Unterschiedliche Funktionen von SRP und SecA beim Transport

Aus dem Institut für Biochemie und Molekularbiologie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Unterschiedliche Funktionen von SRP und SecA
beim Transport eines bakteriellen Proteins
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt 2001
von Christoph Neumann-Haefelin
geboren in Freiburg i. Br.
Dekan:
Prof. Dr. rer. nat. M. Schumacher
Erster Gutachter:
Prof. Dr. med. Matthias Müller
Zweiter Gutachter:
PD Dr. med. Darius Moradpour
Jahr der Promotion:
2003
Für meine Eltern
Die Ergebnisse dieser Arbeit wurden veröffentlicht in:
Christoph Neumann-Haefelin, Ute Schäfer, Matthias Müller and Hans-Georg Koch (2000)
SRP-dependent co-translational targeting and SecA-dependent translocation analyzed as
individual steps in the export of a bacterial protein.
The EMBO Journal 19, pp. 6419-6426
Außerdem wurde im Rahmen dieser Arbeit veröffentlicht:
Hans-Georg Koch, Thomas Hengelage, Christoph Neumann-Haefelin, Juan MacFarlane,
Hedda K. Hoffschulte, Karl-Ludwig Schimz, Bernd Mechler and Matthias Müller (1999)
In vitro studies with purified components reveal signal recognition particle (SRP) and
SecA/SecB as constituents of two independent protein-targeting pathways of Escherichia
coli.
Molecular Biology of the Cell 10, pp 2163-2173
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
ZUSAMMENFASSUNG
1
2
EINLEITUNG
2
2.1
2.2
2.2.1
2.2.2
2.3
2.3.1
2.3.2
2.4
2.4.1
2.4.2
2
4
4
5
6
6
7
7
7
2.5
2.5.1
2.5.2
2.6
Überblick: Proteintransport an der Innenmembran von Escherichia coli
Transportsignale
Signalsequenz sekretorischer Proteine
Signal-Anker- und Stopp-Transfer-Sequenzen polytoper Innenmembranproteine
Erkennung der naszierenden Ketten am Ribosom
Sekretorische Proteine werden von Trigger factor erkannt
Polytope Innenmembranproteine werden von SRP erkannt
Targeting an das SecYEG-Translokon
SecB und SecA sind am Targeting sekretorischer Proteine beteiligt
SRP und sein Rezeptor FtsY sind am Targeting polytoper
Innenmembranproteine beteiligt
Translokation und Integration am SecYEG-Translokon
Translokasefunktion des SecYEG-Translokons
Integrasefunktion des SecYEG-Translokons
Kooperieren SecA/SecB und SRP beim Transport bestimmter Substrate?
10
12
13
13
14
3
ZIELSETZUNG
16
4
MATERIAL UND METHODEN
17
4.1
4.1.1
4.1.2
4.1.3
4.1.4
4.1.5
Material
Chemikalien
Geräte und Materialien
Antibiotika
Escherichia coli - Stämme
Plasmide
Klonierung von pMomp2
Molekularbiologische Methoden
DNA-Isolierung
DNA-Restriktionsenzymverdau und Agarosegelelektrophorese
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Western Transfer
Herstellung von Bestandteilen des zellfreien Systems
Bestandteile des zellfreien Transkriptions-Translations-Systems
Zytosolische Translationsfaktoren (CTF)
Ribosomen
Initiationsfaktor 2
17
17
17
18
19
19
19
22
22
22
23
25
26
26
26
28
28
4.2
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4
4.3
4.3.1
Inhaltsverzeichnis
4.4
4.4.1
4.4.2
4.4.3
4.4.4
4.4.5
4.4.6
4.4.7
4.4.8
4.4.9
4.4.10
4.4.11
T7-RNA-Polymerase
Membranvesikel
Inside-Out Innenmembranvesikel (INV)
Harnstoffextrahierte Vesikel (HINV)
Translokations- und Insertionsfaktoren
Ffh-Aufreinigung
Versuche im zellfreien System zum Proteintransport in Escherichia coli
Gekoppelte Transkription-Translation im zellfreien System
Synthese ribosomenassoziierter naszierender Ketten (RANCs)
Puromycin-Behandlung
Protease-Resistenz-Test
Differentialzentrifugation über zweistufigen Saccharosegradienten
Quervernetzung mit DSS
Isolierung ribosomenassoziierter naszierender Ketten (RANCs)
Isolierung von Innenmembranvesikeln
TCA-Fällung
Immunpräzipitation
SDS-PAGE und Autoradiographie
28
28
28
30
30
30
32
32
34
34
35
35
36
36
36
36
37
38
5
ERGEBNISSE
39
5.1
Momp2: Ein Hybridprotein aus Mannitpermease (MtlA) und
Outer membrane protein A (OmpA)
Momp2 wird effizient in „Inside-out“-Innenmembranvesikel (INV)
transloziert
Momp2 wird am Ribosom sowohl von Ffh als auch von Trigger factor
erkannt
Die Translokation von Momp2 in HINV benötigt nur SecA und SecB,
jedoch nicht SRP
Eine gestörte Interaktion zwischen SecA und SecY beeinträchtigt die
Translokation, nicht jedoch die Membranassoziation von Momp2
Quervernetzung von Momp2-RANCs mit Membrankomponenten:
Kotranslationale Interaktion zwischen Momp2 und SecY
Das kotranslationale Targeting von Momp2 erfolgt SRP-abhängig
Nach dem SRP-abhängigen Targeting werden SecA und SecB zur
Translokation von Momp2 benötigt
4.3.2
4.3.3
5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8
39
40
42
46
48
51
53
54
6.
DISKUSSION
56
6.1
Momp2: Ein Hybridprotein aus der Signal-Anker-Sequenz von
MtlA und dem signalsequenzlosen OmpA als Modellprotein zum
Proteintransport in Escherichia coli
56
Inhaltsverzeichnis
6.2
6.3
6.4
6.5
6.10
Die Signal-Anker-Sequenz reicht für die Erkennung durch SRP aus
Trigger factor erkennt den reifen Anteil sekretorischer Proteine
SRP und Trigger factor konkurrieren um naszierende Ketten
Die Signal-Anker-Sequenz ermöglicht ein kotranslationales,
SRP-abhängiges Targeting von Momp2
Die Translokation der periplasmatischen Domäne von Momp2
erfordert SecA
Der Membrantransport von Momp2 erfolgt in drei Schritten, bei
denen SRP und SecA unterschiedliche Rollen übernehmen
Der Membrantransport von Innenmembranproteinen mit großen
periplasmatischen Domänen erfordert eine Kooperation zwischen
SRP und SecA
Unterschiedliche Mechanismen bei der Integration von
Innenmembranproteinen
Ausblick
7.
LITERATUR
69
8.
ANHANG
78
8.1
8.2
Abkürzungen
Plasmidkarten von pDMB, pOmpA-SpeI, p717MtlA-B, pMtlA-SpeI-2
und Momp2
Sequenzen von ompA, mtlA und momp2
78
6.6
6.7
6.8
6.9
8.3
DANKSAGUNG
LEBENSLAUF
56
57
58
59
61
63
64
67
68
80
82
1
1
1 Zusammenfassung
Zusammenfassung
Escherichia coli besitzt als gramnegatives Bakterium eine Zellhülle aus Innenmembran
(Zytoplasmamembran), Periplasma und Außenmembran. Proteine dieser Kompartimente
müssen nach ihrer Synthese im Zytosol an ihre Bestimmungsorte transportiert werden. Für das
Targeting (Zielsteuerung) ungefalteter Proteine an die Innenmembran und ihren
anschließenden Transport sind im wesentlichen zwei unterschiedliche Transportwege
beschrieben. Entscheidend für das duale Targeting ist dabei die spezifische Erkennung der
jeweiligen Substrate während ihrer Synthese am Ribosom: Polytope Innenmembranproteine
werden anhand ihrer Signal-Anker-Sequenzen vom Signal recognition particle (SRP) erkannt;
ihr Membrantargeting und ihre Integration in die Innenmembran erfolgen kotranslational und
werden von SRP und seinem Rezeptor FtsY vermittelt. Sekretorische Proteine (lösliche
periplasmatische Proteine und Außenmembranproteine) werden am Ribosom hingegen von
Trigger factor gebunden; ihr Membrantargeting und ihre Translokation durch die
Innenmembran werden erst posttranslational von SecA und SecB vermittelt. Bisher war jedoch
umstritten, ob SecA auch an der Integration bestimmter Innenmembranproteine beteiligt ist.
Daher wurde in dieser Arbeit der Membrantransport eines Hybridproteins aus dem
polytopen Innenmembranprotein Mannitpermease (MtlA) und dem sekretorischen Outer
membrane protein A (OmpA) in einem zellfreien Transkriptions-Translations-System aus
Escherichia coli untersucht. Das Hybridprotein wurde durch die Fusion der ersten SignalAnker-Sequenz von MtlA mit dem reifen Proteinteil von OmpA, also dem signalsequenzlosen
OmpA, hergestellt. Diese Konstruktionsweise legt folgende Membrantopologie nahe, die
experimentell bestätigt wurde: Während die von MtlA stammende Signal-Anker-Sequenz das
Protein in der Innenmembran verankert, wird der von OmpA stammende Proteinanteil als
periplasmatische Domäne durch die Innenmembran transloziert.
Die von MtlA stammende Signal-Anker-Sequenz ermöglichte die Erkennung des
Hybridproteins durch SRP sowie das durch SRP und seinen Rezeptor FtsY vermittelte
kotranslationale Targeting: Im Gegensatz zu ribosomenassoziierten naszierenden Ketten von
OmpA wurden ribosomenassoziierte naszierende Ketten des Hybridproteins nicht nur mit
Trigger factor, sondern auch mit SRP quervernetzt. Weiterhin wurden nur in Anwesenheit von
SRP und FtsY ribosomenassoziierte naszierende Ketten des Hybridproteins als Ausdruck eines
kotranslationalen Targetings mit SecY quervernetzt, das die zentrale Komponente der am
Proteintransport beteiligten Membranpore ist. Im Anschluß an dieses SRP-abhängige Targeting
erforderte die Translokation der von OmpA stammenden periplasmatischen Domäne jedoch
SecA: Die Translokation in Inside-out-Innenmembranvesikel (INV) wurde durch SRP und
FtsY nicht erreicht, sondern erforderte SecA. SRP und SecA haben beim Transport dieses
Hybridproteins also unterschiedliche Funktionen: SRP und FtsY vermitteln das
kotranslationale Targeting und die Integration der Signal-Anker-Sequenz, während SecA die
Translokation der periplasmatischen Domäne vermittelt. Diese Kooperation zwischen SRP und
SecA ist wahrscheinlich auch beim Membrantransport bestimmter authentischer
Innenmembranproteine in Escherichia coli nötig, die wie das hier untersuchte Hybridprotein
ausgedehnte periplasmatische Domänen enthalten.
2 Einleitung
2
2
Einleitung
2.1 Überblick: Proteintransport an der Innenmembran von Escherichia
coli
Escherichia coli besitzt als gramnegatives Bakterium eine Zellhülle aus Innenmembran
(Zytoplasmamembran), Periplasma und Außenmembran. Proteine dieser Kompartimente
müssen nach ihrer Synthese im Zytosol an ihre Bestimmungsorte transportiert werden. Im
folgenden werden die Vorgänge näher beschrieben, die im Zytosol und an der Innenmembran
stattfinden. Hier lassen sich drei Schritte des Proteintransports voneinander abgrenzen:
Zunächst werden die zu transportierenden Proteine im Zytosol spezifisch erkannt. Im zweiten
Schritt werden sie an die Innenmembran herangeführt. Dieser Vorgang wird als Targeting
(Zielsteuerung) bezeichnet. Schließlich werden Innenmembranproteine in die Lipidschicht
integriert; lösliche periplasmatische Proteine sowie Außenmembranproteine müssen hingegen
durch die Innenmembran transloziert werden. Sie werden daher entsprechend der
Nomenklatur bei Eukaryonten als sekretorische Proteine bezeichnet.
Diese beiden unterschiedlichen Vorgänge, nämlich Integration der Innenmembranproteine
sowie Translokation sekretorischer Proteine, erfordern unterschiedliche Erkennungs-,
Targeting- und Transportmaschinerien (Abb. 2.1). Die Selektion für den jeweiligen
Transportweg erfolgt dabei bereits während einer frühen Phase der Proteintranslation am
Ribosom: Sekretorische Proteine werden – ebenso wie zytosolische – von dem
ribosomenassoziierten Chaperon Trigger factor gebunden; erst nach beendeter Translation
und Loslösung vom Ribosom erfolgt das SecA- und SecB-abhängige Targeting. Sekretorische
Proteine benutzen für ihre Translokation durch die Innenmembran das SecYEG-Translokon
als Membranpore; dieser Vorgang erfolgt posttranslational und erfordert die ATPase-Aktivität
von SecA sowie den Protonengradienten der Innenmembran. Polytope Innenmembranproteine
werden hingegen von dem Signal recognition particle (SRP) gebunden, das aus dem Protein
Ffh (Fifty-four homologue) und einer 4,5S RNA besteht. SRP erkennt die
Innenmembranproteine anhand ihrer langen hydrophoben Signal-Anker-Sequenzen.
Anschließend erfolgt durch die Interaktion zwischen SRP und seinem Rezeptor FtsY das
Targeting an das SecYEG-Translokon; dieses vermittelt die kotranslationale Integration in die
Innenmembran. Die Integrasefunktion des SecYEG-Translokons erfordert im Gegensatz zu
seiner Translokasefunktion nur die SecY- und SecE-Untereinheiten, nicht aber SecG, und
zusätzlich YidC.
Drei weitere Transportwege stehen offenbar nur wenigen Proteinen offen: Das PhagenMantel-Protein M13 procoat protein benötigt offenbar nur YidC für seine ansonsten von
Proteinen unabhängige Membraninsertion (Samuelson et al., 2000). Die erst kürzlich
identifizierte und noch wenig charakterisierte TAT-Maschinerie (TAT für Twin arginin
translocation) vermittelt den Membrantransport einiger Redoxfaktor-enthaltender Proteine in
vollständig gefaltetem Zustand (Berks et al., 2000). Toxine wie z.B. Hämolysin werden mit
2 Einleitung
3
Hilfe von ABC-Transportern (ABC für ATP binding cassette) über die Innen- und
Außenmembran ins Zelläußere transportiert (Binet et al., 1997).
In den folgenden Kapiteln werden die einzelnen Schritte im SecA/SecB-abhängigen
Transport sekretorischer Proteine und im SRP-abhängigen Transport polytoper
Innenmembranproteine einander gegenübergestellt.
Signalpeptidase
N
G
G
SecA
G E
E
N
C
N
Sec
Y
E
Yid
C
E N
FtsY
SRP
SRP
ADP + Pi
C
SecA
FtsY
µH +
C
ATP
SecB
E
SecA
SecA
Yid
C
Sec
Y
Sec
Y
Sec
Y
Sec
Y
N
N
SecB
C
N
SRP
TF
SRP
A
TF
B
Abb. 2.1: Membrantransport von sekretorischen Proteinen (A) und Innenmembranproteinen
(B) in Escherichia coli
A: Sekretorische Proteine werden am Ribosom von Trigger factor (TF) erkannt; ihr Targeting an
das SecYEG-Translokon findet posttranslational statt und wird von SecA und SecB vermittelt.
SecA transloziert sekretorische Proteine in ATP-abhängigen Zyklen durch die Innenmembran; bei
diesen Zyklen dreht sich die Membrantopologie von SecG um. Der Protonengradient
Innenmembran
+
(∆µH )
unterstützt
die
Translokation.
Die
Signalpeptidase
spaltet
der
die
Signalsequenz nach ihrer Translokation ab.
B: Polytope Innenmembranproteine werden kotranslational von SRP erkannt; dieses vermittelt
zusammen mit seinem Rezeptor FtsY das kotranslationale Targeting an das SecYEG-Translokon.
Bei der Integration in die Innenmembran sind nur SecY und SecE, nicht jedoch SecG, sowie YidC
beteiligt.
(Abb. modifiziert nach Müller et al., 2000)
2 Einleitung
4
2.2 Transportsignale
Bereits 1975 schlugen Blobel und Dobberstein in ihrer ”Signalhypothese” vor, daß in allen
Zellen sekretorische Proteine anhand N-terminaler Signale erkannt werden. In der Tat
konnten sowohl für sekretorische Proteine als auch für polytope Innenmembranproteine
Transportsignale identifiziert werden.
2.2.1 Signalsequenz sekretorischer Proteine
Bakterielle sekretorische Proteine werden in der Regel als Vorläuferproteine
(Präkursorproteine) synthetisiert, die am N-Terminus eine abspaltbare Signalsequenz tragen.
Erst im Laufe ihrer Translokation wird diese Signalsequenz durch die Signalpeptidase, ein
integrales Membranprotein der Innenmembran, entfernt. Die Signalsequenz ist 18 bis 26
Aminosäuren lang und setzt sich aus drei Regionen zusammen: Der positiv geladenen, Nterminalen N-Region, der hydrophoben H-Region sowie der eher polaren, C-terminalen CRegion, welche die Schnittstelle für die Signalpeptidase enthält (von Heijne, 1990). In
Abb. 2.2 ist exemplarisch die Signalsequenz des Outer membrane protein A (OmpA)
dargestellt.
OmpA
MKK TAIAIAVALAGFATV AQA
N
C
H
MtlA
MSSDIKIKVQSFGRFLSNMVMPNI GAFIAWGIITALFIPTGWLP
Signal-Anker-Sequenz
Amphiphile Helix
Abb. 2.2: Signalsequenz von OmpA (oben) und Signal-Anker-Sequenz mit vorangehender
amphiphiler Helix von MtlA (unten)
Oben: Die N-Region (3 AS) der OmpA-Signalsequenz enthält zwei positiv geladene Lysine (K), die
H-Region (15 As, gelb hinterlegt) besteht aus hydrophoben Aminosäuren und die C-Region (3 As)
enthält an den Positionen –1 und –3 vor dem reifen OmpA Alanine (A), eine Aminosäure mit
kleinen, neutralen Seitenketten. Dieses Motiv wird von der Signalpeptidase erkannt, sie spaltet die
Signalsequenz ab (blauer Pfeil).
Unten: Die N-terminale Signal-Anker-Sequenz (20 As, gelb hinterlegt) besteht aus hydrophoben
Aminosäuren; ihr geht eine amphiphile Helix voraus, die ebenfalls eine positive Nettoladung trägt:
Sie enthält zwei positiv geladene Lysine (K), ein positiv geladenes Arginin (R), aber nur ein negativ
geladenes Aspartat (D).
Die N-Region ist 1-5 Aminosäuren lang und enthält die basischen Aminosäuren Lysin oder
Arginin. Diese positive Ladung ist für die korrekte Orientierung der Signalsequenz in der
Innenmembran
verantwortlich:
Die
negativ
geladenen
Kopfgruppen
der
Membranphospholipide halten die N-Region auf der zytosolischen Seite fest (de Vrije et al.,
1990); dies wird vermutlich durch das elektrochemische Membranpotential (auf der
5
2 Einleitung
zytosolischen Seite negativ) unterstützt (von Heijne, 1986a). Die hydrophobe H-Region ist 7
bis 15 Aminosäuren lang und bildet eine α-Helix aus, mit der die Signalsequenz in der
Innenmembran verankert wird. Die Translokationseffizienz ist von der Hydrophobizität und
Länge der H-Region abhängig (Chou und Kendall, 1990; Doud et al., 1993). Die C-Region
ist 3-7 Aminosäuren lang und enthält die Schnittstelle für die Signalpeptidase: Die
Aminosäuren an den Positionen -1 und -3 vor der Schnittstelle tragen kleine, neutrale
Seitenketten. Die Prozessierung des Vorläuferproteins ist für seine Translokation jedoch nicht
essentiell: Nach einer Mutation in der Schnittstelle bleibt das Vorläuferprotein über seine
Signalsequenz in der Membran verankert. Die C-Region der Signalsequenz sowie der NTerminus des reifen Proteins sind neutral oder negativ geladen: Basische Aminosäuren in
dieser Region stören die korrekte Orientierung der Signalsequenz in der Innenmembran und
behindern dadurch die Translokation (Li et al., 1988).
Obwohl alle sekretorischen Proteine Signalsequenzen enthalten, wurde auch eine
Translokation signalsequenzloser Proteine unter bestimmten Voraussetzungen beobachtet
(Derman et al., 1993; Flower et al., 1994; Prinz et al., 1996). Umgekehrt führt die artifizielle
Ausstattung von Proteinen mit einer Signalsequenz nicht immer zu deren Translokation (Lee
et al., 1989). Dies läßt darauf schließen, daß auch der reife Proteinanteil, also das Protein
ohne seine Signalsequenz, eine wesentliche Rolle beim Transport dieser Proteine spielt.
Hiermit stimmt überein, daß sowohl Trigger factor als auch SecB auch an nicht-sekretorische
Proteine binden. Durch genetische Analysen wurden secA-, secY-, secE- und secG-Mutanten
gefunden, die einen durch eine mutierte Signalsequenz bedingten Translokationsdefekt
aufheben (Bieker et al., 1990; Schatz und Beckwith, 1990; Bost und Belin, 1997). Daraus
wurde zunächst geschlossen, daß diese vier Sec-Proteine direkt mit der Signalsequenz
interagieren. Biochemisch konnte solch eine Interaktion jedoch nur mit SecA gezeigt werden
(Miller et al., 1998).
2.2.2 Signal-Anker- und Stopp-Transfer-Sequenzen polytoper Innenmembranproteine
Polytope Innenmembranproteine tragen im Gegensatz zu sekretorischen Proteinen keine
abspaltbare Signalsequenz. Statt dessen sind sie mit einer sich abwechselnden Folge von
Signal-Anker- und Stopp-Transfer-Sequenzen ausgestattet. Diese sind hydrophober und mit
ca. 20 Aminosäuren länger als die H-Region der Signalsequenz sekretorischer Proteine. In
Abb. 2.2 wird die erste Signal-Anker-Sequenz der Mannitpermease (MtlA) mit der
Signalsequenz von OmpA verglichen. Die Signal-Anker- und Stopp-Transfer-Sequenzen
bilden jeweils α-Helices aus, die die Innenmembran als transmembrane Domänen
durchspannen. Die korrekte Membranorientierung ergibt sich aus der “positiv-inside rule”:
Signal-Anker-Sequenzen sind N-terminal, Stopp-Transfer-Sequenzen jedoch C-terminal von
basischen Aminosäuren flankiert (von Hejine, 1986b). Experimentell läßt sich die
Membranorientierung durch einen Tausch der Ladungsverteilung umdrehen (von Heijne,
1989).
2 Einleitung
6
2.3 Erkennung der naszierenden Ketten am Ribosom
Sekretorische Proteine werden posttranslational durch die Innenmembran transloziert,
während polytope Innenmembranproteine kotranslational in diese integriert werden. Dies
macht eine spezifische Erkennung der naszierenden Ketten schon während einer frühen Phase
ihrer Synthese am Ribosom notwendig: Naszierende Ketten sekretorischer Proteine müssen
von Chaperonen gebunden und an ihrer Faltung gehindert werden, da die Proteine für ihre
Translokation zumindest teilweise entfaltet vorliegen müssen (Randall und Hardy, 1986).
Polytope Innenmembranproteine sind sehr hydrophob und daher im wässrigen Milieu des
Zytosols besonders aggregationsgefährdet (Ahrem et al., 1989). Ihre kotranslationale
Integration erfordert daher einen raschen Transport der naszierenden Ketten zum SecYEGTranslokon, bevor die Translation weit fortgeschritten ist.
2.3.1 Sekretorische Proteine werden von Trigger factor erkannt
Sekretorische Proteine werden während ihrer Synthese am Ribosom von Trigger factor
gebunden. Trigger factor ist ein 48 kD großes, nicht essentielles Protein, das in allen bisher
untersuchten Bakterien vorkommt (Bukau et al., 2000). Seinen Namen erhielt Trigger factor
aufgrund der Beobachtung, daß er den Membrantransport von OmpA ”triggert”, indem er das
Vorläuferprotein pOmpA in einer translokationskompetenten, lose gefalteten Konformation
hält (Crooke und Wickner, 1987). Trigger factor bindet vermutlich nahe dem Ausgang des
Peptidkanals an die große Ribosomenuntereinheit und ist sowohl ein Chaperon als auch eine
Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase (PPIase). Trigger factor besteht aus drei Domänen: Die
N-terminale Domäne vermittelt die Bindung ans Ribosom; die zentrale Domäne besitzt
PPIase-Aktivität und vermittelt die Substratbindung; die Funktion der C-terminalen Domäne
ist bisher nicht bekannt (Stoller et al., 1996; Hesterkamp et al., 1997; Scholz et al., 1998).
Trigger factor interagiert in vitro mit naszierenden Ketten aller bisher getesteten
sekretorischen und zytosolischen Proteine (Hesterkamp et al., 1996; Valent et al., 1995,1997;
Beck et al., 2000). Dabei dient die Signalsequenz sekretorischer Proteine offenbar nicht als
primäre Bindestelle für Trigger factor: Trigger factor bindet auch an naszierende Ketten mit
stark modifizierten Signalsequenzen (Valent et al., 1997); seine Bindestelle(n) ist (sind) also
im reifen Proteinanteil enthalten. Die Interaktion von Trigger factor mit naszierenden Ketten
sekretorischer Proteine verhindert das Binden von SRP: Nur in Abwesenheit von Trigger
factor kann SRP mit geringer Affinität an naszierende Ketten sekretorischer Proteine binden
(Beck et al., 2000). Außerdem verhindert Trigger factor das kotranslationale Binden von
SecB und SecA: Nach der Beendigung der Translation und Freisetzung der Polypeptidkette
vom Ribosom dissoziiert Trigger factor von der Polypeptidkette und SecB und SecA können
binden (Beck et al., 2000).
Trigger factor könnte also zwei unterschiedliche Rollen bei der Translokation sekretorischer
Proteine erfüllen: Einerseits dient Trigger factor als Chaperon und hält sein Substrat in
teilweise ungefalteter Konformation, bevor SecB diese Rolle übernehmen kann. Andererseits
7
2 Einleitung
könnte Trigger factor naszierende Ketten sekretorischer Proteine vor der Bindung durch SRP
schützen; die Bindung naszierender Ketten durch Trigger factor führt jedoch per se nicht zur
Translokation: Auch zytosolische Proteine werden von Trigger factor erkannt und gebunden
(Hesterkamp et al., 1996; Valent et al., 1995 und 1997). Außerdem führt die Depletion von
Trigger factor nicht zu einem Defekt in der Proteintranslokation (Guthrie und Wickner,
1990).
2.3.2 Polytope Innenmembranproteine werden von SRP erkannt
Im Gegensatz zu sekretorischen Proteinen werden naszierende Ketten polytoper
Innenmembranproteine nicht von Trigger factor gebunden (Beck et al., 2000). Statt dessen
werden sie vom Signal recognition particle (SRP) erkannt und gebunden (Einzelheiten zu
SRP siehe 2.4.2). Dabei erkennt SRP seine Substrate anhand ihrer N-terminalen SignalAnker-Sequenzen (Valent et al., 1997; de Gier et al., 1998; Beck et al., 2000). Diese sind im
Vergleich zu den Signalsequenzen sekretorischer Proteine deutlich länger und hydrophober;
dementsprechend können auch sekretorische Proteine von SRP erkannt werden, wenn die
Hydrophobizität ihrer Signalsequenz artifiziell erhöht wird (Valent et al., 1997; Lee und
Bernstein, 2001). Ob SRP neben der N-terminalen auch die weiter C-terminal folgenden
Signal-Anker-Sequenzen erkennt, ist bisher nicht geklärt. Anschließend erfolgt durch die
Interaktion zwischen SRP und seinem Rezeptor FtsY das Targeting an das SecYEGTranslokon.
2.4 Targeting an das SecYEG-Translokon
2.4.1 SecB und SecA sind am Targeting sekretorischer Proteine beteiligt
Nach beendeter Translation werden die sekretorischen Vorläuferproteine vom Ribosom
freigesetzt. Dabei verlieren sie auch ihren Kontakt mit dem ribosomenassoziierten Chaperon
Trigger factor (Beck et al., 2000). Die Vorläuferproteine müssen jetzt zum Translokon in der
Innenmembran transportiert werden (Targeting); dabei müssen sie weiterhin an ihrer Faltung
gehindert werden. Bei bestimmten Vorläuferproteinen übernimmt SecB die Aufgabe als
Chaperon (Collier et al., 1988; Lecker et al., 1990) und kooperiert mit SecA beim Targeting
dieser Vorläuferproteine (Hartl et al., 1990; Swidersky et al., 1990).
SecB ist ein nicht-essentielles Protein, das nur in gramnegativen Bakterien vorkommt. Die
17 kD großen Untereinheiten bilden Homotetramere (Driessen, 2001). Vor kurzem konnte die
Kristallstruktur von SecB aus Haemophilus influenzae bestimmt werden (Abb. 2.3; Xu et al.,
2000). Das Tetramer ist als ein Dimer aus Dimeren organisiert und hat eine rechteckige Form.
Auf beiden Seiten befindet sich ein langgestreckter Kanal, der zwei unterschiedliche
Peptidbindestellen enthält. Die eine Bindestelle ist eine tiefe Spalte, die vermutlich
hydrophobe und aromatische Peptidregionen erkennt; die zweite Bindestelle ist eine flache
Rinne, die vermutlich ausgedehnte Peptidregionen mit hohem Gehalt an basischen
Aminosäuren bindet. Mithilfe einer Peptidbibliothek wurde ein entsprechendes SecB-
2 Einleitung
8
Bindemotiv auf sekretorischen Proteinen ermittelt, das neun Aminosäuren lang und reich an
aromatischen und basischen Aminosäuren ist (Knoblauch et al., 1999). Um die
Peptidbindestellen auf beiden Seiten des SecB-Tetramers zu besetzen, wickeln sich die
sekretorischen Proteine vermutlich als langgestreckte Polypeptidkette um das Chaperon
herum. Tatsächlich wurden auf sekretorischen Proteinen bis zu 460 Aminosäuren lange
Bereiche identifiziert, die von SecB gebunden werden (Smith et al., 1997). Da SecB in vitro
auch an zytosolische Proteine bindet, ergibt sich die Frage, wie seine Spezifität für
sekretorische Proteine in vivo entsteht. SecB erkennt Peptidsequenzen, die sich bei gefalteten
Proteinen typischerweise im Inneren befinden, und bindet daher bevorzugt an ungefaltete
Polypeptide (Knoblauch et al., 1999). Die Signalsequenz sekretorischer Proteine verlangsamt
deren Faltung (Park et al., 1988); nach dem “Kinetic partitioning model” wird dadurch die
Bindung von SecB möglich; nicht-sekretorische Proteine hingegen falten schneller und
verbergen potentielle SecB-Bindemotive in ihrem Inneren (Hardy und Randall, 1991). Die
Signalsequenz selbst ist jedoch keine primäre SecB-Bindestelle (Randall et al., 1990). Auch
die SecA-Bindestelle auf SecB konnte mit Hilfe der Kristallstruktur näher charakterisiert
werden (Abb. 2.3C): Die konservierten Aminosäuren Asp20, Glu24, Leu75 und Glu77, die
schon in früheren Arbeiten als SecA-Bindestelle identifiziert wurden (Kimsey et al., 1995;
Fekkes et al., 1998), liegen auf flachen Ebenen auf beiden Seiten des SecB-Tetramers. Diese
Ebenen sind negativ geladen. Auch die 13 C-terminalen Aminosäuren von SecB sind an der
SecA-Bindung beteiligt (Volkert et al., 1999). Sie bilden in der Kristallstruktur α-Helices in
der Form von sehr beweglichen Armen.
A
B
C
Abb. 2.3: Struktur von SecB
A SecB ist ein Homotetramer (Untereinheiten A-D); es ist als Dimer aus Dimeren organisiert. Die
13 C-terminalen Aminosäuren bilden jeweils α-Helices in der Form sehr beweglicher Arme (Pfeile).
Der Verlauf des Peptidbindekanals ist schwarz schraffiert.
B Der Peptidbindekanal (Ein- bzw. Ausgang mit Pfeilen markiert) enthält zwei unterschiedliche
Bindestellen: Bindestelle 1 ist eine tiefe Spalte; Bindestelle 2 ist eine flache Rinne.
C Die schon früher als SecA-Bindestelle identifizierten Aminosäuren von SecB (Pfeile) liegen auf
einer polaren Ebene. Die rote Kolorierung spiegelt das Maß an Polarität wieder. Das SecBTetramer ist in (C) im Vergleich zu (A) und (B) um 90° rotiert.
(Abb. aus Xu et al., 2000)
9
2 Einleitung
Der zweite Targetingfaktor für sekretorische Proteine ist SecA. Er ist für das
Membrantargeting sekretorischer Proteine unabdingbar (Hartl et al., 1990; Swidersky et al.,
1990). SecA ist ein essentielles Protein, das seine Biosynthese auf der Stufe der Translation
autoreguliert; die 102kD-Untereinheiten bilden Homodimere (Economou, 1998; Manting und
Driessen, 2000). SecA-Homologe wurden in allen Bakterien sowie in Chloroplasten
beschrieben, nicht jedoch in Archäen und Eukaryonten außerhalb der Chloroplasten. SecA
besteht aus zwei Domänen. Die 70 kD große N-Domäne hat ATPase-Aktivität; sie enthält
eine hochaffine sowie eine niedrigaffine Nukleotidbindestelle (Mitchell und Oliver, 1993).
Zwischen den beiden Nukleotidbindestellen liegt die Bindestelle für das Vorläuferprotein
(Kimura et al., 1991). Die 30 kD große C-Domäne ist für die Dimerisierung von SecA und für
die Regulation seiner ATPase-Aktivität verantwortlich (Hirano et al., 1996) und vermittelt die
Interaktion mit SecY (Snyders et al., 1997) und mit Membranphospholipiden. Die 22 Cterminalen Aminosäuren bilden die Bindestelle für SecB. Die Bindestelle ist hoch
konserviert: Sie enthält die basischen Aminosäuren Arginin und Lysin sowie ein CysteinHistidin-Motiv, das ein zweiwertiges Zinkion koordiniert (Fekkes et al., 1999); dadurch wird
eine optimale Bindung an die negativ geladene Bindeebene von SecB möglich. SecA liegt zur
Hälfte löslich im Zytosol vor, die andere Hälfte ist mit der Innenmembran assoziiert (Müller
et al., 2000). Diese Membranassoziation wird durch SecY und Phospholipide vermittelt.
Mögliche Bindestellen für SecA auf Vorläuferproteinen sind bisher noch wenig
charakterisiert. Sowohl die Signalsequenz als auch Regionen im reifen Proteinteil scheinen
hieran beteiligt zu sein (Miller et al., 1998). Es konnte jedoch gezeigt werden, daß SecA
unabhängig von SecB an Vorläuferproteine binden kann (Beck et al., 2000). Daher müssen
für SecB und SecA individuelle Bindestellen existieren.
In mehreren Arbeiten wurde die Bindung von SecA (Chun und Randall, 1994) und SecB
(Kumamoto und Francetic, 1993; Randall et al., 1997) an ribosomenassoziierte naszierende
Ketten gezeigt. Dem widersprechen jedoch neuere Daten, nach denen die Polypetidketten erst
nach ihrer Ablösung vom Ribosom mit SecA und SecB interagieren. Solange die naszierende
Kette am Ribosom gebunden ist, werden ihre Bindestellen für SecA und SecB offenbar durch
das ribosomenassoziierte Chaperon Trigger factor blockiert (Beck et al., 2000).
Dementsprechend können SecA und SecB das Membrantargeting sekretorischer Proteine erst
nach deren Loslösung vom Ribosom übernehemen (Behrmann et al., 1998).
Es bleibt umstritten, ob SecA in seiner löslichen Form oder in seiner membrangebundenen
Form den Komplex aus Vorläuferprotein und SecB bindet: Im ersten Modell bindet lösliches
SecA zunächst den Komplex aus Vorläuferprotein und SecB und bindet erst dann an das
SecYEG-Translokon (Hoffschulte et al., 1994). Im zweiten Modell hat SecA bereits an das
SecYEG-Translokon gebunden und dient als Rezeptor für den Komplex aus Vorläuferprotein
und SecB (Fekkes et al., 1997). Jedenfalls spielt die Signalsequenz bei der Bildung des
großen Komplexes aus Vorläuferprotein, SecB, SecA und SecYEG eine wesentliche Rolle
(Fekkes et al., 1998). Sobald SecA ATP bindet, dissoziiert SecB von diesem großen Komplex
2 Einleitung
10
(Fekkes et al., 1997). SecA bildet hingegen mit seiner ATPase-Aktivität den Motor des
Translokationsvorgangs.
2.4.2 SRP und sein Rezeptor FtsY sind am Targeting polytoper Innenmembranproteine
beteiligt
Das Signal recognition particle (SRP) und sein Rezeptor (SR für SRP-Rezeptor) existieren in
allen drei Domänen des Lebens, also in Bakterien, Archäen und Eukaryonten. Sie wurden
erstmals in Säugerzellen entdeckt und vermitteln hier das kotranslationale Targeting sowohl
von sekretorischen Proteinen als auch von Membranproteinen an das Endoplasmatische
Retikulum (Keenan et al., 2001). Das Säuger-SRP besteht aus einer 7SL RNA sowie sechs
Proteinuntereinheiten, die nach ihrem Molekulargewicht benannt sind. Sein Rezeptor SR
besteht aus einer α-Untereinheit, die die Bindestelle für SRP enthält, sowie einer
β-Untereinheit, die als Membrananker dient. Sobald bei der Synthese von sekretorischen
Proteinen oder Membranproteinen die Signalsequenz auf der Oberfläche des Ribosomen
erscheint, wird diese von SRP erkannt: SRP bindet über seine Komponenten SRP54 und
7SL RNA sowohl an die Signalsequenz als auch an das Ribosom. Im Anschluß an die
Erkennung der naszierenden Kette bewirken SRP9 und SRP14 eine Translationsarretierung;
diese beiden Komponenten sind über eine spezielle Domäne der 7SL RNA, der Alu-Domäne,
mit den anderen SRP-Komponenten verknüpft. Anschließend erfolgt das Targeting der
arretierten naszierenden Kette durch die Bindung von SRP54 an den SRP-Rezeptor SR.
Sowohl SRP54 als auch SRα haben stark homologe GTPase-Domänen; diese durchlaufen
einen typischen Zyklus: Die Bindung von SRP54 an SRα erfolgt im nukleotidfreien Zustand;
anschließend binden beide GTP. Hierauf wird die Signalsequenz auf den Sec61-Komplex, das
Homolog zum SecYEG-Komplex, übertragen. Die anschließende GTP-Hydrolyse führt zur
Dissoziation der Bindungspartner, die schnell in den nukleotidfreien Zustand zurückkehren
(Rapiejko und Gilmore, 1997). Auch SRβ trägt eine GTPase-Domäne, deren Funktion
allerdings noch unklar ist.
In Escherichia coli existieren Homologe zu SRP54, der 7SL RNA und SRα, nämlich das
Fifty-four homologue (Ffh), die 4,5S RNA sowie FtsY (Keenan et al., 2001). Alle drei
SRP/SR-Komponenten sind essentielle Zellbestandteile. Ffh wird nach seinem eigenen
Molekulargewicht auch P48 genannt. Es besteht wie das eukaryote homologe Protein aus drei
Domänen: Die Funktion der N-Domäne ist bisher nicht bekannt. Die G-Domäne ist eine
GTPase vom Ras-Typ und für die Bindung an FtsY verantwortlich (Freymann et al., 1997).
Die M-Domäne bindet die Domäne IV der 4,5S RNA. Zusammen bilden sie den hoch
konservierten Kern von SRP, dessen Kristallstruktur vor kurzem bestimmt wurde (Keenan et
al., 1998; Batey et al., 2000): Eine tiefe Grube dient durch hydrophobe und elektrostatische
Wechselwirkungen als Erkennungsstelle für Signal-Anker-Sequenzen (Abb. 2.4). Die 4,5S
RNA ist mit 114 Nukleotiden wesentlich kleiner als ihr Säugerhomolog (über 300
Nukleotide). FtsY enthält wie das eukaryote homologe Protein eine N- sowie eine G-Domäne,
2 Einleitung
11
welche ebenfalls eine GTPase vom Ras-Typ ist und die SRP-Bindung vermittelt (Montoya et
al., 1997). Zusätzlich verfügt FtsY über eine negativ geladene Region am N-Terminus, die ADomäne. In Escherichia coli wurde bisher kein homologes Protein zu SRβ identifiziert, das in
Säugerzellen als Membrananker dient. Wahrscheinlich bindet FtsY sowohl über
Phospholipide, als auch über ein bisher nicht identifiziertes Membranprotein, eventuell das
Translokon, an die Membran. Dabei spielt die A-Domäne eine wichtige Rolle (Millman et al.,
2001).
Signalerkennungsgrube
A
B
Abb. 2.4: Die M-Domäne von Ffh und die Domäne IV der 4,5S RNA bilden zusammen den
Kern von SRP
A Oberflächendarstellung des Komplexes aus der M-Domäne von Ffh (rot) und der Domäne IV der
4,5S RNA (blau). Hydrophobe Aminosäuren in der Signalerkennungsgrube sind gelb dargestellt,
die angrenzenden Nukleotide grün.
B In diesem Modell ist eine Signal-Anker-Sequenz (grüner und blauer Zylinder) in der
Signalerkennungsgrube gebunden. Ffh ist als rotes Band dargestellt, die 4,5S RNA als schwarze
Kette. Der positiv geladene N-Terminus der Signal-Anker-Sequenz zeigt zum negativ geladenen
Rückrat der 4,5S RNA (in diesem Bereich ist die 4,5S RNA rot eingezeichnet).
(Abb. aus Batey et al., 2000 und Walter et al., 2000)
Als mögliche Substrate für das bakterielle SRP wurden polytope Innenmembranproteine
identifiziert. Diese sind besonders hydrophob und aggregieren daher in vitro in der
Abwesenheit von Membranlipiden schnell (Ahrem et al., 1989). Ein kotranslationales
Targeting durch SRP könnte daher ihre Aggregation im wässrigen Milieu des Zytosols
verhindern. In der Tat konnte gezeigt werden, daß die Integration mehrerer polytoper
Innenmembranproteine von SRP abhängt (MacFarlane und Müller, 1995; Seluanov und Bibi,
1997; Tian et al., 2000). Um Proteine auf ihre Abhängigkeit von unterschiedlichen
Targetingfaktoren zu untersuchen, wurde ein zellfreies System aus Escherichia coli-Extrakten
entwickelt, das sowohl frei von SecA und SecB als auch von SRP und FtsY ist. Hierin konnte
gezeigt werden, daß ein polytopes Membranprotein für seine Integration in
Innenmembranvesikel alle drei SRP/SR-Komponenten benötigt, nicht jedoch SecA oder
SecB. Für den Transport eines sekretorischen Proteins hingegen werden SecA und SecB,
nicht jedoch die SRP/SR-Komponenten benötigt (Koch et al., 1999).
2 Einleitung
12
Das SRP-abhängige Targeting in Bakterien scheint dem in Säugerzellen in vielen Punkten zu
entsprechen: Auch das Targeting in Bakterien erfolgt kotranslational (Beck et al., 2000) und
erfordert eine Interaktion zwischen Ffh, FtsY und Membranlipiden; die Bindung von Ffh an
FtsY erfolgt dabei in Abwesenheit von Nukleotiden, während die Dissoziation von Ffh und
FtsY die Bindung von GTP (Valent et al., 1998; Scotti et al., 1999) sowie dessen Hydrolyse
(Miller et al., 1994) erfordert. Bisher ist in Escherichia coli jedoch im Gegensatz zu
Säugerzellen keine Translationsarretierung beobachtet worden. Für die SRP-Komponenten
SRP9, SRP14 und die Alu-Domäne der 7SL RNA, die in Säugerzellen die
Translationsarretierung bewirken, finden sich in Escherichia coli keine Homologe. Ein
weiterer Unterschied zum eukaryotischen System besteht darin, daß der bakterielle SRPRezeptor FtsY sowohl löslich als auch membranassoziiert vorliegt. Ob eine funktionelle
Bindung von Ffh auch an lösliches FtsY erfolgen kann, ist noch umstritten (Zelazny et al.,
1997; Valent et al., 1998).
2.5 Translokation und Integration am SecYEG-Translokon
Obwohl die posttranslationale Translokation sekretorischer Proteine und die kotranslationale
Integration polytoper Innenmembranproteine zwei grundlegend unterschiedliche Vorgänge
sind, benutzen beide die gleiche Membranpore, das SecYEG-Translokon (Koch et al., 1999).
Wesentliche Unterschiede bestehen jedoch in der Energetisierung der Transportvorgänge
sowie in den beteiligten Domänen und Kofaktoren des Translokons.
In vivo liegen die integralen Membranproteine SecY, SecE und SecG als Komplex vor und
bilden eine Membranpore, das SecYEG-Translokon (Manting und Driessen, 2000). SecY und
SecE sind essentielle Proteine mit zehn bzw. drei transmembranen Domänen. SecG ist ein
nicht-essentielles Protein mit zwei transmembranen Domänen. In Abwesenheit von SecE wird
SecY von der Protease FtsH abgebaut (Akiyama et al., 1996). SecY und SecE bilden auch
ohne SecG einen funktionellen Komplex (Akimaru et al., 1991); dabei sind multiple
Kontaktstellen zwischen SecY und SecE nachgewiesen worden (Manting und Driessen,
2000). Durch die Interaktion von SecE-Molekülen unterschiedlicher SecYEG-Komplexe
kommt es zu deren Oligomerisierung (Kaufmann et al., 1999). Wahrscheinlich liegt SecYEG
in seiner inaktiven Form als Dimer vor und bildet in seiner aktiven Form als Translokon ein
Tetramer (Manting et al., 2000).
Neben SecYEG gibt es noch einen weiteren Komplex, der von den kotranskribierten
Proteinen SecD, SecF und YajC gebildet wird. SecD- und secF-Deletionsmutanten sind kaum
lebensfähig; YajC ist hingegen nicht essentiell. Der SecDFYajC-Komplex liegt in nur sehr
wenigen Exemplaren pro Bakterienzellen vor; es ist bisher unklar, ob dieser Komplex mit
SecYEG nur transient assoziiert oder einen stabilen Holokomplex bildet.
13
2 Einleitung
2.5.1 Translokasefunktion des SecYEG-Translokons
Für die Translokation sekretorischer Vorläuferproteine in Proteoliposomen sind in vitro SecA,
ATP und isolierte SecY-SecE-Komplexe ausreichend (Akimaru et al., 1991). In vivo wird
zusätzlich SecB für das Targeting zahlreicher Vorläuferproteine benötigt. Die Rollen von
SecB und SecA beim Targeting sekretorischer Vorläuferproteine an das SecYEG-Translokon
wurden bereits oben beschrieben. Dieses Targeting führt zur Bindung eines Komplexes aus
Vorläuferprotein, SecA und SecB an das SecYEG-Translokon. Daneben stellt SecA jedoch
auch den Motor der Translokation dar (Economou und Wickner, 1994; Economou 1998):
Nach der Bindung von ATP an SecA dissoziiert SecB von dem Komplex und SecA inseriert
tief in die Membran. Bei dieser Membraninsertion nimmt SecA einen N-terminalen Abschnitt
des Vorläuferproteins inklusive der Signalsequenz mit; diese kann hierauf von der
Signalpeptidase abgespalten werden. Die Hydrolyse des gebundenen ATPs führt zur
Deinsertion von SecA; durch wiederholte ATP-abhängige Insertions-Deinsertions-Zyklen
kann SecA so das gesamte Protein in Abschnitten von 20 bis 40 Aminosäuren durch die
Membran “hindurchfädeln”. Die Länge des je Zyklus translozierten Abschnittes wird durch
hydrophobe Abschnitte und Sekundärstrukturen wie zum Beispiel Disulfidbrücken
vermindert (Uchida et al., 1995; Sato et al., 1997; van der Wolk et al., 1997). Neben der
ATP-Hydrolyse dient auch der Protonengradient der Innenmembran der Energetisierung der
Translokation (Swidersky et al., 1990).
Die Rolle der einzelnen Translokonkomponenten bei der Translokation sind erst teilweise
bekannt. SecY interagiert während der Translokation direkt mit SecA und seinem Substrat.
Der Austausch einer einzelnen Aminosäure in der C-terminalen zytosolischen Domäne in der
secY205-Mutante verhindert die Insertion von SecA und führt somit zu einer starken
Beeinträchtigung der Translokation (Matsumoto et al., 1997). Auch SecE ist für die
Translokation essentiell; hierfür sind jedoch die dritte transmembrane Domäne und die
angrenzende zytosolische Schleife ausreichend (Schatz et al., 1991). SecG wird für die
Translokation in Proteoliposomen nicht benötigt; bei niedrigen Temperaturen oder in
Abwesenheit des Protonengradienten ist es jedoch für Zellwachstum und Proteintranslokation
essentiell (Hanada et al., 1996). Während der Membraninsertion von SecA dreht sich die
Membrantopologie von SecG um (Nishiyama et al., 1996); möglicherweise ist diese Inversion
der SecG-Topologie mit dem Insertions-Deinsertions-Zyklus von SecA gekoppelt und
unterstützt diesen. Über die Rollen von SecD, SecF und YajC bei der Translokation gibt es
erst vage Vorstellungen; secD- und secF-Mutanten zeigen Translokationsdefekte, yajCMutanten jedoch nicht.
2.5.2 Integrasefunktion des SecYEG-Translokons
Auch naszierende Ketten verschiedener Innenmembranproteine können mit SecY
quervernetzt werden (Valent et al., 1998; Scotti et al., 1999; Beck et al., 2000). Nach der
Blockierung des SecYEG-Translokons ist nicht nur die Translokation sekretorischer Proteine,
2 Einleitung
14
sondern auch die Integration polytoper Innenmembranproteine beeinträchtigt (Koch et al.,
1999). Dies zeigt, daß das SecYEG-Translokon auch als Integrationspore für polytope
Innenmembranproteine dient.
Bei der Translokation bzw. Integration sind jedoch unterschiedliche Domänen von SecY
beteiligt: Die kältesensitive Mutante secY40 reagiert stark sensitiv auf reduzierte SRP-Spiegel
und zeigt reduzierte Integrationsraten, jedoch keinen Translokationsdefekt (Newitt und
Bernstein, 1998). Eine Mutation in der C-terminalen zytosolischen Domäne von SecY
(secY205) stört die Interaktion mit SecA (Matsumoto et al., 1997); hierdurch wird die
Translokation stark eingeschränkt, während die Integration nicht betroffen ist (Koch und
Müller, 2000). Neben SecY erfordert die Integration polytoper Innenmembranproteine auch
SecE: Konditionelle secE-Mutanten sowie secY24-Mutanten, deren Interaktion mit SecE
gestört ist, zeigen sowohl einen Translokations- als auch einen Integrationsdefekt (Koch und
Müller, 2000). Wie oben beschrieben, spielt SecG wahrscheinlich bei den InsertionsDeinsertions-Zyklen von SecA eine Rolle. Da SecA an der kotranslationalen Integration
polytoper Innenmembranproteine nicht beteiligt ist, sollte dies folglich auch für SecG
zutreffen. In der Tat wurde in einer secG-Mutante ein Translokationsdefekt, jedoch keine
Beeinträchtigung der Integration polytoper Innenmembranproteine beobachtet (Koch und
Müller, 2000). Somit ist auch verständlich, daß Eukaryonten SecY- und SecE-, nicht jedoch
SecG-homologe Proteine haben: In Eukaryonten gibt es auch kein SecA. Vor kurzem wurde
beobachtet, daß auch YidC an der Integration SRP-abhängiger Innenmembranproteine
beteiligt ist (Scotti et al., 2000; Houben et al., 2000). YidC ist ein essentielles integrales
Membranprotein, daß zu Oxa1p in Mitochondrien und Albino3 in Chloroplasten homolog ist.
YidC scheint auf die Integration von Membranproteinen spezialisiert zu sein: Auch die
Insertion des M13 procoat protein, die nicht auf die Hilfe anderer Proteine angewiesen ist,
benötigt YidC (Samuelson et al., 2000).
Die Integration von Innenmembranproteinen findet im Gegensatz zur Translokation
sekretorischer Proteine kotranslational statt (Beck et al., 2000). Dabei geht - wie schon früher
in Säugerzellen beobachtet - das Ribosom auch in Bakterien einen engen Kontakt mit dem
Translokon ein und dichtet es dadurch vermutlich ab (Prinz et al., 2000).
2.6 Kooperieren SecA/SecB und SRP beim Transport bestimmter
Substrate?
In den vorangehenden Kapiteln wurden die SecA/SecB-abhängige Translokation
sekretorischer Proteine und die SRP-abhängige Integration polytoper Innenmembranproteine
einander gegenübergestellt. In mehreren Arbeiten wurde jedoch gezeigt, daß neben SRP auch
SecA am Membrantransport bestimmter Innenmembranproteine beteiligt ist. Die dabei
untersuchten Proteine besitzen neben transmembranen Domänen zusätzlich ausgedehnte
periplasmatische Domänen, die durch die Innenmembran transloziert werden müssen (Details
siehe 6.8). Bisher war die Rolle von SecA beim Transport dieser Proteine umstritten:
15
2 Einleitung
Einerseits wurde die Interaktion von SecA mit Innenmembranproteinen als unspezifische
Interaktion gedeutet (Manting und Driessen, 2000), andererseits wurde vorgeschlagen, daß
SecA die Translokation der großen periplasmatischen Domänen katalysiert (Scotti et al.,
1999; Dalbey et al., 2000); ein weiteres Modell ging davon aus, daß SecA ein obligater
Bestandteil des Translokons ist und auch bei der Integration transmembraner Domänen eine
essentielle Funktion hat (Qi und Bernstein, 1999).
3 Zielsetzung
3
16
Zielsetzung
Für das Targeting ungefaltener Proteine an die Innenmembran und ihren anschließenden
Transport sind in Escherichia coli im wesentlichen zwei unterschiedliche Wege beschrieben
(Abb. 2.1): Das Membrantargeting und die Translokation sekretorischer Proteine werden
durch Trigger factor, SecA und SecB vermittelt, während das Membrantargeting und die
Integration polytoper Innenmembranproteine durch das Signal recognition particle (SRP)
sowie seinen Rezeptor FtsY vermittelt werden. Entscheidend für dieses duale Targeting ist
dabei die spezifische Erkennung der jeweiligen Substrate, die während ihrer Synthese am
Ribosom stattfindet: Sekretorische Proteine werden anhand ihrer reifen Proteinanteile durch
Trigger factor erkannt; ihre Signalsequenz scheint dabei eine untergeordnete Rolle zu spielen.
Polytope Innenmembranproteine werden hingegen anhand ihrer Signal-Anker-Sequenz(en)
durch SRP erkannt. Dieses Konzept zweier individueller Transportmechanismen beruht im
wesentlichen auf Arbeiten mit dem sekretorischen SecA/SecB-abhängigen Protein Outer
membrane protein A (OmpA) sowie dem SRP-abhängigen polytopen Innenmembranprotein
Mannitpermease (MtlA) (Koch et al., 1999; Beck et al., 2000). Es wird jedoch durch Arbeiten
in Frage gestellt, denen zufolge sowohl SRP als auch SecA an der Integration bestimmter
Innenmembranproteine beteiligt sind (Traxler und Murphy, 1996; Valent et al., 1998; Qi und
Bernstein, 1999; Tian et al., 2000).
Ziel dieser Arbeit war es daher, in dem für OmpA und MtlA etablierten zellfreien System zu
klären, ob für die Integration bestimmter Innenmembranproteine sowohl SRP als auch SecA
benötigt werden. Gegebenenfalls sollten die unterschiedlichen Funktionen von SRP und SecA
bei der Integration dieser Innenmembranproteine untersucht werden. Als Modellprotein
wurde ein Hybridprotein aus der ersten Signal-Anker-Sequenz von MtlA sowie dem
signalsequenzlosen OmpA gewählt. Da die Signal-Anker-Sequenz von MtlA die
Erkennungssequenz für SRP darstellt, war auch eine Erkennung des Hybridproteins Momp2
durch SRP zu erwarten. So konnte geprüft werden, ob SRP alleine zur Integration von
Momp2 führt oder ob hierzu zusätzlich SecA benötigt wird. Dazu sollten das Hybridprotein
sowie OmpA und MtlA als ausschließlich SecA/SecB- bzw. SRP-abhängige Kontrollproteine
in einem zellfreien Transkriptions-Translations-System aus E. coli synthetisiert werden;
anschließend sollte ihre Interaktion mit unterschiedlichen Targeting- und Transportfaktoren in
Quervernetzungsversuchen untersucht und die Bedingungen für ihren Transport in
Innenmembranvesikel durch unterschiedliche Methoden (Protease-Resistenz-Test und
Differentialzentrifugation) charakterisiert werden.
17
4
4 Material und Methoden
Material und Methoden
4.1 Material
4.1.1 Chemikalien
S-Methionin / 35S-Cystein Markierungsmischung; „Enhanced
Chemiluminescence ECL Westernblotting System“
Baker:
Polyethylenglykol 6000
Boehringer Mannheim: Alkalische
Phosphatase;
Ampicillin;
Aprotinin;
ATP;
Chloramphenicol;
CTP;
E64
Proteaseinhibitor;
GTP;
Kanamycinsulfat;
Kreatinphosphat;
Kreatinphoshatkinase;
Leupeptin; PMSF; Proteinase K; RNaseH (Ribonuklease H);
Tetracylin; UTP
Caltag Laboratories:
Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper, Meerrettich-Peroxidase-gekoppelt
DIFCO:
Bacto-Agar für Agarplatten
BRL Life Technologies: 1-kb-DNA-Standard; gefärbte Molekulargewichtsmarker, niedrigbzw. hochmolekular
ICN:
Saccharose (ultra rein)
Kleeblatt:
Milchpulver
New England BioLabs: Restriktionsenzyme; T4-DNA-Polymerase; T4-DNA-Ligase
Merck:
Ammoniumperoxodisulfat; Bromphenolblau
Pharmacia:
Protein-A-Sepharose
Promega:
RNasin RNase-Inhibitor
Pierce:
DSS
Roth:
30 % Acrylamid / 0.8 % Bisacrylamid; BSA; DTT; EDTA;
Essigsäure; Ethanol; Ethidiumbromid; Glukose; Glycerin; Glycin;
Harnstoff; HCl; Hefeextrakt; Imidazol; IPTG dioxanfrei;
Isobuthanol; Isopropanol; Kaliumacetat; KH2PO4; K2HPO4; KOH;
Magnesiumacetat; MgCl2; NaCl; NaOH; Pepton aus Casein;
Ponceau S; SDS; TCA; Tris Base ultra rein; Triton X100
Serva:
Agarose für DNA-Elektrophorese; Brilliant Blau G 250
Sigma:
18 L-Aminosäuren (ohne Methionin und Cystein); DMSO rein;
Fruktose; Phosphoenolpyruvat; Puromycin; Putrescin; Spermidin;
TEMED; Triethanolamin; Tween 20; Xylencyanol
DNA-Oligonukleotide wurden von Dr. G. Igloi am Institut für Biologie III der Universität
Freiburg synthetisiert.
Amersham:
35
4.1.2 Geräte und Materialien
Abimed Gilson:
Agfa:
Bachhofer:
Peristaltikpumpe Minipuls 2
Röntgenfilmentwickler Curix 60
UV Transilluminator 312 nm
4 Material und Methoden
18
Beckman:
Airfuge-Ultrazentrifuge mit Rotor A-100/30; Ultrazentrifuge TL100; Rotor TLA 100.2; Ausschwingrotor SW28; Rotor 50.2 Ti
Biorad:
Geltrockner 583; Western-Transfer-Apparatur Trans-BlotTM Cell
Eppendorf:
Thermomixer 5436
Fuji:
Röntgenfilme (Medical X-Ray)
Heraeus:
Tischzentifuge Biofuge pico
Herolab:
Geldokumentation Easy Lab
Hettich:
Kühlzentrifuge Universal 16R
Hoefer:
Gradientenmischer
Kontes Glass:
Dounce Homogenisator
Kontron:
Ultrazentrifuge TGA-65; Ausschwingrotor TST 41.14
Kontron / Hermle:
Kühlzentrifuge Centrikon H-401; Rotoren A6.9 und A8.24
BRL Life Technologies: Agarosegelelektrophorese-Apparatur Horizon 11-14
Molecular Dynamics: Phosphoimager mit Expositionskassetten und Software Image Quant
Pharmacia:
FPLC-Anlage (Pumpe LKB Pump P-500, Kontrollgerät LKB
Controller LCC-500 Plus, Ventil LKB Motor Valve MV-7, UVMonitor Single Path Monitor UV-1, Schreibgerät LKB REC-2,
Fraktionssammler LKB RediFrac); Photometer Ultraspec 3000; pHMeter 766 Calimatic; Elektrophorese-Netzgerät EPS 500 / 400; 5 ml
HiTrap Chelating Säule; 5 ml HiTrap Desalting Säule;
Qiagen:
Plasmid Maxi Kit
Roth:
Spritzenfilter 0.2 µm
Schleicher und Schüll: Nitrozellulosemembran; Whatman 3MM Filterpapier
SCM Aminco:
French Pressure Zelle
Institutswerkstatt:
SDS-PAGE-Apparatur
4.1.3 Antibiotika
Antibiotikum
Konzentration der
Stammlösung
gelöst in
Verdünnungsfaktor
Endkonzentration
Ampicillin (Amp)
100 mg / ml
H2O
1 : 1000
100 µg / ml
Chloramphenicol
(Cm)
35 mg / ml
Ethanol
1 : 1000
35 µg / ml
Kanamycin (Kan)
50 mg / ml
H2O
1 : 1000
50 µg / ml
Tetracyclin (Tet)
5 mg / ml
50 % Ethanol
1 : 250
20 µg / ml
Die Antibiotika-Stammlösungen wurden über Filter (0.2 µm) steril filtriert.
4 Material und Methoden
19
4.1.4 Escherichia coli - Stämme
Stamm
Beschreibung
Resistenz Referenz
MRE600
RNase-negativ
Cammack und Wade, 1965 CTF
MC4100
araD139 ∆(argF-lac)
U169 rpsL150 relA1
flbB3501 deoC1 ptsF25
rbsR
Silhavy et al., 1984
CTF
DNA-Isolierung
(pDMB; pMomp2)
XL1-Blue
supE44 hsdR17 recA1
endA1 gyrA46 thi relA1
lacF‘ [proAB+ lacIq
lacZ∆M15 Tn10(tetr)]
Tet
Bullock et al., 1987
DNA-Isolierung
(p717MtlA-B)
N4156
pAra14FtsY’
polA end thy gyrA
pAra14-FtsY‘ (ftsY unter
Kontrolle des araB
Promotors)
Amp
Luirink et al., 1994
FtsY--CTF
AD179
MC4100∆ompT
Akiyama und Ito, 1990
Wildtyp-INV
TY1
ompT::kan, secY205
Kan, Tet Matsumoto et al., 1997
secY205-INV
BL21(DE3)
pLysS
F ompT hsdSB(rBmB) gal
dcm (DE3) pLyS
Cm
Ffh-Aufreinigung
[Novagen]
Verwendung
4.1.5 Plasmide
• pET-19b-P48 (G. Eisner, unveröffentlicht): ffh-10His unter T7-Promotor-Kontrolle in
pET-19b [Novagen]
• pDMB (Behrmann et al., 1998): ompA unter T7-Promotor-Kontrolle in pGEM-3Z
[Promega]
• p717MtlA-B (Beck et al., 2000): mtlA unter T7-Promotor-Kontrolle in pKSM717
(Maneewannakul et al., 1994)
Klonierung von pMomp2
Die Klonierung des Plasmids pMomp2 wurde von Dr. U. Schäfer durchgeführt
(Plasmidkarten und DNA-Sequenzen siehe 8.2 bzw. 8.3). Zunächst wurden im Plasmid
pDMB hinter der Signalsequenz von OmpA sowie im Plasmid p717MtlA-B hinter der ersten
Signal-Anker-Sequenz von MtlA SpeI-Schnittstellen eingefügt. Hierzu wurde eine
ortsspezifische Mutagenese mittels PCR in zwei Schritten in modifizierter Form (Beck, 2000)
nach Dilsiz und Crabbe (1994) durchgeführt (Abb. 4.1).
Im Fall von pDMB wurden in der ersten PCR der mutagene Primer OmpA66 mit der SpeISchnittstelle sowie OmpA168 als Primer verwendet; in der zweiten PCR kamen ein T7Promotor-Primer sowie das Produkt aus der ersten PCR zum Einsatz (Sequenzen der Primer
siehe Tabelle). Das hierbei entstandene Produkt wurde mit EcoRI und BstXI geschnitten und
in das mit alkalischer Phosphatase dephosphorylierte, ebenfalls mit EcoRI und BstXI
geschnittene Plasmid pDMB zurückkloniert. Das resultierende Plasmid wurde pOmpA-SpeI
genannt.
4 Material und Methoden
-167 -145
20
1
76
ompA
PT7
-146
EcoRI
67
Matrize: pDMB
117
BstXI
92
OmpA66-SpeI
150
169
Primer 1. PCR
OmpA168
-167 -148
-344
Primer 2. PCR
Produkt der 1. PCR
T7-PromotorPrimer
1
-302
139
Matrize: p717MtlA-B
mtlA
PT7
-31
NcoI
130 154
254
NcoI
MtlA129-SpeI
262
283
Primer 1. PCR
MtlA282
-344 -325
T7-PromotorPrimer
Produkt der 1. PCR
Primer 2. PCR
Abb. 4.1: Einführung der SpeI-Schnittstellen in pDMB und p717MtlA-B durch ortspezifische
Mutagenese. Gezeigt sind die Lokalisation der verwendeten Primer und die Schnittstellen der
Restriktionsenzyme im Bezug auf das ompA- bzw. mtlA-Gen.
Abb. 4.2: Klonierung von pMomp2 aus pOmpA-SpeI und p717MtlA-SpeI-2
pOmpA-SpeI wurde mit PstI geschnitten, die überstehenden 3‘-Enden mit T4-DNA-Polymerase
entfernt und das linearisierte Plasmid darauf mit SpeI geschnitten; p717MtlA-SpeI-2 wurde mit KpnI
geschnitten, die überstehenden 3‘-Enden mit T4-DNA-Polymerase entfernt und das linearisierte
Plasmid darauf mit SpeI geschnitten. Anschließend wurde das 3707 Bp Fragment von p717MtlASpeI-2 mit dem 1059 Bb Fragment von pOmpA-SpeI mit Hilfe der T4-DNA-Ligase ligiert und das
resultierende Plasmid pMomp2 genannt.
4 Material und Methoden
21
Im Fall von p717MtlA-B wurden in der ersten PCR der mutagene Primer MtlA129 mit der
SpeI-Schnittstelle sowie MtlA282 als Primer verwendet; in der zweiten PCR kamen
wiederum ein T7-Promotor-Primer sowie das Produkt aus der ersten PCR als Primer zum
Einsatz. Das hierbei entstandene Produkt wurde mit NcoI geschnitten und in das
dephosphorylierte, ebenfalls mit NcoI geschnittene Plasmid p717MtlA-B zurückkloniert. Das
resultierende Plasmid wurde p717MtlA-SpeI-2 genannt.
Anschließend wurden die Plasmide pOmpA-SpeI sowie p717MtlA-SpeI-2 mit SpeI sowie
einem zweiten Restriktionsenzym stromabwärts (3‘) von ompA bzw mtlA geschnitten, und die
gewünschten Fragmente zu pMomp2 ligiert (Abb. 4.2). Hierzu wurde pOmpA-SpeI mit PstI
geschnitten, die überstehenden 3‘-Enden mit T4-DNA-Polymerase entfernt, und das
linearisierte Plasmid darauf mit SpeI geschnitten. p717MtlA-SpeI-2 wurde mit KpnI
geschnitten, die überstehenden 3‘-Enden mit T4-DNA-Polymerase entfernt, und das
linearisierte Plasmid darauf ebenfalls mit SpeI geschnitten. Schließlich wurde das 3,7 kb
Fragment von p717MtlA-SpeI-2 mit dem 1 kb Fragment von pOmpA-SpeI mit Hilfe der T4DNA-Ligase ligiert. Das resultierende Plasmid wurde pMomp2 genannt. Es enthält momp2
unter T7-Promotor-Kontrolle. momp2 wurde sequenziert und die erwartete Basenfolge
bestätigt.
DNA-Oligonukleotide für die Klonierung von pOmpA-SpeI sowie p717MtlA-SpeI-2:
Oligonukleotid
Sequenz 5’
3’
Bemerkung
OmpA66
CCGAAAGATACTAGTTGGTACA
CTGG
hybridisiert an Bp 67-92 von ompA
Einführung einer SpeI-Schnittstelle nach
der Signalsequenz in ompA (N26 zu T26;
T27 zu S27)
OmpA168
CCAGTTGGTTTTCATGGGTC
komplementär zu Bp 169 bis 150 von ompA
MtlA129
CCGAACGAGACTAGTGCGAAGC hybridisiert an Bp 130-154 von mtlA
TGG
Einführung einer SpeI-Schnittstelle nach
der ersten transmembranen Helix in mtlA
(T47 unverändert; L48 zu S48)
MtlA282
GCATGTCTGCGCCGACGATAAC
komplementär zu Bp 283 bis 262 von mtlA
T7-PromotorPrimer
(Promega)
TAATACGACTCACTATAGGG
hybridisiert an Bp 1 bis 20 des T7Promotors
4 Material und Methoden
22
4.2 Molekularbiologische Methoden
4.2.1 DNA-Isolierung
Die Zellen wurden in 250 ml LB-Medium (10 g Pepton, 10 g NaCl und 5 g Hefeextrakt auf
1 l Wasser) übernacht bei 37°C im Schüttler angezogen, wobei die den jeweiligen
Resistenzen entsprechenden Antibiotika zugegeben wurden:
• pDMB im Stamm XL1-Blue: Tetracyclin (Resistenz auf F1-Plasmid kodiert), Ampicillin
(Resistenz auf pDMB kodiert)
• p717MtlA-B im Stamm MC4100: Ampicillin (Resistenz auf p717MtlA-B kodiert)
• pMomp2 im Stamm XL1-Blue: Tetracyclin (Resistenz auf F1-Plasmid kodiert), Ampicillin
(Resistenz auf pMomp2 kodiert)
Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte mit Hilfe des Qiagen Plasmid Maxi Kit nach dem
mitgelieferten Protokoll. Das luftgetrocknete DNA-Pellet wurde in 500 µl TE-Puffer
resuspendiert und die DNA durch Zugabe von 50 µl 3 M Kaliumacetat, pH 5.5 und 1 ml
Ethanol 30 min bei -70°C gefällt. Anschließend wurde die DNA durch 15minütige
Zentrifugation bei 14 000 Rpm und 4°C in der Kühlzentrifuge Universal 16R sedimentiert
und nach einmaligem Waschen mit 70 % Ethanol in 100 µl TE-Puffer resuspendiert.
TE-Puffer:
10 mM
1 mM
Tris / HCl pH 8.0
EDTA pH 8.0
Zur Kontrolle wurde die isolierte Plasmid-DNA mit zwei plasmidspezifischen
Restriktionsenzymen verdaut und die erwartete Größe der Fragmente in der
Agarosegelelektrophorese verifiziert. Die DNA-Konzentration wurde über die Messung der
Absorption bei 260 nm bestimmt (zur Messung wurde die DNA 1 : 500 mit H2O verdünnt;
eine A260 von 1 entspricht 50 µg/ml).
4.2.2 DNA-Restriktionsenzymverdau und Agarosegelelektrophorese
Der Verdau der Plasmid-DNA fand nach folgendem Schema mit einem oder mehreren
geeigneten Restriktionsenzymen bei 30minütiger Inkubation bei 37°C statt:
DNA (1-2 µg/µl)
1 µl
Restriktionsenzyme (10 u/µl)
je 1 µl
mitgelieferter10x Puffer
2 µl
H2O
ad 20 µl
Anschließend wurden 2 µl 10x DNA-Ladelösung zugegeben und die Proben über ein
0.8%iges Agarosegel bei 100 mA aufgetrennt. Als Laufpuffer wurde 1x TAE-Puffer
verwendet. Die DNA-Banden konnten im UV-Licht sichtbar gemacht und über ein EDVgestütztes Photosystem dokumentiert werden.
23
10x DNA-Ladelösung:
50 %
0.05 %
0.05 %
Glycerin
Bromphenolblau
Xylencyanol
50x TAE-Puffer:
242 g
57 ml
100 ml
ad 1 l
Tris Base
Essigsäure
0.5 M EDTA pH 8.0
H2O
4 Material und Methoden
Herstellung des 0.8%igen Agarosegels:
Zu 80 ml 1x TAE-Lösung wurden 0.64 g Agarose hinzugefügt, das Gemisch in der
Mikrowelle erhitzt und dann mit 10 µl Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml in H2O) versetzt.
Die heiße Lösung wurde in die Elektrophoreseapparatur eingefüllt.
4.2.3 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Die Auftrennung denaturierter Proteine erfolgte durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) nach Laemmli (1970). Dabei kamen Gele mit einer PolyacrylamidKonzentration von 13 bzw. 15 % zur Anwendung.
13%iges Trenngel:
30 ml
30 % Acrylamid, 0.8 % Bisacrylamid
14 ml
2 M Tris / HCl pH 8.8
280 µl
25 % SDS
ad 70 ml
H2O
Direkt vor dem Gießen wurden zugegeben:
28 µl
TEMED
400 µl
10 % Ammoniumperoxodisulfat
15%iges Trenngel:
35 ml
30 % Acrylamid, 0.8 % Bisacrylamid
weiter wie bei 13%igem Trenngel.
Zur optimalen Auftrennung von naszierenden Ketten und ihren Quervernetzungsprodukten
wurden 7 - 17%ige Gradientengele gegossen. Dabei wurden 30 ml einer 7%igen
Acrylamidlösung und 30 ml einer 17%igen Acrylamidlösung mittels Gradientenmischer
gemischt und durch Überschichtung in die Gelapparatur gegossen.
7 %ige Lösung:
7 ml
6 ml
120 µl
ad 30 ml
17%ige Lösung:
17 ml
6 ml
120 µl
7 ml
-
30 % Acrylamid, 0.8 % Bisacrylamid
2 M Tris / HCl pH 8.8
25 % SDS
2.5 M Saccharose
H2O
Direkt vor dem Gießen wurden zu beiden Lösungen jeweils 10 µl TEMED und 100 µl 10%
Ammoniumperoxodisulfat zugegeben.
4 Material und Methoden
Sammelgel:
24
3.35 ml
30 % Acrylamid, 0.8 % Bisacrylamid
2.4 ml
0.5 M Tris / HCl pH 6.8
3.75 ml
2.5 M Saccharose
80 µl
25 % SDS
ad 20 ml
H2O
Direkt vor dem Gießen wurden zugegeben:
8 µl
TEMED
150 µl
10 % Ammoniumperoxodisulfat
Neben den in SDS-PAGE-Ladepuffer denaturierten Proben wurden als Längenstandards
vorgefärbte Molekulargewichtsmarker in einer Probentasche des Polyacrylamidgels
aufgetragen.
SDS-PAGE-Ladepuffer:
Lösung 1:
0.2 M
Tris Base
0.02 M
EDTA, pH 7.5
Lösung 2:
8.3 %
SDS
83.3 mM
Tris Base
29.2 %
Glycerin
0.03 %
Bromphenolblau
jeweils frisch bzw. in Aliquots bei -20°C gelagert: 0.5 ml Lösung 1
0.4 ml Lösung 2
0.1 ml 1 M DTT
Die Gele liefen übernacht bei einer Stromstärke von 15 mA, wobei mit SDS-PAGELaufpuffer gepuffert wurde.
SDS-PAGE-Laufpuffer:
5x Tris-Glycin-Puffer:
400 ml 5x Tris-Glycin-Puffer
8 ml 25 % SDS
ad 2 l H2O
150 g Tris
720 g Glycin
ad 5 l H2O
Nach beendetem Lauf konnten die Gele zur Sichtbarmachung der Proteinbanden in
Coomassie-Blau-Lösung gefärbt und anschließend mit Fixierlösung entfärbt werden.
Coomassie-Blau-Lösung: 3.125 g
1250 ml
250 ml
1000 ml
Fixierlösung:
Brilliant Blau G 250
technischer Ethanol
Essigsäure
H2O
10 % Essigsäure
35 % Ethanol
25
4 Material und Methoden
Zur Autoradiographie wurden die Gele meist ohne Färbung 30 min in Fixierlösung inkubiert,
15 min gewässert und anschließend bei 55°C (Gradientengele) bzw. 60°C (13 und 15 %ige
Gele) 2 h unter Vakuum getrocknet.
4.2.4 Western Transfer
Western Transfer diente vor allem dazu, den Gehalt an Translokations- bzw.
Insertionsfaktoren (SecA, SecB, Ffh, FtsY, SecY) in den verschiedenen Komponenten des
zellfreien Systems zu bestimmen. Die Proben wurden zunächst durch SDS-PAGE aufgetrennt
und anschließend auf eine Nitrozellulosemembran transferiert. Dazu wurden folgende
Materialien 5 min in Transferpuffer äquilibriert und dann in folgender Reihenfolge ohne
Luftblasen in die Blottaparatur eingesetzt:
Minuspol
Pluspol
Saugschwamm
Whatman-Papier
SDS-PAGE-Gel
Nitrozellulosemembran
Whatman-Papier
Saugschwamm
Transferpuffer:
600 ml
600 ml
2 ml
ad 3 l
5x Tris-Glycin-Puffer (siehe 4.2.3.)
technischer Ethanol
25 % SDS
H2O
Der Transfer erfolgte 2 h bei 80 V und 400 mA. Zur Kontrolle wurden die auf die
Nitrozellulosemembran transferierten Proteinbanden kurz mit Ponceau-S-Lösung (0.2 %
Ponceau S, 3 % TCA) angefärbt und mit H2O wieder entfärbt. Alle anschließenden Schritte
fanden unter leichtem Rütteln statt. Zunächst wurde die Membran 2 h mit Milchpulver (5 %
Milchpulver in TTBS) blockiert und dann mit TTBS gewaschen (nach dem Abspülen der
Milchpulverlösung 3 x 10 min auf dem Rüttler).
10x TBS:
1M
9%
Tris / HCl pH 7.5
NaCl
TTBS:
0.1 %
Tween-20 in 1x TBS
Daraufhin wurde mit dem gewünschte Antiserum in folgender Verdünnung in 1 % BSA /
TTBS für 1 h inkubiert:
4 Material und Methoden
Antiserum (vom Kaninchen)
αFfh
αFtsY
αSecA
αSecB
αTrigger factor
αSecY
26
Verdünnung
1 : 2500
1 : 2500
1 : 5000
1 : 5000
1 : 10000
1 : 2500
Herkunft
K.-L. Schimz
K.-L. Schimz
K.-L. Schimz
K.-L. Schimz
E. Deuerling
M. Müller
Nach nochmaligem Waschen (wie oben beschrieben) wurde der 2. Antikörper (antiKaninchen Antikörper von der Ziege, Meerrettich-Peroxidase-gekoppelt) in der Verdünnung
1 : 5000 in 1 % BSA, 20 mM MgCl2 in TTBS zugegeben und nochmals für 1 h inkubiert.
Nach weiteren Waschschritten (wie oben beschrieben) wurde zur Detektion der Antikörpermarkierten Banden das „Enhanced Chemiluminescence ECL Westernblotting System“
verwendet. Dazu wurde ein 1:1 Gemisch der beiden ECL-Lösungen auf die durch
vorsichtiges Tupfen mit Whatman-Filterpapier abgetrocknete Membran gleichmäßig verteilt
und nach einminütigem Einwirken wieder mit Whatmann-Filterpapier entfernt. Durch
Auflegen eines Röntgenfilmes für ca. 10 - 20 s und anschließende Filmentwicklung konnten
die lumineszierenden Banden sichtbar gemacht werden.
4.3 Herstellung von Bestandteilen des zellfreien Systems
4.3.1 Bestandteile des zellfreien Transkriptions-Translations-Systems
Zytosolische Translationsfaktoren (CTF)
Die Zytosolischen Translationsfaktoren (CTF) wurden nach dem Protokoll von Müller und
Blobel (1984b) entweder aus dem RNAse-freien E. coli-Stamm MRE600 oder aus dem E.
coli-Stamm MC4100 gewonnen. Vier mal je 1 Liter S-150-Medium wurde mit je 10 ml einer
Übernachtkultur angeimpft und die Zellen bei 37°C bis zu einer OD580 von 1.6 angezogen.
S-150-Medium:
753 ml
H2O mit 10 g Hefeextrakt
(MRE600 / MC4100) 41 ml
1 M KH2PO4
166 ml
1 M K2HPO4
41 ml
25 % D-Glukose
Die Lösungen wurden jeweils einzeln autoklaviert.
Alternativ konnten FtsY-depletierte CTF aus dem E. coli-Stamm N4156 pAra14-FtsY’
gewonnen werden, in dem das ftsY-Gen unter der Kontrolle eines Arabinosepromotors steht.
Dabei kam ein abgeändertes S-150-Medium zur Anwendung, dem außerdem Ampicillin
zugegeben wurde. Da FtsY in E. coli ein essentielles Protein darstellt, wurde die ÜbernachtVorkultur in Anwesenheit von 0.2 % Arabinose zur Induktion des ftsY-Gens angezogen.
27
S-150-Medium:
(für FtsY─-CTF)
4 Material und Methoden
984 ml
8 g Pepton, 5 g Hefeextrakt und 5 g NaCl in Wasser
gelöst +100 µl 10 N NaOH
16 ml
25 % D-Fruktose
Diese beiden Lösungen wurden einzeln autoklaviert.
Alle folgenden Schritte erfolgten auf Eis bzw. bei 4°C. Nach einem Waschschritt wurden die
Zellen durch 10minütige Zentrifugation bei 7 000 Rpm im Rotor A6.9 geerntet. Anschließend
wurden die Zellen in S30-Puffer im Verhältnis 1 ml Puffer je 1 g Feuchtgewicht resuspendiert
und bei drei Durchläufen durch die French Press bei 8 000 Psi aufgeschlossen.
S30-Puffer:
50 mM
50 mM
15 mM
1 mM
0.5 mM
Triethanolaminacetat pH 7.5
Kaliumacetat pH 7.5
Magnesiumacetat
DTT
PMSF (in Ethanol frisch gelöst)
Durch 30minütige Zentifugation bei 15 000 Rpm im Rotor A8.24 (30 000 x g) konnten
Zelltrümmer und ganze Zellen entfernt werden; der Überstand wurde nochmals 2.5 h bei
45 000 Rpm im Rotor 50.2Ti (150 000 x g) zentrifugiert. Der hierbei entstandene Überstand
war frei von Membranen und Ribosomen und wurde S-150 genannt. Aus dem Pellet konnten
die Ribosomen weiter aufgereinigt werden (siehe unten).
Jeweils 6 ml einer 10 bzw. 30%igen (w/w) Saccharoselösung (10.38 g bzw. 33.81 g
Saccharose /100 ml in CTF-Puffer) wurden im Gradientenmischer gemischt und mithilfe
einer langen Kanüle in Zentrifugenröhrchen unterschichtet.
CTF-Puffer:
50 mM
50 mM
5 mM
1 mM
Triethanolaminacetat pH 7.5
Kaliumacetat pH 7.5
Magnesiumacetat
DTT
Der so entstandene Saccharosegradient wurde 1 h bei 4°C äquilibriert; anschließend wurde je
Zentrifugenröhrchen 1 ml des S-150 auf den Gradienten aufgetragen. Diese wurden 20-24 h
bei 39 000 Rpm im Ausschwingrotor TST 41.14 mit freiem Auslaufen zentrifugiert. Die
Zentrifugationsröhrchen wurden von unten mit einer Nadel punktiert und die Gradienten dann
langsam mit Hilfe der Pumpe Minipuls 2 (Geschwindigkeit 130 Einheiten) abgezogen; unter
Aufzeichnung der Absorption bei 280 nm wurden ca. 20 Fraktionen à 600 µl (23 Tropfen im
Pharmacia Fraktionssammler LKB RediFrac) gesammelt. Sofern die Absorptionsmuster
unterschiedlicher Gradienten sich entsprachen, wurden die jeweils gleichen Fraktionen
gepoolt und auf Aktivität im zellfreien Transkriptions-Translations-System getestet und die
aktiven Fraktionen (meist Fraktionen 12-14) wiederum gepoolt.
4 Material und Methoden
28
Ribosomen
Die Ribosomen wurden nach dem Protokoll von Müller und Blobel (1984b) aus dem Pellet
gewonnen, das bei der Herstellung des S-150 anfiel (siehe oben). Um ribosomenassoziierte
Proteine zu entfernen, wurden die Ribosomen mit Hochsalz gewaschen. Alle Schritte wurden
wiederum auf Eis bzw. bei 4°C durchgeführt. Die Ribosomen wurden in Hochsalzpuffer
resuspendiert und dann durch einstündige Zentrifugation bei 90 000 Rpm im Rotor
TLA 100.2 erneut pelletiert.
Hochsalzpuffer:
50 mM
1M
5 mM
1 mM
Triethanolaminacetat pH 7.5
Kaliumacetat pH 7.5
Magnesiumacetat
DTT
Das durchsichtige Ribosomenpellet war von einer gelblichen Membranschicht überlagert, die
manuell entfernt werden konnte. Das Ribosomenpellet wurde in 1 ml Hochsalzpuffer je Liter
Ausgangskultur resuspendiert.
Je 200 µl wurden auf einen 10-40%igen (w/w) Saccharosegradienten aufgetragen (10.38 g
bzw. 47.06 g Saccharose je 100 ml Lösung in CTF-Puffer (siehe oben)) und 17 h bei
29 000 Rpm im Rotor TST 41.14 zentrifugiert. Die Gradienten wurden in Fraktionen à 500 µl
gesammelt, wobei die Absorption bei 254 nm aufgezeichnet wurde (Absorption durch die
rRNA). 25 µl jeder Fraktion wurden über SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt
und mit Coomassie angefärbt. Die ribosomenhaltigen Fraktionen konnten anhand ihres
charakteristischen Bandenmusters identifiziert werden (meist Fraktionen 1-9). Die
ribosomenhaltigen Fraktionen wurden gepoolt, die Ribosomen nochmals pelletiert (1 h bei
90 000 Rpm im Rotor TLA 100.2) und in CTF-Puffer resuspendiert.
Initiationsfaktor 2
Der Initiationsfaktor 2 wurde von H. Hoffschulte nach dem Protokoll von Müller und Blobel
(1984a) aufgereinigt.
T7-RNA-Polymerase
Die T7-RNA-Polymerase wurde von R. Helde aufgereinigt (Beck, 2000).
4.3.2 Membranvesikel
Inside-Out Innenmembranvesikel (INV)
Die Herstellung der INV folgte weitgehend dem Protokoll von Müller und Blobel (1984a).
Zur Präparation von Wildtyp-INV wurde der E. coli-Stamm AD179 (∆ompT) verwendet. Vier
mal je 1 Liter INV-Medium wurde mit je 20 ml einer Übernacht-Vorkultur angeimpft und die
Zellen bei 37°C im Schüttler bis zu einer OD580 von 1.6 angezogen.
29
INV-Medium:
4 Material und Methoden
753 ml
H2O mit jeweils 10 g Hefeextrakt und Pepton
41 ml
1 M KH2PO4
166 ml
1 M K2HPO4
41 ml
25 % D-Glukose
Die Lösungen wurden jeweils einzeln autoklaviert.
SecY205-INV wurden aus dem Stamm TY1 gewonnen; dabei wurde dem INV-Medium
Arabinose statt Glukose zugesetzt.
Alle folgenden Schritte wurden auf Eis bzw. bei 4°C durchgeführt. Die Zellen wurden
zunächst durch 10minütige Zentrifugation bei 7 000 Rpm im Rotor A6.9 geerntet und dann
nach einem Waschschritt in Puffer A im Verhältnis 1 ml Puffer je 1 g Feuchtgewicht
resuspendiert.
Puffer A:
50 mM
250 mM
1 mM
1 mM
0.5 mM
Triethanolamin pH 7.5
Saccharose
EDTA
DTT
PMSF (in Ethanol frisch gelöst)
Bei drei Durchläufen durch die French Press (8 000 Psi) wurden die Zellen aufgeschlossen,
Zelltrümmer und ganze Zellen wurden durch 5minütige Zentrifugation bei 5 000 Rpm im
Rotor A8.24 entfernt. Der Überstand wurde für 2 h bei 40 000 Rpm (150 000 x g) im Rotor
50.2Ti zentrifugiert. Das hierbei entstehende Rohmembranpellet (bestehend aus
Innenmembranen, Außenmembranen sowie Ribosomen) wurde mit Hilfe eines Dounce
Homogenisators in Puffer A resuspendiert; anschließend wurden die Innenmembranen durch
einen Saccharosestufengradienten von den anderen Bestandteilen abgetrennt. Hierzu wurden
12 ml 0.77 M mit 12 ml 1.44 M und schließlich mit 10 ml 2.02 M Saccharoselösung (jeweils
in Puffer A) in einem Zentrifugenröhrchen untergeschichtet und der so entstandene
Stufengradient für 1 h bei 4°C äquilibriert. Nach Überschichtung von ca. 2 ml
Rohmembranen je Gradient wurde für 16 h bei 25 000 Rpm im Ausschwingrotor SW28
zentrifugiert.
Die Innenmembranen befanden sich hiernach als gelbe Bande zwischen der 0.77 M und
1.44 M Saccharoselösung; die Zentrifugenröhrchen wurden seitlich mit einer Kanüle
punktiert und die gelbliche Lösung abgezogen. Diese wurde etwa vierfach mit 50 mM
Triethanolamin pH 7.5 verdünnt, anschließend wurden die INV durch zweistündige
Zentrifugation bei 40 000 Rpm im Rotor 50.2Ti pelletiert und in INV-Puffer resuspendiert.
INV-Puffer:
50 mM
1 mM
250 mM
Triethanolamin pH 7.5
DTT
Saccharose
Das INV-Sediment, das aus 4 l Kultur gewonnen wurde, wurde in ca. 1 ml Puffer
resuspendiert, um eine ausreichend hohe INV-Konzentration zu erhalten (Die OD bei 280 nm
4 Material und Methoden
30
sollte über 30 liegen; die Absorptionsmessung erfolgte in einer 100fach mit 2% SDS
verdünnten Suspension).
Harnstoffextrahierte Vesikel (HINV)
Um die INV mit einer Endkonzentration von 6 M Harnstoff zu extrahieren, wurden 100 µl
INV mit 400 µl 7.5 M Harnstoff-Puffer vermischt und für 1 h auf Eis inkubiert (Helde et al.,
1997).
Harnstoff-Puffer:
7.5 M
50 mM
250 mM
Harnstoff
Triethanolamin pH 7.5
Saccharose
Anschließend wurden die 500 µl Vesikelsuspension durch 200 µl 750 mM Saccharosekissen
(750 mM Saccharose, 50 mM Triethanolamin pH 7.5) 15 min bei 70 000 Rpm und 4°C im
Rotor TLA 100.2 sedimentiert. Zur Entfernung eventueller Harnstoffreste wurde das Pellet in
100 µl
INV-Puffer (siehe oben) resuspendiert und nochmals über ein 750 mM
Saccharosekissen pelletiert. Schließlich wurde das Pellet in 50 µl INV-Puffer resuspendiert.
4.3.3 Translokations- und Insertionsfaktoren
aufgereinigt von
Protokoll
Konzentration
SecA
K. Beck und D. Trescher
Helde et al.,1997
1 mg / ml
SecB
H. Hoffschulte
Hoffschulte et al., 1994
2 mg / ml
F1-ATPase
H. Hoffschulte
Müller et al., 1987
1 mg / ml
FtsY
H. Hoffschulte
Koch et al., 1999 (modifiziert nach
Luirink et al., 1994)
1 mg / ml
Die F1-ATPase wurde in 50 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA pH 8.0 aufgenommen. Alle
anderen Proteine wurden in CTF-Puffer (siehe 4.3.1) aufgenommen.
Ffh-Aufreinigung
Zur Aufreinigung von Ffh wurde der Vektor pET-19b-P48 im E.coli-Stamm BL21(DE3)
pLysS verwendet (G. Eisner, unveröffentlicht). Auf diesem Vektor wurde das ffh-Gen hinter
eine Sequenz aus 10 Histidin kloniert. Es steht unter der Kontrolle der T7-RNA-Polymerase,
die durch IPTG induziert bzw. durch Glucose reprimiert wird. Die ersten Reinigungsschritte
bis zum S-30 wurden ebenfalls von G. Eisner durchgeführt. Eine Vorkultur wurde in LBMedium mit Ampicillin, Chloramphenicol und 0.4 % Glucose übernacht angezogen. Mit je
10 ml dieser Übernachtkultur wurden zwei mal je 1 l LB-Medium mit Ampicillin und
Chloramphenicol angeimpft. Die Zellen wurden bei 30°C bis zu einer OD580 von 0.45
angezogen. Nach der Zugabe von je 0.5 ml 1 M IPTG zur Induktion des ffh-Gens wurden die
Zellen bis zu einer OD580 von 1.35 weiter angezogen.
31
LB-Medium:
10 g
10 g
5g
100 µl
ad 1 l
4 Material und Methoden
Pepton
NaCl
Hefeextrakt
10 N NaOH
H2O
Alle folgenden Schritte erfolgten auf Eis bzw. bei 4°C. Die Zellen wurden durch 10minütige
Zentrifugation bei 7 000 Rpm im Rotor A6.9 geerntet und in 25 ml Startpuffer resuspendiert.
Startpuffer:
50 mM
300 mM
Kaliumphoshat-Puffer pH 7.2
NaCl
Anschließend wurden die Zellen mit Proteaseinhibitoren versetzt (siehe Tabelle) und bei drei
Durchläufen durch die French Press bei 8 000 Psi aufgeschlossen. Durch eine 30minütige
Zentrifugation bei 15 000 Rpm im Rotor A8.24 (30 000 x g) entstand der S-30 als Überstand.
Eine 5 ml Pharmacia HiTrap Chelating Säule wurde mit Hilfe der FPLC-Anlage zunächst mit
10 ml H2O (0.5 ml / min bei allen folgenden Schritten) gespült und dann mit 20 ml Startpuffer
äquilibriert. Der S-30 wurde nochmals mit Proteaseinhibitoren versetzt, dann wurden 2 x 3 ml
S-30 nacheinander auf die Säule aufgetragen. Nach dem Auftragen der ersten 3 ml wurde die
Säule mit Startpuffer gespült.
Proteaseinhibitor
Stammlösung
Verdünnung
Endkonzentration
Aprotinin
2 mg / ml in H2O
1 : 1000
2 µg / ml
Leupeptin
0.5 mg / ml in H2O
1 : 1000
0.5 µg / ml
E64
10 mg / ml in 50 %
Ethanol
1 : 1000
10 µg / ml
PMSF
100 mM in Ethanol
1 : 100
1 mM
Anschließend wurde erst mit Startpuffer und dann mit 150 mM Imidazol-Puffer (150 mM
Imidazol in Startpuffer) jeweils solange gespült, bis kein bei 280 nm absorbierendes Material
mehr eluiert wurde. Danach wurde mit 300 mM Imidazol-Puffer (300 mM Imidazol in
Startpuffer) das Ffh-10His eluiert. Dabei wurde möglichst eng fraktioniert: Nur die 3 ml Eluat
mit der höchsten Absorption bei 280 nm wurden sofort weiterbehandelt. Andernfalls wurde
ein Ausfallen des Ffh-10His in der wässrigen Lösung beobachtet.
Nachdem eine 5 ml Pharmacia HiTrap Desalting Säule mit CTF-Puffer (siehe 4.3.1)
äquilibriert worden war, wurden 1.5 ml Ffh-10His-Eluat mit Hilfe einer sterilen Spritze
aufgetragen; durch das anschließende Auftragen von 2 ml CTF-Puffer wurde das Ffh-10His in
CTF-Puffer eluiert. Durch sofortige Zugabe von 1 Volumen Glycerin und Lagerung bei -20°C
wurde das Ausfallen des Ffh-10His verhindert. Die Ffh-Konzentration lag bei 0.1 mg/ml.
4 Material und Methoden
32
4.4 Versuche im zellfreien System zum Proteintransport in Escherichia coli
4.4.1 Gekoppelte Transkription-Translation im zellfreien System
Die Proteinsynthese erfolgte durch gekoppelte Transkription-Translation im zellfreien System
(Koch et al., 1999). Das zellfreie System enthielt an biologischen Komponenten Zytosolische
Translationsfaktoren (CTF), Ribosomen, Initiationsfaktor 2 sowie T7-RNA-Polymerase.
Zusätzlich wurden Nukleotide, Aminosäuren und ein ATP-regenerierendes System
(Kreatinphosphat, Kreatinphosphatkinase und Phosphoenolpyruvat) benötigt. Durch Zugabe
von Spermidin, Putrescin, DTT (zum Schutz vor Oxidation), dem RNase-Inhibitor RNasin
(zum Schutz der RNA vor unspezifischem Verdau) sowie Phosphoenolpyruvat wurde die
Synthese optimiert. Als Puffersystem diente 40 mM Triethanolaminacetat pH 7.5, bei DSSQuervernetzungsexperimenten hingegen 40 mM HEPES pH 7.5. Die optimalen
Salzbedingungen waren von dem jeweils sythetisierten Protein abhängig; in der Regel war
eine effiziente Synthese bei 70 mM K+ und 8 mM Mg++ möglich. Durch Zugabe des Gens des
zu synthetisierenden Proteins in Form von Plasmid-DNA unter T7-Promotor-Kontrolle sowie
radioaktiv markierter Aminosäuren (35S-Met und 35S-Cys) wurde während 30minütiger
Inkubation bei 37°C das gewünschte radioaktiv markierte Protein synthetisiert.
Ein 25-µl-Ansatz des Transkriptions-Translations-Systems setzte sich im einzelnen
folgendermaßen zusammen:
Stammlösung Endkonzentration µl / Ansatz
Komponente
10fach Kompensationspuffer (siehe unten)
2.5
25 µl Endvolumen
H2O
Polyethylenglycol
40 % w/v
3.2 % w/v
2
18 Aminosäuren (ohne Met, Cys)
je 1 mM
je 0.04 mM
1
Putrescin
200 mM
8 mM
1
DTT
200 mM
2 mM
0.25
50 mM
je 10 mM
200 mN
2.5 mM
je 0.5 mM
1.25
Phosphoenolpyruvat
200 mM
5 mM
0.625
Kreatinphoshat
500 mM
8 mM
0.4
Kreatinphosphatkinase
10 mg / ml
40 µg / ml
0.1
NTP-Mix:
ATP
GTP, UTP, CTP
KOH (zur Neutralisation)
Zytosolische Tranlstionsfaktoren (CTF)
Ribosomen
3*
7.5 µM *
90 nM *
Initiationsfaktor 2
0,3 *
0,5 *
Plasmid-DNA
1 mg / ml *
40 µg / ml *
1*
RNasin RNase-Inhibitor
40 U / µl
0.32 U / µl
0.2
T7-RNA-Polymerase
20 U / µl
0.24 U / µl
0.3
weitere Komponenten je nach Fragestellung
35
S-Met, 35S-Cys
10 µCi / µl
0.28 µCi / µl
0.7
* variierte je nach Präparation und mußte daher für jede Präparation neu titriert werden.
4 Material und Methoden
33
Dabei wurden für n Syntheseansätze jeweils (n+1) Ansätze zusammen pipettiert und diese
erst nach Zugabe der radioaktiv markierten Aminosäuren in Aliquots aufgeteilt. Je nach
Fragestellung wurden dem Transkriptions-Translations-Systems weitere Komponenten
zugesetzt (siehe 4.4.2, 4.4.4 und 4.4.5). Diese konnten entweder vor dem Aliquotieren allen
Ansätzen oder erst nach dem Aliquotieren einzelnen Ansätzen zugesetzt werden. In jedem
Fall mußten jedoch auch diese Komponenten bei der Berechnung des Endvolumens
berücksichtigt werden. Um die gewünschten Puffer- und Salzbedingungen zu erreichen,
mußten die Ionenkonzentrationen der Puffer berücksichtigt werden, in denen die biologischen
Komponenten
aufgenommen
waren.
Daher
wurde
zunächst
ein
10fach
„Kompensationspuffer“ berechnet und pipettiert. Das folgende Rechenbeispiel geht von einer
Synthese mit 3 µl CTF, 0.3 µl Ribosomen, 0.5 µl Initiationsfaktor 2, 0.5 µl INV und 2 µl
SecA aus:
T
K
Mg
Sper
gewünschte Endkonzentration:
mM
40
70
8
0.8
entspricht pro 25-µl-Ansatz: (1)
nmol
1000
1750
200
20
in biologischen Komponenten sind bereits
enthalten:
3 µl CTF (T50K50Mg5)
0.3 µl Ribosomen (T50K50Mg5)
0.5 µl Initiationsfaktor 2 (K350)
0.5 µl INV (T50)
2.0 µl SecA / SecB / FtsY (T50K50Mg5)
µl Ffh (T25K25Mg2.5)
Σ (2)
nmol
nmol
nmol
nmol
nmol
nmol
nmol
150
15
150
15
175
15
1.5
25
100
____
290
100
____
440
10
____
26.5
je 25 µl Ansatz müssen noch hinzugefügt
werden: (3) = ∆ (1) – (2)
nmol
710
1310
173.5
20
jeder µl von 2.5 µl 10fach
Kompensationspuffer muß enthalten:
(4) = (3) / 2.5
nmol
284
524
69.4
8
Stammlösung (5)
M
1M
4M
1M
0.1 M
für 0.25 ml 10fach Kompensationspuffer
muß an Stammlösung zugefügt werden:
(6) = (4) x 0.25 / (5)
µl
71
32.8
17,4
20
T
Triethanolaminacetat pH 7.5
Mg
Magnesiumacetat
K
Kaliumacetat pH 7.5
Sper
Spermidin
H2 O
108.8
( 250)
4 Material und Methoden
34
4.4.2 Synthese ribosomenassoziierter naszierender Ketten (RANCs)
Die Synthese von ribosomenassoziierten naszierenden Ketten (RANCs) wurde mit einer nach
Haeuptle et al. (1986) modifizierten Methode durchgeführt (Beck et al., 2000). Vor Start der
Synthese im zellfreien System wurden DNA-Oligonukleotide zugegeben, deren Sequenz zur
mRNA des zu synthetisierten Proteins komplementär waren. In der TranskriptionsTranslations-Reaktion hybridisieren diese DNA-Oligonukleotide mit der mRNA; die
Endonuclease RNaseH erkennt diese Hybride und verdaut den hybridisierten mRNA-Teil.
Die so verkürzte mRNA trägt an ihrem 3‘-Ende kein Stoppkodon, so daß das Ribosom am
Ende der Translation die Polypeptidkette nicht freisetzen kann und ribosomenassoziierte
naszierende Ketten (RANCs) entstehen.
Für die Synthese der RANCs wurden folgende DNA-Oligonukleotide in den genannten
Konzentrationen verwendet:
Oligonukleotid
Sequenz 5’
3’
Synthetisiertes Polypeptid
MtlA 189
ACCGTGGTTAATGGC naszierende Ketten von MtlA bis
GTTGTT
L189 (MtlA-189)
3 µg / 25 µlAnsatz
OmpA β5
TAAACGTTGGATTTA naszierende Ketten von pOmpA bis
GTGTC
A125 (pOmpA-125)
naszierende Ketten von Momp2 bis
A146 (Momp2-146)
3 µg / 25µlAnsatz
4 µg / 25µlAnsatz
OmpA β8
GGAGCTGCCTCGCCC naszierende Ketten von pOmpA bis
TGACC
F191 (pOmpA-191)
naszierende Ketten von Momp2 bis
F212 (Momp2-212)
3 µg / 25µlAnsatz
4 µg / 25µlAnsatz
OmpA 280
GGAGATCAGGTAAT
CAACAAC
3 µg / 25µlAnsatz
4 µg / 25µlAnsatz
anti-10SaRNA
TTAAGCTGCTAAAGC 10Sa-RNA-antisenseGTAGTTTTCGTCGTT Oligonukleotid
TGCGACTA
naszierende Ketten von pOmpA bis
S280 (pOmpA-280)
naszierende Ketten von Momp2 bis
S301 (Momp2-301)
Konzentration
0,25 µg / 25µlAnsatz
RNaseH war bereits in den CTF in ausreichendem Maße vorhanden, nur bei Verwendung von
CTF aus dem Stamm MC4100 wurden 0.6 U RNaseH zugesetzt. Außerdem wurden 0.25 µg
eines 10Sa-RNA-antisense-Oligonukleotids dem Reaktionsansatz zugegeben; dieses
antisense-Oligonukleotid hybridisiert mit der 10Sa RNA und unterdrückt so ihre Funktion.
Die 10Sa RNA löst synthetisierte Polypeptide ohne Stoppkodon vom Ribosom los, so daß
diese verdaut werden können (Hanes und Plückthun, 1997; Keiler et al., 1996).
4.4.3 Puromycin-Behandlung
Zur Loslösung der naszierenden Ketten vom Ribosom konnten diese mit Puromycin
behandelt weren. Dazu wurden nach der Synthese 2 µl 11mM Puromycin, mit KOH auf
pH 6.5 titriert, je 25 µl Syntheseansatz zugegeben und für weitere 15 min bei 37°C inkubiert.
35
4 Material und Methoden
4.4.4 Protease-Resistenz-Test
Um die Translokation bzw. Insertion der im zellfreien System synthetisierten Proteine in
Innenmembranvesikel zu untersuchen, wurden dem jeweiligen Syntheseansatz nach 5 min
entweder INV oder HINV zugegeben und die Synthese dann 30 min bei 37°C fortgesetzt. Die
optimale Menge an Vesikeln mußte für jede Vesikelpräparation durch Titration im zellfreien
System neu ermittelt werden. Bei Verwendung von HINV mußten zur Wiederherstellung der
Translokationsbzw.
Integrationskompetenz
gereinigte
Translokationsbzw.
Integrationsfaktoren zugegeben werden. Die dabei verwendeten Konzentrationen betrugen:
SecA
SecB
F1-ATPase
Ffh
FtsY
80 ng / µl
40 ng / µl
40 ng / µl
2 ng / µl
20 ng / µl
Da die Wildtyp-CTF inaktives FtsY enthielt, das bei der „Reaktivierung“ von HINV durch
zugegebenes FtsY störte, wurden bei der Verwendung von HINV FtsY─-CTF verwendet. Im
Anschluß an die 30minütige Synthese wurde die Hälfte eines Doppelansatzes (50 µl) direkt
mit TCA gefällt, die andere Hälfte wurde zunächst mit 25 µl Proteinase K (1 mg / ml) für
20 min bei 25°C inkubiert, anschließend wurde auch diese Probe mit TCA gefällt. Um eine
vollständige Inaktivierung der Proteinase K zu erreichen, wurden mit Proteinase K behandelte
Proben nach Zugabe der TCA zunächst 10 min auf 56°C erhitzt und erst dann auf 4°C
abgekühlt.
4.4.5 Differentialzentrifugation über zweistufigen Saccharosegradienten
Die Assoziation von im zellfreien System synthetisierten Proteinen mit
Innenmembranvesikeln wurde durch die Auftrennung des Versuchsansatzes in
unterschiedliche Fraktionen mittels eines zweistufigen Saccharosegradienten untersucht. Im
Anschluß an die Synthese wurden jeweils Doppelansätze (50 µl) auf einen SaccharoseStufen-Gradienten aufgetragen, der aus je 50 µl einer 0.77 M und einer 1.44 M
Saccharoselösung (jeweils in 50 mM Triethanolamin pH 7.5; 50 mM Kaliumacetat pH 7.5;
8 mM Magnesiumacetat) durch Unterschichtung hergestellt worden war. Nach 30minütiger
Zentrifugation bei 30 Psi in der Beckman Airfuge wurde der Gradient in drei Fraktionen
aufgeteilt: Die oberen 75 µl enthielten als Überstand die zytosolischen Komponenten des
zellfreien Systems; die unteren 75 µl waren die Membranfraktion: Sie enthielten an der
Interphase zwischen den beiden Saccharoselösungen die Membranvesikel. Diese Fraktionen
wurden jeweils mit TCA gefällt. Aggregierte, während der Zentrifugation pelletierte Proteine
wurden in 25 µl SDS-PAGE-Ladepuffer (siehe 4.2.3) durch 5minütiges Rütteln resuspendiert
und durch 5minütige Inkubation bei 95°C denaturiert.
4 Material und Methoden
36
4.4.6 Quervernetzung mit DSS
Zur Quervernetzung von im zellfreien System synthetisierten naszierenden Ketten mit ihren
Bindungspartnern wurde das homobifunktionelle, membrangängige Quervernetzungsreagenz
DSS verwendet. Nach der 30minütigen Synthese (dabei diente HEPES statt
Triethanolaminacetat zur Pufferung, siehe oben) wurden die Reaktionsansätze mit 1/10
Volumen 25 mM DSS in DMSO gemischt und weitere 20 min bei 25°C inkubiert.
Anschließend wurde die Quervernetzungsreaktion durch Zugabe von Tris / HCl pH 7,5 mit
einer Endkonzentration von 50 mM und 15minütiger Inkubation bei 25°C abgestoppt und die
Probe entweder TCA-gefällt oder zur Identifizierung der Quervernetzungsprodukte mit
spezifischen Antiseren immunpräzipitiert.
4.4.7 Isolierung ribosomenassoziierter naszierender Ketten (RANCs)
Zur Isolierung der ribosomenassoziierten naszierenden Ketten wurden diese durch ein
Saccharosekissen pelletiert. Hierzu wurden die Proben auf 200 µl Saccharose-Kissen
aufgetragen und 60 min bei 70 000 Rpm im Rotor TLA 100.2 bei 4°C zentrifugiert.
Anschließend wurden die RANCs in 10 µl INV-Puffer (siehe 4.3.2) je Syntheseansatz
resuspendiert.
Saccharose-Kissen:
580 mM
40 mM
70 mM
6 mM
1 mM
0.1 mM
8 mM
5 mM
Saccharose
HEPES pH 7.5
Kaliumacetat pH 7.5
Magnesiumacetat
DTT
Spermidin
Putrescin
Phosphoenolpyruvat
4.4.8 Isolierung von Innenmembranvesikeln
Im Anschluß an die Quervernetzung von ribosomenassoziierten naszierenden Ketten
(RANCs) mit SecY von Innenmembranvesikeln wurden die Vesikel über ein
Saccharosekissen isoliert, um die Spezifität und Sensitivität der folgenden
Immunpräzipitation zu erhöhen. Hierzu wurden die Proben auf 200 µl Saccharosekissen
(750 mM Saccharose, 50 mM Triethanolaminacetat pH 7.5) aufgetragen und durch
15minütige Zentrifugation bei 70 000 Rpm im Rotor TLA 100.2 bei 4°C pelletiert.
Anschließend wurden die Vesikel in 100 µl INV-Puffer (siehe 4.3.2) ohne DTT resuspendiert.
4.4.9 TCA-Fällung
Zur TCA-Fällung wurden die Proben mit jeweils 1 Volumen 10 % TCA versetzt und
mindestens 30 min bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde das gefällte Material durch 5 min
Zentrifugation bei 13000 Rpm in der Tischzentrifuge „Biofuge pico“ pelletiert; nach
Absaugen des Überstandes wurde das Pellet durch 5minütiges Rütteln in 25 µl SDS-PAGELadepuffer (siehe 4.2.3) gelöst und 5 min bei 95°C denaturiert.
37
4 Material und Methoden
4.4.10 Immunpräzipitation
Zunächst wurden pro Immunpräzipitation 5 mg Protein-A-Sepharose in 1 ml Tritonpuffer
aufgenommen und zum Quellen 5 min auf Eis inkubiert.
Tritonpuffer:
1%
0.9 %
25 mM
5 mM
Triton X-100
NaCl
Tris / HCl pH 6.8
EDTA pH 8
Durch einminütige Zentrifugation mit 13000 Rpm in der Tischzentrifuge „Biofuge pico“
wurde die Protein-A-Sepharose pelletiert; nach dem Absaugen des Überstandes und einem
Waschschritt mit 1 ml Tritonpuffer wurde die Protein-A-Sepharose schließlich in 1 ml
Tritonpuffer aufgenommen und das spezifische Antiserum (vom Kaninchen) hinzugefügt:
Antiserum
αTF
αFfh
αSecY
µl pro Immunpräzipitation
10 µl
15 µl
20 µl
Die folgende einstündige Inkubation bei 4°C erfolgte auf einem Überkopfschüttler, so daß das
Sedimentieren der Protein-A-Sepharose verhindert wurde. Nach zwei weiteren
Waschschritten mit jeweils 1 ml Tritonpuffer wurden die Antikörper-ProteinA-SepharoseKomplexe wiederum in 1 ml Tritonpuffer aufgenommen.
Die Proteine von vierfachen Syntheseansätzen (100 µl) wurden durch 5minütige Inkubation
bei 95°C in 1 % SDS denaturiert, mit den in Tritonpuffer gelösten Antikörper-ProteinASepharose-Komplexen gemischt und anschließend für 1 h bei 4°C auf dem Überkopfschüttler
gedreht. Für die Immunpräzipitation von SecY fand die Denaturierung mit 1 % SDS 10 min
bei 37°C statt und die anschließende Inkubation mit Protein-A-Sepharose wurde übernacht
durchgeführt. Schließlich wurden die Proben zweimal mit 1 ml Tritonpuffer gewaschen
(jeweils zweiminütige Zentrifugation bei 13 000 Rpm in der Biofuge), durch einen
Waschschritt mit 1 ml Äquilibrierungspuffer (25 mM Tris / HCl pH 6.8) an die Puffer- bzw.
Salzbedingungen des SDS-PAGE-Ladepuffers angepaßt, in 30 µl SDS-PAGE-Ladepuffer
(siehe 4.2.3) aufgenommen, 5 min gerüttelt, 7 min bei 95°C inkubiert und nach einminütiger
Zentrifugation (zur Sedimentierung der nicht auf das SDS-PAGE-Gel aufzutragenden
Protein-A-Sepharose) auf ein SDS-PAGE-Gel aufgetragen. Die Denaturierung der SecYImmunpräzipitate erfolgte in SDS-PAGE-Probenpuffer ohne DTT, um die Reduktion der
Immunglobuline gering zu halten. Dies war notwendig, weil die schweren Ketten der
Immunglobuline im SDS-PAGE-Gel auf etwa gleicher Höhe wie Quervernetzungsprodukte
zwischen SecY und naszierenden Ketten von MtlA bzw. Momp2 laufen und dies zu
unerwünschten Interferenzerscheinungen führt.
4 Material und Methoden
38
4.4.11 SDS-PAGE und Autoradiographie
Im Anschluß an die TCA-Fällung bzw. Immunpräzipitation wurden die in SDS-PAGELadepuffer denaturierten Proteine über SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
aufgetrennt (siehe 4.2.3). Die Sichtbarmachung der radioaktiven Proteinbanden erfolgte
mittels Phosphoimager / Image Quant (Molecular Dynamics), wobei die getrockneten Gele in
den Filmkasetten übernacht, bei Quervernetzungsexperimenten 1-3 Wochen exponiert
wurden. Die Quantifizierung der Banden wurde ebenfalls mit dem Programm Image Quant
durchgeführt.
Abb 4.3 faßt die verschiedenen Versuche im zellfreien System zusammen.
Transkription-Translation im zellfreien System
• Plasmid-DNA
•Nukleosidtriphosphate (NTP)
•ATP-regenerierendes System (PEP, CP, CPK)
•T7-Polymerase
• Ribosomen
• Initiationsfaktor 2
• Zytosolische Translationsfaktoren (CTF)
• Aminosäuren inclusive 35S-Methionin und 35S-Cystein
Je nach Fragestellung:
•Inside-out-Innenmembranvesikel (INV) oder
harnstoffgewaschene Vesikel (HINV)
• aufgereinigte Translokationsfaktoren
(SecA, SecB, Ffh, FtsY)
• DNA-Oligomere zur Synthese naszierender
Ketten
Inkubation bei
37°C
Evtl. Puromycin-Behandlung zur
Loslösung der naszierenden Ketten vom
Ribosom
Quervernetzung mit DSS
kovalente Kopplung miteinander
interagierender Proteine
TCA-Fällung
Immunpräzipitation
Protease -Resistenz-Test
Differentialzentrifugation
über zweistufigen
Saccharosegradienten
Auftrennung in
Nicht transportierte
Proteine werden von
Proteinase K verdaut
TCA-Fällung
Überstand
(lösliche
Proteine)
Membranfraktion
Pellet
(aggregierte
Proteine )
TCA-Fällung
Auftrennung der Proteine über SDS-Gelelektrophorese, Nachweis der synthetisierten, radioisotopmarkierten Proteine durch
Szintillations-Abbildungsverfahren (Phosphor-Imager)
=>Nachweis von
Protein-ProteinInteraktionen
=>Nachweis
erfolgreicher
Translokation bzw.
Integration
=> Nachweis von MembranTargeting der Proteine
Abb. 4.3: Versuche im zellfreien System zum Membrantransport von Escherichia coli
5 Ergebnisse
39
5.
Ergebnisse
5.1 Momp2: Ein Hybridprotein aus Mannitpermease (MtlA) und Outer
membrane protein A (OmpA)
Das Hybridprotein Momp2 wurde durch die Fusion von amphiphiler Helix und erster SignalAnker-Sequenz von MtlA mit dem signalsequenzlosen OmpA hergestellt: Das Outer
membrane protein A (OmpA) wird als Vorläuferprotein (pOmpA) synthetisiert; nach seiner
Translokation durch die Innenmembran wird die Signalsequenz durch die Signalpeptidase
abgespalten, so daß das reife OmpA ins Periplasma freigesetzt wird (Abb. 5.1A).
Mannitpermease (MtlA) ist ein polytopes Innenmembranprotein mit N-terminaler amphiphiler
Helix, sechs transmembranen α-Helices sowie einer großen C-terminalen zytoplasmatischen
Domäne (Abb. 5.1B; Sugiyama et al., 1991). Die erste transmembrane α-Helix von MtlA
dient als Signal-Anker-Sequenz und wird von SRP erkannt (Beck et al., 2000). Bei der
Konstruktion von Momp2 wurde die 21 Aminosäuren lange Signalsequenz sowie 5 weitere
Aminosäuren von pOmpA durch die N-terminalen 47 Aminosäuren von MtlA ersetzt. Dieser
Bereich von MtlA besteht aus der amphiphilen Helix (24 Aminosäuren), der ersten SignalAnker-Sequenz (20 Aminosäuren) sowie 3 zusätzlichen Aminosäuren (Abb. 5.1C).
pOmpA
346 As
27
26
21
47 48
Periplasma
Momp2
367 As
MtlA
637 As
Signalpeptidase
27
47
44
Innenmembran
25
24
334
Zytosol
A
B
C
Abb. 5.1: Membrantopologie von pOmpA, MtlA und Momp2
A. OmpA wird als Vorläuferprotein (pOmpA) synthetisiert; nach seiner Translokation durch die
Innenmembran wird die Signalsequenz (grün, 21 As) durch die Signalpeptidase abgespalten, so
daß das reife OmpA ins Periplasma freigesetzt wird.
B. Das Innenmembranprotein MtlA besteht aus einer N-terminalen amphiphilen Helix (blau, 24 As),
sechs transmembranen α-Helices (die erste transmembrane α-Helix ist rot eingezeichnet und
besteht aus den As 25-44) sowie einer großen zytoplasmatischen Domäne am C-Terminus (As
334-637).
C. Momp2 ist ein Hybridprotein aus amphiphiler Helix (blau) und erster transmembraner α-Helix
(rot) von MtlA sowie einem signalsequenzlosen OmpA. Bei seiner Konstruktion wurden die ersten
26 As von pOmpA durch die ersten 47 As von MtlA ersetzt.
As = Aminosäuren
5 Ergebnisse
40
Die Konstruktionsweise von Momp2 legt die im Diagramm gezeigte Membrantopologie von
Momp2 nahe: Die amphiphile Helix bleibt auf der zytosolischen Seite, die Signal-AnkerSequenz vermittelt eine Membranverankerung, und der von OmpA stammende Proteinanteil
ragt in das Periplasma hinein. Diese Topoplogie wurde, wie weiter unten ausgeführt,
experimentell bestätigt. Somit entspricht Momp2 einer Reihe von authentischen
Innenmembranproteinen in Escherichia coli, die aus einer großen periplasmatischen Domäne
bestehen, welche durch eine α-Helix in der Membran verankert ist.
5.2 Momp2 wird effizient in „Inside-out“-Innenmembranvesikel (INV)
transloziert
Zunächst sollte geprüft werden, ob das Hybridprotein Momp2 in Innenmembranvesikel
transportiert werden kann: Die Translokationseffizienz* von Momp2 sollte mit der
Translokationseffizienz von pOmpA bzw. der Integrationseffizienz von MtlA verglichen
werden. Hierzu wurde die Synthese der drei Proteine in einem zellfreien System mit einem
Protease-Resistenz-Test gekoppelt: Die Proteine wurden in einem zellfreien TranskriptionsTranslations-System aus E. coli synthetisiert und dabei durch die Zugabe von 35S-Methionin
und 35S-Cystein radioaktiv markiert. Dem Syntheseansatz wurden „Inside-out“Innenmembranvesikel (INV) zugegeben. Diese sind im Vergleich zu den Verhältnissen in der
E. coli-Zelle invertiert: Die zytosolische Seite der Innenmembran zeigt nach außen, die
periplasmatische Seite hingegen nach innen. Außerdem enthalten die INV alle
Targetingfaktoren (SecA, SecB, SRP und den SRP-Rezeptor FtsY) in ausreichenden Mengen.
Sekretorische Proteine können daher durch die Innenmembran in die INV transloziert werden,
während Innenmembranproteine in die Lipidschicht der INV integriert werden können. Im
Anschluß an die Synthesephase wurden die Versuchsansätze mit Proteinase K inkubiert.
Diese konnte alle Proteine außerhalb der INV verdauen. Sekretorische Proteine, die in die
INV transloziert worden waren, waren hingegen vor Proteinase K geschützt. Auch die
transmembranen und periplasmatischen Anteile integraler Innenmembranproteine wurden
durch die Lipidschicht der INV vor einem Proteaseverdau geschützt; große zytosolische
Anteile wurden jedoch verdaut, so daß kleinere Proteinfragmente (membrangeschützte
Fragmente) entstanden. Schließlich wurden die Proteine mit TCA gefällt und mittels SDSGelelektrophorese aufgetrennt. Die synthetisierten, radioaktiv markierten Proteine wurden
durch ein autoradiographisches Verfahren (Phoshoimaging) sichtbar gemacht.
Abb. 5.2A zeigt diesen Protease-Resistenz-Test für pOmpA. In Abwesenheit von INV
entstand nur das Vorläuferprotein pOmpA, das durch Proteinase K so gut wie vollständig
verdaut wurde (Spuren 1 und 2). Nach Zugabe von INV wurde ein großer Teil des
*
Beim Membrantransport von Momp2 wird die Signal-Anker-Sequenz in die Innenmembran integriert, die
große periplasmatische Domäne jedoch durch die Innenmembran transloziert. Vereinfachend wird der
Membrantransport von Momp2 hier als Translokation bezeichnet.
5 Ergebnisse
41
Vorläuferproteins durch die Abspaltung seiner Signalsequenz durch die Signalpeptidase zum
reifen OmpA „prozessiert“ (Spur 3); das reife OmpA war proteaseresistent (Spur 4). Daß auch
das Vorläuferprotein pOmpA teilweise proteaseresistent war, war nicht zu erwarten; dieses
Phänomen wird jedoch in vitro regelmäßig beobachtet und ist möglicherweise auf eine im
Vergleich zu den Verhältnissen in der E. coli-Zelle verminderte Signalpeptidaseaktivität in
den INV zurückzuführen. Auch MtlA wurde in Abwesenheit von INV nahezu vollständig von
Proteinase K verdaut (Abb. 5.2B, Spuren 1 und 2); in Anwesenheit von INV entstand beim
Proteinase-K-Verdau ein membrangeschütztes Fragment (Spuren 3 und 4): Die amphiphile
Helix sowie die zytosolische C-terminale Domäne von MtlA liegen auf der Außenseite der
INV und konnten daher von Proteinase K verdaut werden (vergleiche Abb. 5.1B). Abb. 5.2C
zeigt den Protease-Resistenz-Test für das Hybridprotein Momp2: In der Negativkontrolle
ohne INV wurde Momp2 durch Proteinase K vollständig verdaut (Spuren 1 und 2). In
Anwesenheit von INV entstand ein nur etwas kleineres membrangeschütztes Fragment
(Spuren 3 und 4). Die vergleichsweise geringe Größenabnahme von Momp2 nach
Proteinase-K-Behandlung läßt darauf schließen, daß nur die amphiphile Helix für einen
Proteaseverdau zugänglich ist. Die Signal-Anker-Sequenz ist hingegen in die schützenden
Membranlipide integriert und der reife OmpA-Anteil von Momp2 ragt in die INV hinein
(vergleiche Abb. 5.1C). Die Translokationseffizienz von Momp2 entsprach in etwa der
Translokationseffizienz von pOmpA bzw. der Integrationseffizienz von MtlA.
+
INV
+
PK
+
+
+
INV
+
PK
+
+
MtlA
INV
3
4
MtlAMGF
1
A
3
4
+
PK
Momp2MGF
OmpA
2
+
+
Momp2
pOmpA
1
+
2
3
1
2
4
B
C
Abb. 5.2: Membrantransport von pOmpA, MtlA und Momp2 in einem zellfreien System
pOmpA, MtlA und Momp2 wurden in einem zellfreien Transkriptions-Translations-System aus E.
35
35
coli synthetisiert und dabei durch die Verwendung von
S-Methionin und
S-Cystein
radioisotopmarkiert. Die Synthese fand jeweils in Abwesenheit (Spuren 1 und 2) bzw. in
Anwesenheit (Spuren 3 und 4) von INV statt. Anschließend wurde je ein Aliquot direkt mit TCA
gefällt (Spuren 1 und 3), ein weiteres Aliquot wurde zuvor mit Proteinase K (PK)
behandelt
(Spuren 2 und 4). Die Proteine wurden über SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt; die
radioisotopmarkierten
Proteine
wurden
(Phosphoimaging) sichtbar gemacht.
MGF = membrangeschütztes Fragment
durch
ein
autoradiographisches
Verfahren
5 Ergebnisse
42
5.3 Momp2 wird am Ribosom sowohl von Ffh als auch von Trigger factor
erkannt
Aus früheren Berichten ist bekannt, daß ribosomenassoziierte naszierende Ketten (RANCs)
des sekretorischen Proteins pOmpA von Trigger factor, nicht jedoch von Ffh gebunden
werden (Beck et al., 2000). Dabei bevorzugt Trigger factor offenbar das reife OmpA als
Bindestelle, während die Signalsequenz eher eine untergeordnete Rolle zu spielen scheint
(Valent et al., 1997). RANCs des polytopen Innenmembranproteins MtlA werden hingegen
von SRP, nicht jedoch von Trigger factor gebunden. SRP bindet dabei mindestens an die
erste Signal-Anker-Sequenz von MtlA (Beck et al., 2000). Das Hybridprotein Momp2 enthält
also einerseits mit der Signal-Anker-Sequenz von MtlA eine Bindestelle für SRP, andererseits
aber mit dem reifen OmpA auch die vermutliche(n) Bindestelle(n) für Trigger factor. Dies
ließ erwarten, daß sowohl SRP als auch Trigger factor an RANCs von Momp2 binden
würden. Dies sollte durch Quervernetzungsexperimente geprüft werden.
Hierzu wurden im zellfreien Transkriptions-Translations-System ribosomenassoziierte,
naszierende Ketten von pOmpA, MtlA und Momp2 nach einer Methode von Haeuptle et al.
(1986) synthetisiert (Abb. 5.3): Dem Syntheseansatz wurden DNA-Oligonukleotide
zugegeben, deren Sequenz zu einem Abschnitt der mRNA des zu synthetisierten Proteins
komplementär war. In der Transkriptions-Translations-Reaktion hybridisieren diese DNAOligonukleotide mit der mRNA; die Endonuklease RNAseH erkennt diese Hybride und
verdaut den hybridisierten mRNA-Teil. Die so verkürzte mRNA trägt an ihrem 3‘-Ende kein
Stoppkodon, so daß das Ribosom am Ende der Translation die Polypeptidkette nicht
freisetzen kann und ribosomenassoziierte naszierende Ketten (RANCs) entstehen. Diese
imitieren eine Momentaufnahmen einer Polypeptidkette in statu nascendi.
T7 Promotor
Plasmid
Transkription
5'
antisense DNAOligonukleotid
5'
3'
mRNA
endogene
3' RNaseH
5'
3' Translation
verkürzte
mRNA
5'
ribosomenassoziierte
naszierende Kette
Abb. 5.3: Synthese ribosomenassoziierter naszierender Ketten (RANCs)
Dem Transkriptions-Translations-Ansatz werden „antisense“ DNA-Oligonukleotide zugefügt, die mit
der mRNA hybridisieren. RNaseH erkennt diese Hybride und verdaut den hybridisierten mRNATeil. Die so verkürzte mRNA trägt an ihrem 3‘-Ende kein Stoppkodon, so daß das Ribosom am
Ende der Translation die Polypeptidkette nicht freisetzen kann.
(Abb. modifiziert nach Beck, 2000)
Im Anschluß an die Synthese der RANCs wurden deren Bindungspartner durch
Quervernetzung mit dem homobifunktionellen, membranpermeablen Quervernetzungsreagenz
Disuccinimidyl-Suberat (DSS) identifiziert. DSS besteht aus Suberinsäure (COOH-(CH2)6COOH), die an beiden Enden mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) verestert ist (Abb. 5.4A).
43
5 Ergebnisse
A
B
pH 7 - 9
Abb. 5.4: Strukturformel (A) und Reaktionsschema (B) von DSS
DSS reagiert im neutralen Bereich mit primären Aminen unter Abspaltung von NHS und
Ausbildung einer Amidbindung (Abb. 5.4B). Somit ermöglicht es die kovalente Koppelung
eng benachbarter Polypeptide, wobei v.a. die ε-Amine der Lysin-Seitenketten als
Reaktionspartner dienen. Das Suberat-Molekül kann einen Abstand von bis zu 11.4 Å
zwischen zwei miteinander quervernetzten Polypeptiden überbrücken. Im Anschluß an die
Quervernetzung konnten die Versuchsansätze mit spezifischen Antisera immunpräzipitiert
werden, um die einzelnen Quervernetzungspartner zu identifizieren.
In Abb. 5.5 wird zunächst das Verhalten von 125 Aminosäuren langen RANCs von pOmpA
(pOmpA-125) sowie 189 Aminosäuren langen RANCs von MtlA (MtlA-189) demonstriert.
Für pOmpA-125 entstand als DSS-Quervernetzungsprodukt eine prominente Doppelbande,
welche mit einem spezifischen Antiserum gegen Trigger factor immunpräzipitiert werden
konnte (Spuren 2 und 3). Trigger factor war also im zellfreien System bereits enthalten. Das
Auftreten einer Doppelbande als Quervernetzungsprodukt zwischen pOmpA und Trigger
factor ist bereits früher beobachtet worden (Beck et al., 2000); die untere Bande entspricht
mit ihrem Molekulargewicht von etwas mehr als 70 kD der Summe von pOmpA-125 (14 kD)
und Trigger factor (das 48 kD große Protein zeigt im SDS-Polyacrylamidgel ein aberrantes
Laufverhalten und läuft bei 58 kD; Hesterkamp et al., 1996). Das Entstehen der oberen Bande
ist nicht endgültig geklärt; mögliche Ursachen für das veränderte Laufverhalten sind: (1) Die
RANCs sind in ihrer Länge heterogen, (2) unterschiedliche Lysine von Trigger factor oder
den RANCs reagieren mit DSS, so daß ein unterschiedliches Laufverhalten resultiert, oder (3)
Trigger factor wird an mehreren Bindestellen mit den RANCs quervernetzt, so daß ein
„Knäuel“ mit schlechteren Laufeigenschaften entsteht. Nach Zugabe des SRP-Proteins Ffh
konnte kein weiteres Quervernetzungsprodukt nachgewiesen werden (Spuren 6-8). Für MtlA189 konnte in Abwesenheit von Ffh kein prominentes Quervernetzungsprodukt beobachtet
werden (Spuren 10 – 12). Erst nach Zugabe von Ffh wurde eine deutliche
Quervernetzungsbande sichtbar, die in ihrem Molekulargewicht von etwas weniger als 70 kD
der Summe von MtlA-189 (19 kD) und Ffh (48 kD) entsprach und auch mit spezifischem
anti-Ffh-Serum immunpräzipitiert werden konnte (Spuren 14 und 16). Beim Quervernetzen
von Momp2-146 entstand ebenfalls eine Doppelbande, die aufgrund ihrer Größe und durch
5 Ergebnisse
44
Immunpräzipitation mit anti-Trigger-factor-Serum als Quervernetzungsprodukt von Momp2146 mit Trigger factor identifiziert werden konnte (Spuren 18 und 19). Nach Zugabe von Ffh
entstand ein weiteres Quervernetzungsprodukt, welches mit anti-Ffh-Serum immunpräzipitiert
werden konnte (Spuren 22 und 24). Die Quervernetzungsintensität zwischen Momp2-146 und
Trigger factor nahm durch die Zugabe von Ffh deutlich ab (vergleiche Spuren 19 und 23).
pOmpA-125
Ffh
DSS
IP α
*
MtlA-189
+
+ + +
+ + +
TF Ffh
TF Ffh
Momp2-146
+
+ + +
+ + +
TF Ffh
+
+ +
+ + +
TF Ffh
TF Ffh
+
TF Ffh
221
__
__97
__70
x TF
x x Ffh
*
*
MtlA
*
*
x
x
*
*
*
*x
x
Momp2
pOmpA
MtlA-189
pOmpA-125
Momp2
-146
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
__46
__29
__19
__14
21 22 23 24
Abb. 5.5: Momp2-RANCs können sowohl mit Ffh als auch mit Trigger factor quervernetzt
werden
pOmpA-125, MtlA-189 und Momp2-146 wurden in Ab- bzw. Anwesenheit von Ffh im zellfreien
System synthetisiert; jeweils ein Reaktionsansatz (25 µl) wurde direkt mit TCA gefällt (Spuren
1,5,9,13,17 und 21), der Rest wurde mit DSS quervernetzt und die RANCs über ein
Saccharosekissen isoliert; hiervon wurden wiederum ein Reaktionsansatz mit TCA gefällt (Spuren
2,6,10,14,18,22) und jeweils vierfache Reaktionsansätze mit anti-Trigger-factor- (Spuren
3,7,11,15,19,23) bzw. anti-Ffh-Antikörpern (Spuren 4,8,12,16,20,24) immunpräzipitiert.
Dieses Experiment zeigt, daß sowohl SRP als auch Trigger factor an naszierende Ketten von
Momp2 binden. Eine funktionelle Interaktion zwischen RANCs und Ffh kann durch die
Zugabe des SRP-Rezeptors FtsY zusammen mit Innenmembranen aufgelöst werden (Valent
et al., 1998; Scotti et al., 1999). Daher sollte im folgenden überprüft werden, ob auch im Fall
von Momp2 die Zugabe von FtsY und Innenmembranen die Dissoziation von Ffh von den
naszierenden Ketten bewirkt.
Zunächst wurden die Versuchsbedingungen mit naszierenden Ketten von MtlA etabliert
(Abb. 5.6 oben): MtlA-189 wurde in Abwesenheit (Spuren 1 und 2) bzw. in Anwesenheit
(Spuren 3 - 12) von Ffh synthetisiert und anschließend mit DSS quervernetzt. Nur in
Anwesenheit von Ffh entstand ein Quervernetzungsprodukt, das mit seinem
Molekulargewicht von etwas weniger als 70 kD dem oben beschriebenen
Quervernetzungsprodukt von MtlA-189 und Ffh entsprach (x in Spur 4). Waren bei der
5 Ergebnisse
45
Synthese INV mit ihrem endogenen FtsY-Gehalt anwesend, verschwand das
Quervernetzungsprodukt zwischen der naszierenden Kette und Ffh (Spur 6); durch Zugabe
der FtsY-freien HINV oder von FtsY alleine konnte dieser Effekt nicht erzielt werden (Spuren
8 und 10). Erst durch die gleichzeitige Zugabe von aufgereinigtem FtsY und HINV wurde die
Fähigkeit, Ffh von MtlA-189 abzulösen, weitgehend wieder hergestellt (Spur 12). Dies zeigt,
daß FtsY und Innenmembranen erforderlich sind, um die Interaktion zwischen Ffh und
naszierenden Ketten von MtlA zu beenden.
INV
Vesikel
Ffh
HINV
HINV
+
FtsY
DSS
+
+
+
+
+
+
+
+
+
__97
__70
X =MtlA-189 x Ffh
?
x
MtlA
x
x
__46
__29
__
19
__14
MtlA-189
__97
__70
X =Momp2-146 x Ffh
?
x
x
x
__46
Momp2
__29
__
19
__14
Momp2146
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Abb. 5.6: Die Dissoziation von Ffh von MtlA- bzw. Momp2-RANCs erfordert FtsY und
Innenmembranen
MtlA-189 und Momp2-146 wurden ohne Zugabe (Spur 1 und 2) bzw. nach Zugabe von Ffh (Spur 312) im zellfreien System synthetisiert. Zusätzlich waren in einzelnen Ansätzen INV (Spuren 5 und
6), HINV (Spuren 7 und 8 sowie 11 und 12) und FtsY (Spuren 9-12) bei der Synthese anwesend.
Im Anschluß an die Synthese wurde jeweils ein Reaktionsansatz (25 µl) direkt mit TCA gefällt
(ungeradzahlige Spuren), ein weiterer Reaktionsansatz wurde zuvor mit DSS quervernetzt
(geradzahlige Spuren). Die in Spur 2 mit „?“ markierte Bande bei ca. 70 kD entspricht einem
unspezifischen Syntheseprodukt, das durch DSS-Quervernetzung verstärkt wurde; es trat zwar in
allen Versuchen auf, wird bei den in diesem Versuch geringen Syntheseraten jedoch besonders
deutlich.
5 Ergebnisse
46
Derselbe Effekt wurde auch für Momp2-146 beobachtet (Abb. 5.6 unten): Die Ablösung von
Ffh von der naszierenden Momp2-Kette erforderte ebenfalls sowohl FtsY als auch HINV.
Aufgrund geringer Syntheseraten von Momp2-146 in diesem Versuch und des hohen
Hintergrundes sind die Ergebnisse in diesem Versuch jedoch nur bedingt aussagekräftig.
Die beiden beschriebenen Quervernetzungsexperimente zeigen einerseits, daß sowohl SRP als
auch Trigger factor kotranslational an Momp2 binden. Andererseits schien die Dissoziation
von Ffh von den Momp2-RANCs nach Zugabe von FtsY und Innenmembranen einen ersten
Hinweis dafür zu liefern, daß die Interaktion von SRP mit naszierenden Ketten von Momp2
von funktionellem Charakter ist. Bei dem sekretorischen Protein pOmpA führt die Bindung
von Trigger factor an die naszierenden Ketten zu einer späteren Interaktion mit SecA und
SecB. Bedeutet demnach die Bindung von Trigger factor an naszierende Ketten von Momp2,
daß auch Momp2 zu einem späteren Zeitpunkt mit SecA und SecB interagiert? Wenn ja,
welches sind dann die spezifischen Aufgaben von SRP bzw. Trigger factor, SecA und SecB
beim Membrantransport von Momp2? Diese beiden Fragen sollten in den nächsten Versuchen
geklärt werden.
5.4 Die Translokation von Momp2 in HINV benötigt nur SecA und SecB,
jedoch nicht SRP
In Abb. 5.2 wurde bereits gezeigt, daß Momp2 in „Inside-out“-Innenmembranvesikel (INV)
transloziert werden kann. Da die INV alle Targetingfaktoren (SecA, SecB, Ffh und FtsY) in
ausreichenden Mengen enthalten, geht aus diesem Versuch jedoch nicht hervor, welche
Targetingfaktoren hierfür tatsächlich nötig sind. Dies sollte im folgenden Versuch durch die
Verwendung von harnstoffgewaschenen Vesikeln (HINV) getestet werden. Durch die
Behandlung mit 6 M Harnstoff werden die Targetingfaktoren SecA, SecB, Ffh und FtsY
entfernt. Auch das verwendete zellfreie Transkriptions-Translations-System ist frei von
diesen Targetingfaktoren (Koch et al., 1999).
Im Rahmen eines Protease-Resistenz-Tests wurden zunächst pOmpA, MtlA und Momp2 in
der Abwesenheit von Vesikeln synthetisiert. Bei dem anschließenden Verdau mit
Proteinase K wurden alle drei Substrate wieder beihnahe vollständig verdaut (Abb. 5.7,
Spuren 1 und 2). Nach der Zugabe von INV hingegen wurden die bereits in Abb. 5.2
gezeigten proteaseresistenten Spezies beobachtet, die für alle drei Substrate eine erfolgreiche
Translokation bzw. Integration anzeigen (Spuren 3 und 4). Durch die Verwendung der
harnstoffgewaschenen Vesikel (HINV) wurde der Transport aller drei Substrate nahezu
vollständig unterbunden (Spuren 5 und 6). Entsprechend früheren Ergebnissen (Koch et al.,
1999), konnte die Translokation von pOmpA durch SecA, SecB und die F1-Untereinheit der
F1F0-ATPase wiederhergestellt werden (Spuren 7 und 8), während die Integration von MtlA
von der Zugabe der SRP-Komponente Ffh und des SRP-Rezeptors FtsY abhängig war
(Spuren 9 und 10); die Abhängigkeit der Integration von 4,5S RNA kann in dem verwendeten
zellfreien System nicht demonstriert werden, da die 4,5S RNA in dem verwendeten
5 Ergebnisse
47
Zellextrakt in ausreichendem Maße enthalten war (Koch et al., 1999). Trotz der weiter oben
demonstrierten Bindung von SRP an naszierende Ketten von Momp2, konnte die
Translokation von Momp2 in HINV durch die Zugabe von Ffh und FtsY nicht
wiederhergestellt werden (Spuren 9 und 10); vielmehr war die Zugabe von SecA, SecB und
der F1-Untereinheit der F0F1-ATPase notwendig und ausreichend (Spuren 7 und 8).
INV
HINV
+
+
SecA, SecB, F1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
44
1,1
40
2
22
24
+
Ffh, FtsY
PK
+
+
pOmpA
OmpA
% Translokation
1,3
45
1,5
MtlA
MtlA-MPF
1
% Integration
24
2
Momp2
Momp2-MPF
1
% Integration
1
Abb.
5.7:
Momp2
2
34
3
benötigt
4
für
0,6
5
seine
6
32
7
0,9
8
Translokation
9
in
10
28
11
12
harnstoffgewaschene
Innenmembranvesikel (HINV) nur SecA, SecB und die F1-ATPase
pOmpA, MtlA und Momp2 wurden in Abwesenheit von Innenmembranvesikeln (Spuren 1 und 2), in
Anwesenheit von INV (Spuren 3 und 4) oder in Anwesenheit von HINV (Spuren 5 - 12) im zellfreien
System synthetisiert. Außerdem wurden entsprechend der Beschriftung SecA, SecB, F1-ATPase,
Ffh und FtsY bei der Synthese zugegeben. Anschließend wurde jeweils ein Reaktionsansatz (25
µl) direkt mit TCA gefällt (ungeradzahlige Spuren), ein weiterer Reaktionsansatz wurde zuvor mit
Proteinase K (PK) behandelt (geradzahlige Spuren). Zur Bestimmung der Translokations- bzw.
Integrationseffizienz wurde die Radioaktivität in den einzelnen Proteinbanden mit Hilfe des
Programmes Image Quant ermittelt. Die Translokationseffizienz von OmpA entspricht dem
Verhältnis der OmpA- und pOmpA-Banden nach Protease-K-Verdau zu den OmpA- und pOmpABanden vor Protease-K-Verdau. Die Integrationseffizienz von MtlA entspricht dem Verhältnis von
MtlA-MGF zu MtlA. Dieser Wert wurde dann mit 1.5 multipliziert, da MtlA-MGF nur noch 16 der
ursprünglich 24 Methionine enthält. Die Translokationseffizienz von Momp2 entspricht dem
Verhältnis von Momp2-MGF zu Momp2.
MGF = membrangeschütztes Fragment.
5 Ergebnisse
48
Die Translokation von Momp2 ist in vitro also nicht von SRP abhängig und kann auch in
Abwesenheit von SRP stattfinden. Da in vivo die Synthese von Momp2 jedoch immer in
Anwesenheit von SRP stattfindet, ist zu erwarten, daß dann auch eine Bindung von SRP an
naszierende Ketten von Momp2 erfolgt, wie dies weiter oben durch DSS-Quervernetzung von
Ffh an RANCs von Momp2 gezeigt wurde. Diese Bindung scheint über die Bindung von
Trigger factor zu dominieren, da bei Zugabe von Ffh die Quervernetzungsbande mit Trigger
factor deutlich schwächer wurde (Abb. 5.5). Außerdem bewirkten FtsY und Innenmembranen
eine Dissoziation von SRP vom SRP-RANC-Komplex (Abb. 5.6). Diese Ergebnisse sprechen
für eine funktionelle Rolle von SRP bei dem Membrantargeting von Momp2. Die Rolle von
SRP beim Export von Momp2 zu analysieren, machte daher einen anderen experimentellen
Ansatz erforderlich.
5.5 Eine gestörte Interaktion zwischen SecA und SecY beeinträchtigt die
Translokation, nicht jedoch die Membranassoziation von Momp2
Hierzu kamen in den folgenden Versuchen INV eines SecY-Mutanten-Stammes zum Einsatz.
Die secY205-Mutante unterscheidet sich vom Wildtyp durch den Austausch einer einzigen
Aminosäure (Tyrosin zu Aspartat) in der C-terminalen, zytoplasmatischen Domäne von SecY.
Hierdurch ist die Interaktion zwischen SecA und SecY gestört, wodurch die Translokation
sekretorischer Proteine stark beeinträchtigt wird (Matsumoto et al., 1997). Im Gegensatz dazu
ist die Integration polytoper Innenmembranproteine nicht betroffen, da diese auf eine
funktionelle SecA-SecY-Interaktion nicht angewiesen sind (Koch und Müller, 2000). Somit
stellten die secY205-INV ein ideales Werkzeug dar, um die Beteiligung von SecA und SecB
bzw. SRP an Targeting und Transport von Momp2 zu untersuchen. Durch Verwendung der
secY205-INV im Protease-Resistenz-Test sollte zunächst geprüft werden, ob eine gestörte
SecA-SecY-Interaktion den Membrantransport von Momp2 beeinträchtigt; zusätzlich sollte
durch Differentialzentrifugation in Anwesenheit der secY205-INV untersucht werden, ob trotz
gestörter SecA-SecY-Interaktion ein Membrantargeting von Momp2 durch SRP zustande
kommen kann.
Die secY205-INV wurden zunächst auf die Translokationseffizienz von pOmpA bzw. die
Integrationseffizienz von MtlA hin untersucht. Dabei wurden frühere Ergebnisse bestätigt
(Abb. 5.8): Die Translokationseffizienz von pOmpA verringerte sich im Fall der secY205INV auf ein Fünftel des Wildtypniveaus (Spuren 5 und 6 im Vergleich zu Spuren 3 und 4);
die Integrationseffizienz von MtlA hingegen zeigte bei Wildtyp-INV und secY205-INV
keinen Unterschied. Momp2 verhielt sich auch in diesem Versuchsansatz wie pOmpA: Die
Translokationseffizienz sank bei Verwendung der secY-205-INV auf etwa ein Viertel des
Wildtypniveaus.
5 Ergebnisse
49
Wildtyp
INV
+
PK
secY205
+
+
pOmpA
OmpA
% Translokation
4
50
10
1
28
27
1
46
12
MtlA
MtlA-MGF
% Integration
Momp2
Momp2-MGF
% Translokation
1
2
3
4
5
6
Abb. 5.8: SecY205-INV erlauben die Integration von MtlA, nicht jedoch die Translokation von
pOmpA und Momp2
pOmpA, MtlA und Momp2 wurden in Abwesenheit von Innenmembranvesikeln (Spuren 1 und 2), in
Anwesenheit von Wildtyp-INV (Spuren 3 und 4) oder in Anwesenheit von secY205-Mutanten-INV
(Spuren 5 und 6) im zellfreien System synthetisiert. Anschließend wurde jeweils ein
Reaktionsansatz (25 µl) direkt mit TCA gefällt (ungeradzahlige Spuren), ein weiterer
Reaktionsansatz wurde zuvor mit Proteinase K (PK) behandelt (geradzahlige Spuren).
MGF = membrangeschütztes Fragment
Damit zeigt der Protease-Resistenz-Test in zwei unterschiedlichen Versuchen, nämlich zum
einen bei der Wiederherstellung der Translokationskompetenz von HINV und zum anderen
beim Vergleich zwischen Wildtyp-INV und secY205-INV, daß eine vollständige
Translokation von Momp2 SecA-abhängig ist.
Um den Targetingmechanismus von Momp2 näher zu untersuchen, wurde die
Differentialzentrifugation
der
Translationsprodukte
über
einen
zweistufigen
Saccharosegradienten eingesetzt (Abb. 5.9). Hierbei wurden wiederum pOmpA, MtlA und
Momp2 ohne Vesikel (Spuren 1-3), in der Anwesenheit von Wildtyp-INV (Spuren 4 – 6)
sowie in der Anwesenheit von secY205-INV (Spuren 7 – 9) synthetisiert. Anschließend
erfolgte die Auftrennung der Syntheseansätze in einen lösliche Anteile enthaltenden
Überstand, eine Membranfraktion sowie ein Pellet aus aggregiertem Material. Für alle drei
Substrate war eine deutliche Verschiebung vom Überstand zur Membranfraktion durch die
Zugabe von Wildtyp-INV zu beobachten (vergleiche Spuren 1/2 und 4/5), was ihre
Membranassoziation ausdrückt. Beim Einsatz der secY205-INV wurde die
5 Ergebnisse
50
Membranassoziation von pOmpA gegenüber den Wildtyp-INV deutlich reduziert, während
die Membranassoziation von MtlA durch die Verwendung der secY205-INV nicht betroffen
war (vergleiche Spuren 4/5 und 7/8). In diesem Versuchsansatz verhielt sich Momp2 nun in
gleicher Weise wie MtlA: Die Membranassoziation von Momp2 wurde durch die secY205Mutation ebenfalls nicht beeinträchtigt.
-
INV
Fraktion
Üst
Wildtyp
Mem Pel
Üst
secY205
Mem
Pel
Üst
Mem
Pel
pOmpA
OmpA
% der Probe
69
12
20
30
46
24
50
19
31
42
8
50
13
47
40
8
49
43
48
18
33
8
87
5
12
74
13
1
2
3
4
5
6
7
8
9
MtlA
% der Probe
Momp2
% der Probe
Abb. 5.9: Im Gegensatz zu pOmpA assoziieren MtlA und Momp2 mit secY205-INV
pOmpA, MtlA und Momp2 wurden in Abwesenheit von Innenmembranvesikeln (Spuren 1 - 3), in
Anwesenheit von Wildtyp-INV (Spuren 4 - 6) oder in Anwesenheit von secY205-Mutanten-INV
(Spuren 7 - 9) im zellfreien System synthetisiert. Anschließend wurde je ein Doppelansatz (50 µl)
über einen zweistufigen Saccharosegradienten in Überstand (Spuren 1,4 und 7), Membranfraktion
(Spuren 2,5 und 8) sowie Pellet (Spuren 3, 6 und 9) aufgetrennt.
Üst = Überstand; Mem = Membranfraktion; Pel = Pellet
Somit decken sich für pOmpA und MtlA die Ergebnisse von Protease-Resistenz-Test und
Differentialzentrifugation mit secY205-INV: Sowohl Translokation als auch Targeting von
pOmpA werden durch die gestörte SecA-SecY-Interaktion behindert; Integration bzw.
Targeting der MtlA werden hierdurch jedoch nicht beeinflußt. Anders verhält es sich für
Momp2: Die geringe Translokationseffizienz bei Verwendung von secY205-INV,
nachgewiesen durch Proteaseresistenz, spricht dafür, daß eine vollständige Translokation von
Momp2 ohne eine produktive SecA-SecY-Interaktion nicht stattfinden kann; die
Membranassoziation von Momp2 ist von dieser SecA-SecY-Interaktion jedoch unabhängig.
Dies läßt auf ein SecA-unabhängiges Targeting von Momp2 schließen.
51
5 Ergebnisse
5.6 Quervernetzung von Momp2-RANCs mit Membrankomponenten:
Kotranslationale Interaktion zwischen Momp2 und SecY
Wie aus früheren Arbeiten bekannt ist, interagieren integrale Innenmembranproteine wie
MtlA kotranslational mit Bestandteilen des Translokons (Valent et al., 1998; Beck et al.,
2000). Im Gegensatz dazu binden sekretorische Proteine wie pOmpA erst posttranslational an
die Membran; das Membrantargeting von pOmpA setzt die Loslösung des Proteins vom
Ribosom voraus (Behrmann et al., 1998). Dementsprechend können ribosomenassoziierte
naszierende Ketten (RANCs) von pOmpA auch nicht mit SecY, der Hauptkomponente des
Translokons, quervernetzt werden; hierfür ist vielmehr die Loslösung vom Ribosom sowie die
artifizielle Schaffung eines Translokationsintermediats durch das Anhängen eines größeren
Moleküls an den C-Terminus von pOmpA erforderlich, um das pOmpA-Intermediat im
Translokon zu arretieren (Beck et al., 2000). Im folgenden sollte untersucht werden, ob
Momp2 kotranslational mit dem Translokon interagiert und Momp2-RANCs daher mit SecY
von INV quervernetzt werden können.
In dem in Abb. 5.10 dargestellten Versuch wurde zunächst die kotranslationale Interaktion
zwischen MtlA und SecY bestätigt: Nach der Synthese von MtlA-189 in Anwesenheit von
INV trat nach anschließender Inkubation mit DSS eine zusätzliche prominente Bande auf, die
in ihrer Größe von ca. 50 kD einem Quervernetzungsprodukt zwischen MtlA-189 (19 kD) und
SecY (das 49 kD große Protein zeigt im SDS-Polyacrylamidgel ein aberrantes Laufverhalten
und läuft bei 35 kD, Ito 1984) entsprach; dieses Quervernetzungsprodukt konnte auch mit
einem spezifischen SecY-Antiserum immunpräzipitiert werden (Spur 4). Auch RANCs von
Momp2 in drei verschiedenen Längen (Momp2-146, Momp2-212 und Momp2-301) konnten
mit SecY von INV quervernetzt werden (Spuren 8,12 und 16); die Interaktion von Momp2212 mit SecY war aufgrund geringerer Syntheseraten nur schwach zu erkennen.
5 Ergebnisse
52
MtlA-189
+
+
INV
DSS
Momp2-146
+
+
+
Momp2-212 Momp2-301
+ +
+
+
+
+ +
+
+
+
+
221
97
> < x SecY
72
>
<
MtlA
>
Momp2
Momp2-301
<
>
<
46
<
>
29
Momp2-212
20
MtlA-189
Momp2-146
14
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
97
72
>
IP α SecY
>
<
>
>
<
<
46
<
Abb. 5.10: Momp2-RANCs unterschiedlicher Länge können mit SecY von INV quervernetzt
werden.
MtlA-189, Momp2-146, -212 und -301 wurden jeweils in Ab- oder Anwesenheit von INV im
zellfreien System synthetisiert. Anschließend wurden jeweils ein Reaktionsansatz (25 µl) direkt mit
TCA gefällt (ungeradzahlige Spuren), der Rest mit DSS quervernetzt. Hiervon wurde ein einfacher
Reaktionsansatz wiederum mit TCA gefällt (geradzahlige Spuren, obere Bildhälfte); aus den
restlichen Ansätzen wurden die Vesikel über ein Saccharosekissen isoliert (zu Ansätzen, die bisher
keine Vesikel enthielten, wurden vor der Zentrifugation INV zur Gleichbehandlung zugegeben) und
dann 15fache Ansätze mit anti-SecY-Antikörpern immunpräzipitiert (Spuren im unteren Bildteil).
Um den kotranslationalen Charakter des Membrantargetings von Momp2 zu unterstreichen,
wurde Momp2-146 in Anwesenheit von INV synthetisiert; anschließend wurde ein Aliquot
direkt mit DSS quervernetzt, das andere zuvor mit Puromycin behandelt (Abb. 5.11). Das
Antibiotikum Puromycin löst Polypeptidketten vom Ribosom ab; nach der Loslösung von
Momp2-146 vom Ribosom war die Quervernetzung mit SecY deutlich schwächer (siehe auch
Abb. 5.12, Spur 7).
5 Ergebnisse
53
INV
Puromycin
DSS
+
+
+
+
+
+
IP α SecY
Momp2-146
x SecY
46
1
2
3
Abb. 5.11: Die Quervernetzung von Momp2-146 mit SecY von INV verschwindet weitgehend nach
Ablösung der Ribosomen durch Puromycin
Momp2-146 wurde in Abwesenheit (Spur 1) bzw. in Anwesenheit von INV (Spuren 2 und 3) im
zellfreien System synthetisiert. Ansatz Nr. 3 wurde im Anschluß an die Synthese mit Puromycin
behandelt, um die Ribosomen von den naszierenden Ketten abzulösen. Die Proben wurden mit
DSS quervernetzt; anschließend wurden die Vesikel über ein Saccharosekissen isoliert (zu Ansatz
Nr.1, der bisher keine Vesikel enthielt, wurden vor der Zentrifugation INV zur Gleichbehandlung
zugegeben) und dann 15fache Ansätze mit anti-SecY-Antikörpern immunpräzipitiert.
Somit sprechen zwei Beobachtungen gegen ein SecA-abhängiges Targeting von Momp2:
Zum einen kann das Targeting von Momp2 unabhängig von einer funktionellen SecA-SecYInteraktion stattfinden, was mit Hilfe der Assoziation an secY205-INV gezeigt wurde; zum
anderen erfolgte das Targeting von Momp2 kotranslational; ein kotranslationales, durch SecA
vermitteltes Targeting kann jedoch ausgeschlossen werden (Behrmann et al., 1998). Die
Ähnlichkeit zwischen dem Targeting von MtlA und Momp2 lassen demnach eher ein SRPabhängiges Targeting auch von Momp2 vermuten.
5.7 Das kotranslationale Targeting von Momp2 erfolgt SRP-abhängig
Um zu prüfen, ob das kotranslationale Targeting von Momp2 tatsächlich von SRP abhängig
ist, wurden Momp2-RANCs in Anwesenheit unterschiedlicher Translokationsfaktoren
synthetisiert und mit SecY von harnstoffgewaschenen Vesikeln (HINV) quervernetzt
(Abb. 5.12). Wie oben beschrieben, waren die Targetingfaktoren SecA, SecB, Ffh und FtsY
durch die Harnstoffbehandlung entfernt worden. Hierdurch wurde die kotranslationale
Interaktion zwischen Momp2-146 und SecY deutlich reduziert, die Quervernetzungseffizienz
sank auf ein Drittel des Ausgangswertes (vergleiche Spuren 2 und 3). Die Interaktion
zwischen Momp2-146 und SecY konnte ausschließlich durch Ffh und FtsY (Spur 4)
wiederhergestellt werden, die Quervernetzungseffizienz übertraf sogar den Wert für INV. Die
Zugabe von SecA, SecB und F1-ATPase zeigte hingegen keinen wesentlichen Effekt (Spur 5).
Bei der gleichzeitigen Zugabe aller Targetingfaktoren wurden Ffh und FtsY offenbar in ihrer
Funktion gehemmt (Spur 6). Dieser Effekt war in dem zellfreien System schon früher
beobachtet worden; eine Interpretation ist auf der Basis der bisherigen Daten jedoch
schwierig. Die Behandlung eines Aliquots mit Puromycin vor der Quervernetzung diente
wiederum dem Nachweis, daß das Targeting kotranslational erfolgt: Nach der Loslösung der
5 Ergebnisse
54
naszierenden Kette vom Ribosom war eine Quervernetzung auch hier nicht mehr möglich
(Spur 7).
Vesikel
-
INV
HINV
Ffh, FtsY
HINV
HINV
+
+
+
SecA, SecB, F1
HINV
+
+
Puromycin
DSS
HINV
+
+
+
+
+
+
+
+
IP α SecY
Momp2-146
x SecY
46
Quervernetzungs<1
effizienz in %
100
35
135
41
89
2
2
3
4
5
6
7
1
Abb. 5.12: Nur in Anwesenheit von Ffh und FtsY können Momp2-RANCs effizient mit SecY
von Innenmembranvesikeln quervernetzt werden.
Momp2-146 wurde in Anwesenheit von Vesikeln (Spur 1), in Anwesenheit von INV (Spur 2) oder in
Anwesenheit von HINV (Spuren 3-7) im zellfreien System synthetisiert. Außerdem wurden SecA
und SecB (Spuren 5 und 6) oder Ffh und FtsY (Spuren 4, 6 und 7) bei der Synthese zugegeben.
Die Proben wurden mit DSS quervernetzt; anschließend wurden die Vesikel über ein
Saccharosekissen isoliert (zu Ansatz Nr. 1, der bisher keine Vesikel enthielt, wurden vor der
Zentrifugation INV zur Gleichbehandlung zugegeben) und dann 15fache Ansätze mit anti-SecYAntikörpern immunpräzipitiert. Ansatz Nr. 7 wurde vor der DSS-Quervernetzung mit Puromycin
behandelt,
um
die
Ribosomen
von
den
naszierenden
Ketten
abzutrennen.
Die
Quervernetzungseffizienz für INV wurde gleich 100 % gesetzt.
Durch den geschilderten Versuch wird klar gezeigt, daß das kotranslationale Targeting von
Momp2 durch SRP vermittelt wird. Die Tatsache, daß die Interaktion zwischen Momp2-146
und SecY durch die Verwendung von HINV nicht vollständig unterbunden wird, legt nahe,
daß unter den gewählten In-vitro-Bedingungen ein gewisses Maß an Membrantargeting auch
ohne Targeting- und Transportfaktoren möglich ist. Ein entsprechendes Phänomen war zuvor
schon bei Arbeiten zum Proteintransport in Säugerzellen beobachtet worden; es wurde auf die
unphysiologisch hohen Konzentrationen an RANCs und Translokons im In-vitro-System
zurückgeführt (Neuhof et al., 1998; Raden und Gilmore, 1998).
5.8 Nach dem SRP-abhängigen Targeting werden SecA und SecB zur
Translokation von Momp2 benötigt
Durch die Membranassoziaton von Momp2 an secY205-INV (Abb. 5.9) sowie die
Quervernetzung von Momp2-RANCs mit SecY von HINV (Abb. 5.12) konnte gezeigt
55
5 Ergebnisse
werden, daß das kotranslationale Targeting von Momp2 nicht von SecA/SecB abhängig ist,
sondern durch SRP vermittelt wird. Für die vollständige Translokation von Momp2 waren
jedoch SecA/SecB notwendig; dies wurde durch die Reaktivierung von HINV (Abb. 5.7)
sowie den Effekt der secY205-Mutation auf die Translokation in secY205-INV im ProteaseResistenz-Test (Abb. 5.8) gezeigt.
Im Anschluß an diese Doktorarbeit wurde von H.-G. Koch eine Methode etabliert, mit der das
Membrantargeting von Momp2 und seine anschließende Translokation als einzelne Schritte
im Transport von Momp2 untersucht werden konnten. Zunächst wurde das Targeting von
Momp2 untersucht: RANCs von Momp2 wurden in der Anwesenheit von HINV und
unterschiedlichen Targetingfaktoren synthetisiert; anschließend wurden die HINV durch ein
Flotationsverfahren als Membranfraktion isoliert. Hierbei bestätigten sich die weiter oben
beschriebenen Ergebnisse: Nur in Anwesenheit von Ffh und FtsY assoziierten die Momp2RANCs mit HINV und wurden mit diesen in der Membranfraktion isoliert. Dann wurde die
Translokation von Momp2 untersucht: Die Membranfraktion wurde mit Puromycin inkubiert,
um die naszierenden Ketten von den Ribosomen loszulösen. Gleichzeitig wurde einem
Aliquot SecA, SecB und die F1-ATPase zugesetzt. Durch die folgende Inkubation mit
Proteinase K wurde die Translokation in die HINV geprüft. Auch hierbei wurden die weiter
oben beschriebenen Ergebnisse bestätigt: Das Targeting naszierender Ketten von Momp2
führte per se noch nicht zur Proteinase-K-Resistenz. Für die Translokation naszierender
Ketten von Momp2 in die HINV und die daraus resultierende Proteinase-K-Resistenz waren
SecA/SecB nötig.
Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, daß der Transport von Momp2
in zwei Schritten erfolgt: Das Membrantargeting von Momp2 erfolgt kotranslational und
SRP-abhängig. Die anschließende Translokation von Momp2 hingegen erfordert SecA und
SecB.
6 Diskussion
6.
56
Diskussion
6.1 Momp2: Ein Hybridprotein aus der Signal-Anker-Sequenz von MtlA
und dem signalsequenzlosen OmpA als Modellprotein zum
Proteintransport in Escherichia coli
In vorangehenden Arbeiten wurden individuelle Transportmechanismen für das sekretorische
Protein Outer membrane protein A (OmpA) sowie das polytope Innenmembranprotein
Mannitpermease (MtlA) identifiziert (Koch et al., 1999; Beck et al., 2000): Das
Membrantargeting und die Translokation von OmpA werden durch Trigger factor, SecB
sowie SecA vermittelt, während das Membrantargeting und die Integration von MtlA durch
das Signal recognition particle (SRP) sowie seinen Rezeptor FtsY vermittelt werden
(Abb. 2.1). Das auf diesen Arbeiten beruhende Konzept zweier individueller
Transportmechanismen für sekretorische Proteine bzw. Innenmembranproteine wird jedoch
durch Arbeiten in Frage gestellt, denen zufolge sowohl SRP als auch SecA an der Integration
bestimmter Innenmembranproteine beteiligt sind (Einzelheiten siehe 6.8). Daher sollte in
dieser Arbeit geklärt werden, ob für die Integration bestimmter Innenmembranproteine
sowohl SRP als auch SecA benötigt werden und welche unterschiedlichen Funktionen SRP
und SecA dabei übernehmen. Als Modellprotein wurde ein Hybridprotein aus der ersten
Signal-Anker-Sequenz von MtlA sowie dem signalsequenzlosen OmpA gewählt. Da die
Signal-Anker-Sequenz von MtlA die Erkennungssequenz für SRP darstellt, war auch eine
Erkennung des Hybridproteins Momp2 duch SRP zu erwarten. So konnte geprüft werden, ob
SRP alleine zur Integration von Momp2 führt oder ob hierzu zusätzlich SecA benötigt wird.
Der OmpA-Anteil von Momp2 bildet eine periplasmatische Domäne, die über die von MtlA
stammende Signal-Anker-Sequenz in der Membran verankert ist (Abb. 5.1C). Damit gleicht
Momp2 in seiner Membrantopologie einer Reihe authentischer Innenmembranproteine, wie
zum Beispiel dem FtsQ, einem an der Zellteilung beteiligten Protein (Abb. 6.2A).
Naszierende Ketten von FtsQ konnten sowohl mit SRP als auch mit SecA quervernetzt
werden, woraus geschlossen wurde, daß beide Faktoren am Targeting und der Integration von
FtsQ beteiligt sind (Valent et al., 1998). Momp2 ist im Vergleich zu FtsQ als Modellprotein
besonders geeignet: Sein Targeting und Transport kann direkt mit den ausschließlich
SecA/SecB- bzw. SRP-abhängigen Kontrollproteinen OmpA und MtlA verglichen werden.
6.2 Die Signal-Anker-Sequenz reicht für die Erkennung durch SRP aus
In
früheren
Arbeiten
wurden
die
Signal-Anker-Sequenzen
verschiedener
Innenmembranproteine als Erkennungssequenz für SRP identifiziert: (1) Die Quervernetzung
von SRP an naszierende Ketten von FtsQ mit dem Quervernetzer DSS konnte durch das
Einfügen zusätzlicher Lysine in die Signal-Anker-Sequenz von FtsQ deutlich gesteigert
werden (Valent et al., 1997). Die Aminogruppe von Lysin ist der bevorzugte Reaktionspartner
für DSS. (2) Ffh konnte „ortsspezifisch“ mit der Signal-Anker-Sequenz in naszierenden
57
6 Diskussion
Ketten von MtlA quervernetzt werden (Beck et al., 2000). Hierfür wurde Tmd-Phe in die
Signal-Anker-Sequenz von MtlA eingebaut; Tmd-Phe ist ein Aminosäureanalogon, das durch
UV-Bestrahlung als Quervernetzungsreagenz aktiviert werden kann. (3) Das SRPunabhängige Phagen-Mantel-Protein M13 procoat protein wurde SRP-abhängig, wenn die
Hydrophobizität seiner ersten transmembranen Domäne artifiziell erhöht wurde (de Gier et
al., 1998).
Im Einklang mit der Beobachtung, daß SRP seine Substrate anhand ihrer Signal-AnkerSequenzen erkennt, konnten naszierende Ketten von MtlA, nicht jedoch naszierende Ketten
des sekretorischen Proteins pOmpA mit Ffh quervernetzt werden (Beck et al., 2000; Abb. 5.5,
Spuren 6/8 und 14/16). Bisher war jedoch nicht bekannt, ob neben der hydrophoben SignalAnker-Sequenz noch weitere Eigenschaften der Innenmembranproteine für die Erkennung
durch SRP nötig sind.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß naszierende Ketten von Momp2 im Gegensatz zu denen
von pOmpA mit Ffh quervernetzt werden können (Abb. 5.5, Spuren 22 und 24): Erst die
Fusion von OmpA mit der Signal-Anker-Sequenz von MtlA ermöglicht also die Erkennung
durch SRP. Damit konnte erstmals gezeigt werden, daß eine lange und hydrophobe SignalAnker-Sequenz für die Erkennung eines Innenmembranproteins durch SRP ausreicht; andere
für Innenmembranproteine spezifische Eigenschaften sind hierfür offenbar nicht nötig.
Inzwischen wurde dieses Ergebnis durch die Arbeit einer anderen Arbeitsgruppe bestätigt:
Neben OmpA wurde auch das sekretorische Protein Maltose binding protein (MBP) von SRP
erkannt, nachdem seine Signalsequenz durch die erste Signal-Anker-Sequenz des polytopen
Innenmembranproteins Acriflavine resistance protein B (AcrB) ersetzt wurde (Lee und
Bernstein, 2001).
6.3 Trigger factor erkennt den reifen Anteil sekretorischer Proteine
Naszierende Ketten von Momp2 konnten nicht nur mit Ffh, sondern auch mit Trigger factor
quervernetzt werden (Abb. 5.5, Spuren 18 und 19). Da Trigger factor an pOmpA, nicht aber
an MtlA-Sequenzen bindet (Beck et al., 2000; Abb. 5.5, Spuren 10 und 11), erkennt Trigger
factor Momp2 offenbar am reifen Proteinanteil von OmpA. Daß die Signalsequenz für die
Erkennung sekretorischer Proteine durch Trigger factor keine Rolle spielt, steht mit früheren
Beobachtungen in Einklang: (1) Trigger factor besitzt keine Substratspezifität für
sekretorische Proteine, sondern bindet auch an naszierende Ketten zytosolischer Proteine
(Valent et al., 1995 und 1997; Hesterkamp et al., 1996). (2) Trigger factor bindet auch dann
an sekretorische Proteine, wenn deren Signalsequenz stark modifiziert wurde. So konnten in
der Signalsequenz der Alkalischen Phosphatase (PhoA) 10 Aminosäuren durch Leucin (stark
hydrophob) oder Alanin (wenig hydrophob) ersetzt werden, ohne daß die
Quervernetzungseffizienz mit Trigger factor beeinflußt wurde (Valent et al., 1997). (3)
Trigger factor bindet auch dann an naszierende Ketten des Außenmembranporins PhoE, wenn
diese ohne Signalsequenz synthetisiert wurden (Valent et al., 1997). (4) Vor kurzem wurden
6 Diskussion
58
mit Hilfe einer Peptidbibliothek Bereiche im reifen OmpA, nicht jedoch in seiner
Signalsequenz, als Erkennungssequenzen für Trigger factor identifiziert (Schaffitzel, 2001).
6.4 SRP und Trigger factor konkurrieren um naszierende Ketten
Sowohl SRP als auch Trigger factor binden an ribosomenassoziierte naszierende Ketten. Sie
unterscheiden sich jedoch hinsichtlich ihrer Substratspezifität: So wird das sekretorische
Protein pOmpA nur von Trigger factor, nicht jedoch von SRP gebunden (Beck et al., 2000;
Abb. 5.5, Spuren 6-8). Das Innenmembranprotein MtlA wird hingegen von SRP, nicht jedoch
von Trigger factor gebunden (Beck et al., 2000; Abb 5.5, Spuren 14-16). Auch eine andere
Arbeitsgruppe untersuchte die Substratspezifität von SRP und Trigger factor (Valent et al.,
1995, 1997): In einer ersten Arbeit (Valent et al., 1995) wurden ribosomenassoziierte
naszierende Ketten in Weizenkeimlysat synthetisiert, aufgereinigt und dann in E.coli-Lysat
mit interagierenden Proteinen quervernetzt. Dabei wurden in Einklang mit den oben
beschriebenen Ergebnissen verschiedene sekretorische Proteine, nicht jedoch die
Innenmembranproteinen FtsQ und Signalpeptidase (Lep) mit Trigger factor quervernetzt. Im
Widerspruch zu oben beschriebenen Ergebnissen wurden jedoch nicht nur
Innenmembranproteine, sondern auch sekretorische Proteine mit SRP quervernetzt. Dies
könnte auf die Synthese im heterologen Weizenkeimlysat zurückgeführt werden. In einer
späteren Arbeit (Valent et al., 1997) wurde ein homologes E. coli-System verwendet.
Erstaunlicherweise wurden in diesem System nicht nur sekretorische Proteine, sondern auch
FtsQ und Lep mit Trigger factor quervernetzt. Hingegen konnten unter den normalen
Konzentrationen an SRP und Trigger factor nur Innenmembranproteine, nicht jedoch
sekretorische Proteine mit SRP quervernetzt werden. Dies unterstützt die Hypothese, daß die
Quervernetzung zwischen SRP und sekretorischen Proteinen in der früheren Arbeit auf die
Synthese im Weizenkeimlysat zurückgeführt werden kann.
Offenbar konkurrieren SRP und Trigger factor um naszierende Ketten sekretorischer
Proteine: In einem Trigger factor-depletierten System konnte SRP auch an pOmpA binden
(Beck et al., 2000). Unter physiologischen Verhältnissen könnte diese Bindung von SRP an
sekretorische Proteine durch Trigger factor verhindert werden. Außerdem verhindert Trigger
factor, daß SecB und SecA an die naszierende Kette binden, bevor diese vom Ribosom
freigesetzt wurde (Beck et al., 2000). Wahrscheinlich können sekretorische Proteine nur
wesentlich langsamer durch das Translokon transloziert werden, als die Proteintranslation am
Ribosom fortschreitet. Ein kotranslationales Targeting sekretorischer Proteine würde daher
SecYEG-Translokons blockieren. Diese liegen in der Zelle jedoch in relativ geringer Anzahl
vor und könnten somit den limitierenden Faktor beim Proteintransport darstellen. Die Rolle
von Trigger factor könnte daher darin liegen, ein kotranslationales Targeting sekretorischer
Proteine, sei es durch SRP, sei es durch SecB und SecA, zu verhindern. Das
Membrantargeting und die Integration von polytopen Innenmembranproteinen müssen
hingegen kotranslational erfolgen, da diese besonders hydrophob sind und nach ihrer
59
6 Diskussion
vollständigen Synthese im Zytosol schnell aggregieren würden (Ahrem et al., 1989). Auch
von Valent et al. (1995) konnte eine Konkurrenz zwischen SRP und Trigger factor um die
naszierenden Ketten sekretorischer Proteine demonstriert werden; nur nach SRP-Depletion
konnte Trigger factor auch an FtsQ und Lep quervernetzt werden. In der späteren Arbeit
(Valent et al., 1997) wurde dieses Modell allerdings verändert: Zwar konnte in hohen
Konzentrationen zugefügtes SRP auch mit sekretorischen Proteinen quervernetzt werden; die
Quervernetzungseffizienz von Trigger factor wurde dadurch jedoch nicht beeinflußt, was eher
gegen eine Konkurrenz zwischen SRP und Trigger factor spricht.
In dieser Arbeit wurde das Hybridprotein Momp2 auf seine Interaktionen mit SRP und
Trigger factor hin untersucht. Momp2 enthält einerseits mit der Signal-Anker-Sequenz von
MtlA eine Bindestelle für SRP, andererseits mit dem reifen Proteinanteil von OmpA auch
Bindestellen für Trigger factor. Waren in einem Syntheseansatz Ffh und Trigger factor
anwesend, dann konnten beide Proteine mit naszierenden Ketten von Momp2 quervernetzt
werden (Abb. 5.5, Spur 22-24). Dieses Ergebnis kann jedoch auf zwei unterschiedliche
Weisen interpretiert werden: (1) Ffh und Trigger factor können gleichzeitig an dieselbe
naszierende Kette binden, ohne sich dabei gegenseitig zu behindern. (2) Ffh und Trigger
factor konkurrieren beim Binden an die naszierende Kette; dies könnte sogar so weit führen,
daß entweder nur Ffh oder nur Trigger factor an eine einzelne Momp2-Kette binden kann.
Durch die Zugabe von SRP nahm die Quervernetzungseffizienz mit Trigger factor deutlich ab
(Abb. 5.5, vergleiche Spuren 19 und 23). Dies scheint auf eine Konkurrenz der beiden
Proteine hinzuweisen.
6.5 Die Signal-Anker-Sequenz ermöglicht ein kotranslationales, SRPabhängiges Targeting von Momp2
Das Targeting von naszierenden Ketten an das Endoplasmatische Retikulum von Säugerzellen
erfolgt kotranslational. Dabei sorgen die SRP-Untereinheiten SRP9 und SRP14 für eine
Arretierung der Translation, bis der nötige Kontakt zwischen Ribosom und Translokon
hergestellt ist. In Bakterien wurde bisher weder eine Arretierung der Translation selbst
nachgewiesen, noch konnte eine SRP-Untereinheit identifiziert werden, die hierfür
verantwortlich sein könnte. Daher erscheint es fraglich, ob ein kotranslationales Targeting in
Bakterein überhaupt möglich ist. Eine Lösung dieses Problems könnte darin liegen, daß die
Synthese von Innenmembranproteinen in Bakterienzellen in unmittelbarer Nachbarschaft der
Innenmembran stattfindet (Lynch und Wang, 1993; Ma et al., 1994) und ein kotranslationales
Targting daher auch ohne Translationsarretierung möglich ist. Es konnte gezeigt werden, daß
naszierende Ketten von MtlA nur solange mit dem SecYEG-Translokon interagieren, wie sie
mit dem Ribosom assoziiert sind (Beck et al., 2000), was für ein kotranslationales Targeting
spricht. Bisher wurde jedoch nicht gezeigt, daß dieses kotranslationale Targeting von SRP
vermittelt wird.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, daß das Targeting von Momp2 an SecY kotranslational
6 Diskussion
60
erfolgen kann. So konnten ribosomenassoziierte naszierende Momp2-Ketten mit SecY
quervernetzt werden (Abb. 5.10, Spuren 8, 12 und 16). Nach der Loslösung der naszierenden
Ketten vom Ribosom durch das Antibiotikum Puromycin konnten diese hingegen nicht mehr
mit SecY quervernetzt werden (Abb. 5.11, Spur 3). Ribosomenassoziierte naszierende
pOmpA-Ketten binden hingegen nicht an Membranvesikel; sie müssen zuvor von den
Ribosomen abgelöst werden (Behrmann et al., 1998). Es ist also die von MtlA stammende
Signal-Anker-Sequenz, die das kotranslationale Targeting von Momp2 an SecY möglich
macht.
Im Anschluß wurde gezeigt, daß dieses kotranslationale Targeting von Momp2 an SecY SRPabhängig ist: Die Quervernetzung der ribosomenassoziierten Momp2-Ketten an SecY von
harnstoffgewaschenen Membranvesikeln konnte nur durch SRP, nicht aber durch SecA/SecB
wiederhergestellt werden (Abb. 5.12). Analog dazu war die Bindung von Momp2 an secY205Membranvesikel durch die gestörte SecA-SecY-Interaktion in diesen Vesikeln nicht betroffen
(Abb. 5.9, vergleiche Spuren 4/5 und 7/8), so daß eine SecA-abhängige Membranassoziation
ausscheidet. Somit konnte erstmals gezeigt werden, daß das SRP-abhängige Targeting von
Innenmembranproteinen kotranslational erfolgt.
Erstaunlicherweise konnten ribosomenassoziierte Momp2-Ketten auch in Abwesenheit von
Targeting- und Transportfaktoren mit geringer Effizienz an SecY quervernetzt werden
(Abb. 5.12, Spur 3). Ein entsprechendes Phänomen war schon zuvor beobachtet worden,
nämlich ein SRP-unabhängiges Targeting an das Endoplasmatische Retikulum von
Säugerzellen. Dieses Targeting war jedoch nicht funktionell (Jungnickel und Rapoport, 1995)
und wurde auf die hohen Konzentrationen an naszierenden Ketten und Translokons im Invitro-System zurückgeführt (Neuhof et al., 1998; Raden und Gilmore, 1998). Wahrscheinlich
ermöglichen auch hier im zellfreien System aus E. coli die hohen Konzentrationen an
ribosomenassoziierten naszierenden Momp2-Ketten und SecYEG-Komplexen deren
unspezifische Interaktion. Außerdem binden Ribosomen nicht nur über naszierende
Polypeptidketten an Translokons: Auch nicht translatierende Ribosomen binden über ihre
ribosomale RNA (rRNA) direkt an Translokons (Prinz et al., 2000).
Wie oben dargelegt, ist das kotranslationale Targeting von Momp2 SRP-abhängig. Trotzdem
ergab ein Protease-Resistenz-Test, daß Momp2 in vitro auch in Abwesenheit von SRP in
Innenmembranvesikel transloziert werden kann (Abb. 5.7, Spuren 7/8). Dies entspricht der
Beobachtung, daß bestimmte Proteine, die unter physiologischen Verhältnissen Substrate von
SRP sind, in Abwesenheit von SRP auch alternative Targetingmechanismen, vermutlich SecB
und SecA, nutzen können: Fusionsproteinen aus der ersten transmembranen Domäne
verschiedener Innenmembranproteine und dem sekretorischen Protein Alkalische Phosphatase
(PhoA) wurden auf ihre Integration hin untersucht. Die Funktion von SRP wurde dabei durch
die Expression eines dominanten, lethalen ftsY-Allels blockiert. Nur ein Teil der
Fusionsproteine wurde dadurch betroffen (Newitt et al., 1999). Möglicherweise ist dabei die
Hydrophobizität der transmembranen Domänen und somit die Anfälligkeit der Proteine zur
61
6 Diskussion
Aggregation im Zytosol ausschlaggebend. Von Lee und Bernstein (2001) wurden
Fusionsproteine zwischen der ersten Signal-Anker-Sequnez des Innenmembranproteins AcrB
und den sekretorischen Proteinen OmpA bzw. Maltose binding protein (MBP) untersucht. Die
Integration dieser beiden Fusionsproteine wurde durch die Depletion von Ffh verhindert.
Diese unterschiedlichen Ergebnisse zeigen, daß bestimmte Proteine in Abwesenheit von SRP
vermutlich SecB und SecA als alternative Targetingmechanismen nutzen können, andere
hingegen auf SRP angewiesen sind. Momp2 scheint zu der ersten Gruppe zu gehören:
Wahrscheinlich wird Momp2 in Abwesenheit von SRP am Ribosom nur von Trigger factor
gebunden; das Targeting erfolgt dann anschließend durch SecA und SecB. Möglicherweise
wird die von MtlA stammende Signal-Anker-Sequenz dabei als alternative Signalsequenz
erkannt. Dieses Targeting erfolgt jedoch auf alle Fälle posttranslational, da das
kotranslationale Targeting an SecY nur duch SRP vermittelt werden kann (Abb. 5.12). SRP
ist ein essentieller Zellbestandteil. Daher erfolgt in vivo die Proteinsynthese immer in
Anwesenheit von SRP; die starke Bindung von SRP an ein naszierendes
Innenmembranprotein, wie hier für Momp2 beobachtet (Abb. 5.5, Spuren 22 und 24), sollte
dann zum kotranslationalen Targeting führen.
6.6 Die Translokation der periplasmatischen Domäne von Momp2
erfordert SecA
Obwohl die Bindung von SRP an Momp2 zum Membrantargeting führt, kann die vollständige
Translokation von Momp2 nicht durch SRP vermittelt werden; für diesen Schritt wird SecA
benötigt. Dies wurde in dieser Arbeit durch zwei Experimente gezeigt: Die Translokation von
Momp2 in harnstoffgewaschene Innenmembranvesikel konnte durch SRP nicht vermittelt
werden; hierfür mußte SecA/SecB zugegeben werden (Abb. 5.7). Zusätzlich war die
Translokation von Momp2 in secY205-Mutantenvesikel, bei denen die Interaktion von SecA
mit SecY gestört ist, stark beeinträchtigt (Abb. 5.8).
SecA ist vermutlich für die Translokation von Momp2 essentiell, da es durch seine ATPabhängigen Insertions-Deinsertions-Zyklen den „Motor“ für die Translokation des von OmpA
stammenden Proteinanteils, also der periplasmatischen Domäne, bildet. In mehreren Arbeiten
wurde gezeigt, daß SecA an die Signalsequenz von sekretorischen Proteinen bindet (Miller et
al., 1998). Hieraus wurde gefolgert, daß SecA seine Substrate an der Signalsequenz erkennt.
Für Momp2 kann dies jedoch nicht der Fall sein, da Momp2 statt der Signalsequenz eines
sekretorischen Proteins die Signal-Anker-Sequenz eines Innenmembranproteins enthält. Daß
SecA dennoch mit Momp2 interagieren kann, läßt sich nur damit erklären, daß SecA auch den
reifen Proteinanteil von OmpA erkennt. Dies steht mit dem von Economou und Wickner
(1994) entwickelten Modell in Einklang, nach dem SecA sekretorische Proteine durch
repetitive Insertions-Deinsertions-Zyklen durch das Translokon fädelt. Beim ersten Zyklus
könnte SecA dabei an die Signalsequenz binden; diese wird jedoch schon früh während der
Translokation durch die Signalpeptidase abgespalten (van der Wolk et al., 1997) und steht bei
6 Diskussion
62
den folgenden Insertions-Deinsertions-Zyklen zur Substratbindung durch SecA nicht mehr zur
Verfügung. Folglich müßte SecA nicht nur an die Signalsequenz sekretorischer Proteine,
sondern auch an diverse Regionen innerhalb des reifen Proteins binden.
In den hier vorgestellten Experimenten wurde zusammen mit SecA auch immer SecB
zugegeben. SecB hat beim Targeting sekretorischer Proteine zwei unterschiedliche Aufgaben:
Zum einen verhindert es als Chaperon die Faltung sekretorischer Polypeptidketten. Zum
anderen ist SecB zusammen mit SecA am Targeting sekretorischer Proteine beteiligt. An der
Translokation selbst ist SecB jedoch nicht beteiligt: SecB dissoziiert vor dem ersten
Insertions-Deinsertions-Zyklus von dem Komplex aus Vorläuferprotein und SecA (Fekkes et
al., 1997). Das Targeting von Momp2 erfolgt kotranslational und wird von SRP vermittelt.
Daher ist es gut vorstellbar, daß SecB für den Transport von Momp2 entbehrlich ist: Die
Targetingfunktion von SecB wird von SRP übernommen und seine Chaperonfunktion wird
beim kotranslationalen Targeting wahrscheinlich nicht benötigt. Ein entsprechendes Ergebnis
wurde für Fusionsproteine der sekretorischen Proteine OmpA bzw. Maltose binding protein
(MBP) erzielt: Die Translokation der beiden Proteine wurde durch die Fusion mit der ersten
Signal-Anker-Sequenz des Innenmembranproteins AcrB SRP-abhängig (siehe oben); sie war
aber nicht mehr SecB-abhängig. Die Abhängigkeit dieser Fusionsproteine von SecA wurde
dabei nicht untersucht (Lee und Bernstein, 2001).
Aus den in dieser Arbeit beschriebenen Experimenten kann nicht geschlossen werden, ob die
Translokation der periplasmatischen Domäne von Momp2 ko- oder posttranslational erfolgt.
Die Bindung von Trigger factor an naszierende Ketten von pOmpA verhindert das
kotranslationale Binden von SecA; erst nach der Freisetzung der Polypeptidkette vom
Ribosom und damit auch von Trigger factor kann SecA binden (Beck et al., 2000). Im Fall
von Momp2 wäre jedoch auch ein kotranslationales Binden von SecA denkbar: Trigger factor
kann vermutlich nicht an eine naszierende Kette binden, an die zuvor schon SRP gebunden
hat (siehe 6.4). Bei der kotranslationalen Translokation ins Endoplasmatische Retikulum von
Säugerzellen bindet das translatierende Ribosom an das Translokon und dichtet dadurch die
Membranpore ab; dieser enge Kontakt bleibt vermutlich während der gesamten Translokation
bestimmter Proteine bestehen (Crowley et al., 1993 und 1994). Auch in Escherichia coli
wurde eine Bindung des Ribosoms an das Translokon nachgewiesen (Prinz et al., 2000). Es
ist vorstellbar, daß das Ribosom bei der kotranslationalen Integration ausschließlich SRPabhängiger Innenmembranproteine auch in Escherichia coli das Translokon abdichtet. Die
Translokation der periplasmatischen Momp2-Domäne erfordert jedoch die Insertion und
Deinsertion von SecA in das Translokon (vergleiche Economou und Wickner, 1994). Der
Ribosom-Translokon-Kontakt müßte also so dynamisch sein, daß er diese großen
Konformationsänderungen von SecA zuläßt. Außerdem konnte Momp2 auch dann transloziert
werden, wenn das kotranslationale, SRP-abhängige Targeting in der Abwesenheit von SecA
stattfand und SecA erst anschließend zugegeben wurde (siehe 5.8). Der Ribosom-TranslokonKontakt müßte also auch so flexibel sein, daß er den Zugang von zwei SecA-Untereinheiten
63
6 Diskussion
(je 102 kD) zum Translokon ermöglicht. In der Tat konnte bei Säugerzellen beobachtet
werden, daß bei der Translokation bestimmter Proteine ein regulierter Zugang vom Zytosol
zum Translokon besteht (Hedge und Lingappa, 1996). Die andere Möglichkeit ist, daß SecA
erst posttranslational an Momp2 bindet und dann die Translokation der periplasmatischen
Domäne katalysiert.
Welche zusätzlichen Komponenten des Translokons neben SecY und SecE für den
Membrantransport von Momp2 notwendig sind, wurde in dieser Arbeit nicht untersucht. Zwei
mögliche Kandidaten sind YidC und SecG: YidC spielt bei der Topogenese von
transmembranen Domänen eine Rolle (Scotti et al., 2000; Houben et al., 2000; Beck et al.,
2001) und könnte an der Integration der Signal-Anker-Sequenz von Momp2 in die
Lipiddoppelschicht beteiligt sein, während SecG bei den Insertions-Deinsertions-Zyklen von
SecA mitwirkt (Nishiyama et al., 1996) und die Translokation der periplasmatischen Domäne
von Momp2 unterstützen könnte.
6.7 Der Membrantransport von Momp2 erfolgt in drei Schritten, bei
denen SRP und SecA unterschiedliche Rollen übernehmen
Die oben beschriebenen Beobachtungen lassen darauf schließen, daß der Membrantransport
von Momp2 in drei Schritten abläuft, bei denen SRP und SecA unterschiedliche Rollen
übernehmen (Abb. 6.1): Sobald die N-terminale Signal-Anker-Sequenz von Momp2 aus dem
Peptidtunnel auf der Oberfläche des Ribosoms auftaucht, wird sie von SRP erkannt und
gebunden (Abb. 6.1A). Anschließend führt die Interaktion zwischen SRP und seinem
Rezeptor FtsY zum kotranslationalen Targeting an das Translokon (Abb. 6.1B). Schließlich
erfolgt die Translokation der periplasmatischen Domäne; nur dieser Vorgang erfordert SecA
(Abb. 6.1C). Es ist bisher nicht geklärt, ob die Translokation der periplasmtischen Domäne
ko- oder posttranslational erfolgt. Mindestens SecY und SecE werden als Komponenten des
Translokons benötigt; wahrscheinlich unterstützt zusätzlich SecG die Insertions-DeinsertionsZyklen von SecA. YidC könnte an der Integration der Signal-Anker-Sequenz in die
Lipidphase beteiligt sein.
6 Diskussion
64
Translokon
Translokon
FtsY
SecA
SRP
N
?
SRP
A
B
C
Abb. 6.1: Der Membrantransport von Momp2 erfolgt in drei Schritten, bei denen SRP und
SecA unterschiedliche Rollen übernehmen
A Sobald die N-terminale Signal-Anker-Sequenz von Momp2 auf der Oberfläche des Ribosoms
auftaucht, wird sie von SRP erkannt und gebunden.
B Die Interaktion zwischen SRP und seinem Rezeptor FtsY führt zum kotranslationalen Targeting
an das Translokon.
C Nur die Translokation der periplasmatischen Domäne von Momp2 erfordert SecA. Ob dies kooder posttranslational erfolgt, ist bisher nicht geklärt (durch das ? am Ribosom symbolisiert).
Wahrscheinlich wirken neben SecY und SecE als Komponenten des Translokons auch SecG bei
der Translokation der periplasmatischen Domäne und YidC bei der Integration der Signal-AnkerSequenz in die Lipidphase mit.
6.8 Der Membrantransport von Innenmembranproteinen mit großen
periplasmatischen Domänen erfordert eine Kooperation zwischen SRP
und SecA
In mehreren Arbeiten wurde gezeigt, daß sowohl SRP als auch SecA am Membrantransport
bestimmter Proteine in Escherichia coli beteiligt sind. Dabei handelte es sich um
Innenmembranproteine, die wie Momp2 über ausgedehnte periplasmatische Domänen
verfügen: FtsQ, ein an der Zellteilung beteiligtes Protein, hat N-terminal einen 25
Aminosäuren langen zytosolischen Abschnitt, eine 25 Aminosäuren lange transmembrane
Domäne sowie eine 225 Aminosäuren große periplasmatische Domäne (Abb. 6.2A). Damit ist
FtsQ strukturell Momp2 sehr ähnlich. Die Integration von FtsQ ist SRP-abhängig: Sie wird
durch Mutationen im Gen ffs, welches die 4,5S RNA von SRP kodiert, gestört (Tian et al.,
2000). Außerdem können naszierende Ketten von FtsQ mit Ffh und SecA quervernetzt
werden (Valent et al., 1998). Die Signalpeptidase I (Lep) ist ein Innenmembranprotein mit
zwei transmembranen Domänen. Am C-Terminus folgt eine 247 Aminosäuren lange
periplasmatische Domäne (Abb. 6.2B). Die Integration von Lep ist SecA- (Wolfe et al., 1985)
und SRP-abhängig (de Gier et al., 1996), jedoch nicht SecB-abhängig (de Gier et al., 1998).
Dementsprechend konnten naszierende Ketten von Lep mit SecA und Ffh quervernetzt
6 Diskussion
65
werden (Valent et al., 1998). Maltosepermease (MalF) durchspannt die Innenmembran mit
acht transmembranen Domänen; zwischen der dritten und vierten transmembranen Domäne
liegt eine 183 Aminosäuren lange periplasmatische Domäne (Abb. 6.2C). Die Integration von
MalF konnte durch Natriumazid verhindert werden, einem Inhibitor von SecA (Traxler und
Murphy, 1996). In einem genetischen Ansatz konnte gezeigt werden, daß sowohl Mutationen
in secA als auch in ffs, welches die 4,5S RNA von SRP kodiert, die Integration von MalF
stören (Tian et al., 2000). Das Acriflavine resistance protein B (AcrB) hat zwölf
transmembrane Domänen; auf die erste sowie die siebte transmembrane Domäne folgen
periplasmatische Domänen von 311 bzw. 315 Aminosäuren Länge (Abb. 6.2D). Die
Integration von AcrB wurde sowohl durch eine SecA-Depletion (Qui und Bernstein, 1999) als
auch durch eine Mutation in ffs behindert (Tian et al., 2000).
311
247
315
183
225
Periplasma
3
33
6
31
13
6
13
Innenmembran
Zytosol
FtsQ
275 As
Lep
514 As
MalF
514 As
AcrB
1049 As
A
B
C
D
Abb. 6.2: FtsQ, Lep, MalF und AcrB sind Innenmembranproteine mit großen
periplasmatischen Domänen.
Dargestellt ist die Membrantopologie nach Swissprot-Analyse. Die Zahlen bezeichnen die Länge
der periplasmatischen Domänen in Aminosäuren. Große periplasmatische Domänen sind rot
gezeichnet.
As = Aminosäuren
Bisher war umstritten, welche Rolle SecA beim Transport dieser Proteine spielt. So wurde
vorgeschlagen, daß die Quervernetzung von SecA mit naszierenden Ketten von FtsQ und Lep
nicht auf einer spezifischen Interaktion, sondern auf der Nähe am gemeinsamen Bindepartner
SecY beruhen könnte (Manting und Driessen, 2000). Andere Arbeiten schienen eher dafür zu
sprechen, daß SecA als obligater Bestandteil des Translokons sowohl für die Integration
transmembraner Domänen als auch die Translokation periplasmatischer Domänen essentiell
ist (Qi und Bernstein, 1999). Ein drittes Modell ging davon aus, daß SecA die Translokation
der großen periplasmatischen Domänen katalysiert (Scotti et al., 1999; Dalbey et al., 2000,
Müller et al., 2000). Dieses Modell basierte auf der Beobachtung, daß das Targeting und die
Integration kurzer naszierender Ketten von FtsQ kotranslational stattfindet und nicht von
SecA, sondern nur von SRP abhängig ist (Scotti et al., 1999). Mit diesem Modell stimmen
6 Diskussion
66
auch Ergebnisse von Untersuchungen zu Lep überein: Die Membrantopologie von Lep wurde
durch eine Verschiebung der Ladungsverteilung invertiert; dadurch wurde die große Cterminale periplasmatische Domäne ins Zytosol verlegt. Dieses Konstrukt, Lep-inv, war zwar
noch SRP-abhängig (de Gier et al., 1996), jedoch nicht mehr SecA-abhängig (von Heijne,
1989).
In dieser Arbeit konnten anhand des Modellproteins Momp2 die unterschiedlichen
Funktionen von SRP und SecA beim Transport eines Proteins mit einer transmembranen
Domäne und einer großen periplasmatischen Domäne eindeutig geklärt werden. Dabei
übernimmt SRP das Targeting an das SecYEG-Translokon, während SecA in einem späteren
Stadium für die Translokation der großen periplasmatischen Domäne benötigt wird. Die oben
zusammengestellten Ergebnisse zu Innenmembranproteinen mit großen periplasmatischen
Domänen lassen darauf schließen, daß das hier für Momp2 entwickelte Modell auf diese
Gruppe von Innenmembranproteinen mit großen periplasmatischen Domänen übertragen
werden kann. Da Innenmembranproteine mit kleinen periplasmatischen Abschnitten SecAunabhängig, solche mit großen periplasmatischen Domänen jedoch SecA-abhängig in die
Membran integrieren, ist es vorstellbar, daß ab einer bestimmten kritischen Größe dieser
periplasmatischen Bereiche SecA für die Translokation benötigt wird. So wurde schon früher
vermutet, daß für die Translokation von periplasmatische Domänen bis zu einer Länge von
60-70 Aminosäuren SecA entbehrlich ist (von Heijne, 1989). Während bei einfach
strukturierten Proteinen wie Momp2, FtsQ und Lep sowohl eine ko- als auch eine
posttranslationale Translokation der periplasmatischen Domänen denkbar ist, sind die
Verhältnisse bei komplexer strukturierten Proteinen wie MalF und AcrB komplizierter: Bei
diesen folgen auf die periplasmatischen Domänen weitere transmembrane Domänen. Es
erscheint plausibel, daß auch die Integration dieser C-terminalen transmembranen Domänen
kotranslational erfolgen muß, um ihre Aggregation zu verhindern. Auch hier sind zwei
unterschiedliche Mechanismen denkbar: (1) Sowohl die Integration der transmembranen
Domänen als auch die Translokation der periplasmatischen Domänen erfolgt kotranslational.
Integration und Translokation könnten dann in der Reihenfolge der Synthese aufeinander
folgen (Integration–Translokation–Integration). (2) Die periplasmatischen Domänen
verbleiben so lange im Zytosol, bis alle transmembranen Domänen kotranslational integriert
sind und die Polypeptidkette vom Ribosom freigesetzt ist; erst dann transloziert SecA die
periplasmatischen Domänen. In beiden Fällen müßte der Ribosomen-Translokon-Kontakt ein
hohes Maß an Flexibilität besitzen.
67
6 Diskussion
6.9 Unterschiedliche Mechanismen bei der Integration von
Innenmembranproteinen
Aus den Ergebnissen dieser Arbeit sowie den oben dargestellten Beobachtungen zu anderen
Innenmembranproteinen ergibt sich ein Modell, demzufolge die Integration von
Innenmembranproteinen in Escherichia coli durch drei unterschiedliche Mechanismen
erfolgen kann (Tabelle 6.1): (1) Die Integration des M13 procoat protein benötigt neben YidC
offenbar keine weiteren Proteine. (2) Die Integration von Innenmembranproteinen, die nur
über kurze periplasmatische Domänen verfügen, erfordern die löslichen Komponenten SRP
und FtsY sowie ein Translokon aus SecY und SecE. Wahrscheinlich ist YidC an der
Integration der transmembranen Domänen in die Lipidschicht beteiligt. Solche Proteine sind
z.B. MtlA, Lactosepermease (LacY) und SecY. Die größten periplasmatischen Domänen
dieser Proteine sind 22, 18 bzw. 34 Aminosäuren lang. Diese Arbeit bekräftigt frühere
Ergebnisse, denen zufolge SecA für die Integration dieser Innenmembranproteine nicht
benötigt wird (MacFarlane und Müller, 1995; Koch et al., 1999; Beck et al., 2000). SecA wird
nur für den Membrantransport einer dritten Gruppe von Innenmembranproteinen benötigt: (3)
Innenmembranproteine mit großen periplasmatischen Domänen (siehe Abb. 6.2) benötigen
zusätzlich SecA für die Translokation der großen periplasmatischen Domänen. Hieran könnte
auch SecG beteiligt sein.
Integration abhängig von:
Innenmembranprotein:
1
•
YidC
•
M13 procoat protein
2
•
SRP/FtsY
•
Mannitpermease (MtlA)
•
SecYE, evtl. YidC
•
Lactosepermease (LacY)
•
SecY
3
•
SRP/FtsY
•
Maltosepermease (MalF)
•
SecA
•
Acriflavine resistance protein B (AcrB)
•
SecYE, evtl. SecG, YidC
•
Signalpeptidase I (Lep)
•
FtsQ
Tabelle 6.1: Die Integration von Innenmembranproteinen in Escherichia coli kann durch drei
unterschiedliche Mechanismen erfolgen
6 Diskussion
68
6.10 Ausblick
In dieser Arbeit konnte am Beispiel des Hybridproteins Momp2 der grundsätzliche
Integrationsmechanismus für Innenmembranproteine mit langen periplasmatischen Domänen
aufgezeigt werden. Mit Momp2 und den hier vorgestellten Methoden können in Zukunft
weitere Detailfragen zum Proteintransport in Escherichia coli geklärt werden: In dieser Arbeit
wurde gezeigt, daß die Translokation der langen periplasmatischen Domäne von Momp2
SecA/SecB benötigt. Es stellt sich jedoch die Frage, ob SecA für die Translokation ausreicht,
oder ob SecB immer anwesend sein muß. Da nur solche Innenmembranproteine SecA für ihre
Integration benötigen, die über große periplasmatische Domänen verfügen, könnte mit
unterschiedlich langen naszierenden Ketten von Momp2 getestet werden, bis zu welcher
Länge der periplasmtischen Domänen die Proteine auch ohne SecA integriert werden können.
Außerdem bleibt zu überprüfen, ob SecA die Translokation der periplasmatischen Domänen
bereits kotranslational oder aber erst posttranslational vermittelt.
69
7
7 Literatur
Literatur
Ahrem B, Hoffschulte HK, Müller M (1989) In vitro membrane assembly of a polytopic,
transmembrane protein results in an enzymatically active conformation. J Cell Biol
108: 1637-1646
Akimaru J, Matsuyama S, Tokuda H, Mizushima S (1991) Reconstitution of a protein
translocation system containing purified SecY, SecE, and SecA from Escherichia coli. Proc
Natl Acad Sci USA 88: 6545-6549
Akiyama Y, Ito K (1990) SecY protein, a membrane-embedded secretion factor of E. coli, is
cleaved by the ompT protease in vitro. Biochem Biophys Res Commun 167: 711-715
Akiyama Y, Kihara A, Tokuda H, Ito K (1996) FtsH (HflB) is an ATP-dependent protease
selectively acting on SecY and some other membrane proteins. J Biol Chem 271: 3119631201
Batey RT, Rambo RP, Lucast L, Rha B, Doudna JA (2000) Crystal structure of the
ribonucleoprotein core of the signal recognition particle. Science 287: 1232-1239
Beck K (2000) Quervernetzungsstudien früher Translokationsintermediate in Escherichia
coli. Dissertationsschrift an der Fakultät für Biologie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Beck K, Wu LF, Brunner J, Müller M (2000) Discrimination between SRP- and SecA/SecBdependent substrates involves selective recognition of nascent chains by SRP and trigger
factor. EMBO J 19: 134-143
Beck K, Eisner G, Trescher D, Dalbey RE, Brunner J, Müller M (2001) YidC, an assembly
site for polytopic Escherichia coli membrane proteins located in immediate proximity to the
SecYE translocon and lipids. EMBO rep 2: 709-714
Behrmann M, Koch HG, Hengelage T, Wieseler B, Hoffschulte HK, Müller M (1998)
Requirements for the translocation of elongation-arrested, ribosome-associated OmpA across
the plasma membrane of Escherichia coli. J Biol Chem 273: 13898-13904
Berks BC, Sargent F, Palmer T (2000) The Tat protein export pathway. Mol Microbiol 35:
260-274
Bieker KL, Phillips GJ, Silhavy TJ (1990) The sec and prl genes of Escherichia coli. J
Bioenerg Biomembr 22: 291-310
Binet R, Létoffé S, Ghigo JM, Delepelaire P, Wandersman C (1997) Protein secretion by
gram-negative bacterial ABC-transporters - a review. Gene 192: 7-11
Blobel G, Dobberstein B (1975) Transfer of proteins across membranes. I. Presence of
proteolytically processed and unprocessed nascent immunoglobulin light chains on
membrane-bound ribosomes of murine myeloma. II. Reconstitution of functional rough
microsomes from heterologous components. J Cell Biol 67: 835-862
Bost S, Belin D (1997) prl mutations in the Escherichia coli secG gene. J Biol Chem
272: 4087-4093
Bukau B, Deuerling E, Pfund C, Craig EA (2000) Getting newly synthesized proteins into
shape. Cell 101: 119-122
7 Literatur
70
Bullock WO, Fernandez JM, Short JM (1987) BioTechniques 5: 376
Cammak KA, Wade HE (1965) The sedimentation behaviour of ribonuclease-active and
inactive ribosomes from bacteria. J Biochem 96: 671-680
Chou MM, Kendall DA (1990) Polymeric sequences reveal a functional interrelationship
between hydrophobicity and length of signal peptides. J Biol Chem 265: 2873-2880
Chun SY, Randall LL (1994) In vivo studies of the role of SecA during protein export in
Escherichia coli. J Bacteriol 176: 4197-4203
Collier DN, Bankaitis VA, Weiss JB, Bassford PJ Jr. (1988) The antifolding activity of SecB
promotes the export of the E. coli maltose-binding protein. Cell 53: 273-283
Crooke E, Wickner W (1987) Trigger factor: a soluble protein that folds pro-OmpA into a
membrane-assembly-competent form. Proc Natl Acad Sci USA 84: 5216-5220
Crowley KS, Reinhart GD, Johnson AE (1993) The signal sequence moves through a
ribosomal tunnel into a noncytoplasmic aqueous environment at the ER membrane early in
translocation. Cell 73: 1101-1115
Crowley KS, Liao S, Worrell VE, Reinhart GD, Johnson AE (1994) Secretory proteins move
through the endoplasmic reticulum membrane via an aqueous, gated pore. Cell 78: 461-4
471
Dalbey RE, Chen M, Jiang F, Samuelson JC (2000) Understanding the insertion of
transporters and other membrane proteins. Curr Opin Cell Biol 12: 435-442
de Gier JW, Mansournia P, Valent QA, Phillips GJ, Luirink J, von Heijne G (1996) Assembly
of a cytoplasmic membrane protein in Escherichia coli is dependent on the signal recognition
particle. FEBS Lett 399: 307-309
de Gier JW, Scotti PA, Saaf A, Valent QA, Kuhn A, Luirink J, von Heijne G (1998)
Differential use of the signal recognition particle translocase targeting pathway for inner
membrane protein assembly in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 95: 14646-14651
de Vrije GJ, Batenburg AM, Killian JA, de Kruijff B (1990) Lipid involvement in protein
translocation in Escherichia coli. Mol Microbiol 4: 143-150
Derman AI, Puziss JW, Bassford PJ Jr., Beckwith J (1993) A signal sequence is not required
for protein export in prlA mutants of Escherichia coli. EMBO J 12: 879-888
Dilsiz N, Crabbe MJC (1994) A high-yield modification of mutation by overlap extension
using three primers. Anal Biochem 222: 510-511
Doud SK, Chou MM, Kendall DA (1993) Titration of protein transport activity by
incremental changes in signal peptide hydrophobicity. Biochemistry 32: 1251-1256
Driessen AJ (2001) SecB, a molecular chaperone with two faces. Trends Microbiol 9: 193196
Economou A, Wickner W (1994) SecA promotes preprotein translocation by undergoing
ATP-driven cycles of membrane insertion and deinsertion. Cell 78: 835-843
Economou A (1998) Bacterial preprotein translocase: mechanism and conformational
dynamics of a processive enzyme. Mol Microbiol 27: 511-518
71
7 Literatur
Fekkes P, van der Does C, Driessen AJ (1997) The molecular chaperone SecB is released
from the carboxy-terminus of SecA during initiation of precursor protein translocation.
EMBO J 16: 6105-6113
Fekkes P, de Wit JG, van der Wolk JP, Kimsey HH, Kumamoto CA, Driessen AJ (1998)
Preprotein transfer to the Escherichia coli translocase requires the co-operative binding of
SecB and the signal sequence to SecA. Mol Microbiol 29: 1179-1190
Fekkes P, de Wit JG, Boorsma A, Friesen RH, Driessen AJ (1999) Zinc stabilizes the SecB
binding site on SecA. Biochemistry 38: 5111-5116
Flower AM, Doebele RC, Silhavy TJ (1994) PrlA and prlG suppressors reduce the
requirement for signal sequence recognition. J Bacteriol 176: 5607-5614
Freymann DM, Keenan RJ, Stroud RM, Walter P (1997) Structure of the conserved GTPase
domain of the signal recognition particle. Nature 385: 361-364
Guthrie B, Wickner W (1990) Trigger factor depletion or overproduction causes defective cell
division but does not block protein export. J Bacteriol 172: 5555-5562
Haeuptle M-T, Frank R, Dobberstein B (1986) Translation arrest by oligonucleotides
complementary to mRNA coding sequences yields polypeptides of predetermined length.
Nucleic Acids Res 14: 1427-1448
Hanada M, Nishiyama K, Tokuda H (1996) SecG plays a critical role in protein translocation
in the absence of the proton motive force as well as at low temperature. FEBS Lett 381: 25-28
Hanes J, Plückthun A (1997) In vitro selection and evolution of functional proteins by using
ribosome display. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-4942
Hardy SJ, Randall LL (1991) A kinetic partitioning model of selective binding of nonnative
proteins by the bacterial chaperone SecB. Science 251: 439-443
Hartl FU, Lecker S, Schiebel E, Hendrick JP, Wickner W (1990) The binding cascade of
SecB to SecA to SecY/E mediates preprotein targeting to the E. coli plasma membrane. Cell
63: 269-279
Hegde RS, Lingappa VR (1996) Sequence-specific alteration of the ribosome-membrane
junction exposes nascent secretory proteins to the cytosol. Cell 85: 217-228
Helde R, Wiesler B, Wachter E, Neubuser A, Hoffschulte HK, Hengelage T, Schimz KL,
Stuart RA, Müller M (1997) Comparative characterization of SecA from the alpha-subclass
purple bacterium Rhodobacter capsulatus and Escherichia coli reveals differences in
membrane and precursor specificity. J Bacteriol 179: 4003-4012
Hesterkamp T, Hauser S, Lütcke H, Bukau B (1996) Escherichia coli trigger factor is a prolyl
isomerase that associates with nascent polypeptide chains. Proc Natl Acad Sci USA 93: 44374441
Hesterkamp T, Deuerling E, Bukau B (1997) The amino-terminal 118 amino acids of
Escherichia coli trigger factor constitute a domain that is necessary and sufficient for binding
to ribosomes. J Biol Chem 272: 21865-21871
Hirano M, Matsuyama S, Tokuda H (1996) The carboxyl-terminal region is essential for SecA dimerization. Biochem Biophys Res Commun 229: 90-95
7 Literatur
72
Hoffschulte HK, Drees B, Müller M (1994) Identification of a soluble SecA/SecB complex by
means of a subfractionated cell-free export system. J Biol Chem 269: 12833-12839
Houben EN, Scotti PA, Valent QA, Brunner J, de Gier JL, Oudega B, Luirink J (2000)
Nascent Lep inserts into the Escherichia coli inner membrane in the vicinity of YidC, SecY
and SecA. FEBS Lett 476: 229-233
Ito K (1984) Identification of the secY (prlA) gene product involved in protein export in
Escherichia coli. Mol Gen Genet 197: 204-208
Jungnickel B, Rapoport TA (1995) A posttargeting signal sequence recognition event in the
endoplasmic reticulum membrane. Cell 82: 261-270
Kaufmann A, Manting EH, Veenendaal AK, Driessen AJ, van der Does C (1999) Cysteinedirected cross-linking demonstrates that helix 3 of SecE is close to helix 2 of SecY and helix
3 of a neighboring SecE. Biochemistry 38: 9115-9125
Keenan RJ, Freymann DM, Walter P, Stroud RM (1998) Crystal structure of the signal
sequence binding subunit of the signal recognition particle. Cell 94: 181-191
Keenan RJ, Freymann DM, Stroud RM, Walter P (2001) The signal recognition particle.
Annu Rev Biochem 70: 755-775
Keiler KC, Waller PRH, Sauer RT (1996) Role of a peptide tagging system in degradation of
proteins synthesized from damaged messenger RNA. Science 271: 990-993
Kimsey HH, Dagarag MD, Kumamoto CA (1995) Diverse effects of mutation on the activity
of the Escherichia coli export chaperone SecB. J Biol Chem 270: 22831-22835
Kimura E, Akita M, Matsuyama S, Mizushima S (1991) Determination of a region in SecA
that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. J Biol Chem 266: 6600-6606
Knoblauch NT, Rüdiger S, Schönfeld HJ, Driessen AJ, Schneider-Mergener J, Bukau B
(1999) Substrate specificity of the SecB chaperone. J Biol Chem 274: 34219-34225
Koch HG, Hengelage T, Neumann-Haefelin C, MacFarlane J, Hoffschulte HK, Schimz KL,
Mechler B, Müller M (1999) In vitro studies with purified components reveal signal
recognition particle (SRP) and SecA/SecB as constituents of two independent proteintargeting pathways of Escherichia coli. Mol Biol Cell 10: 2163-2173
Koch HG, Müller M (2000) Dissecting the translocase and integrase functions of the
Escherichia coli SecYEG translocon. J Cell Biol 150: 689-694.
Kumamoto CA, Francetic O (1993) Highly selective binding of nascent polypeptides by an
Escherichia coli chaperone protein in vivo. J Bacteriol 175: 2184-2188
Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227: 680-685
Lecker SH, Driessen AJ, Wickner W (1990) ProOmpA contains secondary and tertiary
structure prior to translocation and is shielded from aggregation by association with SecB
protein. EMBO J 9: 2309-2314
73
7 Literatur
Lee C, Li P, Inouye H, Brickman ER, Beckwith J (1989) Genetic studies on the inability of
beta-galactosidase to be translocated across the Escherichia coli cytoplasmic membrane. J
Bacteriol 171: 4609-4616
Lee HC, Bernstein HD (2001) The targeting pathway of Escherichia coli presecretory and
integral membrane proteins is specified by the hydrophobicity of the targeting signal. Proc
Natl Acad Sci USA 98: 3471-3476
Li P, Beckwith J, Inouye, H (1988) Alteration of the amino terminus of the mature sequence
of a periplasmic protein can severely affect protein export in Escherichia coli. Proc Natl Acad
Sci USA 85: 7685-7689
Luirink J, ten Hagen-Jongman CM, van der Weijden CC, Oudega B, High S, Dobberstein B,
Kusters R (1994) An alternative protein targeting pathway in Escherichia coli: studies on the
role of FtsY. EMBO J 13: 2289-2296
Lynch AS, Wang JC (1993) Anchoring of DNA to the bacterial cytoplasmic membrane
through cotranscriptional synthesis of polypeptides encoding membrane proteins or proteins
for export: a mechanism of plasmid hypernegative supercoiling in mutants deficient in DNA
topoisomerase I. J Bacteriol 175: 1645-1655
Ma D, Cook DN, Pon NG, Hearst JE (1994) Efficient anchoring of RNA polymerase in
Escherichia coli during coupled transcription-translation of genes encoding integral inner
membrane polypeptides. J Biol Chem 269: 15362-15370
MacFarlane J, Müller M (1995) The functional integration of a polytopic membrane protein
of Escherichia coli is dependent on the bacterial signal-recognition particle. Eur J Biochem
233: 766-771
Maneewannakul S, Maneewannakul K, Ippen-Ihler K (1994) The pKSM710 vector casette
provides tightly regulated lac and T7lac promotors and stratagies for manipulating N-terminal
protein sequences. Plasmid 31: 300-307
Manting EH, van der Does C, Remigy H, Engel A, Driessen A (2000) SecYEG assembles
into a tetramer to form the active protein translocation channel. EMBO J 19: 852-861
Manting EH, Driessen AJM (2000) Escherichia coli translocase: the unravelling of a
molecular machine. Mol Microbiol 37: 226-238
Matsumoto G, Yoshihisa T, Ito K (1997) SecY and SecA interact to allow SecA insertion and
protein translocation across the Escherichia coli plasma membrane. EMBO J 16: 6384-6393
Miller A, Wang L, Kendall DA (1998) Synthetic signal peptides specifically recognize SecA
and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. J Biol Chem 273: 11409-11412
Miller JD, Bernstein HD, Walter P (1994) Interaction of E. coli Ffh/4.5S ribonucleoprotein
and FtsY mimics that of mammalian signal recognition particle and its receptor. Nature
367: 657-659
Millman JS, Qi HY, Vulcu F, Bernstein HD, Andrews DW (2001) FtsY binds to Escherichia
coli inner membranes via interactions with phosphatidylethanolamine and membrane proteins.
J Biol Chem 276: 25982-25989
7 Literatur
74
Mitchell C, Oliver D (1993) Two distinct ATP-binding domains are needed to promote
protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Mol Microbiol 10: 483-497
Montoya G, Svensson C, Luirink J, Sinning I. Crystal structure of the NG domain from the
signal-recognition particle receptor FtsY. Nature. 1997 Jan 23;385(6614):365-8
Müller M, Blobel G (1984a) In vitro translocation of bacterial proteins across the plasma
membrane of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 81: 7421-7425
Müller M, Blobel G (1984b) Protein export in Escherichia coli requires a soluble activity.
Proc Natl Acad Sci USA 81: 7737-7741
Müller M, Fisher RP, Rienhofer-Schweer A, Hoffschulte HK (1987) DCCD inhibits protein
translocation into plasma membrane vesicles from Escherichia coli at two different steps.
EMBO J 6: 3855-3861
Müller M, Koch HG, Beck K, Schäfer U (2000) Protein traffic in bacteria: multiple routes
from the ribosome to and across the membrane. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 66: 107-157
Neuhof A, Rolls MM, Jungnickel B, Kalies KU, Rapoport TA (1998) Binding of signal
recognition particle gives ribosome/nascent chain complexes a competitive advantage in
endoplasmic reticulum membrane interaction. Mol Biol Cell 9: 103-115
Newitt JA, Bernstein HD (1998) A mutation in the Escherichia coli secY gene that produces
distinct effects on inner membrane protein insertion and protein export. J Biol Chem
273: 12451-12456
Newitt JA, Ulbrandt ND, Bernstein HD (1999) The structure of multiple polypeptide domains
determines the signal recognition particle targeting requirement of Escherichia coli inner
membrane proteins. J Bacteriol 181: 4561-4567
Nishiyama K, Suzuki T, Tokuda H (1996) Inversion of the membrane topology of SecG
coupled with SecA-dependent preprotein translocation. Cell 85: 71-81
Park S, Liu G, Topping TB, Cover WH, Randall LL (1988) Modulation of folding pathways
of exported proteins by the leader sequence. Science 239: 1033-1035
Prinz A, Behrens C, Rapoport TA, Hartmann E, Kalies KU (2000) Evolutionarily conserved
binding of ribosomes to the translocation channel via the large ribosomal RNA. EMBO J
19:1900-1906
Prinz WA, Spiess C, Ehrmann M, Schierle C, Beckwith J (1996) Targeting of signal
sequenceless proteins for export in Escherichia coli with altered protein translocase. EMBO J
15: 5209-5217
Qi HY, Bernstein HD (1999) SecA is required for the insertion of inner membrane proteins
targeted by the Escherichia coli signal recognition particle. J Biol Chem 274: 8993-8997
Raden D, Gilmore R (1998) Signal recognition particle-dependent targeting of ribosomes to
the rough endoplasmic reticulum in the absence and presence of the nascent polypeptideassociated complex. Mol Biol Cell 9: 117-130
75
7 Literatur
Randall LL, Hardy SJ (1986) Correlation of competence for export with lack of tertiary
structure of the mature species: a study in vivo of maltose-binding protein in E. coli. Cell
46: 921-928
Randall LL, Topping TB, Hardy SJ (1990) No specific recognition of leader peptide by SecB,
a chaperone involved in protein export. Science 248: 860-863
Randall LL, Topping TB, Hardy SJ, Pavlov MY, Freistroffer DV, Ehrenberg M (1997)
Binding of SecB to ribosome-bound polypeptides has the same characteristics as binding to
full-length, denatured proteins. Proc Natl Acad Sci USA 94: 802-807
Rapiejko PJ, Gilmore R (1997) Empty site forms of the SRP54 and SRα GTPases mediate
targeting of ribosome-nascent chain complexes to the endoplasmic reticulum. Cell 89: 703713
Samuelson JC, Chen M, Jiang F, Moller I, Wiedmann M, Kuhn A, Phillips GJ, Dalbey RE
(2000) YidC mediates membrane protein insertion in bacteria. Nature 406: 637-641
Sato K, Mori H, Yoshida M, Tagaya M, Mizushima S (1997) Short hydrophobic segments in
the mature domain of ProOmpA determine its stepwise movement during translocation across
the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. J Biol Chem 272: 5880-5886
Schaffitzel E (2001) In vitro Analysen der Interaktion von Chaperonen mit naszierenden
Polypeptidketten. Dissertationsschrift an der Medizinischen Fakultät der Albert-LudwigsUniversität Freiburg
Schatz PJ, Beckwith J (1990) Genetic analysis of protein export in Escherichia coli. Annu
Rev Genet 24: 215-248
Schatz PJ, Bieker KL, Ottemann KM, Silhavy TJ, Beckwith J (1991) One of three
transmembrane stretches is sufficient for the functioning of the SecE protein, a membrane
component of the E. coli secretion machinery. EMBO J 10: 1749-1757
Scholz C, Mucke M, Rape M, Pecht A, Pahl A, Bang H, Schmid FX (1998) Recognition of
protein substrates by the prolyl isomerase trigger factor is independent of proline residues. J
Mol Biol 277: 723-732
Scotti PA, Valent QA, Manting EH, Urbanus ML, Driessen AJ, Oudega B, Luirink J (1999)
SecA is not required for signal recognition particle-mediated targeting and initial membrane
insertion of a nascent inner membrane protein. J Biol Chem 274: 29883-29888
Scotti PA, Urbanus ML, Brunner J, de Gier JW, von Heijne G, van der Does C, Driessen AJ,
Oudega B, Luirink J (2000) YidC, the Escherichia coli homologue of mitochondrial Oxa1p, is
a component of the Sec translocase. EMBO J 19: 542-549
Seluanov A, Bibi E (1997) FtsY, the prokaryotic signal recognition particle receptor
homologue, is essential for biogenesis of membrane proteins. J Biol Chem 272: 2053-2055
Silhavy TJ, Berman ML, Enquist LW (1984) Experiments with gene fusion, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York, pp XI-XII
Smith VF, Hardy SJ, Randall LL (1997) Determination of the binding frame of the chaperone
SecB within the physiological ligand oligopeptide-binding protein. Protein Sci 6: 1746-1755
7 Literatur
76
Snyders S, Ramamurthy V, Oliver D (1997) Identification of a region of interaction between
Escherichia coli SecA and SecY proteins. J Biol Chem 272: 11302-11306
Stoller G, Tradler T, Rucknagel KP, Rahfeld J-U, Fischer G (1996) An 11.8 kDa proteolytic
fragment of the E. coli trigger factor represents the domain carrying the peptidyl-prolyl
cis/trans isomerase activity. FEBS Lett 384: 117-122
Sugiyama JE, Mahmoodian S, Jacobson GR (1991) Membrane topology analysis of
Escherichia coli mannitol permease by using a nested-deletion method to create mtlA-phoA
fusions. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9603-9607
Swidersky UE, Hoffschulte HK, Müller M (1990) Determinants of membrane-targeting and
transmembrane translocation during bacterial protein export. EMBO J 9: 1777-1785
Tian H, Boyd D, Beckwith J (2000) A mutant hunt for defects in membrane protein assembly
yields mutations affecting the bacterial signal recognition particle and Sec machinery. Proc
Natl Acad Sci USA 97: 4730-4735
Traxler B, Murphy C (1996) Insertion of the polytopic membrane protein MalF is dependent
on the bacterial secretion machinery. J Biol Chem 271: 12394-12400
Uchida K, Mori H, Mizushima S (1995) Stepwise movement of preproteins in the process of
translocation across the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. J Biol Chem 270: 3086230868
Valent QA, Kendall DA, High S, Kusters R, Oudega B, Luirink J (1995) Early events in
preprotein recognition in E. coli: interaction of SRP and trigger factor with nascent
polypeptides. EMBO J 14: 5494-5505
Valent QA, Degier JWL, von Heijne G, Kendall DA, Tenhagenjongman CM, Oudega B,
Luirink J (1997) Nascent membrane and presecretory proteins synthesized in Escherichia coli
associate with signal recognition particle and trigger factor. Mol Microbiol 25: 53-64
Valent QA, Scotti PA, High S, de Gier JW, von Heijne G, Lentzen G, Wintermeyer W,
Oudega B, Luirink J (1998) The Escherichia coli SRP and SecB targeting pathways converge
at the translocon. EMBO J 17: 2504-2512
van der Wolk JP, de Wit JG, Driessen AJ (1997) The catalytic cycle of the Escherichia coli
SecA ATPase comprises two distinct preprotein translocation events. EMBO J 16: 7297-7304
Volkert TL, Baleja JD, Kumamoto CA (1999) A highly mobile C-terminal tail of Escherichia
coli protein export chaperone SecB. Biochem Biophys Res Commun 264: 949-954
von Heijne G (1986a) Net N-C charge imbalance may be important for signal sequence
function in bacteria. J Mol Biol 192: 287-290
von Heijne G (1986b) The distribution of positively charged residues in bacterial inner
membrane proteins correlates with the trans-membrane topology. EMBO J 5: 3021-3027
von Heijne G (1989) Control of topology and mode of assembly of a polytopic membrane
protein by positively charged residues. Nature 341: 456-458
von Heijne G (1990) The signal peptide. J Membr Biol 115: 195-201
77
7 Literatur
Walter P, Keenan R, Schmitz U (2000) SRP – where the RNA and membrane worlds meet.
Science 287: 1212-1213
Wolfe PB, Rice M, Wickner W (1985) Effects of two sec genes on protein assembly into the
plasma membrane of Escherichia coli. J Biol Chem 260: 1836-1841
Xu Z, Knafels JD, Yoshine K (2000) Crystal structure of the bacterial protein export
chaperone SecB. Nat Struct Biol 7: 1172-1177
Zelazny A, Seluanov A, Cooper A, Bibi E (1997) The NG domain of the prokaryotic signal
recognition particle receptor, FtsY, is fully functional when fused to an unrelated integral
membrane polypeptide. Proc Natl Acad Sci USA 94: 6025-6029
8 Anhang
8
78
Anhang
8.1 Abkürzungen
A
Amp
Abb.
As
ATP
Bp
BSA
Cm
CP
CPK
CTF
CTP
DMSO
DNA
DSS
DTT
E. coli
EDTA
Ffh
GTP
HEPES
HINV
INV
IP (α)
IPTG
Kan
kD
MGF
mRNA
Momp2
MtlA
NTP
OD
OmpA
PAGE
PCR
PEP
PK
PMSF
pOmpA
psi
RANC
RNA
Rpm
S
SDS
SR
SRP
Absorption
Ampicillin
Abbildung
Aminosäure(n)
Adenosintriphosphat
Basenpaar(e)
Rinderserumalbumin
Chloramphenicol
Kreatinphosphat
Kreatinphosphatkinase
Zytosolische Translationsfaktoren
Cytidintriphosphat
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Dissuccinimidylsuberat
Dithiotreitol
Escherichia coli
Ethylendiamintetraacetat
Fifty-four homolgue
Guanosintriphosphat
N-(2-Hydoxyethyl)piperazin-N‘-(2-Ethan-Sulfonsäure)
harnstoffgewaschene INV
inside-out Innenmembranvesikel
Immunpräzipitation (gegen)
Isopropyl-β-D-thiogalactosid
Kanamycin
Kilodalton
membrangeschütztes Fragment
messenger RNA
Hybridprotein aus der ersten Signal-Anker-Sequenz von MtlA und
dem signalsequenzlosen OmpA
Mannitpermease
Nukleosidtriphosphat
Optische Dichte
Outer membrane protein A
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Polymerasekettenreaktion
Phosphoenolpyruvat
Proteinase K
Phenylmethylsulfonylfluorid
Vorläuferprotein des Outer membrane protein A
pounds per square inch
ribosomenassoziierete naszierende Kette
Ribonukleinsäure
Rotationen pro Minute
Svedberg-Koeffizient
Natriumdodecylsulfat
SRP-Rezeptor
Signal recognition particle
79
TCA
TEMED
Tet
Tmd-Phe
Tris
U
UTP
UV
w/w
Trichloressigsäure
N, N, N‘, N‘-Tetramethylethylendiamin
Tetracylin
L-4‘-(3-[triflouromethyl]-3H-diazirin-3yl)phenylalanin
Trihydroxymethylaminomethan
Unit(s)
Uridin-5‘-Triphosphat
ultraviolett
weight per weight (Gewicht pro Gewicht)
8 Anhang
8 Anhang
80
8.2 Plasmidkarten von pDMB, pOmpA-SpeI, p717MtlA-B, pMtlA-SpeI-2
und Momp2
Abb. 8.1: Plasmidkarte von pDMB bzw. pOmpA-SpeI
Angegeben ist jeweils das erste Nukleotid der Restriktionsenzymschnittstelle. Die in pOmpA-SpeI
eingefügte SpeI-Schnittstelle ist rot eingezeichnet.
Abb. 8.2: Plasmidkarte von p717MtlA-B bzw. pMtlA-SpeI-2
Angegeben ist jeweils das erste Nukleotid der Restriktionsenzymschnittstelle. Die in pMtlA-SpeI-2
eingefügte SpeI-Schnittstelle ist rot eingezeichnet.
81
Abb. 8.3: Plasmidkarte von pMomp2
Angegeben ist jeweils das erste Nukleotid der Restriktionsenzymschnittstelle.
8 Anhang
8 Anhang
82
8.3 Sequenzen von ompA, mtlA und momp2
ompA
in pDMB
EcoRI
TAATACGACTCACTATAGGGCGAATTCTTACATCGCCAAGGGTGCTCGGCATAAGC
T7-Promotor
T7-PromotorCGAAGATATCGGTAGAGTTAATATTGAGCAGATCCCCCGGTGAAGGATTTAACCGT
Primer
GTTATCTCGTTGGAGATATTCATGGCGTATTTTGGATGATAACGAGGCGCAAAAA
Signalsequenz
Signalsequenz
OmpA66 mit
SpeISchnittstelle
BstXI
M
K
K
T
A
I
A
I
A
V
A
L
A
G
F
A
ACTAG T
A
T
S
OmpA168
OmpAβ5
OmpAβ8
OmpA280
Abb. 8.4: Sequenz von ompA in pDMB
Die in pOmpA-SpeI geänderten Nukleotide und Aminosäuren sind rot angegeben.
T
V
A
Q
8 Anhang
83
mtlA
in p717MtlA-B
T7-Promotor TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGCGCGTATTCAGG
T7-PromotorCTGACCCTGCGCGCTGCGCAGGGCTTTATTGATTCCATTTTTACACTGATGAATGTTCCGTTG
Primer
CGCTGCCCGGATTACAGGGGAATTAATTCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTAT
GCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAAT
TAATTCTTACACTTAGTTAAATTGCTAACTTTATAGATTACAAAACTTAGGAGGGTTTTTACC
NcoI
ATGGGGGATCCATAAGAAGGGGTGTTTTT
Membrandomänen
MtlA129 mit
SpeISchnittstelle
G
A
F
I
A
W
G
I
I
T
A
L
F
I
P
T
L
V
G
P
M
I
T
Y
L
L
A
G
I
I
G
M
P
L
A
S
I
F
L
G
G
M
T
G
N
I
A
G
V
C
AC TAGT
G
W
L
P
P
L
L
I
G
Y
T
S
T
G
G
NcoI
MtlA282
I
L
A
I
L
A
F
L
G
I
G
P
I
N
F
M
V
V
H
D
M
L
MtlA189
V
V
E
F
P
T
A
L
T
I
L
G
G
G
L
A
A
A
M
A
V
S
F
V
V
S
A
I
L
8 Anhang
84
Abb. 8.5: Sequenz von mtlA in pDMB
Die in p717MtlA-SpeI-2 geänderten Nukleotide und Aminosäuren sind rot angegeben.
8 Anhang
85
momp2
in pMomp2
T7-Promotor TAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGCGCGTATTCAGG
T7-PromotorCTGACCCTGCGCGCTGCGCAGGGCTTTATTGATTCCATTTTTACACTGATGAATGTTCCGTTG
Primer
CGCTGCCCGGATTACAGGGGAATTAATTCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTTACACTTTAT
GCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGAAT
TAATTCTTACACTTAGTTAAATTGCTAACTTTATAGATTACAAAACTTAGGAGGGTTTTTACC
NcoI
ATGGGGGATCCATAAGAAGGGGTGTTTTT
1. Membrandomäne
SpeI
G
G
W
L
A
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OmpAβ5
OmpAβ8
OmpA280
Abb. 8.6: Sequenz von momp2 in pMomp2
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Danke !
Herrn Prof. Matthias Müller danke ich herzlich für die Aufnahme in seine Arbeitsgruppe, vor
allem für die freundliche Atmosphäre und die ständige Hilfsbereitschaft bei der
experimentellen Arbeit und der Niederschrift dieser Arbeit.
Bei Herrn Privatdozent Dr. Darius Moradpour bedanke ich mich für die freundliche
Übernahme des Zweitgutachtens.
Ganz besonders danke ich Dr. Hans-Georg Koch für die hervorragende Betreuung im Labor.
Sein Einsatz und seine Hilfe bei der Konzeption und Durchführung der Versuche hat ganz
besonders zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen. Vielen Dank für die gute Atmosphäre bei
unserer Zusammenarbeit!
Für die herzliche Aufnahme, die ständige Hilfsbereitschaft und zahlreiche gemeinsame
Unternehmungen danke ich der ganzen Arbeitsgruppe Müller. Mein besonderer Dank gilt Dr.
Ute Schäfer für die Klonierung des Hybridproteins Momp2.
Der F.-F.-Nord-Stiftung danke ich für die Unterstützung meiner Arbeit durch ein
Forschungsstipendium.
Ganz besonders herzlich möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die mir eine
sorgenfreie Ausbildung ermöglichen und mich auch sonst in allem unterstützen.
Dir, liebe Elke, gilt mein herzlichstes Dankeschön. Durch Dein Verständnis und Deine Hilfe
hast Du mir auch für diese Arbeit die nötige Kraft gegeben!
Lebenslauf
Name:
Christoph Neumann-Haefelin
Geburtsdatum:
21.10.1977, Freiburg im Breisgau
Eltern:
Dr. Christiane Neumann-Haefelin, Ärztin, z.Z. nicht berufstätig
Dr. Dieter Neumann-Haefelin, Universitätsprofessor für Virologie
Geschwister:
Tobias, 34 Jahre, Assistenzarzt
Daniel, 27 Jahre, Wirtschaftsingenieur
Schulbildung:
1983-1987
1987-1996
1996
Weiherhof-Grundschule, Freiburg
Friedrich-Gymnasium, Freiburg
Abitur mit Mathematik, Latein, Physik und Geschichte als
Prüfungsfächern
Militär-/Zivildienst entfällt, da meine beiden Brüder bereits entsprechende Dienste geleistet
haben.
Studium:
Seit 10/1996
9/1998
3/2000
8/2000
9/2000
2/2001
3/2001
Medizinstudium, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Physikum
1. Staatsexamen
Famulatur in Chirurgie, Missionsärztliche Klinik Würzburg
Famulatur in Innerer Medizin, Katharinen-Krankenhaus
Frankfurt
Famulatur in Radiologie, Institut für Radiologische
Diagnostik Freiburg
Famulatur in Augenheilkunde, Universitäts-Augenklinik
Freiburg
Dissertation:
Seit 10/1998 Experimentelle Doktorarbeit bei Prof. Dr. med. M. Müller,
Institut
für Biochemie und Molekularbiologie, Universität
Freiburg
Stipendien:
Seit 12/1996 Stipendiat der Studienstiftung des deutschen Volkes
4-12/1999
Forschungsstipendium der F.-F.-Nord-Stiftung
Freiburg, den 20. August 2001