N-LINKED PROTEIN GLYCOSYLATION IN THE CYTOPLASM

DISS. ETH NO. 22048
N-LINKED PROTEIN GLYCOSYLATION
IN THE CYTOPLASM
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
ANDREAS FABIAN NÄGELI
MSc ETH Biology, ETH Zürich
born on 17. 12. 1984
citizen of
Marthalen/ZH
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Markus Aebi, examiner
Prof. Dr. Dario Neri, co-examiner
Prof. Dr. Rudolf Glockshuber, co-examiner
2014
Summary
SUMMARY
N-linked protein glycosylation is a very common post translational modification that
is found throughout the three domains of life. A classical, highly conserved pathway
entails the assembly of an oligosaccharide on a lipid carrier, its translocation across a
membrane (the endoplasmic reticulum membrane in eukaryotes, the plasma
membrane in prokaryotes) and the en bloc transfer of the oligosaccharide to the
side chain amide group of an asparagine residue in the sequon N-X-S/T of secreted
polypeptides.
This
transfer
is
catalyzed
by
a
membrane-bound
oligosaccharyltransferase (OST). After the transfer, oligosaccharide undergoes a
number of trimming and elongation steps to give rise to a vast array of different
glycan structures. N-glycans are involved in many biological processes such as for
example protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum, cell-cell
recognition or immune modulation and inflammation. Certain species in the class of
γ-proteobacteria encode an unusual pathway for N-linked protein glycosylation. This
pathway takes place in the cytoplasm and is mediated by a soluble Nglycosyltransferase (NGT) that uses nucleotide-activated sugars to modify
asparagine residues with single monosaccharides. Surprisingly, it uses the same
consensus sequon (N-X-S/T) as OST even though the two enzymes are not related.
NGT constitutes a novel class of N-glycosylation catalyzing enzymes. Chapter 1 of
this thesis offers a brief overview of protein glycosylation in general and more
detailed introduction to both the classical and the cytoplasmic N-glycosylation
pathways. Furthermore some of the efforts taken to use bacteria as expression hosts
for glycoproteins are discussed. The following chapters are dedicated to the
detailed characterization of the cytoplasmic N-glycosylation system, the enzymology
of NGT and its potential biotechnological application.
To study cytoplasmic N-glycosylation in more detail, we needed a readily accessible
experimental system. Chapter 2 unveils the study of the cytoplasmic N-glycosylation
in the porcine respiratory tract pathogen Actinobacillus pleuropneumoniae and its
functional transfer to Escherichia coli. N-linked glucose specific human sera as well
as mass spectrometric approaches were used for the analysis of the glycosylation
process. We identified autotransporter adhesins as the preferred protein substrate
of NGT in vivo and in-depth analysis of the modified sites in E. coli revealed a
relaxed peptide substrate specificity. While N-X-S/T is the preferred acceptor
sequon, we detected glycosylation of alternative sequons, including modification of
glutamine and serine residues.
In order to further characterize the NGT catalyzed reaction, we performed a detailed
biochemical analysis, which is reported in chapter 3. We developed a sensitive and
quantitative in vitro assay based on HPLC separation and quantification of
fluorescently labeled substrate peptides. With this assay we were able to directly
quantify glycopeptide formation by A. pleuropneumoniae NGT and determine its
substrate specificities: NGT turns over a number of different sugar donor substrates
I
Summary
and allows activation by both UDP and GDP. Quantitative analysis of peptide
substrate turnover demonstrated a strikingly similar specificity as the classical,
oligosaccharyltransferase-catalyzed N-glycosylation. N-X-S/T sequons turned out to
be the optimal NGT substrates, which confirmed our in vivo findings.
NGT offers a new route for the production of N-linked glycoproteins. Chapter 4
describes the development of a chemoenzymatic method for direct glycosylation of
polypeptides: A glucose moiety was introduced at the consensus N-glycosylation
sequence (N-X-S/T) in a polypeptide by NGT followed by attachment of a complex
N-glycan to the glucose primer by endoglycosidase (ENGase)-catalyzed
transglycosylation. Different high-mannose and complex type N-glycans could be
readily transferred to the glucose moiety by ENGases to provide full-size
glycopeptides. The usefulness of the chemoenzymatic method was exemplified by
an efficient synthesis of a complex glycoform of polypeptide C34, a potent HIV
inhibitor derived from HIV-1 gp41. Interestingly, the Glc-Asn linked glycopeptide
was completely resistant to PNGase F digestion, as well as significantly less
susceptible to hydrolysis by Endo-M compared to the natural GlcNAc-Asn linked
glycopeptide. The chemoenzymatic glycosylation method provides an efficient way
for introducing complex N-glycans into polypeptides, for gain of novel properties
that could be valuable for drug discovery.
II
Zusammenfassung
ZUSAMMENFASSUNG
N-gebundene Proteinglykosylierung ist eine sehr häufige posttranslationale
Modifikation die in allen drei Domänen des Lebens vorkommt. Ein klassischer,
hochkonservierter Biosyntheseweg beinhaltet den Aufbau eines Oligosaccharids auf
einem Lipid, seine Translokation über eine Membran (die Membran des
endoplasamatischen Retikulums in Eukaryoten, die Plasmamembran in Prokaryoten)
und den en bloc Transfer auf die Seitenkettenamidgruppe eines Asparaginrests im
Sequon N-X-S/T eines sekretierten Proteins. Dieser Transfer wird von einem
membrangebundenen Enzym, der Oligosaccharyltransferase (OST) katalysiert. Nach
dem Transfer wird das Oligosaccharid einer Reihe von Trimm- und
Elongationsschritten unterzogen und es entsteht eine Vielzahl verschiedener
Glykanstrukturen. N-Glykane sind in viele verschieden biologische Prozesse
involviert, wie zum Beispiel Proteinfaltung und Qualitätssicherung im
Endoplasmatischen Retikulum, Zell-Zell Erkennung oder Modulation des
Immunsystems und Entzündung. Einige Spezies der Klasse γ-Proteobacteria
vollführen eine sehr ungewöhnliche Art der N-Glykosylierung. Diese Glykosylierung
findet im Zytoplasma statt und wird von einer löslichen N-Glykosyltransferase
katalysiert. Dieses Enzym verwendet Nukleotid-aktivierte Zucker um Asparaginreste
mit einzelnen Monosacchariden zu modifizieren. Überraschenderweise erkennt
dieses Enzym die gleiche Konsensussequenz (N-X-S/T) wie OST, obwohl die beiden
Enzyme nicht miteinander verwandt sind. NGT stellt eine neue Klasse von NGlykosylierungsenzymen dar. Kapitel 1 dieser Arbeit bietet eine kurze Übersicht
über Proteinglykosylierung im Allgemeinen und eine detailliertere Einführung in die
klassische und die zytoplasmatische N-Glykosylierung. Ausserdem werden einige
Möglichkeiten der Anwendung von Bakterien als Expressionswirte zur Herstellung
von Glykoproteinen diskutiert. Die folgenden Kapitel sind der detaillierten
Charakterisierung
des
zytoplasmatischen
N-Glykosylierungssystems,
der
Enzymologie von NGT und seiner potenziellen biotechnologischen Anwendung
gewidmet.
Zur Untersuchung der zytoplasmatische N-Glykosylierung benötigten wir ein
experimentelles System, welches einfache Manipulation und Analyse erlaubt. Kapitel
2 zeigt die Erforschung der zytoplasmatische N-Glykosylierung in Actinobacillus
pleuropneumoniae, einem Atemwegserreger in Schweinen, und die Rekonstruktion
des
Glykosylierungssystem
in
Escherichia
coli.
Zur
Analyse
des
Glykosylierungsprozesses wurden menschliche Seren die spezifisch mit Ngebundener Glukose reagieren sowie Massenspektrometrie verwendet. Wir haben
Autotransporteradhesine als bevorzugte Substratproteine von NGT in vivo
identifiziert und eine detaillierte Analyse der modifizierten Stellen in E. coli hat eine
Peptidsubstratspezifität ergeben, die weit weniger steng ist als bisher angenommen.
Während N-X-S/T das bevorzugte Akzeptorsequon darstellt, haben wir auch
III
Zusammenfassung
Glykosylierung von alternativen Sequons sowie Modifikation von Glutamin- und
Serinresten nachgewiesen.
Um die von NGT katalysierte Reaktion besser zu charakterisieren, haben wir eine
detaillierte biochemische Analyse durchgeführt welche in Kapitel 3 beschrieben
wird. Wir haben eine sensitive und quantitative in vitro Testmethode entwickelt um
die Bildung von Glykopeptiden durch A. pleuropneumoniae NGT direkt zu messen.
Sie basiert auf der Trennung und Quantifizierung von fluoreszierenden
Substratpeptiden per HPLC und erlaubte uns die Substratspezifitäten von NGT zu
eruieren. NGT setzt diverse Zuckerdonorsubstrate um und toleriert die Aktivierung
des Zuckers durch sowohl UDP als auch GDP. Quantitative Analyse der
Peptidsubstratspezifität von NGT ergab eine überraschend ähnliche Spezifität wie
sie für die klassische, OST-katalysierte N-Glykosylierung beschrieben wurde. N-X-S/T
Sequons wurden am besten umgesetzt, was unsere vorhergehenden in vivo
Resultate bestätigte.
NGT bietet neue Möglichkeiten zur Herstellung von N-Glykoproteinen. Kapitel 4
schildert die Entwicklung einer chemoenzymatischen Methode zur direkten
Glykosylierung von Polypeptiden: Modifikation eines Peptides mit einer
Glukoseeinheit an der N-Glycosylierungskonsensussequenz (N-X-S/T) durch NGT,
gefolgt von der Anlagerung eines komplexen N-Glykans an die Glukose via
Endoglykosidase (ENGase)-katalysierter Transglykosylierung. Sowohl Mannosereiche als auch komplexe N-Glykanstrukturen konnten durch ENGase auf die
Glukose transferiert werden. Die Nützlichkeit dieser Methode konnte durch die
effiziente Synthese einer komplexen Glykoform von Polypeptid C34 (einem
potenten HIV Inhibitor abgeleitet von HIV-1 gp419) demonstriert werden.
Interessanterweise war das Glc-Asn gebundenen Glykopeptid komplett resistent
gegen Spaltung durch PNGase F und auch signifikant weniger anfällig auf Hydrolyse
durch Endo-M als das natürliche, GlcNAc-Asn gebundene Glykopeptid. Die
chemoenzymatische Glykosylierungsmethode bietet daher eine effiziente
Möglichkeit zur Modifikation von Polypeptide mit komplexen N-Glykanen und
schafft Glykopeptide mit neuen Eigenschaften, die für die Arzneimittelforschung
sehr wertvoll sein könnten.
IV