Analyse des Einflusses von Lebensmittel und Wirt auf
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Analyse des Einflusses von Lebensmittel und Wirt auf die Virulenz bakterieller Erreger zur Verbesserung der Lebensmittelsicherheit Cornelia Deeg und Erwin Märtlbauer Department for Veterinary Sciences Lebensmittelinfektionen EFSA Journal 2016;14(12):4634 Proteomics/Massenspektrometrie: Fortschreitende Identifikationsraten Polat AN, Özlü N. Towards single-cell LCMS phosphoproteomics. Analyst. 2014 Oct 7;139(19):4733-49. 2017 Q Exactive HF 40 Aminosäuren pro Tag aus 50 ng Protein identifizierbar 11354 Peptide in 4h aus 50 ng Protein HeLa-Lysat Stefanie Hauck Mit MS aus 2DE: 1 Spot, 2h = 1 Protein Standard 400-800 Spots, keine Membranproteine ≥ 8000 Proteine in 2h aus primären Zellen, label-freie Analyse Proteomics und Lebensmittelinfektionserreger Besseres Verständnis der Interaktion von Mikroorganismus, Lebensmittel und Wirt Veränderungen der Proteinexpression in Abhängigkeit von Lebensmittel/Umwelt Veränderung des Proteoms nach Interaktion mit dem Immunsystem des Wirtes Qualitativ und quantitativ unterschiedliche Immunantwort verschiedener Wirte auf eine Infektion funktionelle Unterschiede, die z.B. Persistenz- und Resistenzmechanismen erklären können Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) • Erreger der Johne'schen Krankheit (Paratuberculose) bei Rindern und anderen Wiederkäuern, eine unheilbare, chronische, infektiöse, granulomatöse Enteritis bei Ruminanten • Ähnlichkeiten zwischen Johne’scher Krankheit und Morbus Crohn vorhanden • Kausale Beteiligung von MAP an Morbus Crohn bisher weder erwiesen noch widerlegt • MAP-Nachweis bei Morbus Crohn Patienten • Rolle als Zoonose-Erreger beim Menschen diskutiert Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) • • • • • Generationszeit von 1,3 bis 4,4 Tagen Sichtbare Kolonien auf festen Nährböden erst nach 8-12 Wochen Prävalenz MAP-positiver Tankmilchproben weltweit bei 4 – 22 % MAP kann Pasteurisierungsprozess überleben, Feldstudien: 2 -12 % MAPpositive pasteurisierte Konsummilchproben Problem: Fehlender sensitiver, spezifischer und schneller Nachweis, der Unterscheidung lebend/tot ermöglicht Veränderungen der Proteinexpression von Bakterien in Lebensmitteln Differenzielle Proteomanalyse von MAP in Milch Welche Proteine sind in MAP exprimiert und werden in der Umgebung „Lebensmittel“ differenziell reguliert? • Charakterisierung des MAP-Proteoms in Standardmedium M7H9 (37°) • Quantitativer Vergleich zu MAP kultiviert für 48h in 4° Milch und 37° Milch 1 M7H9 2 37° Milch 3 37° Milch Differenzielle Proteomanalyse 4° Proteinlandkarten von Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in verschiedenen Medien • Identifikation von insgesamt 2197 MAPProteinen • Viele neue MAP-Proteine erstmals nachgewiesen, 36% hypothetical proteins • Deutliche Unterschiede in Milch bei 4° und 37° im Vergleich zu Kulturmedium Regulation von MAP in verschiedenen Umgebungen (Medium/Milch) Milch 37°C im Vgl. zu Medium Milch 4°C im Vgl. zu Medium • Einige Proteine werden deutlich reguliert • Unterschiede zwischen Milch 4°/37° und Medium deutlich (393) • Umgebung hat mehr Einfluss auf Proteom als Temperatur Medium im Vgl. zu Milch 37° 5fach stärkere Expression Zusammenfassung 2197 MAP-Proteine in verschiedenen Umgebungen detektier- und quantifizierbar 18% dieser Proteine ändern ihre Abundanz um den Faktor ≥ 5,0 in Milch 784 hypothetische MAP-Proteine erstmals als tatsächlich vorhanden bestätigt (=36% des von uns identifizierten MAP-Proteoms) Diese Informationen helfen bei der Auswahl von Zielstrukturen für die Detektion Abweichende Immunphänotypen beim Rind Karina Lutterberg 16% gesunder Kontrollrinder reagiert immunologisch deviant (wie BNP) Kontrollkühe Immundeviante Kühe ConA **** **** IL2 n.s. 16% = ImmunDeviant (ID) **** **** n.s. 16% = ImmunDeviant (ID) Lutterberg K. und Kleinwort K., in Vorbereitung Abweichende Immunphänotypen beim Rind Kristina Kleinwort Wir haben einen immundevianten Phänotyp bei Rindern detektiert, der z.B. die Persistenz von MAP bei diesen Rindern erklären könnte Interaktion von Makrophagen und MAP könnte sowohl immunologisch von den verschiedenen Wirten, als auch von den MAP verschieden beantwortet werden Kontrollkühe Immundeviante Kühe Veränderungen der Proteinexpression von Bakterien nach Interaktion mit dem Immunsystem unterschiedlicher Wirte MAP-Proteom nach Interaktion mit MØ verschiedener Wirte Kokultur von MAP mit primären Makrophagen Kontrollkühe Immundeviante Kühe Reaktion von MAP auf MØ-Interaktion Kontrollkühe • 630 Proteine von MAP detektiert und quantifiziert • 13 Proteine bei den MAP nach Interaktion mit den Kontroll-MØ um Faktor ≥ 5.0 höher abundant • 318 bei den MAP aus Interaktion mit IDRinder-MØ Immundeviante Kühe Deutlich abweichende Reaktion der MAP nach Interaktion mit den Immunzellen Kontrollkühe Hochreguliert in MAP nach in vitro Infektion primärer MØ mit MAP In MAP nach Interaktion mit Kontrolle reguliert ∞ Von MAP in Kontroll-MØ hochregulierte Proteincluster I. ETB03104 hypothetical protein II. Zn-dependent hydrolase 13 Immundeviante Kühe In MAP nach Interaktion mit ID reguliert ∞ 183 318 Von MAP in ID-MØ hochregulierte Proteincluster I. TetR family transcriptional regulator II. Prephenate dehydratase Zusammenfassung MAP reagieren nach in vitro Interaktion mit primären Makrophagen immunologisch unterschiedlicher Wirte mit quantitativen und qualitativen Unterschieden ihres Proteoms 13 Proteine werden bei Interaktion mit MØ von Kontrollrindern anders reguliert Dagegen regulieren MAP 318 bei Interaktion mit MØ von ID-Rindern 5fach stärker 36% der MAP-Proteine bleiben stabil exprimiert Qualitativ und quantitativ unterschiedliche Immunantwort auf eine Infektion durch verschiedene Wirte Unterschiedliche Immunantwort auf MAP-Infektion Sekretierte Immunproteine der Kontroll-/ ID-MØ nach in vitro Infektion mit MAP: • 1701 sekretierte Proteine (Rind) detektiert und quantifiziert • 284 Proteine bei Kontrollen um Faktor ≥ 5.0 höher abundant • 112 bei den ID-Rindern um Faktor ≥ 5.0 höher abundant Unterschiedliche Immunantwort auf MAP-Infektion Sekretierte Immunproteine nach in vitro Infektion Immunologisch abweichende Reaktion auf MAP-Infektion Kontrollkühe Von Kontroll-MØ nach Interaktion mit MAP sekretiert Von ID-MØ nach Interaktion mit MAP sekretiert Immundeviante Kühe Netzwerkanalyse Netzwerkanalyse I. I. TNF alpha/ Nfkappa b Pathway II. IL-23 assoziierte Immunreaktionen Intrinsische ProthrombinAktivierung II. Beta1 Integrin ZelloberflächenInteraktionen Zusammenfassung Rinder MØ sekretieren nach Kokultur mit MAP 1658 Proteine Auch die MØ reagieren qualitativ und quantitativ unterschiedlich auf die Infektion Kontroll-Rinder regulieren 284 Proteine differenziell aus immunologisch erwarteten Pathways (TLR/Nfkappab/IFNgamma/IL-23) MØ von ID-Rindern sekretieren 112 Proteine anders aus Netzwerken ProthrombinAktivierung und beta1-Integrine Ausblick: Infektionserreger Proteomics zur Unterscheidung zwischen zwischen hoch und schwach virulenten Stämmen: Bacillus cereus (AiF/FEI 18677 N) Cronobacter spp. etc. Ausblick: Tierbestände Proteomics zum Nachweis von immunkompetenten Nutztieren (Immunphänotyp): Bessere Mastitisresistenz Bessere Eliminierung von Zoonoserregern Ausblick: Qualität und Stabilität Proteomics zum Nachweis von produktverändernden, mikrobiellen Enzymen: Proteasen, Lipasen Amylasen (Projektantrag FEI 133/09) Danke
