Bionanotechnologie 4
Werbung
Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Rotationsmotoren für die Bionanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 1 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Escherichia coli mit fünf Geißeln im Elektronenmikroskop (26.000 x ). Neben den Geißeln kommen noch dünne Typ-I Pili vor. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 2 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Wir konzentrieren uns hier nur auf die Geißelbewegung mit einem kurzen Seitenblick auf die Spirochaeten. Im Vergleich zur Körpergröße ist die Bewegungsgeschwindigkeit recht hoch (20 – 60 µm/s); das entspricht etwa 30 Körperlängen. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 3 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Die Geißeln bestehen aus einem einzigen Typ Protein mit dem Namen Flagellin, das bei Escherichia coli ein Molekulargewicht von 55 kDa besitzt und einen Durchmesser von 5 nm hat. Bei Halobacterium treten hingegen 5 Gene auf, die die Geißelproteine codieren. Aus dem Durchmesser der Untereinheiten wird klar, daß mehrere auf einem Querschnitt angeordnet sein müssen. Tatsächlich bilden sie einen hohlen Zylinder von ca. 20.000 Protein-Untereinheiten in wahrscheinlich 8 Längssträngen. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 4 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Der Aufbau der Geißel erfolgt durch Anlagerung weiterer Proteine an der Spitze, die durch den Kanal dahin transportiert werden. Die Geißeln können verschiedene Aggregatzustände einnehmen, dabei ändert sich die Steigung der Helix. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 5 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Die wichtigste Aussage ist, daß die Geißeln nicht aktiv beweglich sind, sondern ähnlich wie ein Knethaken an einer Küchenmaschine - von einem Motor an der Basis angetrieben werden. Mit diesem Motor sind die Geißeln durch eine elastische Kupplung (englisch "hook" = Haken) verbunden. Durch die Rotation der Geißeln wird die Zelle angetrieben. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 6 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Das Geißelfilament ist über einen elastischen Haken mit einer zentralen Achse verbunden, die ihrerseits in mehreren Ringen gelagert ist. E. coli besitzt vier solcher Ringe und Bacillus subtilis nur zwei. Der Stator-Ring liegt im periplasmatischen Raum und bleibt stehen. Also wird die Kraft wie bei einem Elektromotor zwischen dem Motor und dem Stator erzeugt. Der P-Ring liegt in der Ebene der Peptidoglukan-Zellwand und der L-Ring in der Ebene der Lipopolysaccharidschicht (outer membrane). Die beiden letztgenannten Ringe (wenn vorhanden) haben die Funktion eines Kugellagers, in dem sich die zentrale Achse dreht. Die Rotationsgeschwindigkeiten dieses Motors sind beachtlich mit ca. 200 Umdrehungen pro Sekunde (12.000 U/min). Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 7 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Wenn man die lebenden Zellen mit einem Antikörper gegen das Geißelprotein versetzt, so findet man Zellen, die mit jeweils einer Geißel miteinander verklebt sind; diese Zellen rotieren gegeneinander (Silverman and Simon, 1974). Die Antikörper haben auch die Eigenschaft, auf Glasflächen zu kleben. Daher kann man Bakterienzellen auf einem Objektträger mit einer Geißel festheften (engl. tethering). Auch diese Zellen rotieren. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 8 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Die Zellen produzieren einen Protonengradienten, indem z.B. in der Atmungskette Protonen nach außen transportiert werden. Andere Bakterien benutzen eine lichtgetriebene Protonenpumpe. Eine dritte Möglichkeit ist eine ATPase, die unter ATP Verbrauch Protonen von innen nach außen transportiert. Dieser Protonengradient wird verwendet, um den Geißelmotor direkt anzutreiben. Der Antrieb muß also zwischen Stator- und Motorscheibe erfolgen. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 9 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 10 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Der am besten untersuchte biologische Rotationsmotor ist die Protonen transportierende F0-F1-ATP-Synthase (ATPase), die in der Zellmembran für die Synthese von ATP sorgt. Nach dem gleichen Prinzip sorgt durch die Kopplung an eine Geißel die Fo-F1-ATP-Synthase für den Antrieb eines Bakteriums (12.000 U/min). Dieser Rotationsmotor ist mit nur 10 nm Breite das kleinste bekannte Motorsystem. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 11 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Der Rotationsmotor besteht aus zwei funktionellen Einheiten: der F0-Einheit mit einem Protonenkanal, die hydrophobe Eigenschaften aufweist und daher in die Membran integriert ist, und der katalytischen F1ATPase mit hydrophilen Eigenschaften. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 12 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 13 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Die F1-ATPase besteht aus einem Ring von je drei alternierenden aund β-Untereinheiten, zwischen denen katalytische Zentren liegen Den Verbindungsschaft (Rotorstab) bilden die Polypeptide des F0-Teils und die γ, δ, ε-Untereinheiten des F1 Kopfs. Die γ-Einheit ragt über den α/β-Ring hinaus und kann für technische Zwecke mit einem Rotorblatt (Aktinfilament) verbunden werden. Rotationsmotor mit einem Ring aus alternierenden α- und βEinheiten. Das Rotorblatt (ein Aktinfilament) ist am Schaft (Rotationsachse, γ-Einheit) befestigt. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 14 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 15 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 16 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 17 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 18 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 19 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Wenn Protonen aufgrund eines transmembranen Protonengradienten durch die F0-Einheit fließen, rotiert der Schaft der F1-ATPase und es wird in den katalytischen β-Zentren ATP produziert. Dabei wird eine Geschwindigkeit von mehreren Tausend Umdrehungen pro Minute und ein Drehmoment von 80-100 pN erzeugt. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 20 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 21 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Warum ist die F1-F0-ATPase so wichtig? Die ATPase ist verantwortlich für die Produktion von ATP, dem Treibstoff für Zellen. ATP ist die Energieversorgung für alle Prozesse der Zellen sowie ihre Reproduktion. Selbst in Ruhe wandelt ein menschlicher Körper ATP in der Menge seines halben Körpergewichts um. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 22 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Direct observation of the rotation of F1-ATPase. Noji H, Yasuda R, Yoshida M, Kinosita K Jr. Research Laboratory of Resources Utilization, Tokyo Institute of Technology, Yokohama, Japan. Cells employ a variety of linear motors, such as myosin, kinesin and RNA polymerase, which move along and exert force on a filamentous structure. But only one rotary motor has been investigated in detail, the bacterial flagellum (a complex of about 100 protein molecules). We now show that a single molecule of F1ATPase acts as a rotary motor, the smallest known, by direct observation of its motion. A central rotor of radius approximately 1 nm, formed by its gamma-subunit, turns in a stator barrel of radius approximately 5nm formed by three alpha- and three beta-subunits. F1-ATPase, together with the membrane-embedded proton-conducting unit F0, forms the H+-ATP synthase that reversibly couples transmembrane proton flow to ATP synthesis/hydrolysis in respiring and photosynthetic cells. It has been suggested that the gamma-subunit of F1-ATPase rotates within the alphabeta-hexamer, a conjecture supported by structural, biochemical and spectroscopic studies. We attached a fluorescent actin filament to the gamma-subunit as a marker, which enabled us to observe this motion directly. In the presence of ATP, the filament rotated for more than 100 revolutions in an anticlockwise direction when viewed from the 'membrane' side. The rotary torque produced reached more than 40 pN nm(-1) under high load. Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 23 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 24 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 25 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 26 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 27 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 28 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 29 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 30 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 31 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 32 Technische Universität Ilmenau, FG Nanotechnologie Zentrum für Mikro- und Nanotechnologien 33
