Die Proteinkinase Polo-like kinase 1 (PLK1) als neue
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Aus dem Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin der Universität zu Köln Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. J. Dötsch Die Proteinkinase Polo-like kinase 1 (PLK1) als neue therapeutische Zielstruktur in der Therapie von Hochrisiko-Neuroblastompatienten Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Felix Goeser aus Stuttgart Promoviert am 12. September 2012 2 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h. c. Th. Krieg 1. Berichterstatter: Privatdozent Dr. med. M. Fischer 2. Berichterstatter: Privatdozent Dr. med. H. C. Reinhardt Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen erhalten: Herr Privatdozent Dr. med. M. Fischer und Frau Dr. rer. nat. S. Ackermann. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den 08. Juni 2012 Felix Goeser 3 Bis auf die Durchführung der endgültigen statistischen Berechnungen der Genexpressionsdaten, der Messung der Proben für die Durchflusszytometrischen Untersuchungen und der in vivo Mausexperimente, wurden alle Messungen und Ergebnisse der in dieser Arbeit angegebenen Versuche nach entsprechender Anleitung durch Herrn Privatdozent Dr. med. M. Fischer, Frau Dr. rer. nat. S. Ackermann und Frau Dipl. biol. H. Kocak (Mitarbeiter der Forschungsgruppe von Herrn Privatdozent Dr. med. M. Fischer) von mir selbst durchgeführt, ermittelt und ausgewertet. Die abschließenden statistischen Berechnungen und Ausführungen (eigenständig durchgeführte Untersuchungen bezogen sich auf ein kleineres Patientenkollektiv) wurden von Frau Dr. med. B. Hero in der Klinik für Pädiatrische Onkologie und Hämatologie am Zentrum für Kinderheilkunde der Uniklinik Köln durchgeführt. Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Durchflusszytometrischen Untersuchungen sind von mir selbst bis zu den Messzeitpunkten durchgeführt worden. Die präparierten Proben wurden an das Allgemeine Pathologische Institut der Universität Heidelberg, Deutschland versandt und dort unter Federführung von Herrn Privatdozent Dr. rer. nat. Volker Ehemann vermessen. Die in vivo Mausexperimente wurden nach vorheriger methodischer Festlegung an der Klinik für Kinderheilkunde III des Universitätsklinikums Essen, Deutschland unter Federführung von Herrn Dr. med. J. H. Schulte durchgeführt. 4 Danksagung Zuerst möchte ich Privatdozent Dr. med. Matthias Fischer für sein mir gegenüber erbrachtes Vertrauen (welch wichtige Erfahrungen waren die Teilnahme an den Forschungskongressen und die bedeutenden Präsentationen dieser Arbeit für mich), seine Geduld und für seine Betreuung als mein Doktorvater, die er mit immer verfügbarem Rat und tatkräftiger Unterstützung ausfüllte, bedanken. Nicht minder gilt dieser Dank Dr. rer. nat. Sandra Ackermann, die mit eben so viel Mühe, Geduld und Freundlichkeit mich in das experimentelle Arbeiten im Labor einwies und mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite stand – so war die Zeit im Labor sehr angenehm und vertrauensvoll; auch und besonders für ihre detaillierte und konstruktive Durchsicht dieses Manuskriptes. Dank gilt auch Dipl. Biol. Hayriye Kocak für Rat und Hilfsbereitschaft. Yvonne Kahlert möchte ich für Ihre Unterstützung besonders bei den WesternblotAnalysen danken. Professor Dr. med. Frank Berthold gilt mein Dank, da er, damals als ich mir ein Thema für meine Doktorarbeit suchte, auf meine sture wiederholte Nachfrage doch schlussendlich einging; ansonsten wäre diese Arbeit nicht von mir durchgeführt worden. Heike Düren möchte ich als „Labormama“ danken, dass Sie immer ein Lächeln und gute Worte für mich und jeden in Ihrem „Reich“ übrig hat. Dr. med. Barbara Hero gilt Dank für die Durchführung und endgültige Berechnung der statistischen Ausführungen dieser Arbeit. Privatdozent Dr. med. Volker Ehemann möchte ich für die Messung der durchflusszytometrischen Proben danken; genauso Dr. med. Johannes H. Schulte, Dr. med. Alexander Schramm und Professor Dr. med. Angelika Eggert für die Durchführung der in vivo Mausversuche. Professor Dr. med. Hinrich Abken möchte ich an dieser Stelle auch erwähnen, da er es damals zu Beginn meines klinischen Studienabschnitts war, der mir die Faszination der molekularen Medizin in einem seiner Wahlpflichtkurse eröffnet hat. Mein herzlichster Dank gilt meiner Familie (meinen Eltern, meiner Schwester) und meiner lieben Carina – ohne Sie hätte ich nicht die Kraft und Ausdauer und vor allem den Rückhalt für diese Arbeit gehabt. Ihnen ist diese Arbeit gewidmet. 5 meiner Familie (meinen Eltern, meiner Schwester und meiner Großmutter Grosi) und Carina gewidmet 6 Inhaltsverzeichnis Glossar / Abkürzungsverzeichnis …………………………………………………... 7 I Allgemeine Einleitung I.I Das Neuroblastom …………………………………………………………. 9 I.II Derzeitige Therapie bei Hochrisikopatienten …………………………... 14 II Einleitung in die Arbeit II.I Polo-like kinase 1 (PLK1) …………………………………………………… 15 II.II Der spezifische PLK1-Inhibitor BI 2536 ………………………………… 18 III Ziele der Arbeit …………………………………………………………………….. 21 IV Publikation …………………………………………………………………………. 22 V Diskussion …………………………………………………………………………... 33 VI Zusammenfassung / Abschlussbemerkung .…………………………………… 38 Literaturverzeichnis …………………………………………………………………... 39 Lebenslauf ……………………………………………………………………………… 49 Präsentation der Arbeit / Kongressteilnahme ……….…………………………….. 50 Publikation (Quellenverweis) ……………………………………………………….. 50 7 Glossar / Abkürzungsverzeichnis 4N DNA Allel-Status (4-fach) AS Aminosäure ATP Adensosin Triphosphat CDK Cyclin dependend kinase CML Chronische myeloische Leukämie COG Children Oncology Group DLT Dosis limitierende Toxizität DNA Desoxyribonucleic acid EFS Event-free survival IC90 Inhibitorische Konzentration 90 (10% vitale Zellen) INRG International Neuroblastoma Risc Group INSS International Neuroblastoma Staging System LC50 Letale Konzentration 50 (50% tote Zellen) mRNA Messanger RNA MTD Maximal tolerable Dosis NB Neuroblastom nM nanomolar NSCLC Non small cell lung cancer OS Overall survival PAM Prediction analysis of microarrays PBD Polo Box Domäne PK Proteinkinase PKC Proteinkinase C PLK1/2/3/4 Polo-like kinase 1/ 2/ 3/ 4 RNA Ribonucleic acid siRNA Short interferring RNA TK Tyrosinkinase 8 TKR Tyrosinkinase Rezeptor TrkA/B/C Neurotrophin Rezeptor A/B/C 9 I Allgemeine Einleitung I.I Das Neuroblastom Das Neuroblastom (NB) ist der häufigste solide Tumor des Kleinkindesalters, einschließlich der Tumoren von Kindern unter 15 Jahren. Es stellt 7 bis 9% aller Malignome des Kindesalters in der Bundesrepublik Deutschland dar und tritt mit 140 Neuerkrankungen pro Jahr auf [12, 34]. Das NB ist ein Tumor des sich entwickelnden sympathischen Nervensystems, meist vom sympathischen Grenzstrang oder dem Nebennierenmark ausgehend. Es wird zu den embryonalen Tumoren gezählt und fällt histopathologisch durch unreife Neuroblasten auf, welche an neuroektodermale Zellen der Embryonalentwicklung erinnern. Das NB zeichnet sich durch eine große Heterogenität seines biologischen und klinischen Verhaltens aus. Zum einen gibt es aggressive Krankheitsverläufe mit tödlichem Ausgang, zum anderen treten spontane Regressionen oder Ausreifungen in benigne Ganglioneurome auf. Dieses Verhalten war und ist der Grund dafür, dass eine intensive wissenschaftliche Auseinandersetzung stattfindet, speziell auch im Bereich der molekularbiologischen Abläufe und Ursachen des Krankheitsgeschehens des NB. Neunzig Prozent aller diagnostizierten Kinder sind 5 Jahre alt oder jünger und das mediane Alter bei Diagnose liegt bei 15 Monaten. Klinisch stellen sich 50% der Fälle zum Zeitpunkt der Diagnose bereits mit Metastasen in entfernten Organen, meist im Knochenmark, den Knochen oder der Leber dar. Der Primärtumor befindet sich durch seinen Ursprung aus sympathischem Nervengewebe meist paravertebral im Bereich der Nebennieren, des sympathischen Grenzstrangs oder der Paraganglien. Die Bewertung der Schwere der Erkrankung kann größtenteils anhand der klinischen Parameter "Alter" und "Stadium" erfolgen. Hierbei gelten junges Alter (jünger als 18 Monate) und niedriges Stadium (INSS-Stadium 1, 2A und 2B) als prognostisch günstig. Zur Risikoeinschätzung werden heute, besonders auch für Hochrisiko-NB- Erkrankungen, zytogenetische Aberrationen bestimmt, die einen Hinweis auf den Verlauf und die Prognose der Erkrankung geben. So geht die Amplifikation eines Ab- 10 schnittes des kurzen Arms von Chromosom 2 (2p24), auf welchem das Onkogen MYCN lokalisiert ist, mit einem sehr aggressiven Verlauf einher. Genauso hat auch der Verlust von Chromosomenabschnitten sowohl auf 1p als auch auf dem langen Arm von Chromosom 11 (11q) meist einen unvorteilhaften Krankheitsverlauf zur Folge. Ein hyperdiploider oder fast triploider Karyotyp geht dagegen mit einem eher gutartigen Verlauf einher. Neben diesen zytogenetischen Veränderungen wird auch ein Zusammenhang zwischen der Expression der Neurotrophin Rezeptoren TrkA, TrkB und TrkC und dem Krankheitsverlauf angenommen. Diese Rezeptoren werden den Tyrosin-Kinase-Rezeptoren (TKR) aus der Familie der Proteinkinasen (PK) zugeordnet, wobei eine hohe Expression des TrkA- und teilweise auch des TrkC-Rezeptors mit einem gutartigen Verlauf korrelieren, hingegen in vielen aggressiven NB-Erkrankungen (Stadium 4 und MYCN-amplifiziert) oft eine TrkB-Expression nachgewiesen werden kann [4, 37, 54, 55]. Trotz all dieser Mechanismen ist bis heute unklar, weshalb sich manche Tumore spontan zurückbilden oder spontan differenzieren und andere hoch maligne und aggressive Krankheitsverläufe zeigen [4, 37, 54, 55]. Es scheinen jedoch zwei sich unabhängig voneinander entwickelnde Subtypen zu existieren. Diese Hypothese konnte in jüngster Vergangenheit durch Ergebnisse von Genexpressions-microarrayUntersuchungen gestützt werden [68]. Aufgrund der unterschiedlichen Verläufe ist es eine große Herausforderung, die verschiedenen Subtypen der Erkrankung zu unterscheiden und jeweils verlaufsorientiert zu behandeln. Das Stadium der Erkrankung zum Zeitpunkt der Diagnose wird durch das International Neuroblastoma Staging System (INSS) als einem der aussagekräftigsten prognostischen Marker definiert. Hierbei werden die Stadien 1, 2A und 2B, 3, 4 und 4S unterschieden [3]. Die Risikoabschätzung von NB-Patienten zur Therapieeinteilung erfolgt im deutschsprachigen Raum im Rahmen der deutschen Neuroblastomstudie NB2004 durch eine Stratifizierung in Gruppen mit einem „niedrigen Risiko“, „mittleren Risiko“ und „hohen Risiko“ [45]. Eine ähnliche Stratifizierung wird in den USA durch die Children Oncology Group (COG) mit den Risikogruppen „niedrig“, „mittel“ und „hoch“ vorgenommen [5]. 11 INSSStadium Definition 1 Lokalisierter Tumor mit kompletter Resektion; mit oder ohne mikroskopische Residuen; repräsentative Lymphknoten sind mikroskopisch für Tumorgewebe negativ (Lymphknoten, die mit dem Primärtumor verwachsen waren oder mit entfernt wurden, dürfen positiv sein). 2A Lokalisierter Tumor mit inkompletter Resektion; repräsentative nicht adhärente Lymphknoten sind mikroskopisch Tumor-negativ. 2B Lokalisierter Tumor mit kompletter oder inkompletter Resektion; ipsilaterale nicht adhärente Lymphknoten, die Tumor-positiv sind; kontralaterale vergrößerte Lymphknoten müssen mikroskopisch Tumor-negativ sein. 3 Unresektabler einseitiger Tumor, der über die Mittellinie infiltriert; mit oder ohne Beteilung der regionalen Lymphknoten / oder Mittellinien-Tumor mit bilateraler Ausbreitung / oder Mittellinien-Tumor mit bilateraler Ausbreitung durch Infiltration (unresezierbar) oder durch Lymphknoten-Beteilung. 4 Jeder primäre Tumor mit Ausbreitung in entfernte Lymphknoten, Knochen, Knochenmark, Leber, Haut und/oder mit Lymphknotenbeteiligung. 4S Lokalisierter Primärtumor (wie für INSS 1, 2A und 2B definiert) mit begrenzter Ausbreitung in Haut, Leber und/oder Knochenmark (begrenzt auf Säuglinge mit einem Alter < 1 Jahr). Tabelle 1: INSS-Stadienenteilung (nach Brodeur et. al. [3]) 12 Abbildung 1: Risikostratifizierung nach NB2004 (del. (Deletion), imb. (Imbalance); nach Oberthuer et al. [45] ) Um die Risikoklassifikation und die Therapiestratifikation in international angelegten Studien vergleichbar zu machen, wurde das International Neuroblastoma Risc Group (INRG)-Klassifizierungssystem entwickelt [7]. Neue Ansätze zur gezielteren Risikoklassifizierung stellen genexpressionsbasierte Microarray-Analysen dar. Mit Hilfe ausgewählter Gensignaturen und spezieller Algorithmen, zum Beispiel dem Predicition analysis of microarrays (PAM)-Algorithmus, kann der individuelle Krankheitsverlauf womöglich exakter vorhergesagt werden [10, 11, 23, 43, 44, 53, 66]. 13 INSS- Pathologische DNA- COG Stadium Alter MYCN-Status Klassifikation Ploidie (Risiko-Einteilung) 1 0-21a jeder jede jede niedrig 2 <365d jeder jede _ niedrig >365d-21a nicht-ampl. jede _ niedrig >365d-21a ampl. günstig _ niedrig >365d-21a ampl. ungünstig _ hoch <365d nicht-ampl. jede jede mittel <365d ampl. jede jede hoch >365d-21a nicht-ampl. günstig _ mittel >365d-21a nicht-ampl. ungünstig _ hoch >365d-21a ampl. jede _ hoch <365d nicht-ampl. jede jede mittel <365d ampl. jede jede hoch >365d-21a jeder jede _ hoch <365d nicht-ampl. günstig >1 niedrig <365d nicht-ampl. jede (=1) mittel <365d nicht-ampl. ungünstig jede mittel <365d ampl. jede jede hoch 3 4 4S Tabelle 2: COG-Risiko-Stratifizierung (Einteilung in: niedrig, mittel und hoch) [5] 14 I.II Derzeitige Therapie bei Hochrisikopatienten Eine exakte Differenzierung von NB-Patienten mit einem hohen Risiko von solchen mit einem geringen Risiko für einen fatalen Verlauf ist essentiell für die Auswahl der Therapiestrategie. Hochrisiko-NB-Patienten erhalten eine hoch aggressive und nebenwirkungsreiche Therapie. Bei Patienten mit geringem und mittlerem Risiko kann dagegen oftmals eine spontane Tumorregression abgewartet werden (Watch and wait-Vorgehen) beziehungsweise gute Heilungsaussichten mit einer weniger aggressiven Therapie erzielt werden. Gegenwärtig werden alle Patienten über 12 (NB2004) bzw. über 18 Monate (INRG) mit einem Neuroblastom im Stadium 4 sowie alle Patienten, deren Tumoren eine Amplifikation des Onkogens MYCN aufweisen als Hochrisikopatienten klassifiziert (siehe oben, Tabelle 1 und 2 und Abbildung 1). Dies betrifft etwa 40% der Patienten. Das derzeitige Therapie-Regime sieht für Hochrisiko-NB-Patienten eine VierfachStrategie vor. Diese besteht aus: (1) einer Induktionstherapie, (2) der chirurgischen Resektion mit einer möglichen Bestrahlung zur Vermeidung von Lokalrezidiven, (3) einer Konsolidierungstherapie mit Hochdosis Chemotherapie und anschließender autologer Stammzelltransplantation und (4) einer abschließenden Erhaltungstherapie durch eine biologische Differenzierungstherapie [13, 16, 36, 39]. Nicht wenige dieser Kinder erliegen trotz dieses multimodalen Therapieregimes schlussendlich ihrer Erkrankung. Denn auch mit diesen intensiven Therapieansätzen konnte die Langzeitüberlebensrate von 15% nur auf unzufriedenstellende 30 bis 40% gesteigert werden. Es treten jedoch sehr viel stärkere Akut- und Langzeitnebenwirkungen der hoch aggressiven Therapie auf [13, 20, 31, 38, 39]. Dies macht den Bedarf sowohl besserer Vorhersagetechniken, als auch insbesondere neuartiger wirksamerer und nebenwirkungsärmerer Therapieansätze deutlich. 15 II Einleitung in die Arbeit II.I Polo-like kinase 1 (PLK1) Die Bedeutung der Proteinkinasen für die Aktivität und Regulation einer Zelle, speziell in Form der sogenannten Zellzykluskinasen, ist bereits länger bekannt [30, 35]. Hierzu zählen auch Vertreter der Familie der so genannten Serin-/Threonin-Kinasen [30]. Basierend auf deren Bedeutung für den Lebenszyklus einer Zelle, wird der Entwicklung von spezifischen Substanzen zur Beeinflussung der durch sie ausgeübten Funktionen zunehmendes Interesse geschenkt. Ziel ist hierbei meist die Unterdrückung der Funktion der jeweiligen Serin-/Threonin-Kinase durch einen spezifisch wirksamen Inhibitor. Es existieren bereits vielfältige experimentelle Grundlagen und Ergebnisse [30]. Angriffspunkt dieser Inhibitoren ist die Mitose als zentrales Steuerungselement im Lebenszyklus einer Zelle. Es ist bekannt, dass Kinasen eine große Rolle bei der Regulation der Mitose und dem Übergang zwischen den Zellzyklusphasen spielen. Die Mitoseregulation wird den sogenannten Cyclin-abhängigen Kinasen (CDK) zugerechnet. Es zeigte sich jedoch, dass hierfür auch PK der Familie der Polo-like Kinasen (PLK) wichtig sind. Diese sind Serin-/Threonin-Kinasen und wurden erstmals in Drosophila melanogaster identifiziert. Mittlerweile konnten vier Mitglieder dieser Familie auch im Menschen identifiziert werden: PLK1, PLK2 (auch als SNK bekannt), PLK3 (auch als FNK oder PRK bekannt) und PLK4 (auch als SAK bekannt) [62]. Es konnte gezeigt werden, dass die PLK eine wichtige Rolle während der Mitose einer Zelle spielen und speziell für die Regulation der so genannten „Checkpoints“ des Zellzyklus essentiell sind [1]. PLK1 ist der am besten untersuchte Vertreter der PLK. Die Aktivität und intrazelluläre Konzentration von PLK1 sind existenziell für die Zellteilung. Es konnte mittlerweile nachgewiesen werden, dass PLK1 in mehreren Tumoren, wie zum Beispiel in Lungenund Brust-Tumoren, aber auch in anderen humanen Tumoren im Vergleich zu entsprechendem Normalgewebe überexprimiert ist und oft mit einer schlechten Prognose der Erkrankung korreliert [8, 19, 58, 62, 70]. PLK1 wurde auch in Zellen der Akuten 16 myeloischen Leukämie, in neoplastischen Mastzellen und in Multiplen Myelom-Zellen als überexprimiert nachgewiesen [48, 49, 60]. Auch in zwei NB-Zelllinien IMR-32 und KCNR konnte eine hohe Expression von PLK1 auf RNA- und Protein-Ebene nachgewiesen werden [21]. Hier konnte ebenso gezeigt werden, dass die Inhibition der PLK1Aktivität durch Short interfering RNA (siRNA) einen deutlichen Einfluss auf das Wachstum beider NB-Zelllinien hatte, indem dieses gehemmt wurde. Des Weiteren kann man PLK1 einen Einfluss in der Entstehung und der prognostischen Einschätzung von Metastasen einiger solider Tumoren zurechnen [26]. Es gibt auch Hinweise darauf, dass nicht alleine die erhöhte Expression von PLK1 einen Einfluss auf das onkogene Potential von Tumoren hat, sondern auch der Mutationsstatus von PLK1. So können gewisse Mutationen zu einer Instabilität von PLK1 führen [62]. In nicht proliferierenden Geweben sind nur sehr geringe Mengen an mRNA von PLK1, als Ausdruck einer verminderten Aktivität, nachweisbar. Dies gilt als weiterer Hinweis für die Bedeutung von PLK1 für die Mitose und die Zellzyklusprogression [52]. Dies wird bestärkt, dadurch dass PLK1 bei der Mitose einer „gesunden“ Zelle nicht derart existentiell zu sein scheint, wie bei einer genotoxisch veränderten [64, 65]. Somit geht man davon aus, dass sich PLK1 als ein Angriffspunkt für eine gezielte Tumortherapie durch Inhibition der PK-Funktion eignet. PLK1 besteht, wie auch die anderen Vertreter der PLK-Familie, aus zwei Kinasedomänen: einer N-terminal gelegenen katalytischen Domäne mit 252 Aminosäuren (AS) und der spezifischen C-terminalen Region mit der so genannten Polo-Box-Domäne (PBD), welche aus 2 Polo-Boxen (PLK1-3) oder 1 Polo-Box (PLK4) besteht, die jeweils 60-70 AS lang sind. Der PBD kommen hierbei sowohl regulierende als auch zielführende Funktionen der Kinaseaktivität zu. Die PBD fungiert als Protein-Protein Interaktionsdomäne und regelt als Phosphopeptid-Bindungsmotif die eigentliche Kinaseaktivität, indem sie normalerweise das Substratbindungszentrum der Kinase besetzt und die Aktivität inhibiert, jedoch nach Bindung ihres spezifischen Phosphopeptides das Substratbindungszentrum und somit die Kinaseaktivität freigibt [52, 62]. Der Einfluss von PLK1 auf die Mitose spiegelt sich darin wider, dass PLK1 während der G0-, G1- und S-Phase eine niedrige Aktivität aufweist, diese jedoch in der G2Phase durch eine starke Erhöhung der Proteinkonzentration ansteigt und während der 17 M-Phase ihren Höhepunkt findet. Hierbei wurde ersichtlich, dass insbesondere PLK1 eine tragende Rolle bei der Beendigung eines G2-Zellzyklusarrestes mit einem resultierenden G2/M-Übergang auf dem Boden eines DNA-Schadens spielt [64, 65]. PLK1 ermöglicht durch die Interaktion mit weiteren Zellzyklusproteinen einen CheckpointRelease, durch Überwindung des so genannten DNA-Schaden-Checkpoints [64, 65]. Dieser ermöglicht durch einen Zellzyklusarrest entweder die Reparatur der beschädigten DNA oder führt bei deren Misserfolg die Zelle in Apoptose und ist somit existenziell für die genomische Integrität einer Zelle. Hieraus lässt sich ableiten, dass PLK1 eine wichtige Funktion beim Zellzyklusübergang in die M-Phase und deren Durchlaufen spielt [62]. Es konnte auch gezeigt werden, dass Mutationen von PLK1 zu Spindeldefekten und späten Mitosefehlern, wie zum Beispiel Fehlern bei der Zellseptierung führen. Dies wird durch die spezifische intrazelluläre Lokalisation von PLK1 erklärt. PLK1 konnte wie folgt intrazellulär lokalisiert werden: an den Centrosomen, der äquatorialen Spindelzone von Mitosechromosomen und an den Kinetochoren, beziehungsweise der Centromer-Region von mitotischen Zellen [62]. Eine Inaktivierung der PLK1-Aktivität resultiert in einem Metaphase-Arrest und der Ausbildung von hantelförmigen Chromatin-Strukturen [62]. Neben dem Nachweis der Überexpression in mehreren Tumorentitäten bietet sich PLK1 auch durch die folgenden Eigenschaften als Zielstruktur einer Therapie an: Die Überexpression und die daraus resultierende Kinaseüberaktivität resultiert in Multinukleationen und ermöglicht mitotischen Zellen, den G2-Arrest nach einem DNASchaden zu überwinden (Apoptoseresistenz, siehe oben). Außerdem spielt PLK1 in der Inaktivierung des hierbei involvierten Tumorsuppressor-Gens P53 eine Rolle [32]. Bei der Untersuchung möglicher Ansatzpunkte einer spezifischen Inhibition der PKAktivität zeigte sich, dass PLK1 hierfür zwei mögliche Zielstrukturen liefert: Einmal die N-terminale Kinasedomäne, welche eine relativ große Ähnlichkeit zu anderen Kinasedomänen der Familie der PK aufweist, und zum anderen die spezifische ProteinProtein Interaktionsdomäne in Form der PBD. Erste Versuche der Inhibition der PLK1-Aktivität wurden mit Antikörpern in Zelllinien durchgeführt und hierbei wurde die existenzielle Bedeutung von PLK1 für die korrek- 18 te Zellteilung deutlich, im Besonderen für den korrekten Aufbau und die Koordinierung der Centrosomen und Mikrotubuli [29]. Die Inhibition von PLK1 durch siRNA zeigte eine Abschwächung der Zellzyklus-Progression in dem Maße, dass die Proliferation deutlich reduziert war und die Apoptoserate in mehreren Tumor-Zelllinien deutlich anstieg, wohingegen in nicht-entarteten Zelllinien lediglich eine ZellzyklusVerlangsamung festzustellen war [57]. Ein weiterer Weg, die PLK1-Aktivität abzuschwächen, stellt die ATP-kompetitive Hemmung der Kinaseaktivität durch Small molecule-Inhibitoren dar, die mit ATP um die Bindung an der Serin-/ThreoninKinasedomäne konkurrieren. Der erste Vertreter dieser Substanzgruppe, welcher PLK1 ATP-kompetitiv inhibiert, ist Scytonemin, ein natürliches Produkt von Cyanobakterien. Die PK CDK1, CHK1, MYT und PKC werden durch Scytonemin ebenfalls gehemmt [59]. Eine weitere Substanz ist das Funasteroid Wortmannin, welches neben PLK1 auch die PI3K-Kinase inhibiert [33]. Mittlerweile sind Versuche mit mehreren spezifischen PLK1-Inhibitoren (siehe die unten aufgeführten Substanzen), wie zum Beispiel BI 2536, BI 6727 und GSK461364, bis in klinische Phase II-Studien fortgeschritten [6]. Dabei befindet sich BI 2536 in Phase II-Studien (siehe unten, II.II Der spezifische PLK1-Inhibitor BI 2536); BI-6727, GSK461364, ON 019190.Na und HMN-214 befinden sich in Phase IStudien; TAL und NMS-1 sind am Übergang von der präklinischen Phase zu Phase IStudien; DAP-81, CYC-800 und LC-445 sind präklinisch [52]. II.II Der spezifische PLK1-Inhibitor BI 2536 In mehreren präklinischen und klinischen Studien zeigte sich das DihydropteridinonDerivat BI 2536 (Boehringer Ingelheim, Deutschland) als eine wirksame Substanz zur Inhibition der PLK1-Aktivität. BI 2536 inhibiert ATP-kompetitiv die enzymatische Aktivität von PLK1 mit einer durchschnittlichen IC50 von 0,8 nM (bezogen auf mehrere humane Krebs-Zelllinien, siehe unten) und hat eine sehr hohe Selektivität für PLK1 (>1000-fach gegenüber anderen PK) [58]. Auch die anderen Vertreter der Polo-like kinase-Familie werden durch BI 2536 gehemmt: bei PLK2 beträgt die IC50 3,5nM und bei PLK3 9,0 nM - und ist somit 4-mal, respektive 11-mal schwächer als bei PLK1; bezogen 19 auf PLK4 ist die Wirkung von BI 2536 1000-fach schwächer als bei den übrigen PLKVertretern [24, 58]. Auch PLK 2/3/4 sind an der Regulation des Zellzyklus beteiligt [63]. BI 2536 blockiert auch die PLK1-Aktitvität der Isoformen in der Maus und in der Ratte mit der gleichen Potenz, die bei der humanen Form von PLK1 festgestellt werden konnte [58]. Mit BI 2536 behandelte Zellen zeigen verschiedene intrazelluläre Veränderungen während ihrer Mitose, wie zum Beispiel einen Arrest in der Prometaphase oder eine abnormale Anzahl mitotischer Spindeln und fehlerhafte Anordnung der Chromosomen, was die Einleitung von Apoptose zur Folge haben kann [14, 21, 52, 58]. In HeLa-Zellen hat eine Behandlung mit 60nM BI 2536 einen Effekt, der mit einer PLK1-Depletion durch siRNA vergleichbar ist: Es zeigen sich eine Akkumulation tetraploider Zellen (G2/M-Phasen-Arrest) mit 4-fachem DNA-Gehalt (4N-DNA) und einem Anstieg der Apoptoserate [58]. In mehreren Tumorzelllinien (unter anderem Mamma-, Kolon-, Bronchial-, Pankreasund Prostata-Karzinom, malignes Melanom und hämatologische Krebszelllinien) konnte eine Wirksamkeit von BI 2536 in der Hemmung der Tumorzell-Proliferation nachgewiesen werden. Dies war unabhängig von ihrem Ursprungsgewebe und ihrem Status onkogener Veränderungen und/oder Mutationen, wie dies zum Beispiel in Zelllinien mit onkogenen Mutationen in Tumorsuppressorgenen oder Onkogenen, wie zum Beispiel RB1, TP53, PTEN und KRAS gezeigt werden konnte. Die LC50 variierte hierbei zwischen 2nM und 25nM; bei 100nM wurde jeweils ein kompletter mitotischer Arrest beobachtet [58]. Dies zeigte sich auch bei in vitro Untersuchungen von anaplastischen Schilddrüsen Karzinom-Zelllinien, wo eine BI 2536-Behandlung ebenfalls zu einem Zellzyklusarrest in der Promethaphase mit einem resultierenden 4N-DNAGehalt führte [42]. Hierbei betrug die LC50 zwischen 1,4nM und 5,6nM für die einzelnen Zelllinien. Die Selektivität von BI 2536 für die anaplastischen Schilddrüsenkarzinomzellen konnte weiter durch die Behandlung von Normalgewebe (nicht entartete Schilddrüsenzellen) und anschließendem Wirksamkeitsvergleich gezeigt werden [42]. In Tumor-Xenograft-Versuchen von immundefizienten Mäusen mit Colon-, Pankreasund nichtkleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC)-Modellen konnte eine Tumor- 20 wachstumshemmung und/oder eine Regression des Tumors durch intravenöse Injektion von BI 2536 nachgewiesen werden [58]. In einer ersten Phase-I Studie wurde bei Patienten mit fortgeschrittenen soliden Tumoren (colorectal, renal, Sarkome, Pankreas, Prostata und andere) eine maximal tolerable Dosis (MTD) von 200mg erreicht, wobei die hauptsächliche Dosis-limitierende Toxizität (DLT) in reversiblen Neutropenien bestand [40]. Die Hauptnebenwirkungen bestanden als Übelkeit, Müdigkeit und Appetitlosigkeit. Es konnte eine hohe TotalClearance und Gewebsdistribution nachgewiesen werden, ohne dass kumulativtoxische Wirkungen zu beobachten waren [40]. Weitere Phase-I Studien haben diese Ergebnisse bestätigt [18, 46]. Mittlerweile sind bereits mehrere Phase-II Studien mit BI 2536 abgeschlossen und weitere werden durchgeführt [6]. Diese konnten zum Teil die Ergebnisse aus den Phase-I Studien zum Beispiel bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Brochialkarzinom (NSCLC), fortgeschrittenem Pankreaskarzinom und Hormon-refraktärem Prostatakarzinom bestätigen. Die Ergebnisse dieser Studien in Bezug auf Ansprechen der Therapie und Überleben deuten positive Tendenzen an und waren der jeweiligen Vergleichstherapie und erfolgten Vortherapien entsprechend oder überlegen [15, 22, 41, 51, 56]. 21 III Ziele der Arbeit Ziel dieser Arbeit ist die präklinische Evaluation von PLK1 als therapeutische Zielstruktur bei Hochrisiko-NB-Erkrankungen. Hochrisiko-NB-Patienten haben auch heute noch eine schlechte Überlebenschance, so dass neue Therapie-Strategien dringend benötigt werden. PLK1 konnte in einer Vielzahl humaner Tumore im Vergleich zu entsprechendem Normalgewebe als überexprimiert nachgewiesen werden. Die spezifische Inhibition von PLK1 führt zu verminderter Proliferation und zu Zellzyklusarrest. BI 2536 hemmt spezifisch und effektiv die Aktivität von PLK1. In PLK1überexprimierenden Zelllinien und Geweben zeigt sich durch BI 2536 sowohl in vitro als auch in vivo ein deutlicher anti-tumoröser Effekt durch Zellzyklusarrest und Hemmung der Zellproliferation, die zu einer Suppression von Tumorbildung und Tumorwachstum führen. Zu Anfang sollte die statistische Korrelation zwischen PLK1 Genexpressions-Werten mit prognostischen Markern des NB und mit dem klinischen Verlauf von NB-Patienten in einem großen Kollektiv untersucht werden. Anschließend sollte durch WesternblotAnalysen die PLK1-Expression auf Proteinebene in parentalen NB-Zelllinien und in primären NB-Erkrankungen untersucht werden. Die Untersuchungen zur Wirksamkeit des spezifischen PLK1-Inhibitors BI 2536 sollten in vitro und in vivo durchgeführt werden. Die in vitro Experimente (Zellkultur und durchflusszytometrische Untersuchungen) sollten den Effekt von BI 2536 sowohl auf die Wachstumseigenschaften als auch auf den Zellzyklus verschiedener parentaler NB-Zelllinien untersuchen. Bei den in vivo Experimenten sollte der Effekt von BI 2536 auf das Wachstum von NB-Xenografts in immundeffizienten Mäusen untersucht werden. Dies sollte sowohl im Hinblick auf die Suppression der Tumorbildung als auch auf die Suppression des Tumorwachstums bereits zuvor bestehender Tumoren erfolgen. 22 IV Publikation 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 V Diskussion Hochrisiko-Neuroblastomerkrankungen und PLK1 Die Therapie von Hochrisiko-NB-Patienten stellt bis heute eine große Herausforderung dar. Trotz eines multimodalen Therapieansatzes mit jeweils annähernd ausgereizten Einzelkomponenten ist der Therapieerfolg bis heute nicht zufrieden stellend. Hierbei werden eine hochdosierte Induktionschemotherapie, Operation, Bestrahlung und myeloablative Chemotherapie mit konsekutiver autologer Knochenmark-Transplantation miteinander kombiniert [39]. Zur Remissionerhaltung werden spezifische Immuntherapien und Therapien mit Retinoiden verwendet [39]. Die Therapie von HochrisikoNB-Patienten konnte nicht in dem gleichen Maße optimiert werden wie die Behandlung der niedrigen und mittleren Risikogruppen, die insbesondere von einer besseren Stratifizierung und strengeren Therapieeinschlusskriterien mit häufiger eingesetztem Watch-and-wait-Verhalten profitieren. Auch wenn Verbesserungen bei der Therapie der Hochrisiko-NB-Erkrankungen erzielt wurden, so ist die Gesamtüberlebensrate heute immer noch weniger als 40% [39]. Vor allem in der Therapie von pädiatrischen Krebserkrankungen spielen die durch die hochdosierten und unselektiven zytotoxischen Therapien verursachten Akut- und Langzeitnebenwirkungen eine bedeutsame Barriere für eine erfolgreiche Therapie. Dies begründet sich vor allem darauf, dass die einzelnen Substanzen meist mit ihrer jeweiligen Maximaldosis ausgereizt werden müssen. Hierbei sind im Besonderen die Zweitneoplasien, wie zum Beispiel Leukämien und Sarkome, aber auch akute Therapiekomplikationen durch schwerwiegende Infektionen zu nennen [17, 28]. Da diese unvermeidbare Folgen der nicht zielgerichteten konventionellen Chemo- und Bestrahlungstherapie darstellen, wird der Bedarf für neue, vor allem zielgerichtete und nebenwirkungsärmere Ansätze in der Therapie von Hochrisiko-NB-Patienten deutlich. PLK1 als therapeutische Zielstruktur: Wie bereits ausführlich beschrieben (siehe II.I Polo-like kinase 1), stellt PLK1 als Serin-/Threonin-Kinase, die Einfluss auf den Zellzyk- 34 lus nimmt, ein geeignetes Ziel in der Therapie von malignen Erkrankungen dar. Es besteht ein immer breiter werdendes und weiter fortschreitendes Interesse, die Bedeutung von PLK1 für die Entstehung und die Aufrechterhaltung von humanen Tumoren, aufzudecken [8, 19, 52, 62, 70]. Eine erhöhte Expression von PLK1 im Vergleich zu Normalgewebe wurde in einer Vielzahl humaner Tumorentitäten nachgewiesen [8, 58]. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Expression von PLK1 mit dem metastatischen Potential und der Prognose von Tumoren korreliert [26]. Gleichzeitig sind mehrere Substanzen verfügbar, welche die Aktivität von PLK1 spezifisch und wirksam inhibieren [52, 62]. Sowohl in vitro als auch in vivo führt die Inhibition von PLK1 zu einer deutlichen Hemmung des Wachstums der untersuchten humanen Tumorzelllinien und Tumor-Xenografts [42, 50, 58]. Die klinische Wirksamkeit dieser Inhibition durch den spezifischen PLK1-Inhibitor BI 2536 konnte bereits in klinischen Phase-I und Phase-II Studien bestätigt werden und/oder wird in diesen derzeit untersucht [6, 15, 18, 22, 40, 41, 46, 51, 56, 67]. PLK1 spielt eine wichtige Rolle im Bereich der Regulation der Zellzyklus-Checkpoints und des Zellspindelapparates während der Mitose und die Inhibition der PLK1Aktivität führt zu Zellzyklusarrest [29, 57, 70]. Auf diesem Wege könnten durch eine spezifische Inhibition schwerwiegende Nebenwirkungen, wie sie in der Anwendung konventioneller Chemotherapeutika und Bestrahlungstherapien als Folge deren unspezifischen Wirkungsmechanismusses entstehen, verhindert werden. Diese Schlussfolgerung beruht auch auf der Erkenntnis, dass sich PLK1 in den attackierten Geweben überexprimiert darstellt und diese somit sensibler und empfänglicher reagieren sollten als dies für vergleichbares Normalgewebe anzunehmen ist. PLK1 und das Neuroblastom: Es konnte gezeigt werden, dass mehrere Gene, die in Prozessen der Zellteilung und der Chromosomen-Segregation eine Rolle spielen, in Hochrisiko-NB-Erkrankungen (INSS Stadium 4 und Alter >18 Monate oder MYCNamplifiziert) überexprimiert sind [27]. Dies konnte hierbei auch für PLK1 gezeigt werden. Die Assoziation der PLK1-Expression mit Prognosemarkern und klinischen Verläufen wurde in der vorliegenden Arbeit in einem großen NB-Kollektiv genauer unter- 35 sucht. Es konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte PLK1-Expression signifikant mit ungünstigen prognostischen Markern im NB (Alter >18 Monate, INSS Stadium 4, MYCN-Amplifikation, ungünstige Klassifikation mit einem genexpressionsbasierten Klassifikator (PAM)) und mit einem schlechten Krankheitsverlauf (Event-free survival, EFS) und vermindertem Gesamtüberleben (Overall survival, OS) assoziiert sind. Die statistischen Korrelationsanalysen zwischen den PLK1-Expressionswerten und dem EFS, beziehungsweise dem OS, lassen außerdem zu der Annahme kommen, dass ein kritisches Niveau in der PLK1-Aktivität existiert, ab dem PLK1 einen direkten Einfluss auf das maligne Wachstum von soliden Tumoren ausübt, wie dies bereits für andere Tumorentitäten postuliert wurde [25, 69]. Trotzdem bleibt die Bedeutung von PLK1 für die Risikoeinschätzung bei NB-Erkrankungen fraglich, da die derzeit hierzu eingesetzten Strategien und neuartige DNA- und RNA-basierte prognostische Klassifizierungssysteme, auch ohne auf PLK1 zurück zu greifen, sehr exakt erscheinen [10, 11, 23, 43, 44, 53, 66]. In den anschließenden proteinanalytischen Untersuchungen mit Westernblot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die zuvor gemessenen RNA-Expressions-Werte von PLK1 gut mit den endogenen Proteinlevels der untersuchten Stichproben korrelieren. Hieraus lässt sich ableiten, dass mit der Bestimmung von PLK1-mRNA eine zugängliche Messgröße zur Beurteilung der PLK1-Expression und des endogenen Proteinniveaus von PLK1 besteht. Auch konnte in allen in dieser Arbeit untersuchten NB-Zelllinien eine hohe endogene PLK1-Expression auf Proteineben nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse decken sich mit Resultaten der Arbeit von Hu et al. [21], in der unter anderem auch in NB-Zelllinien eine erhöhte RNA-Expression von PLK1 und eine ausgeprägte PLK1-Expression auf Proteineben nachgewiesen wurden. BI 2536 und das Neuroblastom: In den letzten Jahren konnten große Fortschritte im Verständnis von pathogenetisch ursächlichen und verlaufsbestimmenden Faktoren für das NB verzeichnet werden. Diese haben zu einer weiter verbesserten Risikostratifizierung (siehe oben) mit verbesserten klinischen Verläufen und verbessertem Gesamtüberleben beigetragen. Dies trifft, wie bereits zuvor erwähnt, jedoch zu einem großen Teil nur für lokalisierte, nicht aggressive und insbesondere nicht für Hochrisiko- 36 Verläufe des NB zu. Zu neuen Therapieansätzen trugen diese Erkenntnisse bisher nicht bei. Und so konnten trotz der breiten Verbesserungen im Verständnis des NB kaum Zielstrukturen identifiziert werden, die für einen neuartigen und zielgerichteten Therapieansatz geeignet sind. Ausgehend von den Erfolgen des PK-Inhibitors Imatinib in der Therapie der Chronisch myeloischen Leukämie (CML) zu Beginn des 21. Jahrhunderts, spielt der therapeutische Ansatz mit Small molecule-PK-Inhibitoren eine immer größere Bedeutung in der Therapie von adulten Neoplasien. Zu Beginn diente dieser Therapieansatz meist nur als Zweit- oder Drittlinien-Therapie nach Versagen der konventionellen Therapieschemata. Im Gegensatz hierzu steht die Therapie von CML-Patienten, wo die durch Imatinib inhibierte BCR-ABL-PK die pathogenetische Grundlage der Erkrankung selbst darstellt. Mittlerweile finden Small molecule-PK-Inhibitoren jedoch in der Therapie einer immer weiter fortschreitenden Anzahl von Tumorentitäten und Krankheitsstadien Verwendung [2, 61]. Diese Entwicklung beschränkt sich bisher jedoch weitestgehend auf das Gebiet der Therapie adulter Tumoren. In der pädiatrischen Onkologie steht diese neue Therapierichtung noch in den grundlegenden Anfängen. So wurden zielgerichtete Therapien bisher nur sehr vereinzelt im NB untersucht [9, 13]. Derzeit werden einige Studien durchgeführt, die die Wirksamkeit der folgenden Small molecule-PK-Inhibitoren im NB untersuchen sollen: mit den nicht-selektiven Kinaseinhibitoren Gefitinib und CEP-701, dem ALK-Inhibitor PF-02341066 und dem Aurora A-Kinaseinhibitor MLN8237 [6]. Wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, stellt PLK1 eine mögliche Struktur für eine zielgerichtete Therapie im NB und der selektive PLK1-Inhibitor BI 2536 eine Substanz für diese Therapie dar, da sowohl in vitro als auch in vivo eine eindeutige antitumoröse Wirksamkeit von BI 2536 im NB nachgewiesen werden konnte. So lag die Wirksamkeit (LC50) in allen untersuchten NB-Zelllinien im niedrigen nanomolaren Bereich. Gleichzeitig sind die erforderlichen Konzentrationen von BI 2536 für die als therapiewirksam angesehenen IC90-Level in einer Konzentrations-Bandbreite, wie sie nach intravenöser Applikation von 200mg BI 2536 in Phase-I und Phase-II Studien erreicht wurden [40, 51]. Die Inhibition von PLK1 durch BI 2536 führte in NB-Zelllinien zu einer starken Abnahme lebender Zellen und zu reduzierter Proliferation. Eine Kon- 37 zentration von 25nM BI 2536 führte in den untersuchten NB-Zelllinien zu einem G2/M-Phasen Zellzyklusarrest und zu anschließendem Zelltod. Dies deckt sich gut mit Ergebnissen der PLK1-Inhibition durch BI 2536 in Zelllinien anderer Tumorentitäten [42, 58]. In in vivo Versuchen mit NB-Xenograft-Modellen in nu/nu-Mäusen mit den NB-Zelllinien Kelly und SK-N-AS zeigte BI 2536 sowohl eine Suppression der Tumorbildung, als auch eine Suppression des Wachstums bereits bestehender Tumoren in den immundefizienten Mäusen. Zusammenfassend zeigen die in vitro und die in vivo Ergebnisse einen signifikanten antitumorösen Effekt von BI 2536 bei den untersuchten NB-Zelllinien und NB-Xenografts. Schlussfolgerung aus den Ergebnissen: In Hochrisiko-NB konnte ein erhöhtes PLK1Expressionsniveau im Vergleich zu NB mit niedrigem und mittlerem Risiko nachgewiesen werden. Das mRNA-Expressionsniveau spiegelt auch die endogene Expression von PLK1 auf Proteinebene wider. Die Inhibition von PLK1 durch BI 2536 führte zu einer signifikanten Verminderung des NB-Zellwachstums und zu Zellzyklusarrest in vitro und zur Suppression des Wachstums und der Tumorbildung von NB-Xenografts in vivo. Dies weist auf eine Bedeutung von PLK1 in der Tumorprogression des NB hin und eröffnet die Perspektive, dass PLK1 eine mögliche Struktur für einen neuen zielgerichteten Therapieansatz bei Hochrisiko-NB-Erkrankungen darstellen kann. Einige Phase-I und Phase-II Studien in verschiedenen adulten Tumorentitäten mit BI 2536 haben gezeigt, dass diese Therapie generell gut verträglich ist und dass es in 30 bis 40% der Fälle zu einer Krankheitsstabilisierung gekommen ist [15, 18, 22, 40, 41, 46, 51, 56, 67]. In diesen Arbeiten wurde jedoch auch angemerkt, dass BI 2536 möglicherweise eine für die endgültige klinische Anwendung unvorteilhafte Pharmakokinetik aufweist, was den Bedarf neuer Substanzen auf der Basis der selektiven Inhibition von PLK1 verdeutlicht. Diese Substanzen sind derzeit in der Entwicklung und werden zum Teil bereits klinisch untersucht [6, 47, 50, 52]. Der Einsatz klinisch anwendbarer PLK1Inhibitoren könnte zu einer Verbesserung der bisher erzielten unzufriedenstellenden Therapieergebnisse bei Hochrisiko-NB-Patienten beitragen. 38 VI Zusammenfassung / Abschlussbemerkung Bis heute ist der Therapieerfolg von Hochrisiko-NB-Patienten unzufriedenstellend. Es bedarf der Entdeckung neuer Strukturen, die für einen spezifischen und zielgerichteten Therapieansatz bei Hochrisiko-NB-Erkrankungen dienen können. Die Serin- /Threonin-Kinase PLK1 erfüllt wichtige Aufgaben in der Regulation des Zellzyklus. PLK1 ist in einer Vielzahl humaner Tumoren überexprimiert und ihre Inhibition führt zu verminderter Proliferation, Zellzyklusarrest und Zelltod. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine erhöhte Expression von PLK1 beim NB mit ungünstigen Prognosemarkern und mit einem schlechtem klinischen Verlauf sowie einem reduzierten Gesamtüberleben korreliert. Der spezifische PLK1-Inhibitor BI 2536 zeigte sowohl in vitro als auch in vivo einen eindeutigen anti-tumorösen Effekt auf alle untersuchten NB-Zelllinien und NB-Xenografts durch Hemmung der Zellproliferation und Zellzyklusarrest und durch Suppression von Tumorbildung und Tumorwachstum. Insgesamt lassen die Ergebnisse dieser Arbeit zu dem Schluss kommen, dass mit PLK1 eine neue potentiell therapierelevante Struktur im NB gefunden werden konnte und dass sich diese mit BI 2536 effektiv inhibieren lässt. Diese Ergebnisse können als Ausgangspunkt für die Entwicklung einer neuen zielgerichteten Therapie bei HochrisikoNB-Patienten dienen. Hierbei ist eine PLK1-Inhibition sowohl als Monotherapie mittels BI 2536 oder eines anderen, spezifischen PLK1-Inhibitors, als auch in Kombination mit einer konventionellen Chemotherapie und/oder Radiotherapie denkbar. Ein nächster Schritt hierbei wäre eine erste klinische Evaluation/Prüfung eines spezifischen PLK1Inhibtors in einer Phase-I Studie bei Hochrisiko-NB-Patienten im Rezidiv, für die keine anderen Therapieoptionen mehr in Frage kommen. Der Bedarf für die Entwicklung neuartiger Therapien für Hochrisiko-NB-Patienten ist aufgrund der schlechten Überlebenschancen dieser Patienten weiterhin groß, da die konventionellen Therapieoptionen weitestgehend ausgeschöpft sind und zu schwerwiegenden und oftmals therapielimitierenden Akut- und Langzeitnebenwirkungen führen. 39 Literaturverzeichnis 1 Archambault V, Glover DM.: Polo-like kinases: conservation and divergence in their functions and regulation. (Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Apr;10(4):265-75.) 2 Berz D, Wanebo H.: Targeting the growth factors and angiogenesis pathways: small molecules in solid tumors. (J Surg Oncol. 2011 May 1;103(6):574-86. doi: 10.1002/jso.21776.) 3 Brodeur GM, Pritchard J, Berthold F, Carlsen NL, Castel V, Castelberry RP, De Bernardi B, Evans AE, Favrot M, Hedborg F, et al.: Revisions of the international criteria for neuroblastoma diagnosis, staging, and response to treatment. 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(Oncologist. 2009 May 27. [Epub ahead of print]) 53 Schramm A, Schulte JH, Klein-Hitpass L, Havers W, Sieverts H, Berwanger B, Christiansen H, Warnat P, Brors B, Eils J, Eils R, Eggert A.: Prediction of clinical outcome and biological characterization of neuroblastoma by expression profiling. (Oncogene. 2005 Nov 24;24(53):7902-12.) 54 Schwab M, Westermann F, Hero B, Berthold F.: Neuroblastoma: biology and molecular and chromosomal pathology. ( Lancet Oncol. 2003 Aug;4(8):472-80.) 55 Schwab M.: Human neuroblastoma: from basic science to clinical debut of cellular oncogenes. (Naturwissenschaften. 1999 Feb;86(2):71-8.) 56 Sebastian M, Reck M, Waller CF, Kortsik C, Frickhofen N, Schuler M, Fritsch H, GaschlerMarkefski B, Hanft G, Munzert G, von Pawel J.: The efficacy and safety of BI 2536, a novel Plk-1 inhibitor, in patients with stage IIIB/IV non-small cell lung cancer who had relapsed after, or failed, chemotherapy: results from an open-label, randomized phase II clinical trial. (J Thorac Oncol. 2010 Jul;5(7):1060-7.) 57 Spänkuch-Schmitt B, Bereiter-Hahn J, Kaufmann M, Strebhardt K.: Effect of RNA silencing of polo-like kinase-1 (PLK1) on apoptosis and spindle formation in human cancer cells. (J Natl Cancer Inst. 2002 Dec 18;94(24):1863-77.) 47 58 Steegmaier M, Hoffmann M, Baum A, Lénárt P, Petronczki M, Krssák M, Gürtler U, GarinChesa P, Lieb S, Quant J, Grauert M, Adolf GR, Kraut N, Peters JM, Rettig WJ.: BI 2536, a potent and selective inhibitor of polo-like kinase 1, inhibits tumor growth in vivo. (Curr Biol. 2007 Feb 20;17(4):316-22. Epub 2007 Feb 8.) 59 Stevenson CS, Capper EA, Roshak AK, Marquez B, Eichman C, Jackson JR, Mattern M, Gerwick WH, Jacobs RS, Marshall LA.: The identification and characterization of the marine natural product scytonemin as a novel antiproliferative pharmacophore. (J Pharmacol Exp Ther. 2002 Nov;303(2):858-66.) 60 Stewart HJ, Kishikova L, Powell FL, Wheatley SP, Chevassut TJ.: The polo-like kinase inhibitor BI 2536 exhibits potent activity against malignant plasma cells and represents a novel therapy in multiple myeloma. (Exp Hematol. 2010 Dec 22. [Epub ahead of print]) 61 Stoffel A.: Targeted therapies for solid tumors: current status and future perspectives. (BioDrugs. 2010 Oct 1;24(5):303-16. doi: 10.2165/11535880-000000000-00000.) 62 Strebhardt K, Ullrich A.: Targeting polo-like kinase 1 for cancer therapy. (Nat Rev Cancer. 2006 Apr;6(4):321-30.) 63 Van de Weerdt BC, Medema RH.: Polo-like kinases: a team in control of the division. (Cell Cycle. 2006 Apr;5(8):853-64. Epub 2006 Apr 17.) 64 Van Vugt MA, Brás A, Medema RH.: Polo-like kinase-1 controls recovery from a G2 DNA damage-induced arrest in mammalian cells. (Mol Cell. 2004 Sep 10;15(5):799-811.) 65 Van Vugt MA, Gardino AK, Linding R, Ostheimer GJ, Reinhardt HC, Ong SE, Tan CS, Miao H, Keezer SM, Li J, Pawson T, Lewis TA, Carr SA, Smerdon SJ, Brummelkamp TR, Yaffe MB.: A mitotic phosphorylation feedback network connects Cdk1, Plk1, 53BP1, and Chk2 to inactivate the G(2)/M DNA damage checkpoint. (PLoS Biol. 2010 Jan 26;8(1):e1000287.) 48 66 Vermeulen J, De Preter K, Naranjo A, Vercruysse L, Van Roy N, Hellemans J, Swerts K, Bravo S, Scaruffi P, Tonini GP, De Bernardi B, Noguera R, Piqueras M, Cañete A, Castel V, Janoueix-Lerosey I, Delattre O, Schleiermacher G, Michon J, Combaret V, Fischer M, Oberthuer A, Ambros PF, Beiske K, Bénard J, Marques B, Rubie H, Kohler J, Pötschger U, Ladenstein R, Hogarty MD, McGrady P, London WB, Laureys G, Speleman F, Vandesompele J.: Predicting outcomes for children with neuroblastoma using a multigene-expression signature: a retrospective SIOPEN/COG/GPOH study. (Lancet Oncol. 2009 Jul;10(7):663-71. Epub 2009 Jun 8.) 67 Wäsch R, Hasskarl J, Schnerch D, Lübbert M.: BI_2536--targeting the mitotic kinase Pololike kinase 1 (Plk1). (Recent Results Cancer Res. 2010;184:215-8.) 68 Wei JS, Greer BT, Westermann F, Steinberg SM, Son CG, Chen QR, Whiteford CC, Bilke S, Krasnoselsky AL, Cenacchi N, Catchpoole D, Berthold F, Schwab M, Khan J.: Prediction of clinical outcome using gene expression profiling and artificial neural networks for patients with neuroblastoma. (Cancer Res. 2004 Oct 1;64(19):6883-91.) 69 Wolf G, Elez R, Doermer A, Holtrich U, Ackermann H, Stutte HJ, Altmannsberger HM, Rübsamen-Waigmann H, Strebhardt K.: Prognostic significance of polo-like kinase (PLK) expression in non-small cell lung cancer. (Oncogene. 1997 Feb 6;14(5):543-9.) 70 Yuan J, Hörlin A, Hock B, Stutte HJ, Rübsamen-Waigmann H, Strebhardt K.: Polo-like kinase, a novel marker for cellular proliferation. (Am J Pathol. 1997 Apr;150(4):1165-72.) 49 Lebenslauf Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht. 50 Präsentationen der Arbeit / Kongressteilnahme Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden im Rahmen folgender Forschungsveranstaltungen von mir persönlich vorgestellt: 06/2010 Als Oral Report auf dem ANR (Advance in Neuroblastoma Research) 2010 (Internationaler Neuroblastomkongress) in Stockholm, Schweden 07/2010 Als Oral Report auf der 23. Jahrestagung der Kind-Philipp-Stiftung für Leukämieforschung in Wilsede, Deutschland Publikation (Quellenverweis) ( Siehe IV. Publikation): Ackermann S, Goeser F, Schulte JH, Schramm A, Ehemann V, Hero B, Eggert A, Berthold F, Fischer M.: Polo-like kinase 1 is a therapeutic target in high-risk neuroblastoma. (Clin Cancer Res. 2011 Feb 15;17(4):731-41. Epub 2010 Dec 17.)
