Zur regionalen Prävalenz von Chlamydia trachomatis
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Universität Ulm Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. Steffen Stenger Zur regionalen Prävalenz von Chlamydia trachomatis- Infektioneneine prospektive, PCR- basierte Studie an über 1000 Jugendlichen und jungen Erwachsenen aus Ulm und Umgebung Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm vorgelegt von Yvonne Tausch aus Mediasch, Rumänien 2012 Amtierender Dekan : Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter : Prof. Dr. Andreas Essig 2. Berichterstatter : Prof. Dr. Detlef Michels Tag der Promotion : 25.10.2013 Für meine Eltern Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ........................................................................................................ I Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................. II 1. Einleitung................................................................................................................. 1 1.1 Chlamydien .................................................................................................... 1 1.2 Chlamydia trachomatis ................................................................................... 3 1.3 Diagnostik ...................................................................................................... 5 1.4 Therapie ......................................................................................................... 9 1.5 Prävention ...................................................................................................... 9 1.6 Zielsetzung ................................................................................................... 10 2. Probanden, Material und Methoden ...................................................................... 11 2.1 Probanden .................................................................................................... 11 2.2 Material ........................................................................................................ 12 2.3 Methoden ..................................................................................................... 14 3. Ergebnisse ............................................................................................................ 28 3.1 Bestimmung der analytischen Sensitivität .................................................... 28 3.2 Probanden .................................................................................................... 28 3.3 Evaluation zweier NAV zum Nachweis einer C.trachomatis Infektion .......... 31 3.4 Prävalenz von C.trachomatis in Abhängigkeit von diversen Einflussgrößen 34 3.5 Pooling ......................................................................................................... 43 4.Diskussion .............................................................................................................. 46 5.Zusammenfassung ................................................................................................. 58 6.Literaturverzeichnis ................................................................................................ 60 7. Danksagung .......................................................................................................... 75 8.Lebenslauf .............................................................................................................. 76 I Abkürzungsverzeichnis ºC Grad Celcius AC Amplifikationskontrolle AE elution buffer ATL tissue lysis buffer AW wash buffer bp Basenpaare bzw. beziehungsweise ca. circa C. Chlamydia CA California CC Konjugatkontrolle CT Chlamydia trachomatis DIF direkte Immunfluoreszenz d.h. das heißt EB elementary body EK Elementarkörperchen EIA Enzymimmunoassay evtl. eventuell FDA Food and Drug Administration FITC Fluoreszein Isothyozyanat G-BA gemeinsamer Bundesausschuss IFT Immunfluoreszenztest IFU inclusion forming units Inc. incorporation LPS Lipopolysaccharid MgCl2 Magnesiumchlorid µl Mikroliter µM Mikromolar mL Milliliter mM Millimolar min. Minuten II Mio Millionen MOMP major outer membran protein N Anzahl NAV Nukleinsäureamplifikationsverfahren NG Neisseria gonorrhoeae NJ New Jersey Nr. Nummer nvCT (Swedish) new variant of Chlamydia trachomatis omc outer membrane complex omp outer membrane protein PCR Polymerase-chain-reaction PID pelvic inflammatory disease = Entzündung des kleinen Beckens PN Primer-Nukleotid POCT Point-of-care Test RB reticulate body RK Retikularkörperchen rpm revolutions per minute s Sekunden s. siehe STD sexual transmitted disease Tab. Tabelle U Umdrehungen UNG Uracyl N-Glycosylase v.a. vor allem vs. versus III 1. Einleitung 1.1 Chlamydien Bei der Familie der Chlamydiaceae handelt es sich um gram-negative, obligat intrazelluläre Bakterien, mit einem charakteristischen, biphasischen Entwicklungszyklus. Chlamydien besitzen ein relativ kleines Genom (1,1-1,3 Mio.bp) und einen unvollständigen Stoffwechsel. Ihre Zellwand enthält charakteristischerweise keine Peptidoglykanschicht, obwohl Gene für die Peptidoglykansynthese vorhanden sind. Zu den humanpathogenen Spezies der Familie der Chlamydiaceae gehören Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae ,Chlamydia psittaci und Chlamydia abortus. Dabei sind C.psittaci und C.abortus zoonotische Infektionserreger. Allen Chlamydienspezies gemeinsam ist der obligat intrazelluläre Entwicklungszyklus. Für die intrazelluläre Vermehrung der Chlamydien unter Laborbedingungen eignen sich verschiedene humane Zelllinien, wie McCoy-, Hep2- oder HeLa-Zellen. Der produktive Vermehrungszyklus der Chlamydien nimmt unter optimalen Bedingungen ca. 48-72h in Anspruch. Chlamydien treten in zwei funktionell und morphologisch unterschiedlichen Formen, den Elementarkörperchen (0,2µm) und den Retikularkörperchen (0,8-1µm) auf. Die Elementarkörperchen ermöglichen das Überleben des Erregers außerhalb der Wirtszelle und stellen die infektiöse Form der Chlamydien dar. Chlamydien besitzen einen komplexen biphasischen Vermehrungszyklus, der mit der Anheftung des EK an die Membran der Wirtszelle beginnt, wobei ein cysteinreiches chlamydiales Membranprotein als Adhäsin fungiert (Klos, 2009; Everett et al., 1991). Als Rezeptoren auf der Wirtszelle werden Heparansulfat- ähnliche Liganden diskutiert (Stephens et al., 2001). Die Aufnahme der EK wird möglicherweise über ein Typ3-Sekretionssystem induziert, indem das injizierte chlamydiale Effektorprotein (TARP) zur Rekrutierung von Aktin und Internalisierung der EK in einem Phagosom führt (Fields et al., 2003).Die Fusion der Phagosomen mit Lysosomen wird mit Hilfe eines noch unbekannten Mechanismus verhindert und etwa 1-2h nach der Infektion bilden sich die EKzu stoffwechselaktiven RK um, um ihren Transkriptions- und Syntheseapparat zu starten. Etwa 12h nach der Infektion beginnen die RK sich durch binäre Teilung zu vermehren. Als Folge füllt sich die Phagosomenvakuole nun mit RK, die lichtmikroskopisch als Einschlusskörperchen sichtbar werden. Die RK diffe1 renzieren sich innerhalb der Einschlusskörperchen zu infektiösen EK.Nach etwa 2-3 Tagen rupturieren die Einschlusskörperchen, die Wirtszelle geht zu Grunde und EK werden freigesetzt. Die neue Generation an EK kann wiederum andere Zellen befallen (siehe Abb.1) (Schachter et al., 1988; Moulder et al., 1974). Abb. Nr.1: Entwicklungszyklus der Chlamydien unter idealen Bedingungen (Ward, 2004) Schematische Darstellung des Vermehrungszyklus von Chlamydia trachomatis in einer Epithelzelle. Rot dargestellt sind die Elementarkörperchen(EB), rot-weiß dargestellt sind die Retikularkörperchen(RB) Chlamydien können im weiteren Verlauf andere Zellen infizieren, z.B. Monozyten, mit deren Hilfe sie sich wie ein trojanisches Pferd im Körper ausbreiten können (Klos, 2009). In vitro wurden auch chronisch persistierende, nicht produktive Infektionen beschrieben, die durch morphologisch aberrante Retikularkörperchen mit veränderter Genund Antigenexpression charakterisiert sind. Diese Form kann in-vitro induziert werden durch Behandlung der Wirtszelle mit Antibiotika oder Zytokinen (z.B. INF-γ induzierter Tryptophanmangel) (Beatty et al., 1995).Es wird davon ausgegangen, dass es 2 sich um reaktivierbare Körperchen handelt, d.h., dass sie sich wieder zu infektiösen EKs weiterentwickeln können (Wyrick, 2010). 1.2 Chlamydia trachomatis Chlamydia trachomatis wird mit Hilfe des „major outer membrane protein“ (MOMP) bzw. des entsprechenden kodierendes Genes (ompA) in 18 verschiedene Sero- und Genotypen unterteilt, die mit den Buchstaben A-K, Ba, L1, L2, und L3 benannt sind. Die verschiedenen Sero- bzw. Genotypen führen zu Infektionen, die unterschiedliche klinische Manifestationen verursachen. Die Serotypen A-C sind verantwortlich für das Trachom, eine chronische, follikuläre Entzündung der Augenbindehaut, welche unbehandelt zur Erblindung führen kann und weltweit mit 1,3 Millionen Erblindeten die häufigste vermeidbare Ursache der Erblindung darstellt. In bestimmten Regionen Zentralafrikas und Asien, wo extrem schlechte Hygienestandards herrschen, ist die Krankheit noch endemisch (Bell et al., 1986; Taylor et al., 1981). Die Übertragung der Infektion von Mensch zu Mensch erfolgt als Schmierinfektion, oft auch durch Fliegen. Der Mensch ist das einzige Erregerreservoir und die Zielzellen der Chlamydien sind Konjunktivalepithelzellen. Die resultierende zelluläre Immunantwort, führt zur Freisetzung lysosomaler Enzyme und zum Gewebeumbau. Es resultiert eine für die Erkrankung typische Follikelbildung. Die chronischen Entzündungsprozesse können zu einer Vaskularisierung und Narbenbildung auf der Kornea und letztendlich zur Erblindung führen. Die Serotypen L1-L3 verursachen das Lymphogranuloma venereum, eine invasiv verlaufende Geschlechtskrankheit, von der in Europa insbesondere homosexuelle Männer betroffen sind. In Mitteleuropa wurden in den vergangenen 10 Jahren gehäuft Infektionen mit einem neuen Genotyp L2b beobachtet (Stary et al.,2008). Noch relativ häufig anzutreffen ist die über Sexualkontakte übertragbare Krankheit v.a. in Süd-Ost-Asien und Afrika. Die klinischen Zeichen beruhen auf der chlamydienbedingten Freisetzung von Zytokinen und anderen Entzündungsmediatoren, der Zellschädigung und der induzierten granulomatösen Entzündungsreaktion. Nach einer Inkubationszeit von bis zu 3 Wochen entsteht ein schmerzloser Genitalulkus und danach eine inguinale Lymphadenopathie (Bubonbildung). Bei Ausbleiben einer Therapie chronifiziert die Krankheit. Es kommt zu einem fibrösen Verschluss der 3 Lymphbahnen und einer Elephantitis der betroffenen Körperregion. Bei Analverkehr kann es über die Infektion des Rektums zu einer Kolitis kommen. Die Chlamydia trachomatis Serotypen D-K lösen urogenitale und neonatale Infektionen aus.Infektionen mit diesen Serotypen gehören in Industrieländern zu den am weitesten verbreiteten bakteriellen sexuell übertragbaren Infektionen. In den USA geht man von 2 bis 3 Millionen Neuerkrankungen pro Jahr aus (CDC, 2009). Innerhalb der Bundesrepublik wird mit Hilfe des STD-Sentinels von einer 6%igen Prävalenz ausgegangen (Robert-Koch-Institut, September 2009), allerdings betrifft dies vor allem auch Risikogruppen. Die Infektion ist nicht meldepflichtig, daher sind nur relativ wenige Daten zu Chlamydia trachomatis Infektionen in Deutschland vorhanden. Bei Frauen kommt es in der Regel initial zu einer Infektion der Zervixmukosa. Als klassische Symptome werden Beschwerden wie mukopurolenter Ausfluss, Zervixödem, Ektopie und postkoitale Blutungen beschrieben.Chlamydien werden hierbei in 60% der Infektionen mit symptomatischer Zervizitis und mukopurolentem Ausfluss diagnostiziert (Reddy et al., 1997). Bei Neugeborenen von infizierten Müttern können bei Übertragung während der Geburt in den ersten Lebenswochen Konjunktivitis und/ oder eine Pneumonie auftreten (Belletal., 1994, Hammerschlag et al., 1994). Eine intrauterine Übertragung der Chlamydia trachomatis Infektion ist nicht ausgeschlossen und wurde vereinzelt beschrieben (Mardh et al., 1984). Der von einigen Autoren postulierte Zusammenhang zwischen Frühgeburtlichkeit und einer Chlamydia trachomatis Infektion der Mutter ist umstritten (Gencay et al., 2000; Claman et al., 1995). Bis zu 70% der Infektionen verlaufen jedoch asymptomatisch oder oligosymptomatisch (Stokes 1997; Cunningham 1995) und werden deshalb in der Regel nicht diagnostiziert und folglich auch nicht antibiotisch behandelt. Dies kann zu Folgeerkrankungen des oberen Genitaltraktes führen (Thurman et al., 2008;Hoyme 1994). Bei einer aufsteigenden Infektion des Genitaltrakts mit Entzündungen des kleinen Beckens kann es bei der Frau zu Endometritis, Salpingitis, Pelveoperitonitis und zur akuten Perihepatitis, auch Fritz-Hugh-Curtis-Syndrom, kommen. 4 Als Symptome werden vor allem Blutungsanomalien und chronische Unterbauchschmerzen beobachtet. In der angloamerikanischen Literatur werden Infektionen des kleinen Beckens ausgehend von einer Salpingitis als Pelvic inflammatory disease (PID) zusammengefasst. Hierbei handelt es sich um einen Symptomkomplex aus Pelveoperitonitis, Pyosalpinx, Tuboovarial- oder Douglasabszess, der sich zu einer diffusen Peritonitis weiterentwickelt. Die akute Perihepatitis tritt meistens als Begleitkomplikation auf. Diese kann mit Leberkapselschmerz im rechten Oberbauch, Fieber und Schulterschmerzen einhergehen. Auf Grund der chronischen Entzündungsreaktion und des daraus resultierenden fibrotischen Gewebeumbaus kann es zum Funktionsverlust der Tuben und damit zu Tubarinfertilität oder Extrauteringravidität kommen (Schneede et al., 2003; Paavonen, J. & Eggert- Kruse, 1999; Dieterle et al.,1998; Scholes et al., 1996). Beim Mann verursachtChlamydia trachomatis eine akute oder subakute eitrige Urethritis (Schachter, 1991). In der Mehrheit der Fälle verläuft die Infektion asymptomatisch oder äußert sich in leicht eitrigem Urethralsekret bei nur geringen Beschwerden. Bei aufsteigendem Infekt kommt es zur Epididymitis, die jedoch relativ selten ist (Gonzales et al., 2004). 1.3. Diagnostik Als Untersuchungsmaterialen eignen sich in Abhängigkeit der klinischen Manifestation zellreiche Abstriche der Zervix, der Urethra oder der Konjunktiven. Des Weiteren können auch Urin oder selbstentnommene Vaginalabstriche in Kombination mit hoch sensitiven und spezifischen Testverfahren, so genannten NAV genutzt werden. Grundsätzlich hängt die Ergebnisqualität immer von einer korrekten Probenentnahme und einer adäquaten Lagerung der Probe ab (Newhall et al., 1999; Schachter et al., 1992). Die Sensitivität der Zellkultur wird durch die Viabilität der Elementarkörperchen im Untersuchungsmaterial bestimmt. Die Verwendung eines geeigneten Transportmediums, ein schneller Transport in das untersuchende Labor sowie die Kühlung des Untersuchungsmaterials sind wichtige Faktoren, die die Sensitivität der Zellkultur beeinflussen. 5 Für den Nachweis einer Chlamydia trachomatis Infektion stehen verschiedene Nachweismethoden, die sich hinsichtlich Spezifität und Sensitivität unterscheiden, zur Verfügung. Der kulturelle Nachweis von Chlamydia trachomatis erfolgt durch Inokulation empfindlicher Zellkulturen mit dem Untersuchungsmaterial und fluoreszenzmikroskopischer Darstellung der Einschlusskörper nach 48h Inkubationszeit. Die Chlamydienkultur ist wegen des Aufwands und der eingeschränkten Sensitivität eine in der Routinediagnostik selten eingesetzte Methode. Bei einer Spezifität von 100% wird je nach Zellreihe, Reagenzien und Transportbedingungen für die Sensitivität Werte von 70-85% erzielt (Gaydos C. und Essig A., 2011). Aufgrund des großen Zeit- und hohen Personalaufwandes ist die Chlamydienkultur für wissenschaftliche Fragestellungen Speziallaboratorien vorbehalten. Eine weitere direkte Nachweismethode stellen die Antigen-Teste (EIA; IFT) dar. Beim direkten Immunfluoreszenztest (DIF) werden die Elementarkörperchen und intrazelluläre Einschlusskörperchen unter dem Fluoreszenzmikroskop optisch sichtbar gemacht. Dies geschieht mit Hilfe von monoklonalen mit Fluoreszenzfarbstoff (in der Regel FITC) gekoppelten Antikörpern, die das Major Outer Membran Protein (MOMP) von Chlamydia trachomatis markieren. Die Immunfluoreszenzmikroskopie ist in starkem Maße von der Erfahrung des Untersuchers abhängig. Besonders bei geringer Bakterienkonzentration des Abstrichs, sind Sorgfalt und Erfahrung des Untersuchers erforderlich, um die wenigen Elementarkörperchen zu erkennen, sie gegen Artefakte abzugrenzen und so die Diagnose stellen zu können. Ein Vorteil des Immunfluoreszenztests, im Gegensatz zu anderen Nachweismethoden, ist die Tatsache, dass ein trainierter Untersucher erkennen kann, ob ausreichend zelluläres Untersuchungsmaterial für den Test gewonnen wurde (Scott, 1995). Die subjektive Bewertung des Abstriches durchden Untersucher und die variable Abstrichqualität führt zu großen Differenzen der Methode in Sensitivität und Spezifität von 80-85% bzw. 99% (Gaydos C. und Essig A., 2011). Beim Enzym-Immuno-Assay wird ein Lipopolysaccharid (LPS) der Bakterienmembran als Zielsubstanz verwendet. In mehreren Reaktionsschritten wird das Antigen gebunden, markiert, durch einen enzymbedingten Farbumschlag sichtbar gemacht und photometrisch bestimmt. Geringer personeller Aufwand, leichte Handhabung 6 und Objektivität bei der Testauswertung haben dazu geführt, dass der EIA in der Routine von Klinik und Praxis weit verbreitet war. Von allen Methoden zum Nachweis von Chlamydia trachomatis Infektionen der Zervix weist der EIA bei akzeptabler Spezifität (95%) die geringste Sensitivität (53-76%) auf (Gaydos C. und Essig A., 2011). Der EIA ist für die Urindiagnostik nicht ausreichend sensitiv. EIAs werden heutzutage praktisch nicht mehr durchgeführt. Zudem sind sogenannte Point-of-Care-Teste(POCT) entwickelt worden, die auf dem Prinzip des Festphasen-Immunoassays beruhen, deren Zuverlässigkeit aber deutlich unterhalb des EIA liegen (Fonseca et al., 1995, Dieterle, 1995). Aufgrund des geringen Zeitaufwandes bieten POCT die Möglichkeit eine Einzeitbehandlung des erkrankten Patienten direkt nach Vorliegen des Untersuchungsergebnisses noch in der Praxis des Arztes durchzuführen. Dies kann bei Patienten mit mangelnder Compliance vor allem wichtig sein (Hook et al., 1995). Der serologische Nachweis C. trachomatis spezifischer Antikörper, eignet sich für Fragestellungen und für Infektionen, bei denen kein klinisches Untersuchungsmaterial für den direkten Erregernachweis gewonnen werden kann. Der Antikörpernachweis eignet sich nicht für die Erkennung akuter und asymptomatischer Infektionen. Speziesspezifische Verfahren stehen für den Nachweis aufsteigender und invasiver Infektionen zur Verfügung (Forsbach-Birk, 2010). Die Nukleinsäureamplifikationsverfahren (NAV) sind aktuell die Verfahren der Wahl für die Diagnostik von Chlamydia trachomatis Infektionen und für das Screening von asymptomatischen Patienten. Definierte Sequenzen der Chlamydien-DNA oder -RNA können enzymatisch in einer Reihe von Thermozyklen praktisch unendlich vervielfacht werden. Theoretisch kann auf diese Weise mittels eines einzigen ChlamydienDNA- oder -RNA-Moleküls durch millionenfache Amplifikation der Nachweis einer Infektion geführt werden. In den USA sind derzeit 3 verschiedene Verfahren durch die FDA zugelassen: Der auf einem PCR-Verfahren basierende Roche Amplicor-Test (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz), sowie Verfahren die auf der transkriptionsvermittelten Amplifikation (APTIMA, Gen-Probe, Inc., San Diego, CA) und dem Verfahren der„strand displacement amplification“ (SDA, BD ProbeTec Becton Dickinson and Company, Diagnostic Systems Franklin Lakes, NJ) beruhen. Darüber hinaus gibt es in Deutschlandweitere 7 teilweise CE-zertifizierte Verfahren, die im Vergleich zu den oben genannten Verfahren weniger gut durch systematische, großangelegte Studien evaluiert sind. Anerkannte Zielgene sind ompA, das kryptisches Plasmid von Chlamydia trachomatis und die ribosomale 23s-RNA. Das kryptische Plasmid und die 23s-RNA liegen in mehreren Kopien vor, so dass diese Verfahren gegenüber ompA-basierten Verfahren Vorteile bei der analytischen Sensitivität haben (Reddy et al., 1997; Martin et al., 1995). Die Angabe zur Sensitivität und Spezifität dieser Verfahren basieren auf einer Vielzahl von publizierten Vergleichsstudien und liegen in Abhängigkeit des Untersuchungsmaterials und des gewählten Untersuchungsverfahren in einem Bereich von 89,9-97% und 97,1-100% (Gaydos C. und Essig A., 2011). Die Durchführung von NAV für den Chlamydia trachomatis Nachweis ermöglicht die Untersuchung von nicht-invasiv gewonnenem Untersuchungsmaterial wie Urinproben oder (selbstentnommene) Vaginalabstriche. Damit sind für die Diagnostik unkomplizierter Chlamydia trachomatis Infektionen Spekulumuntersuchungen bei der Frau bzw. schmerzhafte Harnröhrenabstriche beim Mann entbehrlich. Die schnelle Durchführbarkeit innerhalb weniger Stunden und die hohe Zuverlässigkeit trotz Verunreinigungen mit Blut und Zervixsekret stellen weitere Vorteile der NAV dar. Problematisch erweisen sich Kontaminationen mit probenfremdem DNA/ RNA Material sowie zahlreichen Inhibitoren, die zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen können. Des Weiteren sind die höheren Kosten ebenfalls ein negativer Faktor. Veränderungen der Zielgens können zum falsch negativen Nachweis führen. Um C. trachomatis Stämme zu erkennen, die Mutationen für eines dieser Gene enthalten, sollten Methoden genutzt werden die auch noch andere Genabschnitte erfassen. Wie bei der 2006 in Schweden entdeckten Variante (nvCT), die eine 377-bp große Deletion in der Zielfrequenz für das kryptische Plasmid aufweist und somit von den kommerziellen, häufig eingesetzten NAV nicht erfasst werden konnte. Erst durch die Definition neuer Zielsequenzen gelang es auch diese Variante erfolgreich zu detektieren.Eine zuverlässige Diagnostik ist entscheidend für eine gezielte Therapie der Infektion. 8 1.4 Therapie Die Therapiedauer beträgt 7-10 Tage. Tetrazykline (Tetracyclin, Doxycyclin), Chinolone (Levofloxacin), Makrolid- (Erythromycin, Clarithromycin, Roxythromycin) und Azolid-Antibiotika (Azithromycin) gelten als Mittel der Wahl. Makrolide z.B. Erythormycin werden bevorzugt bei Schwangeren oder Kindern eingesetzt. Azithromycin reichert sich intrazellulär an, erreicht hohe Gewebekonzentrationen und besitzt eine Halbwertszeit von ca. 3 Tagen. Bei unkomplizierter Infektion kann die Substanz auch zur Einzeittherapie angewandt werden. Als venerische Erkrankung sollte eine Partnermitbehandlung erfolgen, sofern eine Infektion durch eine adäquate Diagnostik nicht ausgeschlossen wurde. 1.5 Prävention Chlamydia trachomatisist weltweit vor Neisseria gonorrhoeae der am häufigsten durch Geschlechtsverkehr übertragene bakterielle Infektionserreger. Risikofaktoren, die mit einer erhöhten Prävalenz an urogenitalen Chlamydieninfektionen einhergehen, sind Alter unter 25 Jahre, Promiskuität, keine Verwendung von Barrieremethoden zur Kontrazeption, Nullipararität, sozioökonomische Faktoren und Sexualkrankheiten in der Anamnese (Reddy et al., 1997). Da die Mehrzahl der Infektionen asymptomatisch verlaufen und nicht behandelt werden, kann es zum Aufsteigen der Erreger in den oberen Genitaltrakt kommen und als Folge dessen zu Komplikationen wie Adnexitis, Tubarsterilität, Endometritis, Salpingits und PID kommen. Zur Vermeidung dieser schweren Folgeerkrankungen wurde am 01.01.2008 vom Gemeinsamen Bundesausschuss der Ärzte, Krankenkassenund Krankenhäuser (GBA) für Deutschland ein jährliches Screening junger Frauen aufgenitale Chlamydia trachomatis Infektionen beschlossen. Das Screening ist für sexuell aktiveFrauen bis zur Vollendung des 25. Lebensjahres gedacht. Die Untersuchung auf eine Chlamydia trachomatisInfektion soll mittels Nukleinsäureamplifikationsverfahren (NAV) aus Urinproben erfolgen, wobei zur Wahrung des Wirtschaftlichkeitsgebotes der Test in einemPooling-Verfahren durchgeführt werden kann, bei dem Proben von bis zu fünf Patientinnen gemeinsam getestet werden (G-BA, 2008). Beim Pooling werden bis zu fünf Proben zusammengegeben. Nur wenn der Gesamtpool positiv wird, werden die Proben einzeln getestet. Daher ist das Pooling nur in 9 Gebieten mit mittlerer bis niedriger Prävalenz sinnvoll. Einige Studien beschreiben durch das Pooling eine signifikante Senkung der Sensitivität (Currie et al., 2004; Morré et al., 2002) während andere Studien eine vergleichbare Sensitivität (Krepel et al., 1999; Kacena et al., 1998; Peeling et al., 1998) gegenüber Einzeltestungen beschreiben. Die Einführung des Poolingverfahrens war ursprünglich vor allem für Anwender mit limitierten Ressourcen in Entwicklungs- und Schwellenländer Asiens und Afrikas gedacht (Lindau et al., 2005). Wie bei anderen Geschlechtskrankheiten auch kann durch den Gebrauch von Kondomen eine Übertragung effektiv verhindert werden. Zur Vermeidung von Neugeboreneninfektionen erfolgt ein Screening von Schwangeren im ersten Trimenon. 1.6 Zielsetzung Chlamydia trachomatis ist der am häufigsten sexuell übertragene bakterielle Mikroorganismus in den westlichen Industrieländern, wobei die Mehrzahl der Infektionen unerkannt bleiben. Dies kann zu schwerwiegenden Folgeerkrankungen führen. 2008 wurde ein Chlamydia trachomatis Screening vom G-BA für Deutschland beschlossen. Daten hinsichtlich alters-, geschlechts,- symptom- und regionsspezifischer Prävalenz von Chlamydia trachomatis sind allerdings in Deutschland spärlich, da es keine Meldepflicht für den Erreger gibt. Das primäre Ziel dieser Arbeit ist daher die Bestimmung der Prävalenz von Chlamydia trachomatis Infektionen bei über 1000 sexuell aktiven Jugendlichen und jungen Erwachsenen in Ulm und Umgebung, die Ermittlung von Risikofaktoren und die Erfassung der klinischen Symptomatik. Dafür wurden anhand eines Fragebogens Daten zu klinischer Symptomatik und des Sexualverhalten eruiert. Zum anderen soll in dieser Arbeit ein neu eingeführtes NAV-Verfahren hinsichtlich Sensitivität, Spezifität und seiner Eignung für die Routinediagnostik beurteilt werden. Zusätzlich wurde überprüft ob das vom G-BA vorgeschlagene Pooling der Proben praktikabel ist und nicht zum Sensitivitätsverlust führt. 10 2. Probanden, Material und Methoden 2.1 Probanden Für die Durchführung der Untersuchung hat die Ethikkommission der Universität Ulm unter der Antragsnummer 269/08 ein positives Votum abgegeben. Die Probanden wurden mit Hilfe von Postern, Broschüren und Vorträgen über Chlamydia trachomatis Infektionen aufgeklärt. Zur Studienteilnahme war das Vorliegen einer schriftlichen Einverständniserklärung erforderlich. 2.1.1 Probandenerhebung Insgesamt wurden von freiwilligen Probanden 1.082 Urinproben untersucht. Davon wurden 1003 Probanden in die Studie aufgenommen. Es handelte sich um Probanden, für die gemäß G-BA Beschluss ein jährliches C. trachomatis-Screening empfohlen wird, das heißt sexuell aktive junge Frauen zwischen 14 und 25 Jahren, sowie Frauen, die aufgrund ihres Sexualverhaltens ein erhöhtes Risiko für eine STD haben. Zusätzlich untersuchten wir Männer zwischen 14 und 35 Jahren, bzw. auch ältere Männer, sofern sie ein erhöhtes Risiko aufwiesen eine STD zu akquirieren. Die Proben wurden dabei aus verschiedenen Einrichtungen im Raum Ulm / Neu-Ulm rekrutiert: 1. Praxen niedergelassener Ärzte (Gynäkologische Praxis Dr. LadenburgerStrauss, Senden; Allgemeinarztpraxis Dr. Schlaupitz, Neu-Ulm) 2. Schüler und Studenten der Schule für Gesundheitsberufe bzw. der Universität Ulm 3. STD –Sprechstunde der Gesundheitsämter Ulm und Neu-Ulm 4. Arbeitsmedizinische Einrichtung (TÜV) des Universitätsklinikums Ulm 5. Ulmer Bundeswehrkasernen 2.1.2 Einschlusskriterien Sofern eine unterschriebene Einverständniserklärung vorlag, wurden Probanden in die Studie eingeschlossen, wenn anhand des Fragebogens (s. 2.3.6) sexuelle Aktivi- 11 tät angegeben wurde und wenn sie weiblich und zwischen 14 und 25 Jahren alt oder männlich und zwischen 14 und 35 Jahren alt waren. Des Weiteren wurden Personen, die ihre Probe in den STD-Sprechstunden der Gesundheitsämter abgaben, unabhängig vom Lebensalter eingeschlossen. 2.2 Material 2.2.1 Reagenzien COBAS®Amplicor CT PCR (Roche Diagnostics GmbH; Prenzberg) - CT/ NG-Probenaufbereitungskit - CT/ NG-Amplifikationskit - COBAS®Amplicor CT Detektionskit - COBAS®Amplicor Interne Kontrolle Detektionskit - COBAS®Amplicor Detektions-Reagenzienkit - Waschpuffer 2.2.2 Reagenzien GenoQuick®CT (Hain Lifescience GmbH; Nehren) - Genolyse DNA-Isolierungskit - vorbeschichtete Teststreifen zur DNA-Detektion - Röhrchen zur DNA-Detektion - MgCl2-Lösung 25 mM - PN-Mix - Polymerase: HotStarTaq 1,5U/ Ansatz - 10x Polymerasepuffer ( 15mM MgCl2) - Positivkontrolle - UNG 0,1U/ Ansatz - UNG Dilution Buffer - Negativkontrolle (= H2O) 2.2.3 QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen; Hilden) Dieses Kit wurde zur DNA-Isolierung bei Proben mit DNA-Inhibition verwendet. 12 - ATL-Puffer - Proteinase K - AL-Puffer - Ethanol - AW1-Puffer - AW2-Puffer - AE-Puffer 2.2.4 Plastikmaterialien - 2,0 ml Safe-Lock Eppendorf (Eppendorf; Hamburg) - 1,5 ml Safe-Lock Eppendorf (Eppendorf; Hamburg) - 0,2 ml Safe-Lock Eppendorf (Eppendorf; Hamburg) - 15 ml Bluecap (Becton Dickinson; Le Point de Claix, Frankreich) - Filterspitzen (Sarstedt; Nürnbrecht) - Psipetten(= EFT-Pastetten) (Firma Peske; Aindlingen-Arnhofen) 2.2.5 Reinigungsmittel - Natriumhypochlorid (Hedinger; Stuttgart) 2.2.6 Geräte - PCR-Kabinet captair®bio (Erlab; Köln) - Sicherheitswerkbank Herasafe (Heraeus Instruments; Fellbach) - Thermocycler Applied Biosystems 2720 (Hain Lifesience GmbH; Nehren) - PCR-System Cobas® Amplicor® (Diagnostics GmbH; Penzberg) - Thermomixer 95 °C (Eppendorf; Hamburg) - Thermomixer 37 °C (Eppendorf; Hamburg) - Vortex-2 Genie (Scientific Industries; Bohemia, USA) - Zentrifuge (Eppendorf; Hamburg) 13 2.3 Methoden 2.3.1 Vorversuch In Vorversuchen wurde zunächst anhand gespikter Urinproben die analytische Sensitivitätdes Verfahrens bestimmt. D.h. verschiedene Urinproben wurden mit definierten Konzentrationenviabler C. trachomatis-Stämme verschiedener Serogruppen versetzt. DieBestimmung der Konzentration infektiöser Einheiten (inclusion forming units, IFU) erfolgtedurch Inokulation von HeLa 229-Monolayern mit serieller Verdünnung von Chlamydien-Elementarkörperchen-Suspensionen. Anschließend wurde mittels GenoQuick®CT und Cobas®Amplicor® überprüft,ab welcher Konzentration C. trachomatisDNA nachweisbar ist. Folgende Bakterienkonzentrationenwurden eingesetzt: C. trachomatis Serogruppe D: 0,024 IFU/ 500µl Urin; 0,24 IFU/ 500µl Urin; 2,4 IFU/ 500µl Urin C. trachomatis Serogruppe K: 0,068 IFU/ 500µl Urin; 0,68 IFU/ 500µl Urin; 6,8 IFU/ 500µl Urin C. trachomatis Serogruppe L2: 0,01 IFU/ 500µl Urin; 0,1 IFU/ 500µl Urin; 1,0 IFU/ 500µl Urin 2.3.2 Gewinnung des Untersuchungsmaterials In der Regel wurde von jedem Patienten eine Urinprobe untersucht. Bei den Urinproben handelte es sich um Morgen- oder so genannten Erststrahlurin. Die Abgabe erfolgte entweder unmittelbar morgens nach dem Aufstehen oder mindestens zwei Stunden nach der letzten Miktion.Ein regelmäßig organisierter Probentransport garantierte, dass die meisten Proben nach Entnahme innerhalb von 24 Stunden untersucht werden konnten, am Wochenende spätestens nach Stunden. Dreimal wöchentlich wurden die Proben auf dem schnellsten Weg und ohne Unterbrechung der Kühlkette zum Detektionslabor geliefert. Die Proben wurden alliquotiert in eine Probe zur sofortigen Diagnostik, drei Rückstellproben und eine gepoolte Rückstellprobe. Die gepoolte Rückstellprobe diente zur Evaluierung eines Poolingverfahrens. Hierbei handelte es sich um ein Verfahren, bei dem eine definierte Anzahl an Urinproben, hier fünf, zu gleichen Teilen in einem ge- 14 meinsamen Ansatz verarbeitet wurden. Dieses Verfahren wurde entwickelt um Ressourcen einzusparen und somit die Kosteneffektivität des Nachweisverfahrens zu steigern. Probenbehälter: sterile Standardbehälter für Urin Probenmaterial: Erststrahlurin bzw. Morgenurin Probenvolumen: ca. 10-20 ml Probenstabilität: nach Entnahme max. 72h bei 2-8°C Probenlagerung: Urin vor DNA- Isolierung: 2-8°C Urin Rückstellproben (3x1,8ml): -20°C Urin gepoolt Rückstellproben (1x1,8ml): -20°C DNA und Amplifikate: -20°C 2.3.3 Verarbeitung des Untersuchungsmaterials Zur Vermeidung von Kontaminationen wurden die Richtlinien zur PCR-Diagnostik der Deutschen Gesellschaft für Mikrobiologie und Hygiene befolgt. Neben dem Einsatz von Kontrollen, wie z.B. durchgeführte Inhibitions-, Sensitivitäts-, Negativ- und Positivkontrollen, trugen ein durchdachtes Konzept der räumlichen Trennung der einzelnen Untersuchungsschritte, ein spezieller Reinigungsplan sowie eine besondere Kleiderordnung zur Qualitätskontrolle der PCR-Diagnostik bei. Die räumliche Trennung für die verschiedenen Arbeitsschritte beim GenoQuick®CT wurde strikt eingehalten. So gab es den Prä-PCR-Raum für den Ansatz des PCRMastermixes sowie die Verteilung auf die Reaktionsgefäße, den DNA- Isolierungsraum für die Isolierung der bakteriellen DNA und deren Zugabe zum Mastermix und den Post-PCR-Raum für die Durchführung der Hybridisierung und der Detektion. 2.3.3.1 Durchführung DNA-Isolierung und Amplifikation wurden in der Regel am gleichen Tag, am Wochenende spätestens innerhalb von 72 Stunden nach Probenabgabe durchgeführt. 15 2.3.3.2 Vorbereitung Die Thermomixer wurden auf 37°C und 95°C vorgeheizt. Zeitgleich wurden die Urine auf Raumtemperatur gebracht und gründlich mit dem Vortexer gemischt (3-10s). Die Proben wurden in folgende Aliquots aufgeteilt a.) 500µl für GenoQuick®CT in 1,5ml Safe- Lock b.) 500µl für COBAS®Amplicor (500µl Waschpuffer schon vorgelegt) in 1,5ml Safe-Lock c.) 500µl für Pooling in 15ml Bluecap d.) 3 x 1,8ml für Einzelurin-Rückstellproben (-20°C in 2,0ml Safe-Lock) e.) 1x 1,8ml Rückstellprobe Pool (-20°C) in 2,0ml Safe-Lock . 2.3.3.3 DNA- Isolierung Die DNA- Isolierung stellte einen der kritischsten Schritte der Nachweisverfahren dar. Hier musste auf besondere Sorgfaltgeachtet werden. 2.3.3.3.1 Vorbereitung der Proben für die COBAS®Amplicor- PCR Für die Durchführung des COBAS®Amplicor war die DNA nach einem vom Hersteller festgelegten Verfahren zu isolieren. Das CT/NG-Probenaufbereitungskit wurde auf Raumtemperatur gebracht, um evtl. Präzipitate zu lösen, wurden die Urinproben gründlich gemischt. In ein 1,5ml Schraubröhrchen wurde 500µl CT/NG Urinwaschpuffer gegeben. Dazu wurde 500µl Urin gegeben. Der Ansatz wurde gut gevortext, anschließend bei 37°C inkubiert und danach für 5 Minuten bei 1300U/ min zentrifugiert. Nach dem Abzentrifugieren der Urinproben wurde mit Hilfe einer Einmal-Psipette der Überstand abgenommen und mit dem Pellet weitergearbeitet. Die anschließenden Schritte dienten dazu, die Erreger-DNA freizusetzten und diese für die PCR vorzubereiten. Es wurden nun 250µl CT/NG-Lysispuffer in jedes Röhrchen gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 15min wurden 250µl CT/NG-Diluent dazugegeben. Eine weitere Inkubationszeit von 5min bei 95°C folgte. Danach wurde die Probe abzentrifugiert und mit dem Pellet weitergearbeitet. 16 2.3.3.3.2 Vorbereitung der Proben für GenoQuick®CT Für die Durchführung des GenoQuick®CT wurde vom Hersteller zur DNA-Isolierung das Genolyse DNA-Isolierungskit empfohlen. Im Falle einer PCR Inhibition bei Durchführung des GenoQuick®CT wurde ein Säulenextraktionsverfahren zur DNAIsolierung eingesetzt. Das Funktionsprinzip setzte sich aus drei Schritten zusammen. Pelletieren der Zellen und Abnahme der Probenflüssigkeit, Lyse unter alkalischen Bedingungen und erhöhter Temperatur sowie Neutralisierung. Die Proben wurden zuerst 15min bei 1300U/min zentrifugiert, anschließend wurde der Überstand mit einer Psipette abgenommen und mit dem Pellet weitergearbeitet. Danach wurde 100µl Lysispuffer zu den Proben gegeben und das Gemisch gevortext. Nach einer 5 minütigen Inkubationszeit bei 95°C wurde alles kurz anzentrifugiert und 100µl Neutralisationspuffer dazugegeben. Zum Schluss wurden die Proben gevortext und 5min bei 1300U/min zentrifugiert. 2.3.3.3.3 Vorbereitung der Proben für Qiamp®DNA Mini Kit der Firma Quiagen Bei diesem DNA Isolierungsverfahren handelte es sich um ein sogenanntes Säulenisolierungsverfahren. Es wurde bei wiederholter Probeninhibiton der Nachweisverfahren genutzt, um bei der DNA-Isolierung eine Kontamination mit polymeraseninhibierenden Substanzen auszuschließen. Dafür wurden 500µl Urin in ein 1,5ml Safe-Lock pipettiert und dann für 20min bei 20.000x g zentrifugiert. Danach folgten mehrere Waschschritte. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 180µl ATL-Puffer aufgenommen und 20µl Proteinase K wurden zugeben. Nach einer Inkubation von mindestens 3 Stunden bis max. über Nacht bei 56°C wurde die Probe bei ca. 800rpm geschüttelt. Das Pellet sollte nach der Inkubation komplett gelöst sein. Die Proben wurden kurz anzentrifugiert. Dann wurde 200µl AL-Puffer zugegeben und die Proben 15 Sekunden gevortext. Anschließend erfolgte eine Inkubation für 10min bei 70°C auf einem Thermoblock ohne Schütteln. Die Proben wurden danach kurz anzentrifugiert. Nach der Zugabe von 200µl Ethanol (96-100%) und 15 Sekunden Vortexen wurden die Proben auf eine beschriftete QIAamp Säule pipettiert. Nach 1min Zentrifugation bei 6.000x g (8000rpm) wurde der Durchlauf verworfen und die Säule in ein neues 2ml Sammel17 röhrchen gestellt. Danach wurden 500µl AW1-Puffer auf die Säule pipettiert. Nach 1min Zentrifugation bei 6.000x g (8000rpm) wurde der Durchlauf erneut verworfen und die Säule wiederum in ein neues 2ml Sammelröhrchen gestellt. Im nächsten Schritt wurden 500µl AW2-Puffer auf die Säule pipettiert. Nach 3min Zentrifugation bei 20.000x g (14000rpm) wurde der Durchlauf verworfen und die Säule in ein frisches 2ml Sammelröhrchen gestellt. Nach 1min Zentrifugation bei 14000rpm wurde der Durchlauf verworfen und die Säule in ein neues 1,5ml Reaktionsgefäß gestellt. 100µl AE-Puffer wurden auf die Säule pipettiert. Die Probe wurde dann 1min bei Raumtemperatur stehen gelassen und danach 1min bei 6.000 x g (8000rpm) zentrifugiert. Nochmals wurden 100µl AE-Puffer auf die Säule pipettiert und diese 1min bei 6.000 x g (8000rpm) zentrifugiert und somit die DNA aus der Säulenmembran herausgewaschen. Die Säule wurde verworfen, ca. 200µl DNA befanden sich jetzt im 1,5ml Reaktionsgefäß. Die Proben wurden bei 2-8°C bis zum Einsatz in der PCR gelagert werden und wurden anschließend bei -20°C eingefroren. 2.3.3.4 Amplifikation und Detektion 2.3.3.4.1 COBAS®Amplicor Mit Hilfe des COBAS®Amplicor konnte man bis zu 24 Proben auf einmal und vollautomatisch detektieren. Eine Sequenz des kryptischen Plasmids stellte in diesem Test die Zielsequenz dar. Amplifikation und Detektion wurden in 2 Schritten nacheinander durchgeführt. Die Proben wurden in das COBAS®Amplicor Instrument überführt. Um die Validität der Ergebnisse zu prüfen, verfügte dieses Gerät über jeweils eine Positiv- und Negativkontrolle. Zusätzlich wurde jede Probe intern mit einem rekombinant hergestellten Plasmid bestückt, um eine mögliche Inhibition der PCR zu erkennen. Nachdem die PCR mit Biotin-gelabelten Primern durchgeführt wurde, folgte eine letzte Denaturierung der Amplifikate. An magnetische Beads gebundene spezifische Detektionssonden hybridiserten mit den Amplifikaten. Diese Hybride wurden durch einen Magneten im Röhrchen festgehalten, während die anderen Bestandteile der PCR ausgewaschen wurden. Die kolorimetrische Messung im Photometer konnte nur erfolgen, wenn Tetramethylbenzidin in blaue Farbpräzipitate umgesetzt wurde. Diese Substrat wurde 18 freigesetzt, indem Avidin-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat an das Biotin der Amplifikate gebunden hatte. Mit Hilfe einer kolorimetrischen Messung konnte ermittelt werden, ob eine Probe Chlamydia trachomatis DNA enthielt oder nicht. 2.3.3.4.2 GenoQuick®CT 2.3.3.4.2.1 Amplifikation Der erste Schritt bestand aus der Herstellung des Mastermixes. Dieser wurde in einem DNA-freien Raum auf einem Kühlblock zusammengestellt. Zur benötigten Probenmenge wurden zusätzlich immer eine Positivkontrolle, eine Negativkontrolle und ein Leerwert hinzugefügt. Der Mastermix enthält die Polymerase, Primer Nukleotide, MgCl2, und UNG. Das Herstellen der Ansätze erfolgte gemäß einemPipettierschema (siehe Tabelle 1). 19 Tab. Nr. 1: Pipettierschema Mastermix GenoQuick®CT Es wird dargestellt welche Mengen von dem 10x Polymerasepuffer, der MgCl2- Lösung, des PN-Mixes, der HotStar TaqPolymerase des UNG und des UNG Dilution Buffer benötigt werden um eine definierte Anzahl an Proben bearbeiten zu können.(MgCl2= Magnesiumchlorid; µl=Mikroliter; mM=Millimolar; PN=Primer-Nukleotid;UNG= Uracyl N-Glycosylase) Ansätze (n= Prä-Mix Master-Mix (4mM MgCl2) Anzahl) 10x PolymerasePuffer (15mM MgCl2- Primer- Polymerase: Lösung Nukleotid- HotStarTaq UNG 0,1 U/Ansatz UNG Dilution 25 mM Mix 1,5 U/Ansatz µl µl µl µl µl µl 1 5 5 35 0,3 0,1 0,9 2 10 10 70 0,6 0,2 1,8 3 15 15 105 0,9 0,3 2,7 4 20 20 140 1,2 0,4 3,6 5 25 25 175 1,5 0,5 4,5 6 30 30 210 1,8 0,6 5,4 7 35 35 245 2,1 0,7 6,3 8 40 40 280 2,4 0,8 7,2 9 45 45 315 2,7 0,9 8,1 10 50 50 350 3 1,0 9,0 20 100 100 700 6 2,0 18,0 25 125 125 875 7,5 2,5 22,5 50 250 250 1750 15 5,0 45,0 100 500 500 3500 30 10,0 90,0 MgCl2) Buffer Der Mastermix wurde nach ausreichendem Vermischen in 0,2ml Safe-Lock-PCRTubes aliquotiert. Anschließend wurden an einem räumlich getrennten Arbeitsplatz jeweils 5µl der isolierten DNA der Patientenprobe und einmal 5µl der Negativkontrolle zugefügt. An einem dritten Arbeitsplatz wurde in einen Ansatz 5µl der Positivkontrolle zugefügt. 20 Die so pipettierten Probenansätze wurden in den Thermocycler überführt, der wie folgt programmiert war: - 44 PCR-Zyklen, bei denen jeweils eine Denaturierungs-, Annealing- und Elongationsphase durchlaufen wird. - Zyklus 1: Denaturierung bei 95ºC für 15 Minuten - Zyklus 2- 11: Denaturierung bei 95ºC für 30 Sekunden, Annealing bei 58ºC für 120 Sekunden - Zyklus 12- 41: Denaturierung bei 95ºC für 25 Sekunden, Annealing bei 53ºC für 40 Sekunden, Elongation bei 70ºC für 40 Sekunden Nach nochmaliger 2 minütiger Erhitzung auf 95ºC folgte eine Einzelstrangbildung danach wurden diese 5 Minuten auf 20ºC abgekühlt. Anschließend kam es zur Hybridisierung der Einzelstränge mit einer spezifischen Sonde, die im Primer- NukleotidMix enthalten ist und die zur Detektion eine spezifische Gold- Bindungsstelle enthielt. Sollten die fertigen Amplifikate bis zur Detektion länger als 30min gelagert worden sein, wurden die Hybridisierungsschritte des Thermocyclerprogramms wiederholt, da der Hybrid-Komplex nicht lange genug stabil bleibt. 2.3.3.4.2.2 Detektion Beim GenoQuick®CT wurde das kryptische Plasmid und das omcB-Gen auf der chromosomalen DNA amplifiziert und zur Detektion mit Hilfe eines Streifenassays genutzt. Dafür wurden jeweils 100µl Laufpuffer in ein Röhrchen gegeben. Diesem wurden dann jeweils 10µl Amplifikat zugefügt und durch Auf- und Abpipettieren gut durchmischt. Die vorbeschrifteten Teststreifen wurden mit der Goldmatrix nach unten in die zugehörigen Röhrchen gestellt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die amplifizierte Nukleinsäure hybridisierte mit einer im Primer/ Nukleotid-Mix enthaltener spezifischen Sonde, die eine Bindungsstelle für Gold enthielt. Auf dem Teststreifen wurde der Amplifikat-Sonden Komplex mit Gold markiert.Über einen Puffer gelangte der markierte Komplex zu einer spezifischen Bindungsstelle auf dem Teststreifen und lagerte sich dort an.Diese Reaktion führte zu einer sichtbaren Bande auf dem Streifen. Die Auswertung des Streifens erfolgte visuell (siehe Abb.1). Die Konjugatkontrolle (CC-Bande) musste erscheinen, da sie die Effizienz der Konjugatbindung sowie den korrekten Durchlauf zeigt. 21 Die Amplifikationskontrolle (AC-Bande) weist ein internes Kontrollprodukt nach, um mögliche Hemmstoffe der Polymerase oder Fehler bei Ansatz und Durchführung auszuschließen. Sie musste bei negativen Proben reagieren, konnte bei positiven aber auch ausbleiben. Die CT-Bande erschien nur, wenn die genetischen Marker für Chlamydia trachomatis in der Einzelprobe vorhanden waren. Damit eine Probe als positiv gewertet werden konnte, mussten mindestens die CCBande und die CT-Bande auf dem Streifen erscheinen. Abb. Nr. 2: Schematische Darstellung eines Detektionsstreifens für den GenoQuick®CT Anhand der schematischen Darstellung wird die Auswertung mit Hilfe der 3 Banden (CC, AC, CT) dargestellt. Die Goldmatrix ist der Teil des Streifens der mit dem Amplikon in Berührung kommt. Der Amplifikat- Sonden- Komplex wird bei der Goldmatrix mit Gold markiert.Über einen Puffer gelangt der markierte Komplex zu einer spezifischen Bindungsstelle auf dem Teststreifen und lagert sich dort an.Diese Reaktion führt zu einer sichtbaren Bande auf dem Streifen. 22 2.3.4 Interpretation der Ergebnisse Beim GenoQuick®CT war eine Probe als positiv zu bewerten, wenn die CT- spezifische Bande sichtbar war. Aufgrund der unterschiedlichen DNA-Konzentrationen in den Proben, konnte die Signalintensität der verschiedenen Banden voneinander abweichen. Banden, die die gleiche oder eine höhere Signalintensität als die Positivkontrolle aufwiesen, wurden als positiv bezeichnet. Abb. Nr. 3: Darstellung verschiedener Auswertungsstreifen des GenoQuick®CT Verschiedene Bandenstärken werden hier dargestellt, dazu werden als Referenz Positiv- und Negativkontrolle dargestellt. Man kann hier die unterschiedlichen Intensitäten der CT-Banden erkennen. Bei der Positivkontrolle sind alle 3 Banden sichtbar, bei der Negativkontrolle nur die CC- und die AC-Bande. Bei den schwach positiven Proben und den sehr schwach positiven Proben war die CT-Bande nur sehr leicht ausgeprägt. Bei Signalstärken, die geringer als die Positivkontrolle waren (siehe Abbildung Nr.3) wurden die Proben erneut getestet. Die Ergebnisse der Wiederholungsuntersuchung waren dann für die weitere Auswertung maßgebend. Als negativ wurden die Proben bewertet, bei denen nur die CC- und ACKontrollbanden entwickelt waren. 23 Als nicht valide wurden die Proben bezeichnet, bei denen die CC- und/oder ACBande nicht oder nur sehr schwach entwickelt waren. Bei diesen Proben wurde die Testung ebenfalls wiederholt. Als inhibiert wurden die Proben bezeichnet, bei denen die AC-Bande schwach entwickelt war und die CT-Bande gefehlt hatte. Auch bei diesen Proben wurde die Testung wiederholt. War die Probe wiederholt inhibiert wurde diese mit Hilfe einer anderen DNA-Isolierungsmethode (s. 2.3.3.3.3; Qiamp®DNA Mini Kit der Firma Quiagen) erneut getestet. Bei der COBAS®Amplicor-PCR wurden die Proben mit Hilfe einer Geräteigenen Software kolorimetrisch ausgewertet. Sie konnten positiv, negativ oder inhibiert sein. In letzterem Fall wurde die Testung wiederholt. 2.3.5 Berechnung des Goldenen Standards Der Goldene Standard wurde unter Berücksichtigung beider NAV-Verfahren be- stimmt und zur Ermittlung der C. trachomatis Prävalenz der Studienpopulation genutzt. Die Proben wurden als richtig positiv oder richtig negativ bewertet, wenn die Chlamydia trachomatis DNA mit beiden beziehungsweise mit keinem der Nachweisverfahren detektiert wurde. Im Falle von diskrepanten Ergebnissen wurden beide Testverfahren wiederholt. Die Ergebnisse dieses Wiederholungslaufes mussten bei beiden Verfahren gleich sein. Bei weiterhin diskrepanten Ergebnissen wurde die Cobas®Taqman-PCR in einem Referenzlabor für die PCR-Diagnostik (Prof.Dr.U.Reischl, Institut für Mikrobiologie, Universität Regensburg) zur Bestimmung des endgültigen Ergebnisses herangezogen. Die Auswertung für die Pooltestung erfolgte im Vergleich mit dem Goldstandard. 2.3.6 Dokumentation 2.3.6.1 Fragebogen zur Erhebung der Prävalenz Mit Hilfe eines standardisierten Fragebogens wurden Angaben zu Geschlecht, Alter, Sexualverhalten, Symptome, Geschlechtskrankheiten, früheren und aktuellen Partnerschaften erfasst. Die Erhebung erfolgte anonymisiert. Die Zuordnung zum Unter24 suchungsmaterial der Patienten erfolgte durch einen Nummerncode. Das Patientenklientel für die Prävalenzstudie wurde in 2.3.2 beschrieben. 2.3.6.2 Eingabemaske in Exceltabelle Nach Eingang der Urinproben mit Fragebögen, wurden die Angaben auf den Fragebögen in eine, für die Studie erstellte Datenbank übertragen. 1. Fortlaufende Studiennummer 2. Geschlecht des Patienten 3. Probenquelle 4. Geschlecht, Alter des Patienten 5. Anzahl der Sexualpartner 6. Verhütung mit Kondom 7. Homo- oder Bisexualität 8. Geschlechtserkrankungen 9. Alter des ersten Geschlechtsverkehrs 10. Einnahme von hormonellen Kontrazeptiva 11. Partnerschaft und Dauer der Partnerschaft 12. Gründe für den Arztbesuch 13. Beschwerden 14. Andere Gründe für den Arztbesuch 15. Sonstige Beschwerden 16. Sonstige andere Gründe 17. Interne Labornummer 18. Datum der Probenabgabe, Probeneingang, DNA-Isolierung, Durchführung 19. Untersuchungsmaterial 20. Durchführende Person 21. Ergebnis GenoQuick®CT 22. Ergebnis aus Vergleichsmethode (COBAS®Amplicor C. trachomatis Detection Kit, Roche) 23. Wiederholungsergebnis GenoQuick®CT bei Diskrepanz zur Vergleichsmethode 24. Ergebnis der durchgeführten Referenzmethode COBAS®Taqman 25 25. Befundergebnis 26. Ergebnisinterpretation 27. Bemerkungen 28. Freigebender Arzt 29. Poolnummer 30. Endergebnisse 31. Gesamtergebnis 26 Abb. Nr. 4: Screenshot der Eingabemaske In der Abbildung ist zu erkennen wie die Ergebnisse protokolliert wurden, anhand dieser Eingabe war es möglich, die Patienten nach verschiedenen Kriterien einzuordnen. 2.3.7 Statistische Analyse Alle Analysen wurden mit der SPSS Software durchgeführt (SPSS 10.0, Chicago, IL). Alle Signifikanztestungen waren zweiseitig und alpha wurde bei 0,05 plaziert. Die statistische Analyse wurde mit Hilfe des Chi-Quadrat-Tests für kategorische Variablen durchgeführt. Im Fall von gering erwarteten Häufigkeiten und bei Analysen von Abweichungen der stetigen Variablen einschließlich multiplen Vergleichen wurde der Exakte Chi-Quadrat-Test angewandt. 27 3. Ergebnisse 3.1 Bestimmung der analytischen Sensitivität In Vorversuchen wurde zunächst anhand gespikter Urinproben die analytische Sensitivität der beiden eingesetzen PCR- Nachweisverfahren GenoQuick®CT und Cobas®Amplicor® bestimmt. Dafür wurden Stämme von drei unterschiedlichen Serogruppen ausgewählt. In drei unabhängigen Messungen ergab sich für den GenoQuick®CT im Median für die jeweiligen Serogruppen eine mittlere Nachweisgrenze von - 0,48 IFU / ml Urin für C. trachomatis Serogruppe D, - 1,36 IFU / ml Urin für C. trachomatis Serogruppe K, - 0,2 IFU / ml Urin für C. trachomatis Serogruppe L2. Für den Cobas®Amplicor® ergab sich im Median für die jeweiligen Serogruppen eine mittlere Nachweisgrenze von - 0,24 IFU / ml Urin für C. trachomatis Serogruppe D, - 0,68 IFU / ml Urin für C. trachomatis Serogruppe K, - 0,1 IFU / ml Urin für C. trachomatis Serogruppe L2. 3.2 Probanden Im Zeitraum 1. November 2008 bis 31. August 2009 konnten 1082 Probanden rekrutiert werden, wobei 1003 gemäß der Aufnahmekriterien in die Studie eingeschlossen werden konnten. Es wurden Erststrahlurine von 1003 weiblichen und männlichen Probanden auf das Vorhandensein von Chlamydia trachomatis DNA untersucht,wobei 736 (73,4%) Proben von weiblichen und 263 (26,2%) Proben von männlichen Probanden stammten. 4 Probanden machten keine Angaben zum Geschlecht (siehe Abbildung Nr.5). 28 männlich weiblich keine Angabe 0,4% 26,2% 73,4% Abb. Nr. 5: Anteil männlicher und weiblicher Teilnehmer an der Studienpopulation Anzahl (n) aller Studienteilnehmer = 1003; 0,4% (n=4) keine Angabe zum Geschlecht, 26,2% (n=263) männliche, 73,4% (n=736) weibliche Teilnehmer Die Probanden wurden aus 4 großen Bereichen rekrutiert. Probanden der Gruppe 1 kamen aus gynäkologischen Praxen, Allgemeinmedizinpraxen und arbeitsmedizin arbeitsmedizinischen Sprechstunden. In Gruppe 2 wurden Probanden, welche welche die STD STD-Beratung der Gesundheitsämter Ulm und Neu-Ulm Neu Ulm aufsuchten, zusammengefasst. Der Gruppe 3 wurden die Studenten der Universität Ulm und der Fachhochschule Neu Neu-Ulm und der Gruppe 4 wurden die Schüler der Ulmer Gesundheitsschulen zugeordnet. Gruppe 1 Gruppe 2 Gruppe 3 Gruppe 4 10,5% 35,9% 38,7% 15,0% Abb.Nr. 6: Gesamtzahl der Probanden nach Gruppen Die Probanden wurden in 4 Gruppen eingeteilt. Gruppe 1: Probanden aus gynäkologischen und Allgemeinmedizinpraxen, Gruppe 2: Probanden aus den Gesundheitsämtern Ulm und NeuNeu Ulm, Gruppe 3: Studenten, Gruppe 4 4: Schüler 29 Abbildung Nummer 6 zeigt die Verteilung des Probandenklientels. Den größten Anteil machten mit 38,7% (n=388) die Studenten aus. Auch einen sehr großen Teil machten die Patienten der gynäkologischen und Allgemeinmedizinpraxen mit 35,9% (n=360) aus. Die Probanden, die die Gesundheitsämter besuchten, sind mit 15% (n=150) vertreten und die Schüler stellten mit 10,5% (n=105) die kleinste Gruppe dar. Mit Hilfe des Fragebogens konnten 984 Probanden altersbezogen erfasst werden (siehe Abbildung Nummer 7). Die Probanden wurden geschlechtsspezifisch in 3 Altersgruppen unterteilt. Diese bestanden aus Probanden, die 14-19 Jahre (n=174) alt waren, 20-25 Jahre (n=619) alt waren und die über 25 Jahre (n=191) alt waren. Bei beiden Geschlechtern war die Altersklasse der 20-25jährige mit der größten Anzahl an Probanden repräsentiert. Anzahl der Probanden in Zahlenwerten 700 600 500 400 männlich 300 weiblich 200 gesamt 100 0 14-19 Jahre 20-25 Jahre über 25 Jahre keine Altersangabe Alter in Jahren Abb.Nr. 7: Altersverteilung der Probanden in 3 Gruppen nach Gesamtzahl und Geschlecht geordnet Mit Hilfe der Grafik lässt sich erkennen welche Altersklassen in welchem Ausmaß in der Studie repräsentiert sind. Der größte Anteil der Probanden war 20-25 Jahre alt (n=619), der Großteil dieser Probanden war weiblich (n=736). Die Proben wurden von verschiedenen Einsendern zugeschickt und in dem Zeitraum November 2008-August 2009 gesammelt und ausgewertet. 30 3.3 Evaluation zweier NAV zum Nachweis einer Chlamydia trachomatis Infektion In dieser Arbeit werden 2 verschiedene NAV miteinander verglichen. Der COBAS®Amplicor und der GenoQuick®CT. Der COBAS®Amplicor detektiert eine Sequenz des kryptischen Plasmids, der GenoQuick®CT zusätzlich das omp2-Gen. 996 Urine zeigen in beiden Tests übereinstimmende Ergebnisse, davon waren 38 positiv und 958 negativ. 7 Urine zeigen in beiden Tests wiederholt diskrepante Ergebnisse. Diese Proben wurden mit dem Cobas®TaqMan® untersucht und das daraus erhaltene Testergebnis als richtig betrachtet. Damit ergeben sich als Goldstandard richtig positive Proben 43 (4,3%) und richtig negative Proben 960 (95,7%). 3.3.1 Testergebnisse GenoQuick®CT und COBAS®Amplicor im Vergleich zum Goldstandard 3.3.1.1.Bestimmung der Prävalenz mittels COBAS®Amplicor Wie in Tabelle Nr. 2 gezeigt, wurden mittels COBAS®Amplicor von den 1003 bearbeiteten Proben 41 als richtig positiv und 951 als richtig negativ detektiert. 9 Proben wurden als falsch positiv und 2 Proben als falsch negativ detektiert. Tab. Nr. 2: Prävalenz des COBAS®Amplicor im Vergleich zum Goldstandard Anhand der positiven Endergebnisse bezogen auf die Gesamtprobenanzahl, lässt sich die Prävalenz berechnen. Goldstandard Cobas®Amplicor Positiv Negativ Gesamt Positiv 41 9 50 Negativ 2 951 953 Gesamt 43 960 1003 31 3.3.1.2 Bestimmung der Prävalenz mittels GenoQuick®CT Aus der Tabelle Nr. 4 geht hervor, dass von den 1003 bearbeiteten Proben 40 als richtig positiv und 953 als richtig negativ detektiert wurden. 7 Proben wurden falsch positiv und 3 Proben wurden falsch negativ detektiert. Tab.Nr.3: Prävalenz des GenoQuick®CT im Vergleich zum Goldstandard Anhand der positiven Endergebnisse bezogen auf die Gesamtprobenanzahl lässt sich die Prävalenz berechnen. Goldstandard GenoQuick®CT Positiv Negativ Gesamt Positiv 40 7 47 Negativ 3 953 956 Gesamt 43 960 1003 3.3.1.3 Prävalenz in Abhängigkeit des durchgeführten Verfahrens Tab.Nr. 4: Prävalenz in Abhängigkeit des durchgeführten Verfahrens Anhand der positiven Ergebnisse bezogen auf die Gesamtprobenanzahl lässt sich die Prävalenz berechnen Ergebnis N P Gesamt Positive in % Ergebnis Co- 953 50 1003 5,0% 956 47 1003 4,7% 960 43 1003 4,3% bas®Amplicor Ergebnis GenoQuick®CT Goldstandard In Abhängigkeit der verschiedenen Nachweisverfahren ergaben sich unterschiedliche PCR-Prävalenzen für Chlamydia trachomatis. Mittels des Cobas®Amplicor ergab sich eine Prävalenz von 5,0%. Für den GenoQuick®CT ergab sich eine Prävalenz von 4,7%. Gemäß dem in Material und Methoden definierten Goldstandard betrug die Prävalenz 4,3%. 32 3.3.2 Sensitivität und Spezifität des COBAS®Amplicor Die berechnete Sensitivität für den COBAS®Amplicor bezogen auf den Goldstandard betrug 95,4%. Die Spezifität betrug 99,1%. Der positive Vorhersagewert war 82,0%, der negative Vorhersagewert 99,8%. 3.3.3.3 Sensitivität und Spezifität des GenoQuick®CT Die berechnete Sensitivität für den GenoQuick®CT bezogen auf den Goldstandard betrug 93,0%. Die Spezifität betrug 99,3%. Der positive Vorhersagewert war 85,1%, der negative 99,7%. Beide Nachweismethoden zeigten vergleichbare Werte für Sensitivität, Spezifität, positiven und negativen Vorhersagewert (siehe Tabelle Nr.5). Tab. Nr. 5 : Sensitivität, Spezifität, positiver und negativer Vorhersagewert des COBAS®Amplicor und des GenoQuick®CT im Vergleich Anhand der Tabelle lässt sich erkennen, dass kaum statistische Unterschiede hinsichtlich Sensitivität, Spezifität, positivem und negativem Vorhersagewert der beiden Nachweisverfahren vorhanden sind. COBAS®Amplicor GenoQuick®CT Sensitivität (%) 95,4 93,0 Spezifität (%) 99,1 99,3 Positiver Vorhersagewert (%) 82,0 85,1 Negativer Vorhersagewert (%) 99,8 99,7 33 3.4 Prävalenz von Chlamydia trachomatis in Abhängigkeit von diversen Einflussgrößen 3.4.1 Prävalenz von Chlamydia trachomatis in Abhängigkeit von Geschlecht und Alter Insgesamt konnten für die alters- und geschlechtsabhängige Auswertung 984 Proben berücksichtigt werden, die von 723 weiblichen und 261 männlichen Probanden gewonnen wurden. 13 weibliche und 2 männliche Probanden gaben kein Alter an. Das Durchschnittsalter der Studienpopulation war 23,4 Jahre. Bei den 736 getesteten Frauen ergab sich bezogen auf den Goldstandard eine Chlamydia trachomatis Prävalenz von 4,2%, unter den 263 getesteten Männern betrug die Prävalenz 4,6% (p=0,81). Bei den weiblichen Probanden fand sich die höchste Prävalenz vor allem in den jüngeren Altersgruppen. Bei den 14-19jährigen (n= 168) betrug die Chlamydia trachomatis Prävalenz 4,2%, bei den 20-25jährigen (n=460) 5,0%, während bei den Prävalenz der C. trachomatis Infektionen in Prozent über 25jährigen (n=95) nur eine positive Probe (1,1%) detektiert werden konnte. 18,0% 16,0% 14,0% 12,0% 10,0% männlich 8,0% weiblich 6,0% gesamt 4,0% 2,0% 0,0% 14-19 Jahre 20-25 Jahre über 25 Jahre nicht angegeben Alter in Jahren Abb.Nr.8: Darstellung der Prävalenz der Chlamydia trachomatis Infektionen nach Alter und Geschlecht In der Abbildung wird die alters- und geschlechtsspezifische Prävalenz von Chlamydia trachomatis dargestellt. Die Proben wurden von verschiedenen Einsendern zugeschickt und in dem Zeitraum November 2008- August 2009 gesammelt und ausgewertet. 34 Bei den männlichen Probanden fiel eine extrem hohe Prävalenz in der Gruppe der 14-19jährigen auf. Anzumerken ist, dass in dieser Altersklasse nur 6 Probanden rekrutiert werden konnten, von denen einer positiv war. Bei den Männern war die Prävalenz vor allem in der Altersklasse der über 25jährigen (n=96) mit 8,3% relativ hoch (p≤0,05). Bei den 20-25jährigen (n=159) war die Prävalenz mit 1,9% eher niedrig. Damit war die Prävalenz bei den über 25jährigen signifikant höher (p=0,035) im Vergleich mit den jüngeren Altersgruppen. Darüber hinaus war die Prävalenz bei den über 25jährigen Männern auch signifikant höher als bei den Frauen der gleichen Altersgruppe (p=0,036). Die Gesamtprävalenz beider Geschlechter in den drei Altersklassen betrug bei den 14-19jährigen (n=174) 4,6%, bei den 20-25jährigen (n=619) 4,2% und bei den über 25jährigen (n=191) 4,7%. 3.4.2 Prävalenz von Chlamydia trachomatis in Abhängigkeit von der Gruppenzugehörigkeit Wie bereits unter 3.2 erwähnt, wurden die Probanden in Abhängigkeit ihrer Rekrutierung in vier große Gruppen eingeteilt. Gruppe 1 beinhaltete Probanden, die sich in gynäkologischen und Allgemeinmedizinpraxen vorstellen. Gruppe 2 umfasste Probanden, die sich in den Gesundheitsämtern Ulm und Neu-Ulm in den STD-Sprechstunden vorstellten. Gruppe 3 waren die Studenten der Universität Ulm und der Fachhochschule Neu-Ulm und Gruppe 4 die Schüler der Ulmer Gesundheitsschulen. Die Gesamtprävalenz der Studienpopulation betrug 4,3%. Die Prävalenz bei den Probanden der Praxen betrug 4,7%, die bei den Probanden der Gesundheitsämter 3,3%. Die Prävalenz bei den Studenten betrug 3,9% und bei den Schülern 5,7%. 35 C. trachomatis Prävalenz in Prozent 6,0% 5,0% 4,0% 3,0% 2,0% 1,0% 0,0% Praxen Gesundheitsämter Studenten Schüler Gruppe Abb. Nr. 9: C. trachomatis Prävalenz nach Gruppen in Prozent Gruppe 1: Probanden der gynäkologischen und Allgemeinmedizinpraxen (n=345); Gruppe 2: Probanden der Gesundheitsämter Ulm und Neu-Ulm (n=150); Gruppe 3: Studenten (n=388); Gruppe 4: Schüler (n=105).Die Proben wurden von verschiedenen Einsendern zugeschickt und in dem Zeitraum November 2008- August 2009 gesammelt und ausgewertet. 3.4.3 Prävalenz von Chlamydia trachomatis in Abhängigkeit von der Symptomatik Um zu bestimmen, inwiefern die Prävalenz mit typischen klinischen Symptomen der Chlamydia trachomatisInfektion einhergeht, wurden mit Hilfe eines Fragebogens diese Symptome abgefragt. Dabei konnten die Probanden folgende Symptome angeben: Ausfluss, Schmerzen beim Wasserlassen, Juckreiz oder Schmerzen beim Geschlechtsverkehr, interzyklische Menstrualblutung und Unterbauchschmerzen. 20 der 31 infizierten Frauen (64,5%) und alle der 12 infizierten Männer (100%) haben keine derartigen Symptome angegeben. Von den symptomatischen Chlamydia tra- chomatis positiven Frauen wurde Ausfluss von 8 Probandinnen (72,7%) als häufigstes Symptom genannt. Darauf folgten bei jeweils 3 Probandinnen (27,3%) Schmerzen beim Wasserlassen, Bauchschmerzen und unregelmäßigen Menstrualblutungen. Schmerzen beim Geschlechtsverkehr wurden von 2 infizierten Probandinnen angegeben. Juckreiz wurde nicht angegeben. 36 80,0% Angabe der Symptome in Prozent 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% Ausfluss Schmerzen beim Wasserlassen Bauchschmerzen interzyklische Schmerzen beim Menstrualblutungen Geschlechtsverkehr Symptome der weiblichen Probandinnen mit C.trachomatis Infektion Abb. Nr. 10: Häufigkeit typischer Symptome bei C. trachomatis positiven symptomatischen Frauen Von den positiv getesteten Probanden hatten 35,5% Beschwerden. Aus der Grafik ist ersichtlich, dass der Ausfluss(n=8) mit 72,2% das Hauptsymptom darstellt. Schmerzen beim Wasserlassen, Bauchschmerzen und interzyklische Menstrualblutungen werden jeweils von 27,3% (n=3) der positiven Probanden angegeben. Schmerzen beim Geschlechtsverkehr werden von 18,2% (n=2) der positiven Probanden angegeben.Die Proben wurden von verschiedenen Einsendern zugeschickt und in dem Zeitraum November 2008- August 2009 gesammelt und ausgewertet. 3.4.4 Prävalenz von Chlamydia trachomatis in Abhängigkeit des ersten Sexualkontaktes Die Angaben von 961 Probanden waren auswertbar, darunter 709 weibliche und 252 männliche Probanden. Frauen, die früh den ersten Sexualkontakt hatten, wiesen eine höhere Prävalenz auf. So waren weibliche Probanden, die das Alter bei ihrem ersten Geschlechtsverkehrs mit 11-15 Jahren angaben (n=213) mit einer Prävalenz von 7,5% signifikant häufiger Chlamydia trachomatis positiv (p=0,04) als diejenigen, die den ersten Geschlechtsverkehr im Alter von 16-18 Jahren (n=402) hatten, bzw. diejenigen, die beim ersten Sexualkontakt älter als 18 Jahre (n=94) waren, mit der jeweiligen Prävalenz von 3,0% und 1,1%. Bei den männlichen Probanden war von denen, die mit 11-15 Jahren (n=57) zum ersten Mal Geschlechtsverkehr hatten, keiner positiv. Die Probanden, die mit 16-18 Jahren (n=149) zum ersten Mal Geschlechtsverkehr hatten zeigten eine Prävalenz von 6,0% und die,die mit über 18 37 Jahren (n=46) zum ersten Mal Geschlechtsverkehr hatten, zeigten eine Prävalenz von 4,3%. Anteil der C. trachomatis positiv getesteten Probanden in Prozent 8,0% 7,0% 6,0% 5,0% 4,0% männlich 3,0% weiblich 2,0% 1,0% 0,0% 11- 15 Jahre 16- 18 Jahre über 18 Jahre Alter der Probanden beim ersten Geschlechtsverkehr Abb. Nr. 11: Chlamydia trachomatis Prävalenz in Abhängigkeit des Alters beim ersten Geschlechtsverkehr in % Anzahl der Probanden n=961 ; n=252 männliche Probanden und n=709 weibliche Probanden. 57 Probanden waren männlich und zwischen 11-15 Jahre beim ersten Geschlechtsverkehr, 149 männliche Probanden waren zwischen 16 und 18 Jahren und 46 männliche Probanden über 18 Jahre alt. 213 der weiblichen Probanden hatten im Alter von 11-15 Jahren zum ersten Mal Geschlechtsverkehr, 402 Probandinnen waren zwischen 16 und 18 Jahren beim ersten Geschlechtsverkehr und 94 Probandinnen waren über 18 Jahre beim ersten Geschlechtsverkehr. Die Proben wurden von verschiedenen Einsendern zugeschickt und in dem Zeitraum November 2008- August 2009 gesammelt und ausgewertet. 3.4.5 Prävalenz der Chlamydia trachomatis Infektion nach dem Gebrauch von Kontrazeptiva mit Barrierefunktion Insgesamt konnten Proben von 263 männlichen Probanden ausgewertet werden. Bei Männern, die nie Kondome benutzten (n=27), fand sich mit 18,5% (p≤0,05) eine signifikant höhere Prävalenz der Chlamydia trachomatis Infektion als bei Männern, die immer (n=47) (0%) beziehungsweise manchmal (n=182) (3.8 %) ein Kondom benutzten (p=0,001). 38 Anzahl der C. trachomatis positiv und negativ getesteten Probanden in Zahlenwerten 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 immer manchmal negativ nie keine Angabe positiv Abb. Nr. 12: Prävalenz in Abhängigkeit des Gebrauchs von Kondomen Bei den Probanden, die immer ein Kondom benutzten (n=47), wurden keine positiven Proben detektiert, bei den Probanden die manchmal ein Kondom benutzten (n=182), wurden 7 positive Proben detektiert und bei den Probanden die nie ein Kondom benutzten (n=27) wurden 5 positive Proben detektiert. 7 Probanden machten keine Angaben zur Kondomnutzung. Die Proben wurden von verschiedenen Einsendern zugeschickt und in dem Zeitraum November 2008- August 2009 gesammelt und ausgewertet. 3.4.6 Prävalenz der Chlamydia trachomatis Infektion nach der Nutzung von hormonellen Kontrazeptiva Insgesamt konnten wir 736 Proben von weiblichen Probanden auswerten. Die Einnahme hormoneller Kontrazeptiva hatte keinen Einfluss auf die Prävalenz von Chla- mydia trachomatis. So fanden sich bei Frauen, die angaben, hormonelle Kontrazeptiva zu nutzen (n=592), eine Chlamydia trachomatis Prävalenz von 4,2%, mit 25 positiv getesteten Proben, und bei Frauen, die keine hormonellen Kontrazeptiva nutzen (n=119), eine Prävalenz von 5,0% (p=0,628), mit 6 positiv getesteten Proben. 39 Anzahl der Probandinnen in Zahlenwerten 800 700 600 500 400 Negativ 300 Positiv 200 100 0 ja nein keine Angabe gesamt Nutzung von hormonellen Kontrazeptiva Abb. Nr. 13: Darstellung von Chlamydia trachomatis positiv und negativ getesteten Probandinnen abhängig von der Nutzung hormoneller Kontrazeptiva Aus der Grafik wird ersichtlich dass eine Nutzung von hormonellen Kontrazeptiva zu keinem signifikanten Anstieg der Prävalenz führt.Bei den Probandinnen,die hormonell verhüten (n=592) wurden 25 positive Proben detektiert, bei denen die keine hormonellen Kontrazetiva einnehmen (n=119) wurden 6 positive Proben detektiert. Bei den Probandinnen, die keine Angabe zur Nutzung hormoneller Kontrazeptiva machten (n=26) fanden sich keine positiven Proben. Die Proben wurden von verschiedenen Einsendern zugeschickt und in dem Zeitraum November 2008- August 2009 gesammelt und ausgewertet. 3.4.7 Prävalenz von Chlamydia trachomatis in Abhängigkeit der Anzahl der bisherigen Sexualpartner Es konnten Proben von 1003 Probanden ausgewertet werden. Generell ist festzustellen, dass die Prävalenz bei beiden Geschlechtern mit der Anzahl der Sexualpartner zunimmt (Abb.Nr.14). Bei den weiblichen Probandinnen mit bisher einem Sexualpartner (n=200) wurden 3 positive Proben detektiert (1,5%) (p<0,05). Bei den Probandinnen mit 2-4 Sexualpartnern (n=355) wurden 12 positive Proben detektiert (3,4%). Die höchste Chlamydia trachomatis Prävalenz fand sich mit 16 positiven Proben (9%) bei den Probandinnen, die über 4 Sexualpartner hatten (n=177). Insbesondere unterschied sich die Prävalenz signifikant bei weiblichen Probandinnen mit bisher einem Sexualpartner (1,5%) im Vergleich zu den Probandinnen mit mehr als 4 Sexualpartnern (9%) (p=0,002). Bei den männlichen Probanden fand sich die höchste Prävalenz mit 5 positiven Proben (4,9%) bei denen, die 2-4 Geschlechtspartner (n=103) hatten. Bei keinem der 22 getesteten Probanden mit nur einem Sexualpartner konnte eine positive Probe de40 tektiert werden. Bei den Probanden, die mehr als 4 Sexualpartner hatten (n=136) wurden 6 positive Proben detektiert (4,4%). 6 Probanden, 4 weibliche, 2 männliche, machten keine Angaben zur Anzahl der Sexualpartner, davon war 1Proband Chla- Anzahl der C.trachomatis positiv getesteten Probanden in Zahlenwerten mydia trachomatis positiv. 25 20 15 männlich 10 weiblich gesamt 5 0 1 2 bis 4 über 4 Anzahl bisherige Sexualpartner Abb. Nr. 14: C. trachomatis Prävalenz in Abhängigkeit der Anzahl bisheriger Sexualpartner In dem Gesamtprobandklientel gaben n=222 Probanden an bisher einen Sexualpartner gehabt zu haben, davon waren n=200 weibliche und n=22 männliche Probanden. N=458 gaben an 2-4 Sexualpartner gehabt zu haben, davon waren n=355 weibliche und n=103 männliche Probanden. Über 4 Sexualpartner wurden von n=314 Probanden angegeben, davon n=177 weiblich und n=136 männlich. Die Proben wurden von verschiedenen Einsendern zugeschickt und in dem Zeitraum November 2008- August 2009 gesammelt und ausgewertet. Insgesamt wurde bei der Beurteilung der Prävalenz von Chlamydia trachomatis bei beiden Geschlechtern gemeinsam eine Prävalenz von 1,4% bei Probanden mit einem Sexualpartner (n=222), eine Prävalenz von 3,7% bei Probanden mit 2-4 Sexualpartner (n=458) und eine Prävalenz von 7,0% bei Probanden mit mehr als 4 Sexualpartnern (n=313) festgestellt. 3.4.8. Prävalenz von Chlamydia trachomatis in Abhängigkeit der Dauer der aktuellen Beziehung Es konnten 999 Proben ausgewertet werden. 760 Probanden, davon 581 weibliche und 179 männliche, gaben an in einer festen Beziehung zu leben. 234 Probanden, 41 davon 152 weibliche und 82 männliche, gaben an keine Beziehung zu führen und 5 machten keine näheren Angaben. Die Prävalenz war bei Probanden, die nicht in einer dauerhaften Beziehung lebten zwar tendenziell höher (6,0% vs. 3,7%), was aber statistisch nicht zu sichern war (p=0,138). Probanden, die seit relativ kurzer Zeit (<12 Monate) in einer dauerhaften Beziehung lebten, waren signifikant häufiger (p<0,05) Chlamydia trachomatis positiv (5,4%) als Probanden, die länger als ein Jahr bereits in einer Beziehung lebten (2,8%). Geschlechtsspezifisch ließen sich keine signifikan- Anzahl der auf C. trachomatis positiv getesteten Probanden in Prozent ten Unterschiede eruieren. 7,0% 6,0% 5,0% 4,0% männlich 3,0% weiblich 2,0% gesamt 1,0% 0,0% 0-12 Monate über 12 Monate nicht genauer angegeben Dauer der aktuellen Beziehung Abb. Nr. 15: Abbildung zur Darstellung der positiven Probanden in Abhängigkeit der Beziehungsdauer N=239 Probanden gaben an in einer Beziehung seit 0-12 Monaten zu leben, davon n=172 weibliche und n=67 männliche Probanden, n=10 weibliche und n=3 männliche Probanden waren C. trachomatis positiv. Eine Beziehung die bereits länger als 1 Jahr andauert gaben n=499 Probanden an, davon waren n=10 weibliche und n=4 männliche Probanden C. trachomatis positiv. N=22 Probanden gaben keine Dauer der Beziehung an, davon war eine Probandin (n=1) C. trachomatis positiv. Die Proben wurden von verschiedenen Einsendern zugeschickt und in dem Zeitraum November 2008- August 2009 gesammelt und ausgewertet. 3.4.9 Prävalenz von Chlamydia trachomatis in Abhängigkeit von früheren sexuell übertragbaren Krankheiten (STD) Es konnten 999 Proben ausgewertet werden. 30 Probanden machten dabei keine näheren Angaben zu früheren STD, wobei davon immerhin 4 Probanden Chlamydia trachomatis positiv waren. 909 Probanden gaben an, bisher keine STD gehabt zu 42 haben, wovon 36 (4,0%) positiv waren. 60 Probanden gaben an, bereits eine STD gehabt zu haben, davon waren 3 (5,0%) positiv. Die Prävalenz der C. trachomatis Infektionen war unter den Probanden mit einer früheren STD nicht signifikant höher als bei den Probanden ohne Vorerkrankungen (P>0,05). Geschlechtsspezifisch konnten hier keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. 3.5 Pooling Aus insgesamt 1100 Einzelurinproben wurden 220 gepoolte Proben, bestehend aus jeweils 5 Einzelproben gebildet. Diese gepoolten Proben wurden mittels GenoQuick®CT analysiert und mit den Ergebnissen der Einzelproben basierend auf dem Goldstandard verglichen. Ein Pool wurde als richtig positiv betrachtet, wenn er mindestens eine Probe enthielt, die in der Einzeltestung gemäß Goldstandard als positiv detektiert wurde. Ein Pool wurde als richtig negativ bewertet, sofern sämtliche enthaltene Proben in der Einzeltestung gemäß dem Goldstandard als negativ bewertet wurden. Bei diskrepanten Ergebnissen zwischen Pooluntersuchung und Einzeltestung gemäß Goldstandard erfolgte eine Wiederholungsuntersuchung der jeweiligen diskrepanten Poolproben. Bei der 1. Testung trat bei 3 Poolproben eine PCR-Inhibition auf. Nach Wiederholung der Untersuchung ergab sich ein negatives Testergebnis. Bei 7 Poolproben trat eine Diskrepanz zu den Einzeltestungen auf. Von diesen blieben nach der 2. Testung immer noch 3 falsch negativ, die anderen 4 waren richtig positiv. 1 Pool wurde falsch positiv getestet, dieser war nach der 2. Testung richtig negativ. Nach der Wiederholung der diskrepanten Poolproben zeigten insgesamt 217 Poolproben eine Übereinstimmung mit den Ergebnissen der Einzeltestung bezogen auf den Goldstandard. Bei 3 Poolproben traten diskrepante Ergebnisse im Vergleich zu den Einzeltestungen auf. 43 1. Testung 2. Testung 180 172 37 33 7 7 0 richtig negativ richtig positiv inhibiert 3 1 falsch negativ 0 falsch positiv Abb. Nr. 17: Anzahl der richtig negativen, richtig positiven, inhibierten, falsch negativen und falsch positiven Poolproben Die Poolproben wurden, falls sie inhibiert, falsch negativ oder falsch positiv waren, in einer 2. Testung wiederholt getestet. Es blieben 3 Poolproben weiterhin falsch negativ, d.h. die positiven Einzelproben konnten in diesem Fall nicht detektiert werden.Die Proben wurden von verschiedenen Einsendern zugeschickt und in dem Zeitraum November 2008- August 2009 gesammelt und ausgewertet. Tab. Nr. 8: Darstellung der Poolergebnisse nach der 1. Pooltestung und der Wiederholungsuntersuchung im Vergleich mit Einzeltestungengemäß dem Goldstandard Erwartetes Poolingergebnis gemäß den Einzeltestungen basierend auf dem Goldstandard 1. Pooltestung positiv negativ gesamt positiv 33 1 34 negativ 7 179 186 gesamt 40 180 220 positiv 37 0 37 negativ 3 180 183 gesamt 40 180 220 2.Pooltestung 44 Es lassen sich für die erste Pooltestung und die Wiederholungsuntersuchung folgende Werte für Sensitivität (82,5% vs. 92,5%), Spezifität (99,4% vs. 100%), positiven (97,1% vs. 100%) und negativen (96,2% vs. 98,4%) Vorhersagewert berechnen (siehe Tab. Nr. 9). Tab. Nr. 9: Darstellung der aus den Werten von Tab. 8 berechenbaren Sensitivität, Spezifität, dem positiven und negativen Vorhersagewert 1.Pooltestung 2.Pooltestung Sensitivität (%) 82,5 92,5 Spezifität (%) 99,4 100 Positiver Vorhersagewert (%) 97,1 100 negativer Vorhersagewert (%) 96,2 98,4 45 4. Diskussion Die vorliegende Dissertationsarbeit basiert auf den Daten einer prospektiven Studie zur Prävalenz von Chlamydia trachomatis, die wir zwischen dem ersten November 2008 und dem 31. August 2009 mit über 1000 Freiwilligen aus Ulm und Umgebung durchgeführt haben.Damit handelte es sich bis dato um eine der größten prospektiven Studien zur Prävalenz von Chlamydia trachomatis Infektionen in Deutschland, bei der auch klinische und demografische Daten, sowie Angaben zum Sexualverhalten der Probanden erhoben wurden (Fieser et al., 2012). Chlamydia trachomatis Infektionen des Urogenitaltraktes sind in Industrieländern weit verbreitet. 2009 wurden in Europa 343 000 Neuerkrankungen gemeldet, die meisten in der Altersgruppe der 15-24jährigen (ECDC, 2009). Durch das STD-Sentinel, an dem sich zurzeit in Deutschland ca. 250 Einrichtungen beteiligen, wird bei ca. 6% der Untersuchten eine Infektion mit Chlamydia trachomatis nachgewiesen. Dabei handelt es sich jedoch meist um Personen mit erhöhtem Risikoverhalten, wie Prostituierte oder Patienten aus STD-Sprechstunden. In einzelnen Studien wurden Prävalenzraten von 10% bei 17-jährigen Mädchen bzw. 20% bei 20- bis 24-jährigen Frauen gefunden(Robert-Koch-Institut, 2010; Gille et al., 2005; WHO, 2001). Da die Chlamydia trachomatis Infektion in Deutschland nicht meldepflichtig ist, stehen nur relativ wenig präzise Daten zur Prävalenz vonChlamydia trachomatis zur Verfügung. Junges Alter und ein neuer Sexualpartner stellen die beiden wichtigsten Risikofaktoren für eine Infektion dar (ECDC, 2009). Da Chlamydia trachomatis überwiegend eher asymptomatische Infektionen auslöst, bleiben diese in der Regel unerkannt, was vor allem bei Frauen zu schwerwiegenden Komplikationen mit weitreichenden Folgeschäden führen kann (Mylonas, 2012). Als Chlamydia trachomatis assoziierte Folgeerkrankungen gelten die Extrauteringravidität und die Tubarsterilität (Silins et al., 2005; Peipert et al., 2003). Es wird davon ausgegangen, dass eine Infektion mit Chlamydia trachomatis einen der wichtigsten Gründe für ungewollte Kinderlosigkeit darstellt(ECDC, 2009).Um derartige Spätschäden unerkannter Infektionen mit Chlamydia trachomatis zu vermeiden, wurde in Deutschland 2008 durch den Gemeinsamen Bundesausschuss im Gesundheitswesen ein Screeningprogramm für 15-25jährige junge Frauen eingeführt (G-BA, 2008). 46 In anderen Ländern wie Schweden (Egger et al., 1998; Kamwendo et al., 1996; Hermann et al., 1995), England (La Montagne et al., 2004) und in den USA (CDC, 2009) werden dagegen schon länger Chlamydia trachomatis Screeningprogramme durchgeführt. Bei den Screeningprogrammen werden zur Diagnostik des Erregers NukleinsäureAmplifikations-Verfahren (NAV) eingesetzt (Shaw et al., 2011). Die Durchführung von NAV für den Chlamydia trachomatis Nachweis ermöglicht die Untersuchung von nicht-invasiv gewonnenem Untersuchungsmaterial wie Urinproben oder (selbstentnommenen) Vaginalabstrichen. Damit sind für die Diagnostik Spekulumuntersuchungen bei der Frau bzw. schmerzhafte Harnröhrenabstriche beim Mann entbehrlich. In unserer Studie wurden Urinproben von 1003 Probanden untersucht. Es handelte sich um Freiwillige, für die gemäß G-BA Beschluss ein jährliches Chlamydia tracho- matis Screening empfohlen wird. Das heißt sexuell aktive, junge Frauen zwischen 14 und 25 Jahren, sowie Frauen und Männer welche, die STD-Beratungsstellen der Gesundheitsämter Ulm und Neu-Ulm aufsuchten. Wir untersuchten Erststrahlurin mit Hilfe von 2 unterschiedlichen NAV-Nachweisverfahren. Das primäre Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der regionalen Prävalenz von Chlamydia trachomatis, die Ermittlung der Risikofaktoren und die Erfassung der klinischen Symptomatik. Zum anderen sollte in dieser Arbeit ein neu eingeführtes NAVNachweisverfahren hinsichtlich Sensitivität, Spezifität, positivem und negativem Vorhersagewert und seiner Eignung für die Routinediagnostik beurteilt werden. Zusätzlich überprüften wir das vom G-BA vorgeschlagene Pooling der Proben auf Praktikabilität und Sensitivität. Für die Diagnostik haben bei den NAV die PCR (COBAS®Amplicor, Roche Diagnostics, Basel, Schweiz), die SDA (BD ProbeTec Becton Dickinson and Company, Diagnostic Systems Franklin Lakes, NJ) und die TMA (APTIMA, Gen-Probe, Inc., San Diego, CA) den größten Stellenwert. Es handelt sich um Verfahren, die von der FDA zugelassen sind und in großen Studien hinsichtlich Sensitivität, Spezifität, positivem Vorhersagewert und negativem Vorhersagewert gut evaluiert sind (Essig & Gaydos, 2011; Jespersen et al., 2005; Gaydos et al., 2004; Moncada et al., 2003). Diese Ver47 fahren können inzwischen auch auf teil- und vollautomatischen Plattformen betrieben werden und erlauben damit auch eine rationelle Abarbeitung bei hohem Probenaufkommen. In den Laboratorien des Instituts für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene des Universitätsklinikums Ulm wird das PCR basierte Verfahren COBAS®Amplicor (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) zur Diagnostik von Chlamydia trachomatis eingesetzt. Mit Einführung des Chlamydia trachomatis Screening drängen weitere Hersteller auf den Markt, deren NAV-Systeme bisher allerdings noch nicht ausreichend evaluiert sind. Ein weiteres Ziel dieser Studie war daher die Evaluierung eines neuen PCRVerfahrens (GenoQuick®CT), das bis dato erst wenige Wochen auf dem Markt war und das neben dem kryptischen Plasmid mit dem omp2 ein weiteres Zielgen einsetzt. Bereits in den Vorversuchen mit gespikten Urinproben (s.3.1) konnten wir feststellen, dass die Werte für die mittlere Nachweisgrenze der Serogruppen D, K und L2 für beide Nachweisverfahren in einem vergleichbaren Bereich lagen. Es wurden die Urinproben aller Patienten sowohl mit der GenoQuick®CT- als auch mit der COBAS®Amplicor-PCR untersucht. Bei diskrepanten Untersuchungsergebnissen wurden beide Nachweisverfahren wiederholt. Bei anhaltend diskrepanten Ergebnissen wurden die entsprechenden Proben in einem Referenzlabor mit einem dritten Verfahren, dem COBAS®TaqMan untersucht. Als richtig positiv bzw. richtig negativ wurden jene Proben definiert, die ein übereinstimmendes Testergebnis aufwiesen. Bei wiederholt diskrepantem Testergebnis wurde das Testergebnis des Referenzlabors als richtig erachtet. Gemessen an diesem Goldstandard fanden wir in der Untersuchungsgruppe eine Chlamydia trachomatis Prävalenz von 4,3%. Die Prävalenz von Chlamydia trachomatis basierend auf der GenoQuick®CT-PCR betrug 4,7% und basierend auf der COBAS®Amplicor-PCR 5%. Damit ergab sich für die GenoQuick®CT-PCR eine etwas niedrigere Sensitivität (93,0% versus 95,4%) bei einer diskret besseren Spezifität (99,3% versus 99,1%). Daraus resultiert ein besserer positiver Vorhersagewert der GenoQuick®CT-PCR (85,1% versus 82%) bei vergleichbarem negativem Vorhersagewert (99,7% versus 99,8%). Der eindeutige Vorteil des GenoQuick®CT ist, dass der Test zusätzlich zum kryptischen Plasmid noch das omp2-Gen detektiert. Dies ist vor allem wichtig für den Nachweis der neuen schwedischen Variante, die eine Deletion im kryptischen Plas48 mid aufweist. Im Rahmen der vorliegenden Studie führte die Analyse der diskrepanten Ergebnisse zur Identifikation der neuen schwedischen Variante bei einer Studienteilnehmerin (Fieser et al., 2012). Vergleicht man die beiden Nachweisverfahren hinsichtlich der Praktikabilität sind auch hier beide nahezu äquivalent. Wobei sich der GenoQuick®CT zum einen wegen seiner Gerätegröße, zum anderen wegen seiner einfachen Bedienung und schnellen Durchführung besonders für kleinere Labore eignet. Ein wesentlicher Nachteil des Nachweisverfahrens stellt die starke Untersucherabhängigkeit der Methode dar. Insbesondere die Interpretation von sehr schwachen Banden ist schwierig und subjektiv. Dagegen gibt es beim COBAS®Amplicor keine Möglichkeit zur Fehlinterpretation, aufgrund einer vollautomatischen kolorimetrischen Ergebnisbestimmung. Der Geräteaufwand beider Nachweismethoden scheint vergleichbar zu sein. Zwar kann man theoretisch mit dem GenoQuick®CT bis zu 90 Proben in einem Ansatz bestimmen, mit dem COBAS®Amplicor nur 24, doch lässt die Probenvorbereitung für beide Tests es kaum zu, mehr als 24 Proben auf einmal vorzubereiten. Insgesamt kann man sagen, dass der COBAS®Amplicor ein objektives Nachweisverfahren ist, das auch von einem unerfahrenen Mitarbeiter adäquat ausgewertet werden kann, das aber Mängel hinsichtlich der Diagnostik mutierter Chlamydienspezies aufweist, da es lediglich das kryptische Plasmid detektiert. Inzwischen hat der Herstellerdarauf reagiert und eine zusätzliche Zielsequenz (omp1) in das System eingeführt. Der GenoQuick®CT ist das schnellere, platzsparendere Nachweisverfahren, das zwei Zielsequenzen detektiert, allerdings einen Nachteil hinsichtlich der Subjektivität der Bandeninterpretation aufweist. Wenn man verschiedene Studien miteinander vergleicht, ist es wichtig auf die verschiedenen Studiendesigns zu achten, vor allem hinsichtlich des benutzten Probenmaterials und der genutzten Nachweisverfahren. Gemäß den Empfehlungen des gemeinsamen Bundesausschusses im Gesundheitswesen (G-BA) für das Chlamydia trachomatis Screening untersuchten wir in der vorliegenden Studie Erststrahlurine. Es wurde aber gezeigt, dass ein vaginaler Abstrich eine deutlich höhere Keimlast als der Erststrahlurin hat (Robert Koch Institut, 2010; Wiggins et al., 2007). (Selbst-)entnommene Vaginalabstriche gelten vor allem in den USA daher inzwischen als am besten geeignetes Untersuchungsmaterial für den NAV-Nachweis unkomplizierter Chlamydia trachomatis Infektionen bei Frauen. Wir können daher nicht ausschließen, dass die Prävalenz in unserer Studie eventuell höher gewesen wäre, 49 wenn wir vaginale Abstriche genutzt hätten. Ein weiteres Problem bei Urinproben ist die Anwesenheit von PCR-Inhibitoren, die den Reaktionsablauf der PCR stören (Mahony et al., 1998). 2-4% der Urinproben enthalten solche Inhibitoren (Chan et al., 2000; Van der Pol et al., 2000). Auch bei uns gab es mit beiden Nachweisverfahren vereinzelt Inhibitionen, die eine zweite Testung nötig machten. Im Vergleich zu Prävalenzen anderer europäischer Ländern, die sich zwischen 1,2% und 10,4% beliefen (ECDC, 2009; Simms et al., 2009; Baud et al., 2008; Novak und Karlsson, 2006; van Bergen et al., 2005; Gille et al., 2005; Klavs et al., 2004; Cladet al., 2001) liegt die Chlamydia trachomatis Prävalenz unserer Studienpopulation im mittleren Bereich. Daten des nationalen Screeningprogrammes in England ergaben eine Prävalenz von 9,3% bei Frauen und 7,6% bei Männern unter 25 Jahre (Simms et al., 2009). Dagegen betrug die Prävalenz in der Schweiz 1,2% bei Männern zwischen 18 und 26 Jahren (Baud et al., 2008) und 2,8% bei Frauen zwischen 15 und 35 Jahren (Paget et al., 2002). Verglichen mit anderen publizierten Daten aus Deutschland war die Prävalenz in Ulm und Umgebung geringer als in Berlin (5,4%) (Griesinger et al., 2007; Gille et al., 2005). In der vorher genannten Studie wurde insbesondere in der Gruppe der 17 Jahre alten Frauen eine Chlamydia trachomatisPrävalenz von 10% festgestellt. Diese Prävalenz können wir mit unserer Studie in keiner Altersgruppe bestätigen. Ursächlich dafür könnte ein anderes Sexualverhalten Jugendlicher und junger Erwachsener in einem eher großstädtisch geprägtem Umfeld sein (van Bergen et al., 2005) verglichen mit einer eher ländlichen Gegend. Mit Hilfe eines Fragebogens eruierten wir Informationen hinsichtlich des Alters, Geschlechts, Dauer der aktuellen Beziehung, Alter des ersten Sexualkontaktes, Anzahl der Sexualpartner, Benutzung von Kontrazeptiva mit Barrierefunktion, Symptomatik und früherer STDs. Diese stellen alle Risikofaktoren dar, die in verschiedenen Studien validiert wurden (Carey et al., 2010; Australasian Society for HIV Medicine 2010; Knauper et al., 2004; Nelson et al., 2001). In Übereinstimmung mit anderen Studien konnten wir zeigen, dass die Chlamydia trachomatis Prävalenz entscheidend vom Alter der Probanden abhängig ist (Simms et al., 2009; Novak und Karlsson, 2006; Klaveset al., 2004; Paget et al., 2002). So ist diese bei jungen sexuell aktiven Frauen eher hoch und nimmt ab dem Alter von 25 50 Jahren drastisch ab. Bei uns zeigte sich bei der Altersklasse der 14-19jährigen eine Prävalenz von 4,2%, bei den 20-25jährigen eine Prävalenz von 5,0%, und bei den über 25jährigen eine Prävalenz von 1,1%. Bei Männern fanden wir hingegen überraschender Weise die höchste Prävalenz von 8,3% in der Altersgruppe der über 25jährigen. Dies haben wir sowohl bei Probanden, die aus den ärztlichen Praxen rekrutiert wurden (8,9%) als auch in der Gruppe der Studenten (6,3%) festgestellt. Aufgrund der geringen Teilnehmerzahl (n=6) sind die Daten in der Gruppe der 14-19jährigen nicht auswertbar, sodass wir für diese Altersgruppe keine belastbaren Daten erheben konnten. Eine niederländische Arbeitsgruppe (Van Bergen et al., 2005) fand ebenfalls innerhalb ihres Studienkollektivs die höchste Prävalenz bei Männern in der Altersgruppe der 25-29jährigen, diese war mit 2,1% jedoch weitaus geringer als in unserer Studie. Denkbar ist, dass die bisher veröffentlichten relativ niedrigen Chlamydia trachomatis Prävalenzen bei Männern (Baud et al., 2008) daher kommen, dass nur sehr junge Altersgruppen getestet wurden. Aus unserer Sicht sind weitere Studien notwendig, die sich vor allem auch auf die Altersgruppe der 25-35jährigen Männer fokussieren. Belastbare Daten zu altersabhängigen Prävalenzen bei Männern sind auch deshalb wichtig, weil bereits seit Längerem eine Einführung des Chlaymdia trachomatis Screenings für asymptomatische Männer in der Diskussion steht (CDC, 2007). Vor allem Männer, die nie ein Kondom benutzten, haben ein erhöhtes Risiko einer Infektion. So konnten wir eine Chlamydia trachomatis Prävalenz von 18,5% bei Männern, die nie Kondome benutzten feststellen, im Vergleich zu 3,8% bei unregelmäßiger und 0% bei strikter Kondomnutzung. Auch Personen, die relativ viele Sexualpartner und relativ früh ihre ersten Sexualkontakte hatten, haben eine höhere Chlamydia trachomatis Prävalenz. So beträgt die Prävalenz bei Probanden mit >4 Partnern 7,0%, bei Probanden die erst seit Kurzem eine Beziehung führen 5,4% und bei weiblichen Probandinnen, die Ihren ersten Sexualkontakt im Alter von 11-15 Jahren hatten 7,5%. Wie auch schon in anderen Studien (Novak und Karlsson, 2006; van Bergen et al., 2005; Paget et al. 2002) gezeigt, sind die meisten infizierten Probanden asymptomatisch, bei uns waren das 64,5% der weiblichen und 100% der männlichen positiv getesteten Probanden. Von den 35,5% der infizierten Frauen mit Symptomen wurde Ausfluss mit 72,7% als häufigstes Symptom angegeben. Damit kommen wir, wie 51 auch schon andere (Reddy et al., 1997), zu dem Ergebnis, dass Chlamydia tracho- matis-Infektionen des Urogenitaltraktes eher asymptomatisch oder mit unspezifischen Symptomen einhergehend verlaufen. All diese verschiedenen Ergebnisse unterstützen die Empfehlungen, ein generelles Screening für junge sexuell aktive Frauen bis 25 Jahren in Deutschland durchzuführen, obwohl in den vergangenen Jahren die Effektivität des Screenings immer wieder zur Diskussion stand (Gottlieb et al., 2010; Low et al., 2009). Screening Untersuchungen können entweder opportunistisch oder systematisch, z.B. basierend auf einem Register, durchgeführt werden. Beim opportunistischen Screening wird dem Patienten beim Arztbesuch die entsprechende Untersuchung empfohlen. Diese wird dann immer wieder in festen Zeitintervallen angeboten. Menschen, die selten oder gar nie einen Arzt aufsuchen haben damit keinerlei Möglichkeiten das Screening-Angebot zu nutzen. Das sogenannte schwedische Experiment (Egger et al., 1998), das Nationale Chlamydien Screening Programm in England (Department of Health, 2004), sowie das 2008 eingeführte Chlamydia trachomatis Screening in Deutschland (G-BA, 2008) sind Beispiele für ein opportunistisches Screeningprogramm. Streng genommen wird das schwedische Experiment nicht als Screeningprogramm angesehen, da es sich hierbei nicht um ein nationales Programm handelt, sondern regional ein unterschiedliches Vorgehen praktiziert wird. Beim registerbasierten Screening handelt es sich um ein proaktives systematisches Vorgehen, bei dem ein Register benutzt wird, um Individuen für das Screening zu erfassen und zur Teilnahme einzuladen. Diese Art des Screenings wird zurzeit in den Niederlanden als Pilotprogramm durchgeführt. Da sich das Screening sowohl für das Individuum als auch für die Gesamtpopulation hinsichtlich der Senkung der Infektionsrate bewähren soll, ist es wichtig, dass Screeningprogramme eine hohe Akzeptanz erfahren. Selbst wenn die Akzeptanz nach dem Testangebot relativ hoch ist, kann nur eine Minorität der Zielpopulation erreicht werden, wenn der erfasste Personenkreis klein ist und die angebotene Untersuchung nicht regelmäßig genutzt wird. 52 In den USA hat die jährliche Screeningrate von 25% im Jahr 2000 auf 41% im Jahr 2007 zugenommen (CDC, 2009). In Schweden hatten 71% der Frauen einen Chlamydientest in einer Zeitperiode über 10 Jahren, jedoch nur 1% der Frauen wurden in dieser Zeit mindestens 10 Mal getestet, was theoretisch einem korrekten jährlichen Screening während eines 10-Jahres-Zeitraums entsprechen würde (Low et al., 2006). In England betrug die Rate der erreichten Zielbevölkerung (14-25jährige Frauen) national 9,5% und sollte bis 2010 25% betragen (NCSP, 2009). Bei einem einmalig durchgeführten heimbasierten Screening in den Niederlanden wurden die Probenentnahmekits per Post verschickt. Die Teilnahme betrug in städtischen Gegenden 37%-41% (Van Bergen et al. 2005). Zurzeit wird ein systematisches Internet-basiertes selektives Screeningprogramm für 16-29 Jahre alte Probandinnen in multiplen Screeningrunden als Pilotprogramm in den Niederlanden durchgeführt. In den ersten Monaten des Programmes erhielten 20% der Zielpopulation ein Kit, wovon dann wiederum 80% Proben zur Testung abgaben. Das Programm ist in einem so genannten „stepped wedge“ Design eingebaut und soll den Einfluss auf die Prävalenz der Chlamydia trachomatis Infektionen und ihre Komplikationen nach mehreren Scenningrunden erheben (Morré et al., 2009). Obwohl einige Studien einen Zusammenhang zwischen PID und Infertilität mit einer Chlamydia trachomatis Infektion zeigten, waren diese alle retrospektiv, selektiv und beinhalteten eine bestimmte Patientenpopulation. Der Beweis für den Einfluss des Screenings zur Prävention komplizierter Chlamydia trachomatis Infektionen sollte jedoch von hochqualifizierten, randomisierten und prospektiven Studien geführt werden. So konnte anhand einer prospektiven, randomisierten Interventionsstudie (selektives Populationsscreenig) aus den USA gezeigt werden, dass die Inzidenz von PID in einem Jahr in der Interventionsgruppe um 56% niedriger war als in der Kontrollgruppe (Scholes et al., 1996).Eine andere prospektive, randomisierte Studie in Dänemark evaluierte den Einfluss des Chlamydia trachomatis Screening auf die PIDInzidenz bei Schülern und bei jungen Erwachsenen anhand selbstentnommener Proben für die Chlamydientestung (Ostergaard etal., 2000). Unter den Schülerinnen war die Inzidenzrate von PID um 50 % geringer als im Vorjahr. Studien in den USA und Schweden zeigten, dass die Chlamydienprävalenz und die Komplikationsrate nach der Einführung des Screenings abnahmen. Doch der tatsächliche Einfluss des Screenings kann in Frage gestellt werden, da auch in anderen 53 Ländern bedingt durch HIV- Kampagnen insgesamt die STD Rate abfiel (Bachmann et al. 2003; Egger et al., 1998; Kamwendo et al., 1998; Hillis et al., 1995). Drei Studien in kanadischen Schulen zeigten, dass das Screening einen positiven Einfluss auf den Rückgang der Chlamydia trachomatis Prävalenz hat (Hodgins et al., 2002). Allerdings wurde dieReliabilität dieser Studien kritisiert, weil es sich nicht um randomisierte Studien handelt (Low et al., 2009). Eine weitere wichtige Frage ist, ob auch Männer in das Screening mit aufgenommen werden sollten. Es gibt noch keine direkte Evidenz, dass die Krankheitsbelastung bei Frauen sinkt, wenn Männer in das Screening eingeschlossen werden. Die meisten Modellstudien zeigten außerdem, dass das Screening bei Männern weniger kosteneffektiv als das Screening bei Frauen ist (Kalwij et al., 2010). Dennoch könnte ein zusätzliches Screening bei Männern mit hohem Infektionsrisiko kosteneffektiv sein, da sie dann als asymptomatisches Erregerreservoir erkannt und ausgeschaltet werden könnten und somit auch die Krankheitslast bei der anfangs definierten Zielbevölkerung abnehmen würde (Gift et al., 2008). Das englische Screeningprogramm bietet sowohl Männern als auch Frauen bis 25 Jahren die Möglichkeit teilzunehmen. Dies soll dazu dienen, dass Männer aktiv Verantwortung hinsichtlich ihrer eigenen sexuellen Gesundheit und der ihres Partners übernehmen. Junge Männer sind eine große Gruppe von Trägern nichtdiagnostizierter und nichtbehandelter Chlamydia trachomatis Infektionen. Sie sind aber schwierig zu erreichen, da sie Gesundheitsämter oder Arztpraxen seltener aufsuchen als Frauen (Low, 2008). Diese Aussage können wir mit unseren Daten nur unterstützen, denn wir fanden mit 8,3% die höchste Chlamydia trachomatis Prävalenz bei Männern, die älter als 25 Jahre waren. Die Entwicklung von Nachweisverfahren, die auf einer nichtinvasiven Probenentnahme beruhen, wie die auf Urin basierende NAV-Testung, haben ein Screening auch für junge Männer akzeptierbar gemacht (Marrazzo et al., 2007). Befragungen von jungen Männern haben gezeigt, dass diese eher eine anonyme Testung, z.B. via Internet, bevorzugen (Satterwhite et al., 2010). Zur Senkung der Kosten der Screeningprogramme wird ein Pooling empfohlen. In unserer Studie haben wir eine Erniedrigung der Sensitivität beim Pooling im Vergleich zur Einzeltestung feststellen können. Wir haben die Pools mit dem GenoQuick®CT untersucht. Die Sensitivität des GenoQuick®CT in der Einzeltestung betrug 93%, bei der ersten Pooltestung 82,5% bzw. 92,5% bei der Wiederholungstes54 tung. Die deutliche Senkung der Sensitivität sollte bei der Einführung eines auf Pooltestung basierenden Screenings zur Erhöhung der Kosteneffektivität beachtet werden. Bei unserer Studie wurden in der ersten Testung sieben der 220 Pools falsch negativ und einer falsch positiv getestet. Da in der Wiederholungstestung immerhin 4 von 7 falsch negativen Poolproben als richtig positiv getestet wurden, könnte dies auf ein Verdünnungsproblem nach Pooling bei geringer Bakterienlast in der Einzelprobe hinweisen. Dadurch kann der oben beschriebene, deutliche Verlust hinsichtlich der Sensitivität in der Einzeltestung erklärt werden. Eine Wiederholungstestung von gepoolten Proben ist unter Routinebedingungen jedoch unüblich, weil nicht wirtschaftlich, sodass für die Bewertung des Probenpooling die Ergebnisse der ersten Testung maßgebend sind. Unsere Daten sind daher in Übereinstimmung mit Studien, die eine signifikante Senkung der Sensitivität nach Pooling beschrieben (Currie et al., 2004; Morré et al., 2002). Beim Pooling innerhalb großer Screeningprogramme sollte unbedingt darauf geachtet werden, dass dies nur in Verbindung mit DNAIsolierungsmethoden geschieht, die hoch aufgereinigte DNA erbringen (Rours et al., 2005). Neben Screeningmaßnahmen sollten auch noch andere Maßnahmen zur Prävention von Chlamydia trachomatis Infektionen nicht außer Acht gelassen werden. Unsere Erfahrung bei der Beratung junger Menschen während der Rekrutierungsphase der vorliegenden Studie zeigte, dass Jugendliche und junge Erwachsene schlecht über Chlamydia trachomatis Infektionen informiert sind. Das gilt insbesondere auch für die Präventivmaßnahmen, sodass sich durchaus mit Aufklärungskampagnen, z.B. im Schulunterricht, eine Verbesserung der Situation erreichen ließe. Die konsequente Anwendung primärer Präventionsmaßnahmen würde das Screening, das eine Sekundärpräventionsmaßnahme darstellt, überflüssig machen. Primäre Prävention beinhaltet Aufklärungskampagnen und „Safer Sex-Kampagnen“, die letztendlich in einer Änderung des Sexualverhaltens der Population resultieren. Weitere Maßnahmen der primären Prävention umfassen eine Impfung oder auch eine medikamentöse Prävention. Als sekundäre Prävention werden Maßnahmen wie ein Chlamydia trachomatis Screening und eine Partnermitbehandlung definiert. Die WHO empfiehlt die Umsetzung von evidenzbasierten Strategien (siehe oben) zur primären Prävention und eine Überwachung der sexuell übertragbaren Krankheiten (WHO, 2006). Die Regierungen wurden ermutigt, in Kampagnen für „Safer-Sex“ zu investieren, um das Bewusstsein der Bevölkerung hinsichtlich Risikoverhalten und55 Frühsymptomen zu erweitern (Low et al., 2006). Trotz allem ist die Prävalenz von Chlamydia trachomatis Infektionen in den Jahren danach in England, Schweden und den Niederlanden gestiegen (Low et al., 2008). Eine weitere Möglichkeit wäre es, eine wirksame Impfung zu entwickeln. Damit ist aber vorerst noch nicht zu rechnen, da die Impfstoffentwicklung für Chlamydia tra- chomatis noch auf der Ebene der Grundlagenforschung betrieben wird. In einem hypothetischen Szenario, in dem 80% der Bevölkerung mit einem 100% effektiven Impfstoff, der etwa eine 10jährige Immunität hervorrufen würde, geimpft würden, wären Infektionen mit Chlamydia trachomatis 5 Jahre nach einer großflächigen Einführung der Impfung ausgerottet (Burnham und Rey-Ladino, 2005). Die einmalige oder periodische Behandlung von mutmaßlichen Infektionen wird für Länder diskutiert, die entweder eine hohe Prävalenz haben oder noch nicht über genügend präventive oder kurative Ressourcen verfügen. Von drei randomisierten kontrollierten Studien, bei denen weiblichen Prostituierten monatlich chlamydienwirksame Antibiotika verabreicht wurden, konnte nur in einer die Infektionsrate gesenkt werden (Manhart und Holmes, 2005). Studien in denen sich Frauen in Infertitlitätssprechstunden vorstellten zeigten, dass die Prävalenz von Infektionen des unteren Genitaltrakts niedrig ist (1,8%) (Land et al., 2002; Macmillan und Templeton, 1999;Eggert- Kruse et al., 1997). Mehrere Jahre nach einer Chlamydieninfektion können dagegen viable Chlamydienformen immer noch im oberen Genitaltrakt persistieren (Dieterle et al., 1998; Gérard et al., 1998). Diese können nach einer instrumentellen intrauterinen Behandlung eventuell reaktiviert werden (Land et al., 2003). Daher wird von manchen Zentren eher eine Einzeldosis Azithromycin bei Frauen, bei denen eine instrumentelle intrauterine Untersuchung durchgeführt wird, verabreicht, als ein endozervikales Screening durchgeführt, welches dann die ausschließliche Behandlung der positiven Patientinnen zur Folge hätte (Land et al., 2003). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass primäre Prävention über „Safer-Sex“ Kampagnen ein Bewusstsein hinsichtlich der sexuellen Gesundheit und eine ordnungsgemäße Beratung die Eckpfeiler der Prävention sexuell übertragbarer Krankheiten sind.Auf jeden Fall sollte der Aufklärung von Jugendlichen und der Primärprä- 56 vention via „Safer-Sex“ Kampagnen eine größere Bedeutung beigemessen und eine kontinuierliche Aufklärung der Bevölkerung angestrebt werden. In diesen Bereichen sollte vor allen Dingen auch auf die Gefahr einer Ping-Pong-Infektion hingewiesen werden, damit eine Mitbehandlung des Partners als selbstverständlich erachtet wird. Darüber hinaus können eine frühe Diagnose und eine adäquate Therapie die weitere Übertragung und die Entwicklung von Folgeerkrankungen verhindern. Prophylaktische Behandlungen sollten ausnahmsweise, z.B. vor instrumentellen intrauterinen Untersuchungen bei Frauen mit Verdacht auf eine viable Chlamydia trachomatis Infektion, in Erwägung gezogen werden (Land et al., 2010). Wir fanden in unserem Studienkollektiv eine Gesamtprävalenz von Chlamydia tra- chomatis- Infektionen von 4,2% bei Frauen und 4,6% bei Männern. Mit Hilfe von Screeninguntersuchungen kann eine frühe Diagnose gestellt und infizierte Patienten frühzeitig behandelt werden. Dies ist vor allem im Hinblick auf die große Zahl asymptomatischer Infektionen wichtig. Um das ideale Kollektiv für das Screening zu ermitteln, sind noch weitere Studien hinsichtlich der Chlamydia trachomatis Prävalenz bei Männern erforderlich. Aufgrund der aktuellen Datenlage ist es nicht möglich, eine altersspezifische Risikogruppe bei Männern zu definieren.Die Risikogruppe bei den Frauen dagegen scheint mit den bis zu 25Jahre alten Frauen gut definiert zu sein. Durch die geringe Prävalenz (1,1%) bei den über 25jährigen Frauen würde es sich hinsichtlich der Kosten-NutzenEffektivität nicht lohnen, diese Gruppe noch in das Screening einzuschließen. Des Weiteren sollten überlegt werden, statt Erststrahlurin selbstentnommene Vaginalabstriche als Untersuchungsmaterial zu verwenden, da bei letzteren die Erregerlast höher ausfällt. Die in der vorliegenden Studie eingesetzten NAV-Nachweisverfahren zeigten eine vergleichbare Leistung, sodass die Entscheidung für ein bestimmtes Verfahren nach Probenaufkommen, Platz und Ausbildungsgrad der Arbeitskräfte entschieden werden muss. Nach unseren Daten muss das Probenpooling, aufgrund der deutlich geringeren Sensitivität im Vergleich zur Einzeltestung, als kostensparender Faktor beim Chlamydia trachomatis-Screening kritisch überdacht werden. 57 5. Zusammenfassung Wir führten eine prospektive Studie zur Prävalenz von Chlamydia trachomatis bei sexuell aktiven freiwilligen Probanden aus Ulm und Umgebung durch. Insgesamt konnten über 1000 Probanden beider Geschlechter in die Studie eingeschlossen werden. Damit handelt es sich um eine der größten prospektiven Studien zur Prävalenz von Chlamydia trachomatis Infektionen in Deutschland, bei der auch klinische, demografische Daten sowie Angaben zum Sexualverhalten der Probanden erhoben wurden. Die Probanden wurden aus vier Bereichen rekrutiert. So beteiligten sich Freiwillige, die gynäkologische, allgemeinmedizinische Praxen sowie arbeitsmedizinische Sprechstunden aufsuchten. Zweitens handelte es sich um Freiwillige, die die Sprechstunden bezüglich sexuell übertragbarer Erkrankungen der Gesundheitsämter Ulm und Neu-Ulm aufsuchten. Drittens beteiligten sich Studenten der Universität Ulm und der Fachhochschule Neu-Ulm und schließlich beteiligten sich Schüler der Ulmer Gesundheitsschulen. Mit Hilfe eines standardisierten Fragebogens erhoben wir Daten zu Alter und Geschlecht der Probanden sowie Risikofaktoren wie Dauer der aktuellen Beziehung, Alter des ersten Sexualkontaktes, Anzahl der Sexualpartner, Gebrauch von Kontrazeptiva mit Barrierefunktion, Symptomatik und frühere Geschlechtskrankheiten. Die labortechnische Untersuchung der Proben erfolgte mit Hilfe von zwei unterschiedlichen Nukleinsäureamplifikationsverfahren (COBAS®Amplicor und GenoQuick®CT), die wir hinsichtlich Sensitivität, Spezifität, positivem und negativem Vorhersagewert verglichen haben. Als Untersuchungsmaterial verwendeten wir Erststrahlurin, ein Untersuchungsmaterial, welches für das Chlamydia trachomatis Screening empfohlen wird. Des Weiteren haben wir mit Hilfe des GenoQuick®CT Untersuchungen von gepoolten Proben durchgeführt. Dieses Poolingverfahren soll zur Kosteneffektivität bei Chlamydia trachomatis Screeninguntersuchungen beitragen. Die beiden Nachweisverfahren hatten vergleichbare Werte für Sensitivität (95, 4% für den Cobas®Amplicor und 93% für den GenoQuick®CT), Spezifität (99,1% versus 99,3%), positiver (82,0% versus 85,1%) und negativer (99,8% versus 99,7%) Vorhersagewer. Beim Poolingverfahren war eine Abnahme der Sensitivität des Geno- 58 Quick®CT von 93% bei der Einzeltestung auf 82,5% bei der ersten Pooltestung feststellbar. Anhand unserer Ergebnisse kommen wir zu der Schlussfolgerung, dass beide Nachweisverfahren als Detektionsmethoden als gleichwertig zu betrachten sind, wobei für Laboratorien mit großem Probenaufkommen der Cobas®Amplicor auf Grund des besseren Laborhandlings Vorteile hat. Hinsichtlich des Screenings sollte das Pooling kritisch überdacht werden, da wir eine deutliche Abnahme der Sensitivität feststellen konnten Die Chlamydia trachomatis Prävalenz in unserer Studienpopulation betrug 4,3 %. Damit befinden wir uns verglichen mit Studien aus anderen europäischen Ländern (1,2%-10,4%) im mittleren Bereich. Eine Studie aus Berlin fand eine Chlamydia tra- chomatis Prävalenz von 5,0%. In unserer Studie betrug die Chlamydia trachomatis Prävalenz innerhalb der Altersgruppe der 14-19jährigen 4,6%, in der der 2025jährigen betrug sie 4,2% und bei den über 25jährigen betrug sie 4,7%. Bei den männlichen Probanden belief sich die Chlamydia trachomatis Prävalenz auf 4,6%, bei den weiblichen Probandinnen belief sie sich auf 4,2%, wobei die 20-25jährigen Probandinnen mit 5,0% die höchste Chlamydia trachomatis Prävalenz aufwiesen. Überraschender Weise haben wir mit 8,3% eine relativ hohe Chlamydia trachomatis Prävalenz bei Männern, die älter als 25 Jahre sind, gefunden.Dieses Patientenkollektiv wird in der Regel nicht durch die Screeningempfehlung abgedeckt. Da das Screening von Männern zunehmend diskutiert wird, halten wir weitere altersbezogene Chlamydia trachomatis Prävalenzstudien bei Männern für erforderlich, um das geeignete Screening-Alter von Männern zu bestimmen. Wie erwartet, war die Mehrzahl der infizierten Probanden asymptomatisch. Die Chlamydia trachomatis Prävalenz bei Frauen stieg mit sinkendem Alter des ersten Sexualkontakts. Bei beiden Geschlechtern stieg die Chlamydia trachomatis Prävalenz mit der Anzahl der Sexualpartner, dem Nichtgebrauch von Kondomen und einer kurzen Dauer der aktuellen Beziehung. Gezielte Maßnahmen der Primärprävention für Jugendliche und junge Erwachsene wie Aufklärungskampagnen zu sexuell übertragbaren Erkrankungen könnten, neben der Optimierung von Screening- Maßnahmen, einen wichtigen Beitrag zur Senkung der Chlamydia trachomatis Prävalenz und der damit verbundenen Folgeerkrankungen leisten. 59 6. Literaturverzeichnis 1. 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Des Weiteren möchte ich mich bei Frau Diplom-Dokumentarin Werner-Belak bedanken, die mir hinsichtlich der statistischen Analyse und Aufbereitung der Daten eine wesentliche Hilfe war. Für eine enthusiastische Mitarbeit bei der Probenrekrutierung gilt mein Dank Frau Dr. Ladenburger-Strauß. Ebenso möchte ich Herrn Prof. Dr. Udo Reischl danken, der die diskrepanten Proben immer zeitnah im Referenzlabor bearbeitet und ausgewertet hat. Als letztes möchte ich der Person danken, ohne die ich meine experimentellen Daten nicht hätte erheben können. Für ihre besondere Geduld, ihre freundliche und offene Art, und dafür, dass sie mich in die Laborarbeit eingewiesen hat. Vielen Dank Frau Ulrike Simnacher. 72 9.Lebenslauf Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt. 73
