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0 INHALTSVERZEICHNIS ........................................................................................ 3 1 EINLEITUNG .............................................................................................................................................. 8 1.1 RELEVANZ TROPISCHER REGENWÄLDER FÜR DIE VIRUSDIVERSITÄT ........................................................... 8 1.2 EINFLUSS DES MENSCHEN AUF DAS AUFTRETEN NEUARTIGER ERREGER .................................................... 8 1.3 MOSKITOS ALS VIRUSRESERVOIR ......................................................................................................................... 9 1.3.1 Infektionen durch Arboviren .................................................................................................................... 10 1.3.2 Relevanz Insekten-­‐restringierter Viren ............................................................................................... 11 1.4 NIDOVIRALES .......................................................................................................................................................... 12 1.4.1 Familie Coronaviridae ................................................................................................................................ 19 1.4.1.1 Unterfamilie Coronavirinae ................................................................................................................................................. 20 1.4.1.2 Unterfamilie Torovirinae ...................................................................................................................................................... 23 1.4.2 Familie Roniviridae ...................................................................................................................................... 26 1.4.3 Familie Arteriviridae ................................................................................................................................... 27 1.5 FORSCHUNGSHINTERGRUND UND FORSCHUNGSSTAND ZU BEGINN DER ARBEIT .................................... 29 1.6 ZIELSETZUNG DER ARBEIT .................................................................................................................................. 31 2 MATERIAL ............................................................................................................................................... 32 2.1 CHEMIKALIEN UND REAGENZIEN ...................................................................................................................... 32 2.2 PUFFER UND LÖSUNGEN ...................................................................................................................................... 34 2.3 ENZYME .................................................................................................................................................................. 37 2.4 BAKTERIENSTÄMME UND PLASMIDE ................................................................................................................ 37 2.5 ANTIKÖRPER UND SEREN .................................................................................................................................... 38 2.5.1 Primär-­‐Antikörper ........................................................................................................................................ 38 2.5.2 Sekundär-­‐Antikörper ................................................................................................................................... 39 2.6 KITS ......................................................................................................................................................................... 39 2.7 ZELLLINIEN ............................................................................................................................................................ 40 2.8 TECHNISCHE GERÄTE .......................................................................................................................................... 41 2.9 VERBRAUCHSMATERIALIEN ................................................................................................................................ 43 2.10 SOFTWARE .......................................................................................................................................................... 44 2.11 PROBENMATERIAL ............................................................................................................................................. 45 3 METHODEN ............................................................................................................................................. 47 3.1 ZELLKULTUR .......................................................................................................................................................... 47 3.1.1 Kultivierung der Zelllinien ........................................................................................................................ 47 3.1.2 Bestimmung der Zellzahl ........................................................................................................................... 47 3.1.3 Anzucht der Viren auf Insektenzellen .................................................................................................. 48 3.1.4 Endpunktaufreinigung ............................................................................................................................... 48 3.1.5 Herstellung von Virusstocks und Titration ........................................................................................ 49 3 3.1.6 Wachstumskinetik ........................................................................................................................................ 49 3.1.7 Infektion der Säugetierzellen ................................................................................................................... 50 3.1.8 Aufkonzentration von Virus mittels Ultrazentrifugation ............................................................ 50 3.1.9 Virusaufreinigung mittels einer Gradientenultrazentrifugation ............................................. 51 3.2 ELEKTRONENMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNGEN .................................................................................... 52 3.2.1 Negativkontrastierung von Viruspellets ............................................................................................. 52 3.2.2 Herstellung von EM-­‐Dünnschnittpräparaten infizierter Zellen ............................................... 52 3.2.3 Auswertung am Elektronenmikroskop und fotografische Dokumentation ........................ 52 3.3 RNA-­‐ISOLIERUNG ................................................................................................................................................ 53 3.3.1 Extraktion viraler RNA aus Zellkulturüberstand ............................................................................ 53 3.3.2 Extraktion der gesamten RNA aus Zellen ........................................................................................... 53 3.3.3 Phenol-­‐Chloroform Extraktion mittels TRIzol® LS ....................................................................... 53 3.4 CDNA-­‐SYNTHESE ................................................................................................................................................. 54 3.4.1 Einzelstrang-­‐cDNA ....................................................................................................................................... 54 3.4.2 Doppelstrang-­‐cDNA ..................................................................................................................................... 55 3.5 PRIMER-­‐ UND SONDENDESIGN ........................................................................................................................... 55 3.6 POLYMERASEKETTENREAKTION ........................................................................................................................ 56 3.6.1 PCR und „nested“-­‐PCR ................................................................................................................................. 56 3.6.2 Quantitative PCR ........................................................................................................................................... 57 3.6.3 One-­‐Step RT-­‐PCR ........................................................................................................................................... 58 3.6.4 Generische „screening“-­‐PCR ..................................................................................................................... 58 3.6.5 Unspezifische DNA-­‐Amplifikation .......................................................................................................... 59 3.6.5.1 „Particle-­‐associated nucleic acid“-­‐PCR .......................................................................................................................... 59 3.6.5.2 Modifizierte PAN-­‐PCR ........................................................................................................................................................... 60 3.6.5.3 SIA „random“-­‐PCR ................................................................................................................................................................... 61 3.6.6 „Walking“-­‐PCR ................................................................................................................................................ 61 3.6.7 Amplifikation der Enden von Nukleinsäuren .................................................................................... 62 3.6.7.1 3’-­‐RACE ........................................................................................................................................................................................ 62 3.6.7.2 5’-­‐RACE ........................................................................................................................................................................................ 62 3.6.7.3 RLM-­‐RACE .................................................................................................................................................................................. 63 3.6.8 „Scanning”-­‐PCR .............................................................................................................................................. 64 3.7 AGAROSE-­‐GELELEKTROPHORESE ...................................................................................................................... 65 3.8 AUFREINIGUNG VON DNA .................................................................................................................................. 66 3.8.1 Aufreinigung von DNA in PCR-­‐Produkten .......................................................................................... 66 3.8.2 Aufreinigung von DNA aus Agarosegelen .......................................................................................... 66 3.9 PRÄPARATIVE PLASMID-­‐ISOLIERUNG AUS BAKTERIEN ................................................................................ 66 3.10 KONZENTRATIONSMESSUNG VON NUKLEINSÄUREN ................................................................................... 67 3.11 KLONIERUNG UND TRANSFORMATION .......................................................................................................... 67 4 3.11.1 Klonierung mittels TOPO® TA cloning®“-­‐Kit ............................................................................... 67 3.11.2 Klonierung mittels Restriktionsverdau und Ligation ................................................................. 69 3.12 EXPRESSION REKOMBINANTER PROTEINE IN EUKARYOTISCHEN ZELLEN .............................................. 70 3.13 HERSTELLUNG EINER STANDARDREIHE FÜR DIE QPCR ............................................................................. 71 3.14 SANGER-­‐SEQUENZIERUNG ................................................................................................................................ 72 3.15 454-­‐PYROSEQUENZIERUNG ............................................................................................................................. 72 3.16 SEQUENZANALYSE ............................................................................................................................................. 74 3.17 THEORETISCHE ANALYSE VON PROTEINFUNKTIONEN ............................................................................... 75 3.18 PHYLOGENETISCHE ANALYSE .......................................................................................................................... 75 3.19 NORTHERN BLOT ............................................................................................................................................... 76 3.20 BRADFORD-­‐ASSAY ............................................................................................................................................. 79 3.21 SDS-­‐POLYACRYLAMID-­‐GELELEKTROPHORESE ............................................................................................ 79 3.22 WESTERN BLOT ................................................................................................................................................. 81 3.23 PROTEINFÄRBUNGEN ........................................................................................................................................ 83 3.23.1 Coomassie-­‐Färbung eines Proteingels .............................................................................................. 83 3.23.2 Coomassie-­‐Färbung einer SequiBlot-­‐PVDF-­‐Membran ............................................................... 83 3.23.3 Silbernitrat-­‐Färbung ................................................................................................................................ 84 3.23.4 Fast Green-­‐Färbung .................................................................................................................................. 84 3.24 EDMAN-­‐SEQUENZIERUNG ................................................................................................................................ 84 3.25 MASSENSPEKTROMETRIE ................................................................................................................................. 85 3.26 DEGLYKOSYLIERUNG VON PROTEINEN .......................................................................................................... 85 3.27 IMMUNFLUORESZENZ-­‐TEST ............................................................................................................................. 85 3.27.1 IFT mit Virus-­‐infizierten Insektenzellen ........................................................................................... 85 3.27.2 IFT mit rekombinanten, viralen Proteinen in Säugetierzellen ............................................... 87 4 ERGEBNISSE ........................................................................................................................................... 89 4.1 SEQUENZIERUNG DES CAVALLY-­‐VIRUS VOLLGENOMS .................................................................................. 89 4.2 PRÄVALENZ NEUER, CAVV-­‐ÄHNLICHER VIREN ............................................................................................... 92 4.3 SEQUENZIERUNGEN DER VOLLGENOME VON HANA-­‐VIRUS, MÉNO-­‐VIRUS, NSÉ-­‐VIRUS UND MOUMO-­‐ VIRUS 96 4.3.1 Hana-­‐Virus ....................................................................................................................................................... 97 4.3.2 Nsé-­‐Virus ........................................................................................................................................................... 97 4.3.3 Méno-­‐Virus ....................................................................................................................................................... 99 4.3.4 Moumo-­‐Virus ................................................................................................................................................... 99 4.4 GENOMANALYSE ................................................................................................................................................... 99 4.5 PHYLOGENETISCHE VERWANDTSCHAFTSBEZIEHUNGEN ........................................................................... 104 4.6 WIRTSTROPISMUS UND MORPHOLOGIE DER MESONIVIREN ..................................................................... 106 5 4.6.1 Herstellung Virusstocks und Ausbildung zytopathogener Effekte ....................................... 106 4.6.2 Wachstumskinetiken auf Insektenzellen ......................................................................................... 107 4.6.3 Infektionsversuche von Säugetierzellen ........................................................................................... 108 4.6.4 Morphologische Untersuchungen ....................................................................................................... 108 4.7 IDENTIFIKATION DER VIRALEN „MESSENGER“ RNAS VON CAVALLY-­‐VIRUS .......................................... 110 4.8 CHARAKTERISIERUNG DER FUSIONSSTELLEN DER SG MRNAS VON CAVV ............................................. 111 4.9 TRANSKRIPTIONSMECHANISMUS DER MESONIVIREN ................................................................................ 114 4.10 EXPRESSION DER MESONIVIRUS-­‐STRUKTURPROTEINE ........................................................................... 115 4.10.1 Aufbereitung der Mesonivirus-­‐Proteine ........................................................................................ 116 4.10.2 Färbung der mesoniviralen Strukturproteine ............................................................................ 117 4.10.3 Sequenzierung und Identifikation der Strukturproteine ....................................................... 117 4.11 MESONIVIRUS-­‐KREUZREAKTIVITÄT ............................................................................................................ 120 4.12 NACHWEIS DER VIRALEN PROTEINE IN INFIZIERTEN ZELLEN ............................................................... 123 4.13 SEROLOGIE ....................................................................................................................................................... 127 4.13.1 Immunfluoreszenztest auf Insektenzellen .................................................................................... 127 4.13.2 Serologische Untersuchungen der Humanseren ........................................................................ 128 4.13.3 Western Blot-­‐Analysen der Humanseren ...................................................................................... 131 4.13.4 IFT mit rekombinantem CavV-­‐Glykoprotein in Säugetierzellen ......................................... 132 5 DISKUSSION ......................................................................................................................................... 134 5.1 GENOMGRÖßE .................................................................................................................................................... 134 5.2 GENOMORGANISATION ..................................................................................................................................... 135 5.2.1 Replikase-­‐Polyprotein .............................................................................................................................. 135 5.2.2 Strukturproteine und akzessorische Proteine ............................................................................... 137 5.3 MORPHOLOGIE ................................................................................................................................................... 138 5.4 KLASSIFIZIERUNG DER ISOLATE INNERHALB MESONIVIRIDAE .................................................................. 139 5.5 TRANSKRIPTIONSMECHANISMUS .................................................................................................................... 140 5.6 PROTEINEXPRESSION UND -­‐MODIFIKATION ................................................................................................. 141 5.7 SEROLOGISCHE VERWANDTSCHAFT DER MESONIVIREN UNTEREINANDER ........................................... 144 5.8 PHYLOGENETISCHE VERWANDTSCHAFT ....................................................................................................... 144 5.9 EVOLUTION DER MESONIVIREN ...................................................................................................................... 145 5.10 VORKOMMEN DER MESONIVIREN ................................................................................................................ 147 5.11 ISOLATION DER MESONIVIREN ..................................................................................................................... 149 5.12 ÜBERTRAGUNG DER MESONIVIREN ............................................................................................................. 150 6 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................................................................ 152 7 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................... 153 8 ANHANG ................................................................................................................................................ 168 6 8.1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................................................................. 168 8.2 VEKTORKARTEN ................................................................................................................................................. 175 8.3 PRIMERTABELLE ................................................................................................................................................ 176 8.4 PROTEIN-­‐ALIGNMENTS .................................................................................................................................... 190 8.5 ERKLÄRUNG ZUR DISSERTATION .................................................................................................................... 197 8.6 VORVERÖFFENTLICHUNGEN ............................................................................................................................ 198 8.7 DANKSAGUNG ..................................................................................................................................................... 199 7
