Rationales Design von Enzymen mit neuartigen Eigenschaften

Jahrbuch 2007/2008 | Kombrink, Erich | Rationales Design von Enzymen mit neuartigen Eigenschaften
Rationales Design von Enzymen mit neuartigen Eigenschaften
Rational design of enzymes with novel catalytic properties
Kombrink, Erich
Max-Planck-Institut für Pflanzenzüchtungsforschung, Köln
Korrespondierender Autor
E-Mail: [email protected]
Zusammenfassung
Pflanzen synthetisieren viele sekundäre Inhaltsstoffe, die sich von Phenylalanin ableiten und Schutzfunktionen
gegen w idrige Umw eltbedingungen erfüllen. Mit dem Ziel, die Ursachen für diese Produktvielfalt zu verstehen,
w urde für ein Schlüsselenzym des Phenylpropanoidstoffw echsels der Mechanismus der Substratselektion
aufgeklärt. Dadurch ergeben sich Möglichkeiten, durch biotechnologische Anw endung Eigenschaften von
Pflanzen gezielt zu verändern.
Summary
Plants synthesize a vast array of secondary compounds derived from phenylalanine, w hich fulfill defense
functions against unfavorable environmental conditions. To understand the basis for this chemical diversity,
the mechanism of substrate selection w as unraveled for a key enzyme of phenylpropanoid metabolism. This
know ledge may provide strategies of engineering natural product pathw ays aiming at targeted modifications
of plant properties.
Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe dienen der Anpassung an eine variable Umwelt
Pflanzen sind in ihrer Umw elt fest verw urzelt und daher nicht in der Lage, Stress oder harschen
Umw eltbedingungen auszuw eichen. Um sich den w echselnden Lebensbedingungen an einem Standort
anzupassen, haben Pflanzen im Verlauf der Evolution durch plastische Anpassung ihres Metabolismus auf
diese
Einflüsse
chemische
und
biochemische
Schutzmechanismen
entw ickelt,
die
mechanische
W iderstandsfähigkeit verleihen (Lignin, Verholzung), Wasserverlust verhindern (Wachs- und Korkschichten),
schädliche UV-Strahlen abhalten (Farbstoffe, Schutzpigmente) und vor Befall durch Mikroorganismen und
Insekten schützen (Antibiotika, Inhibitoren) [1]. Als Folge dieses Prozesses sind Pflanzen in der Lage, eine
außerordentliche Vielfalt an chemischen Verbindungen zu synthetisieren (über 100000 Substanzen sind bisher
identifiziert w orden), die als Sekundärmetabolite bezeichnet w erden und in der Vergangenheit häufig nur als
Abfallprodukte des Primärstoffw echsels angesehen w urden. Inzw ischen ist für viele Substanzklassen aber
nachgew iesen w orden, dass sie w ichtige biologische Funktionen erfüllen [2]. Die meisten Substanzen w erden
über w enige Stoffw echselw ege produziert und können somit großen Substanzklassen zugeordnet w erden,
beispielsw eise Alkaloiden, Isoprenoiden, Phenylpropanoiden oder Glucosinolaten.
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Die außerordentliche Strukturvielfalt entsteht durch Variation der Ausgangsverbindung und der enzymatischen
Modifikation
der
Endprodukte
durch
Hydroxylierung,
Methylierung,
Oxidation
oder
Verknüpfung
mit
Zuckerresten (Glykosylierung) [3]. Verw andte Pflanzenfamilien synthetisieren häufig gleichartige Substanzen Leguminosen
stellen
Isoflavonoide
her, Solanaceaen
synthetisieren
Sesquiterpene
-, w as
auch
als
taxonomisches Merkmal dienen kann, w ährend andere Substanzklassen, w ie Phenylpropanoide, in allen
Pflanzenfamilien vertreten sind [4].
Vom Phenylpropanoidstoffwechsel leiten sich viele wichtige Substanzen ab
Verbindungen, die als Abw ehrstoffe gegen biotischen und abiotischen Stress w irken und damit eine große
Bedeutung bei der natürlichen Resistenz von Pflanzen gegenüber Mikroorganismen (Bakterien, Pilze) oder
Verw undung (Insektenfraß) haben, finden sich in allen Substanzklassen [2]. Der in Pflanzen ubiquitäre
Phenylpropanoidstoffw echsel nimmt dabei eine besondere Stellung ein, w eil einerseits Massenprodukte w ie
Lignin oder Kork über diesen Weg gebildet w erden, die als Holzkomponenten für die Entw icklung und Stabilität
von Pflanzen w ichtig sind und neben Cellulose die häufigsten Biopolymere der Erde darstellen, andererseits
leitet sich eine enorme Vielfalt von Verbindungen aus dem Phenylpropanoidstoffw echsel ab, die zusätzliche
biologische Funktionen als Antibiotika, Antioxidantien, Blüten- und Fruchtfarbstoffe oder Signalstoffe erfüllen.
Alle Phenylpropanoide w erden aus Phenylalanin synthetisiert, das durch die W irkung von drei Enzymen in
einen aktivierten Zimtsäure-CoA-Ester umgew andelt w ird, der als Ausgangsverbindung für die nachfolgenden,
komplexen Stoffw echselw ege dient (Abb. 1).
Übe rsicht übe r de n P he nylpropa noidstoffwe chse l und
P roduk te , die sich da ra us a ble ite n. A P he nyla la nin wird von
de n Enzym e n P he nyla la nin-Am m onia k -Lya se (P AL) und
Zim tsä ure -4-Hydrox yla se (C 4H) zunä chst in 4-C um a rsä ure (4Hydrox yzim tsä ure ) und da nn durch 4-C um a ra t:C oA-Liga se
(4C L) in de n e ntspre che nde n a k tivie rte n C oA-Este r
um ge wa nde lt. Die se r und a nde re a k tivie rte Zim tsä ure de riva te
we rde n in k om ple x e n Stoffwe chse lwe ge n we ite r um ge se tzt. B
Be ispie le für P roduk te de s P he nylpropa nstoffwe chse ls sind
Lignin (Holz) und Sube rin (Kork ) sowie Fla vonoide und
Anthocya ne , die a ls Frucht- und Blüte nfa rbstoffe in vie le n
P fla nze n a uftre te n, z.B. in R ose nge wä chse n (Ga rte nrose ,
Ha ge butte , Brom be e re ), P ra chtwinde (Ipom oe a ), P a prik a
(C a psicum ), Goldm ohn (Eschscholzia ) und für die
unte rschie dliche n Fä rbunge n ve ra ntwortlich sind, die von ge lb,
rot, bla u bis zu viole tt und schwa rz re iche n k önne n.
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Das letzte Enzym dieser Reaktionskette, 4-Cumarat:CoA-Ligase (4CL), nimmt eine besondere Stellung ein, w eil
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es am Verzw eigungspunkt zu den nachgeordneten Stoffw echselw egen liegt und vermutlich an der Steuerung
des Stoffflusses in die unterschiedlichen Wege beteiligt ist. Darüber hinaus zeichnen sich alle bisher
untersuchten 4CL-Enzyme dadurch aus, dass sie ein breites Substratspektrum verw erten und neben 4Cumarsäure (4-Hydroxyzimtsäure) auch andere, natürlich vorkommende Zimtsäurederivate umsetzen, w as zu
der bereits erw ähnten Produktvielfalt beiträgt. Die Frage, durch w elchen Mechanismus Substrate ausgew ählt,
in bestimmte Stoffw echselw ege kanalisiert und damit in ein entsprechendes Produktspektrum umgew andelt
w erden, ist w eitgehend ungeklärt.
Isoenzyme erfüllen spezifische Aufgaben im Pflanzenmetablismus
In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana sind 4-Cumarat:CoA-Ligasen (4CLs) durch vier Gene kodiert, die sich
in ihren Expressionsmustern unterscheiden. In Kombination mit den unterschiedlichen enzymatischen und
regulatorischen Eigenschaften der kodierten Enzyme w erden dadurch unterschiedliche Aufgaben erfüllt,
beispielsw eise die Biosynthese von Lignin oder Flavonoiden in speziellen Zelltypen oder Organen [5]. Das
herausragende Merkmal des Isoenzyms At4CL2 ist, dass Ferulasäure (3-Methoxy-4-hydroxyzimtsäure) im
Gegensatz zu anderen Zimtsäurederivaten nicht umgesetzt w ird [6]. Diese natürliche Verlustmutante diente
einer Forschergruppe des Max-Planck-Instituts für Züchtungsforschung als Ausgangsmaterial, den molekularen
Mechanismus
der
Substratselektion
in
dieser
Enzymklasse
aufzuklären.
Als
Hilfsmittel
w urde
in
Zusammenarbeit mit einer Arbeitsgruppe der Universität Köln zunächst ein dreidimensionales Strukturmodell
des Enzyms erstellt (Abb. 2).
Dre idim e nsiona le s Struk turm ode ll de s Enzym s At4C L2 a us
Ara bidopsis. A Da s Hom ologie m ode ll de r Enzym fa ltung von
At4C L2 wurde m ithilfe de r Krista llstruk tur von ve rwa ndte n
P rote ine n (P he A und Lucife ra se ) e rre chne t. Da s P rote in
be ste ht a us zwe i unte rschie dliche n Dom ä ne n, de r größe re Te il
(bla u und grün) binde t da s Substra t (4-C um a rsä ure ), de r
k le ine re Te il (rot) e nthä lt die k a ta lytische Am inosä ure (Lysin540), die a n de r R e a k tion be te iligt ist. B De ta ila nsicht de r
Substra tbindungsta sche m it Ka ffe e sä ure a ls ge bunde ne m
Substra t. Aus die se m Mode ll la sse n sich die Am inosä ure re ste
be stim m e n, die in e nge m Konta k t m it de m Substra t ste he n.
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In
dieses
Modell ließen
sich
die
gut umgesetzten
Substrate
4-Cumarsäure
und
Kaffeesäure
(3,4-
Dihydroxyzimtsäure) leicht einpassen, w ährend sich für die größere Ferulasäure ein sterischer Konflikt mit zw ei
Aminosäureresten (Leucin-320 und Methionin-293) ergab, die im 3-D-Modell benachbart sind [7]. Der
zielgerichtete Austausch dieser großen Aminosäuren gegen kleinere, w ie sie in anderen 4CLs vorliegen, führte
zu
einer
Enzymvariante,
die
aufgrund
der
vergrößerten
Substratbindungstasche
erw artungsgemäß
Ferulasäure umsetzte (Abb. 3). Dieses „Erfolgserlebnis“ hat nicht nur das Strukturmodell bestätigt, sondern
auch
die
Kreativität
der
Forscher
angespornt,
nach
w eiteren
Möglichkeiten
zu
suchen,
um
das
Substratspektrum des Enzyms gezielt zu erw eitern. Sinapinsäure (3,5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure) w urde
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als nächste Herausforderung gew ählt, da diese natürlich vorkommende Substanz von At4CL2 gleichfalls nicht
umgesetzt w ird. Dem Strukturmodell entsprechend, konnte die Substratbindungstasche im vorhergesagten
Bereich vergrößert w erden, w as in diesem Fall durch die gezielte Deletion einer Aminosäure erreicht w urde
und w as zu einer Enzymvariante führte, die Sinapinsäure umsetzte.
Ve rä nde runge n de r Substra tbindungsta sche und de r
Substra tve rwe rtung von At4C L2 durch Am inosä ure a usta usch. A
Te ila nsicht de r Substra tbindungsta sche de s W ildtyp-Enzym s
(At4C L2-W T) m it ge bunde ne r Ka ffe e sä ure . Von die se m Enzym
we rde n nur 4-C um a rsä ure und Ka ffe e sä ure um ge se tzt. B In
de r Enzym va ria nte At4C L2-P L ist die Substra tbindungsta sche
durch Austa usch von zwe i Am inosä ure n (Me t293P ro und
Lys320Le u) ve rgröße rt, wodurch ne be n 4-C um a rsä ure und
Ka ffe e sä ure a uch Fe rula sä ure um ge se tzt we rde n k a nn. C
Te ila nsicht de r Substra tbindungsta sche de r Va ria nte At4C L2P L+∆L356 m it ge bunde ne r Sina pinsä ure . Durch De le tion e ine r
Am inosä ure (Le u356) ist die Substra tbindungste lle we ite r
ve rgröße rt worde n, wodurch nun zusä tzlich a uch noch de r
Um sa tz von Sina pinsä ure m öglich ist. Alle Enzym a k tivitä te n
sind im Ve rhä ltnis zum Um sa tz von 4-C um a rsä ure
a nge ge be n.
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In w eiteren Variationen w urde auch die Umsatzrate für die unpolare Zimtsäure gezielt verbessert, indem ein
Enzym mit einer aus hydrophoben Aminosäuren aufgebauten Substratbindungstasche hergestellt w urde [7].
Die
nächsten
Herausforderungen:
Neue
Möglichkeiten
für
die
Grundlagenforschung
und
gentechnologische Anwendungen
Welche Schlussfolgerungen und praktischen Anw endungen ergeben sich aus den erzielten Ergebnissen? Zum
einen ist da selbstverständlich der rein erkenntnisgew innende Wert zu nennen, nämlich die detailgetreue
Struktur eines Enzyms - der kleinsten biologisch aktiven Einheit - zu erforschen. Weiterführend stellt sich die
Frage, ob es möglich ist, die Eigenschaften und Substrate von anderen, bisher nicht untersuchten Enzymen
durch solche Ergebnisse vorherzusagen. Dass dies nicht nur eine Annahme, sondern praktische Notw endigkeit
ist, ergibt sich aus den vollständig sequenzierten Genomen, die inzw ischen für viele Organismen vorliegen und
die zahlreiche neue Proteine zu Tage fördern, denen noch eine Funktion zugeordnet w erden muss [7, 8].
Diesbezüglich ist mit der Untersuchung von 4CL-ähnlichen Proteinen aus Arabidopsis thaliana zumindest ein
Teilerfolg erzielt w orden: Für zw ei Proteine, deren Substratbindungstasche aus hydrophoben Aminosäuren
aufgebaut ist, konnte bestätigt w erden, dass sie hydrophobe Substrate, Fettsäuren und Fettsäurederivate
(Jasmonsäuren) umsetzen [9, 10].
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Zum anderen ist mit den neu geschaffenen Enzymen aber auch die Werkzeugkiste der Forscher um ein
w eiteres Element bereichert w orden, das erlauben sollte, mittels Gentechnik Veränderungen an Pflanzen
vorzunehmen. Holzqualität (Hartholz oder Weichholz) ist unter anderem davon abhängig, w elche Moleküle von
der Pflanze für die Synthese von Lignin verw endet w erden, und ebenso w erden Blütenfarbe oder andere
Pflanzeninhaltsstoffe verändert, w enn modifizierte Ausgangsverbindungen in Stoffw echselw ege einfließen.
Dementprechend
konzentrieren sich die
gegenw ärtigen Forschungsaktivitäten auf die
Frage, w elche
Eigenschaften sich in Pflanzen verändern, w enn Enzyme mit neuartigen Eigenschaften durch gezielt
steuerbare Promotoren (Genregulatoren) in unterschiedlichen Gew eben, Zelltypen oder Entw icklungsstufen
synthetisiert w erden. Die Ausw irkungen solcher gentechnologischen Veränderungen auf die physiologischen
und biochemischen Eigenschaften der Pflanzen vorauszusagen ist gegenw ärtig nicht möglich. Da die
erw ähnten Stoffw echselw ege und Produkte aber von großer Bedeutung für die Eigenschaften von Pflanzen
sind, ist eine spätere Anw endung der gew onnenen Erkenntnisse zur Verbesserung von Nutzpflanzen nicht
unrealistisch.
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