WONG u. KOZEK (1974) wurden 1400 Sektionsberichte von Makaken
ausgewertet, die in einem kalifornischen Forschungszentrum starben. Dabei wurde in vier Fällen
eine Toxoplasmose diagnostiziert. Vor ihrem Verenden konnten bei den vier Makaken
Konvulsionen, Gewichtsverluste, vergrößerte Lymphknoten, Nasenausfluss und intermittierende
Diarrhö beobachtet werden. Die Tiere waren chronischen Stresssituationen in Form von
Bestrahlungen, chirurgischen Eingriffen, experimentellen Malaria-Infektionen, Bisswunden sowie
konkurrierenden Bakterien- und Parasiteninfektionen ausgesetzt. Es wurde daher diskutiert, dass
sich diese Einflüsse prädisponierend auf die Ausbildung der Toxoplasmose ausgewirkt haben
könnten.
VAN DEN AKKER et al. (1959) beobachteten bei einem Makaken chronische Diarrhö. Im SFT
hatte das Tier einen Titer von 1:512 und in der KBR von 1:32. Nach der Euthanasie konnten aus
dem Gehirn Bradyzoiten isoliert werden, die pathologisch-anatomische Untersuchung verlief
negativ. Ein weiterer Fall einer klinischen Toxoplasmose konnte bei einem jungen Rhesusaffen
beobachtet werden. Dieser war zusammen mit anderen Tieren untergebracht, die experimentell mit
T. gondii infiziert wurden. Das Tier verstarb nach kurzer Krankheitsdauer (NERY-GUIMARÃES
et al. 1971). Ein 3 Jahre alter Schimpanse starb nachdem er zentralnervöse Störungen entwickelt
hatte. Das Gehirn des Tieres wurde daraufhin auf eine eventuelle Tollwut-Infektion hin untersucht,
dabei wurden Gewebezysten von T. gondii entdeckt (SCHOBERT 1970 zit. von McCLURE u.
GUILLOUD 1971).
Bei den von LEVADITI u. SCHOEN (1933) sowie von KOPCIOWSKA u. NICOLAU (1938)
geschilderten Fällen ist zweifelhaft, ob die Übertragung von T. gondii auf natürlichem Weg
stattfand oder experimentell verursacht wurde (REMINGTON et al. 1965). LEVADITI u. SCHOEN
(1933)
berichteten
Lymphknotengewebe
von
von
einer
Toxoplasmose
einem
bei
Meerschweinchen
einem
Pavian.
verabreicht,
Dem
Tier
wurde
welches
mit
einem
primatenpathogenen Virus infiziert war. Fünf Tage nach der Inokulation starb der Pavian an einer
Meningoenzephalitis. Im Gehirn des Tieres wurden T.-gondii-Zysten gefunden, die eine große
Anzahl an Parasiten enthielten. Obwohl bei einer anschließenden histologischen Untersuchung der
Lymphknoten des Meerschweinchens keine Gewebezysten gefunden wurden, wurde die Spontanität
2. Literaturübersicht
47
der Toxoplasmose angezweifelt, da nicht sicher ausgeschlossen werden konnte, dass T. gondii auf
diesem Weg übertragen wurde.
KOPCIOWSKA u. NICOLAU (1938) beschrieben eine spontane Toxoplasmose bei einem
Schimpansen. Dieser wurde euthanasiert, nachdem er 15 Tage zuvor intrazerebral mit dem Gehirn
eines Kaninchens inokuliert wurde, das mit dem Aujeszky-Virus infiziert war. Im Gehirn des
Schimpansen wurde neben virusinduzierten Läsionen eine einzige T.-gondii-Zyste gefunden.
In der Abb. 2 ist dargestellt, wie sich die in der Tab. 4 aufgelisteten 238 Todesfälle prozentual auf
die unterschiedlichen Spezies verteilen. Dabei wird deutlich, dass der Anteil der Altweltaffen, die in
Folge einer Toxoplasmose gestorben sind, nur sehr gering ist (3 %), während die Neuweltaffen mit
insgesamt 184 Todesfällen (77 %) den mit Abstand größten Anteil ausmachen. Dabei entfallen über
die Hälfte der Todesfälle unter den Neuweltaffen auf die Totenkopfaffen. Bei den Halbaffen sind
die Kattas mit 42 Todesfällen (18 %) die am häufigsten betroffene Spezies. Ein objektiv belegbarer
Grund dafür, warum Neuweltaffen und Lemuren so signifikant häufiger mit letalen Erkrankungen
auf eine T.-gondii-Infektion reagieren als Altweltaffen, konnte bislang nicht gefunden werden
(BRACK et al. 1995b).
Die Zahl der hier aufgeführten in den vergangenen Jahrzehnten durch eine Toxoplasmose
verursachten Todesfälle scheint in Bezug auf die Gesamtpopulationen der weltweit von Menschen
gehaltenen nicht humanen Primaten gering. Beispielsweise wurden in einer Studie von LEONG et
al. (2004) retrospektiv die Todesursachen von 276 Lisztaffen untersucht, die innerhalb eines
Zeitraumes von 4 Jahren in verschiedenen Institutionen in den USA starben. Dabei wurde nur in
einem einzigen Fall eine disseminierte Toxoplasmose diagnostiziert. Es muss aber berücksichtigt
werden, dass, wenn in den Tierbeständen eine Toxoplasmose auftritt, es innerhalb weniger Tage zu
großen Verlusten unter den teilweise sehr wertvollen und artgeschützten Tieren kommen kann. Die
Toxoplasmose kann daher bei seuchenhaften Ausbrüchen sowie in Problembeständen, in denen der
Erreger endemische Infektionen hervorruft, von großer Bedeutung sein. So kam es in einem
norddeutschen Safaripark innerhalb weniger Jahre zu massiven Verlusten innerhalb des Bestandes
an Kattas und Totenkopfaffen. Der zweimalige Versuch, eine Zuchtgruppe unter den Kattas
aufzubauen, scheiterte daran, dass 15 von 17 und sechs von 17 Tieren an einer Toxoplasmose
starben (BRACK et al. 1995b, 1998; WOHLSEIN et al. 1999).
48
2. Literaturübersicht
Tab. 4: Klinische Toxoplasmosen bei nicht humanen Primaten nach natürlicher Infektion
Gattung
Anzahl der Tiere Anzahl Referenz
mit klinischen
verenSymptomen
deter
x/n
Tiere
Halbaffen
Hapalemur sp.
3/?
3
HARING u. DAVIS (1998)
Lemur sp.
1/?
1/?
2/2
1
1
2
8/16
6/19
4/6
15/17
6/17
1/?
6
6
4
15
6
1
SUREAU et al. (1962)
UILENBERG u. RIBOT (1965)
ITAKURA u. NIGI (1968); NIGI u. ITAKURA
(1968)
ISENBÜGEL (1983)
BORST u. VAN KNAPEN (1984)
DUBEY et al. (1985a)
BRACK et al. (1995b); WOHLSEIN et al. (1999)
BRACK et al. (1998)
SPENCER et al. (2004)
Nycticebus sp.
1a /4
1b
ZAMAN u. GOH (1968)
Propithecus sp.
1/1
1
CHANG et al. (1980)
Varecia sp.
1/?
1
UILENBERG u. RIBOT (1965)
Alouatta sp.
1/1
?
1
6
THEZE (1916)
EPIPHANIO et al. (2003)
Aotus sp.
2/?
2/4
?
2
2
1
SEIBOLD u. WOLF (1971)
BORST u. VAN KNAPEN (1984)
EPIPHANIO et al. (2003)
Ateles sp.
1/?
1
RATCLIFFE u. WORTH (1951)
Cacajao sp.
1/?
?
1
1
RATCLIFFE (1954)
RATCLIFFE (1961)
Callicebus sp.
1/1
1
SEIBOLD u. WOLF (1971)
Callithrix sp.
?
3/16
?
?
6
3
1
3
HILGENFELD (1965a, b, 1966)
DIETZ et al. (1997)
JENSEN et al. (1998)
EPIPHANIO et al. (2003)
Cebus sp.
1/?
1/?
1b
1
DE RODANICHE (1954a)
NERY-GUIMARÃES et al. (1971)
Lagothrix sp.
1/3
?
1
1
STOLZ (1962)
BENIRSCHKE u. LOW (1970)
Neuweltaffen
?, unbekannt; a T. gondii nur histologisch nachgewiesen, Tiere ohne klinische Symptome; b Euthanasie
2. Literaturübersicht
49
Tab. 4: Klinische Toxoplasmosen bei nicht humanen Primaten nach natürlicher Infektion
(Fortsetzung)
Gattung
Anzahl der Tiere Anzahl Referenz
mit klinischen
verenSymptomen
deter
x/n
Tiere
Lagothrix sp.
1
3
5
HESSLER et al. (1971)
BOUER et al. (1999)
EPIPHANIO et al. (2003)
Leontopithecus sp. ?
?
?
2/?
4/5
3/3
?
2
3
3
2
4
3
10
RATCLIFFE (1961)
HILGENFELD (1966)
GRINER (1983)
DIETZ et al. (1997)
PERTZ et al. (1997)
JUAN-SALLES et al. (1998)
EPIPHANIO et al. (2003)
Pithecia sp.
?
?
1
2
RATCLIFFE (1954)
ZWART et al. (1989)
Saimiri sp.
2/?
1/?
1/?
?
2
1
1
1
9/17
1/15
3/5
17/21
6/31
?
17/17
17/17
?/14
9/28
5/?
8/14
?
3/?
9
1
3
17
6
7
11
6
2
9
5
8
3
3
RATCLIFFE u. WORTH (1951)
RATCLIFFE (1954)
DÖBEREINER (1955)
ZUCKERMAN (1956) zit. von HILGENFELD
(1966)
McKISSICK et al. (1968)
ANDERSON u. McCLURE (1982)
WOOLF u. ANTHONEY (1982)
DICKSON et al. (1983)
BORST u. VAN KNAPEN (1984)
ZWART et al. (1989)
TUDGE (1991)
CUNNINGHAM et al. (1992)
BRACK et al. (1995b); WOHLSEIN et al. (1999)
BACCIARINI et al. (2001a, b)
INOUE (1997)
BRACK et al. (1998)
EPIPHANIO et al. (2003)
ANDRADE et al. (2004)
1/2
?
4/7
3/?
3/3
1
1
4
3
3
BENIRSCHKE u. RICHART (1960)
GRINER (1983)
BRACK et al. (1995b)
DIETZ et al. (1997)
WOHLSEIN et al. (1999)
Saguinus sp.
1/?
3/?
?
?, unbekannt; a T. gondii nur histologisch nachgewiesen, Tiere ohne klinische Symptome; b Euthanasie
50
2. Literaturübersicht
Tab. 4: Klinische Toxoplasmosen bei nicht humanen Primaten nach natürlicher Infektion
(Fortsetzung)
Gattung
Anzahl der Tiere Anzahl Referenz
mit klinischen
verenSymptomen
deter
x/n
Tiere
Saguinus sp.
?
1/276
5
1
EPIPHANIO et al. (2003)
LEONG et al. (2004)
Macaca sp.
1/?
1/?
4/1400
1b
1
4
VAN DEN AKKER et al. (1959)
NERY-GUIMARÃES et al. (1971)
WONG u. KOZEK (1974)
Pan sp.
1a /?
1/?
1b
1
Papio sp.
1/?
4/94a
1
94b
KOPCIOWSKA u. NICOLAU (1938)
SCHOBERT (1970) zit. von McCLURE u.
GUILLOUD (1971)
LEVADITI u. SCHOEN (1933)
McCONNELL et al. (1973)
Altweltaffen
?, unbekannt; a T. gondii nur histologisch nachgewiesen, Tiere ohne klinische Symptome; b Euthanasie
3%
2%
18%
40%
37%
Altweltaffen
Halbaffen außer Kattas
Kattas
Neuweltaffen außer Totenkopfaffen
Totenkopfaffen
Abb. 2: Todesfälle durch T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen Primaten (n = 238)
2. Literaturübersicht
51
2.5.5. Klinische Symptome und Verlauf der Erkrankung
Das Krankheitsbild einer Toxoplasmose bei nicht humanen Primaten ist variabel und unspezifisch
(McKISSICK et al. 1968). Klinische Symptome lassen sich insbesondere bei Lemuren und
Neuweltaffen beobachten. Altweltaffen einschließlich der Menschenaffen erkranken hingegen
selten klinisch, obwohl laut BRACK et al. (1995a) auch bei ihnen häufig eine Infektion mit T.
gondii serologisch nachweisbar ist (siehe Kap. 2.5.2.). Die in 35 Fallberichten am häufigsten
genannten klinischen Symptome sind in Tab. 5 zusammengestellt. Die Beobachtungen beziehen
sich dabei alle auf Tiere, die sich zum Zeitpunkt der Erkrankung in Gefangenschaft befanden.
Berichte über klinische Toxoplasmosen im natürlichen Habitat gibt es bislang keine.
Bei Neuweltaffen und Lemuren lassen sich akute disseminierte Toxoplasmosen beobachten, wie sie
auch in der Humanmedizin von immundefizienten Patienten bekannt sind (referiert in
CUNNINGHAM et al. 1992). Häufig kommt es bei diesen Tieren zu plötzlichen Todesfällen, denen
ein kurzes Krankheitsgeschehen von 1 bis 11 Tagen vorausgegangen ist (POTKAY 1992). Es gibt
jedoch auch zahlreiche Berichte über ein Verenden der Tiere, ohne dass zuvor klinische Symptome
beobachtet werden konnten. In einer Studie von EPIPHANIO et al. (2003) geschah dies mit einer
Häufigkeit von 44 %. Oft sind die Tiere zum Zeitpunkt des Todes in einer guten körperlichen
Verfassung, was den akuten Verlauf der Erkrankung deutlich macht (HESSLER et al. 1971;
CUNNINGHAM et al. 1992; BOUER et al. 1999; EPIPHANIO et al. 2000, 2001, 2003). Es können
Tiere jeder Altersstufe erkranken, wobei es sich je nach Infektionsquelle um Einzeltiererkrankungen
oder um die Infektion einer gesamten Gruppe handelt (siehe Kap. 2.5.3.).
Zu den beobachteten unspezifischen klinischen Symptomen gehören Fieber oder Hypothermie
sowie blasse Schleimhäute und Gewichtsverluste. Im Differentialblutbild kann die Ausbildung einer
Leukozytose oder einer Leukopenie festgestellt werden. Die Tiere sind im Allgemeinen durch
Schwäche, Depression und Bewegungsunlust gekennzeichnet oder befinden sich in einem
somnolenten, lethargischen oder apathischen Zustand. Die Bewusstseinsstörungen können sich bis
hin zum Koma verstärken. Die erkrankten Tiere zeigen eine zusammengekauerte Körperhaltung,
isolieren sich vom Rest der Gruppe oder sitzen dicht aneinandergedrängt im Gehege.
Verdauungsstörungen äußern sich durch verminderten Appetit bis hin zu Anorexie. Von
McKISSICK et al. (1968) wurden auch übermäßige Nahrungs- und Wasseraufnahme beobachtet.
52
2. Literaturübersicht
Häufig beobachtete Symptome sind Erbrechen sowie das Auftreten von ungeformtem Kot oder
Diarrhö. Im Zusammenhang mit einer durch T. gondii verursachten Pankreatitis wurde bei einem
Tier Hyperglykämie in Verbindung mit Polydipsie und Polyurie festgestellt (CHANG et al. 1980).
Bei Beteiligung des Respirationstraktes wurden Dyspnoe, Tachypnoe und Husten beobachtet, bei
dem es auch vereinzelt zur Haemoptyse kam. Auch Reibungsgeräusche bei Auskultation der Lunge
wurden festgestellt (NIGI u. ITAKURA 1968). Einzelne Tiere entwickelten einen Augen- und
Nasenausfluss, wobei auch Epistaxis beobachtet wurde (McKISSICK et al. 1968; EPIPHANIO et
al. 2001, 2003).
Beim Auftreten von neurologischen Symptomen kann es zu Kreisbewegungen, ataktischen
Bewegungsstörungen oder zur Ausbildung von Paresen kommen, die ein- oder beidseitig in
Erscheinung treten können. Erkrankte Tiere haben teilweise stark verlangsamte Reflexe oder
entwickeln einen Strabismus. Auch das Auftreten von Konvulsionen wurde beschrieben.
Ein Totenkopfäffchen wurde dabei beobachtet, wie es wiederholt seinen Kopf gegen die
Käfigwände schlug (McKISSICK et al. 1968).
Bei trächtigen Weibchen wurden Aborte sowie Früh- oder Totgeburten beobachtet (BRACK et al.
1998; WOHLSEIN et al. 1999).
Fälle von chronischer Toxoplasmose sind bei Neuweltaffen und Lemuren selten. McKISSICK et al.
(1968) beschrieben jedoch bei einem Totenkopfaffen das Auftreten von protrahierter Diarrhö, die
bereits 43 Tage vor dem Tod des Tieres auftrat. Ein anderer Totenkopfaffe wurde erst zwei Monate
nach Ausbruch der Krankheit auf Grund von neurologischen Symptomen eingeschläfert
(BACCIARINI et al. 2001a). Laut DUBEY (1986) ist das Überleben von erkrankten Tieren selten.
In Einzelfällen konnte jedoch eine Rekonvaleszenz beobachtet werden (ISENBÜGEL 1983;
TUDGE 1991; CUNNINGHAM et al. 1992). Diese Fälle sind in Kap. 2.5.4. ausführlich dargestellt.
Bei Altwelt- und Menschenaffen verläuft eine Infektion mit T. gondii meistens latent. Treten
klinische Symptome auf, so sind sie im Allgemeinen weniger schwer wiegend als bei Neuweltaffen
(WONG et al. 1974; BRACK et al. 1995b). Es wurden Lustlosigkeit, Anorexie, eine Schwellung
der oberflächlichen Lymphknoten, Fieber, Gewichtsverluste, Nasenausfluss und Diarrhö
beobachtet, welche intermittierend oder protrahiert in Erscheinung trat (MOHR et al. 1955; VAN
2. Literaturübersicht
53
DEN AKKER et al. 1959; DRAPER et al. 1971; WONG et al. 1974; WONG u. KOZEK 1974).
MOHR et al. (1955) berichteten zudem von Schwäche, Leukopenie und dem Auftreten von
Konvulsionen.
Experimentell konnte bei Makaken und Meerkatzen eine okuläre Toxoplasmose durch die Injektion
von Tachyzoiten in die Retina erzeugt werden (CULBERTSON et al. 1982; HOLLAND et al.
1988). Die dadurch entstandene Retinochorioiditis äußerte sich in gelb-weißen Läsionen der Retina,
die nach Abheilung eine Narbe hinterließen. Zudem konnten HOLLAND et al. (1988)
Gewichtsverluste und Diarrhö bei den Tieren beobachten.
Die wenigen in der Literatur beschriebenen Fälle von klinischen Toxoplasmosen bei Altweltaffen
beziehen sich jedoch auf experimentell infizierte oder unter chronischen Stresssituationen leidende
Tiere, bei denen es auch vereinzelt zu Todesfällen kam (COWEN u. WOLF 1945; MOHR et al.
1955; NERY-GUIMARAES et al. 1971; WONG u. KOZEK 1974).
54
2. Literaturübersicht
Tab. 5: Häufigkeit beobachteter klinischer Symptome bei Toxoplasmosen bei nicht humanen
Primaten
Klinisches
Auftreten in
Referenz
Symptom
35 Fallberichten
Abs. H. Rel. H.
(n)a
(%)b
Anorexie
19
54
MOHR et al. (1955); BENIRSCHKE u. RICHART (1960); STOLZ
(1962); HILGENFELD (1966); McKISSICK et al. (1968); NIGI u.
ITAKURA (1968); WERNER et al. (1969); DRAPER et al. (1971);
NERY-GUIMARAES et al. (1971); HESSLER et al. (1971);
ISENBÜGEL (1983); BORST u. VAN KNAPEN (1984);
CUNNINGHAM et al. (1992); BRACK et al. (1998); JUAN-SALLES
et al. (1998); WOHLSEIN et al. (1999); EPIPHANIO et al. (2001,
2003); SPENCER et al. (2004)
Dyspnoe
12
34
BENIRSCHKE u. RICHART (1960); HILGENFELD (1966);
McKISSICK et al. (1968); WOOLF u. ANTHONEY (1982);
DICKSON et al. (1983); DIETZ et al. (1997); JUAN- SALLES
et al. (1998); BACCIARINI et al. (2001a); EPIPHANIO et al. (1999b,
2001, 2003); SPENCER et al. (2004)
Apathie/Lethargie 11
31
HILGENFELD (1966); McKISSICK et al. (1968); CUNNINGHAM
et al. (1992); WERNER et al. (1969); HESSLER et al. (1971);
BOUER et al. (1999); EPIPHANIO et al. (1999b, 2001); WOHLSEIN
et al.(1999); BACCIARINI et al. (2001a); SPENCER et al. (2004)
Diarrhoe
10
29
MOHR et al. (1955); VAN DEN AKKER et al. (1959); STOLZ
(1962); UILENBERG u. RIBOT (1965); McKISSICK et al. (1968);
HESSLER et al. (1971); WONG u. KOZEK (1974); CUNNINGHAM
et al. (1992); BOUER et al. (1999); BACCIARINI et al. (2001a)
Erbrechen
6
17
BENIRSCHKE u. RICHART (1960); STOLZ (1962); McKISSICK
et al. (1968); BOUER et al. (1999); BACCIARINI et al. (2001a, b);
EPIPHANIO et al. (2003)
Fieber
5
14
DE RODANICHE (1954b); MOHR et al. (1955); STOLZ (1962);
NERY-GUIMARAES et al. (1971); WONG et al. (1974)
Hypothermie
5
14
UILENBERG u. RIBOT (1965); HILGENFELD (1966); CHANG et
al. (1980); EPIPHANIO et al. (2001, 2003)
Ataxie
4
11
McKISSICK et al. (1968); DICKSON et al. (1983);
ISENBÜGEL (1983); EPIPHANIO et al. (2001)
Konvulsionen
3
9
MOHR et al. (1955); CHANG et al. (1980); DICKSON et al. (1983)
Paresen
2
6
CHANG et al. (1980); ISENBÜGEL (1983)
Aborte
2
6
BRACK et al. (1998); WOHLSEIN et al. (1999)
keine
(plötzlicher Tod)
11
31
ANDERSON u. McCLURE (1982); WOOLF u. ANTHONEY (1982);
DICKSON et al. (1983); DIETZ et al. (1997); PERTZ et al. (1997);
BRACK et al. (1998); BACCIARINI (2001a); FURUTA et al. (2001);
EPIPHANIO et al. (1999a, b, 2003)
a
, absolute Häufigkeit; b, relative Häufigkeit
2. Literaturübersicht
55
2.5.6. Pathologie und Pathogenese
Während der ungeschlechtlichen Vermehrung des Parasiten im Zwischenwirt kommt es zu einem
massenhaften Befall der Parenchymzellen. Tachyzoiten dringen aktiv in die Wirtszellen ein und
vermehren sich explosionsartig. Eine Wirtszelle füllt sich nach mehreren Teilungsvorgängen an,
kann aber nur maximal 32 Tachyzoiten aufnehmen (FRENKEL 2000). Danach geht sie zugrunde
und die Tachyzoiten werden frei, um in benachbarte Zellen einzudringen. Das Absterben
parasitenbefallener Wirtszellen verursacht Gewebenekrosen, die sich durch den Tod vieler
benachbarter Zellen herdförmig ausbreiten. Auf die Zerstörung der Zellen folgt in der Regel eine
Infiltration mit Entzündungszellen (GARDINER et al. 1998). Wird durch den Parasiten eine starke,
unkontrollierte Immunantwort induziert, stellt dies möglicherweise die Hauptursache für die
Organschäden und damit auch für die Letalität der Toxoplasmose dar (referiert in EPIPHANIO et
al. 2003). Vermutlich spielt bei der Pathogenese der akuten Toxoplasmose auch das Auftreten von
Immunkomplexen eine Rolle, die während des Auftretens der klinischen Symptome serologisch
nachweisbar sind.
Das pathologische Bild einer akuten disseminierten Toxoplasmose bei nicht humanen Primaten
wird durch das Auftreten multipler Nekroseherde in den verschiedenen Organen mit oder ohne
entzündliche zelluläre Infiltration charakterisiert (McKISSICK et al. 1968). Die in 33 Fallberichten
am häufigsten genannten makroskopischen und mikroskopischen pathologischen Befunde sind in
der Tab. 6 zusammengestellt.
Die makroskopisch sichtbaren Veränderungen sind wie die klinischen Symptome variabel und
unspezifisch (McKISSICK et al. 1968). Zu den häufigsten Sektionsbefunden zählen schlecht
retrahierte, emphysematöse und ödematisierte Lungen mit einer ausgeprägten Hyperämie. In
einigen Fällen kann auch eine Atelektase festgestellt werden. Leber und Milz sind häufig vergrößert
und hyperämisch. In einigen Fällen können in Leber, Niere und Milz miliare, grauweiße Herde
nachgewiesen werden. Im Thorax, im Perikard und in der Bauchhöhle befinden sich oft vermehrte
Ansammlungen von Transsudat. Die Mesenteriallymphknoten stellen sich häufig geschwollen und
ödematisiert dar, vereinzelt sind sie hämorrhagisch. In Nieren, Herz und Lunge können petechiale
Blutungen beobachtet werden. Bei einigen Tieren wird ein Ikterus festgestellt. Vereinzelt werden
56
2. Literaturübersicht
am Dünndarm unterhalb der Serosa umschriebene, 1 bis 2 mm breite, rote Banden beobachtet
(DICKSON et al. 1983; PERTZ et al. 1997; BACCIARINI et al. 2001a, b).
Mikroskopisch werden bei fast allen nicht humanen Primaten mit einer generalisierten
Toxoplasmose multifokale Organnekrosen nachgewiesen. Am häufigsten sind dabei Leber,
Lymphknoten, Darm, Herz, Milz, Niere und Nebennieren betroffen, vereinzelt werden auch
Nekrosen in Lunge, Pankreas, mesenterialem Fettgewebe, Skelettmuskulatur, Peyerschen Platten,
Auge und Gehirn festgestellt. Beim überwiegenden Teil der Tiere wird eine interstitielle Pneumonie
diagnostiziert. Entzündliche Veränderungen der Organe werden zudem oft in Darm, Leber,
Myokard, Milz, Lymphknoten, Niere, Nebennieren und Gehirn nachgewiesen, vereinzelt sind
Rückenmark, Hirnhäute, Pankreas, mesenteriales Fettgewebe, Skelettmuskulatur und Gebärmutter
betroffen.
Der Nachweis der Parasiten kann mikroskopisch oder immunhistologisch erfolgen. Dabei können
Tachyzoiten im Bereich der Nekroseherde innerhalb der verschiedenen Organe frei sowie im
Zytoplasma
von
Makrophagen
oder
diversen
anderen
Wirtszellen
wie
Pneumozyten,
Alveolarmakrophagen, Gefäßendothelien, Hepatozyten, Kupfferschen Sternzellen, Histiozyten,
Monozyten, Darmepithelzellen und Skelettmuskelzellen nachgewiesen werden (ISENBÜGEL
1983; INOUE 1997; BRACK et al. 1998; WOHLSEIN et al. 1999; FURUTA et al. 2001).
EPIPHANIO et al. (2003) konnten den Parasiten zudem in Erythrozyten beobachten, die
Tachyzoiten lagen dabei frei im Zytoplasma und nicht in einer parasitophoren Vakuole.
Gewebezysten können in Gehirn, Myocard, Niere, Milz, Schilddrüse, Nebennieren, Pankreas und in
der Skelettmuskulatur vorhanden sein (McKISSICK et al. 1968; ZAMAN u. KRISHNAMURTI
1969; HESSLER et al. 1971; McCONNELL et al. 1973, 1974; CHANG et al. 1980; WOHLSEIN et
al. 1999). Die Zysten liegen dabei in der Regel ohne eine Entzündungsreaktion im Gewebe
(BACCIARINI et al. 2001a, b).
2. Literaturübersicht
57
Tab. 6: Häufigkeit von makroskopischen und mikroskopischen pathologischen Befunden bei
akuten disseminierten Toxoplasmosen bei nicht humanen Primaten
Befund
Auftreten in
Referenz
33 Fallberichten
Abs. H.a Rel. H.b
(n)
(%)
multifokale
29
88
BENIRSCHKE u. RICHART (1960); UILENBERG u. RIBOT
Nekrosen
(1965); HILGENFELD (1966); ITAKURA u. NIGI (1968);
McKISSICK et al. (1968); WERNER et al. (1969); HESSLER et al.
(1971); WONG u. KOZEK (1974); CHANG et al. (1980);
ANDERSON u. McCLURE (1982); ISENBÜGEL (1983); BORST u.
VAN KNAPEN (1984); DUBEY et al. (1985a); HARPER et al.
(1985); CUNNINGHAM et al. (1992); DIETZ et al. (1997); INOUE
(1997); PERTZ et al. (1997); BRACK et al. (1998); JUAN-SALLES
et al. (1998); BOUER et al. (1999); EPIPHANIO et al. (1999a, 2000,
2001, 2003); WOHLSEIN et al. (1999); BACCIARINI et al.
(2001b); FURUTA et al. (2001); SPENCER et al. (2004)
Pneumonie
24
73
COWEN u. WOLF (1945); DE RODANICHE (1954b);
BENIRSCHKE u. RICHART (1960); STOLZ (1962); UILENBERG
u. RIBOT (1965); HILGENFELD (1966); ITAKURA u. NIGI (1968);
McKISSICK et al. (1968); UILENBERG (1970); ANDERSON u.
McCLURE (1982); BORST u. VAN KNAPEN (1984); DIETZ et al.
(1997); INOUE (1997); PERTZ et al. (1997); BRACK et al. (1998);
JUAN-SALLES et al. (1998); EPIPHANIO et al. (1999a, 2000, 2001,
2003); WOHLSEIN et al. (1999); BACCIARINI et al. (2001b);
FURUTA et al. (2001); SPENCER et al. (2004)
Lungenödem
21
64
DE RODANICHE (1954b); BENIRSCHKE u. RICHART (1960);
HILGENFELD (1966); ITAKURA u. NIGI (1968); McKISSICK et al.
(1968); WERNER et al. (1969); CHANG et al. (1980); ANDERSON
u. McCLURE (1982); HARPER et al. (1985); CUNNINGHAM et al.
(1992); DIETZ et al. (1997); INOUE (1997); BRACK et al. (1998);
JUAN-SALLES et al. (1998); BOUER et al. (1999); EPIPHANIO et
al. (1999a, 2000, 2001, 2003); WOHLSEIN et al. (1999); FURUTA et
al. (2001)
Lymphadenopathie
18
55
BENIRSCHKE u. RICHART (1960); ITAKURA u. NIGI (1968);
McKISSICK et al. (1968); WERNER et al. (1969); ANDERSON u.
McCLURE (1982); ISENBÜGEL (1983); DUBEY et al. (1985a);
HARPER et al. (1985); CUNNINGHAM et al. (1992); BRACK et al.
(1998); JUAN-SALLES et al. (1998); EPIPHANIO et al. (1999a,
2000, 2001, 2003); WOHLSEIN et al. (1999); BACCIARINI et al.
(2001b); FURUTA et al. (2001)
Enteritis
17
52
HILGENFELD (1966); UILENBERG u. RIBOT (1965); McKISSICK
et al. (1968); WERNER et al. (1969); UILENBERG (1970);
ISENBÜGEL (1983); HARPER et al. (1985); CUNNINGHAM et al.
(1992); DIETZ et al. (1997); INOUE (1997); PERTZ et al. (1997);
BRACK et al. (1998); JUAN-SALLES et al. (1998); EPIPHANIO et
al. (1999a); BACCIARINI et al. (2001b); FURUTA et al. (2001);
a
, absolute Häufigkeit; b, relative Häufigkeit
58
2. Literaturübersicht
Tab. 6: Häufigkeit von makroskopischen und mikroskopischen pathologischen Befunden bei
akuten disseminierten Toxoplasmosen bei nicht humanen Primaten (Fortsetzung)
Befund
Auftreten in
Referenz
33 Fallberichten
Abs. H.a Rel. H.b
(n)
(%)
Enteritis
17
52
SPENCER et al. (2004)
Hepatitis
16
49
BENIRSCHKE u. RICHART (1960); STOLZ (1962); UILENBERG
u. RIBOT (1965); HILGENFELD (1966); McKISSICK et al. (1968);
CHANG et al. (1980); CUNNINGHAM et al. (1992); DIETZ et al.
(1997); PERTZ et al. (1997); JUAN-SALLES et al. (1998); BOUER
et al. (1999); EPIPHANIO et al. (1999a, 2000, 2001, 2003);
BACCIARINI et al. (2001b)
Splenomegalie
15
46
DE RODANICHE (1954b); McKISSICK et al. (1968); WERNER et
al. (1969); UILENBERG (1970); WONG u. KOZEK (1974);
ANDERSON u. McCLURE (1982); BORST u. VAN KNAPEN
(1984); HARPER et al. (1985); DIETZ et al. (1997); BRACK et al.
(1998); BOUER et al. (1999); WOHLSEIN et al. (1999);
BACCIARINI et al. (2001b); FURUTA et al. (2001); EPIPHANIO et
al. (2003)
Myocarditis
14
42
COWEN u. WOLF (1945); STOLZ (1962); McKISSICK et al. (1968);
HESSLER et al. (1971); WONG u. KOZEK (1974); ISENBÜGEL
(1983); CUNNINGHAM et al. (1992); PERTZ et al. (1997); BRACK
et al. (1998); JUAN-SALLES et al. (1998); WOHLSEIN et al. (1999);
EPIPHANIO et al. (2000, 2003); BACCIARINI et al. (2001b)
Splenitis
10
30
BENIRSCHKE u. RICHART (1960); STOLZ (1962); McKISSICK et
al. (1968); CUNNINGHAM et al. (1992); PERTZ et al. (1997);
EPIPHANIO et al. (1999a, 2000, 2001, 2003); SPENCER et al. (2004)
Hydrothorax
9
27
DE RODANICHE (1954b); ITAKURA u. NIGI (1968); McKISSICK
et al. (1968); WONG u. KOZEK (1974); HARPER (1985); BRACK et
al. (1998); EPIPHANIO et al. (1999a, 2000, 2003)
Nephritis
8
24
STOLZ (1962); McKISSICK et al. (1968); WONG u. KOZEK (1974);
PERTZ et al. (1997); BOUER et al. (1999); EPIPHANIO et al. (2000,
2001, 2003)
Ascites
7
21
ITAKURA u. NIGI (1968); WERNER et al. (1969); WONG u.
KOZEK (1974); HARPER et al. (1985); BOUER et al. (1999);
EPIPHANIO et al. (2000, 2003)
Gastrointestinale
Ulcerationen
7
21
HILGENFELD (1966); McKISSICK et al. (1968); CUNNINGHAM
et al. (1992); JUAN-SALLES et al. (1998); EPIPHANIO et al. (2000,
2001, 2003)
Enzephalitis
6
18
COWEN u. WOLF (1945); STOLZ (1962); BRACK et al. (1998);
WOHLSEIN et al. (1999); BACCIARINI et al. (2001b); EPIPHANIO
et al. (2003)
a
, absolute Häufigkeit; b, relative Häufigkeit
2. Literaturübersicht
59
Tab. 6: Häufigkeit von makroskopischen und mikroskopischen pathologischen Befunden bei
akuten disseminierten Toxoplasmosen bei nicht humanen Primaten (Fortsetzung)
Befund
Auftreten in
Referenz
33 Fallberichten
Abs. H.a Rel. H.b
(n)
(%)
Hepatomegalie
6
18
BORST u. VAN KNAPEN (1984); CUNNINGHAM et al. (1992);
DIETZ et al. (1997); EPIPHANIO et al. (1999a, 2001, 2003)
Ikterus
4
12
STOLZ (1962); UILENBERG (1970); BRACK et al. (1998);
WOHLSEIN et al. (1999)
Hydropericard
4
12
ITAKURA u. NIGI (1968); UILENBERG (1970); WONG u. KOZEK
(1974); EPIPHANIO et al. 2003
Adrenalitis
3
9
JUAN-SALLES et al. (1998); EPIPHANIO et al. (2000, 2001)
Pankreatitis
2
6
CHANG et al. (1980); EPIPHANIO et al. (2003)
a
b
, absolute Häufigkeit; , relative Häufigkeit
2.5.7. Therapie
Die meisten nicht humanen Primaten, die unter einer akuten Toxoplasmose litten, wurden zunächst
unspezifisch entsprechend der gezeigten klinischen Symptome behandelt. Hierbei wurde häufig
eine antibiotische Behandlung durchgeführt, wobei in der Regel Antibiotika mit einem breiten
Wirkungsspektrum, z. B. Ampicillin, Tetracyclin oder Chloramphenicol verwendet wurden (DE
RODANICHE 1954a; BENIRSCHKE u. RICHART 1960; STOLZ 1962; HESSLER et al. 1971;
CHANG et al. 1980; ISENBÜGEL 1983; CUNNINGHAM et al. 1992; PERTZ et al. 1997;
BACCIARINI et al. 2001a, b). Diese Therapie wurde durch die Gabe von Corticosteroiden oder
Vitamin-B-Komplex-Präparaten ergänzt (STOLZ 1962; CHANG et al. 1980; ISENBÜGEL 1983;
BACCIARINI et al. 2001a, b). Im Zusammenhang mit einem erhöhten Blutzuckerspiegel,
hervorgerufen durch eine akute Pankreatitis, wurde von CHANG et al. (1980) der Einsatz von
Insulin beschrieben. Einige der erkrankten Tiere wurden zudem subcutan oder intravenös mit
Natriumchlorid- und Glucose- oder mit Ringer-Lösung infundiert (CUNNINGHAM et al. 1992;
PERTZ et al. 1997; BACCIARINI et al. 2001a, b). Diese Behandlungsversuche führten jedoch
nicht zu einer Genesung der Tiere.
60
2. Literaturübersicht
Eine spezifische Therapie der Toxoplasmose bei nicht humanen Primaten wurde aus Ergebnissen
von In-vitro-Studien mit Chemotherapeutika an Tachyzoiten und von Tierversuchen sowie aus
Erfahrungen in der Humanmedizin abgeleitet (LEHNER 1984; HARPER et al. 1985; SWENSON
1993; referiert in SCHOONDERMARK-VAN DE VEN et al. 1995; CATAO-DIAS 2001). Die in
der Literatur bevorzugt angegebenen Medikamente zur Therapie einer Toxoplasmose bei nicht
humanen Primaten mit den entsprechenden Dosierungen sind in Tab. 7 aufgeführt. Von vielen
Autoren wird eine Kombinationsbehandlung aus Pyrimethamin mit einem Sulfonamid, bevorzugt
Sulfadiazin empfohlen (LEHNER 1984; BRACK 1987; WOLFF 1990, 1993; SWENSON 1993;
HUBBARD 1995; BRACK et al. 1995a; GOZALO u. TANTALEAN 1996; JOHNSONDELANEY 1996; PARROTT 1997; CARPENTER et al. 2001; CATAO-DIAS 2001). Diese
Behandlungsstrategie erwies sich auch experimentell bei der Therapie von infizierten
Totenkopfäffchen als effektiv (HARPER et al. 1985). Zudem gelang es SCHOONDERMARKVAN DE VEN et al. (1995) auf diese Weise eine konnatale Toxoplasmose bei trächtigen
Rhesusaffen zu verhindern. Die Muttertiere wurden zunächst intravenös mit Tachyzoiten infiziert.
Unmittelbar nachdem der Parasit mit der PCR in der Amnionflüssigkeit nachgewiesen wurde,
begann die Behandlung. Zehn bis dreizehn Tage nach Beginn der Therapie konnten keine Erreger
mehr in der Amnionflüssigkeit nachgewiesen werden und auch die Gewebe der Jungtiere wiesen
bei der Geburt keine Toxoplasmen auf. Obwohl in der Humanmedizin der Einsatz von
Pyrimethamin und Sulfadiazin während einer Schwangerschaft auf Grund möglicher Missbildungen
des Kindes als kontraindiziert gilt (SCHOONDERMARK-VAN DE VEN et al. 1995), wurden in
dieser Studie keine toxischen Effekte der Substanzen festgestellt.
Pyrimethamin und Sulfadiazin wirken synergistisch gegen das Tachyzoitenstadium von
T. gondii, nicht jedoch gegen die enzystierten Bradyzoiten. Beide Wirkstoffe können die Blut-HirnSchranke sowie die Plazenta passieren (SCHOONDERMARK-VAN DE VEN et al. 1995). Da es
sich bei den Medikamenten um Folsäureantagonisten handelt, ist die Behandlung nicht
unumstritten. So kann es während der Therapie zu reversiblen Störungen der Hämatopoese
kommen, so dass bei der Behandlung eine regelmäßige Kontrolle des Blutbildes sowie eine tägliche
Applikation von Folsäure stattfinden sollte (LEHNER 1984; HUBBARD 1995; PARROTT 1997;
CARPENTER et al. 2001; CATAO-DIAS 2001).
2. Literaturübersicht
61
Weitere für die Behandlung einer Toxoplasmose geeignete Chemotherapeutika sind Clindamycin
und Spiramycin (BRACK 1987; WOLFF 1990, 1993; BRACK et al. 1995a; GOZALO u.
TANTALEAN
1996;
JOHNSON-DELANEY
1996).
Während
experimentell
infizierte
Totenkopfäffchen trotz einer Behandlung mit Spiramycin starben (CHANG u. PECHERE 1988),
konnten SCHOONDERMARK-VAN DE VEN et al. (1994) in einer Studie mit Rhesusaffen die
Wirksamkeit des Medikaments bei der Behandlung einer konnatalen Toxoplasmose nachweisen.
Spiramycin musste dabei allerdings mindestens 3 Wochen verabreicht werden, um effektiv zu sein.
Insgesamt führten spezifische Therapieversuche in der Vergangenheit selten zum Erfolg. Die
alleinige Behandlung mit Clindamycin oder Sulfadiazin konnte die erkrankten Tiere nicht vor dem
Verenden retten oder es kam nach Beendigung der Therapie zu einer Reaktivierung der Infektion
(FRENKEL u. ESCAJADILLO 1987; ESCAJADILLO u. FRENKEL 1991; SPENCER et al. 2004).
Auch Versuche von Kombinationsbehandlungen aus Sulfonamiden mit Trimethoprim oder
Pyrimethamin scheiterten (DIETZ et al. 1997; BRACK et al. 1998). Hingegen beschrieb
ISENBÜGEL (1983), dass durch die 16-tägige Gabe von MaderanR (Sulfadiazin und Pyrimethamin)
als Kindersirup und dem zusätzlichen Einsatz von Vitaminpräparaten bei zwei schwer erkrankten
Kattas eine Rekonvaleszenz erreicht werden konnte. Ein weiterer Therapieerfolg wurde von
BRACK et al. (1995b) berichtet. Dabei konnte in einem Fall von massiven Verlusten bei Kattas und
Totenkopfaffen eine Therapie mit Pyrimethamin und Sulfasalizin die verbliebenen Totenkopfaffen
retten. Allerdings wurde nicht nachgewiesen, dass diese ebenfalls infiziert waren.
Erwiesene Therapieerfolge wurden somit fast ausschließlich unter experimentellen Bedingungen
erzielt. Das mag in erster Linie daran liegen, dass die wirksamen Chemotherapeutika frühzeitig und
gezielt nach stattgefundener Infektion eingesetzt wurden. Der Einsatz von einem Sulfonamid in
Kombination mit Trimethoprim oder Pyrimethamin zeigte sich bei der Behandlung am effektivsten
(HARPER et al. 1985; SCHOONDERMARK-VAN DE VEN et al. 1995).
Die Prognose ist bei akuten disseminierten Toxoplasmosen und spätem Behandlungsbeginn sehr
ungünstig. Da keine geeignete Vakzine zur Verfügung steht, kommt der rechtzeitigen
medikamentellen Behandlung der Toxoplasmose eine besondere Bedeutung zu (BACCIARINI et
al. 2001b). Eine spezifische Therapie sollte bereits beim ersten Auftreten von klinischen
Symptomen und schon im Verdachtsfall eingeleitet werden. Es wurden auch Überlegungen
62
2. Literaturübersicht
angestellt, bei besonders gefährdeten oder wertvollen Tierbeständen eine regelmäßige
Untersuchung der Antikörpertiter durchzuführen (WONG u. KOZEK 1974; WOOLF u.
ANTHONEY 1982).
Gegen die Gewebezysten von T. gondii, die die Gefahr einer Reaktivierung der Infektion bergen,
gibt es zurzeit kein wirksames Medikament. Experimentell konnte eine Wirksamkeit von
Hydroxynaphthoquinon nachgewiesen werden (referiert in CATAO-DIAS 2001).
Tab.7: Medikamente und Dosierungen zur Therapie der Toxoplasmose bei nicht humanen
Primaten
Medikament
Dosierung
Clindamycin
12,5-25 mg/kg zweimal täglich p. o. über 4 Wochen
Folsäure
0,04-0,2 mg/kg täglich p. o. während der Behandlung mit
Pyrimethamin
Pyrimethamin
2 mg/kg täglich p. o. über 3 Tage, dann 1 mg/kg täglich p. o. über 4
Wochen
Für Menschenaffen liegt die maximale tägliche Dosis in den ersten 3
Tagen bei 100 mg und in den darauf folgenden 4 Wochen bei 25 mg.
Spiramycin
150000-300000 I. E./kg p. o.
Sulfadiazin
100 mg/kg täglich p. o. oder 25-50 mg/kg viermal täglich p. o.
Für Menschenaffen liegt die maximale Dosis bei 6 g pro
Behandlung.
2.6. Diagnostik von T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen Primaten
In diesem Kapitel werden das Prinzip sowie die Vor- und Nachteile der bislang verwendeten
Testverfahren zur Diagnose von T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen Primaten dargestellt.
Die in epidemiologischen Studien verwendeten serologischen Methoden zum Nachweis von
Antikörpern gegen T. gondii bei nicht experimentell infizierten nicht humanen Primaten wurden
2. Literaturübersicht
63
bereits im Kap. 2.5.2. mit den entsprechende Referenzen aufgeführt. Deshalb werden diese
Referenzen an dieser Stelle nicht mehr erwähnt.
2.6.1. Indirekte Nachweismethoden
2.6.1.1. SFT
Der Sabin-Feldman-Test (SFT) wurde in den späten 1940ern entwickelt (SABIN u. FELDMAN
1948). In der Humanmedizin erlangte dieses Verfahren insbesondere in der Diagnose von T.-gondiiInfektionen bei Schwangeren und Neugeborenen große Bedeutung. Trotz der Notwendigkeit von
lebenden Tachyzoiten für dessen Durchführung ist er bis heute der Standardtest geblieben, an dem
die Qualität anderer Testverfahren zur Diagnose einer T.-gondii-Infektion gemessen wird
(ASHBURN 1992). Im SFT werden IgG1-, IgG3- und IgM-Antikörper gegen T. gondii erfasst
(GROSS et al. 2004). Das Testprinzip beruht auf der Tatsache, dass sich vitale T.-gondiiTachyzoiten mit Methylenblau intensiv blau anfärben lassen, während die Parasiten in Anwesenheit
spezifischer Antikörper nahezu ungefärbt bleiben. Als Voraussetzung für diese Änderung der
Anfärbbarkeit wird ein humanes Serum als Aktivator (accessory factor) benötigt. Der Aktivator ist
nach neueren Untersuchungen mit dem Komplement identisch. Das Testserum wird zunächst
hitzeinaktiviert, um körpereigenes Komplement zu zerstören. Anschließend erfolgt nach Zusatz des
Aktivatorserums eine Inkubation des Untersuchungsgutes mit lebenden Tachyzoiten bei 37 °C. Sind
Antikörper gegen T. gondii im Testserum vorhanden, findet eine komplementvermittelte Zytolyse
der Tachyzoiten statt und diese lassen sich durch die anschließend zugesetzte basische
Methylenblaulösung nicht mehr anfärben (positive Reaktion). Ist das Testserum frei von
spezifischen Antikörpern, findet keine Zytolyse statt und der Farbstoff wird in die Zellen
eingeschleust,
die
dadurch
eine
tiefblaue
Färbung
(negative
Reaktion)
annehmen
(BUNDESGESUNDHEITSBLATT 1989).
Der SFT besitzt für die Untersuchung von humanen Seren eine sehr hohe Sensitivität und Spezifität.
Unspezifische Reaktionen sind bei Humanseren selten. Da mit dem SFT auch sehr niedrige
Antikörpertiter erfasst werden, ist der Test sowohl für die Untersuchung von akuten als auch von
latenten T.-gondii-Infektionen geeignet. Nachteile des SFTs sind, dass er nicht automatisierbar ist
64
2. Literaturübersicht
und dass immer frisch infizierte Versuchstiere als Quelle vitaler Tachyzoiten benötigt werden. Die
Durchführung erfolgt daher nur noch in sehr wenigen Speziallaboren. Bei den nicht humanen
Primaten wurde der Test in der Vergangenheit häufig genutzt (siehe Kap. 2.5.2.), ist aber in neuerer
Zeit durch modernere Methoden wie IFAT, MAT und ELISA abgelöst worden.
2.6.1.2. IFAT
Für den indirekten Immunfluoreszenzantikörpertest (IFAT) werden intakte T.-gondii-Tachyzoiten
auf einem festen Träger (z. B. einem Objektträger) fixiert. Anschließend erfolgt eine
Überschichtung
des
fixierten
Antigens
mit
dem
Testserum,
das
in
verschiedenen
Verdünnungsstufen auf markierten Flächen des Objektträgers aufgetragen wird. Im Serum
vorhandene Antikörper gegen T. gondii lagern sich an die Zelloberfläche der Tachyzoiten und
werden anschließend mit fluoreszeinmarkierten Sekundärantikörpern (Konjugat) nachgewiesen. Die
zweiten Antikörper sind gegen bestimmte Immunglobuline der zu untersuchenden Tierart gerichtet.
Die Auswertung erfolgt unter UV-Licht mit einem Fluoreszenzmikroskop. Als positives Ergebnis
wird eine helle, ununterbrochene periphere Fluoreszenz des Parasiten gewertet. Die alleinige
Fluoreszenz des apikalen Teils der Tachyzoiten (Polfluoreszenz) wird hingegen als unspezifische
Reaktion beurteilt und durch eine Infektion mit anderen kreuzreagierenden apikomplexen Arten
verursacht. Die mit dem IFAT messbaren Titer nehmen einen ähnlichen Verlauf wie durch den SFT
bestimmte Titer (CARMICHAEL 1975).
Im IFAT ist der Nachweis verschiedener Immunglobulinisotypen durch die Verwendung eines
klassenspezifischen Konjugates (z. B. anti-IgG oder anti-IgM) möglich. Dadurch kann der IFAT für
eine Bestimmung des Infektionszeitpunktes eingesetzt werden und eignet sich sowohl für den
Nachweis von akuten als auch von latenten Infektionen. Die verschiedenen Immunglobulinisotypen
werden nach einer Infektion unterschiedlich schnell gebildet und sind verschieden lange im Serum
nachweisbar. In einer von ARAUJO et al. (1973) durchgeführten Studie wurden acht
Bärenmakaken entweder subcutan oder intravenös mit T.-gondii-Tachyzoiten oder oral mit
Gewebezysten infiziert. Bei fünf Tieren wurden im IFAT bereits nach einer Woche IgM-Antikörper
2. Literaturübersicht
65
gegen T. gondii ermittelt, nach zwei Wochen wiesen sieben Tiere einen spezifischen IgMAntikörpertiter auf.
Nachteile des IFATs bestehen in der subjektiven Auswertung des Tests, für die ein geschultes
Personal notwendig ist, sowie in der Zeitaufwendigkeit und einer möglichen Kreuzreaktion mit eng
verwandten Apicomplexa.
2.6.1.3. Agglutinationstests
Zu den bei nicht humanen Primaten verwendeten Agglutinationstests zählen der direkte
Agglutinationstest (DAT), der indirekte Hämagglutinationstest (IHAT) sowie der LatexAgglutinationstest (LAT).
Der DAT zum Nachweis von T.-gondii-Infektionen wurde erstmals von FULTON u. TURK (1959)
beschrieben und durch DESMONTS u. REMINGTON (1980) modifiziert. Das Testprinzip beruht
darauf, dass intakte, formalinbehandelte Tachyzoiten in der Gegenwart von spezifischen
Antikörpern agglutinieren. Diese Agglutination wird durch den Zusatz von Farbstoffen sichtbar
gemacht. Im DAT werden nur IgG-Antikörper gegen T. gondii detektiert, weil spezifische und
unspezifische IgM-Antikörper durch den Zusatz von Mercapthoethanol zerstört werden. Bei dem in
Mikrotiterplatten durchgeführten Test bildet sich bei Anwesenheit von spezifischen Antikörpern im
Testserum durch Bindung der Antikörper an die Tachyzoiten ein Schleier, der den gesamten Boden
der Plattenvertiefung bedeckt (positive Reaktion). Enthält das Testserum keine Antikörper gegen T.
gondii, sinken die Tachyzoiten unvernetzt zu Boden und bilden am tiefsten Punkt der Vertiefung
einen knopfförmigen Bodensatz (negative Reaktion). Der Test ist einfach durchführbar, besitzt eine
hohe Sensitivität und Spezifität und ergibt bei Menschen und Tieren dem SFT vergleichbare Titer
(referiert in CARME et al. 2002). Der DAT ist aber kommerziell nur schwer erhältlich.
Der IHAT zum Nachweis von T.-gondii-Infektionen wurde erstmals von JACOBS u. LUNDE
(1957) beschrieben. Bei diesem Test wird aus Tachyzoiten gewonnenes lösliches Antigen an
Tannin-behandelte Erythrozyten gekoppelt und anschließend mit Glutaraldehyd stabilisiert. Sind in
dem Testserum spezifische Antikörper gegen T. gondii enthalten, kommt es zu einer Agglutination
66
2. Literaturübersicht
(positive Reaktion). Der Test ist zwar einfach durchzuführen und nicht speziesspezifisch, jedoch
auch sehr störanfällig und die Ergebnisse sind schwer reproduzierbar (CARUANA 1980).
Agglutinierende Antikörper treten nach einer Infektion später im Serum auf, als die im SFT
nachweisbaren Antikörper. Das Testverfahren ist daher bei frischen Infektionen oft noch negativ
(REMINGTON u. DESMONTS 1983). In der veterinärmedizinischen Labordiagnostik werden
IHAT-Titer unter 1:128 als unspezifische Reaktionen gewertet (DUBEY et al. 1985b).
Beim LAT wird aus T.-gondii-Tachyzoiten gewonnenes lösliches Antigen an Latex-Partikel
gekoppelt. Sind im Testserum Antikörper gegen T. gondii enthalten, kommt es zu einer
Agglutination der antigenbeschichteten Partikel. Dieser Test lässt sich einfach und zuverlässig mit
dem Serum von Menschen und Tieren durchführen. Es ergeben sich dabei mit dem SFT
vergleichbare Titer (BALFOUR et al. 1982). Ein Nachteil des LATs ist, dass durch IgM-Antikörper
zu einem geringen Prozentsatz unspezifische (und somit falsch positive) Ergebnisse ausgelöst
werden können (HOLLIMAN et al. 1989).
2.6.1.4. KBR
Die Komplementbindungsreaktion (KBR) zum Nachweis von T.-gondii-Infektionen wurde erstmals
von WARREN u. SABIN (1942) beschrieben. In der KBR wird eine definierte Menge Komplement
mit einer Mischung aus Antigen und Testserum inkubiert. Sind in dem Testserum Antikörper gegen
T. gondii enthalten, bildet sich ein Antigen-Antikörper-Komplex, an den sich das Komplement
bindet. Enthält das Testserum keine spezifischen Antikörper, so bleibt das zugefügte Komplement
frei in Lösung und verursacht bei einem dem Testansatz zugefügten Indikatorsystem, das
Erythrozyten einer anderen Tierart enthält, eine Lysis der roten Blutkörperchen (negative Reaktion).
Bei Anwesenheit von spezifischen Antikörpern im Testserum bleibt diese Hämolyse aus (positive
Reaktion).
Da in der KBR latente Infektionen nicht erfasst werden dient dieser Test in der Humanmedizin nur
als ergänzende Methode. So gibt ein positives Ergebnis in der KBR zusammen mit den Ergebnissen
aus IFAT oder SFT einen Hinweis auf das Vorliegen einer akuten T.-gondii-Infektion
2. Literaturübersicht
67
(BUNDESGESUNDHEITSBLATT 1989). Bei nicht humanen Primaten wurde die KBR entweder
allein oder in Kombination mit dem SFT und/oder dem IFAT eingesetzt (siehe Kap. 2.5.2.). Da das
Testverfahren sehr aufwendig ist, praktisch keine standardisierten Antigene und Reagentien
erhältlich sind und der Test an jede Spezies neu angepasst werden muss, wird die KBR heute kaum
noch eingesetzt. Stattdessen erfolgt heute der Nachweis spezifischer IgM-Antikörper (z. B. im
IFAT oder ELISA).
2.6.1.5. ELISA
Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) wurde Anfang der 1970er Jahre entwickelt. In
diesem Test können spezifische Antikörper oder Antigene nachgewiesen werden. Zum Nachweis
von Antikörpern gegen T. gondii wird aus Tachyzoiten gewonnenes lösliches Antigen an einen
festen Träger, z. B. an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, gebunden und mit dem Testserum
überschichtet. Sind spezifische Antikörper gegen T. gondii im Serum vorhanden, binden diese an
das Antigen. Die übrigen, ungebundenen Antikörper werden durch nachfolgende Waschschritte
entfernt. Der Nachweis der spezifischen Antikörper erfolgt durch die Zugabe eines
enzymmarkierten Sekundärantikörpers. Das Konjugat bindet sich an den Antigen-AntikörperKomplex und das daran gekoppelte Enzym kann ein anschließend hinzugefügtes Substrat umsetzen,
wobei eine Farbreaktion stattfindet. Die Enzym-Substrat-Reaktion wird nach einer bestimmten Zeit
abgestoppt und das Ergebnis durch eine photometrische Messung quantitativ bestimmt. Dabei wird
die Absorption oder die optische Dichte gemessen.
Durch die Verwendung eines klassenspezifischen Konjugates eignet sich der ELISA sowohl für den
Nachweis von akuten als auch von latenten T.-gondii-Infektionen. Zudem wird eine quantitative
Bestimmung durch die Festlegung von Titern ermöglicht. Gegenüber dem IFAT besitzt er den
Vorteil, dass die Erfassung der Ergebnisse objektiv geschieht. Der ELISA lässt sich leicht
automatisieren und ist daher für Screening-Untersuchungen mit großen Probenzahlen geeignet.
68
2. Literaturübersicht
2.6.1.6. Immunoblot
Für den Nachweis von Antikörpern gegen T. gondii im Immunoblot erfolgt zunächst mit Hilfe des
stark ionischen Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) eine Auftrennung von löslichem
Tachyzoiten-Antigen in der Polyacrylamidgel-Elektrophorese (PAGE). Die aufgetrennten Proteine
werden anschließend elektrophoretisch auf eine Trägermembran übertragen und mit dem Testserum
inkubiert. Sind spezifische Antikörper im Testserum enthalten, binden diese an die Antigenproteine
und werden anschließend mit einem enzymmarkierten Konjugat nachgewiesen. Nachteile dieser
Methode sind, dass nur der qualitative Nachweis der Infektion erfolgen kann somit keine
Titerbestimmung möglich ist. Zudem ist für die Auswertung ein geschultes Personal notwendig.
In einer von FURUTA et al. (2001) durchgeführten Studie wurde ein Immunoblot für den Nachweis
von Antikörpern gegen T. gondii bei experimentell infizierten Totenkopfaffen benutzt.
2.6.2. Sonstige Nachweismethoden
2.6.2.1. Mikroskopischer und immunhistologischer Nachweis im Gewebe
Lichtmikroskopisch können in histologischen Schnitten Gewebezysten von T. gondii nachgewiesen
werden. Die Zysten liegen meist reaktionslos im Gewebe und finden sich in erster Linie im Gehirn
aber auch in anderen Wirtsorganen (siehe Kap. 2.5.6.). Tachyzoiten von T. gondii befallen viele
unterschiedliche Wirtszelltypen (siehe Kap. 2.5.6.). In einer Studie von EPIPHANIO et al. (2003)
an verschiedenen Neuweltaffenspezies wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie
Tachyzoiten von T. gondii u. a. in Endothelzellen, Makrophagen, Fibroblasten, Pneumozyten Typ I
und II sowie in Erythrozyten nachgewiesen.
Mit Hilfe von spezifischen Konjugaten kann der immunhistologische Nachweis des Parasiten
erfolgen. WOHLSEIN et al. (1999) wiesen den Erreger in Organen von Kattas, Totenkopfaffen und
Lisztaffen mit einem polyklonalen Antikörper gegen T. gondii aus dem Kaninchen als
Primärantikörper sowie einem biotingekoppelten anti-Kaninchen-Konjugat aus der Ziege in einem
Avidin-Biotin-Peroxidasekomplex-System nach. Für die immunhistologische Antigendarstellung
2. Literaturübersicht
69
wurde Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) als Chromogen verwendet und so die PeroxidaseAktivität sichtbar gemacht.
Nachteilig an der mikroskopischen und immunhistologischen Untersuchung ist der hohe
Zeitaufwand bei der Aufarbeitung und Untersuchung der Proben. Zudem ist die Wahrscheinlichkeit,
dass man bei der Anfertigung eines histologischen Schnittes durch einen Gewebebezirk schneidet,
der Parasitenmaterial enthält, nur gering.
2.6.2.2. PCR
Die PCR (Polymerasekettenreaktion) ist eine molekularbiologische Methode, bei der aus der
genomischen DNA von T. gondii definierte Stücke vervielfältigt werden. Nach Extraktion der DNA
aus dem Organmaterial des zu untersuchenden Tieres erfolgt ein Zyklus mit schnellem Wechsel von
verschiedenen Temperaturen. Nacheinander wird ein Schmelzen der doppelsträngigen DNA bei ca.
94 °C, die Anlagerung der Primer bei ca. 45-50 °C und die Primerextension bei ca. 72 °C in
mehreren Zyklen wiederholt. Bei jedem Zyklus wird das von den Primern flankierte DNA-Stück
verdoppelt. Die PCR-Produkte (Amplifikate) werden anschließend z. B. in der Elektrophorese in
einem Agarosegel mit Hilfe eines Farbstoffs sichtbar gemacht.
Für den Nachweis von T.-gondii-DNA bei Kattas, Totenkopfaffen und Lisztaffen wurde in einer
von WOHLSEIN et al. (1999) durchgeführten Studie das B1-Genfragment mit Hilfe der Primer
oligo 1 und oligo 4 amplifiziert. Es wurden dabei verschiedene formalinfixierte Organe der Tiere
untersucht und dabei jeweils eine spezifische Bande mit 194 Basenpaaren nachgewiesen. Bei der
von FURUTA et al. (2001) durchgeführten PCR wurde das NTPase-Gen von T. gondii amplifiziert.
Hier erfolgte der Nachweis des Parasiten in Leber und Lunge von experimentell infizierten
Totenkopfaffen.
70
2. Literaturübersicht
2.6.2.3. Biologische Verfahren
Der Nachweis von T. gondii kann auch durch die Inokulation von Probenmaterial in Labortiere wie
beispielsweise
Mäuse
durchgeführt
werden.
Als
Proben
können
Sekrete,
Exkrete,
Körperflüssigkeiten und Gewebeproben dienen. Inokulierte Mäuse bilden nach der Infektion mit T.gondii-haltigem Probenmaterial spezifische Antikörper, die ca. 3 Wochen post infectionem
serologisch nachgewiesen werden können.
SCHOONDERMARK-VAN DE VEN et al. (1993) nutzten bei ihrer an experimentell infizierten
trächtigen Rhesusaffen durchgeführten Studie diese Methode für den Nachweis einer vertikalen
Infektion mit T. gondii, indem sie Amnionflüssigkeit intraperitoneal in Mäuse inokulierten (siehe
Kap 2.5.3.).
3. Material und Methoden
71
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1. Material
3.1.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien
Angaben zu Geräten und Verbrauchsmaterialien finden sich bei ihrer ersten Erwähnung im Text
oder in Form einer Fußnote.
3.1.2. Reagenzien und Lösungen
Alle verwendeten Chemikalien und Reagenzien sind bei ihrer ersten Erwähnung im Text mit einem
Stern (*) gekennzeichnet und im Anhang 9.1. alphabetisch aufgeführt.
Lösungen sind bei ihrer ersten Erwähnung im Text unterstrichen. Alle verwendeten Lösungen
sowie deren Zusammensetzungen sind im Anhang 9.2. alphabetisch aufgeführt.
3.1.3. Seren von nicht humanen Primaten
Die Blutentnahmen bei den nicht humanen Primaten erfolgten im Rahmen diagnostischer
Maßnahmen zur Bestimmung T.-gondii-infizierter Tiere. Die Tab. 8 zeigt eine Übersicht über
Anzahl, Tierart, laufende Nummer und Herkunft der im IgG-ELISA untersuchten Tiere.
Bei den aus dem Serengeti-Park Hodenhagen stammenden Weißkopfmakis, Kattas und
Totenkopfaffen wurden zur Feststellung einer eventuell stattfindenden Serokonversion sowie zur
Untersuchung der Antikörperdynamik während des Aufenthaltes im Freigehege Verlaufsblutproben
entnommen. Insgesamt fanden bei diesen Tieren von März bis Dezember 2004 bis zu vier
Blutentnahmen statt. Im März und Dezember befanden sich die Tiere dabei im Winterquartier,
während sie sich bei den Untersuchungsterminen im Mai und Juni in unterschiedlichen Freigehegen
befanden. Diese Freigehege waren so angelegt, dass die Besucher des Parks durch sie
72
3. Material und Methoden
hindurchlaufen konnten. Bei den Weißkopfmakis bildeten bei der Erstuntersuchung die Tiere H1H4, H5-H10, H21-H23 und H26 sowie H31-H33 jeweils eine Gruppe. Der Weißkopfmaki H32
musste auf Grund von Rangordnungskämpfen im Mai von seiner Gruppe getrennt werden und
wurde schließlich im Herbst 2004 an eine Privatperson abgegeben. Ansonsten gab es unter den
Weißkopfmakis
hinsichtlich
der
Gruppenzusammensetzung
während
des
gesamten
Untersuchungszeitraums keine Veränderungen. Bei H1, H2, H6, H7, H10, H21 und H26 handelte es
sich um männliche und bei H3-H5, H8, H9, H22, H23 sowie H31-H33 um weibliche Tiere. Der
Weißkopfmaki H35 war ein Jungtier von H8 und H36 ein Jungtier von H9. Beide Nachkommen
wurden im Juni 2004 geboren, eine Geschlechtbestimmung wurde bei den Tieren innerhalb des
Untersuchungszeitraumes nicht durchgeführt. Das geschätzte Zahnalter der Weißkopfmakis H2, H3,
H5, H7-9, H23 und H31 lag bei der Erstuntersuchung zwischen 2 und 3 Jahren. Das Alter der Tiere
H1, H4, H10, H21 und H33 wurde auf 4 bis 6 Jahre und das der Tiere H6, H22, H26 und H32 auf 8
bis 10 Jahre geschätzt.
Bei den aus dem Serengeti-Park Hodenhagen stammenden Totenkopfaffen bildeten bei der
Erstuntersuchung die Tiere H11 und H12, H13-H20 sowie H27-H30 jeweils eine Gruppe. Zwischen
Mai und Juni 2004 wurden die Tiere H11 und H12 sowie H27-H30 zu einer Gruppe
zusammengefügt. Bei H18 und H29 handelte es sich um männliche, bei den übrigen Nummern um
weibliche Tiere. Das geschätzte Zahnalter der Totenkopfaffen H11, H12, H18 und H28 lag bei der
Erstuntersuchung zwischen 3 und 4 Jahren. Das Alter der Tiere H13, H16, H17, H19, H27, H29 und
H30 wurde auf 6 bis 8 Jahre und das der Tiere H14, H15 und H20 auf über 10 Jahre geschätzt.
Bei den aus Hodenhagen stammenden Kattas handelte es sich bei H24 um ein weibliches und bei
H25 um ein männliches Tier. Beide wurden auf ein Alter zwischen 3 und 4 Jahren geschätzt und
wurden zusammen mit den Weißkopfmakis H21-H23 und H26 in einer Gruppe gehalten.
Bei allen übrigen nicht humanen Primaten fand nur eine Blutentnahme statt. Die Proben wurden in
der Zeit zwischen Juni 2004 und Juli 2005 gewonnen. Bei den aus dem Deutschen Primatenzentrum
stammenden Rhesusaffen wurden die Blutproben im Rahmen einer routinemäßigen Untersuchung
auf Tuberkulose entnommen und das Serum anschließend für die Untersuchung im ELISA zur
Verfügung gestellt. Alle untersuchten Tiere hatten Zugang zu einem Freigehege, welches für
Besucher nicht zugänglich war. Bei den Rhesusaffen stammten die Tiere aus unterschiedlichen
3. Material und Methoden
73
Zuchtkolonien, deren Zusammensetzung nicht statisch war, sondern sich in unregelmäßigen
Abständen änderte. Ansonsten wurden Tiere derselben Spezies innerhalb einer Gruppe gehalten.
Bei dem aus dem Tier- und Freizeitpark Jaderberg stammenden Totenkopfaffen J4 sowie dem Katta
J9 handelte es sich um weibliche Tiere, die übrigen Kattas, Totenkopfaffen sowie der
Weißbüschelaffe waren männliche Tiere. Das Alter ist nicht bekannt.
Bei dem aus dem Arche Noah Zoo Braunschweig stammenden Katta B1 handelte es sich um ein 6
Jahre altes männliches, bei dem Katta B2 um ein 9 Jahre altes weibliches Tier. Bei den
Totenkopfaffen handelte es sich bei B7 um ein männliches und bei B3-B6 um weibliche Tiere. Das
Männchen war zum Untersuchungszeitpunkt 14, B4-B6 waren 6 und B3 2 Jahre alt.
Bei den verschiedenen Neuweltaffenspezies aus dem Zoologischen Garten Magdeburg handelte es
sich bei M7 und M9 um weibliche, bei den übrigen Nummern um männliche Tiere. Die Tiere M2
und M1 waren 15 bzw. 17 Jahre alt, bei M3, M4 und M7 lag das Alter zwischen 8 und 9 und bei
M5, M6, M8 und M9 zwischen 1 und 4 Jahren.
Bei den Rhesusaffen aus dem Deutschen Primatenzentrum handelt es sich bei R1, R7, R11, R12
und R18 um männliche und bei R2-R6, R8-R10, R13-R17 und R19 um weibliche Tiere. Das Alter
der Rhesusaffen R1, R8, R12, R15, R16, R17 und R19 lag zum Untersuchungszeitpunkt zwischen 1
und 2 Jahren, das von R4, R7, R11, R14 und R18 zwischen 3 und 4 Jahren; R3, R9, R10 und R13
waren 6 bis 8 Jahre und R2, R5 und R6 waren 13 bis 15 Jahre alt. Die Tiere R2, R3, R5, R6, R9 und
R10 stammten aus dem Centre de Primatologie in Straßburg und befanden sich seit 1998 im
Deutschen Primatenzentrum. Alle übrigen Rhesusaffen wurden im Deutschen Primatenzentrum
geboren.
Die drei ältesten Totenkopfaffen aus dem Serengeti-Park Hodenhagen waren Wildfänge aus
Guayana, alle übrigen der untersuchten nicht humanen Primaten wurden in Gefangenschaft
geboren.
74
3. Material und Methoden
Tab. 8: Übersicht über die im IgG-ELISA untersuchten nicht humanen Primaten
Tierart
Anzahl
laufende
der Tiere Nummer
(n)
Herkunft der Tiere
Weißkopfmaki
19
H1-H10, H21-H23, H26, Serengeti-Park Hodenhagen
H31-H33, H35, H36
Katta
2
2
3
H24, H25
B1, B2
J7-J9
Serengeti-Park Hodenhagen
Arche Noah Zoo Braunschweig
Tier- und Freizeitpark Jaderberg
Totenkopfaffe
14
5
5
H11-H20, H27-H30
J1-J5
B3-B7
Serengeti-Park Hodenhagen
Tier- und Freizeitpark Jaderberg
Arche Noah Zoo Braunschweig
Weißbüschelaffe
1
1
J10
M9
Tier- und Freizeitpark Jaderberg
Zoologischer Garten Magdeburg
Schwarzer Löwenaffe
2
M3, M4
Zoologischer Garten Magdeburg
Braunrücken-Tamarin
1
M1
Zoologischer Garten Magdeburg
Goldkopflöwenaffe
1
M2
Zoologischer Garten Magdeburg
Rothand-Tamarin
2
M5, M6
Zoologischer Garten Magdeburg
Schwarzpinselaffe
2
M7, M8
Zoologischer Garten Magdeburg
Rhesusaffe
19
R1-R19
Deutsches Primatenzentrum
3.1.4. Toxoplasma gondii
Die zur Antigengewinnung verwendeten Tachyzoiten des T.-gondii-Stammes BK wurden
freundlicherweise von Frau Dr. Ingrid Reiter-Owona vom Institut für Medizinische Mikrobiologie,
Immunologie und Parasitologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität in Bonn zur
Verfügung gestellt. Der Stamm wurde in Mäusen1 durch die intraperitoneale (i. p.) Injektion einer
Tachyzoitensuspension in einem zweitägigen Rhythmus passagiert.
1
Stamm NMRI
3. Material und Methoden
75
3.1.5. Mäuse
Für die Herstellung des ELISA-Antigens wurden 12 Wochen alte weibliche Mäuse2 aus einer
spezifisch-pathogenfreien Zucht3 verwendet. Die Mäuse wurden in Gruppen von fünf bis zehn
Tieren in Makrolonkäfigen Typ II auf Weichholzgranulat für Labortiere4 gehalten. Die Käfige und
das Zubehör wurden in wöchentlichem Abstand gereinigt. Wasser und pelletiertes Fertigfutter5
stand den Tieren ad libitum zur Verfügung. Die Unterbringung der Tiere erfolgte in einem
ausschließlich für diesen Zweck bestimmten separaten Raum.
3.2. Methoden
3.2.1. Serumgewinnung und -lagerung
Die Blutentnahme bei den nicht humanen Primaten (siehe Kap. 3.1.3.) erfolgte aus der Vena
femoralis unter Sedation6. Bei den Weißkopfmakis, den Kattas und den Rhesusaffen wurde jeweils
eine Blutprobe von etwa 3-4 ml unter Verwendung von 0,8 mm Kanülen7 sowie 4,5 ml
Vacutainern8 entnommen. Bei den Neuweltaffen wurden 1-ml-Spritzen9 sowie 0,5 mm Kanülen
verwendet und eine Blutprobe von 1-2 ml gewonnen. Diese wurde in 1,5-ml-Reaktionsgefäße
überführt. Nach einer Gerinnungszeit von 8 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Blut für
10 Minuten bei 700 g (Vacutainer) oder 6000 g (1,5-ml-Reaktionsgefäße) zentrifugiert10
2
Stamm NMRI
3
HARLAN-WINKELMANN, Borchen
4
ALTROMIN, Lage
5
ALTROMIN, Lage
6
Ursotamin -Injektionslösung, 5-20 mg/kg Kgw i. m., SERUMWERK, Bernburg
®
Valium 10 Roche, 0,1-0,25 mg/kg Kgw i. m., HOFFMANN-LA ROCHE, Grenzach-Whylen
7
Kanülen für Vacuetten, WDT, Garbsen
8
Vacuetten zur Serumgewinnung, WDT, Garbsen
9
1-ml-Tb-Spritze ERSTA mit Silikon-Kolbenring, WDT, Garbsen
®
®
10
Labofuge 6000, HERAEUS, Osterode
11
Biofuge A, HERAEUS, Osterode
11
. Das
76
3. Material und Methoden
Serum wurde abpipettiert und in Portionen zu maximal 0,5 ml bis zur weiteren Verwendung bei –20
°C eingefroren.
3.2.2. SFT
Der SFT wurde dankenswerterweise von Frau Dr. Ingrid Reiter-Owona am Institut für
Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Parasitologie der Rheinischen Friedrich-WilhelmsUniversität in Bonn durchgeführt. Da die Ergebnisse dieses Tests Voraussetzungen für einen Teil
der eigenen Untersuchungen waren, werden die zugehörigen Ergebnisse unter Material und
Methoden dargestellt (siehe Kap. 3.2.2.5.).
3.2.2.1. Untersuchungsgut
Insgesamt wurden die Seren von 51 nicht humanen Primaten im SFT auf Antikörper gegen T.
gondii getestet. Es wurden alle in Tab. 1 (Kap. 3.1.3.) aufgeführten Weißkopfmakis,
Totenkopfaffen, Kattas sowie der Weißbüschelaffe J10 untersucht. Von den aus dem Serengeti-Park
Hodenhagen stammenden Weißkopfmakis und Totenkopfaffen wurden bis zu drei Serumproben
untersucht, die den Tieren an unterschiedlichen Zeitpunkten entnommen wurden (siehe Kap. 3.1.3.).
Alle Seren wurden vor Durchführung des Tests für 60 Minuten bei 56 °C hitzeinaktiviert.
3.2.2.2. Antigengewinnung für den SFT
Zur Gewinnung des T.-gondii-Antigens wurden Mäuse12 mit etwa 2,5 x 106 Tachyzoiten13 in max.
0,3 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung i. p. infiziert. Etwa 48 Stunden p. i. wurde aus der
Bauchhöhle der getöteten Tiere durch Spülung mit ca. 2 ml PBS das Exsudat gewonnen.
Anschließend wurde jedes einzelne Exsudat mikroskopisch auf seinen Gehalt an Tachyzoiten und
12
Stamm NMRI, ca. 10 Wochen alt
13
T.-gondii-Stamm BK
3. Material und Methoden
77
auf eventuelle Verunreinigungen hin kontrolliert. Das gesammelte Exsudat enthielt ca. 20 x 106
Tachyzoiten pro ml.
3.2.2.3. Aktivatorserum
Das Aktivatorserum stammte von einer T.-gondii-negativen Person, deren Serum zuvor im SFT auf
seine lytischen Eigenschaften hin getestet worden war. In vorangegangenen Tests wurde
sichergestellt, dass das Serum keine falsch positiven Reaktionen verursachte.
3.2.2.4. Testdurchführung
3.2.2.4.1. Vorversuch
In einem Vorversuch mit einem bekannt positiven (Standardserum) und einem bekannt negativen
humanen Serum wurde kontrolliert, ob mit dem gewonnenen Exsudat der vorgeschriebene Endtiter
von 1:4000 erreicht wurde und das negative Serum keine Zytolyse induzierte. Bei diesem Ansatz
wurde das Exsudat einmal unverdünnt und einmal in einer Verdünnung von 1:2 ausgetestet. Die
Durchführung erfolgte in Mikrotiterplatten.
Vorlegen der Kontrollseren:
In die Reihen 1 und 2 sowie 3 und 4 wurden in die erste Vertiefung (A) je 50 µl positives bzw.
negatives Kontrollserum vorgelegt.
In die Vertiefungen B-H wurden zuerst je 25 µl PBS pipettiert, danach je 50 µl Aktivator eingefüllt.
Die Serumverdünnung erfolgte von Reihe A-H mit jeweils 25 µl.
Nach der Serumverdünnung gab man 50 µl Aktivator in Reihe A hinzu. Abschließend wurde in jede
Vertiefung 25 µl T.-gondii-Exsudat unverdünnt (Reihe 1 und 3) oder 1:2 verdünnt (Reihe 2 und 4)
pipettiert.
78
3. Material und Methoden
Bei jedem Testansatz wurde eine Aktivator-Exsudat-Kontrolle mitgeführt, die 25 µl PBS anstelle
von Serum enthielt. Die Mikrotiterplatte wurde mit Klebefolie14 verschlossen, kurz auf den Rüttler15
gestellt und danach für 30 Minuten in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubiert.
Als Indikator wurden dann in jede Vertiefung ca. 25 µl der gebrauchsfertigen Methylenblaulösung
eingetropft. Nach kurzer Einwirkungszeit und Mischen mittels einer Pasteurpipette wurde pro
Serumverdünnungsstufe je ein Tropfen der Suspension (ca. 10 µl) auf einen Objektträger gebracht
und mikroskopisch16 ausgewertet (Objektiv 40x). Als positiv galt die Serumverdünnungsstufe, bei
der die Anzahl der ungefärbten Tachyzoiten mehr als 50 % betrug. Für den Hauptversuch wurde
diejenige Exsudat-Verdünnung ausgewählt, mit der das Standardserum den vorgeschriebenen
Endtiter von 1:4000 erreichte.
3.2.2.4.2. Hauptversuch
Der Hauptversuch entsprach im Wesentlichen dem Vorversuch. Neben dem Standardserum wurden
jeweils 50 µl der unverdünnten Affenseren in Reihe A pipettiert. Von dort wurden
4-er Verdünnungsreihen (1:4, 1:16, 1:64, 1:256, 1:1024, 1:4096) hergestellt.
Bei jedem Testansatz wurden eine Aktivator-Exsudat-Kontolle, welche 25 µl PBS anstelle des
Serums enthielt, sowie das Standardserum mitgeführt.
3.2.2.4.3. Auswertung
Wie bereits im Vorversuch beschrieben wurde bei der anschließenden mikroskopischen
Auswertung des Versuchs von jeder Serumverdünnung ca. 10 µl gefärbte Suspension auf einen
Objektträger gebracht. Es wurden dabei mehrere Gesichtsfelder durchgemustert (Objektiv 40x) und
das Verhältnis von gefärbten zu ungefärbten Tachyzoiten ermittelt. Die negative (Antigen14
Plate Sealing Tape, ICN BIOMEDICALS INC., Kalifornien (USA)
15
MS 1 Minishaker, IKA-WORKS INC., Wilmington, North Carolina (USA)
16
LEITZ, Wetzlar
3. Material und Methoden
79
Aktivator-)Kontrolle sollte nicht mehr als 10 % ungefärbte Zellen (d. h. positiv reagierende
Tachyzoiten)
enthalten.
Das
positive
Kontrollserum
musste
innerhalb
von
drei
Serumverdünnungsstufen einen klaren Übergang von stark positiver (annähernd 100 % ungefärbte
Tachyzoiten) zu eindeutig negativer Reaktion zeigen. Als SFT-Titer wurde diejenige reziproke
Serumverdünnung angegeben, bei der die Zahl der ungefärbten Tachyzoiten noch mehr als 50 %
betrug. Jede Serumprobe wurde bis zu dreimal untersucht und dabei jeweils der SFT-Titer
bestimmt. Wich das Ergebnis der einzelnen SFTs um eine Titerstufe voneinander ab, wurde das
Serum endgültig mit der höheren Titerstufe bewertet oder es wurde ein weiterer SFT durchgeführt.
Ergaben sich bei drei durchgeführten SFTs drei unterschiedliche Titer, wurde der Endtiter durch das
Mittel zwischen dem höchsten und dem niedrigsten Einzeltiter bestimmt.
Seren mit einem Titer ≥ 1:16 wurden als positiv, Seren mit einem Titer von 1:4 wurden als
grenzwertig und Seren mit einem Titer < 1:4 wurden als negativ beurteilt.
3.2.2.5. Ergebnisse aus dem SFT
In der Tab. 9 sind die im SFT ermittelten Einzeltiter für die Serumproben aller Weißkopfmakis und
der Kattas H24 und H25 für die Untersuchungszeitpunkte März, Juni und Dezember dargestellt. Die
Serumproben vom Untersuchungszeitpunkt Mai wurden mit Ausnahme der des Weißkopfmakis H6
nicht im SFT untersucht. Das Tier H6 wies im Mai einen SFT-Titer von 1:1000 auf.
Die jeweiligen Endtiter wurden nach den in 3.2.2.4.3. genannten Kriterien festgelegt und sind für
die Weißkopfmakis in Tab. 13 in Kap. 4.2.1. sowie für die Kattas in Tab. 14 in Kap. 4.2.2.
aufgeführt und werden dort den im ELISA ermittelten Endtitern gegenübergestellt.
Der Tab. 9 ist zu entnehmen, dass der Weißkopfmaki H6 im März als negativ und an den übrigen
Untersuchungszeitpunkten als positiv beurteilt wurde. Der Weißkopfmaki H9 wurde im März als
grenzwertig und im Dezember als hoch positiv eingestuft. Bei diesen Tieren wurde somit im SFT
eine Serokonversion nachgewiesen. Bei den übrigen Weißkopfmakis war die im SFT
vorgenommene Beurteilung der Serumproben als positiv oder negativ über den gesamten
Untersuchungszeitraum konstant.
80
3. Material und Methoden
Die Serumproben der Kattas H24 und H25 wurden im SFT als positiv, die der Kattas J7-J9, B1 und
B2 sowie des Weißbüschelaffen J10 wurden als negativ beurteilt. Ebenfalls negativ waren alle
Serumproben der Totenkopfaffen. Bei den aus dem Serengeti-Park Hodenhagen stammenden
Totenkopfaffen war dies für sämtliche Verlaufsblutproben der Fall.
Tab. 9: Im SFT ermittelte Einzeltiter für die Serumproben der Weißkopfmakis und der Kattas
Laufende
Nummer
Serum März
A
B
H1
neg.a / n.u. / n.u.b
neg.
H2
256 / 1000 / n.u.
4000 / n.u. / n.u.
4000 / >64000 / n.u.
H3
256 / 256 / n.u.
16000 / n.u. / n.u.
16000 / >64000 / n.u.
H4
16
/ 256 / 64
1000 / n.u. / n.u.
4000 / >64000 / n.u.
H5
16
/ 64 / n.u.
256
/ n.u. / n.u.
1000
H6
neg. / n.u. / n.u.
64
/ n.u. / n.u.
1000 / >64000 / n.u.
H7
16
1000 / n.u. / n.u.
4000 / >64000 / n.u.
/ 64
C
/ n.u.
Serum Juni
A
B
C
/ n.u. / n.u.
Serum Dezember
A
B
C
neg.
c
/ n.u.
/ n.u.
/ >64000 / n.u.
H8
64
/ 256 / n.u.
---
H9
4
/ 4
---
H10
neg. / n.u. / n.u.
neg.
/ n.u. / n.u.
H21
16
/ 256 / 64
1000
/ n.u. / n.u.
---
H22
64
/ 256 / n.u.
1000
/ n.u. / n.u.
---
H23
16
/ 64 / n.u.
1000
/ n.u. / n.u.
---
H26
16
/ 16
256
/ n.u. / n.u.
1000
/ n.u.
/ n.u.
H31
neg. / n.u. / n.u.
neg.
/ n.u. / n.u.
neg.
/ n.u.
/ n.u.
H32
16
/ 16
/ n.u.
256
/ n.u. / n.u.
H33
neg.
/ n.u. / n.u.
neg.
/ n.u. / n.u.
/ n.u.
/ 16
--4000 / >64000 / n.u.
neg.
/ n.u.
/ n.u.
--neg.
/ n.u.
/ n.u.
H35
---
---
neg.
/ n.u.
/ n.u.
H36
---
---
neg.
/ n.u.
/ n.u.
H24
1000 / 4000 / n.u.
4000 / n.u. / n.u.
H25
256
a
/ 256 / n.u.
---
, negativ; b, nicht untersucht; c, keine Blutentnahme
-----
3. Material und Methoden
81
3.2.3. ELISA
3.2.3.1. Kontrollseren zur Optimierung der ELISAs
Für die Etablierung der verschiedenen ELISA-Formate standen keine Referenzseren von
experimentell infizierten Tieren zur Verfügung, da alle in die Untersuchungen einbezogenen nicht
humanen Primaten geschützten Tierarten angehören, die in den Anhängen I und II des
Washingtoner Artenschutzabkommens (CITES) aufgelistet sind. Daher wurden die Seren nicht
humaner Primaten (siehe Kap. 3.1.3.) zunächst im SFT, dem in der Humanmedizin als
Goldstandard geltenden Referenztest, auf Antikörper gegen T. gondii getestet. Die Weißkopfmakis
waren neben den Kattas die einzige Spezies, bei denen im SFT positive und negative Tiere
festgestellt wurden (siehe Kap. 3.2.2.5.). Da von den Weißkopfmakis eine größere Anzahl an
Serumproben zur Verfügung stand, wurden von dieser Spezies Seren als Kontrollseren bei der
Optimierung der ELISAs verwendet. Als Kontrollseren für den IgG-ELISA sowie für den IgGAviditäts-ELISA dienten diejenigen Seren der Weißkopfmakis, die im SFT bei einer Verdünnung
von 1:4 negativ waren und die einen SFT-Antikörpertiter von mindestens 1:1000 aufwiesen. Es
erfolgte somit eine Selektion von zu diagnostischen Zwecken gewonnenen Einzelseren unter
Berücksichtigung der oben genannten Bedingungen, aus denen für die Etablierung dieser ELISAFormate ein Sammelserum hergestellt wurde, das als Kontrollserum diente und bei der Optimierung
ausschließlich verwendet wurde. Für das positive Kontrollserum wurden jeweils 0,5 ml der
Serumproben des Weißkopfmakis H2 aus den Untersuchungen im März und Juni sowie der
Weißkopfmakis H4, H7, H21 und H22 aus der Untersuchung im Juni eingesetzt, da von diesen
Serumproben eine ausreichend große Menge vorhanden war. Für das negative Kontrollserum
wurden jeweils 0,5 ml der Serumproben der Weißkopfmakis H1, H10, H31 und H33 aus der
Untersuchung im März sowie der Serumproben der Weißkopfmakis H10 und H31 aus der
Untersuchung im Juni verwendet.
Zur Etablierung des IgM-ELISAs wurde ebenfalls das o. g. negative Kontrollserum eingesetzt,
wohingegen
als
positives
Kontrollserum
ein
Einzelserum
diente
(Serum
von
Untersuchungszeitpunkt Juni). Dieses wies im SFT einen Antikörpertiter von 1:16000 auf.
H3,
82
3. Material und Methoden
3.2.3.2. Antigengewinnung für den ELISA
Zur Gewinnung von Antigen für den ELISA wurden 20 Mäuse mit ca. 3 x 106 T.-gondiiTachyzoiten in maximal 0,3 ml isotonischer Kochsalzlösung17 i. p. infiziert. Die Mäuse wurden am
3. Tag p. i. getötet und enthäutet. Es wurden ca. 2,5 ml physiologische Kochsalzlösung mit einer
0,6-mm-Kanüle in die Bauchhöhle injiziert und wieder abgezogen, nach Möglichkeit ohne dabei
Blutgefäße zu verletzen. Eine derartige Spülung der Bauchhöhle wurde bei jeder Maus zwei- bis
dreimal wiederholt und das Exsudat mikroskopisch18 auf Tachyzoiten, eine eventuelle
Kontamination durch Wirtszellen sowie bakterielle Verunreinigungen untersucht. Die Exsudate
wurden anschließend in zwei 50-ml-Zentrifugenröhrchen19 gesammelt und für 10 Minuten bei 700 g
zentrifugiert. Der Überstand wurde bis auf 4 ml vorsichtig abpipettiert und das bei der
Zentrifugation entstandene Pellet in diesem Rest resuspendiert.
Die
Tachyzoitensuspension
wurde
mittels
Dichtegradienten-Zentrifugation
mit
Percoll
®
(AMERSHAM BIOSCIENCES, Uppsala, Schweden) von Leukozyten, Erythrozyten und anderen
Wirtszellen gereinigt. Dafür wurde zunächst eine isotonische Stammlösung aus neun Teilen
®
Percoll und einem Teil steriler 10 x PBS hergestellt. Aus dieser wurde eine 90%ige, eine 80%ige,
®
sowie eine 20%ige Percoll -Lösung durch Verdünnung mit isotonischer Kochsalzlösung gefertigt.
In konischen 15-ml-Zentrifugenröhrchen20 wurde ein Gradient aus 3 ml isotonischem, 3 ml
90%igem, 3 ml 80%igem und 2 ml 20%igem Percoll
®
geschichtet. Dieser wurde mit dem
Peritonealexsudat überschichtet, welches dafür vorsichtig mit einer Spritze durch eine 0,4-mmKanüle auf den Gradienten gegeben wurde. Durch dieses Vorgehen wurde die Zellwand
wirtseigener Makrophagen zerstört und auch bereits phagozytierte Tachyzoiten konnten noch
gewonnen werden. Anschließend erfolgte eine 20minütige Zentrifugation bei 700 g, 15 °C und
®
Auslauf ohne Bremse21. An der Grenzschicht zwischen isotonischem und 90%igem Percoll bildete
17
0,9%ige Infusionslösung, DELTA SELECT, Pfullingen
18
Standard-Lichtmikroskop, Objektiv 40 x, CARL ZEISS, Oberkochen
19
NUNC, Wiesbaden
20
NUNC, Wiesbaden
21
Megafuge 1,0 R, HERAEUS, Osterode
3. Material und Methoden
83
sich dabei eine deutliche weiße Schicht aus Tachyzoiten. Diese wurden mit einer Pasteurpipette
vorsichtig abgesaugt und mikroskopisch auf ihre Reinheit überprüft.
Die so gewonnenen Tachyzoiten wurden anschließend zweimal mit isotonischer Kochsalzlösung
®
gewaschen, um vorhandene Percoll -Reste zu entfernen. Die Zentrifugation erfolgte hierbei für 10
Minuten bei 700 g. Der Überstand wurde bis auf 4 ml dekantiert und die Tachyzoiten in diesem
Rest resuspendiert.
Die gereinigte Suspension wurde nun mit Ultraschall22 behandelt, um die Tachyzoiten in
Bruchstücke zu zerkleinern. Die Beschallung erfolgte im Ethanol-Eisbad, um eine Überhitzung und
die daraus resultierende Proteindenaturierung zu verhindern, und wurde bei einer Amplitude von 24
für dreimal 1 Minute mit zweiminütigen Pausen durchgeführt. Nach der Beschallung erfolgte eine
mikroskopische Kontrolle, ob alle Tachyzoiten in gleichmäßige Bruchstücke zerkleinert wurden.
Nach Bestimmung der Proteinkonzentration (siehe Kap. 3.2.3.3) wurde die Antigensuspension in
Portionen zu 100 µl bei –20 °C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
3.2.3.3. Bestimmung der Proteinkonzentration des Tachyzoitenantigens
Die Proteinkonzentration des Antigens wurde mit Hilfe eines kommerziellen Testkits23 mit der
Methode nach BRADFORD (1976) bestimmt. Das Testverfahren basiert auf dem Prinzip, dass eine
saure Lösung des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue G-250 durch Proteinbindung einen sichtbaren
Farbumschlag produziert. Der Farbstoff bindet dabei an basische und aromatische Aminosäurereste,
wodurch seine anionische Form stabilisiert wird. Das Absorptionsmaximum des Farbstoffs wechselt
dabei von 465 nm auf 595 nm.
Mit Hilfe einer im Testkit enthaltenen Kontrolllösung24 mit einer definierten Proteinkonzentration
wurde nach Angaben des Herstellers eine Standardkurve von 0 µg Protein/ml bis 20 µg Protein/ml
22
Ultraschallgerät 150 W Ultrasonic Disintegrator Mk2TM, MSE SCIENTIFIC INSTRUMENTS,
Sussex, UK
23
BIO-RAD Protein Assay Kit I, BIO-RAD Laboratories GmbH, München
24
bovines γ-Globulin, Standard I
84
3. Material und Methoden
hergestellt. Von der Antigensuspension wurden 5µl, 10µl und 20 µl jeweils im Doppelansatz einmal
unverdünnt sowie in einer Verdünnung von 1:10 eingesetzt. Nach der Zugabe von jeweils 50 µl
Farbstofflösung und einer Inkubationszeit von mindestens 5 bis maximal 60 Minuten wurde bei
einer Wellenlänge von 600 nm mit dem ImmunoTM-Reader25 die optische Dichte bestimmt. Aus den
gemessenen optischen Dichten und dem Proteingehalt der Standardverdünnungen wurde eine
Eichkurve erstellt, mit deren Hilfe die Proteinkonzentration des Tachyzoitenantigens berechnet
wurde. Dabei wurde eine Konzentration von 3,8 mg/ml ermittelt.
3.2.3.4. Konjugate
Als
Sekundärantikörper
diente
im
IgG-ELISA
sowie
im
IgG-Aviditäts-ELISA
ein
Meerrettichperoxidase(PO)-konjugierter polyklonaler Antikörper gegen Affen-IgG aus der Ziege26.
Als Immunogen wurde bei der Herstellung IgG aus Sammelseren von Rhesusaffen verwendet. Die
Aufreinigung des Antiserums erfolgte durch DEAE-Chromatograpie. Der Sekundärantikörper war
gegen die Fc-Untereinheit des IgG-Moleküls gerichtet, wodurch eine strenge Isotypen-Spezifität
gesichert wurde. Für den IgM-ELISA wurde ein ebenfalls PO-konjugierter Antikörper gegen die
Fc-Untereinheit von Affen-IgM aus der Ziege27 verwendet.
Da zur Zeit kommerziell keine Sekundärantikörper gegen Immunglobuline von Weißkopfmakis
oder anderen Halbaffen erhältlich sind, musste auf die o. g. Konjugate zurückgegriffen werden.
3.2.3.5. IgG-ELISA
Als Konjugat für den IgG-ELISA wurde PO-konjugiertes Ziege-Anti-Affe-IgG(Fc) verwendet
(siehe auch Kap. 3.2.3.4.).
25
ImmunoTM-Reader NJ 2000, NUNC GmbH, Wiesbaden
26
GAMon/IgG(Fc)/PO, Chargennr. 5637, NORDIC IMMUNOLOGICAL LABORATORIES,
Tilburg, NL
27
GAMon/IgM(Fc)/PO, Chargennr. 5662, NORDIC IMMUNOLOGICAL LABORATORIES,
Tilburg, NL
3. Material und Methoden
85
3.2.3.5.1. Testdurchführung
1. Beschichtung der Mikrotiterplatten mit Antigen
Für die Beschichtung der Mikrotiterplatten28 wurde jeweils eine neue Antigen-Portion aufgetaut.
Das Antigen wurde im Volumenverhältnis 1:2 mit 8 M Harnstofflösung 15 Minuten lang bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde eine gebrauchsfertige Verdünnung mit
Beschichtungspuffer hergestellt und jeweils 100 µl dieser Lösung in eine Vertiefung der
Mikrotiterplatte pipettiert29. Das Antigen wurde dabei in einer Konzentration von 1,13 µg/ 100 µl
eingesetzt. Die Bestimmung der optimalen Antigengebrauchsverdünnung erfolgte durch Titration
des Antigens (siehe Kap. 3.2.3.8.). Nach Abdeckung der Platten mit einer Klebefolie30 erfolgte eine
mindestens 15stündige Inkubation bei 4 °C im Kühlschrank.
2. Waschen der Mikrotiterplatten
Nach vorsichtigem Dekantieren des Inhaltes wurden die Platten dreimal für 5 Minuten mit PBS
unter Verwendung des NUNC ImmunoTM Wash 1231 gewaschen. Nach dem letzten Waschgang
wurden die Platten auf einem sauberen Handtuch ausgeschlagen.
3. Absättigung freier Bindungsstellen
In jede Plattenvertiefung wurden 100 µl BSA-PBS pipettiert. Nach Abdeckung der Platten mit der
ursprünglichen
Klebefolie
erfolgte
eine
einstündige
Inkubation
bei
37
Glasperlenwasserbad33.
4. Waschen der Mikrotiterplatten
28
96 Well Immuno Platten F96 Maxi Sorp, NUNC, Wiesbaden
29
Titertek Multichannel Pipette 50-200 µl, EFLAB, Helsinki, Finnland
30
Deckfolie für MicroWellTM-Platten, PVC/SI, NUNC, Wiesbaden
31
NUNC, Wiesbaden
32
Wärmeschrank HERAEUS T5042E, HERAEUS, Hanau
33
30 x 20 x 5 cm große Plastikschalen, 1 cm hoch mit Glasperlen (Durchmesser 4 mm) sowie mit
Aqua bidestillata bis zur Oberfläche der Glasperlenschicht befüllt
®
°C32
im
86
3. Material und Methoden
Nach vorsichtigem Dekantieren des Inhaltes wurden die Platten dreimal für 5 Minuten mit PBSTween unter Verwendung des NUNC ImmunoTM Wash 12 gewaschen. Nach dem letzten
Waschgang wurden die Platten auf einem sauberen Handtuch ausgeschlagen.
5. Aufbringen der Seren
Die Seren wurden in Zweierschritten ab einer Verdünnung von 1:10 in BSA-PBS-Tween titriert,
wobei jeweils 100 µl der Serumverdünnungen in die Plattenvertiefungen gegeben wurden. Wenn
nur wenig Serum zur Verfügung stand, wurde bei den Wiederholungsuntersuchungen ab einer
Verdünnung von 1:20 titriert. In die Vertiefung der auf jeder Platte mitgeführten Leerwertkontrolle
wurden anstelle einer Serumverdünnung nur 100 µl BSA-PBS-Tween pipettiert. Als
Serumkontrolle wurde das positive Referenzserum in einer Standardverdünnung von 1:40
eingesetzt. Nach Abdeckung der Platten mit der ursprünglichen Klebefolie erfolgte eine einstündige
Inkubation bei 37 °C im Glasperlenwasserbad.
6. Waschen der Mikrotiterplatten
Siehe Punkt 4.
7. Aufbringen des Konjugates
Das Konjugat wurde in einer Verdünnung von 1:1000 eingesetzt. Nach Herstellung der KonjugatGebrauchsverdünnung mit BSA-PBS-Tween wurden in jede Plattenvertiefung mit Ausnahme des
Leerwertes 100 µl dieser Lösung pipettiert, wohingegen bei der Leerwertkontrolle 100 µl BSAPBS-Tween eingesetzt wurde. Die optimale Konjugatverdünnung wurde durch Titration ermittelt
(siehe Kap. 3.2.3.8.). Die Platten wurden mit einer neuen Klebefolie abgedeckt und für 1 Stunde bei
37 °C im Glasperlenwasserbad inkubiert.
8. Waschen der Mikrotiterplatten
Siehe Punkt 4.
9. Aufbringen des Substratpuffers
Das Ansetzen des Substratpuffers erfolgte in einem durch Ummantelung mit Alufolie
lichtgeschützten Gefäß. Das OPD (o-Phenylenediamine-Dihydrochlorid)* und das H2O2* wurden
dem Substratpuffer erst kurz vor dem Aufbringen auf die Platten zugegeben. Es wurden jeweils
3. Material und Methoden
87
50 µl der Substratlösung in jede Plattenvertiefung pipettiert und die Platten anschließend für
30 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert.
10. Abstoppen der Reaktion
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 µl 2,5 M H2SO4-Lösung in jede Vertiefung abgestoppt.
11. Messung der optischen Dichten
Die Messung der optischen Dichten mit dem Immunoreader erfolgte möglichst rasch nach dem
Abstoppen der Reaktion. Gemessen wurde bei Wellenlängen von 490 und 620 nm. Um eine
Vergleichbarkeit der Messwerte zwischen unterschiedlichen Platten zu gewährleisten, wurden alle
gemessenen optischen Dichten einer Platte auf den Wert des positiven Kontrollserums bezogen. Die
daraus resultierenden Indexwerte wurden nach der folgenden Formel berechnet:
O.D. des Testserums – O.D. des Leerwertes
Index = ----------------------------------------------------------------------O.D. des positiven Referenzserums – O.D. des Leerwertes
3.2.3.5.2. Festlegung der Grenzwerte für den IgG-ELISA
Um positive von negativen Reaktionen unterscheiden zu können, wurden für den IgG-ELISA
Grenzwerte (Cut-offs) festgelegt. Bei der Berechnung der Grenzwerte wurden die Indexwerte von
vier Weißkopfmakis einbezogen, deren Seren im gesamten Untersuchungszeitraum (März bis
Dezember 2004) im SFT bei einer Verdünnung von 1:4 als negativ beurteilt wurden. Dabei handelt
es sich um die Tiere H1, H10, H31 und H33 (siehe auch Tab. 9 in Kap. 3.2.2.5.). Jedes Serum
wurde im IgG-ELISA mehrfach untersucht. Die Festlegung von Grenzwerten für den ELISA mit
SFT-negativen Seren geschah unter der Hypothese, dass der SFT für die Untersuchung von
Makiseren eine ähnlich hohe Spezifität besitzt wie für die Untersuchung von Humanseren. In Tab.
10 sind für die Serumverdünnungen 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 sowie 1:160 die Anzahl der jeweils in die
Berechnung einbezogenen Indexwerte aufgeführt und die daraus berechneten Mittelwerte,
Standardabweichungen und Grenzwerte dargestellt. Ab einer Serumverdünnung von 1:320 wurde
der für die Verdünnungsstufe 1:160 festgelegte Grenzwert verwendet.
88
3. Material und Methoden
Die Festlegung von Grenzwerten für den IgG-ELISA erfolgte nach der folgenden Formel:
+ 3 x SD (Summe aus dem Mittelwert und der dreifachen Standardabweichung)
Tab. 10: Festlegung der Grenzwerte für den IgG-ELISA
Serumverdünnung
Anzahl der
Indexwerte
(n)
Mittelwert
1: 10
33
0,227
0,067
0,428
1: 20
47
0,220
0,059
0,397
1: 40
52
0,198
0,047
0,339
1: 80
52
0,177
0,046
0,315
1: 160
36
0,156
0,029
0,243
( )
Standardabweichung
(SD)
Cut-off
(
+ 3 x SD)
3.2.3.5.3. Festlegung der Titer und Auswertung des IgG-ELISAs
Als Titer wurde im IgG-ELISA diejenige reziproke Serumverdünnung angegeben, bei der die
ermittelten Indexwerte zuletzt über den in Kap. 3.2.3.5.2. festgelegten Grenzwerten lagen oder
zuletzt gleich den Grenzwerten waren. Für die Endbewertung eines Serums wurden mindestens
zwei voneinander unabhängige Untersuchungen durchgeführt und dabei jeweils der Titer bestimmt.
Wich das Ergebnis der einzelnen ELISAs um eine Titerstufe voneinander ab, wurde das Serum
endgültig mit der höheren Titerstufe bewertet oder es wurde ein weiterer ELISA durchgeführt. Bei
drei durchgeführten ELISAs wurde das Serum endgültig mit dem Titer bewertet, der bei zwei von
drei ELISAs ermittelt wurde. Fielen alle drei ELISAs unterschiedlich aus, wurde der Endtiter durch
das Mittel zwischen dem höchsten und dem niedrigsten Einzeltiter festgelegt.
Seren mit einem Endtiter von ≥ 1:10 wurden als positiv beurteilt. Seren, deren ELISA-Indices
unterhalb der Grenzwerte lagen bzw. einen Titer < 1:10 aufwiesen, wurden als negativ beurteilt.
3. Material und Methoden
89
3.2.3.6. IgG-Aviditäts-ELISA
Alle Seren der nicht humanen Primaten, bei denen sich bei der Untersuchung im IgG-ELISA
Indexwerte ergaben, die über den in Kap. 3.2.3.5.2. festgelegten Grenzwerten lagen, wurden
anschließend im IgG-Aviditäts-ELISA untersucht.
Als Konjugat wurde PO-konjugiertes Ziege-Anti-Affe-IgG(Fc) verwendet (siehe auch Kap.
3.2.3.4.), welches in einer Konzentration von 1:1000 eingesetzt wurde.
Die Durchführung des IgG-Aviditäts-ELISAs entsprach im Wesentlichen der des IgG-ELISAs
(siehe Kap. 3.2.3.5.1.). Die Untersuchung der Seren erfolgte hier jedoch immer in einer
Doppelreihe. Die Seren wurden ab einer Verdünnung von 1:10 bis zu einer Verdünnung von 1:1280
titriert. Wenn nur wenig Serum zur Verfügung stand, wurde bei der Wiederholungsuntersuchung ab
einer Verdünnung von 1:20 bis zu einer Verdünnung 1:2560 titriert. Nach der Seruminkubation
wurde jeweils eine der beiden Reihen für 5 Minuten mit 200 µl 6 M Harnstoff in PBS-Tween
inkubiert, wohingegen die andere Reihe, wie bei der Durchführung des IgG-ELISAs, für 5 Minuten
mit PBS-Tween gewaschen wurde.
3.2.3.7. IgM-ELISA
Im IgM-ELISA wurden alle Verlaufsblutproben der Weißkopfmakis untersucht (siehe Kap. 3.1.3.).
Die Titration der Seren erfolgte ab einer Verdünnung von 1:20. Als Konjugat wurde POkonjugiertes Ziege-Anti-Affe-IgM(Fc) verwendet (siehe Kap. 3.2.3.4.), welches in einer
Konzentration von 1:1000 eingesetzt wurde. Der IgM-ELISA wurde ansonsten wie in dem in Kap.
3.2.3.5.1. aufgeführten Protokoll durchgeführt.
3.2.3.8. Optimierung der ELISA-Formate
In Vorversuchen wurden verschiedene ELISA-Formate zum Nachweis von Antikörpern gegen T.
gondii bei Weißkopfmakis etabliert. Dabei wurden ein IgG-ELISA, ein IgG-Aviditäts-ELISA und
90
3. Material und Methoden
ein IgM-ELISA entwickelt. Die Gebrauchskonzentrationen des Antigens sowie die optimalen
Verdünnungen für das Konjugat wurden dabei durch Titration ermittelt. Da die zur Verfügung
stehenden Volumina der Kontrollseren begrenzt waren, wurde durch Titration festgestellt, wie stark
diese verdünnt werden können. Zudem wurde die Umsetzung des Substrats zu unterschiedlichen
Zeitpunkten abgestoppt, um eine optimale Reaktionszeit zu ermitteln.
Zur Bestimmung der optimalen Antigenkonzentration wurde eine Titration des Antigens in
Zweierschritten ab einer Proteinkonzentration von 18 µg pro 100 µl Beschichtungspuffer
durchgeführt. Dabei wurden zwei Reihen mit Antigen beschichtet, wobei die eine Reihe mit
positivem und die andere mit negativem Kontrollserum in einer Verdünnung von 1:200 beschickt
wurde. Der ELISA wurde ansonsten wie im oben aufgeführten Protokoll durchgeführt (siehe Kap.
3.2.3.5.1.). Als optimale Antigenkonzentration wurde die Konzentration, bei der die Differenz
zwischen der optischen Dichte des positiven Kontrollserums und der optischen Dichte des
negativen Kontrollserums am größten war, definiert. Zudem wurde die Gebrauchskonzentration des
Antigens danach gewählt, dass sich für die optische Dichte des positiven Kontrollserums ein Wert
innerhalb des Plateaubereichs ergab. Die Ergebnisse der Antigentitrationen für den IgG-ELISA
sowie für den IgM-ELISA sind in der Abb. 3 (A-B) dargestellt. Als optimale Konzentration des
Antigens
wurde
sowohl
für
den
IgG-ELISA
als
auch
für
den
IgM-ELISA
eine
Gebrauchskonzentration von 1,13 µg Protein pro Plattenvertiefung ermittelt. Die optimalen
Konzentrationen wurden in Abb. 3 jeweils durch einen Pfeil gekennzeichnet.
Zur Bestimmung der optimalen Konjugatverdünnungen wurde das Konjugat vor Anbruch jeder
neuen Charge in mehreren Verdünnungen getestet (1:250, 1:500, 1:1000, 1:1500, 1:2000, 1:2500).
Diese wurden dafür einzeln angesetzt und jeweils im Doppelansatz auf eine Reihe der Platte
gegeben, wobei eine Reihe zuvor mit positivem und die andere mit negativem Kontrollserum in
einer Verdünnung von 1:200 beschickt wurde. Der ELISA wurde ansonsten wie im oben
aufgeführten Protokoll durchgeführt (siehe Kap. 3.2.3.5.1.). Als optimale Konjugatverdünnung
wurde diejenige definiert, bei der die Differenz zwischen der optischen Dichte des positiven
Kontrollserums und der des negativen Kontrollserums am größten war. Zudem wurde die
Konjugatverdünnung so gewählt, dass sich für das positive Kontrollserum eine optische Dichte >1
ergab. Die Ergebnisse der Konjugattitrationen für den IgG- sowie für den IgM-ELISA sind in der
3. Material und Methoden
91
Abb. 3 (C-D) dargestellt. Als optimal wurde für beide Konjugate eine Verdünnung von 1:1000
ermittelt.
Die Ermittlung von geeigneten Verdünnungen der Kontrollseren erfolgte ebenfalls durch Titration.
Dabei wurden das positive sowie das negative Kontrollserum jeweils ab einer Verdünnung von 1:10
bis zu einer Verdünnung von 1:20480 titriert. Die Durchführung des ELISAs erfolgte ansonsten wie
im oben aufgeführten Protokoll (siehe Kap. 3.2.3.5.1.). Die Ergebnisse der Titrationen der
Referenzseren im IgG-ELISA sowie im IgM-ELISA sind in der Abb. 3 (E-F) dargestellt. Die
Verdünnung des positiven Referenzserums wurde als optimal angesehen, wenn sie sich innerhalb
des Plateaubereichs befand. Für die Serumkontrolle im IgG-ELISA wurde eine optimale
Verdünnung von 1:40 ermittelt, für den IgM-ELISA ergab sich eine optimale Verdünnung von
1:80.
Zur Bestimmung einer optimalen Inkubationszeit der Substratlösung wurde die Reaktion über einen
Zeitraum von einer Stunde in Abständen von jeweils 10 Minuten abgestoppt. Als optimale
Inkubationszeit wurde diejenige definiert, bei der die Differenz zwischen der optischen Dichte des
positiven Kontrollserums und der des negativen Kontrollserums am größten war. Als optimaler
Zeitraum erwies sich eine Inkubationszeit von 30 Minuten.
92
3. Material und Methoden
A
IgM-ELISA
Antigenkonzentration in µg/100µl
C
IgM-ELISA
1,6
1,8
1,4
1,6
1,2
1,4
1
0,8
0,6
0,4
0,2
D
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
1000 1500 2000 2500
250
reziproke Konjugatverdünnung
IgM-ELISA
E
0,2
20480
10240
5120
2560
1280
320
640
160
80
40
20
10
0
20480
0,4
10240
0,6
5120
0,8
1280
2560
1
640
Optische Dichte
1,2
320
1,4
F
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
80
160
1,6
reziproke Serum verdünnung
1000 1500 2000 2500
reziproke Konjugatverdünnung
10
IgG-ELISA
500
40
500
20
250
Optische Dichte
9
Antigenkonzentration in µg/100µl
Optische Dichte
Optische Dichte
IgG-ELISA
18
0,01
9
18
4,5
2,25
1,13
0,28
0,56
0,14
0,07
0,04
0,02
0,01
0
4,5
0,2
2,25
0,4
1,13
0,6
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,56
0,8
0,28
1
0,14
1,2
0,07
1,4
Optische Dichte
Optische Dichte
1,6
B
2
1,8
1,6
1,4
1,2
0,04
1,8
0,02
IgG-ELISA
reziproke Serum verdünnung
Abb. 3: Titration von Antigen, Konjugat und Kontrollserum im IgG- und IgM-ELISA
3. Material und Methoden
93
3.2.4. Mausinokulation
Der Katta H24 verstarb 13 Wochen nach der ersten Probennahme an einer Infektion mit Yersinia
pseudotuberculosis und gelangte im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover zur Sektion. Dabei wurden Gewebeproben des Tieres gewonnen und Teile des Gehirns in
Mäuse inokuliert.
3.2.4.1. Aufbereitung des Gehirns
Es wurde etwa ein Viertel des Gehirns in 100 ml PBS homogenisiert und in zwei 50-mlZentrifugenröhrchen überführt. Die Gehirnsuspension wurde anschließend für 10 Minuten bei
1400 g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das bei der Zentrifugation entstandene
Sediment in 50 ml PBS resuspendiert. Die Suspension wurde in einen 250-ml-Erlenmeyerkolben
gegeben, mit 50 ml einer 0,5%igen Trypsin-PBS-Lösung versetzt und für 30 Minuten im
Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Während der Inkubation wurde der Erlenmeyerkolben regelmäßig
geschwenkt. Danach wurde die Suspension durch einen Trichter und drei Lagen Gaze in zwei 50ml-Zentrifugenröhrchen überführt und erneut für 10 Minuten bei 1400 g zentrifugiert. Anschließend
wurde das Sediment zweimal mit PBS gewaschen (Zentrifugation für 10 Minuten bei 1400 g). Nach
dem letzten Waschschritt wurde der Überstand dekantiert und das Sediment in jedem Röhrchen in
4,5 ml PBS resuspendiert. Der Suspension wurde jeweils 0,5 ml Penizillin/Streptomyzin* zugefügt.
3.2.4.2. Infektion der Mäuse
Es wurden insgesamt sechs Mäuse34 mit jeweils 0,2 ml der Gehirnsuspension i. p. sowie s. c.
infiziert. Drei Mäuse erhielten eine Suspension, bei der das Gehirn lediglich mit PBS homogenisiert
wurde und drei Mäuse wurden mit einer Suspension infiziert, bei der das Gehirn nach dem oben
aufgeführten Protokoll homogenisiert und trypsinisiert wurde.
34
NMRI, weiblich, ca. 18 Wochen alt
94
3. Material und Methoden
Fünf Mäuse starben 1-10 Tage nach der Infektion. Von der einzigen überlebenden Maus, die bei
der Infektion eine nur homogenisierte Gehirnsuspension erhielt, wurde 16 Tage p. i. Blut
gewonnen35 und das Serum im SFT auf Antikörper gegen T. gondii untersucht. Die Maus wurde 46
Wochen p. i. getötet. Die eine Hälfte des Gehirns wurde zur Infektion weiterer Mäuse (1. Passage)
und die andere für die Durchführung einer histologischen Untersuchung (siehe Kap. 3.2.6.) benutzt.
3.2.4.3.
Untersuchung des Mäuseserums im SFT
Das Serum der Maus (siehe Kap. 3.2.4.2.) wurde im SFT nach dem o. g. Protokoll (Kap. 3.2.2.)
untersucht.
3.2.5. IFAT
3.2.5.1.
Untersuchungsgut
Im IFAT wurden die Seren von 4 Mäusen aus der 1. Passage (siehe Kap. 3.2.4.2.) untersucht. Die
Blutentnahmen erfolgten ca. 16 Wochen nach der Infektion.
3.2.5.2. Antigengewinnung für den IFAT
Zur Gewinnung von Antigen für den IFAT wurden 10 Mäuse36 mit ca. 3 x 106 T.-gondiiTachyzoiten37 in maximal 0,3 ml PBS i. p. infiziert. Die Tachyzoiten wurden 48 Stunden p. i. durch
Spülung der Bauchhöhle mit steriler physiologischer Kochsalzlösung gewonnen. Das Exsudat jeder
Maus wurde jeweils in einem 15-ml-Zentrifugenröhrchen gesammelt und für 5 Minuten bei 1400 g
zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abpipettiert, das Sediment in PBS resuspendiert
und die Suspension erneut für 5 Minuten bei 1400 g zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde noch
35
Kapillarpipetten, ROTH, Karlsruhe
36
Stamm NMRI, weiblich, ca. 10 Wochen alt
37
Stamm BK
3. Material und Methoden
95
einmal wiederholt. Nach dem letzten Waschen wurde das Sediment in 0,5 ml PBS aufgeschwemmt
und die Tachyzoiten vorsichtig resuspendiert. Zu jeder Suspension wurden 4,5 ml einer 1%igen
Formaldehyd-Lösung gegeben und die Tachyzoiten damit 30 bis 60 Minuten fixiert. Anschließend
erfolgten erneut zwei Waschschritte mit PBS (Zentrifugation für 10 Minuten bei 1400 g). Nach
jedem Zentrifugieren wurde das Sediment sorgfältig resuspendiert. Nach dem letzten Zentrifugieren
wurde das Sediment in 10 ml PBS resuspendiert und mit einer Zählkammer38 die Anzahl der
Tachyzoiten bestimmt. Die Ausgangskonzentration wurde danach mit PBS so verdünnt, das ca. 2 x
106 Tachyzoiten pro ml enthalten waren.
Nach einer Stunde Lagerung bei Raumtemperatur wurden auf die IFAT-Objektträger39 mit dem
Dispenser40 10 µl Antigensuspension (etwa 1-2 x 104 Tachyzoiten) pro markiertes Feld aufgetragen.
Die Trocknung erfolgte zunächst für eine Stunde bei Raumtemperatur und dann für eine Stunde bei
37 °C im Brutschrank. Anschließend wurden die Objektträger durch zehnmaliges, kurzes
Eintauchen in destilliertes Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Die Objektträger wurden luftdicht
und feuchtigkeitsabweisend verpackt und mit dem Datum der Herstellung versehen. Die Lagerung
erfolgte bei –80 °C für bis zu 6 Monate.
3.2.5.3. Konjugat
Als
Konjugat
diente
FITC
(Fluoreszeinisothiocyanat)-konjugiertes
Kaninchen-anti-Maus-
41
IgG(H+L) , das in einer Verdünnung von 1:62,5 verwendet wurde.
3.2.5.4. Kontrollseren
Als negatives Kontrollserum wurde ein Sammelserum benutzt, welches aus Seren von nicht
38
Thoma, BRAND GmbH, Wertheim
39
16 wells à 6 mm, RENNER GmbH, Dannstadt
40
Multipette® plus, EPPENDORF, Hamburg
41
Artikelnummer 315-095-003, DIANOVA GmbH, Hamburg
96
3. Material und Methoden
infizierten Mäusen42 hergestellt wurde. Als positives Kontrollserum diente ein Sammelserum aus
Mäusen, die im Rahmen einer Studie mit dem T.-gondii-Stamm Dx infiziert wurden und bei denen
150 Tage p. i. eine Blutentnahme stattfand.
3.2.5.5. Testdurchführung
1. Auftauen der Objektträger
Die mit T.-gondii-Tachyzoiten beschichteten Objektträger wurden etwa 15 Minuten bei
Raumtemperatur aufgetaut.
2. Verdünnung der Testseren und Beschichtung der Objektträger
Die Kontrollseren und die Testseren wurden in Zweierschritten ab einer Verdünnung von 1:20 bis
1:655360 mit PBS in einer Mikrotiterplatte titriert. Das negative und das positive Kontrollserum
wurden jeweils von 1:20 bis 1:160 titriert.
Je 10 µl der Serumverdünnungen wurden auf ein Objektträgerfeld aufgetragen. Die
Seruminkubation erfolgte für 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei 37 °C im Wärmeschrank.
3. Spülen, Waschen und Trocknen der Objektträger
Nach der Inkubation wurde jeder Objektträger mit PBS abgespült und anschließend für 10 Minuten
in mit PBS gefüllte Küvetten auf den Magnetrührer43 bei niedrigster Einstellung gestellt.
Nach dem Waschen wurden die Objektträger aus den Küvetten entnommen und die anhaftende
Flüssigkeit abgeklopft. Anschließend wurden die Objektträger für ca. 10 Minuten bei
Raumtemperatur zum Trocknen aufgestellt. Danach wurden die Objektträger am Rand und
zwischen den Vertiefungen mit Wattestäbchen abgetrocknet.
4. Inkubation mit Konjugat
42
Stamm NMRI
43
IKA Combimag RCT 74309, Jahnke & Kunkel GmbH, Staufen
3. Material und Methoden
97
Es wurde Evans Blau* als Gegenfärbung verwendet und eine Konjugatgebrauchslösung (1:62,5)
aus 8 µl Konjugat und 492 µl Evans-Blau-Lösung hergestellt. Je 10 µl der Konjugatverdünnung
wurden auf jedes Objektträgerfeld gegeben, worauf eine Inkubation für 30 Minuten bei 37 °C in der
feuchten Kammer erfolgte.
5. Spülen und Waschen der Objektträger
Siehe Punkt 3.
6. Eindecken der Objektträger
Nachdem die Objektträger am Rand trockengewischt waren, wurden sie mit Eindeckmedium und
mit einem großen Deckgläschen44 abgedeckt. Die Objektträger wurden in Alufolie eingewickelt und
bis zur Auswertung bei Raumtemperatur aufbewahrt.
7. Auswertung
Die Auswertung erfolgte mit dem Fluoreszenzmikroskop bei 400facher Vergrößerung, wobei
folgende Einteilung vorgenommen wurde:
3+
der gesamte Parasit fluoresziert
2+
die Zellwand des Parasiten fluoresziert stark
1+
die Zellwand des Parasiten fluoresziert
trace
die Zellwand des Parasiten fluoresziert schwach oder die
Polkappen fluoreszieren
negativ
keine Fluoreszenz, rötliche Färbung (Evans Blau) der
Tachyzoiten
Als Titer wurde diejenige Verdünnungsstufe des Serums angegeben, in der die Fluoreszenz des
Parasiten noch mit 1+ beurteilt wurde. Eine alleinige Fluoreszenz an einem Pol der Parasiten
(Polkappenfluoreszenz) wurde als unspezifisch bewertet.
44
Deckgläser für Mikroskopie, 24 x 66 mm, KNITTEL GLÄSER, Braunschweig
98
3. Material und Methoden
3.2.6. Histologische Untersuchung von Gewebeproben
Von dem in der Sektion gewonnenen Gehirn des Kattas H24 sowie von dem Gehirn und der Lunge
der Maus, die mit dem Gehirn des Kattas inokuliert wurde (siehe Kap. 3.2.4.), wurden nach einer
routinemäßigen Paraffineinbettung histologische Schnitte in einer Schichtdicke von 4 µm
angefertigt und diese im Färbeautomaten mit H.&E. gefärbt. Anschließend erfolgte eine
lichtmikroskopische Untersuchung auf Gewebezysten von T. gondii.
4. Ergebnisse
99
4. ERGEBNISSE
4.1. Untersuchung von Serumproben nicht humaner Primaten im IgM-ELISA
auf Antikörper gegen T. gondii
Im IgM-ELISA wurden die Verlaufsblutproben aller 19 Weißkopfmakis untersucht. Dabei erwies
sich dieses ELISA-Format als unbrauchbar, da bei den Tieren, bei denen im SFT eine
Serokonversion nachgewiesen wurde (siehe Kap. 3.2.2.5.), im IgM-ELISA keine signifikanten
Unterschiede zu den Titern der Tiere mit einer chronischen Infektion bestanden. Zur Bestimmung
des Infektionsstadiums wurde daher bei den weiteren Untersuchungen ausschließlich der IgGAviditäts-ELISA benutzt.
4.2. Untersuchung von Serumproben nicht humaner Primaten im IgG-ELISA
auf Antikörper gegen T. gondii und Vergleich mit den im SFT ermittelten
Ergebnissen
Um die Ergebnisse aus dem IgG-ELISA graphisch darstellen zu können, wurde aus den für eine
Serumprobe ermittelten Indexwerten für jede Serumverdünnungsstufe der Mittelwert gebildet.
Dieses Vorgehen ist exemplarisch für eine Serumprobe in Tab. 11 aufgeführt.
100
4. Ergebnisse
Tab. 11: ELISA-Indices aus 3 Untersuchungen des Serums von dem Weißkopfmaki H23
(Probenahme März) und daraus berechneter Mittelwert für die graphische Darstellung
Serumverdünnung
1: 10
1: 20
1: 40
1: 80
1: 160
1: 320
1: 640
1: 1280
1: 2560
1: 5120
1: 10240
1: 20480
a
, nicht untersucht
A
0,673
0,572
0,466
0,379
0,275
0,195
0,176
0,122
0,106
0,103
0,106
n.u.
B
0,611
0,548
0,471
0,339
0,350
0,206
0,198
0,143
0,130
0,132
0,133
n.u.
C
n.u.a
0,653
0,482
0,414
0,299
0,221
0,161
0,139
0,101
0,097
0,104
0,098
Mittelwert
0,642
0,560
0,469
0,359
0,313
0,201
0,187
0,133
0,118
0,118
0,120
0,098
4.2.1. Weißkopfmakis
Im IgG-ELISA wurden die Verlaufsblutproben aller 19 Weißkopfmakis auf Antikörper gegen T.
gondii untersucht. Von jedem Tier waren bis zu vier Serumproben vorhanden (siehe Kap. 3.1.3.). In
der Tab. 12 sind für jede Serumprobe die in den einzelnen IgG-ELISAs ermittelten Titer aufgeführt.
Lagen die Indices dabei unterhalb der in Kap. 3.2.3.5.2. festgelegten Grenzwerte, wurde die
Serumprobe als negativ bezeichnet.
Die Festlegung der Endtiter und somit auch die endgültige Einstufung eines Serums als positiv oder
negativ erfolgten nach den in Kap. 3.2.3.5.3. beschriebenen Kriterien. Die Endtiter (und die
endgültige Beurteilung eines Serums) sind in der Tab. 13 aufgeführt, wo sie den im SFT ermittelten
Endtitern gegenübergestellt werden. In der Tab. 13 wird deutlich, dass die Ergebnisse aus beiden
Testverfahren hinsichtlich der Beurteilung der Seren als positiv oder negativ bei dem
überwiegenden Teil der untersuchten Serumproben übereinstimmten. Unterschiedliche Ergebnisse
wurden nur bei den Weißkopfmakis H6, H9 und H26 festgestellt. Das Serum von H6 wurde im
März im SFT als negativ beurteilt, wies jedoch im ELISA einen Endtiter von 1:40 auf. Bei H9
wurde das Serum im SFT zum Untersuchungszeitpunkt März mit einem Endtiter von 1:4 als
4. Ergebnisse
101
Tab. 12: Im ELISA ermittelte Einzeltiter für die Serumproben der Weißkopfmakis
Laufende
Nummer
Serum März
A
B
C
Serum Mai
A
B
H1
neg.a/ neg. / neg.
neg. / neg. / n.u.b
neg. / neg. / n.u.
neg. / neg. / neg.
H2
2560 / 2560 / n.u.
2560 / 2560 / n.u.
5120 / 2560 / n.u.
1280 / 2560 / n.u.
H3
2560 / 2560 / n.u.
2560 / 2560 / n.u.
5120 / 2560 / 1280
1280 / 1280 / n.u.
H4
640 / 320 / 160
160 / 160 / 160
640 / 640 / n.u.
320 / 160 / n.u.
H5
320 / 640 / n.u.
320 / 320 / n.u.
1280 / 640 / n.u.
320 / 160 / n.u.
H6
160 / 10
10
10
/ 10 / 10
160 / 40 / 20
H7
640 / 640 / n.u.
640 / 320 / n.u.
320
/ 320 / n.u.
320 / 320 / n.u.
H8
640 / 1280 / n.u.
---c
---
---
H9
10
---
---
neg. / neg. / neg.
H10
neg. / neg. / neg.
neg. / neg. / neg.
neg. / neg. / neg.
neg. / neg. / neg.
H21
640 / 640 / n.u.
640 / 320 / n.u.
640 / 640 / n.u.
---
H22
1280 / 1280 / n.u.
640 / 1280 / n.u.
640 / 1280 / n.u.
---
H23
160 / 160 / 160
160 / 320 / 160
160
---
H26
neg. / 10 / neg.
neg. / neg. / 10
neg. / neg. / neg.
neg. / neg. / 10
H31
neg. / neg. / neg.
neg. / neg. / neg.
neg. / neg. / neg.
neg. / neg. / neg.
H32
160 / 80 / 40
160 / 160 / n.u.
160
H33
neg. / neg. / neg.
neg. / neg. / neg.
neg. / neg. / neg.
H35
---
---
---
neg. / neg. / n.u.
---
---
neg. / neg. / neg.
/ neg. / neg.
H36
a
/ 40
--b
Serum Juni
A
B
C
/ 10 / 10
C
Serum Dezember
A
B
C
/ 320 / 160
/ 160 / n.u.
--neg. / neg. / neg.
c
, negativ; , nicht untersucht; , keine Blutentnahme möglich
grenzwertig und im Dezember mit einem Endtiter von > 1:64000 als hoch positiv beurteilt. Im IgGELISA ergab sich jedoch für beide Serumproben ein negatives Ergebnis. Das Serum von H26
wurde im ELISA zu allen vier Untersuchungszeitpunkten als negativ und im SFT als positiv
beurteilt.
Während im SFT bei den Tieren H6 und H9 eine Serokonversion nachgewiesen wurde (siehe Kap.
3.2.2.5.), blieben die im IgG-ELISA vorgenommenen Beurteilungen der Serumproben als positiv
oder
negativ
bei
allen
Tieren
über
den
gesamten
Untersuchungszeitraum
konstant.
102
4. Ergebnisse
Tab. 13: Vergleich der im ELISA und SFT ermittelten Endtiter für die Serumproben der
Weißkopfmakis
Laufende März
Nummer ELISA SFT
Mai
ELISA SFT
Juni
ELISA SFT
Dezember
ELISA SFT
H1
negativ negativ
negativ n.u.a
negativ negativ
negativ negativ
H2
2560
1000
2560
n.u.
5120
4000
2560
>64000
H3
2560
256
2560
n.u.
2560
16000
1280
>64000
H4
320
64
160
n.u.
640
1000
320
>64000
H5
640
64
320
n.u.
1280
256
320
>64000
H6
40
negativ
10
1000
10
64
40
>64000
H7
640
64
640
n.u.
320
1000
320
>64000
b
---
---
---
---
---
---
---
---
---
---
negativ >64000
H8
1280
H9
negativ 4
H10
negativ negativ
negativ n.u.
negativ negativ
negativ negativ
H21
640
64
640
n.u.
640
1000
---
---
H22
1280
256
1280
n.u.
1280
1000
---
---
H23
160
64
160
n.u.
160
1000
---
---
H26
negativ 16
negativ n.u.
negativ 256
negativ 1000
H31
negativ negativ
negativ n.u.
negativ negativ
negativ negativ
H32
80
160
160
---
H33
negativ negativ
negativ n.u.
negativ negativ
negativ negativ
H35
---
---
---
---
negativ negativ
---
---
negativ negativ
256
16
---
n.u.
---
H36
--------a
b
, nicht untersucht; , keine Blutentnahme möglich
256
---
In der Abb. 4(A) sind für alle Weißkopfmakis die Mittelwerte der IgG-ELISA-Indices für die
Erstuntersuchung, d. h. für den Zeitpunkt der ersten Probenahme, dargestellt. Die Verläufe der
Serumtitrationen wurden in der Grafik entsprechend ihrer Beurteilung im SFT farbig
gekennzeichnet. In der Abb. 4(A) wird deutlich, dass bei dem überwiegenden Teil der Serumproben
eine positive Beurteilung im SFT mit entsprechend hohen ELISA-Indices einherging, wobei die
jeweiligen Titrationskurven einen ähnlichen Verlauf nahmen wie die Titration des positiven
Kontrollserums (siehe Kap.3.2.3.8.). Hingegen wiesen Serumproben mit einem negativen SFTErgebnis überwiegend niedrige Indexwerte auf, die unter den in Kap. 3.2.3.5.2. festgelegten
4. Ergebnisse
103
Grenzwerten lagen und in ihrem Verlauf der Titration des negativen Kontrollserums ähnelten.
In der Abb. 4(B-F) sind für alle Weißkopfmakis die Mittelwerte der ELISA-Indices für die
Erstuntersuchung als Säulendiagramm dargestellt. Jede Abbildung beinhaltet eine andere
Serumverdünnung, wobei die Verdünnungen 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 und 1:160 dargestellt sind. Die
Säulen sind in den Abbildungen entsprechend der zuvor ermittelten SFT-Titer farbig markiert und
mit der Nummer des entsprechenden Tieres gekennzeichnet. Die Reihenfolge der Säulen wurde
dabei durch die Höhe des SFT-Titers bestimmt. Der Abb. 4(B-F) ist zu entnehmen, dass es bei dem
überwiegenden Teil der Serumproben eine positive Korrelation zwischen Höhe des SFT-Titers und
Höhe der ELISA-Indices gab. Zudem wird in der Abb. 4(B-F) deutlich, dass es bei Seren, die einen
niedrigen Titer im ELISA aufwiesen, zu einem raschen Abfall der Indexwerte unterhalb des
Grenzwertes kam. So wurde der Weißkopfmaki H32 bei der Erstuntersuchung im ELISA bis zu
einer Verdünnungsstufe von 1:80 als positiv, ab einer Serumverdünnung von 1:160 jedoch als
negativ beurteilt. Sollen im ELISA auch Tiere mit einem niedrigen Titer erfasst werden, sollte eine
Titration daher möglichst ab einer Verdünnung von 1:10 durchgeführt werden.
In der Abb. 5(A-C) sind die Mittelwerte der ELISA-Indices aus dem IgG-ELISA bei einer
Serumverdünnung von 1:10 für die Untersuchungszeitpunkte März, Juni und Dezember als
Säulendiagramm dargestellt und entsprechend ihrer Beurteilung im SFT farbig markiert. Da für die
Serumproben, die im Mai gewonnen wurden, nur für den Weißkopfmaki H6 ein SFT-Ergebnis
vorlag (siehe Kap. 3.2.2.5.), wurde dieser Untersuchungszeitpunkt nicht graphisch dargestellt. Die
Säulen sind in den Abbildungen mit der Nummer der entsprechenden Tiere gekennzeichnet und
nach Größe der Indexwerte bei der Untersuchung im März sortiert. In der Abb. 5(A-C) wird
deutlich, dass sich die im IgG-ELISA ermittelten Ergebnisse bei allen Weißkopfmakis über den
gesamten Untersuchungszeitraum konstant zeigten, während im SFT hinsichtlich der Beurteilung
als positiv oder negativ bei den Weißkopfmakis H6 und H9 eine Serokonversion nachgewiesen
wurde (siehe auch Kap. 3.2.2.5.).
104
4. Ergebnisse
1
ELISA-Index
1
0,8
0,6
0,4
0,8
0,6
0,4
SFT-positiv
SFT-negativ
Tiernum m er
SFT-Titer > 256
SFT-Titer = 16
SFT-grenzw ertig
C
1:20
1
1
ELISA-Index
1,2
0,6
0,4
SFT-Titer = 64
SFT-negativ
D
1:40
1,2
0,8
SFT-Titer = 256
SFT-Titer = 4
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
2
3
8
22
4
21
5
7
23
32
26
9
6
1
10
31
33
35
36
0,2
2
3
8
22
4
21
5
7
23
32
26
9
6
1
10
31
33
35
36
ELISA-Index
2
3
8
22
4
21
5
7
23
32
26
9
6
1
10
31
33
35
36
20480
5120
10240
2560
1280
640
320
80
0
160
0
40
0,2
20
0,2
reziproke Serum verdünnung
B
1:10
1,2
10
ELISA-Index
A
1,2
Tiernum m er
Tiernum m er
SFT-Titer > 256
SFT-Titer = 256
SFT-Titer = 64
SFT-Titer >256
SFT-Titer = 256
SFT-Titer = 64
SFT-Titer = 16
SFT-Titer = 4
SFT-negativ
SFT-Titer = 16
SFT-Titer = 4
SFT-negativ
E
1
ELISA-Index
1
0,8
0,6
0,4
F
1:160
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
2
3
8
22
4
21
5
7
23
32
26
9
6
1
10
31
33
35
36
0,2
2
3
8
22
4
21
5
7
23
32
26
9
6
1
10
31
33
35
36
ELISA-Index
1:80
1,2
Tiernum m er
Tiernum m er
SFT-Titer >256
SFT-Titer = 256
SFT-Titer = 64
SFT-Titer > 256
SFT-Titer = 256
SFT-Titer = 64
SFT-Titer = 16
SFT-Titer = 4
SFT-negativ
SFT-Titer = 16
SFT-Titer = 4
SFT-negativ
Abb. 4: Erstuntersuchung der Weißkopfmakis im IgG-ELISA
4. Ergebnisse
105
A
März
1,2
ELISA-Index
1
0,8
0,6
0,4
0,2
2
8
3
22
5
21
7
4
32
23
6
9
26
1
31
10
33
36
35
0
Tiernum m er
SFT-positiv
SFT-grenzw ertig
SFT-negativ
B
Juni
1,2
ELISA-Index
1
0,8
0,6
0,4
0,2
2
8
3
22
5
21
7
4
32
23
6
9
26
1
31
10
33
36
35
0
Tiernum m er
SFT-positiv
SFT-negativ
Dezember
C
1,2
ELISA-Index
1
0,8
0,6
0,4
0,2
2
8
3
22
5
21
7
4
32
23
6
9
26
1
31
10
33
36
35
0
Tiernum m er
SFT-positiv
SFT-negativ
Abb. 5: Untersuchung der Weißkopfmakis im IgG-ELISA bei einer Serumverdünnung von 1:10
zum Untersuchungszeitpunkt März, Juni und Dezember
106
4. Ergebnisse
4.2.2. Kattas
Es wurden die Serumproben aller 7 Kattas im IgG-ELISA auf Antikörper gegen T. gondii
untersucht. Von dem Katta H24 waren zwei Serumproben vorhanden (Untersuchungszeitpunkte
März und Juni), bei den übrigen Tieren erfolgte nur eine Blutentnahme. In der Tab. 14 sind die im
IgG-ELISA ermittelten Einzel- und Endtiter sowie die Endtiter aus dem SFT für die Kattas H24 und
H25 aufgeführt. Die Serumproben der Kattas J7-J9, B1 und B2 waren sowohl im IgG-ELISA als
auch im SFT bei allen Untersuchungen negativ. Hinsichtlich der Einstufung der Seren als positiv
oder negativ lässt sich somit für alle 7 untersuchten Tiere eine Übereinstimmung der Ergebnisse aus
beiden Testverfahren feststellen.
In der Abb. 6(A) sind die Mittelwerte der ELISA-Indices für die Erstuntersuchung der Kattas
dargestellt. Die Verläufe der Serumtitrationen sind entsprechend ihrer Beurteilung im SFT farbig
gekennzeichnet. In der Abb. 6(B) sind für die Serumverdünnungsstufe 1:10 die Mittelwerte der
ELISA-Indices als Säulendiagramm dargestellt. Die Säulen sind entsprechend der zuvor ermittelten
SFT-Titer farbig markiert und mit der laufenden Nummer der Tiere gekennzeichnet. Der Abb. 6(AB) ist zu entnehmen, dass die Kattas H24 und H25, die bei der Erstuntersuchung im SFT beide
einen Titer ≥ 1:256 aufwiesen, sich im IgG-ELISA durch hohe Indexwerte auszeichneten, die
deutlich über den in Kap. 3.2.3.5.2. festgelegten Grenzwerten lagen, während die SFT-negativen
Kattas niedrige ELISA-Indices aufwiesen, die unterhalb der Cut-offs lagen.
Tab. 14: Vergleich der im ELISA und im SFT ermittelten Titer für die Serumproben der Kattas H24
und H25
Laufende
Nummer
H24
H25
a
März
ELISAa
Einzeltiter
2560 / 2560
1280 / 1280
, keine Probenahme
SFT
Juni
ELISA
Einzeltiter Endtiter
SFT
4000
640 / 640
640
4000
---
---
Endtiter
2560
1280
256
a
---
4. Ergebnisse
107
1
ELISA-Index
1
0,8
0,6
0,4
0,8
0,6
0,4
SFT-positiv
5120
SFT-negativ
10240
2560
1280
640
320
160
0
80
0
40
0,2
20
0,2
reziproke Serum verdünnung
B
1:10
1,2
10
ELISA-Index
A
1,2
H24 H25
J7
J8
J9
B1
B2
Tiernum m er
SFT-Titer > 256
SFT-Titer = 256
SFT-negativ
Abb. 6: Erstuntersuchung der Kattas im IgG-ELISA
4.2.3. Totenkopfaffen
Es wurden die Serumproben von allen 24 Totenkopfaffen im IgG-ELISA auf Antikörper gegen T.
gondii untersucht. Bei den 14 aus Hodenhagen stammenden Tieren waren bis zu vier verschiedene
Serumproben vorhanden, die entsprechend dem Untersuchungsschema der Weißkopfmakis zu
unterschiedlichen Zeitpunkten gewonnen wurden (siehe Kap. 3.1.3). Während im SFT sämtliche
Serumproben der Totenkopfaffen als negativ beurteilt wurden (siehe Kap. 3.2.2.5.), waren bei
Untersuchung der Seren im IgG-ELISA deutliche Unterschiede zwischen den Indexwerten der
einzelnen Tiere festzustellen. Eine Festlegung von ELISA-Titern war jedoch bei diesen Tieren nicht
möglich, da die für die Weißkopfmakis und Kattas verwendeten Grenzwerte bei den
Totenkopfaffen nicht benutzt werden konnten. Bei den Totenkopfaffen wiesen bei Anwendung der
Grenzwerte nämlich auch solche Seren einen Titer von bis zu 1:2560 auf, bei denen nur niedrige
Indexwerte festgestellt wurden und die in ihrem Verlauf der Titration des negativen Kontrollserums
ähnelten. Eine endgültige Einstufung der Seren als positiv oder negativ war unter diesen Umständen
im IgG-ELISA nicht möglich.
In der Abb. 7(A, C, E) sind die Mittelwerte der ELISA-Indices für die Erstuntersuchung der
Totenkopfaffen dargestellt, wobei die Serumverläufe danach gekennzeichnet sind, ob die
Mittelwerte der Indices bei einer Serumverdünnung von 1:10 über oder unter dem in Kap. 3.2.3.5.2.
108
4. Ergebnisse
festgelegten Grenzwert von 0,428 lagen. Die 24 untersuchten Totenkopfaffen stammten aus drei
unterschiedlichen Beständen (siehe Kap. 3.1.3) und wurden entsprechend ihrer Herkunft in
verschiedenen Abbildungen dargestellt. In der Abb. 7(B, D, F) sind die Mittelwerte der ELISAIndices für die Erstuntersuchung der Totenkopfaffen bei einer Serumverdünnung von 1:10 als
Säulendiagramm dargestellt. Die Säulen wurden in der Abb. 7(B, D, F) mit der laufenden Nummer
der Tiere gekennzeichnet und nach Größe der Indexwerte sortiert. Die farbige Markierung der
Säulen richtete sich danach, ob die Mittelwerte der ELISA-Indices bei einer Serumverdünnung von
1:10 über oder unter dem Grenzwert von 0,428 lagen.
Der Abb. 7 ist zu entnehmen, dass bei 11 von 14 Totenkopfaffen aus Hodenhagen, bei 1 von 5
Totenkopfaffen aus Jaderberg und bei 3 von 5 Totenkopfaffen aus Braunschweig die Mittelwerte
der ELISA-Indices für die Erstuntersuchung bei einer Serumverdünnung von 1:10 über 0,428 lagen.
Bei den aus Hodenhagen stammenden Totenkopfaffen waren die im IgG-ELISA ermittelten
Titrationskurven breit gestreut und wiesen in keinem Fall einen Plateaubereich auf, wie es bei der
Titration des positiven Kontrollserums der Fall war (Kap. 3.2.3.8.). Bei den aus Jaderberg und
Braunschweig stammenden Totenkopfaffen waren die Serumverläufe der Tiere, deren Indexwerte
über 0,428 lagen (J1, B3, B6 und B7) deutlich von den Serumverläufen der Tiere abgesetzt, die
unter dem Grenzwert lagen. Der Verlauf der Titrationskurve ähnelte dabei in jedem Fall der
Titration des positiven Kontrollserums.
Die für die Untersuchungszeitpunkte Mai, Juni und Dezember im IgG-ELISA ermittelten Indices
für die aus Hodenhagen stammenden Totenkopfaffen waren mit den in der Erstuntersuchung
festgestellten Werten vergleichbar.
Da bei der Untersuchung der Totenkopfaffen im IgG-ELISA deutliche Unterschiede zwischen den
Serumproben der einzelnen Tiere festgestellt wurden, zeigten die Ergebnisse im Vergleich mit dem
SFT eine große Diskrepanz.
4. Ergebnisse
109
A
1,2
1,2
ELISA-Index
1
0,8
0,6
0,4
0,4
20
28
29
16
13
14
17
11
15
30
18
19
27
12
10240
5120
2560
640
1280
320
160
80
40
0
20
0
Tiernum m er
SFT-negativ, Mittelw ert ELISA-Index > Grenzw ert
SFT-negativ, Mittelw ert ELISA-Index > Grenzw ert
SFT-negativ, Mittelw ert ELISA-Index < Grenzw ert
SFT-negativ, MIttelw ert ELISA-Index < Grenzw ert
C
1,2
1,2
1
1
ELISA-Index
1,4
0,8
0,6
0,4
0,8
0,6
0,4
10240
5120
2560
640
1280
320
160
80
0
40
0,2
0
20
0,2
reziproke Serum verdünnung
D
Jaderberg (1 : 10)
1,4
10
J1
J2
J3
J4
J5
Tiernum m er
SFT-negativ, Mittelw ert ELISA-Index > Grenzw ert
SFT-negativ, Mittelw ert ELISA-Index > Grenzw ert
SFT-negativ, Mittelw ert ELISA-Index < Grenzw ert
SFT-negativ, Mittelw ert ELISA-Index < Grenzw ert
E
Braunschweig
1,4
1,2
1,2
ELISA-Index
1
0,8
0,6
0,4
1
0,8
0,6
0,4
5120
2560
1280
640
320
160
80
40
0
20
0,2
0
10
0,2
reziproke Serum verdünnung
F
Braunschweig (1 : 10)
1,4
10240
ELISA-Index
0,6
0,2
Jaderberg
ELISA-Index
1
0,8
0,2
reziproke Serum verdünnung
B
Hodenhagen (1 : 10)
1,4
10
ELISA-Index
Hodenhagen
1,4
B6
B3
B7
B4
B5
Tiernum m er
SFT-negativ, Mittelw ert ELISA-Index > Grenzw ert
SFT-negativ, Mittelw ert ELISA-Index > Grenzw ert
SFT-negativ, Mittelw ert ELISA-Index < Grenzw ert
SFT-negativ, Mittelw ert ELISA-Index < Grenzw ert
Abb. 7 : Erstuntersuchung der Totenkopfaffen im IgG-ELISA
110
4. Ergebnisse
4.2.4. Andere Neuweltaffen
Außer den Totenkopfaffen wurden weitere Neuweltaffen im IgG-ELISA untersucht. Es wurden
insgesamt 10 Tiere auf Antikörper gegen T. gondii getestet, wobei es sich um 6 verschiedene
Affenspezies handelte (siehe Kap. 3.1.3). Ein SFT-Ergebnis lag nur für den Weißbüschelaffen J10
vor. Die Serumprobe des Tieres wurde als negativ beurteilt (siehe Kap. 3.2.2.5.). Aus den gleichen
Gründen wie bei den Totenkopfaffen (siehe Kap. 4.2.3.) ließen sich auch bei diesen Tieren weder
Titer festlegen noch eine endgültige Einstufung der Seren vornehmen.
In der Abb. 8(A) sind die Mittelwerte der ELISA-Indices dargestellt. Die Verläufe der
Serumtitrationen wurden danach gekennzeichnet, ob die Mittelwerte der ELISA-Indices bei einer
Serumverdünnung von 1:10 über oder unter dem in Kap. 3.2.3.5.2. festgelegten Grenzwert von
0,428
lagen.
In
der
Abb.
8(B)
sind
die
Mittelwerte
der
ELISA-Indices
für
die
Serumverdünnungsstufe 1:10 als Säulendiagramm dargestellt. Die Säulen wurden in den
Abbildungen mit der laufenden Nummer der Tiere gekennzeichnet und nach Größe der Indexwerte
sortiert. Die farbige Markierung der Säulen richtete sich danach, ob die Mittelwerte der ELISAIndices über oder unter 0,428 lagen.
Der Abb. 8(A-B) ist zu entnehmen, dass bei M2 und M7 die Mittelwerte der ELISA-Indices bei
einer Serumverdünnung von 1:10 etwas über 0,428 lagen. Es ließ sich jedoch feststellen, dass die
ermittelten Indexwerte zwischen den einzelnen Tieren keine großen Unterschiede aufwiesen,
sondern insgesamt relativ niedrig waren. Anhand des Serumverlaufes von M2 in Abb. 8(A) wird
deutlich, dass die Cut-offs für diese Tiere nicht geeignet waren, da diese Serumprobe trotz der
niedrigen Indices bei Anwendung der Grenzwerte einen Titer von 1:2560 aufweisen würde. Die
Titrationskurve von M2 wurde in Abb. 8(A) durch einen Pfeil gekennzeichnet.
4. Ergebnisse
111
1,2
1
1
0,6
M9
M3
M5
J10
M1
10240
5120
2560
1280
640
320
80
160
0
40
0,2
0
20
0,2
M6
0,4
M4
0,4
0,8
M8
0,6
M7
0,8
M2
ELISA-Index
1,2
reziproke Serum verdünnung
B
1:10
1,4
10
ELISA-Index
A
1,4
Tiernum m er
Mittelw ert ELISA-Index > Grenzw ert
Mittelw ert ELISA-Index > Grenzw ert
Mittelw ert ELISA-Index < Grenzw ert
Mittelw ert ELISA-Index < Grenzw ert
Abb. 8: Untersuchung der anderen Neuweltaffen im IgG-ELISA
4.2.5. Rhesusaffen
Es wurden alle 19 Rhesusaffen im IgG-ELISA auf Antikörper gegen T. gondii untersucht.
Ergebnisse aus dem SFT lagen für diese Tiere nicht vor. Die in Kap. 3.2.3.5.2. festgelegten
Grenzwerte ließen sich bei dieser Spezies ebenfalls nicht anwenden, da alle untersuchten Tiere
Indices aufwiesen, die weit über den Cut-offs lagen. Eine Titerfestlegung und eine endgültige
Beurteilung der Seren im IgG-ELISA war deshalb ohne geeignete Kontrollseren auch bei den
Rhesusaffen nicht möglich.
In der Abb. 9(A) sind die Mittelwerte der ELISA-Indices dargestellt. Die Verläufe der
Serumtitrationen sind danach gekennzeichnet, ob die Mittelwerte der ELISA-Indices bei einer
Serumverdünnung von 1:10 über 1,2 oder unter 0,95 lagen. In der Abb. 9(B) sind für die
Serumverdünnungsstufe 1:10 die Mittelwerte der ELISA-Indices als Säulendiagramm dargestellt.
Die Säulen wurden in den Abbildungen mit der laufenden Nummer der Tiere gekennzeichnet und
nach Größe der Indexwerte sortiert. Die farbige Markierung der Säulen richtete sich danach, ob die
Mittelwerte der ELISA-Indices bei einer Serumverdünnung von 1:10 über 1,2 oder unter 0,95 lagen.
112
4. Ergebnisse
Der Abb. 9(A-B) ist zu entnehmen, dass bei 13 Rhesusaffen die Mittelwerte der Indices bei einer
Serumverdünnung von 1:10 über 1,2 und bei 6 Rhesusaffen unter 0,95 lagen. In der Abb. 9(A)
lassen sich eindeutige Unterschiede zwischen den Titrationskurven der einzelnen Tiere feststellen.
Die Serumverläufe der Rhesusaffen, bei denen die Indexwerte unter 0,95 lagen, nahmen einen
konkaven Verlauf, während die Titrationskurven der übrigen Tiere konkav bis konvex waren und
zum Teil einen Plateaubereich aufwiesen, wie es auch bei der Titration des positiven
Kontrollserums der Weißkopfmakis der Fall war (siehe Kap. 3.2.3.8.).
1:10
1,4
1,4
1,2
1,2
1
0,8
0,6
0,4
1
0,8
0,6
0,4
Mittelw ert ELISA-Index bei 1:10 > 1,2
MIttelw ert ELISA-Index bei 1:10 < 0,95
10240
5120
2560
1280
640
320
160
80
0
40
0,2
0
20
0,2
reziproke Serum verdünnung
B
R05
R06
R03
R13
R07
R02
R10
R09
R11
R08
R04
R01
R12
R17
R14
R16
R18
R19
R15
ELISA-Index
1,6
10
ELISA-Index
A
1,6
Tiernum m er
Mittelw ert ELISA-Index bei 1:10 > 1,2
Mittelw ert ELISA-Index bei 1:10 < 0,95
Abb. 9 : Erstuntersuchung der Rhesusaffen im IgG-ELISA
4.3. Untersuchung von Serumproben nicht humaner Primaten im IgGAviditäts-ELISA zur Bestimmung des Infektionsstadiums der T.-gondiiInfektionen
Um beurteilen zu können, ob es sich um akute oder chronische T.-gondii-Infektionen handelte,
wurde mit allen Serumproben, bei denen die Indexwerte im IgG-ELISA über den in Kap. 3.2.3.5.2.
festgelegten Grenzwerten lagen, ein IgG-Aviditäts-ELISA durchgeführt. Wurde ein deutlicher
Unterschied zwischen den Indexwerten des Testansatzes ohne Harnstoff und des Testansatzes mit
Harnstoff festgestellt, so deutete dies auf ein positives Ergebnis und somit auf ein frühes Stadium
4. Ergebnisse
113
der T.-gondii-Infektion hin. Bestand hingegen kaum ein Unterschied zwischen den Indexwerten der
Testansätze, wurde dies als Hinweis auf eine chronische T.-gondii-Infektion der Tiere gewertet und
deutete auf ein negatives Ergebnis hin. Da es bislang keine vergleichbaren Untersuchungen mit
Seren von nicht humanen Primaten im IgG-Aviditäts-ELISA gibt, konnte keine endgültige
Auswertung dieses Testverfahrens erfolgen. Wurde innerhalb einer untersuchten Spezies jeweils
eine Serumprobe ermittelt, bei der ein Unterschied zwischen den Indexwerten bestand, sowie eine,
die auf ein negatives Ergebnis hindeutete, wurden zwei entsprechende Serumtitrationen in diesem
Kapitel dargestellt. Die für die übrigen Serumproben ermittelten Ergebnisse sind im Anhang in
Kap. 9.3. aufgeführt.
Die Ergebnisse aus dem IgG-Aviditäts-ELISA wurden alle auf ihre Reproduzierbarkeit hin
überprüft, d. h. es wurden mit jeder Serumprobe mindestens zwei voneinander unabhängige
Untersuchungen durchgeführt.
4.3.1. Weißkopfmakis
Im IgG-Aviditäts-ELISA wurden alle Verlaufsblutproben der Weißkopfmakis H2-H8, H21-H23
und H32 untersucht. Bei H6 und H23 wurden bei der Erstuntersuchung im März sowie bei H23
auch bei der zweiten Probennahme im Mai geringe Unterschiede zwischen den Indexwerten des
Testansatzes ohne Harnstoff und des Testansatzes mit Harnstoff festgestellt. Bei allen übrigen
Serumproben der Weißkopfmakis bestand sowohl bei der Erstuntersuchung als auch bei den
nachfolgenden Untersuchungszeitpunkten im IgG-Aviditäts-ELISA kaum ein Unterschied zwischen
den Indexwerten des Testansatzes ohne Harnstoff und des Testansatzes mit Harnstoff. In der Abb.
10 sind die im IgG-Aviditäts-ELISA ermittelten Ergebnisse für die Weißkopfmakis H6 und H4 bei
der Erstuntersuchung im März dargestellt.
114
4. Ergebnisse
A
B
H4, März
0,8
0,6
0,6
ELISA-Index
0,4
0,2
0
0,4
0,2
ohne Harnstoff
mit Harnstoff
ohne Harnstoff
1280
reziproke Serum verdünnung
640
320
160
80
40
20
1280
reziproke Serum verdünnung
640
320
160
80
40
20
10
0
10
ELISA-Index
H6, März
0,8
mit Harnstoff
Abb. 10: Im IgG-Aviditäts-ELISA ermittelte Ergebnisse für die Weißkopfmakis H6 und H4 (März)
4.3.2. Kattas
Im IgG-Aviditäts-ELISA wurden die Serumproben der Kattas H24 und H25 aus der
Erstuntersuchung im März untersucht. Bei beiden Proben bestand kaum ein Unterschied zwischen
den Indexwerten des Testansatzes ohne Harnstoff und des Testansatzes mit Harnstoff.
4.3.3. Totenkopfaffen
Im IgG-Aviditäts-ELISA wurden die Serumproben der Totenkopfaffen H11, H13-H18, H20, H28H30, J1, B3, B6 und B7 aus der Erstuntersuchung untersucht. Bei H16, H17, J1, B3, B6 und B7
wurden deutliche, bei H11, H20, H28 und H29 wurden geringe und bei H13, H14, H15, H18 und
H30 wurden kaum Unterschiede zwischen den Indexwerten des Testansatzes ohne Harnstoff und
des Testansatzes mit Harnstoff festgestellt. In der Abb. 11 sind die Titrationskurven der Tiere B3
und H18 dargestellt.
Bei den aus Hodenhagen stammenden Totenkopfaffen stand von den Serumproben der anderen
Untersuchungszeitpunkte nicht ausreichend viel Serum zur Verfügung, so dass der IgG-AviditätsELISA mit diesen Proben nicht durchgeführt werden konnte.
4. Ergebnisse
115
A
0,8
ohne Harnstoff
mit Harnstoff
reziproke Serum verdünnung
ohne Harnstoff
1280
640
320
160
1280
640
320
160
0
80
0
40
0,2
20
0,2
80
0,4
40
0,4
0,6
20
0,6
10
ELISA-Index
0,8
reziproke Serum verdünnung
B
H18
1
10
ELISA-Index
B3
1
mit Harnstoff
Abb. 11: Im IgG-Aviditäts-ELISA ermittelte Ergebnisse für die Totenkopfaffen B3 und H18
(März)
4.3.4. Andere Neuweltaffen
Im IgG-Aviditäts-ELISA wurden die Serumproben der Neuweltaffen M2 und M7 untersucht. Bei
beiden Proben wurden kaum Unterschiede zwischen den Indexwerten des Testansatzes ohne
Harnstoff und des Testansatzes mit Harnstoff festgestellt.
4.3.5. Rhesusaffen
Im IgG-Aviditäts-ELISA wurden die Serumproben aller 19 Rhesusaffen untersucht. Bei R2, R6,
R7, R8, R10 und R11 wurden deutliche, bei R1, R3, R4, R5, R9, R12, R13 und R17 wurden geringe
und bei R14, R15, R16, R18 und R19 wurden kaum Unterschiede zwischen den Indexwerten des
Testansatzes ohne Harnstoff und des Testansatzes mit Harnstoff festgestellt. In der Abb. 12 sind die
Ergebnisse der Tiere R8 und R16 dargestellt.
116
4. Ergebnisse
A
1,2
1
1
ohne Harnstoff
mit Harnstoff
reziproke Serum verdünnung
ohne Harnstoff
1280
640
320
1280
640
320
160
80
0
40
0,2
0
20
0,2
160
0,4
80
0,4
0,6
40
0,6
0,8
20
0,8
10
ELISA-Index
1,2
reziproke Serum verdünnung
B
R16
1,4
10
ELISA-Index
R8
1,4
mit Harnstoff
Abb. 12: Im IgG-Aviditäts-ELISA ermittelte Ergebnisse für die Rhesusaffen R8 und R16
4.4. Untersuchung der Serumprobe der Maus im SFT auf Antikörper gegen T.
gondii
Bei der Untersuchung der Serumprobe der Maus (siehe Kap. 3.2.4.2.) im SFT auf Antikörper gegen
T. gondii wurde ein Titer von 1:256 ermittelt.
4.5. Untersuchung von Serumproben der Mäuse im IFAT auf Antikörper gegen
T. gondii
In der Tab. 15 sind für alle 4 im IFAT untersuchten Mäuse (siehe Kap. 3.2.4.2) die in den
Verdünnungsstufen 1:1280 bis 1:81920 jeweils vorgenommenen Bewertungen aufgeführt. Da sich
bei einer Serumverdünnung von 1:20 bis 1:1280 für alle Tiere eine Bewertung von 2+ ergab und ab
einer Verdünnung von 1:81920 alle Seren als negativ eingestuft wurden, wurden diese Ergebnisse
in der Tab. 15 ausgelassen. Für Maus 1 ergab sich ein Titer von 1:20480 und für die Mäuse 2 bis 4
ein Titer von 1:10240.
4. Ergebnisse
117
Tab. 15: Im IFAT ermittelte Ergebnisse für die Serumproben der Mäuse
Serumverdünnunga
laufende Nummer der Maus
1
2
3
a
4
1:1280
2+
2+
2+
2+
1:2560
1+
1+
1+
2+
1:5120
1+
1+
1+
1+
1:10240
1+
1+
1+
1+
1:20480
1+
trace
trace
trace
1:40960
trace
trace
negativ
trace
1:81920
negativ
negativ
negativ
negativ
, die Serumverdünnungen 1:20 bis 1:640 sowie 1:163840 bis 1:655360 sind nicht aufgeführt
4.6. Histologische Untersuchung von Gewebeproben eines verstorbenen Kattas
Bei der histologischen Untersuchung der Gewebeproben wurden sowohl im Gehirn des Kattas H24
als auch im Gehirn und in der Lunge der Maus (siehe Kap. 3.2.4.2.) Gewebezysten von T. gondii
nachgewiesen. In der Abb. 13 ist eine Gewebezyste aus dem Gehirn des Kattas dargestellt. Die
Aufnahme erfolgte mit dem 40er Objektiv (400fache Vergrößerung).
60 µm
Abb. 13: Gewebezyste von T. gondii im Gehirn des Kattas H24 (H.&E. gefärbt)
118
4. Ergebnisse
4.7. Reproduzierbarkeit des IgG-ELISAs
Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit des IgG-ELISAs erfolgte zunächst eine wiederholte
Titration des positiven Kontrollserums. Aus den dabei ermittelten optischen Dichten wurde für die
Serumverdünnungsstufen 1:10 bis 1:2560 der Mittelwert ( )gebildet und die Standardabweichung
(SD) berechnet. Anschließend wurde der Variationskoeffizient (VK) nach der folgenden Formel
ermittelt:
VK = SD/
· 100
In der Tab. 16 sind für die Serumverdünnungsstufen 1:10 bis 1:2560 die Anzahl der in die
Berechnung einbezogenen optischen Dichten (n) aufgeführt und die daraus berechneten
Mittelwerte,
Standardabweichungen
und
Variationskoeffizienten
dargestellt.
Ein
Variationskoeffizient < 5 sprach für eine gute Reproduzierbarkeit, ein Variationskoeffizient < 10
war akzeptabel.
Tab. 16: Berechnung des Variationskoeffizienten
SerumverAnzahl der
Mittelwert
dünnung
ODsa
(n)
( )
Standardabweichung
(SD)
Variationskoeffizient
(VK = s / · 100)
1:10
6
1,449
0,106
7,3
1:20
7
1,482
0,077
5,2
1:40
8
1,524
0,051
3,4
1:80
8
1,441
0,070
4,7
1:160
8
1,267
0,092
7,3
1:320
8
0,987
0,097
9,8
1:640
8
0,710
0,084
11,8
1:1280
8
0,497
0,083
16,7
1:2560
8
0,340
0,056
16,5
a
, optische Dichten
5. Diskussion der Ergebnisse
119
5. DISKUSSION DER ERGEBNISSE
5.1. Problematik von T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen Primaten und
Zielsetzung dieser Dissertation
Einige nicht humane Primaten gehören zu einer Gruppe von hochempfänglichen Spezies, die nach
einer Infektion mit T. gondii an einer akuten disseminierten Toxoplasmose erkranken (INNES
1997). Insbesondere bei Neuweltaffen und Lemuren kommt es durch diesen Parasiten immer wieder
zu Todesfällen. Da alle nicht humanen Primaten geschützte Tierarten sind, die in den Anhängen I
und II des Washingtoner Artenschutzabkommens (CITES) aufgelistet sind, bedeuten solche
Tierverluste nicht nur einen finanziellen Schaden für die jeweiligen Besitzer, sondern sind auch
gegenüber dem Artenschutz relevant. Neben dem Tod einzelner Tiere können auf diese Weise auch
Störungen innerhalb von Zuchtprogrammen verursacht werden, was bei Spezies, die vom
Aussterben bedroht sind, besonders verheerend ist. So führt z. B. der Tod des dominanten
Männchens zu schwerwiegenden Problemen in einer Zuchtgruppe, da sich die Integration neuer
Tiere oft schwierig gestaltet.
Prinzipiell besteht zwar die Möglichkeit einer Therapie der akuten Toxoplasmose, der Beginn der
Behandlung muss jedoch sehr frühzeitig erfolgen, um bei den Tieren eine Rekonvaleszenz zu
erreichen. Die Durchführung einer spezifischen Therapie scheitert deshalb in der Regel daran, dass
die Erkrankung auf Grund der unspezifischen klinischen Symptome nicht oder wegen des akuten
bis perakuten Verlaufes zu spät erkannt wird. In der Vergangenheit wurden Toxoplasmosen bei
nicht humanen Primaten daher meistens erst in der Sektion diagnostiziert (JUAN-SALLES et al.
1997). Dabei erfolgte die Diagnose für die Therapie ebenfalls erkrankter Tiere in der Regel zu spät.
Eine geeignete Vakzine als Schutz vor der Toxoplasmose steht für nicht humane Primaten zurzeit
nicht zur Verfügung. Für Schafe ist ein attenuierter Lebendimpfstoff kommerziell erhältlich, der
diese Tiere vor T.-gondii-verursachten Aborten schützt. Er enthält den T.-gondii-Stamm S48, der
keine Gewebezysten in den Zwischenwirten bildet. Bei Schafen induziert der Impfstoff eine
langanhaltende protektive Immunität, wobei eine Boosterung des Antikörpertiters auf natürlichem
Weg durch die Aufnahme von sporulierten Oozysten auf der Weide stattfindet. Die Vakzine besitzt
120
5. Diskussion der Ergebnisse
für Schafe keine nennenswerten Nebenwirkungen. Der Einsatz dieses Impfstoffs bei nicht humanen
Primaten wäre jedoch ein nicht kalkulierbares Risiko für die Tiere. Da bei einer Lebendvakzine
Mutationen des Impfstammes nicht ausgeschlossen werden können, wäre es denkbar, dass sich die
Parasiten aus dem Impfstamm enzystieren und bei einer Immunsuppression des geimpften Tieres zu
einer Reaktivierung gelangen. Auf diese Weise könnten die gleichen Krankheitssymptome
hervorgerufen werden wie nach einer natürlichen Infektion mit dem Parasiten (HO-YEN 1992). Die
Erprobung einer solchen Vakzinierung bei nicht humanen Primaten wäre somit nur als Tierversuch
unter den dafür geltenden gesetzlichen Bestimmungen durchführbar.
Das Krankheitsbild einer akuten Toxoplasmose bei nicht humanen Primaten ist variabel und
unspezifisch (McKISSICK et al. 1968). Allein auf Grund des klinischen Bildes lässt sich die
Diagnose daher nicht eindeutig stellen. Um akute Toxoplasmosen bei nicht humanen Primaten nicht
erst in der Sektion sondern auch an lebenden Tieren zu diagnostizieren, ist die Entwicklung eines
geeigneten serologischen Testverfahrens notwendig. Für erkrankte Tiere kann eine schnelle
Diagnosefindung gefolgt von der Einleitung einer spezifischen Therapie lebensrettend sein. Es kann
allerdings, z. B. durch den Versand der Serumproben, auch hier eine Zeitverzögerung entstehen und
der Nachweis der T.-gondii-Infektion für die Therapie erkrankter Tiere ebenfalls zu spät erfolgen.
Es müssen daher prophylaktische Maßnahmen bei der Bekämpfung der Toxoplasmose im
Vordergrund stehen, um eine Infektion der nicht humanen Primaten mit dem Erreger zu verhindern.
Dies ist insbesondere deshalb erforderlich, weil selbst eine rechtzeitig eingeleitete Therapie keine
Garantie für das Überleben der Tiere ist.
Akute Toxoplasmosen wurden bei nicht humanen Primaten bislang nur in Gefangenschaft
beobachtet, d. h. die Tiere befanden sich zum Zeitpunkt der Erkrankung in zoologischen Gärten, in
Forschungseinrichtungen oder wurden von Privatpersonen gehalten. In den meisten Fällen konnten
die genauen Infektionswege dabei nicht ermittelt werden, sondern basierten nur auf Vermutungen.
Dies begründet sich einerseits damit, dass in der Regel eine Vielzahl an möglichen
Infektionsquellen bestand, und andererseits durch den Umstand, dass meistens nicht einmal bekannt
war, ob es sich bei den Erkrankungen um Neuausbrüche, d. h. um frische Infektionen, oder um die
Reaktivierung von chronischen Infektionen handelte. Bei Wildfängen kann im Falle einer
Reaktivierung die Infektion mit dem Erreger bereits im natürlichen Habitat stattgefunden haben.
5. Diskussion der Ergebnisse
121
Über die immunologischen Grundlagen von T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen Primaten ist
bislang ebenfalls wenig bekannt. So konnte bisher kein objektiv belegbarer Grund dafür gefunden
werden, warum Neuweltaffen und Lemuren signifikant häufiger mit letalen Erkrankungen auf eine
T.-gondii-Infektion reagieren als Altweltaffen (BRACK et al. 1995b). Neuweltaffen sind zwar in
der Lage, Antikörper gegen T. gondii auszubilden, deren Nachweis gelang in der Vergangenheit bei
diesen Spezies jedoch weit weniger häufig als bei Altweltaffen. Es ist daher anzunehmen, dass
Neuweltaffen wesentlich seltener eine chronische T.-gondii-Infektion ausbilden als Altweltaffen.
Vermutlich handelt es sich bei den meisten der bei Neuweltaffen beobachteten Toxoplasmosen um
frische Infektionen, bei denen es im Falle eines perakuten Verlaufs gar nicht erst zu einer
Serokonversion kommt.
Mit Hilfe eines serologischen Tests, der dafür geeignet ist, epidemiologische Reihenuntersuchungen
z. B. in zoologischen Gärten durchzuführen, könnte frühzeitig festgestellt werden, ob der Parasit in
den entsprechenden Tierbeständen vorkommt. Dabei wäre es sinnvoll, nicht nur diejenigen nicht
humanen Primaten zu untersuchen, bei denen es nach einer Infektion mit dem Erreger zu
Todesfällen kommt (z. B. Neuweltaffen und Lemuren), sondern auch diejenigen, die nach einer T.gondii-Infektion zwar in der Regel nicht erkranken, bei denen sich der Erreger jedoch oft
serologisch nachweisen lässt (z. B. Altweltaffen). Diese Tiere könnten bei der Untersuchung als
Indikator für die Prävalenz des Parasiten dienen. Unter der Voraussetzung, dass bekannt ist, ob T.
gondii in einem Bestand endemisch auftritt, könnten gezielt präventive Maßnahmen ergriffen
werden, um das Risiko eines seuchenhaften Ausbruchs der Toxoplasmose zu minimieren. Würde es
dennoch zu einem Ausbruch kommen, könnte beim ersten Auftreten von klinischen Symptomen
und schon im Verdachtsfall eine Therapie eingeleitet werden. Durch ein regelmäßig durchgeführtes
Monitoring in Problembeständen könnten Neuinfektionen festgestellt und so die Wirksamkeit der
prophylaktischen Maßnahmen überprüft werden. Wenn bekannt ist, welche Tiere einen
Antikörpertiter gegen T. gondii aufweisen, hätte man im Falle eines Krankheitsausbruches auch
einen Anhaltspunkt, ob es sich um eine frische Infektion oder um eine Reaktivierung handelt.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen ELISA zu etablieren, mit dem ein breites Spektrum
an Seren verschiedener Arten nicht humaner Primaten auf Antikörper gegen T. gondii untersucht
werden kann. Bei der Etablierung wurden verschiedene Konjugate getestet und durch
Schachbretttitrationen optimale Antigenkonzentrationen und optimale Verdünnungen für die
122
5. Diskussion der Ergebnisse
Kontrollseren und das Konjugat ermittelt. Der ELISA sollte den serologischen Nachweis akuter
Toxoplasmosen bei nicht humanen Primaten sowie die Durchführung eines Monitorings
ermöglichen, wobei der Serengeti-Park Hodenhagen als Modell diente.
In dem Park traten zwischen 1993 und 1998 zwei seuchenhafte Ausbrüche von akuten
Toxoplasmosen unter den Kattas und den Totenkopfaffen auf. Innerhalb eines Jahres starben 15 von
17 Kattas sowie zwei von 14 Totenkopfaffen nach einem akuten bis perakuten Krankheitsverlauf,
der mit unspezifischen klinischen Symptomen einherging. Bei den Totenkopfaffen abortierten alle
acht graviden Weibchen oder gebaren tote Nachkommen. Bei einer weiteren Epidemie starben
sechs von 17 Kattas, acht von 14 Totenkopfaffen sowie drei von drei Lisztaffen an einer akuten
Toxoplasmose. Die Infektionswege konnten nicht ermittelt werden, es wurde jedoch eine Infektion
durch mit Kot streunender Hauskatzen verunreinigte Einstreu vermutet. Es gelangten insgesamt
sechs Kattas, zwei adulte Totenkopfaffen sowie eine Totgeburt und alle drei Lisztaffen im Institut
für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Sektion. T. gondii wurde bei
diesen Tieren immunhistologisch sowie in der PCR nachgewiesen. Zu Beginn dieser Arbeit war
jedoch völlig unklar, ob auch die verbliebenen Kattas und Totenkopfaffen sowie weitere Affenarten
mit T. gondii infiziert waren. Auffallend war, dass die Weißkopfmakis, die mit den Kattas teilweise
im selben Gehege gehalten wurden, bislang nicht an einer Toxoplasmose erkrankt waren, obwohl
beide Spezies als Angehörige der Lemuridae eine enge verwandtschaftliche Beziehung aufweisen.
Später wurden auch in anderen zoologischen Gärten nicht humane Primaten auf T. gondii
untersucht, um die Anzahl der Proben zu erweitern, die Anwendbarkeit des ELISAs bei weiteren
Spezies auszutesten und einen Vergleich zwischen den verschiedenen Tierbeständen ziehen zu
können.
5.2. Untersuchung von Serumproben nicht humaner Primaten im SFT auf
Antikörper gegen T. gondii
Da für die Etablierung der verschiedenen ELISA-Formate keine Referenzseren von experimentell
infizierten Tieren zur Verfügung standen, wurden die Seren nicht humaner Primaten zunächst im
SFT, dem in der Humanmedizin als Goldstandard geltenden Referenztest, auf Antikörper gegen T.
gondii getestet.
5. Diskussion der Ergebnisse
123
Im SFT wurde bei keinem der Totenkopfaffen ein Antikörpertiter gegen T. gondii nachgewiesen,
obwohl die in Hodenhagen untersuchten Tiere größtenteils aus der selben Gruppe stammten wie
diejenigen, die in den vergangenen Jahren an einer Toxoplasmose gestorben waren. Daraus lässt
sich schließen, dass es sich bei den in Hodenhagen bei den Totenkopfaffen beobachteten Epidemien
jeweils um einen Neuausbruch der Erkrankung gehandelt haben muss und keine Reaktivierung von
chronischen Infektionen stattfand. Bei den Weißkopfmakis und den Kattas wurden im SFT sowohl
positive als auch negative Tiere festgestellt. Da bei den Weißkopfmakis bislang keine durch T.
gondii verursachten Krankheitssymptome oder Todesfälle beobachtet wurden, handelte es sich bei
den SFT-positven Tieren somit um latente Infektionen.
Die Verwendung von SFT-positiven und SFT-negativen Serumproben der Weißkopfmakis als
Kontrollseren für den IgG-ELISA sowie die Festlegung von Grenzwerten mit SFT-negativen
Makiseren geschah unter der Hypothese, dass der SFT für die Untersuchung dieser Tiere eine
ähnlich hohe Spezifität besitzt wie für die Untersuchung von Humanseren. Der Katta H24 war das
einzige der untersuchten Tiere, bei dem der indirekte Nachweis der Infektion im SFT durch den
direkten Nachweis des Parasiten in der histologischen Untersuchung als richtig positiv bestätigt
werden konnte. Da die Weißkopfmakis und die Kattas eine enge verwandtschaftliche Beziehung
aufweisen, ist jedoch zu vermuten, dass bei der Untersuchung der Seren im SFT für beide Spezies
ähnliche Voraussetzungen gelten und der Test jeweils eine ähnliche diagnostische Richtigkeit
aufweist. Die Anwendbarkeit des SFTs bei den Kattas trifft daher höchstwahrscheinlich auch auf
die Weißkopfmakis zu. Es ist jedoch nicht gesagt, dass der SFT bei allen Primaten gleichermaßen
als Goldstandard gelten kann, da die genetischen und somit auch die immunologischen
Unterschiede zwischen Menschen, Halbaffen, Neuweltaffen und Altweltaffen dafür vermutlich zu
groß sind.
5.3. Untersuchung von Serumproben nicht humaner Primaten im ELISA auf
Antikörper gegen T. gondii
5.3.1. IgM-ELISA
124
5. Diskussion der Ergebnisse
Obwohl im IgM-ELISA deutliche Unterschiede bei der Titration der verwendeten Kontrollseren
festgestellt wurden, erwies sich dieses ELISA-Format bei der Untersuchung der Verlaufsblutproben
der Weißkopfmakis als unbrauchbar. Hier zeigten die Titrationskurven aller Serumproben (mit
Ausnahme der Serumproben von H3) einen ähnlichen Verlauf wie die Titration des negativen
Kontrollserums. Dies war auch bei denjenigen Weißkopfmakis der Fall, bei denen im SFT eine
Serokonversion nachgewiesen wurde.
Für das im IgM-ELISA verwendete positive Kontrollserum (H3, Untersuchungszeitpunkt Juni)
wurde im SFT zwar ein Titer von 1:16000, jedoch keine Serokonversion nachgewiesen. Auch im
IgG-Aviditäts-ELISA wurde für die Serumprobe kein Unterschied zwischen den Indexwerten des
Testansatzes ohne Harnstoff und des Testansatzes mit Harnstoff festgestellt. Es ist daher
unwahrscheinlich, dass es sich bei dem Weißkopfmaki H3 tatsächlich um ein frisch mit T. gondii
infiziertes Tier handelte. Es ist einerseits möglich, dass im Serum von H3 persistierende spezifische
IgM-Antikörper gegen T. gondii enthalten waren oder dass es bei der Untersuchung des Serums in
diesem ELISA-Format zu unspezifischen Reaktionen kam.
5.3.2. IgG-ELISA
Da mir keine Referenzseren bei der Etablierung des ELISAs zur Verfügung standen, habe ich für
die Beurteilung der Qualität meiner Untersuchungen einen Vergleich mit den im SFT ermittelten
Ergebnissen geführt. Wegen der grundsätzlichen Unterschiede zwischen den beiden Testverfahren
(z. B. Nachweis verschiedener Antikörperisotypen und -subklassen, Verwendung verschiedener
Serumverdünnungen), war ein direkter Titervergleich nicht möglich. Ich habe deshalb nur die
endgültige Einstufung der Seren als positiv oder negativ sowie die tendenzielle Titerhöhe (d. h.
hohe oder niedrige Titer) verglichen.
5. Diskussion der Ergebnisse
125
5.3.2.1. Weißkopfmakis
Die im SFT und im IgG-ELISA vorgenommenen Einstufungen der Makiseren als positiv oder
negativ stimmten weitgehend überein. Wurde für eine Serumprobe im SFT ein positives und im
IgG-ELISA ein negatives Ergebnis ermittelt, kann dies entweder die Folge einer unspezifischen
(und somit falsch positiven) Reaktion im SFT sein oder ein falsch negatives Ergebnis im ELISA
bedeuten. Die Grenzwerte des IgG-ELISAs wurden auf eine hohe Spezifität des Testes ausgerichtet
(siehe Kap. 5.3.2.6.), eventuell wurden daher einige Seren, die nur einen niedrigen Antikörpertiter
gegen T. gondii aufwiesen, im IgG-ELISA als negativ eingestuft. Dies könnte für die Serumproben
von H9 und H26 zutreffen. Andererseits wurde jedoch das Serum von H6 (März) im SFT als
negativ und im ELISA mit einem Titer von 1:40 als positiv beurteilt. Da im SFT für dieses Tier bei
der Probennahme im Mai eine Serokonversion nachgewiesen wurde, ist es möglich, dass sich der
Weißkopfmaki H6 erst kurz vor der Probennahme im März infiziert hat und diese frische Infektion
zwar bereits im IgG-ELISA jedoch nicht im SFT erfasst wurde. In diesem Fall hätte der IgG-ELISA
sogar eine höhere Sensitivität als der SFT.
Bei einem Titervergleich von IgG-ELISA und SFT wurde für die Erstuntersuchung der
Weißkopfmakis eine positive Korrelation zwischen der Titerhöhe im SFT und der Höhe der
Indexwerte (und somit des Titers) im IgG-ELISA festgestellt. Für die im Dezember gewonnenen
Serumproben wurden im SFT jedoch deutlich höhere Titer ermittelt als im IgG-ELISA. Eine
mögliche Erklärung für diese unterschiedlichen Ergebnisse besteht in einer ungenügenden
Inaktivierung der Seren vor der Durchfühung des SFTs. Um beurteilen zu können, ob bei den
Weißkopfmakis eine Boosterung der Antikörpertiter stattfand, die nur im SFT und nicht im IgGELISA erfasst wurde, oder ob es bei der Untersuchung dieser Serumproben im SFT zu
unspezifischen Reaktionen kam, wäre eine weitere Blutprobennahme erforderlich gewesen. Da es
sich bei den untersuchten nicht humanen Primaten um Tiere aus einem Freizeitpark und nicht um
Versuchstiere handelte, waren die Probennahmen auf einen bestimmten Untersuchungszeitraum
(März bis Dezember 2004) begrenzt und konnten nicht beliebig fortgeführt werden.
126
5. Diskussion der Ergebnisse
5.3.2.2. Kattas
Auf Grund der positiven Befunde in der histologischen Untersuchung konnte für den Katta H24 der
indirekte Nachweis der Infektion im IgG-ELISA als richtig positiv bestätigt werden. Die hier
ermittelten deutlichen Unterschiede zwischen den Indexwerten der SFT-negativen Kattas und
diesem SFT-positiven und nachweislich mit T. gondii infiziertem Tier sprechen dafür, dass der IgGELISA für den Nachweis von T.-gondii-Infektionen bei Kattas eine ausreichende Sensitivität und
Spezifität aufweist.
5.3.2.3. Totenkopfaffen sowie weitere Neuweltaffen
Obwohl alle Serumproben der Totenkopfaffen im SFT als negativ eingestuft wurden, ähnelten die
für diese Tiere im IgG-ELISA ermittelten Verläufe der Titrationskurven denen der Weißkopfmakis.
Es wurden demnach deutliche Unterschiede zwischen den ELISA-Indices der einzelnen
Totenkopfaffen festgestellt. Die unterschiedlichen Ergebnisse aus den beiden Testverfahren lassen
sich entweder durch unspezifische (also falsch positive) Reaktionen im IgG-ELISA erklären oder
sind Ausdruck dafür, dass der SFT für die Untersuchung von Neuweltaffen nicht anwendbar ist. Die
Möglichkeit, dass beide Testverfahren gleichermaßen für die Untersuchung dieser Serumproben
geeignet sind, ist unwahrscheinlich. Ansonsten hätte man bei einer richtig negativen Beurteilung der
Seren im SFT gleichzeitig im IgG-ELISA wesentlich einheitlichere Ergebnisse erwartet und hier
lediglich die Grenzwerte für diese Spezies anpassen müssen.
Im Falle von unspezifischen Reaktionen des IgG-ELISAs wäre es denkbar, dass das verwendete
Konjugat für die Totenkopfaffen nicht geeignet ist. Allerdings wurden im IgG-ELISA auch weitere
Neuweltaffenspezies untersucht, bei denen einheitlich niedrige Indexwerte festgestellt wurden.
Prinzipiell hätten auch bei diesen Tieren durch das Konjugat verursachte unspezifische Reaktionen
auftreten müssen. Eine weitere Möglichkeit für die diskrepanten Ergebnisse besteht darin, dass die
im SFT vorgenommenen Beurteilungen der Seren falsch negativ waren und im IgG-ELISA bei den
Totenkopfaffen unterschiedliche Antikörpertiter gegen T. gondii nachgewiesen wurden.
5. Diskussion der Ergebnisse
127
Obwohl in Braunschweig und Jaderberg bislang keine durch T. gondii verursachten Erkrankungen
oder Todesfälle nachgewiesen wurden, ergaben sich auch für diese Bestände unterschiedliche
Ergebnisse aus beiden Testverfahren. Bei einem Vergleich der in den verschiedenen Beständen
ermittelten Titrationskurven fiel auf, dass die Serumverläufe bei den Totenkopfaffen aus
Braunschweig und Jaderberg im Gegensatz zu den Tieren aus Hodenhagen deutlich voneinander
abgesetzt und bei den Tieren mit hohen Indexwerten durch einen Plateaubereich gekennzeichnet
waren. Es besteht einerseits die Möglichkeit, dass hier spezifische Antikörpertiter gegen T. gondii
nachgewiesen wurden und sich deshalb die Serumverläufe der positiven von den negativen Tieren
unterschieden. Die in Hodenhagen ermittelten breit gestreuten Ergebnisse könnten dann auf eine
Vielzahl unterschiedlicher Titer zurückgeführt werden. Andererseits könnte es bei den
Serumproben aller drei Bestände zu unspezifischen Reaktionen im IgG-ELISA gekommen sein,
wobei die Ergebnisse bei den Totenkopfaffen aus Braunschweig und Jaderberg nur auf Grund der
geringeren Probenzahl deutlicher voneinander abgesetzt waren.
5.3.2.4. Rhesusaffen
Da für die Rhesusaffen keine Ergebnisse aus dem SFT vorlagen, ist die Beurteilung der im IgGELISA ermittelten Verläufe der Titrationskurven schwierig. Grundsätzlich ergab sich auch für diese
Tiere ein ähnliches Bild wie bei den Weißkopfmakis und den Kattas. Es wurden hier jedoch
insgesamt wesentlich höhere Indexwerte ermittelt als bei den übrigen der untersuchten Spezies.
Dies lässt sich damit begründen, dass bei der Herstellung des verwendeten Konjugats als
Immunogen IgG aus Sammelseren von Rhesusaffen verwendet wurde und der Sekundärantikörper
daher eine größere Affinität zu den im Probenserum enthaltenen Antikörpern aufweist.
Bei den im IgG-ELISA festgestellten Unterschieden zwischen den einzelnen Rhesusaffen kann es
sich entweder um den Nachweis unterschiedlicher spezifischer Antikörpertiter gegen T. gondii oder
um unspezifische Reaktionen handeln. Es besteht zudem die Möglichkeit, dass alle Serumproben
negativ sind. Allerdings hätte man für diesen Fall ein einheitlicheres Ergebnis der ELISA-Indices
erwartet.
128
5. Diskussion der Ergebnisse
5.3.2.5. Prädispositionen im Zusammenhang mit T.-gondii-Infektionen
Da Antikörpertiter gegen T. gondii bei den untersuchten nicht humanen Primaten sowohl bei Tieren
beiderlei Geschlechts als auch unterschiedlichen Alters festgestellt wurden, ließen sich hier keine
Prädispositionen für eine Infektion mit dem Parasiten erkennen. Nur bei den Rhesusaffen ergab sich
die Tendenz, dass diejenigen Tiere, die die niedrigsten Indexwerte im IgG-ELISA aufwiesen, zu
den jüngeren zählten. Die Gruppenzugehörigkeit der Weißkopfmakis und Totenkopfaffen aus
Hodenhagen spielte beim Nachweis des Erregers keine Rolle. Die Tatsache, dass in Hodenhagen
die Freigehege für Besucher zugänglich waren, machte bei einem Vergleich der für die
Totenkopfaffen ermittelten Ergebnisse keinen Unterschied zwischen den drei untersuchten
Beständen aus. Bei den Kattas wurden hingegen nur bei den Tieren aus Hodenhagen Antikörper
gegen T. gondii nachgewiesen. Ob die Besucher hier bei der Übertragung des Parasiten eine Rolle
gespielt haben, konnte allerdings nicht geklärt werden. Dass es sich bei den drei Totenkopfaffen
H14, H15 und H20 um Wildfänge handelte, schien sich nicht begünstigend auf das Auftreten einer
Infektion mit T. gondii auszuwirken, da für die Tiere H14 und H15 nur niedrige Indexwerte im IgGELISA ermittelt wurden.
5.3.2.6. Festlegung der Grenzwerte für den IgG-ELISA
Bei der Festlegung der Grenzwerte (Cut-offs) für den IgG-ELISA wurden die Indexwerte
derjenigen Tiere verwendet, deren Seren im gesamten Untersuchungszeitraum im SFT als negativ
beurteilt wurden. Aus den Indices wurden die Mittelwerte und Standardabweichungen berechnet
und die Grenzwerte für die jeweiligen Serumverdünnungen als Summe aus dem Mittelwert und der
dreifachen Standardabweichung festgelegt. Bei dieser Methode wird in erster Linie Wert auf die
Spezifität des Testes gelegt, d. h. die Grenzwerte werden so hoch angesetzt, dass negative
Serumproben auch als negativ beurteilt werden. Da bei der Anfertigung dieser Arbeit jedoch keine
negativen Referenzseren zur Verfügung standen, sind die Cut-offs als Richtwerte zu verstehen, um
eine vorläufige Auswertung des ELISAs vornehmen zu können, und nicht als endgültige
Grenzwerte.
5. Diskussion der Ergebnisse
129
5.3.2.7. Reproduzierbarkeit des IgG-ELISAs
Um die Reproduzierbarkeit des IgG-ELISAs zu überprüfen, wurde für die Serumverdünnungen
1:10 bis 1:2560 der Variationskoeffizient aus den bei der Titration des positiven Kontrollserums
ermittelten optischen Dichten berechnet. Ein Variationskoeffizient < 5 sprach dabei für eine gute
Reproduzierbarkeit, ein Variationskoeffizient < 10 war akzeptabel.
Der niedrigste Variationskoeffizient und somit die beste Reproduzierbarkeit wurde bei einer
Serumverdünnung von 1:40 ermittelt. In dieser Verdünnung ergaben sich für das positive
Kontrollserum optische Dichten innerhalb des Plateaubereichs (siehe Kap. 3.2.3.8.), daher traten
hier die geringsten Schwankungen auf. Insgesamt ergaben sich bis zu einer Verdünnung von 1:320
akzeptable Werte für den Variationskoeffizienten. Dass ab einer Serumverdünnung von 1:640
Werte >10 ermittelt wurden, lässt sich dadurch erklären, dass der IgG-ELISA durch den geringeren
Gehalt an Antikörpern gegen T. gondii hier störungsanfälliger war.
5.3.2.8. Abschließende Bewertung des IgG-ELISAs
Es konnte in dieser Arbeit nicht endgültig geklärt werden, in welchem der beiden Testverfahren (ob
SFT oder IgG-ELISA) die Serumproben im Einzelfall richtig beurteilt wurden und welcher Test
grundsätzlich für welche Spezies die größere diagnostische Richtigkeit besitzt. Dafür wären
Referenzseren notwendig gewesen oder es hätte für jedes der untersuchten Tiere ein direkter
Nachweis von T. gondii erfolgen müssen (z. B. durch eine histologische Untersuchung post
mortem). Eine Tötung der Tiere zu diesem Zweck war selbstverständlich obsolet.
Für die Kattas konnte die grundsätzliche Anwendbarkeit des IgG-ELISAs nachgewiesen werden. Es
ist daher zu vermuten, dass sich der Test auch für die Untersuchung weiterer Lemurenspezies
eignet. Die weitgehende Übereinstimmung der Ergebnisse aus dem SFT und dem IgG-ELISA bei
den Weißkopfmakis bekräftigt diese Hypothese. Es scheint daher möglich zu sein, bei Lemuren ein
Monitoring mit Hilfe des IgG-ELISAs durchzuführen.
Inwieweit sich der IgG-ELISA für den Nachweis von T.-gondii-Infektionen bei anderen
Primatenspezies eignet, konnte nicht abschließend geklärt werden, da hierfür entsprechende
130
5. Diskussion der Ergebnisse
Referenzseren notwendig gewesen wären. Es ist zu vermuten, dass der Test für jede Spezies
(zumindest für Neuweltaffen und Altweltaffen) neu validiert werden muss, da die genetischen und
immunologischen Unterschiede zwischen den einzelnen Arten zu groß sind, als dass sich ein
serologischer Test für alle nicht humanen Primaten unter den gleichen Bedingungen anwenden
ließe.
5.3.3. IgG-Aviditäts-ELISA
Im Aviditäts-ELISA wird die Avidität, d. h. die Summe aller Bindungskräfte zwischen einem
Antigen und den korrespondierenden Antikörpern, nachgewiesen. Die Avidität ist direkt nach einer
Infektion niedrig und steigt in den folgenden Wochen und Monaten stetig an. Bei den ersten
Antikörpern, die unmittelbar nach der Antigenpräsentation gebildet werden, ist die Anpassung an
das Antigen noch weniger ausgeprägt und die Bindungskräfte sind geringer. Mit der Bildung von BGedächtniszellen steigt hingegen die Qualität der Antikörperreaktion und somit auch die Avidität
(NOSSAL 1992). Das Prinzip des Aviditäts-ELISAs beruht auf der Tatsache, dass es leichter ist,
die Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen zu verhindern (Dilutionsprinzip) oder diese
aufzulösen (Elutionsprinzip), wenn die Avidität nicht in voller Stärke ausgeprägt ist. Bei dem in
dieser Arbeit angewendeten Elutionsprinzip erfolgt nach der Bindung der Antikörper an das
Antigen die Inkubation mit einem Agens, das Wasserstoffbrückenbindungen lösen kann (z. B.
Harnstoff), wobei Bindungen mit niedriger Avidität leichter gelöst werden als hoch avide
Bindungen (PULLEN et al. 1986). Bei einer vergleichenden Untersuchung von ELISAs nach dem
Dilutions- und Elutionsprinzip erwies sich der Elutions-ELISA mit 6 M Harnstoff als der Test mit
der deutlichsten Diskriminierung zwischen niedrig und hoch aviden Antikörpern (POLANEC et al.
1994). Daher wurde dieses Prinzip auch in dieser Arbeit angewendet.
Da bislang keine vergleichbaren Untersuchungen mit Seren nicht humaner Primaten im AviditätsELISA durchgeführt wurden, ist nicht bekannt, wie viele Tage nach der Infektion mit T. gondii die
deutlichsten Unterschiede zwischen den Testansätzen ermittelt werden und wie lange diese
Unterschiede nachgewiesen werden können. In einer von SIMON (1995) durchgeführten Studie
wurden bei experimentell mit T.-gondii-Oozysten infizierten Katzen und Schafen zwischen dem 28.
5. Diskussion der Ergebnisse
131
und 101. Tag p. i. bzw. zwischen dem 42. und 106. Tag p. i. deutliche Unterschiede im IgGAviditäts-ELISA nachgewiesen.
Da das Ergebnis aus dem IgG-ELISA positiv sein muss, um den IgG-Aviditäts-ELISA beurteilen zu
können, wurden nur diejenigen nicht humanen Primaten im IgG-Aviditäts-ELISA untersucht, deren
Indexwerte im IgG-ELISA über den in Kap. 3.2.3.5.2. festgelegten Grenzwerten lagen. Es ist
möglich, dass es sich bei denjenigen Tieren, bei denen ein deutlicher Unterschied zwischen den
Indexwerten des Testansatzes ohne Harnstoff und des Testansatzes mit Harnstoff festgestellt wurde,
um ein frühes Stadium der T.-gondii-Infektion handelt. Auffallend ist, dass die größten
Unterschiede bei den Totenkopfaffen und den Rhesusaffen ermittelt wurden. Dies kann einerseits
bedeuten, dass für diese Tiere im IgG-ELISA tatsächlich spezifische Antikörpertiter gegen T. gondii
nachgewiesen wurden und dass im IgG-Aviditäts-ELISA der Nachweis von frischen T.-gondiiInfektionen erbracht wurde. Andernfalls wäre es sowohl im IgG-ELISA als auch im IgG-AviditätsELISA zu unspezifischen Reaktionen bei den Totenkopfaffen und den Rhesusaffen gekommen. Die
Tatsache, dass sowohl bei denjenigen Totenkopfaffen und Rhesusaffen, bei denen im IgG-ELISA
die niedrigsten Indexwerte festgestellt wurden (H15, H18, H30, R14, R15, R16, R18 und R19), als
auch bei den Neuweltaffen M2 und M7 im IgG-Aviditäts-ELISA kaum ein Unterschied zwischen
den Indexwerten der beiden Testansätze bestand, spricht jedoch dafür, dass sowohl im IgG-ELISA
als auch im IgG-Aviditäts-ELISA ein richtig negatives Ergebnis für diese Tiere erhalten wurde.
Für die Weißkopfmakis H6 und H9 wurde im SFT eine Serokonversion nachgewiesen, d. h. dass
sich diese Tiere vermutlich innerhalb des Untersuchungszeitraums mit T. gondii frisch infiziert
haben. Für H9 wurde im IgG-ELISA sowohl bei der Untersuchung im März als auch im Dezember
ein negatives Ergebnis ermittelt, daher wurde mit diesen Serumproben kein Aviditäts-ELISA
durchgeführt. Für H6 wurden im IgG-Aviditäts-ELISA bei der Erstuntersuchung im März geringe
Unterschiede zwischen den Indexwerten der Testansätze festgestellt und es wurde im IgG-ELISA
ein positives Ergebnis ermittelt. Im SFT hingegen ergab sich im März eine negative und erst im Mai
eine positive Beurteilung. Die geringen Unterschiede im Aviditäts-ELISA können einerseits
bedeuten, dass sich der Weißkopfmaki H6 kurz vor dem Untersuchungstermin im März mit T.
gondii infiziert hat. In diesem Fall hätte man jedoch bei der im Mai gewonnenen Serumprobe
deutlichere Unterschiede im IgG-Aviditäts-ELISA erwartet. Andererseits könnte die Infektion von
H6 auch schon einige Wochen vor der Erstuntersuchung stattgefunden haben, so dass deutliche
132
5. Diskussion der Ergebnisse
Unterschiede zwischen den Testansätzen nicht mehr nachgewiesen werden konnten. In diesem Fall
wäre das Ergebnis aus dem SFT für die Erstuntersuchung im März falsch negativ.
Eine endgültige Bewertung des IgG-Aviditäts-ELISAs kann nicht erfolgen, da zunächst die
grundsätzliche Anwendbarkeit des Tests mit dem Serum von nachweislich frisch infizierten Tieren
hätte bewiesen werden müssen. Da es sich jedoch bei den untersuchten nicht humanen Primaten
nicht um experimentell infizierte Tiere gehandelt hat, gab es keinen Anhaltspunkt dafür, wann sich
die Tiere mit dem Erreger infiziert haben. Eine experimentelle Infektion von nicht humanen
Primaten zur Gewinnung entsprechender Referenzseren war bei der Anfertigung dieser Arbeit
ausgeschlossen. Die ermittelten Ergebnisse können jedoch ein Hinweis darauf sein, dass sich der
IgG-Aviditäts-ELISA für die Diagnostik von akuten T.-gondii-Infektionen bei nicht humanen
Primaten eignet.
5.4. Untersuchung von Serumproben der Mäuse im IFAT und SFT auf
Antikörper gegen T. gondii
Durch die im SFT und im IFAT ermittelten positiven Befunde bei den inokulierten Mäusen konnte
T. gondii bei dem Katta H24 indirekt nachgewiesen werden. Der Nachweis der Infektion bei den
Mäusen kann als Beweis für die Infektion des Kattas gewertet werden.
5.5. Histologische Untersuchung von Gewebeproben des Kattas und der Maus
Histologische Untersuchungen besitzen für den Nachweis von T. gondii grundsätzlich keine hohe
Sensitivität. Ist nur eine geringe Anzahl an T.-gondii-Zysten in dem jeweiligen Gewebe vorhanden,
ist die Wahrscheinlichkeit, eine solche Zyste in dem Gewebeschnitt nachzuweisen, nicht sehr groß.
Aussagekräftig ist die histologische Untersuchung daher nur im positiven Fall, ist dann jedoch ein
Beweis für eine Infektion mit dem Parasiten.
Von dem Katta H24 wurde bei der Sektion Gehirnmaterial gewonnen und dieses in Mäuse
inokuliert sowie für eine histologische Untersuchung benutzt. Durch den Nachweis von T.-gondii-
5. Diskussion der Ergebnisse
133
Zysten im Gehirn des Kattas sowie im Gehirn und in der Lunge einer Maus, die mit dem
Gehirnmaterial inokuliert wurde, wurde somit in der histologischen Untersuchung bewiesen, dass
der Katta H24 tatsächlich mit T. gondii infiziert war.
5.6. Ausblick
In dieser Studie wurde die Grundlage für die Etablierung eines ELISAs geschaffen, mit dem nicht
humane Primaten auf T. gondii serologisch untersucht werden können. Es gelang, die
Anwendbarkeit des IgG-ELISAs bei Lemuren nachzuweisen, so dass die Voraussetzung für die
Durchführung eines Monitorings bei diesen Spezies geschaffen wurde.
Es wäre interessant, eine größere Anzahl an Lemuren zu untersuchen, um die Qualität des IgGELISAs hinsichtlich Sensitivität und Spezifität zu überprüfen und endgültige Grenzwerte
festzulegen. Dafür wären jedoch negative Referenzseren notwendig.
Um die Anwendbarkeit des IgG-ELISAs auf andere Primatenspezies auszuweiten, bestünde
einerseits die Möglichkeit, weitere Konjugate auszutesten, was auf Grund der zu geringen
Volumina der Serumproben, die in dieser Arbeit zur Verfügung standen, nicht möglich war. Durch
die Erprobung weiterer Konjugate könnte überprüft werden, ob mit diesen Reagenzien bei den
Neuweltaffen die gleichen Ergebnisse ermittelt werden oder ob der in dieser Arbeit verwendete
Sekundärantikörper unspezifische Reaktionen hervorgerufen hat. Zudem könnte man Tiere
infizieren, um entsprechende Referenzseren für die Validierung des ELISAs bei den einzelnen
Spezies zu gewinnen. Wenn man die experimentelle Infektion von nicht humanen Primaten
vermeiden will, ist es wichtig, dass diejenigen Tiere, die im ELISA serologisch untersucht werden,
im Falle des Verendens zur Sektion gelangen. Hier kann durch eine parasitologische Untersuchung
von Gewebeproben das zuvor gewonnene Serum als positiv oder negativ beurteilt werden, so wie
dies auch bei dem Katta H24 der Fall war.
Um einen serologischen Test für die Diagnose von akuten Toxoplasmosen zu etablieren, wäre die
experimentelle Infektion von nicht humanen Primaten allerdings notwendig, um dabei Serum von
nachweislich frisch infizierten Tieren zu gewinnen. Es ist denkbar, dass der IgG-Aviditäts-ELISA
134
5. Diskussion der Ergebnisse
bei einer Validierung mit diesen Referenzseren für den Nachweis von frischen T.-gondiiInfektionen geeignet ist. Es wäre ebenfalls möglich, mit solchen Referenzseren sowie eventuell mit
anderen Konjugaten den IgM-ELISA erneut auszutesten.
Die Erprobung einer Vakzinierung von nicht humanen Primaten gegen T. gondii erscheint mit dem
derzeitig erhältlichen Impfstoff nicht sehr sinnvoll, da selbst grundsätzliche Fragen, wie z. B. die
Boosterung des Antikörpertiters erfolgen soll, bislang nicht geklärt werden konnten. Das Risiko für
die Tiere übersteigt daher vermutlich den Nutzen der Impfung. Zudem wäre das Vorhandensein
eines serologischen Tests zum Nachweis der Infektion die Voraussetzung für ein solches Projekt.
Insgesamt lässt sich sagen, dass prophylaktische Maßnahmen zur Vermeidung der Infektion mit
dem Parasiten grundsätzlich aussichtsreicher sind, als sich im Falle eines Ausbruchs der
Toxoplasmose auf eine schnelle Diagnose und Therapie zu verlassen. Weitergehende
Untersuchungen sollten daher auf die Durchführung eines Monitorings ausgerichtet sein.
6. Zusammenfassung
135
6. ZUSAMMENFASSUNG
BRANDT, Anna Katharina (2006):
Serologische Untersuchungen zur Toxoplasmose nicht humaner Primaten
Es wurden Serumproben von 19 Weißkopfmakis (Eulemur fulvus albifrons), 7 Kattas (Lemur
catta), 19 Rhesusaffen (Macaca mulatta), 24 Totenkopfaffen (Saimiri sp.) sowie 10 weiteren
Neuweltaffen gesammelt und im Sabin-Feldman-Test (SFT) und im Enzyme-linked Immunosorbent
Assay (ELISA) auf Antikörper gegen T. gondii untersucht. Unter Verwendung von SFT-positiven
und SFT-negativen Seren der Weißkopfmakis als Kontrollseren wurde ein IgM-ELISA, ein IgGELISA und ein IgG-Aviditäts-ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen T. gondii bei nicht
humanen Primaten etabliert. Bei der Bewertung des ELISAs erfolgte ein Vergleich mit den
Ergebnissen aus dem SFT, der für die Untersuchung von Humanseren auf Antikörper gegen T.
gondii als Goldstandard gilt.
Für die Weißkopfmakis und Kattas stimmten die im SFT und im IgG-ELISA vorgenommenen
Beurteilungen der Serumproben als positiv oder negativ weitgehend überein. Für die
Totenkopfaffen ergaben sich unterschiedliche Ergebnisse, deren Ursache nicht geklärt werden
konnte. Für die Rhesusaffen lagen keine Ergebnisse aus dem SFT vor. Im IgG-ELISA ergaben sich
für diese Tiere ähnliche Serumverläufe wie bei den Weißkopfmakis und den Kattas, wobei die
jüngsten Rhesusaffen die niedrigsten Indexwerte aufwiesen.
Bei einem Katta wurden post mortem in der histologischen Untersuchung Gewebezysten von T.
gondii nachgewiesen. Dadurch wurden für dieses Tier die im SFT und im IgG-ELISA ermittelten
Ergebnisse als richtig positiv bestätigt und die grundsätzliche Anwendbarkeit des IgG-ELISAs für
die Untersuchung von Lemurenseren auf Antikörper gegen T. gondii nachgewiesen.
Zur Untersuchung des Infektionsstadiums der T.-gondii-Infektionen wurde ausschließlich der IgGAviditäts-ELISA benutzt, da sich der IgM-ELISA als ungeeignet erwies. Die größten Unterschiede
zwischen den Testansätzen des IgG-Aviditäts-ELISAs wurden bei Totenkopfaffen und Rhesusaffen
festgestellt, was auf ein frühes Stadium der T.-gondii-Infektionen bei diesen Tieren hindeutete.
136
6. Zusammenfassung
7. SUMMARY
BRANDT, Anna Katharina (2006):
Serological investigations about toxoplasmosis of non human primates
Serum samples of 19 white-fronted brown lemurs (Eulemur fulvus albifrons), 7 ring-tailed lemurs
(Lemur catta), 19 rhesus monkeys (Macaca mulatta), 24 squirrel monkeys (Saimiri sp.) and 10
other New world monkeys were collected and tested for antibodies against T. gondii by SabinFeldman dye test (SFT) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Using SFT positive and
SFT negative sera from white-fronted brown lemurs as serumcontrols an IgM ELISA, an IgG
ELISA and an IgG avidity ELISA to detect antibodies against T. gondii was established. At
assessment of ELISA a comparison with the results of SFT occured which is the golden standard for
testing human sera for antibodies against T. gondii.
In white-fronted brown lemurs and ring-tailed lemurs the assessments of serumsamples as positive
or negative by SFT and IgG ELISA agreed to a large extent. There were different results for the
squirrel monkeys, the cause of which could not be resolved. There were no results for the rhesus
monkeys by SFT. For these animals similar serum titrations to white-fronted brown lemurs and
ring-tailed lemurs arised by IgG ELISA – the youngest rhesus monkeys showed the lowest index
values.
In one ring-tailed lemur tissue cysts of T. gondii were demonstrated post mortem by histological
examination. Because of this the results found by SFT and IgG ELISA for this animal were proved
to be true and the suitability of IgG ELISA for testing sera from lemurs for antibodies against T.
gondii was demonstrated.
To examine the course of T. gondii infection only the IgG avidity ELISA was used, because the
IgM ELISA proved to be unsuitable. In IgG avidity ELISA the greatest differences between test
series were detected in squirrel monkeys and rhesus monkeys, this suggested that there was an early
course of T. gondii infection in these animals.
8. Literaturverzeichnis
137
8. LITERATURVERZEICHNIS
ALEXANDER, J., C.W. ROBERTS, W. WALKER, G. REICHMANN u. C.A. HUNTER (2000):
The immunology of Toxoplasma gondii infection in the immune-competent host.
In: P. AMBROISE-THOMAS u. P.E. PETERSEN (Hrsg.): Congenital Toxoplasmosis.
Springer-Verlag, Frankreich, S. 69-82
ANDERSON, D.C., u. H.M. McCLURE (1982):
Acute disseminated fatal toxoplasmosis in a squirrel monkey.
J. Am. Vet. Med. Assoc. 181, 1363-1366
ANDERSON, D.C., u. H.M. McCLURE (1993):
Toxoplasmosis.
In: T.C. JONES, U. MOHR u. R.D. HUNT (Hrsg.): Nonhuman primates I.
Springer-Verlag, Berlin, S. 63-69
ANDRADE, M., J.O. COELHO, C.P. CARDOSO, A.M. MARINHO u. R.S. MARCHEVSKY
(2004):
Demonstration of Toxoplasma gondii in squirrel monkeys by immunohistochemical analysis.
Am. J. Primatol. 62(Suppl. 1), 111
ARAUJO, F.G., M.M. WONG, J. THEIS u. J.S. REMINGTON (1973):
Experimental Toxoplasma gondii infection in a nonhuman primate.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 22, 465-472
ASAI, T., T. KINJO, N. MINAMOTO, M. SUGIYAMA, N. MATSUBAYASHI u. I. NARAMA
(1991):
Prevalence of antibodies to five selected zoonosis agents in monkeys.
J. Vet. Med. Sci. 53, 553-559
ASHBURN, D. (1992):
History and general epidemiology.
In: D.O. HO-YEN u. A.W.L. JOSS (Hrsg.): Human Toxoplasmosis.
Oxford Universitiy Press, New York, S. 1-25
BACCIARINI, L., J. VOELLM, M. JANOVSKY u. A. GROENE (2001a):
Acute disseminated toxoplasmosis in a colony of squirrel monkeys (Saimiri boliviensis) in the
Zoologischer Garten Basel, Switzerland.
Erkr. Zootiere 40, 87-89
BACCIARINI, L., J. VOELLM, M. JANOVSKY, A. KAPPLER u. A. GROENE (2001b):
Acute disseminated toxoplasmosis in a colony of squirrel monkeys (Saimiri boliviensis).
Eur. J. Vet. Pathol. 7, 67-73
138
8. Literaturverzeichnis
BALFOUR, A.H., D.G. FLECK, H.P.A. HUGHES u. D. SHARP (1982):
Comparative study of three tests (dye test, indirect haemagglutination test, latex agglutination test)
for the detection of antibodies to Toxoplasma gondii in human sera.
J. Clin. Pathol. 35, 228-232
BAULU, J., G. EVANS u. C. SUTTON (2002):
Pathogenic agents found in Barbados Chlorocebus aethiops sabaeus and in Old World and New
World monkeys commonly used in biomedical research.
Lab. Prim. Newsl. 41, 4-6
BENESON, M.W., E.T. TAKAFUJI, S.M. LEMON, R.L. GREENUP u. A.J. SULZER (1982):
Oocyst-transmitted toxoplasmosis associated with ingestion of contaminated water.
N. Engl. J. Med. 307, 666-669
BENIRSCHKE, K., u. R.J. LOW (1970):
An animal model for human disease: Acute toxoplasmosis.
Comp. Pathol. Bull. 2, 3-4
BENIRSCHKE, K., u. R. RICHART (1960):
Spontaneous acute toxoplasmosis in a marmoset monkey.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 9, 269-273
BORST, G.H.A., u. F. VAN KNAPEN (1984):
Acute acquired toxoplasmosis in primates in a zoo.
J. Zoo Anim. Med. 15, 60-62
BOUER, A., K. WERTHER, J.L. CATAO-DIAS u. A.L.V. NUNES (1999):
Outbreak of toxoplasmosis in Lagothrix lagotricha.
Folia Primatol. 70, 282-285
BRACK, M. (1987):
Agents transmissible from Simian to man.
Springer-Verlag, New York, S. 324-330
BRACK, M., R. GOELTENBOTH u. W. RIETSCHEL (1995a):
Primaten.
In: R. GÖLTENBOTH (Hrsg.): Krankheiten der Zoo- und Wildtiere.
Blackwell Wissenschafts-Verlag, Berlin, S. 25-66
BRACK, M., P. WOHLSEIN u. F.J.KAUP (1995b):
Toxoplasmose nichthumaner Primaten.
Erkr. Zootiere 37, 183-188
BRACK, M., P. WOHLSEIN, D. MINNEMANN u. H.P. BRANDT (1998):
Toxoplasmosis outbreak in ring-tailed lemurs (Lemur catta) and squirrel monkeys (Saimiri
sciureus).
Prim. Rep. 50, 71-82
8. Literaturverzeichnis
139
BRADFORD, M.M. (1976):
A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding.
Anal. Biochem. 72, 248-254
BRITT, A., C. WELCH, A. KATZ, B. IAMBANA, I. PORTON I, R. JUNGE, G. CRAWFORD,
C. WILLIAMS u. D. HARING (2004):
The re-stocking of captive-bred ruffed lemurs (Varecia variegata variegata) into the Betampona
Reserve, Madagascar: methodology and recommendations.
Biodivers. Conserv. 13, 635-657
BUNDESGESUNDHEITSBLATT (1989):
Verfahrensrichtlinien für die Laboratoriumsdiagnostik von parasitären Infektionen beim Menschen.
VI. Spezielle Routinemethode zum Nachweis von Antikörpern gegen Toxoplasma gondii.
Bekanntmachungen des BGA 12/89, 552-555
BUXTON, D. (1990):
Ovine toxoplasmosis: a review.
J. Roy. Soc. Med. 83, 509-511
BUXTON, D. (1998):
Protozoan infections (Toxoplasma gondii, Neospora caninum and Sarcocystis spp.) in sheep and
goats: recent advances.
Vet. Res. 29, 289-310
CADAVID, A.P., L. CANAS, J.J. ESTRADA u. L.E. RAMIREZ (1991):
Prevalence of anti-Toxoplasma gondii antibodies in Cebus spp in the Santa Fe Zoological
Park of Medellin, Colombia.
J. Med. Primatol. 20, 259-261
CARME, B., C. AZNAR, A. MOTARD, M. DEMAR u. B. DE THOISY (2002):
Serologic survey of Toxoplasma gondii in noncarnivorous free-ranging neotropical mammals in
French Guiana.
Vector Borne Zoonotic Dis. 2, 11-17
CARMICHAEL, G.A. (1975):
The application of the indirect fluorescent antibody technique for the detection of toxoplasmosis.
Can. J. Med. Technol. 37, 168-171
CARPENTER, J.W., T.Y. MASHIMA u. D.J. RUPIPER (2001):
Exotic animal formulary.
2. Aufl., Verlag Saunders, Philadelphia
CARUANA, L. B. (1980):
A study of variation in the indirect haemagglutination antibody test for toxoplasmosis.
Am. J. Med. Technol. 46, 368-370
140
8. Literaturverzeichnis
CATAO-DIAS, J.L. (2001):
Medicine.
In: M.E. FOWLER u. Z.S. CUBAS (Hrsg.): Biology, Medicine and Surgery of South American
Wild Animals.
Iowa State Univ. Press, Ames, S. 267-272
CHANG, J., R.W. KORNEGAY, J.L. WAGNER, E.M. MIKAT u. D.B.HACKEL (1980):
Toxoplasmosis in a sifaka.
In: R. J. MONTALI u. G. MIGAKI (Hrsg.): The Comparative Pathology of Zoo Animals.
Smithsonian Institution Press, Washington, D.C., S. 347-352
CHANG, H.R., u. J.C.F. PECHERE (1988):
Activity of spiramycin against Toxoplasma gondii in vitro, in experimental infections and in human
infection.
J. Antimicrob. Chemother. 22(Suppl. B), 87-92
CHATTERTON, J.M.W. (1992):
Pregnancy.
In: D.O. HO-YEN u. A.W.L. JOSS (Hrsg.): Human Toxoplasmosis.
Oxford Universitiy Press, New York, S. 144-183
CHHABRA, M.B., R.C. MAHAJAN, N.K. GANGULY u. N.L. CHITKARA (1976):
Prevalence of Toxoplasma antibodies in rhesus monkeys in India.
Trop. Geogr. Med. 28, 101-103
CHINCHILLA, M., O.M. GUERRERO, A. CASTRO u. J. SABAH (1994):
Cockroaches as transport hosts of the protozoan Toxoplasma gondii.
Rev. Biol. Trop. 42, 329-331
CHOI, W.Y., J.E. YOO, H.W. NAM, C.Y. OH, S.W. KIM, K. KATAKURA u. A. KOBAYASHI
(1987):
Toxoplasma antibodies by indirect latex agglutination tests in zoo animals.
Korean J. Parasitol. 25, 13-23
COWEN, D.W., u. A. WOLF (1945):
Toxoplasmosis in the monkey. Acute fatal infection experimentally produced in a young Macaca
mulatta.
J. Infect. Dis. 77, 144-157
CULBERTSON, W.W., K.F. TABBARA u. G.R. O'CONNOR (1982):
Experimental ocular toxoplasmosis in primates.
Arch. Ophthalmol. 100, 321-323
CUNNINGHAM, A.A., D. BUXTON u. K.M. THOMSON (1992):
An epidemic of toxoplasmosis in a captive colony of squirrel monkeys (Saimiri sciureus).
J. Comp. Pathol. 107, 207-219
8. Literaturverzeichnis
141
DE ROADNICHE, E. (1954a):
Spontaneous toxoplasmosis in the whiteface monkey, Cebus capucinus, in Panama.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 3, 1023-1025
DE ROADNICHE, E. (1954b):
Susceptibility of the marmoset, Marikina geoffroyi, and the night monkey, Aotus zonalis, to
experimental infection with Toxoplasma.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 3, 1023-1032
DE ROEVER-BONNET, H. (1972):
Toxoplasmosis in tropical Africa.
Trop. Geogr. Med. 24, 7-13
DESMONTS, G., u. J. COUVREUR (1974a):
Toxoplasmosis in pregnancy and its transmission to the fetus.
Bull. N. Y. Acad. Med. 50, 146-159
DESMONTS, G., u. J. COUVREUR (1974b):
Congenital toxoplasmosis. A prospective study of 378 pregnancies.
N. Engl. J. Med. 290, 1110-1116
DESMONTS, G., u. J.S. REMINGTON (1980):
Direct agglutination test for diagnosis of Toxoplasma infection: method for increasing sensitivity
and specifity.
J. Clin. Microbiol. 11, 562-568
DE THOISY, B., M. DEMAR, C. AZNAR u. B. CARME (2003):
Ecologic correlates of Toxoplasma gondii exposure in free-ranging neotropical mammals.
J. Wildl. Dis. 39, 456-459
DE THOISY, B., I. VOGEL, J.M. REYNES, J.F. POULIQUEN, B. CARME, M. KAZANJI u. J.C.
VIE (2001):
Health evaluation of translocated free-ranging primates in French Guiana.
Am. J. Primatol. 54, 1-16
DICKSON, J., J. FRY, R. FAIRFAX u. T. SPENCE (1983):
Epidemic toxoplasmosis in captive squirrel monkeys (Saimiri sciureus).
Vet. Rec. 112, 302
DIETZ, H.H., P. HENRIKSEN, V. BILLE-HANSEN u. S.A. HENRIKSEN (1997):
Toxoplasmosis in a colony of New World monkeys.
Vet. Parasitol. 68, 299-304
DÖBEREINER, J. (1955):
Toxoplasmose espontânea em macaco.
Veterinaria 9, 44-54
142
8. Literaturverzeichnis
DRAPER, C.C., R. KILLICK-KENDRICK, W.M. HUTCHISON, J.C. SIIM u. P.C.C. GARNHAM
(1971):
Experimental toxoplasmosis in chimpanzees.
Br. Med. J. 2, 375-378
DUBEY, J.P. (1977):
Toxoplasma, Hammondia, Besnoitia, Sarcocystis and other tissue cyst-forming coccidia of man and
animals.
In: J.P. KREIER (Hrsg.): Parasitic Protozoa.
Bd. 3, Academic Press, New York, S. 101-237
DUBEY, J.P. (1986):
Toxoplasmosis.
J. Am. Vet. Med. Assoc. 189, 166-170
DUBEY, J.P. (1993):
Toxoplasma, Neospora, Sarcocystis, and other tissue cyst-forming coccidia of humans and animals.
In: J.P. KREIER (Hrsg.): Parasitic Protozoa.
Bd. 6, 2. Aufl., Academic Press, S. 1-158
DUBEY, J.P. (1995):
Duration of immunity to shedding of Toxoplasma gondii oocysts by cats.
J. Parasitol. 81, 410-415
DUBEY, J.P. (1996):
Infectivity and pathogenicity of Toxoplasma gondii oocysts for cats.
J. Parasitol. 82, 957-961
DUBEY, J.P. (1998a):
Toxoplama gondii oocyst survival under defined temperatures.
J. Parasitol. 84, 862-865
DUBEY, J.P. (1998b):
Re-examination of resistance of Toxoplasma gondii tachyzoites and bradyzoites to pepsin and
trypsin digestion.
Parasitol. 116, 43-50
DUBEY, J.P. (1998c):
Toxoplasmosis, sarcocystiosis, isosporosis, and cyclosporosis.
In: S.R. PALMER, E.J.L. SOULSBY u. D.I.H. SIMPSON (Hrsg.): Zoonoses.
Oxford University Press, Oxford, S. 579-97
DUBEY, J.P. (2000):
The scientific basis for prevention of Toxoplasma gondii infection: studies on tissue cyst survival,
risk factors and hygiene measures.
8. Literaturverzeichnis
143
In: P. AMBROISE-THOMAS u. E. PETERSEN (Hrsg.): Congenital Toxoplasmosis: Scientific
Background, Clinical Management and Control.
Springer-Verlag, Paris, S. 271-275
DUBEY, J.P., u. C.P. BEATTIE (1988):
Toxoplasmosis of Animals and Man.
CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida
DUBEY, J.P., G. DESMONTS, C. McDONALD u. K.W. WALLS (1985b):
Serologic evaluation of cattle inoculated with Toxoplasma gondii: Comparison of Sabin-Feldman
dye test and other agglutination tests.
Am. J. Vet. Res. 46, 1085-1089
DUBEY, J.P., u. J.K. FRENKEL (1976):
Feline toxoplasmosis from acutely infected mice and the development of Toxoplasma cysts.
J. Protozool. 23, 537-542
DUBEY, J.P., L.W. KRAMER u. S.E. WEISBRODE (1985a):
Acute death associated with Toxoplasma gondii in ring-tailed lemurs.
J. Am. Vet. Med. Assoc. 187, 1272-1273
DUBEY, J.P., M.R. LAPPIN u. P. THULLIEZ (1995):
Long-term antibody responses of cats fed Toxoplasma gondii tissue cysts.
J. Parasitol. 81, 887-893
DUBEY, J.P., D. S. LINDSAY u. C.A. SPEER (1998a):
Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and
development of tissue cysts.
Clin. Microbiol. Rev. 11, 267-299
DUBEY, J.P., J.K. LUNNEY, S.K. SHEN, O.C.H. KWOK, D.A. ASHFORD u. P. THULLIEZ
(1996):
Infectivity of low numbers of Toxoplasma gondii oocysts to pigs.
J. Parasitol. 82, 438-443
DUBEY, J.P., D.W. THAYER, C.A. SPEER u. S.K. SHEN (1998b):
Effect of gamma irradiation on unsporulated and sporulated Toxoplasma gondii oocysts.
Int. J. Parasitol. 28, 369-375
DURFEE, P.T., J.H. CROSS, RUSTAM u. SUSANTO (1976):
Toxoplasmosis in man and animals in South Kalimantan (Borneo), Indonesia.
Am. J. Trop. Med. Hyg . 25, 42-47
EKANAYAKE, D.K., R.P.V.J. RAJAPAKSE, J.P. DUBEY u. W.P.J. DITTUS (2004):
Seroprevalence of Toxoplasma gondii in wild toque macaques (Macaca sinica) at Polonnaruwa, Sri
Lanka.
J. Parasitol. 90, 870-871
144
8. Literaturverzeichnis
EPIPHANIO, S., J.L. CATAO-DIAS u. M.A.B.V. GUIMARAES (1999a):
Toxoplasmosis in emperor tamarin (Saguinus imperator): Case report.
Braz. J. Vet. Res. Anim. Sci. 36, 72-74
EPIPHANIO, S., M.A.B.V. GUIMARAES, D.L. FEDULLO, S.H.R. CORREA u. J.L. CATAODIAS (2000):
Toxoplasmosis in golden-headed lion tamarins (Leontopithecus chrysomelas) and emperor
marmosets (Saguinus imperator) in captivity.
J. Zoo. Wildl. Med. 31, 231-235
EPIPHANIO, S., M.A.B.V. GUIMARAES, D.L. FEDULLO, S.H.R. CORREA u. J.L. CATAODIAS (1999b):
Toxoplasmosis in Leontopithecus chrysomelas (Kuhl, 1820) and Saguinus imperator (Goeldi,
1907).
Am. Assoc. Zoo Vet. Annu. Conf. Proc 1999, 337-338
EPIPHANIO, S., L.R.M. SA, R.H.F. TEIXEIRA u. J.L. CATAO-DIAS (2001):
Toxoplasmosis in a wild-caught black lion tamarin (Leontopithecus chrysopygus).
Vet. Rec. 149, 627-628
EPIPHANIO, S., I.L. SINHORINI u. J.L. CATAO-DIAS (2003):
Pathology of toxoplasmosis in captive New World primates.
J. Comp. Pathol. 129, 196-204
ESCAJADILLO, A., u. J.K. FRENKEL (1991):
Experimental toxoplasmosis and vaccine tests in Aotus monkeys.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 44, 382-389
EVANS, R. (1992):
Life cycle and animal infection.
In: D.O. HO-YEN u. A.W.L. JOSS (Hrsg.): Human Toxoplasmosis.
Oxford Universitiy Press, New York, S. 26-55
FELDMAN, H.A., u. L.T. MILLER (1956):
Serological study of toxoplasmosis prevalence.
Am. J. Hyg. 64, 320-335
FERRARONI, J.J., S.G. REED u. C.A. SPEER (1980):
Prevalence of Toxoplasma antibodies in humans and various animals in the Amazon.
Proc. Helminthol. Soc. Wash. 47, 148-150
FRENKEL, J.K. (2000):
Biology of Toxoplasma gondii.
In: P. AMBROISE-THOMAS u. P.E. PETERSEN (Hrsg.): Congenital Toxoplasmosis.
Springer-Verlag, S.9-25
8. Literaturverzeichnis
145
FRENKEL, J.K., J.P. DUBEY u. N.L. MILLER (1970):
Toxoplasma gondii: fecal stages identified as coccidian oocysts.
Science 167, 893-896
FRENKEL, J.K., u. A. ESCAJADILLO (1987):
Cyst rupture as a pathogenic mechanism of toxoplasmic encephalitis.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 36, 517-522
FRENKEL, J.K., u. O.E. SOUSA (1983):
Antibodies to Toxoplasma in Panamanian mammals.
J. Parasitol. 69, 244-245
FREYRE, A., J.P. DUBEY, D.D. SMITH u. J.K. FRENKEL (1989):
Oocyst-induced Toxoplasma gondii infections in cats.
J. Parasitol. 75, 750-755
FULTON, J. D., u. J.K. TURK (1959):
Direct agglutination test for Toxoplasma gondii.
Lancet 2, 1068-1071
FURLEY, C. (1996):
The gorilla rescue project, Brazzaville, Congo.
Int. Zoo News 43, 299-300
FURUTA, T., Y. UNE, M. OMURA, N. MATSUTANI, Y. NOMURA, T. KIKUCHI, S.
HATTORI u. Y. YOSHIKAWA (2001):
Horizontal transmission of Toxoplasma gondii in squirrel monkeys (Saimiri sciureus).
Exp. Anim. 50, 299-306
GARDINER, C.H., R. FAYER u. J.P. DUBEY (1998):
Apicomplexa--Toxoplasma and Hammondia
In: C.H. GARDINER, R. FAYER u. J.P. DUBEY (Hrsg.): An Atlas of Protozoan Parasites in
Animal Tissues.
2. Aufl., Armed Forces Institute of Pathology, Washington DC, S. 53-55
GEISSMANN, T. (2003):
Vergleichende Primatologie.
Springer Verlag, Berlin, Heidelberg
GOZALO, A., u. M. TANTALEAN (1996):
Parasitic protozoa in neotropical primates.
Lab. Prim. Newsl. 35, 1-7
GRINER, L.A. (1983):
Pathology of zoo animals.
Zoological Society of San Diego, San Diego, S. 326-345
146
8. Literaturverzeichnis
GROSS, U., M. HOLPERT u. S. GOEBEL (2004):
Impact stage differentiation on diagnosis of toxoplasmosis.
Ann. Ist. Super Sanità 40, 65-70
HARING, D., u. K. DAVIS (1998):
Management of the Grey gentle or Eastern lesser bamboo lemur Hapalemur griseus griseus at
Duke University Primate Center, Durham.
Int. Zoo Yb. 36, 20-34
HARPER, J.S. III, W.T. LONDON u. J.L. SEVER (1985):
Five drug regimens for treatment of acute toxoplasmosis in squirrel monkeys.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 34, 50-57
HESSLER, J.R., J.C. WOODARD u. P.C. TUCEK (1971):
Lethal toxoplasmosis in a woolly monkey.
J. Am. Vet. Med. Assoc. 159, 1588-1594
HILGENFELD, M. (1965a):
Toxoplasmose bei Zootieren.
Zool. Garten (Generalregister) 30, 262-270
HILGENFELD, M. (1965b):
Zur Toxoplasmose der weiblichen Geschlechtsorgane.
Erkr. Zootiere 7, 21-24
HILGENFELD, M. (1966):
Toxoplasmose bei Affen.
Erkr. Zootiere 8, 231-238
HOLLAND, G.N., G.R. O'CONNOR, R.F. DIAZ, P. MINASI u. W.M. WARA (1988):
Ocular toxoplasmosis in immunosuppressed nonhuman primates.
Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 29, 835-842
HOLLIMAN, R.E., J. JOHNSON u. K. DUFFY (1989):
Discrepant Toxoplasma latex agglutination test results.
J. Clin. Pathol. 42, 200-203
HO-YEN, D. O. (1992):
The future.
In: D.O. HO-YEN u. A.W.L. JOSS (Hrsg.): Human Toxoplasmosis.
Oxford Universitiy Press, New York, S. 232-248
HUBBARD, G.B. (1995):
Protozoal diseases of nonhuman primates.
Semin. Avian Exot. Pet Med. 4, 145-149
8. Literaturverzeichnis
147
INNES, E.A. (1997):
Toxoplasmosis: Comparative species susceptibility and host immune response.
Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis. 20, 131-138
INOUE, M. (1997):
Acute toxoplasmosis in squirrel monkeys.
J. Vet. Med. Sci. 59, 593-595
ISENBÜGEL, E. (1983):
Akute Toxoplasmose in einem Katta (Lemur catta) Bestand.
2. Arbeitstagung der Zootierärzte im deutschsprachigen Raum, 38-43
ITAKURA, C., u. H. NIGI (1968):
Histopathological observations on two spontaneous cases of toxoplasmosis in the monkey
(Lemur catta).
Nippon Juigaku Zasshi 30, 341-346
JACKSON, M.H. u. W.M. HUTCHISON (1989):
The prevalence and source of Toxoplasma infection in the environment.
Adv. Parasitol., 28, 55-105
JACOBS, L., u. M.N. LUNDE (1957):
A haemagglutination test for toxoplasmosis.
J. Parasitol. 43, 308-314
JENSEN, L., E. PETERSEN, S.A. HENRIKSEN, H.H. DIETZ u. P. LIND (1998):
Monoclonal antibodies to Toxoplasma gondii strain 119 identify recently isolated Danish strains as
one group.
Int. J. Parasitol. 28, 1305-1313
JOHNSON, A.M. (1997):
Speculation on possible life cycles for the clonal lineages in the genus Toxoplasma.
Parasitol. Today 13, 393-397
JOHNSON, A.M. (1999):
Is there more than one species in the genus Toxoplasma?
Tokai J. Exp. Clin. Med. 23, 383-389
JOHNSON-DELANEY, C.A. (1996):
Zoonotic parasites of selected exotic animals.
Semin. Avian Exot. Pet Med. 5, 115-124
JUAN-SALLES, C., S. LOPEZ, D. BORRAS, M. DOMINGO, N. PRATS u. J. FERNANDEZ
(1997):
Disseminated toxoplasmosis in susceptible zoo species: A sporadic disease?
Am. Assoc. Zoo Vet. Annu. Conf. Proc. 1997, 227-231
148
8. Literaturverzeichnis
JUAN-SALLES, C., N. PRATS, A.J. MARCO, J.A. RAMOS-VARA, D. BORRAS u. J.
FERNANDEZ (1998):
Fatal acute toxoplasmosis in three golden lion tamarins (Leontopithecus rosalia).
J. Zoo Wildl. Med. 29, 55-60
JUNGE, R.E. (2003):
Prosimians.
In: M.E. FOWLER u. R.E. MILLER (Hrsg.): Zoo and Wild Animal Medicine.
5.Aufl., WB Saunders, St Louis, S. 334-346
KAPPERUD, G., P.A. JENUM, B. STRAY-PEDERSEN, K.K. MELBY, A. ESKILD u. J. ENG
(1996):
Risk factors for Toxoplasma gondii infection in pregnancy: results of a prospective case-control
study in Norway.
Am. J. Epidemiol. 144, 405-412
KASCHULA, V.R., A.F. VAN DELLEN u. V. DE VOS (1978):
Some infectious diseases of wild vervet monkeys (Cercopithecus aethiops pygerythrus) in
South Africa.
J. S. Afr. Vet. Assoc. 49, 223-227
KOPCIOWSKA, L. u. S. NICOLAU (1938):
Toxoplasmose spontanée du chimpanzé.
Compt. Rend. Soc. Biol. 129, 179-181
KOTULA, A.W., J.P. DUBEY, A.K. SHARAR, C.D. ANDREWS, S.K. SHEN u. D.S. LINDSAY
(1991):
Effect of freezing on infectivity of Toxoplasma gondii tissue cysts in pork.
J. Food Prot. 54, 687-690
KRAHENBUHL, J.L., u. J.S. REMINGTON (1982):
The immunology of Toxoplasma and toxoplasmosis.
In: S. COHEN, K.S. WARREN (Hrsg.): Immunology of Parasitic Infections.
Blackwell Scientific Publications, London, S. 356-421
KUNTZ, R.E., u. B.J. MYERS (1967):
Microbiological parameters of the baboon (Papio sp.): Parasitology.
In: H. VAGTBORG (Hrsg.): The Baboon in Medical Research.
Bd. 2, University of Texas Press, Austin, S. 741-755
KUTICIC, V., u. T. WIKERHAUSER (1996):
Studies of the effect of various treatments on the viability of Toxoplasma gondii tissue cysts and
oocysts.
In: U. GROSS (Hrsg.): Toxoplasma gondii.
Springer-Verlag, Berlin, S. 261-265
8. Literaturverzeichnis
149
LABELLE, P., J.P. DUBEY, I. MIKAELIAN, N. BLANCHETTE, R. LAFOND, S. ST-ONGE u.
D. MARTINEAU (2001):
Seroprevalence of antibodies to Toxoplasma gondii in lynx (Lynx canadensis) and bobcats (Lynx
rufus) from Quebec, Canada.
J. Parasitol. 87, 1194-1196
LEE, J.J., G.F. LEEDALE u. P. BRADBURY (2000):
An illustrated Guide to the Protozoa. Organisms traditionally referred to as protozoa, or newly
discovered groups.
2. Aufl., Allen Press Inc, Lawrence
LEHNER, N.D.M. (1984):
Biology and diseases of Cebidae.
In: J.F. FOX, B.J. COHEN u. F.M. LOEW (Hrsg.): Laboratory Animal Medicine.
Academic Press, Orlando, Florida, S. 321-353
LEONG, K.M., S.P. TERRELL u. A. SAVAGE (2004):
Causes of mortality in captive cotton-top tamarins (Saguinus oedipus).
Zoo Biol. 23, 127-137
LEVADITI, C. u. R. SCHOEN (1933):
Présence d`un toxoplasmose dans l`encéphale du cynocéphalus babuin.
Bull. Soc. Path. Exot. 26, 402-405
LEVADITI, C., R. SCHOEN u. V. SANCHIS BAYARRI (1928):
L’encéphalomyélite toxoplasmique chronique du lapin et de la souris.
C. R. Séances Soc. Biol. Fil (Paris) 99, 37-40
LEVINE, N.D. (1985):
Veterinary Protozoology.
State University Press, Ames, Iowa
LEVINE, N.D. (1988):
The Protozoan Phylum Apikomplexa.
Bd. 1 und 2, CRC Press, Boca Raton, Florida
LUFT, B.J., u. J.S. REMINGTON (1992):
Toxoplasmic encephalitis in AIDS.
Clin. Infect. Dis. 15, 211-222
LUKESOVA, D., u. I. LITERAK (1998):
Shedding of Toxoplasma gondii oocysts by Felidae in zoos in the Czech Republic.
Vet. Parasitol. 74, 1-7
McCLURE, H.M., u. N.B. GUILLOUD (1971):
Comparative pathology of the chimpanzee.
In: G.H. BOURNE (Hrsg.): The Chimpanzee.
150
8. Literaturverzeichnis
4. Aufl., Karger-Verlag, Basel, S.103-277
McCONNELL, E.E., P.A. BASSON, V. DE VOS, B.J. MYERS u. R.E. KUNTZ (1974):
A survey of diseases among 100 free-ranging baboons (Papio ursinus) from the Kruger National
Park.
Onderstepoort J. Vet. Res. 41, 97-167
McCONNELL, E.E., P.A. BASSON, B. WOLSTENHOLME, V. DE VOS u. H.H. MALHERBE
(1973):
Toxoplasmosis in free-ranging chacma baboons (Papio ursinus) from the Kruger National Park.
Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 67, 851-855
McKISSICK, G.E., H.L. RATCLIFFE u. A. KOESTNER (1968):
Enzootic toxoplasmosis in caged squirrel monkeys Saimiri sciureus.
Pathol. Vet. 5, 538-560
MICHAELS, M.G., J.P. MCMICHAEL, K. BRASKY, S. KALTER, R.L. PETER, T.E. STARZL u.
R.L. SIMMONS (1994):
Screening donors for xenotransplantation.
Transplantation 57, 1462-1465
MOHR, W., H. WAHLE u. A. STAMMLER (1955):
Experimentelle Toxoplasma-Infektion beim Rhesusaffen.
Z. Tropenmed. Parasitol. 6, 386-430
MONTALI, R.J., u. M. BUSH (1999):
Diseases of the Callitrichidae.
In: M.E. FOWLER u. R.E. MILLER (Hrsg.): Zoo and Wild Animal Medicine: Current Therapy.
4. Aufl., WB Saunders, Philadelphia, S. 369-376
MONTALI, R.J., M. BUSH, J. HESS, J.D. BALLOU, D.G. KLEIMAN u. B.B. BECK (1995):
Ex situ diseases and their control for reintroduction of the endangered lion tamarin species
(Leontopithecus spp.).
Erkr. Zootiere 37, 93-98
MURATA, K. (1989):
A serological survey of Toxoplasma gondii infection in zoo animals and other animals.
Nippon Juigaku Zasshi 51, 935-940
NERY-GUIMARAES, F., u. A.J. FRANKEN (1971):
Toxoplasmose em primates não humanos. II. Tentativas de infecções experimentais em Macaca
mulatta, Cebus apella e Callithrix jacchus; e pesquisa de anticorpos em várias espécies de
platyrrhinus. (Toxoplasmosis in nonhuman primates. II. Attempts at experimental infection in
Macaca mulatta, Cebus apella and Callithrix jacchus, and search for antibodies in several species
of platyrrhines.)
Mem. Inst. Oswaldo Cruz 69, 97-111
8. Literaturverzeichnis
151
NERY-GUIMARAES, F., A.J. FRANKEN u. W.A. CHAGAS (1971):
Toxoplasmose em primates não humanos. I. Infeccões naturais em Macaca mulatta e Cebus apella.
(Toxoplasmosis in nonhuman primates. I. Natural infection in Macaca mulatta and Cebus apella.)
Mem. Inst. Oswaldo Cruz 69, 77-87
NICOLLE, C., u. L. MANCEAUX (1908):
Sur une infection à corps de Leishman (ou organismes voisins) du gondi.
C. R. Hebd. Séances Acad. Sci. 147, 763-766
NICOLLE, C., u. L. MANCEAUX (1909):
Sur une protozoaire nouveau du gondi.
C. R. Hebd. Séances Acad. Sci. 148, 369-372
NIGI, H., u. C. ITAKURA (1968):
Spontaneous toxoplasmosis in Lemur catta.
Primates 9, 155-160
NOSSAL, G. J.V. (1992):
The molecular and cellular basis of affinity maturation in the antibody response.
Cell 68, 1-2
PARROTT, T.Y. (1997):
An introduction to diseases of nonhuman primates.
In: K.L. ROSENTHAL (Hrsg.): Practical Exotic Animal Medicine.
Veterinary Learning Systems, Trenton, NJ, S. 258-263
PERRI, S.F., N.E. PALUMBO, M.H. HIGA u. H.E. BLATT (1992):
Toxoplasmosis: An avirulent zoonosis in Hawaii.
Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 31, 25
PERTZ, C., R.R. DUBIELZIG u. D.S. LINDAY (1997):
Fatal Toxoplasma gondii infection in golden lion tamarins (Leontopithecus rosalia rosalia).
J. Zoo Wildl. Med. 28, 491-493
POKORNY, J., J. HÜBNER u. M. ZASTERA (1961):
Izolace kmenu Toxoplasma gondii z nĕktery ch domacich i volnĕ zĭjicich zvirat.
Cesk. Epidemiol. Mikrobiol. Immunol. 10, 323-329
POTKAY, S. (1992):
Diseases of the Callitrichidae: A review.
J. Med. Primatol. 21, 189-236
POLANEC, J., I. SEPPÄLA, S. ROUSSEAU u. K. HEDMAN (1994):
Evaluation of protein-denaturing immunoassays for avidity of immunoglobulin G to rubella virus.
J. Clin. Lab. Analys. 8, 16-21
152
8. Literaturverzeichnis
PROWTEN, A.W., R.V. LEE, R.M. KRISHNAMSETTY, S.K. SATCHIDANAND u. B.I.S.
SRIVASTAVA (1985):
T-cell lymphoma associated with immunologic evidence of retrovirus infection in a lowland gorilla.
J. Am. Vet. Med. Assoc. 187, 1280-1282
PULLEN, G.R., M.G. FITZGERALD u. C.S. HOSKING (1986):
Antibody avidity determination by ELISA using thiocyanate elution.
J. Immunol. Methods 106, 119-125
RAO BHAU, L.N., T.K. KULSHRESTHA, S.K. BHANDARI u. J. SOKHEY (1987):
Sero-epidemiology of toxoplasmosis in rhesus monkeys in India.
Indian Vet. J. 64, 557-559
RATCLIFFE, H.L. (1954):
Causes of death in the animal collection.
Rept. Penrose Res. Lab. Zool. Soc. Philadelphia 1954, 6-16
RATCLIFFE, H.L. (1961):
Causes of death in the animal collection.
Rept. Penrose Res. Lab. Zool. Soc. Philadelphia 1961, 6-18
RATCLIFFE, H.L., u. C.B. WORTH (1951):
Toxoplasmosis of captive wild birds and mammals.
Am. J. Pathol. 27, 655-667
REMINGTON, J.S., O.A. SOAVE u. J. DAVIS (1965):
A serological survey in three species of monkeys for antibodies to Toxoplasma.
Am. J. Trop. Med. Hyg. 14, 724-726
REMINGTON, J.S., u. G. DESMONTS (1983):
Toxoplasmosis.
In: J.S. REMINGTON u. J.O. KLEIN (Hrsg.): Infectious Diseases of the Fetus and Newborn Infant.
2. Aufl., W.D. Saunders, Philadelphia, S. 143-263
RIEMANN, H.P., D.E. BEHYMER, M.E. FOWLER, T. SCHULZ, A. LOCK, J.G. ORTHOEFER,
S. SILVERMAN u. C.E. FRANTI (1974):
Prevalence of antibodies to Toxoplasma gondii in captive exotic mammals.
J. Am. Vet. Med. Assoc. 165, 798-800
SABIN, A.B. (1939):
Biological and immunological identity of Toxoplasma of animal and human origin.
Proc. Soc. Exp. Biol. 41, 75-80
SABIN, A.B., u. H.A. FELDMAN (1948):
Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite
(Toxoplasma).
Science 108, 660-663
8. Literaturverzeichnis
153
SASSEVILLE, V.G., D.R. PAULEY, J.J. MACKEY u. M.A. SIMON (1995):
Concurrent central nervous system toxoplasmosis and simian immunodeficiency virus-induced
AIDS encephalomyelitis in a Barbary macaque (Macaca sylvana).
Vet. Pathol. 32, 81-83
SCHOLTYSECK, E., u. G. PIEKARSKI (1965):
Elektronenmikroskopische Untersuchungen an Merozoiten von Eimerien (Eimeria perforans und E.
stiedae) und Toxoplasma gondii: Zur systematischen Stellung von T. gondii.
Z. Parasitenkd. 26, 91-115
SCHOONDERMARK-VAN DE VEN, E., J. GALAMA, T. VREE, W. CAMPS, I. BAARS, T.
ESKES, J. MEUWISSEN u. W. MELCHERS (1995):
Study of treatment of congenital Toxoplasma gondii infection in rhesus monkeys with
pyrimethamine and sulfadiazine.
Antimicrob. Agents Chemother. 39, 137-144
SCHOONDERMARK-VAN DE VEN, E., W. MELCHERS, W. CAMPS, T. ESKES, J.
MEUWISSEN u. J. GALAMA (1994):
Effectiveness of spiramycin for treatment of congenital Toxoplasma gondii infection in rhesus
monkeys.
Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1930-1936
SCHOONDERMARK-VAN DE VEN, E., W. MELCHERS, J. GALAMA, W. CAMPS, T. ESKES
u. J. MEUWISSEN (1993):
Congenital toxoplasmosis: An experimental study in rhesus monkeys for transmission and prenatal
diagnosis.
Exp. Parasitol. 77, 200-211
SEIBOLD, H.R., u. R.H. WOLF (1971):
Toxoplasmosis in Aotus trivirgatus and Callicebus moloch.
Lab. Anim. Sci. 21, 118-120
SERY, V., J. SAUER, P. VAN NONG, O. JIROVEC, J. JIRA u. J. SEEMAN (1959):
Study of toxoplasmosis in Vietnam.
J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol. 3, 444
SIMON, K.G.M. (1995):
Evaluierung diagnostischer Tests zur Untersuchung von Infektionen mit Toxoplasma gondii bei
Katzen und Schafen.
Hannover, Tierärztl. Hochschule, Diss.
SPENCER, J.A., K.S. JOINER, C.D. HILTON, J.P. DUBEY, M. TOIVIO-KINNUCAN, J.K.
MINC u. B.L. BLAGBURN (2004):
Disseminated toxoplasmosis in a captive ring-tailed lemur (Lemur catta).
J. Parasitol. 90, 904-906
154
8. Literaturverzeichnis
STOLZ, G. (1962):
Spontane, letal verlaufende Toxoplasmose bei einem Affen.
Schweiz. Arch. Tierheilkd. 104, 162-166
SUREAU, P., J.P. RAYNAUD, C. LAPEIRE u. E.R. BRYGOO (1962):
Premier isolement de Toxoplasma gondii à Madagascar. Toxoplasmose spontanée et expérimentale
du Lemur catta.
Bull. Soc. Pathol. Exot. Filiales 55, 358-362
SWENSON, R.B. (1993):
Protozoal parasites of great apes.
In: M.E. FOWLER (Hrsg.): Zoo and Wild Animal Medicine: Current Therapy.
3.Aufl., W.B. Saunders, Philadelphia, S. 352-355
SULAIMAN, L.H., J.W. MAK u. K. SURESH (1989):
Prevalence of Toxoplasma antibodies in monkeys in Malaysia.
Trop. Biomed. 6, 147-148
TENTER, A.M., A.R. HECKEROTH u. L.M. WEISS (2000):
Toxoplasma gondii: from animals to humans.
Int. J. Parasitol. 30, 1217-1258
THEZE, J. (1916):
Pathologie de la Guyane française (Lépre, Filariose etc.). Rapport sur les travaux de l`Institute
d`Hygiene et de Bactériologie 1914-1915.
Bull. Soc. Pathol. Exot. 9, 446-469
THORINGTON, R.W. (1968):
Observations of squirrel monkeys in a Columbian forest.
In: L.A. ROSENBLUM u. R.W. COOPER (Hrsg.): The Squirrel Monkey.
Academic Press, New York, S. 69-85
TUDGE, C. (1991):
Veterinary science at London and Whipsnade: Cases and discoveries.
In: C. TUDGE (Hrsg.): Science for Conservation.
Zoological Society of London, London, S. 52-56
UILENBERG, G. (1970):
Quelques protozaires parasites de mammifères sauvages à Madagascar.
Ann. Parasitol. Hum. Comp. 45, 183-194
UILENBERG, G., u. J.J. RIBOT (1965):
Note sur la toxoplasmose des lémuriens (Primates, Lemuridae).
Rev. Elev. Med. Vet. Pays Trop. 19, 247-248
8. Literaturverzeichnis
155
UMINSKI, J., u. J. PIETRZYK (1961):
Wyniki badan malp w kierunku toksoplazmozy przy pomocy odczynu wiazania dopelniacza.
(Results of investigations performed by means of complement fixation test (C.F.T.) concerning
toxoplasmosis in apes.)
Wiad. Parazytol. 7(Suppl.), 411-412
VAN DEN AKKER, S. P.H. BOOL u. W.C. SPITS-ESHUIS (1959):
Toxoplasmosis bij een hond. (Toxoplasmosis in a dog.)
Tijdschr. Diergeneesk. 84, 767-773
WARREN, J., u. A.B. SABIN (1942):
The complement fixation reaction in toxoplasmic infection.
Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 51, 11-14
WERNER, H., K. JANITSCHKE u. H. KOEHLER (1969):
Über Beobachtungen an Marmoset-Affen Saguinus (Oedipomidas) nach oraler und intraperitonealer
Infektion mit verschiedenen zystenbildenden Toxoplasma-Stämmen unterschiedlicher Virulenz . I.
Mitteilung: Klinische, pathologisch-anatomische, histologische und parasitologische Befunde
Zentralbl. Bakteriol. (Orig.) 209, 553-569
WOHLSEIN, P., H.P. BRANDT, M. BRACK, M. PETERS, G. SCHARES, M. BOER (1999):
Immunohistological and molecular biological investigations on non-human primates with
disseminated toxoplasmosis.
Erkr. Zootiere. 39, 209-214
WOLFF, P.L. (1990):
The parasites of New World primates: A review.
Am. Assoc. Zoo Vet. Annu. Proc. 1990, 87-94
WOLFF, P.L. (1993):
Parasites of New World primates.
In: M.E. FOWLER (Hrsg.): Zoo and Wild Animal Medicine: Current Therapy.
3. Aufl., W.P. Saunders, Philadelphia, S. 378-389
WONG, M.M., u. W.J. KOZEK (1974):
Spontaneous toxoplasmosis in macaques: A report of four cases.
Lab. Anim. Sci. 24, 273-278
WONG, M.M., J. THEIS u. S. KARR JR (1974):
Experimental toxoplasmosis in the stumptailed macaque (M. arctoides).
J. Med. Primatol. 3, 195-212
WOOLF, A., u. T.R. ANTHONEY (1982):
Dropping out.
Lab. Anim. (NY) 11, 13-14
156
8. Literaturverzeichnis
YAMAMOTO, M., M. TOKUCHI, S. HOTTA u. B. NOERJASIN (1970):
A survey of anti-Toxoplasma hemagglutinating antibodies in sera from residents and certain species
of animals in Surabaja, Indonesia.
Kobe J. Med. Sci. 16, 273-280
ZAMAN, V., u. T.K. GOH (1968):
Isolation of Toxoplasma gindii from the slow loris, Nycticebus coucang.
Ann. Trop. Med. Parasitol. 62, 52-53
ZAMAN, V., u. A. KRISHNAMURTI (1969):
Distribution of Toxoplasma cysts in the central nervous system of slow loris, Nycticebus
coucang.
Acta Trop. 26, 167-172
ZHANG, S.Y., M.X. WEI, Z.Y. ZHOU, J.Y. YU u. X.Q. SHI (2000):
Prevalence of antibodies to Toxoplasma gondii in the sera of rare wildlife in the Shanghai
Zoological Garden, People's Republic of China.
Parasitol. Int. 49, 171-174
ZWART, P., M.J. KAASHOEK, M. VAN DER HAGE u. G.M. DORRESTEIN (1989):
Erkrankungen südamerikanischer Säugetiere aus niederländischen Tiergärten.
Erkr. Zootiere 31, 7-14
9. Anhang
157
9. ANHANG
9.1. Chemikalien und andere Reagenzien
Tab. 17: Chemikalien und andere Reagenzien
Produkt
Bezug von
bovines Serumalbumin (Fraction V, 96-99 % Albumin)
SIGMA-ALDRICH, Steinheim
C6H8O7 (Zitrat)
SIGMA-ALDRICH, Steinheim
CO(NH2)2 (Harnstoff)
SERVA, Heidelberg
Ethanol, absolut
MERCK, Darmstadt
Evans Blau
MERCK, Darmstadt
Formaldehydlösung, mind. 37%ig
MERCK, Darmstadt
Glyzerin
MERCK, Darmstadt
H2O2 (Wasserstoffperoxyd, 30%ig)
SIGMA-ALDRICH, Steinheim
H2SO4 (Schwefelsäure 95-97%ig)
MERCK, Darmstadt
KCl (Kaliumchlorid)
MERCK, Darmstadt
KH2PO4 (Kaliumdihydrogenphosphat)
MERCK, Darmstadt
Methylenblau
MERCK, Darmstadt
NaCl (Natriumchlorid)
ROTH, Karlsruhe
Na2CO3 (Natriumkarbonat)
MERCK, Darmstadt
NaHCO3 (Natriumhydrogenkarbonat)
MERCK, Darmstadt
Na2HPO4 (Natriumhydrogenphosphat)
MERCK, Darmstadt
Na2B4O7 (Dinatriumtetraborat)
MERCK, Darmstadt
OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid)
SIGMA-ALDRICH, Steinheim
Penizillin/Streptomyzin (10000 IU/ml Penizillin +
10000 µg/ml Streptomyzin)
p-Phenylendiamin
GIBCO BRL, Eggenstein
SIGMA-ALDRICH, Steinheim
Trypsin
DIFCO, Detroit, USA
Tween 20 (Polyoxyethylen-Sorbitan-Monolaurat)
SIGMA-ALDRICH, Steinheim
158
9. Anhang
9.2. Lösungen
Beschichtungspuffer (Karbonat-Bikarbonat-Puffer, pH 9,6)
Na2CO3
NaHCO3
Aqua bidestillata
1,59 g
2,93 g
ad 1000 ml
Der Puffer wurde in Portionen zu je 50 ml abgefüllt und bei –20 °C bis zum weiteren Gebrauch
gelagert.
5 % BSA in PBS (BSA-PBS)
BSA
PBS
0,5 g
ad 10 ml
Die Lösung wurde jeweils frisch angesetzt.
2 % BSA in PBS-Tween (BSA-PBS-Tween)
BSA
PBS-Tween
0,2 g
ad 10 ml
Die Lösung wurde jeweils frisch angesetzt.
Eindeckmedium
Kochsalzlösung:
Na2HPO4 + 2 H2O
NaCl
Aqua bidestillata
1,8 g
0,6 g
ad 1000 ml
Die Salze wurden in einem 1000-ml-Kolben gelöst, 20 ml dieser Lösung wurden in einen 100-mlKolben überführt. Dazu wurden 0,2 g p-Phenylendiamin* gegeben und gründlich gemischt.
Anschließend wurden 180 ml Glyzerin* zugefügt. Der pH-Wert wurde mit KarbonatBikarbonatpuffer 0,5 M auf 8,0 eingestellt. Das Eindeckmedium wurde portioniert, mit Alufolie
zugedeckt und bei –20 °C gelagert.
Evans-Blau-Lösung
Evans Blau
Aqua bidestillata
0,2 g
ad 100 ml
9. Anhang
159
1%ige Formaldehyd-Lösung
Formaldehydlösung, mind. 37%ig*
PBS
3 ml
108 ml
2,5 M H2SO4 (Stopperlösung)
H2SO4 (96-99%ig)
Aqua bidestillata
66,8 ml
ad 500 ml
Harnstoff
Aqua bidestillata
48,0 g
ad 100 ml
8 M Harnstoff in H2O
Nach vollständiger Lösung des Harnstoffes wurde die Lösung in Portionen zu je 1 ml abgefüllt und
bei –20 °C bis zum weiteren Gebrauch gelagert.
6 M Harnstoff in PBS-Tween
Harnstoff
PBS-Tween
36,0 g
ad 100 ml
Die Lösung wurde jeweils frisch angesetzt.
0,5 M Karbonat-Bikarbonatpuffer (pH 9,0)
NaHCO3
Na2CO3
Aqua bidestillata
42,0 g
53,0 g
ad 1000 ml
Methylenblau*
Ethanol, absolut*
Na2CO3
Aqua bidestillata
Na2B4O7* x 10 H2O
Aqua bidestillata
Lösung a
Lösung b
Lösung c
2,0 g
ad 100 ml
5,3 g
ad 1000 ml
1,91 g
ad 100 ml
3 ml
9,73 ml
0,27 ml
Methylenblaulösung
Lösung a:
Lösung b:
Lösung c:
Gebrauchslösung:
160
9. Anhang
10 x PBS (Stammlösung)
NaCl
KH2PO4
Na2HPO4
KCl
Aqua bidestillata
400,0 g
10,0 g
57,5 g
10,0 g
ad 5000 ml
NaCl
KH2PO4
Na2HPO4
KCl
Aqua bidestillata
8,00 g
0,20 g
1,15 g
0,20 g
ad 1000 ml
1 x PBS, pH 7,4
PBS-Tween, pH 7,4
Tween 20
PBS
0,5 ml
ad 1000,0 ml
0,2 M Phosphatlösung
Na2HPO4
Aqua bidestillata
28,4 g
ad 1000 ml
Die Lösung war bei 4 °C eine Woche haltbar.
Substratpuffer für ELISA, pH 5,0
0,1 M Zitratlösung
0,2 M Phosphatlösung
Aqua bidestillata
OPD
H2O2 (30 %)
18,2 ml
19,3 ml
37,5 ml
30 mg
30 µl
0,5 %ige Trypsin-PBS-Lösung
Trypsin
PBS
0,5 g
ad 100 ml
0,1 M Zitratlösung
C6H8O7 (wasserfrei)
Aqua bidestillata
Die Lösung war bei 4 °C eine Woche haltbar.
19,2 g
ad 1000 ml
9. Anhang
161
9.3. Ergebnisse aus dem IgG-Aviditäts-ELISA
Im Anhang sind alle im IgG-Aviditäts-ELISA ermittelten Ergebnisse aufgeführt, die nicht in Kap.
4.3. gezeigt sind.
9.3.1. Weißkopfmakis
H2, Mai
1
1
0,8
0,6
0,4
0,4
0
0
320
1280
0,4
40
160
10
640
mit Harnsto ff
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
H3, März
1
1
1
0,2
ELISA-Index
1,2
0,4
0,8
0,6
0,4
0,2
0
40
160
640
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
40
160
o hne Harnsto ff
H3, Juni
10
mit Harnsto ff
0,4
0,4
0,2
0
160
640
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
1
0,6
0
mit Harnsto ff
H4, Mai
0,8
0,2
640
1,2
ELISA-Index
ELISA-Index
0,6
160
o hne Harnsto ff
1
1
40
reziproke Serumverdünnung
H3, Dezem ber
0,8
o hne Harnsto ff
0,4
640
1,2
40
0,6
reziproke Serumverdünnung
1,2
10
0,8
0
10
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
0,2
0
10
640
H3, Mai
1,2
0,6
160
o hne Harnsto ff
1,2
0,8
40
reziproke Serumverdünnung
reziproke Serumverdünnung
ELISA-Index
ELISA-Index
0,6
0
H2, Dezem ber
ELISA-Index
0,8
0,2
10
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
1
0,6
0,2
80
1,2
0,8
0,2
20
H2, Juni
ELISA-Index
1,2
ELISA-Index
ELISA-Index
H2, März
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
162
9. Anhang
H4, Dezem ber
1
1
1
0,8
0,6
0,4
0,8
0,6
0,4
0,2
0,2
0
0
40
160
640
mit Harnsto ff
640
20
mit Harnsto ff
0,4
0,4
0
0
320
1280
0,6
0,4
0
40
160
10
640
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
o hne Harnsto ff
H6, Mai
mit Harnsto ff
0,6
0,4
0,2
1,2
1
1
0,8
0,6
0,4
640
o hne Harnsto ff
0,8
0,6
0,4
0
10
40
160
20
640
reziproke Serumverdünnung
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
o hne Harnsto ff
H7, März
H7, Mai
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
ELISA-Index
1
ELISA-Index
1
0,2
1280
mit Harnsto ff
H7, Juni
1,2
0,4
320
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
1,2
0,6
80
reziproke Serumverdünnung
1,2
0,8
mit Harnsto ff
0,2
0
160
640
H6, Dezem ber
1,2
0,2
0
160
o hne Harnsto ff
ELISA-Index
ELISA-Index
1
0,8
40
reziproke Serumverdünnung
H6, Juni
1,2
40
0,8
0,2
10
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
1
0,6
0,2
mit Harnsto ff
H5, Dezem ber
0,8
0,2
1280
1,2
ELISA-Index
0,6
320
o hne Harnsto ff
1
0,8
80
reziproke Serumverdünnung
H5, Juni
ELISA-Index
ELISA-Index
160
o hne Harnsto ff
1
ELISA-Index
40
1,2
10
0,4
0
H5, Mai
80
0,6
reziproke Serumverdünnung
1,2
20
0,8
0,2
10
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
ELISA-Index
1,2
10
ELISA-Index
H5, März
1,2
ELISA-Index
ELISA-Index
H4, Juni
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
20
80
320
1280
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
9. Anhang
163
H8, März
1,2
1
1
0,8
0,6
0,4
0,6
0,4
0,2
0
0
40
160
mit Harnsto ff
10
0,8
0,6
0,4
mit Harnsto ff
0,4
0
0
o hne Harnsto ff
0,8
0,6
0,4
0
40
160
640
10
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
1
ELISA-Index
1,2
1
ELISA-Index
1,2
0,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
40
160
640
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
80
320
o hne Harnsto ff
H23, Mai
10
mit Harnsto ff
0,6
0,4
0,6
0,4
0,2
0
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
mit Harnsto ff
H32, März
1
0
640
1,2
0,8
0,2
160
o hne Harnsto ff
ELISA-Index
ELISA-Index
1
40
reziproke Serumverdünnung
H23, Juni
0,8
160
0,4
1280
1,2
40
0,6
reziproke Serumverdünnung
1,2
10
0,8
0
20
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
0,2
0
10
640
H23, März
1
0,4
160
o hne Harnsto ff
1,2
0,6
40
reziproke Serumverdünnung
H22, Juni
0,8
mit Harnsto ff
0,2
10
640
640
1
0,6
0,2
160
H22, März
0,8
0,2
40
reziproke Serumverdünnung
1,2
H22, Mai
ELISA-Index
640
ELISA-Index
ELISA-Index
ELISA-Index
1
reziproke Serumverdünnung
ELISA-Index
160
H21, Juni
1,2
o hne Harnsto ff
40
o hne Harnsto ff
1
160
0,4
reziproke Serumverdünnung
1,2
40
0,6
0
H21, Mai
10
0,8
0,2
10
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
1
0,8
0,2
10
H21, März
1,2
ELISA-Index
ELISA-Index
ELISA-Index
H7, Dezem ber
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
164
9. Anhang
H32, Juni
1,2
1,2
1
1
ELISA-Index
ELISA-Index
H32, Mai
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
40
160
640
10
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
9.3.2. Kattas
H24, März
H25, März
1,2
1
ELISA-Index
ELISA-Index
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
40
160
640
10
o hne Harnsto ff
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
9.3.3. Totenkopfaffen
H11, März
H13, März
ELISA-Index
ELISA-Index
1
0,8
0,6
0,4
1,2
1
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0,2
0
0
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
H14, März
1,2
ELISA-Index
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
20
80
320
1280
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
9. Anhang
165
H15, März
H16, März
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,8
0,6
0,4
0,2
0,2
0
0
10
40
160
640
0,4
0
o hne Harnsto ff
40
160
o hne Harnsto ff
H20, März
10
640
mit Harnsto ff
0,6
0,4
0,2
0
0
10
40
160
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
640
40
160
640
10
reziproke Serumverdünnung
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
1
0,8
0,2
mit Harnsto ff
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
1
1,2
0,2
ELISA-Index
1
ELISA-Index
1,4
0,4
0,8
0,6
0,4
0,2
0
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
B7
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
mit Harnsto ff
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
640
B6
1,2
0,6
160
o hne Harnsto ff
J1
H30, März
40
reziproke Serumverdünnung
1,2
0,8
mit Harnsto ff
H29, März
ELISA-Index
ELISA-Index
0,4
640
1,2
1
0,6
160
o hne Harnsto ff
H28, März
0,8
40
reziproke Serumverdünnung
1,2
1
ELISA-Index
0,6
reziproke Serumverdünnung
1,2
ELISA-Index
0,8
0,2
10
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
ELISA-Index
1
ELISA-Index
ELISA-Index
1
ELISA-Index
H17, März
1,2
1,2
0
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
166
9. Anhang
9.3.4. Andere Neuweltaffen
M7
1,2
1
1
ELISA-Index
ELISA-Index
M2
1,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
40
160
10
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
9.3.5. Rhesusaffen
R2
10
40
160
640
10
mit Harnsto ff
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
640
10
mit Harnsto ff
mit Harnsto ff
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
160
640
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
R6
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
40
reziproke Serumverdünnung
ELISA-Index
ELISA-Index
0,8
0,6
0,4
0,2
0
R5
ELISA-Index
40
160
o hne Harnsto ff
R4
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
40
1,6
1,4
1,2
1
reziproke Serumverdünnung
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
R3
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
ELISA-Index
ELISA-Index
ELISA-Index
R1
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
mit Harnsto ff
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
9. Anhang
167
R9
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
40
160
10
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
10
640
640
10
40
10
mit Harnsto ff
160
o hne Harnsto ff
R18
640
mit Harnsto ff
R19
ELISA-Index
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
160
640
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
40
160
640
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
R17
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
mit Harnsto ff
reziproke Serumverdünnung
ELISA-Index
ELISA-Index
ELISA-Index
o hne Harnsto ff
ELISA-Index
160
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
640
640
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
R15
160
160
R13
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
40
40
o hne Harnsto ff
reziproke Serumverdünnung
R14
40
mit Harnsto ff
ELISA-Index
ELISA-Index
ELISA-Index
160
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
10
reziproke Serumverdünnung
R12
o hne Harnsto ff
40
640
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
reziproke Serumverdünnung
10
160
o hne Harnsto ff
R11
40
40
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
reziproke Serumverdünnung
mit Harnsto ff
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
R10
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
ELISA-Index
ELISA-Index
ELISA-Index
R7
1,6
1,4
1,2
1
mit Harnsto ff
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
10
40
160
640
reziproke Serumverdünnung
o hne Harnsto ff
mit Harnsto ff
Hannover, den 28.2.2006
Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel „Serologische Untersuchungen zur
Toxoplasmose nicht humaner Primaten“ selbstständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurde für
die statistische Auswertung die Hilfe von Herrn Dr. Rohn vom Institut für Biometrie,
Epidemiologie und Informationsverarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover in
Anspruch genommen. Die Durchführung des SFTs erfolgte von Frau Dr. Ingrid Reiter-Owona am
Institut für Medizinische Mikrobiologie, Immunologie und Parasitologie der Rheinischen FriedrichWilhelms-Universität in Bonn. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw.
Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand
hat von mir mittelbar oder unmittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im
Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation am
Institut für Parasitologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover angefertigt.
Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen
Zweck zur Beurteilung eingereicht.
Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der
Wahrheit entsprechend gemacht habe.
DANKSAGUNG
Ein herzliches Dankeschön geht an...
... Frau Prof. Dr. Astrid M. Tenter für die Überlassung des interessanten Themas sowie für die
freundliche Betreuung und gute Unterstützung bei der Anfertigung dieser Dissertation.
... Herrn Prof. Dr. Michael Böer für die gute Zusammenarbeit und die stets freundliche
Unterstützung bei der Probennahme.
... den Serengeti-Park Hodenhagen, insbesondere an die Familie Sepe, ohne deren Einverständnis
diese Dissertation nicht möglich gewesen wäre, sowie an die Tierpfleger für ihre
Hilfsbereitschaft.
... Frau Dr. Ingrid Reiter-Owona sowie an die Mitarbeiter des Instituts für Medizinische
Mikrobiologie, Immunologie und Parasitologie der Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität
in Bonn für die Untersuchung der Serumproben im SFT und die Überlassung des
T.-gondii-Stammes BK.
... die Mitarbeiter des Deutschen Primatenzentrums in Göttingen, insbesondere an Frau Dr. Annette
Schrod für die Hilfestellung beim Erlernen der Blutprobennahme sowie an Frau Dr. Kerstin
Mätz-Rensing für das Sammeln und Versenden der Serumproben.
... den Arche Noah Zoo Braunschweig, den Tier- und Freizeitpark Jaderberg sowie den
Zoologischen Garten Magdeburg, insbesondere an Herrn Pierre Grothmann, Herrn Dr.
Minnemann und Herrn Dr. M. Tanner für die gute Zusammenarbeit und für die Möglichkeit,
die Tiere auf T. gondii zu untersuchen, sowie an alle Tierpfleger für ihre Hilfsbereitschaft.
... alle Mitarbeiter des Instituts für Parasitologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover,
insbesondere an alle Mitglieder meiner Arbeitsgruppe für die stets entgegengebrachte
Hilfsbereitschaft und das gute Arbeitsklima sowie an Frau Sabine Streichan, Frau Claudia
Backenecker und Frau Amelie Kraemer für die Unterstützung bei der Probennahme.
... Herrn Dr. Karl Rohn aus dem Institut für Biometrie, Epidemiologie und Informations-
verarbeitung der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover für die Beratung.
... Herrn Norbert Schulze, der für mich einen Kescher gebastelt hat.
... die Tierärztliche Gemeinschaftspraxis Heeslingen für die spontan gewährten Urlaubstage.
... meine Eltern, die mich während der ganzen Zeit finanziell unterstützt und trotzdem nie gedrängt
haben.
... Heinke, die auch während ihrer schwersten Stunden noch an mich und an diese Dissertation
dachte.
... Christian für die große Unterstützung (insbesondere in der Endphase!) sowie an alle meine
Freunde für das Verständnis, wenn ich mal wieder keine Zeit hatte.
... den gelben Institutsbus, der trotz des lauten Geklappers nie liegengeblieben ist.