Untersuchungen zur Funktion und zum Repertoire humaner γδ T
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Untersuchungen zur Funktion und zum Repertoire humaner γδ T-Zell Subpopulationen Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg vorgelegt von Nicole Rupp aus Freiburg im Breisgau Dezember 2005 Diese Arbeit wurde am Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Freiburg der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg unter der Leitung von Prof. Dr. Paul Fisch angefertigt. Dekan: Prof. Dr. Georg Fuchs Promotionsvorsitzender: Prof. Dr. Samuel Rossel Tag der mündlichen Prüfung: 01. Juni 2006 2 I. Inhaltsverzeichnis I. Inhaltsverzeichnis I. Inhaltsverzeichnis .........................................................................................................3 II. Zusammenfassung ......................................................................................................6 1. Einleitung.....................................................................................................................7 1.1 Das Immunsystem .................................................................................................7 1.3 Der humane T-Zellrezeptor ..................................................................................10 1.4 Die genetische Organisation des T-Zell Rezeptors..............................................12 1.5 αβ T-Lymphozyten ...............................................................................................15 1.6 γδ T-Lymphozyten ................................................................................................16 1.7 Auftreten von humanen γδ T-Zellen bei Erkrankungen ........................................19 1.8 Ziele der Arbeit.....................................................................................................20 2 Ergebnisse..................................................................................................................22 2.1 Etablierung und Charakterisierung von seltenen γδ T-Zell Klonen .......................22 2.1.1 Etablierung von seltenen γδ T-Zell Klonen.....................................................22 2.1.2 Phänotypische Charakterisierung..................................................................23 2.1.3 Funktionelle Charakterisierung mittels Chromium-Release-Assays ..............30 2.1.4 Bestimmung des Zytokinexpressionsprofils der isolierten γδ T- Zellklone .....33 2.2 Immunhistochemie von γδ T-Zellen ......................................................................37 2.2.1 Das Prinzip der Immunhistochemie ...............................................................37 2.2.2 Immunhistochemische Färbemethoden.........................................................38 2.2.3 Immunhistochemischer Nachweis von γδ T-Zellen in Paraffinschnitten.........39 2.2.4 Immunhistochemischer Nachweis von γδ T-Zellen in Gefrierschnitten ..........42 2.3 γδ T-Zell Expansion am Beispiel eines Patienten mit invasivem Thymom und viszeraler Leishmaniose.............................................................................................44 2.3.1 Krankheitsverlauf...........................................................................................44 2.3.2 Untersuchungen zur γδ T Zell Expansion durch Infektion mit L. donovani.....45 2.3.3 Experimentelle Untersuchungen zur Auswirkung einer Stimulation mit Antigenen verschiedener Leishmanien-Stämme auf die T-Zell Proliferation ..........47 2.3.4 Die Funktion von γδ T-Zellen und αβ T-Zellen bei der Proliferation nach Stimulation mit L.donovani-Antigen ........................................................................52 2.4 Etablierung einer Methode zur Analyse des T-Zell-Repertoires: Spectratyping ...58 3 I. Inhaltsverzeichnis 2.4.1 Anwendung der Spectratyping Technologie zur Analyse des γδ T Zell Repertoires von zwei Patienten mit γδ T Zell Expansion ........................................63 3. Diskussion .................................................................................................................70 3.1 Phänotypische und funktionale Charakterisierung von γδ T-Zell Subklassen ......70 3.2 Die Rolle der NK-Rezeptoren in der T-Zell-vermittelten Tumorbekämpfung ........73 3.3 Bestimmung des Zytokinexpressionsprofils der isolierten γδ T- Zellklone............73 3.4 Immunhistochemischer Nachweis von γδ T-Zellen in Paraffin- und Gefrierschnitten ...................................................................................................................................76 3.5 Die Rolle der γδ T-Lymphozyten bei Infektionen und Tumorerkrankungen ..........78 3.6 Analyse des γδ T-Zell Repertoires mittels der Spectratyping-Technologie...........82 4. Material und Methoden ..............................................................................................84 4.1 Material ................................................................................................................84 Plastik- und Einwegartikel...................................................................................84 Geräte.................................................................................................................86 Kits......................................................................................................................87 Medien, Zusätze und Lösungen für die Zellkultur ...............................................87 Chemikalien ........................................................................................................88 Radioaktive Chemikalien ....................................................................................90 PCR-Reagenzien ................................................................................................90 Primersequenzen................................................................................................90 Enzyme für die Immunhistologie, Restriktionsenzyme und –puffer.....................92 Antikörper ...........................................................................................................92 Rezepte für Lösungen und Medien .....................................................................92 4.2 Methoden .............................................................................................................96 4.2.1 Molekularbiologische Methoden ....................................................................96 RNA-Extraktion mittels Phenol/Chloroform .........................................................96 RNA-Extraktion mittels des RNeasy® Mini Kits ...................................................96 Bestimmung der optischen Dichte am Photometer .............................................97 Auftrennung von RNA-bzw. DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese ...........97 Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................97 cDNA-Synthese ..................................................................................................98 DNA-Extraktion mit dem QIAamp® Blood Mini Kit...............................................98 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und RT-PCR..............................................98 4 I. Inhaltsverzeichnis PCRs zur Überprüfung des Ausgangsmaterials .................................................99 Actin-PCR ...........................................................................................................99 Spectrotyping PCRs..........................................................................................100 Run off Reaktionen ...........................................................................................100 Aufreinigung von PCR-Produkten .....................................................................101 Isolierung humaner peripherer Blutlymphozyten aus Buffy Coats und Vollblut.101 Zellzählung .......................................................................................................102 Durchflusszytometrie (FACS) und Zellsorting ...................................................102 Sortierung von Zellen........................................................................................103 Isolierung von γδ T-Lymphozyten aus PBL mittels MACS.................................103 Chromium-Release-Assay ................................................................................104 Chromium-Release-Assay als Screening der etablierten Zell-Klone.................104 Chromium-Release-Assay mit definierten Effektor/Target-Verhältnissen .........105 Proliferations-Assay ..........................................................................................106 Cytometric Bead Array (CBA) ...........................................................................107 EBV-Tansformation...........................................................................................107 Prime Lymphocyte Test ....................................................................................107 Immunhistochemische Methoden .....................................................................108 Fixierung der Zellen und des Gewebes ............................................................108 Einbettung von Zellen und Zellklonen in Paraffin..............................................108 Herstellen von Paraffin- bzw. Gefrierschnitten..................................................109 Hämatoxylin/Eosin-Färbung..............................................................................109 Demaskierungsmethoden für Paraffinschnitte ..................................................110 Kochen der Schnitte in Citratpuffer (pH6) .........................................................110 Kochen der Schnitte in einer basischen Retrieval-Lösung (pH10) ....................111 Enzymatische Vorbehandlungsmethoden.........................................................111 Avidin-Biotin-Färbung .......................................................................................112 5. Abkürzungsverzeichnis............................................................................................114 6. Literaturverzeichnis .................................................................................................116 7. Danksagung ............................................................................................................134 8. Lebenslauf ...............................................................................................................135 9. Erklärungen .............................................................................................................137 5 II. Zusammenfassung II. Zusammenfassung Die Gesamtheit der T-Lymphozyten beinhaltet je nach Expression des T-Zell-Rezeptors zwei spezifische, distinkte Subpopulationen, die der αβ- beziehungsweise der γδ-TLymphozyten. Die Klasse der γδ-T-Lymphozyten, die im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen, stellt eine hochinteressante und bislang wenig erforschte Zellpopulation dar. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der phänotypischen wie molekularen Charakterisierung von γδ-T-Lymphozyten sowie der Aufklärung der Funktionalität in verschiedenen Krankheitsmodellen. Eine erste Charakterisierung zeigte die Expression von aktivierenden und inhibierenden NK-Zellrezeptoren (NKRs) auf der Oberfläche von etablierten γδ-TZell-Klonen, die in einem potentiellen Zusammenhang mit ihrer zytolytischen Aktivität gegenüber unterschiedlichen Tumor-Zelllinien und ihrer Zytokinexpressionsprofile stehen. Immunhistochemische Färbungen des γδ T-Zell-Rezeptors zeigten eine Akkumulierung von γδ T-Zellen in unterschiedlichen Tumorgeweben. Eine immunhistochemische Färbung der γδ T-Zellen in der Diagnostik erleichtert die Tumordiagnose und Tumore könnten vor der Therapie auf ihre Empfindlichkeit gegenüber speziellen Medikamenten getestet werden. Untersuchungen zur Expansion von γδ-T-Zellen im peripheren Blut bei diversen Krankheitsbildern, ihrer Ursache und ihrer Funktion zeigten an einem Beispiel eines Patienten mit invasivem Thymom und viszeraler Leishmaniose, dass Leishmanien-Antigene eine γδ-T-Zell Expansion induzieren können und, die γδ T-Zellen jedoch bei der aktiven Immunabwehr eine Kofunktion in Form einer Induzierung der T-Helfer-Antwort oder in Form einer Zytokin-vermittelten Regulierung der humoralen Immunantwort übernehmen. Die Etablierung der Methode des Spectratyping erlaubt eine detaillierte Analyse des Repertoires der einzelnen T-Zell-Rezeptor-Ketten, wobei minimale Veränderungen des Repertoires und der Klonalität der Zellen deutlich nachzuweisen sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte diese grundlegende Plattformtechnologie erstmalig im Labor etabliert werden und kann als Ausgangspunkt für weiterführende Forschungsprojekte genutzt werden. 6 1. Einleitung 1. Einleitung 1.1 Das Immunsystem Das komplexe Immunsystem der Säugetiere besteht aus zellulären und humoralen Komponenten, deren Aufgabe es ist, den eigenen Organismus vor körperfremden Substanzen, wie Toxinen und infektiösen Krankheitserregern, wie Bakterien, Protozoen, Pilzen, Viren und Parasiten zu schützen. Darüber hinaus kontrolliert das Immunsystem die Abwehr von körpereigenen Zellen, die Defekte in der Proliferationskontrolle aufweisen und zur Bildung von Tumoren führen. Das System basiert auf der Diskriminierung zwischen körpereigen und körperfremd (von Boehmer and Kisielow, 1990). Es unterscheidet konzeptionell und mechanistisch zwischen angeborener und erworbener Immunität. Die angeborene, unspezifische Immunität ist phylogenetisch älter und bildet die erste Verteidigungslinie des Organismus. Die Induktion der unspezifischen Immunität, die gegen mikrobielle Erreger und deren Bestandteile gerichtet ist, verläuft sehr schnell, ist jedoch unangepasst und unabhängig von einem früheren Erregerkontakt. Unterschiedliche Zelltypen des hämatopoetischen Systems, wie Phagozyten, neutrophile Granulozyten und Natürliche Killerzellen (NK) sowie lösliche Faktoren (Zytokine) und Bestandteile des Komplementsystems vermitteln dabei die erste Abwehr. Die erworbene oder adaptive Immunität, erstmals bei Wirbeltieren zu finden ist, zeichnet sich durch Antigenspezifität, einer Vielzahl an Rezeptoren, einem Gedächtnis und einer Selbst-Fremd-Erkennung aus. Die Grundlage dafür bilden Zellen des lymphatischen Systems, die T- (Thymus) und B-(bursa fabricii) Lymphozyten. Sie entwickeln sich aus gemeinsamen Vorläuferzellen, die sich ihrerseits aus pluripotenten hämatopoetischen Stammzellen entwickelt haben (siehe Abbildung 1.1). Die B-Lymphozyten reifen im Knochenmark heran und bilden durch Produktion und Sekretion von Antikörpern die humorale Immunantwort (Reth, 1992). Die T-Lymphozyten reifen im Thymus und stellen das zelluläre Abwehrsystem des Körpers dar (Fehling and von Boehmer, 1997). Das adaptive Immunsystem kann auch effizient gegen pathogene Organismen vorgehen, die resistent gegenüber der angeborenen Abwehr sind. 1. Einleitung Abbildung 1.1: Zellen der Immunabwehr (nach Silbernagel) 8 1. Einleitung 1.2 T-Lymphozyten Die T-Zellen stammen aus dem Knochenmark und durchlaufen mehrere Genumordnungen in einem spezialisierten Mikromilieu, um einen einheitlichen Antigenrezeptor auf jeder Zelle zu produzieren. Sie differenzieren jedoch nicht im Knochenmark sondern wandern in einem sehr frühen Stadium in den Thymus, welches das für die Rekombination der Rezeptorgene und die Reifung der T-Zellen benötigte Mikromilieu bietet. Während ihrer Proliferation und Reifung zu T-Zellen durchlaufen die Thymocyten eine Reihe von Schritten, die durch Veränderungen im Zustand der T-Zell-Rezeptorgene gekennzeichnet sind. Bei reifen T-Zellen unterscheidet man zwei Hauptgruppen. Zur ersten Gruppe zählen die CD4-positiven (CD4+) T-Zellen, die das Corezeptormolekül CD4 auf ihrer Oberfläche exprimieren. Die zweite Gruppe bilden die CD8 positiven (CD8+), die das Corezeptormolekül CD8 exprimieren. Die Zellen erfüllen unterschiedliche Aufgaben: CD4positive T-Zellen sind darauf spezialisiert, als sog. T-Helferzellen regulativ bei der Stimulierung immunkompetenter Zellen mitzuwirken und durch die Produktion und Sekretion hormonähnlicher Proteine (Zytokine) Makrophagen und B-Zellen zu aktivieren (Klein, 1991). Im Gegensatz dazu werden Zellen, die mit Viren oder Bakterien infiziert oder entartete körpereigene Zellen durch zytotoxische T-Zellen, den CD 8-positiven TZellen eliminiert. Zytotoxische CD8-Zellen töten infizierte Zellen mittels diverser zytologischer Methoden ab und verhindern so eine weitere Vermehrung intrazellulärer Krankheitserreger. Die CD4+ T-Zellen lassen sich auf Grund des Expressionsmusters ihrer Zytokine in weitere Untergruppen einteilen (Lin et al., 1993; Mosmann and Coffman, 1989). CD4+ Entzündungszellen (TH1-Zellen) sind darauf spezialisiert, Makrophagen oder CD8+ TZellen zu aktivieren, die dann intrazelluläre Bakterien besser eliminieren können. Sie sezernieren Interleukin-2 (IL-2), Interferon-γ (IFN-γ) und Tumor-Nekrose-Faktor-β (TNFβ). CD4 T-Helferzellen (TH2-Zellen) regen antigenbindende B-Zellen dazu an, zu antikörperproduzierenden Zellen zu differenzieren. Sie produzieren selektiv die Zytokine IL4, -5, -6 und –10 (Mosmann and Coffman, 1989). Änderungen der Zelloberflächenmoleküle erlauben eine Unterscheidung von Thymocytenpopulationen verschiedener Reifungsstadien. 9 1. Einleitung 1.3 Der humane T-Zellrezeptor T-Zellen erkennen ihr Antigen, ein Peptidfragment, das in den äußeren Domänen des MHC, die eine spaltartige Grube ausbilden, gebunden ist, mit ihrem T-Zell Rezeptor (TCR). Der TCR besitzt eine konstante und eine variable Domäne. Die variable Domäne erkennt spezifisch das Antigen in Form eines kurzen Peptidfragments, das durch den Abbau von Antigenen innerhalb der Zielzelle entstanden ist. Abbildung 1.2: Strukturelle Einzelheiten des T-Zell-Rezeptors (nach Janeway) Peptidbindende, körpereigene Glykoproteine, die MHC-Moleküle (major histocompatibility complex) binden diese Fragmente innerhalb der Zielzellen und transportieren sie als Peptid/MHC_Komplex an die Zelloberfläche. Reife zirkulierende T-Lymphozyten exprimieren an ihrer Oberfläche den T-Zellrezeptor, der diesen Komplex auf der Antigenpräsentierenden Zelle erkennt. MHC-Proteine werden in einer chromosomalen Region codiert und haben auf ihrer Oberfläche eine Vertiefung, die ein aus dem Fremdprotein stammendes Peptidfragment bindet. Der TCR wird zusammen mit Proteinen des CD3-Komplexes auf der Oberfläche der TZellen exprimiert, da keine der Ketten des T-Zellrezeptors eine große zytoplasmatische 10 1. Einleitung Domäne besitzt, die dazu dienen könnte, der Zelle zu signalisieren, dass der TZellrezeptor ein Antigen gebunden hat. Der T-Zellrezeptor definiert die AntigenSpezifität der Zelle, während der CD3-Komplex für den Transport des Gesamtkomplexes an die Zelloberfläche und für die Signaltransduktion (Kearse et al., 1994; Kearse et al., 1995) nach Aktivierung der Zelle verantwortlich ist. Abbildung 1.3: Schematische Darstellung des T-Zell-Rezeptor : CD3-Komplexes (nach Janeway) Der CD3-Komplex besteht aus drei transmembralen Proteinen (CD3γ, CD3δ und CD3), die eine Homologie zu den Immunglobulinen aufweisen, sowie den dimeren ζKetten, die mit dem TCR an der Plasmamembran assoziiert sind. Die CD3-Proteine sowie die ζ-Kette sind für die Expression des TCR an der Zelloberfläche wichtig. Sie besitzen einen extrazellulären Immunglobulinanteil. Die ζ-Ketten bilden ein Dimer, das über Disulfidbrücken stabilisiert wird. Die ζ-Ketten Dimere sind nichtkovalent mit dem TCR und dem CD3-Komplex assoziiert. Der CD3-Komplex besteht aus je einem CD3γεHeterodimer, einem CD3δε-Heterodimer und einem CD3ζζ-Homodimer. Die Untereinheiten des CD3-Komplexes besitzen spezielle Sequenzmotive, die ImmunrezeptorTyrosin-Aktivatorsequenzen (immuno tyrosine-based activation motifs, ITAMs). Die Tyrosinreste der ITAMs werden nach TCR-Aktivierung phosphoryliert und können dann durch zytoplasmatische Signalmoleküle erkannt werden. Allein diese ITAM-Motive ermöglichen es dem TCR-Komplex nach Stimulierung des TCR durch Antigene mit zytosolischen Proteintyrosinkinasen zu assoziieren und so das Signal in das Zellinnere zu übertragen. 11 1. Einleitung 1.4 Die genetische Organisation des T-Zell Rezeptors In den frühen Stadien der Thymocytenreifung durchlaufen die Gene für die T-ZellRezeptoren eine genau festgelegte Abfolge von Umordnungen, die große Mengen an unreifen T-Zellen hervorbringen, von denen jeder Rezeptor eine einzige Spezifität exprimiert. Abbildung 1.4: Entwicklungsstadien von γδ- Und αβ- T-Zellen (nach Janeway) 12 1. Einleitung Erbliche Grundlage der TCR-Diversität sind die zahlreichen Gensegmente, welche die TCR-Ketten codieren. Die Gensegmente für die variablen (V), joining- (J), diversity- (D) und konstanten (C) Bereiche der TCR sind getrennt in drei Loci angeordnet, den so genannten α-/δ-, β- und γ-Loci. Die Umstrukturierung von zwei Rezeptorgensätzen ergibt zwei unterschiedliche T-Zell-Linien. Eine exprimiert αβ- (αβ-TCR) und die andere γδRezeptoren (γδ-TCR). Im peripheren Blut stellen T-Zellen mit αβ-TCR mit einem Anteil von 95% an der Gesamtpopulation eine deutliche Mehrheit dar. Dagegen exprimieren 1-10 % der T-Lymphozyten im peripheren Blut gesunder Spender den γδ TCR. Die Gene für die α-Kette des TCR sind beim Menschen auf Chromosom 14 (14q11) lokalisiert. Der Locus besteht aus 70 Vα- und 61 Jα-Genen und nur einem cα-Gen (Janeway and Travers, 2001). Zwischen der Vα- und der Jα-Region liegt der δ-Locus für die δ-Kette des γδ TCR. Die Gene für die β-Kette liegen auf Chromosom 7 und umfasst 600 kb. Im β-Locus gibt es 52 funktionelle Vβ-Segmente, die in einiger Entfernung von zwei getrennten Clustern liegen, die jeweils ein Dβ-, 6-7 Jβ- sowie ein Cβ-Gensegment enthalten. Jedem Vα- bzw. Vβ-Segment steht eine leader- (L) Sequenz voran, die das Protein für den Transport an die Zelloberfläche ins endoplasmatische Reticulum (ER) dirigiert. Während der Entwicklung der Thymocyten werden durch zufällige somatische Rekombination der separaten V-, J-, bzw. V-, D-, J- Gensegmente diverse TCRα- bzw. β-Kettengene gebildet. Bei der α-Kette rekombinieren zunächst ein Vα-und ein JαSegment, wodurch bei produktiver Umlagerung ein funktionelles Exon entsteht. Transkription und Spleißen des VJα-Exons an Cα bilden die mRNA, die translatiert wird. Bei der Umordnung der β-Ketten rekombinieren zunächst ein Dβ- und ein JβSegment. Anschließend wird durch Rekombination eines DJβ- und eines VβSegmentes ein funktionelles Exon gebildet, das transkribiert und an Cβ gespleißt wird. Die entstandene mRNA wird zur TCRβ-Kette translatiert. Die Variabilität an den Verknüpfungsstellen wird durch zufälliges Entfernen und Einfügen von Nukleotiden erhöht. Die zufällige Kombination der verschiedenen α- und β-Ketten zu TCR-Heterodimeren trägt zur Entstehung vielfältiger TCR bei. Die höchste Variabilität ist bei T-Zellen innerhalb der dritten komplementaritätsbestimmenden Region (complementary determing region 3, CDR3) zu finden, die das Zentrum 13 1. Einleitung der Antigenbindungsstelle bildet. Die CDR3-Region wird von D- und J-Gensegmenten und den zufällig eingefügten Nukleotiden kodiert. Zusätzlich trägt die in allen drei Leserahmen mögliche Translation der D-Region zur Erhöhung der Diversität des TCR bei (Meier and Lewis, 1993). Abbildung 1.5: TCR Rearrangement. Die Gene für die variablen Domänen werden durch somatisches Rearrangement aus Vα α- und Jα αGenen im Falle der α-Kette und aus Vβ β-, Dβ β-, Jβ β-Genen im Falle der β-Kette gebildet. Die rekombinierten V-(D)-J-Regionen von α- und β-Kette werden erst nach der Transkription durch Spleißen mit dem C-Segment verknüpft. Die Organisation der γ- und δ- Ketten-Gene ähnelt derjenigen der α- und β-KettenGene. Der humane TCR γ-Locus befindet sich auf dem Chromosom 7p14-p15 und umfasst zwei konstante Regionen, Cγ1 und Cγ2 (Lefranc M.-P. et al., 1985). Das Cγ1-Gen besitzt drei Exone. Exon 3 kodiert die transmembrane und cytoplasmatische Domäne der TCR γ-Kette. Zu Cγ1 gehören drei, zu Cγ2 zwei J-Segmente, welche für 16-20 Aminosäuren der rearrangierten variablen Region kodieren. Der TCR γ-Locus umfasst 14 V-Regionen mit acht potentiell aktiven Genen und sechs Pseudogenen. Der Genkomplex, der die δ-Kette codiert, befindet sich vollständig innerhalb des Genkomplexes für die T-Zell Rezeptor-α-Kette zwischen den Vα- und Jα-Segmenten 14 1. Einleitung (Greisser H. et al., 1988). Aufgrund dessen zerstört jede Umordnung der α-Kettengene die Gene für die δ-Ketten. Dieser Komplex besteht aus acht V-, drei J-, drei D- und ein C-Segment. An den Verknüpfungsstellen bei der Rekombination wird durch zufälliges Entfernen und Einfügen von Nukleotiden eine hohe Junktionsdiversität des TCR γδ erzielt, die die Diversität des αβ TCR übersteigt. Die Nukleotide liegen in der CDR3, die für die Bindung von Peptiden an den TCR verantwortlich sind. Die Vδ-Gene können auch als Vα-Gene zu Cα rekombinieren. Der TCR δ-Locus wird bei der Rekombination Vα-Jα aus dem Genom entfernt (Chien Y. et al., 1987) was verhindert, daß T-Zellen sowohl den TCR αβ als auch den TCR γδ exprimieren. Der humane TCR γδ existiert in Abhängigkeit von der γ-Kette in drei Formen. Der γ1-δ TCR, dessen γ1-Kette mit einer Disulfidbrücke mit der δ-Kette verbunden ist und zwei weitere Formen, deren Ketten durch eine Duplikation oder Triplikations eines Exons des Cγ1-Gens charakterisiert ist und mangels eines Cysteins nicht in der Lage sind, Disulfidbrücken zu bilden. 1.5 αβ T-Lymphozyten Die αβ T-Lymphozyten exprimieren auf ihrer Oberfläche den αβ-T-Zellrezeptor, der ein Heterodimer aus zwei verschiedenen membranständigen und glykosilierten Polypeptidketten, einer α-Kette und einer β-Kette darstellt. Die beiden Ketten sind durch Disulfidbrücken miteinander verbunden. Die αβ-Heterodimere sind für die Antigenerkennung aller funktionaler Klassen von T-Zellen verantwortlich (Bentley and Mariuzza, 1996). Die αβ T-Zellen unterteilen sich in CD4+ oder CD8+ T-Zellen. Zu den CD4+ T-Zellen gehören sowohl TH1- als auch TH2-Zellen. Die Entwicklung ist abhängig von der Expression der Zytokine zum Zeitpunkt der Antigenerkennung. TH1-und TH2-Zellen unterscheiden sich in ihrem Zytokinprofil. TH1-Zellen produzieren hauptsächlich IFN-γ und induzieren bevorzugt zelluläre Immunität. Sie aktivieren v.a. Makrophagen, die Antigene auf den MHC Klasse II-Molekülen präsentieren. TH2-Zellen zeichnen sich durch die Produktion von IL-4 und IL-5 aus und bevorzugen die Aktivierung der humoralen Immunität. 15 1. Einleitung Die CD8+ T-Zellen sind als zytotoxische T-Zellen (CTLs) v.a. für die Eliminierung von virusinfizierten Zellen verantwortlich. Dies geschieht mittels Apoptose, die durch Perforine, Granzyme und durch die Signaltransduktion über den Fas-Liganden (CD95L) hervorgerufen wird. Die CTLs lysieren ihre Zielzellen nach Erkennung fremder Peptide, die in den Zielzellen synthetisiert werden (virale Antigene, Tumorantigene). Die αβ TLymphozyten zirkulieren im Blut und in den lymphatischen Organen. Treffen diese mit ihrem TCR auf ein Antigen, das auf MHC-Molekülen von Antigenpräsentierenden Zellen (APCs) präsentiert wird, kommt es zur Aktivierung („priming“) der T-Lymphozyten. Dabei erkennen naive CD8+ T-Zellen ihr Antigen auf MHC Klasse I-Molekülen, welche auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert werden, wobei für CD4+ T-Zellen das Antigen an MHC Klasse II-Moleküle gebunden sein muss, die vorwiegend auf APCs zu finden sind. Diese MHC-Restriktion wurde zum ersten Mal 1974 von Peter Doherty und Rolf Zinkernagel gezeigt. 1.6 γδ T-Lymphozyten Die γδ T-Zellen gehen wie die αβ T-Zellen aus Vorläuferzellen des hämatopoetischen Systems hervor. Sie unterscheiden sich jedoch in ihrer Spezifität, im Expressionsmuster der CD4- und CD8-Corezeptoren und in ihrer anatomischen Verteilung voneinander. Nur etwa 1-10 % der T-Lymphozyten im peripheren Blut gesunder Spender exprimieren den γδ TCR. γδ T-Zellen sind auch bei anderen Spezies vorhanden. Dies deutet darauf hin, dass γδ T-Zellen eine spezifische Rolle im Immunsystem zukommt. Diese kleine Lymphozytenpopulation ist anders als die meisten T-Zellen nicht MHC restringiert und exprimiert weder in der Maus noch im Menschen CD4 oder CD8 Corezeptoren. Ihnen wird eine bedeutende Rolle im Immunsystem als „first line of defense“ sowie ein starkes immunmodulatorisches Potential zugeschrieben. Während der Embryonalentwicklung werden zuerst T-Zellen gebildet die den γδ TCR exprimieren (siehe Abbildung 1.6). Die Umordung der γ- und δ-T-Zell-Rezeptorgene verläuft in Wellen von Zellen, die verschiedene V-Gensegmente exprimieren, jedoch exprimieren alle Zellen einer Welle dieselben Vγ- und Vδ-Sequenzen und dieselbe JRegionen, und besitzen dieselbe Spezifität. N-Nukleotide steuern keine zusätzliche 16 1. Einleitung Vielfalt bei weil in diesen frühen T-Zellen die terminale Desoxynucleotidyltransferase fehlt. Abbilddung 1.6: Zeitlicher Verlauf der Umordnung der γ- und δ-T-Zell-Rezeptorgene Die erste Welle der γδ T-Zellen (Vγ5-Zellen) haben ihr Ziel in der Epidermis, dagegen siedeln sich die Zellen der zweiten Welle (Vγ6-Zellen) in der Epidermisschicht des Fortpflanzungstraktes an. Nach der Geburt dominiert die Linie der αβ T-Zellen. 6 verschiedene Vγ-Gene (γ2, γ3, γ4, γ5, γ8, γ9) und mindestens 3 bekannte Vδ-Gene (δ1, δ2, δ3) werden exprimiert um einen funktionalen TCR zu konstruieren (Kabelitz et al, 1999). Bekannt sind auch die δ-Ketten Vδ4, δ5 und δ6, die jedoch kaum bei funktionalen TCRs exprimiert werden. Die unterschiedlichen TCR Vγ/Vδ Elemente werden nicht zufällig rearrangiert. Humane γδ T-Zellen sind in nahezu allen Geweben zu finden. Im peripheren Blut und in den Lymphknoten stellen sie die Minderheit der T-Lymphozyten dar, selten findet man sie in Lymphknoten und in der Milz. Im Gegensatz dazu findet man γδ T-Zellen reichlich im Darm, in der Haut, in der Zunge, im Oesophagus, in der Lunge und in Epithelien des Genitalbereichs. In den unterschiedlichen Geweben findet man jedoch nicht überall dieselbe Unterklasse. Im periheren Blut exprimiert die Mehrheit der γδ T-Zellen die VRegionen Vγ9 und Vδ2. Alle γδ Rezeptoren, die die Vγ9- und Vδ2-Ketten coexprimieren sind mit einer Disulfidbrücke verbunden. Sie erkennen nicht-peptidische Phosphoantigene (Hayday et al, 2000), die zuerst in bakteriellen Extrakten gefunden wurden. In 17 1. Einleitung intraepitheliaren Lymphozyten der Darmschleimhaut hingegen dominiert der Vδ1Subtyp gegenüber der Vδ2 Klasse (Deusch et al. 1991). Auch im humanen Nabelschnurblut und im Thymus dominiert der Vδ1 Subtyp. Die Funktion humaner γδ T-Zellen ist weitestgehend noch unklar. Man entdeckte, dass γδ T-Zellen Zellen nach Aktivierung mit IL-2 starke MHC-unrestringierte Zytotoxizität zeigen, vergleichbar mit NK-Zellen. Daher könnten diesen Zellen eine Rolle bei der Tumorabwehr zukommen. Ebenso fand man γδ T-Zellen, die eine starke Alloreaktivität zeigen (Ciccone et al., 1988, 1989). Die γδ T-Zellen, die eine Alloreaktivität zeigten gehörten alle zur Vδ1 Unterklasse. γδ T Zellen des Vγ9/δ2 Subtyps stellen die Hauptgruppe der γδ T-Zellen dar und spielen eine Rolle in der Abwehr gegen intrazelluläre Pathogene und gegen maligne Bluterkrankungen (Kaufmann and Kabelitz, 1991). Aktivierte γδ T-Zellen sind in der Lage, Myelom- und Lymphomzelllinien in vitro zu lysieren (Fisch et al., 2000). Eine hohe Anzahl von Vγ9/δ2 T Zellen wurde bei genesenen Patienten der akuten Leukämie nach einer Knochenmarkstransplantation gefunden (Haas et al., 1993). Die Klasse der Vδ1 TZellen findet man hauptsächlich in epithelialen Geweben wo diese Zellen verantwortlich sind für die erste Abwehr von Infektionen und malignen Erkrankungen (Triebel F. and Hercend T. 1989). Eine große Anzahl der γδ T-Zellen exprimiert auf ihrer Oberfläche einen oder mehrere KIR Moleküle (killer cell immunglobulin receptor). KIR Moleküle wurden erstmals auf der Oberfläche von Natürlichen Killerzellen (NK) als Liganden für bestimmte MHC Klasse I Allele entdeckt (Lanier LL, 1998). KIRs arbeiten nach dem „missing self“-Prinzip, d.h. sie vermitteln den Zell-Zell-Kontakt und schützen somit körpereigene Zellen vor einer Zytolyse durch zytotoxische T-Zellen oder NK-Zellen. γδ T-Zellen sind wie αβ T-Zellen in der Lage eine große Anzahl von Zytokinen zu produzieren. Sie sezernieren IFN-γ und TNF-α und hemmen auf diesem Weg das Parasitenwachstum bevor eine antikörpervermittelte Immunantwort zur Parasitenbekämpfung bereit steht. Neuere Studien haben gezeigt, dass Vγ9Vδ2-T-Zellen auch fähig sind zur 18 1. Einleitung spezifischen Immunantwort im Sinne des immunologischen Gedächtnisses. Es ist möglich, dass sie hiermit eine Brücke zwischen angeborener und erworbener Immunität bilden (Shen et al.2002). 1.7 Auftreten von humanen γδ T-Zellen bei Erkrankungen Anhäufungen von γδ T-Zellen im peripheren Blut und in Geweben wurden bei verschiedenen Krankheiten beobachtet. Bei viralen oder bakteriellen Infektionen, bei allergischen Luftwegsentzündungen ebenso wie in Hautläsionen von Patienten mit tuberkulöser Lepra, kutaner Leishmaniose und im Blut von Patienten mit Malariainfektionen (Haas et al., 1993). Veränderungen im γδ T-Zell Repertoire beobachtet man auch bei Patienten mit Virusinfektionen und mit Immundefizienzerkrankungen (Haas et al. 1993). Im Blut von Patienten mit EBV-Infektionen findet man Anhäufungen von γδ T-Zellen ebenso wie im peripheren Blut von HIV-infizierten Personen. Jedoch findet man hier eine Anhäufung von Vδ1 T-Zellen bei gleichzeitiger Abnahme der Vδ2-Population (Autran B. et al., 1989; Boullier S. et al., 1995). Während noch unklar ist, ob der Anstieg der Vδ1 TZellpopulation bei einer HIV-Infektion auf eine spezifische Rolle dieser Zellen bei der Immunabwehr hinweist, ist es interessant zu beobachten, dass Vδ1 T-Zellen von HIVinfizierten Spendern durch EBV-transformierte lymphoblastoide Zelllinien von AIDS Patienten, nicht aber von gesunden Spendern stimuliert werden. Dies könnte auf eine Verbindung zwischen der T-Zell Expansion und der chronischen B-Zell Aktivierung während der Progression zu AIDS hindeuten (Hyjek et al., 1997). Eine große Rolle spielen γδ T-Zellen bei Autoimmunkrankheiten. Bei Patienten mit rheumatoider Arthritis finden sich γδ T-Zellen in der synovialen Flüssigkeit (Meliconi et al., 1991). Bei Patienten mit multipler Sklerose (MS) wurden in Läsionen und in der zerebrospinalen Flüssigkeit γδ T-Zellen identifiziert. Eine funktionale Rolle dieser Zellen in MS basiert auf der Entdeckung, dass γδ T-Zellen in vitro von Gliazellen und lysierten Oligodendrozyten aktiviert werden können (Freedman MS et al., 1991; 1997). 19 1. Einleitung Vδ1 T-Zellen akkumulieren im Dünndarmepithel von Patienten mit Darmerkrankungen und innere Organerkrankungen wie Morbus Krohn und Zöliakie (McVay et al., 1997). Es ist jedoch nicht bekannt welche Antigene an der Expansion der Vδ1 T Zellen beteiligt sind. Da aktivierte γδ T-Zellen eine große Anzahl an transformierten Zellen lysieren ist es möglich, dass γδ T-Zellen an der Immunabwehr gegen Tumorzellen beteiligt sind. Man findet γδ T-Zellen zwischen tumor-infiltrierten T-Lymphozyten (TIL) bei Patienten mit Lungentumoren (Zocchi et al., 1994), Dickdarmkarzinomen (Watanabe et al., 1995), Mammakarzinomen (Bank et al. 1993) und anderen Tumorerkrankungen. Die Antigene, die an der Immunabwehr beteiligt sind, sind unbekannt, jedoch spielen Hitzeschockproteine (hsp) und stressinduzierte Antigene eine Rolle bei der Erkennung durch γδ T Zellen. 1.8 Ziele der Arbeit Die Klasse der γ/δ-T-Lymphozyten, die im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen, stellt eine hochinteressante und bislang wenig erforschte Zellpopulation dar. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der phänotypischen wie molekularen Charakterisierung von γ/δ-TLymphozyten sowie der Aufklärung der Funktionalität in verschiedenen Krankheitsmodellen. Zur Charakterisierung der γδ-T-Lymphozyten sollen γδ-T-Zell-Klone etabliert werden, die auf die Expression verschiedener NK-Rezeptoren und auf ihr Lyseverhalten gegenüber unterschiedlicher Tumorzelllinien untersucht werden sollen um mögliche Zusammenhänge zu ermitteln. Anhand von Patienten mit einer γδ T-Zell-Expansion soll die Rolle der γδ-TLymphozyten mittels unterschiedlicher Methoden in verschiedenen Krankheitsmodellen beleuchtet werden. Dies beinhaltet die immunhistochemische Färbung von Gewebeschnitten mittels eines spezifischen γδ-T-Zell-Antikörpers und die Etablierung der Spectratyping-Technologie, die der Analyse des T-Zell Repertoires durch eine geschickte Kombination PCR-basierter Ansätze mit anschließender Analyse an einem DNA20 1. Einleitung Sequenzer dient. Minimale Veränderungen des T-Zell-Repertoires und der Klonalität der Zellen sind hiermit deutlich nachzuweisen. In dieser Arbeit sollen zusätzlich Untersuchungen zur Expansion der γ/δ-T-Zellen, ihrer Ursache und der Funktion an einem Beispiel eines Patienten mit invasivem Thymom und viszeraler Leishmaniose durchgeführt werden. 21 2. Ergebnisse 2 Ergebnisse 2.1 Etablierung und Charakterisierung von seltenen γδ T-Zell Klonen 2.1.1 Etablierung von seltenen γδ T-Zell Klonen Als Ausgangspunkt für eine Charakterisierung der γδ T-Zell Subpopulationen wurden stabile T-Zell Klone aus frischen humanen peripheren Blutlymphozyten (PBL) gesunder Spender etabliert. Zur Generierung der γδ T-Zell Klone wurden die PBL über einen Ficoll-Gradienten isoliert. Von den so gewonnenen PBL wurden jeweils zwei Millionen Zellen mit spezifischen Antikörpern der Subpopulationen Vγ2,3,4; Vγ4; Vγ3,5; Vγ8 und Vγ9-Antikörpern eine Stunde bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen gewaschen und die Zellen mit einem sekundären FITC gekoppelten anti-Maus IgG1 F’ab Antikörper markiert. Die Zellen wurden am MoFlo®-Cytometer der Firma Dako Cytomation sortiert. Die FITC-fluoreszierenden Zellen, welche die γδ T-Zell-Subpopulationen des Spenders darstellen, wurden aufgefangen und in T-Zell-Medium klonal auf 96-well-Platten ausplattiert. Als Feeder Zellen wurden bestrahlte periphere PBL und LCL (Lymphoid Cell Line 721) verwendet. Die γδ T-Zell-Klone wurden nach etwa zwei Wochen von einem auf sechs Wells einer 96-Well-Platte expandiert. Es wurden ausschließlich Zellklone expandiert, bei denen das charakteristische Wachstum der γδ T-Zellen zu sehen war. Eine Übersicht der etablierten und zur Analyse expandierten γδ T-Zell Klone ist in Tabelle 2.1 dargestellt. γδ- Subtyp Anzahl der Klone Vγ2,3,4 2 Vγ4 14 Vγ5 10 Vγ8 2 Vγ9 2 22 2. Ergebnisse Tabelle 2.1: Übersicht der etablierten und zur Analyse expandierten Klone Mittels eines Ficollgradienten wurden PBL von gesunden Spendern isoliert, mit spezifischen Vγγ2,3,4; Vγγ4; Vγγ3,5; Vγγ8 und Vγγ9-Antikörpern, anschließend am MoFlo®-Cytometer sortiert und klonal ausplattiert. Dann wurden die Zellklone expandiert, bei denen das charakteristische Wachstum der γδ T-Zellen zu sehen war. 2.1.2 Phänotypische Charakterisierung Um die derart etablierten T-Zell Klone phänotypisch zu charakterisieren wurde die Expression der γδ-Ketten mittels FACS-Analysen überprüft. FACS Analysen von zwei repräsentativen γδ T-Zell Klonen sind in Abbildung 2.1 dargestellt. Abbildung 2.1: FACS-Analysen der etablierten γδ-T-Zell Klone. 23 2. Ergebnisse Mittels eines spezifischen anti-γδ-T-Zell-Antikörpers wurden die Klone auf die Expression des γδ T-Zell-Rezeptors auf der Oberfläche untersucht. Es wurden ausschließlich die Klone expandiert, die eine Expression dieses Rezeptors auf ihrer Oberfläche zeigten. Die Klone, die eine Expression der γδ-Ketten zeigen wurden weiter expandiert, um ausreichend Zellen für weitergehende phänotypische und funktionelle Analysen zu haben. Zur Charakterisierung der Zellklone wurde zuerst die Spezifität der Vδ-Kette bestimmt. Dazu wurden die Klone mit den spezifischen Antikörpern anti-Vδ1, anti-Vδ2 und antiVδ3 gefärbt und am FACS-Gerät von Becton&Dickinson analysiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2.2 und 2.3 zusammengefasst. Eine wichtige Rolle für die Regulation der T-Zell Funktion spielt die Expression von NKZellrezeptoren (NKRs) auf der Oberfläche der T-Zell Populationen. Diese Rezeptoren können die zytolytische Aktivität der NK- bzw. T-Zellen aktivieren oder inhibieren. Die NKRs gehören zu der Immunglobulin-Superfamilie und sind verantwortlich für NK-ZellAktivierung bei der natürlichen Zytotoxitität. Die Expression dieser Rezeptoren kann mittels Sekretion von Zytokinen auf die Antigen-Abwehr und die Immunantwort Einfluß nehmen. NKRs werden normalerweise auf ca. 5% der peripheren Blutlymphozyten exprimiert (Raulet et al., 2001). Es ist bekannt, dass CD8+ TCRαβ T-Zellen NK- Zellrezeptoren auf ihrer Oberfläche exprimieren, während eine Expression auf der Oberfäche von CD4+ T-Zellen äußerst selten ist (Coles et al., 2000). Eine Expression von NKRs sieht man auch bei nichtkonventionellen T-Zell Populationen wie γδ T-Zellen intraepithelialen Lymphozyten und NKT-Zellen. Die NK-Rezeptoren lassen sich in drei unterschiedliche Gruppen einteilen. Die aus der Immunoglobulin Superfamilie stammenden Killercell Immunoglobulin Receptors (KIR) bestehen aus zwei oder drei extrazellulär immunglobulinähnlichen Domänen. Sie sind als CD158 in der Cluster-ofdifferentiation Nomenklatur aufgeführt und erkennen MHC-Klasse I Allele (HLA-A, -B, C) spezifisch (Dohring et al., 1996) (Wagtmann et al., 1995). Man unterscheidet zwei unterschiedliche Gruppen der KIR-Rezeptoren, zum einen die aktivierenden und zum anderen die inhibierenden KIR-Rezeptoren. Unterschiede in der transmembranären und der zytoplasmatischen Domäne verursachen die Inhibition oder Steigerung der zytotoxischen Aktivität obwohl die Rezeptoren an identische MHC-Klasse I Allele gebunden haben (Biassoni et al., 1996). 24 2. Ergebnisse Durch C-Typ Lectin extrazelluläre Domänen charakterisiert sich eine zweite Familie von NK-Zellrezeptoren, die MHC-Klasse I Moleküle erkennen können. Diese Heterodimere setzen sich aus einer CD94 Untereinheit und einer kovalent gebundenen Kette zusammen. Sie sind auf den Genen des C-Typ Lectin der NKG2 Familie kodiert (Lanier, 1998). CD94 geht aus einem monomorphen Gen hervor, für eine intrinsische Signaltransduktionskapazität fehlt jedoch die zytoplasmatische Domäne (Chang et al., 1995). Die extrazellulären und zytoplasmatischen Domänen sind strukturell verschieden, was sich auch in Unterschieden der Ligandenerkennung und der Signaltransduktion bemerkbar macht (Plougastel et al., 1996). CD94 Homodimere wurden beschrieben, ihre physiologische Funktion ist jedoch nicht definiert (Lopez-Botet et al., 1998). Vier Rezeptoren der NKG2-Familie mit zugehörigen Genen wurden charakterisiert: NKG2A (mit Splicevariante NKG2B), NKG2C, NKG2E (mit Splicevariante NKG2H) und NKG2F. CD94/NKG2 Heterodimere werden ausschließlich von NK-Zellen und zytotoxischen T-Lymphozyten exprimiert, sie erkennen HLA-E, welches Leaderpeptide der MHC-Klasse I gebunden hat (Aramburu et al.,1990). Von den C-Typ Lectin NKZellrezeptoren wirkt nur der CD94/NKG2A inhibitorisch, alle anderen Heterodimere wirken aktivierend. Aktivierende KIRs und CD94/NKG2 Rezeptoren sind essentiell für die Vermittlung der Zytotoxizität gegenüber MHC-Klasse I tragenden Zellen; die Vermittlung der Zytotoxizität gegenüber MHC-Klasse I negativen Zielzellen hingegen erfolgt über andere aktivierende Rezeptoren. Eine Reihe MHC-Klasse I unspezifischer, aktivierender Rezeptoren ist bekannt, wobei diese eher co-stimulatorisch wirken als direkt stimulierend. Diese Rezeptoren stellen die Gruppe der Natural Cytotoxicity Receptors (NCRs) dar (Moretta et al., 2000). Drei NCRs (NKp46, NKp44 sowie NKp30) wurden bis heute spezifiziert. In dieser Arbeit wurden die unter 2.1 beschriebenen seltenen Subpopulationen der γδ TZellen auf die Expression diverser NKRs untersucht. Um die Expression der NKRezeptoren zu untersuchen und einen potentiellen Zusammenhang zwischen den Expressionsprofilen unterschiedlicher NK-Zellrezeptor-Familien herzustellen, wurde die Expression der aktivierenden (NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46) und inhibitorischen (CD94, NKG2A, CD158a=2DL1=p58.1, CD158b=DL2/3=p58.2, CD158k=3DL2=p140) NK-Zell-Rezeptoren mittels FACS-Analysen an einem Gerät von Becton&Dickinson a25 2. Ergebnisse nalysiert. Für die Rezeptoren existieren teilweise mehrere Nomenklaturen. Es wurde eine einheitliche Darstellung gewählt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2.2 und 2.3 dargestellt. Tabelle 2.2: Phänotypische Charakterisierung der γδ T-Zell Klone, die Vγγ2,3,4 oder Vγγ4-Ketten exprimieren. Die für die Expression der Vγγ2,3,4-Kette oder Vγγ4-Kette sortierten Klone wurden mittels FACS auf die Expression der Vγγ- und Vδ δ-Ketten (Vδ δ1, Vδ δ2 und Vδ δ3) und den inhibitorischen (CD94, NKG2A, CD158a, CD158b, CD158k) und aktivierenden (NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46) NKRezeptoren untersucht. Die Klone sind ausschließlich positiv für die dargestellten NK Rezeptoren und exprimieren die anderen inhibitorischen und aktivierenden NK Rezeptoren nicht. 26 2. Ergebnisse Alle Vγ4-Klone des Spenders A exprimieren die Vδ1 Kette, welche die stressinduzierbaren MHC Klasse I assoziierten Ketten MICA und MICB Moleküle auf der Oberfläche von Epithelzellen erkennt. Die MIC Gene codieren für Zell-Oberflächen Glycoproteine die nicht mit β2-Mikroglobulin assoziiert sind. Ihnen fehlt eine konventionelle peptid-bindende Furche und werden aufgrund von Stressfaktoren, wie Infektionen, Zellzerstörungen oder zellulären Veränderungen exprimiert. Auf der Oberfläche aller Vγ4 Klone des Spenders A wird der aktivierende NK-Rezeptor NKG2D exprimiert. NKG2D stellt ein Sondefall bei der Klassifizierung der NKRezeptoren dar. NKG2D ist ein homodimerer Rezeptor für das stress-induzierbare MHC Klasse I-assoziierte Gen MICA/B das auf Tumoren epithelialer Herkunft exprimiert wird. Die Oberflächenexpression von NKG2D setzt eine Bindung mit den transmembranären Adapterproteinen DAP10 und KAP10 voraus (Chang et al., 1999). NKG2D besitzt kein intrazelluläres Motiv zur Signaltransduktion. Die Signaltransduktion geschieht ausschließlich über DAP10 mit Hilfe der Phophatidylinositol (PI)-3 Kinase, welche dann die Zytotoxizität induziert. NKG2D ist somit weniger durch inhibierende Signale beeinflussbar als die aktivierenden KIRs und C-Typ Lectin NKRs. NKG2D wird von allen NKZellen exprimiert, ebenso von fast allen γδT-Lymphozyten und CD8+ T-Lymphozyten. Auch die etablierten Vγ4 Klone des Spenders M zeigten an ihrer Oberfläche eine Expression des NKG2D Rezeptors während nur ein Klon des Spenders D diesen Rezeptor exprimiert. Die Vγ4 Klone wurden zusätzlich auf die aktivierenden NCRs NKp30, NKp44, NKp46 untersucht, jedoch wurde keiner dieser Rezeptoren, unabhängig des Spenders, auf der Oberfläche der Vγ4 Klone exprimiert. Die Klone exprimierten jedoch eine variable Anzahl inhibitorischer Rezeptoren auf ihrer Oberfäche. Vier der Klone von Spender A exprimierten den CD94 Rezeptor. Die Expression dieses inhibitorischen Rezeptors findet man bei der Mehrheit der zirkulierenden γδ T-Zellen. Die Expression des CD94 Rezeptors ist bei γδ T-Zellen höher als bei αβ T-Zellen, bei NK-Zellen jedoch ist der CD94 Rezeptor immer zu finden. Keiner der Vγ4 Klone von Spender A exprimierte den NKG2A Rezeptor, der in der Lage ist, Heterodimere mit dem CD94-Rezeptor zu bilden. CD94/NKG2 Rezeptoren sind lektinartige, 27 2. Ergebnisse durch Disulfidbrücken verbundene Heterodimere, die vorwiegend auf NK Zellen und einer Subpopulation von T-Zellen exprimiert werden. Die zytoplasmatische Domäne ist entweder lang (NKG2A/B) oder kurz (NKG2C/E), abhängig von inhibitorischen oder aktivierenden CD94/NKG2 Isoformen. Zellen, die den NKG2A-Rezeptor exprimieren, zeigten immer auch Expression des CD94 Rezeptors. Dieses Verhalten lässt sich auch bei allen Klonen des Spenders M und bei dem Klon E 1.1 von Spender D erkennen. Fünf der analysierten Klone des Spenders A exprimierten den KIR CD158b, der spezifisch für HLA-Cw1, Cw3, Cw7 und Cw8 ist, und einer dieser Klone exprimierte den KIR CD158a (spezifisch für HLA-Cw2, Cw4 und Cw6). Der p58 Rezeptor existiert in 2 unterschiedliche Formen, CD158a und CD158b, die von den Antikörpern EB6 und GL183 erkannt werden. 20% der γδ T-Zellen exprimieren mindestens einen dieser beiden Rezeptoren, der ein Mitglied der Immunglobulin Familie der NKR ist und zwei Ig Domänen in der extrazellulären Region besitzt. Jedoch exprimierten keiner der etablierten Klone der Spender D und M diese Rezeptoren. Der inhibitorische Rezeptor CD158k wurde von sieben der analysierten Vγ4 Klone exprimiert. CD158k wird von dem Antikörper Q66 erkannt. Anders als bei anderen NK Rezeptoren wird der CD158k Rezeptor als Disulfid-gebundenes Dimer mit einer Molekularmasse von 140 kD auf der Oberfläche von NK Zellen exprimiert. Der CD158k Rezeptor gehört zur Ig Superfamilie und besitzt drei extrazelluläre Ig-ähnliche Domänen und einen nichtpolaren transmembranen Anteil, der mit einem 95-Aminosäuren großen, zytoplasmatischen Teil in Verbindung steht. Im Gegensatz zu den meisten humanen NK-Rezeptoren, die spezifisch für HLA-B und HLA-C sind, ist CD158k ein NK-Rezeptor der spezifisch für eine Gruppe von HLA-A Allelen ist. Desweiteren wurden T-Zell Klone charakterisiert, die auf Expression der Vγ5-Kette, bzw. Vγ8- und Vγ9-Ketten sortiert wurden. Bei den etablierten Klonen konnte keine einheitliche Vδ-Kette identifiziert werden. Sie exprimierten vorwiegend die Vδ1-Kette, ein Klon zeigte jedoch Expression der seltenen Vδ3-Kette. Die Ergebnisse dieser Phänotypisierung wurden in Tabelle 2.5 zusammengefasst. 28 2. Ergebnisse Die für die Vγ5-, Vγ8- und Vγ9-Ketten sortierten Klone wurden mittels FACS auf die Expression der Vγ- und Vδ-Ketten und auf die Expression der inhibitorischen und aktivierenden NK-Rezeptoren wie in Tabelle 2.2 untersucht. Tabelle 2.3: Phänotyp der γδ T Zell Klone, welche die Vγγ5-, Vγγ8- und Vγγ9-Ketten exprimieren. Die etablierten Vγ5-Klone zeigten alle Expression des aktivierenden NKG2D Rezeptors, unabhängig des Spenders. Zusätzlich zeigen drei der Vγ5 Klone des Spenders B Expression des aktivierenden NCR NKp30. NKp30 wird auf der Oberfläche aller NK-Zellen exprimiert und spielt eine große Rolle bei der Induzierung der Zytotoxizität gegen eine große Anzahl von Tumor Zelllinien (Moretta et al., 2000). Der inhibierende Rezeptor CD94 wird auf der Oberfläche von einem Vγ5 Klon exprimiert, der parallel die Rezeptoren NKG2D und NKp30 besitzt. Zwei der isolierten Vγ5 29 2. Ergebnisse Klone zeigen Expression des KIR CD158k. Beide besitzen unterschiedliche Vδ-Ketten und wurden von verschiedenen Spendern isoliert. Die zwei isolierten Vγ8 Klone des Spenders D zeigten weder Expression von aktivierenden noch von inhibitorischen NK Rezeptoren. Auch war es schwer eine eindeutige Vδ-Kette zu identifizieren. Von Spender D wurden als Kontrollklone die beiden Vγ9 Klone etabliert und analysiert. Die Vγ9/δ2 T-Zellen stellen die größte Fraktion der γδ T-Zellen dar und ist die bislang am Besten analysierte Subpopulation. Beide Klone exprimieren die Vδ2-Kette und den aktivierenden Rezeptor NKG2D. Auch zeigen beide Vγ9-Klone die inhibitorischen Rezeptoren CD94 und NKG2A, welche Heterodimere bilden können. Es ist bekannt, dass 80% der Vγ9/δ2-Zellenden CD94/NKG2A Rezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren (Battistini et al., 1997). Einer der Vγ9 Klone exprimiert zusätzlich den CD158k KIR, während der andere der beiden Vγ9 Klone den KIR CD158b an der Oberfläche besitzt. KIR Gene haben sich in Primaten entwickelt um eine Rezeptorfamilie mit einer einzigartigen Struktur zu generieren, die in der Lage ist, MHC Klasse I Moleküle mit Locus und Allelspezifität zu erkennen. 2.1.3 Funktionelle Charakterisierung mittels Chromium-Release-Assays In Funktionsexperimenten wurde die zytolytische Aktivität der in 2.1 etablierten γδ T-Zell Klone gegen verschiedene Tumor-Zelllinien untersucht. Das Lyseverhalten der γδ TZellklone könnte im Zusammenhang mit den phänotypischen Untersuchungen in 2.2 stehen. Die Expression der NK-Rezeptoren auf der Oberfläche der Klone kann das Lyseverhalten der Klone gegenüber Tumorzelllinien beeinflussen. Um das zytolytische Verhalten der Klone zu charakterisieren wurde zuerst das Lyseverhalten der etablierten Klone auf die NK-sensitive K 562-Zelllinie untersucht. K 562 ist eine erythroleukämische Zelllinie, die sowohl von NK-Zellen als auch von bestimmten T-Zellen erkannt werden kann. Desweiteren wurden die γδ T-Zellklone auf die NK-resistente Ziel-Zelllinie Raji untersucht. Bei den Klonen, bei denen ein auffälliges Lyseverhalten gegen eine der beiden Zelllinien zu sehen war, wurde zur genaueren Charakterisierung das Lyse30 2. Ergebnisse verhalten gegen weitere ausgesuchte B-Zell-Lymphom-Linien getestet. Das Zytotoxititätsverhalten der Klone ist in Tabelle 2.4 und 2.5 dargestellt. Tabelle 2.4: Funktionelle Charakterisierung der γδ T-Zell Klone, die Vγγ2,3,4 oder Vγγ4-Ketten exprimieren Die für die Expression der Vγγ2,3,4-Kette oder Vγγ4-Kette sortierten Klone wurden mittels Chromium Release Assay auf ihre zytolytische Aktivität gegenüber verschiedenen Tumor-Zelllinien untersucht. Unabhängig des Spenders zeigten fast alle isolierten Klone zytolytische Lyse gegenüber der K562 Zelllinie während ca. 50% der Klone Lyse gegenüber der Raji-Zelllinie zeigten. Bei den isolierten Vγ2,3,4-Klonen ist auffällig, dass die Klone eine signifikante Lyse ausschließlich gegenüber einem der beiden Ziel-Zelllinien zeigten, die Zellklone also nicht imstande sind beide Zelllinien zu lysieren. Dieses Verhalten lässt sich auch bei vier Vγ4 Klonen des Spenders A beobachten, während drei der isolierten Vγ4 Klone 31 2. Ergebnisse des Spenders M zytolytisches Verhalten gegenüber K 562 und Raji zeigen, auch wenn die Lyse gegenüber K 562 deutlich höher ist. Bei diesen Zytotoxititätsexperimenten lässt sich eine Abhängigkeit des Lyseverhalten vom jeweiligen Spender erkennen. Zur weiteren Charakterisierung wurde das Lyseverhalten der γδ T-Zellklone auf weitere B-Zell-Lymphomlinien, wie z.B. Daudi JP und DG75 getestet. Daudi JP ist eine Burkitt Lymphom Linie, die aufgrund einer Punktmutation kein β2-Mikroglobulin besitzt. Da β2Mikroglobulin einen Hauptteil des HLA Klasse I-Komplexes ist, exprimiert die Daudi JPLinie keine HLA-Klasse I-Moleküle. Keiner der etablierten Vγ4-Klone des Spenders A zeigte ein signifikantes Lyseverhalten gegenüber Daudi JP, während alle drei Vγ4-Klone des Spenders M eine auffällig hohe Lyse gegenüber Daudi JP aufwiesen. Jedoch zeigte einer der beiden isolierten Vγ2,3,4-Klone des Spenders M ebenfalls eine hohe Lyse gegen die Burkitt Lymphom Linie. Ein auffälliges Lyseverhalten zeigten die etablierten Klone des Vγ4 Subtyps von Spender A gegen die Zelllinie DG75. 5 der 6 etablierten Klone des Spenders A zeigen eine signifikante zytolytische Aktivität gegenüber DG75. 3 dieser Klone zeigen parallel dazu eine hohe Lyse gegenüber der Zelllinie Raji. DG75 ist eine EBV-negative lymphoide Zelllinie, die klinisch und histologisch einer Burkitt-Lymphomlinie ähnelt. Desweiteren wurden die etablierten Klone der Subklassen Vγ5, Vγ8 und Vγ9 ebenfalls auf ihre zytolytische Aktivität gegenüber den Tumorzelllinien untersucht. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2.5 zusammengefasst. Die etablierten Vγ5 zeigen der Spender B, D und M zeigen im Allgemeinen eine geringere zytolytische Aktivität gegenüber den beschriebenen Tumor-Zelllinien als die etablierten Vγ4-Klone. 4 der etablierten Vγ5 Klone zeigten eine zytolytische Aktivität gegenüber der NK-sensitiven K562 Zelllinie. Jedoch zeigte keiner der etablierten Klone Zytotoxizität gegenüber der NK-resistenten Zelllinie Raji. Eine geringes Lyseverhalten konnte gegenüber DG75 nachgewiesen werden, es wurden jedoch ausschließlich die Klone des Spenders B auf diese Zelllinie getestet, die Expression der Vδ1-Kette in einem möglichen Zusammenhang mit der signifikanten Lyse der DG75 δ-Kette stehen. 32 2. Ergebnisse Tabelle 2.5: Funktionelle Charakterisierung der γδ T-Zell Klone, die Vγγ5, Vγγ8 oder Vγγ9-Ketten exprimieren Die für die Expression der Vγγ5-Kette, Vγγ8-Kette oder Vγγ9-Kette sortierten Klone wurden mittels Chromium Release Assay auf ihre cytolytische Aktivität gegenüber verschiedenen TumorZelllinien untersucht. 2.1.4 Bestimmung des Zytokinexpressionsprofils der isolierten γδ T- Zellklone Durch die spezifische Antigenerkennung wird die Freisetzung von sezernierten Molekülen der bewaffneten T-Zellen angeregt. Diese Moleküle unterteilen sich in zwei große Gruppen, die Zytotoxine und die Zytokine, die von allen T-Effektorzellen abgegeben werden. Die Zytotoxine sind nicht spezifisch und können auf jede Zelle einwirken, die Zytokine hingegen benötigen spezifische Rezeptoren auf der Zielzelle. Zytokine sind kleine, lösliche Proteine, die von einer Zelle gebildet werden und das Verhalten oder die 33 2. Ergebnisse Eigenschaften einer anderen Zelle verändern. Die Wirkung der Zytokine sind von der Zielzelle abhängig, sie wirken auf B-Zellen, T-Zellen Makrophagen, Gewebezellen und hämatopoetische Zellen. Die Sekretion von Zytokinen ist wesentlich für die Beseitigung einer Infektion durch zytotoxische T-Zellen. Die meisten zytotoxischen T-Zellen sind aber auch in der Lage Interferon-γ (IFN-γ) und TNF-α freisetzen, die ebenfalls zur Wirtsverteidigung beitragen. Zur weiteren Funktionsanalyse der etablierten γδ T-Zellklone wurde mittels CBA ein Zytokinexpressionsprofil erstellt. Bestimmt wurde die Expression der Zytokine Interferon-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5 und IL-10. Als Stimulanz für die Zytokinproduktion wurde ein CD3 Antikörper und PMA eingesetzt. Die Zytokinexpression der Klone wurde im Vergleich zu den unstimulierten Klonen gemessen, da jeder Klon in der Lage sein könnte ohne Zugabe von Stimulantien Zytokine zu produzieren. Die Stimulierung des CD3 Rezeptors bewirkt, dass Signale ins Innere der Zelle geleitet werden, die besagen, dass eine Antigenbindung stattgefunden hat. Für die einzelnen Subklassen wurden jeweils zwei Klone analysiert. Die Auswertung wurde anhand der CBA Software durchgeführt. Die Auswertung der Standardkurven der CBA Methode geht von einem Minimalwert von 20 aus. Das Maximum an Fluoreszenz liegt bei 5000. Es wurde daher eine halblogarithmische Darstellung gewählt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2.2-2.5 dargestellt. Abbildung 2.2: Zytokinexpression der Vγγ4 Klone 10000 1000 E 1.1 Vg4 Medium E 1.1 Vg4 CD3+PMA 100 E 4.3 Vg4 Medium E 4.3 Vg4 CD3+PMA 10 1 IFNg TNFa IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 Zytokine Abbildung 2.2: Zytokinexpressionsprofile der etablierten Vγγ4 T-Zell-Klone 34 2. Ergebnisse γ 5 Klone Abbildung 2.3: Zytokinexpression der Vγ 10000 1000 D1.7 Vg5 Medium D1.7 Vg5 CD3+PMA 100 D1.10 Vg5 Medium D1.10 Vg5 CD3+PMA 10 1 IFNg TNFa IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 Zytokine Abbildung 2.3: Zytokinexpressionsprofile der etablierten Vγγ5 T-Zell-Klone Abbildung 2.4: Zytokinexpression der Vγγ8 Klone 10000 1000 C1.4 Vg8 Medium C1.4 Vg8 CD3+PMA 100 C1.9 Vg8 Medium C1.9 Vg8 CD3+PMA 10 1 IFNg TNFa IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 Zytokine Abbildung 2.4: Zytokinexpressionsprofile der etablierten Vγγ8 T-Zell-Klone 35 2. Ergebnisse γ9 Klone Abbildung 2.5: Zytokinexpression der Vγ 10000 1000 A2.1 A2.1 A4.2 A4.2 100 Vg9 Vg9 Vg9 Vg9 Medium CD3+PMA Medium CD3+PMA 10 1 IFNg TNFa IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 Zytokine Abbildung 2.5: Zytokinexpressionsprofile der etablierten Vγγ9 T-Zell-Klone. Gemeinsame Legende der Abbildungen 2.2 - 2.5: Mittels der CBA Methode wurden für die etablierten γδ-T-Zell-Klone Zytokinexpressionsprofile erstellt. Die Profile beinhalten die Expression der Zytokine IFN-γγ, TNF-α α, IL-2, IL-4, IL-5 und IL-10. Für jeden Klon wurde eine Messung ohne und mit Zugabe eines Stimulanz durchgeführt. Die Zytokinexpression wurde an einem FACS gemessen. Bei dem Expressionsprofil der analysierten Vγ4 Klone zeigt sich nach Zugabe der Stimulantien ein deutlicher Anstieg der beiden Zytokine IFN-γ und TNF-α gegenüber den unstimulierten Zellen. Beide Klone zeigten ein ähnliches Expressionsmuster, keiner der Klone zeigte Expression von IL-2, IL-4, IL-5 oder IL-10 (siehe Abbildung 2.2). Das Profil der analysierten Vγ5 Klone zeigte ein anderes Profil. Beide Klone exprimierten größere Mengen IFN-γ. Jedoch zeigten auch beide Klone Expression von TNF-α, L4, IL-5 und IL-10, wobei der Klon D1.10 durchgängig einen etwas höheren Level an Zytokinen aufweist. IL-2 wurde von keinem der beiden Vγ5 Klone produziert (siehe Abbildung 2.3). Die beiden analysierten Vγ8 Klone zeigten ebenfalls ein ähnliches Zytokinexpressionsprofil. Beide Klone exprimierten hohe Level an IFN-γ, jedoch zeigten die Klone bereits unstimuliert eine relativ hohe Produktion an IFN-γ. Der Klon C1.4 war in der Lage 36 2. Ergebnisse nach Zugabe der beiden Stimulantien einen hohen Level an TNF-α zu produzieren. Auch der Klon C1.9 zeigte Expression von TNF-α, jedoch war keiner der beiden Klone in der Lage IL-2 zu produzieren. IL-4 und IL-5 wurden ebenfalls von beiden Vγ8 Klonen exprimiert, eine Expression von IL-10 zeigte jedoch ausschließlich der Klon C1.9 (siehe Abbildung 2.4). Das Expressionsmuster der Vγ9 Klone zeigte sich weniger einheitlich. Beide Klone zeigten hohe Level an IFN-γ und TNF-α Expression. Jedoch exprimierte ausschließlich der Klon A2.1 zusätzlich noch die Zytokine IL-4 und IL-5. IL-2 und IL-10 wurden von keinem der beiden Klone produziert (siehe Abbildung 2.5). 2.2 Immunhistochemie von γδ T-Zellen 2.2.1 Das Prinzip der Immunhistochemie Die Immunhistologie ist eine der zentralen Methoden der modernen histopathologischen Diagnostik und Forschung. Durch immunhistologische Techniken ist es möglich, Strukturen gegen die Antikörper gebildet werden können, hochspezifisch nachzuweisen. Man nutzt die Spezifität von Antikörpern, um die Verteilung von bestimmten Antigenen am histologischen Schnitt im mikroskopischen Bild nachzuweisen. Ein anschauliches Beispiel für den Nutzen dieser Methode bietet die Metastasenpathologie, bei der die immunhistologische Diagnostik charakteristischer Expressionsmuster von Leber-, Lungen oder Lymphknoten eine entscheidende Hinweise auf die Primärlokalisation des Tumors liefern kann. Inkubiert man einen histologischen Gewebeschnitt mit Antikörpern werden diese Antikörper dort binden wo sich das passende Antigen befindet. Um diese Bindung nachzuweisen muss man den Antikörper sichtbar machen. Um dies zu gewährleisten verwendet man markierte Sekundärantikörper, die entweder fluoreszenzmarkiert sind oder die ein Enzym gekoppelt haben, dass histochemisch nachgewiesen werden kann. Das Antigen dieser Sekundärantikörper besteht aus Immunglobulinen einer bestimmten Tierart 37 2. Ergebnisse und kann deshalb für alle primären Antikörper aus derselben Tierart verwendet werden. Um unspezifische Bindungen der Antikörper zu vermeiden, werden durch eine Absättigung der Schnitte mittels eines Normalserums von der Spezies, aus der der sekundäre Antikörper gewonnen wurde, die Bindungsstellen blockiert. 2.2.2 Immunhistochemische Färbemethoden Es gibt direkte und indirekte Nachweismethoden in der Immunhistochemie. In dieser Arbeit wurde die Avidin-Biotin-Methode (ABC-Methode = Avidin-Biotin-Complex) verwendet, eine indirekte Nachweismethode mit hoher Sensitivität. Sie nutzt die starke Affinität von Avidin zur Bildung von Komplexen aus. Man verwendet einen biotynilierten Sekundär-Antikörper zur Kopplung von enzymmarkiertem Avidin an den biotynilierten Antikörper. Das an Biotin gebundene Avidin besitzt seinerseits drei weitere Biotinbindungsstellen. Diese können durch Markermoleküle (Enzyme), die ihrerseits mit Biotin gekoppelt sind. Als Enzym wird am häufigsten Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase verwendet. Hierbei wird ein farbloses Chromogen in ein farbiges Enzymprodukt umgewandelt. Durch diese Vervielfältigung der Markermoleküle steigt die Sensitivität der Methode deutlich an. Der Ablauf der ABC-Methode ist in Abbildung 2.6 schematisch dargestellt. Grafik 2.6: Prinzip der Avidin-Biotin-Methode (nach DAKO) 38 2. Ergebnisse 2.2.3 Immunhistochemischer Nachweis von γδ T-Zellen in Paraffinschnitten Um die Rolle der γδ T-Zellen bei Tumoren und anderen Krankheiten besser untersuchen zu können, wäre es von Vorteil, γδ T-Zellen spezifisch am Gewebeschnitt des Tumors nachweisen zu können. Die häufigste Form der Gewebeschnitte zur Diagnostik in der Pathologie ist der Paraffinschnitt. Das Gewebe muss, bevor es in Paraffin eingebettet wird, fixiert werden. Das Standardverfahren ist die Formalinfixierung (4% Formaldehyd-Lösung), die eine gute Durchdringung und Erhaltung des Gewebes ermöglicht. Durch Formalin werden die Proteine miteinander vernetzt und die Antigene immobilisiert. Diese Proteinvernetzung führt aber auch zur Maskierung der antigenen Strukturen, was zu großen Problemen bei der Etablierung paraffingängiger Antikörper führen kann. Durch Andauen der Schnitte mit Proteasen oder Kochen der Schnitte in Puffer mit definierten pH-Werten (siehe immunhistochemische Methoden) lassen sich die Molekülvernetzungen aufbrechen. Da die Funktion der γδ T-Zellen weitestgehend unbekannt ist, wurde bislang kein Antikörper gegen den γδ T-Zell-Rezeptor an Paraffinmaterial beschrieben, da er für die Routinediagnostik in der Pathologie bislang nicht eingesetzt wurde. Die Experimente zur Etablierung eines paraffingängigen γδ T-Zell Antikörpers wurde an in Paraffin eingebetteten γδ T-Zell-Klonen durchgeführt. Um die Expression des γδ T-Zell-Rezeptors zu gewährleisten und die Bindungsfähigkeit der eingesetzten Antikörper in vivo zu untersuchen, wurden die Zellklone zunächst mittels eines spezifischen Antikörpers gefärbt und am FACS analysiert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2.7 dargestellt. Abbildung 2.7: FACS-Analyse eines mittels eines spezifischen anti-TCR-γγδ Antikörpers gefärbten γδ-T-Zell Klons. Die Isotypkontrolle ist in rot, die markierten γδ-T-Zellen sind in grün dargestellt. 39 2. Ergebnisse Um dieselben Bedingungen wie die der Gewebeschnitte herzustellen, wurden die verwendeten γδ T-Zell-Klone behandelt wie Gewebeschnitte. Die Zellen wurden zwei mal mit PBS gewaschen und mit einer 4%igen Formalinlösung fixiert um die Proteine miteinander zu vernetzen. Die Vernetzung der Proteine kann ein Problem bei der Immunhistologischen Färbung darstellen, da die Epitope nicht frei zugänglich sind. Um auszuschließen, dass die Konzentration der Formalinlösung einen Einfluss auf die Bindung des Antikörpers hat, wurden die eingesetzten γδ T-Zell Primärantikörper an formalinfixierten Zellen auf Adhäsionsobjektträgern der Firma BioRad getestet. Zusätzlich zu dem γδ T-Zell Antikörper der Fa. Immunotech wurde ein γδ T-Zell Antikörper der Fa. Pierce getestet. Dazu wurden die eingesetzten γδ T-Zell Klone 2mal mit PBS gewaschen und in einer definierten Anzahl von 50000 Zellen pro well auf die Adhäsionsobjektträger pipettiert. Die Zellen wurden 2 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen einer Formalinlösung fixiert (0,5%, 1%, 2%, 3% und 4%). Nach Abwaschen der Formalinlösung wurden die Zellen mittels der ABC-Methode mit zwei γδ T-Zell Primärantikörpern gefärbt. Die Färbungen zeigten, dass die Konzentration der Formalinfixierung an vitalen Zellen keinen Einfluss auf die Bindung der eingesetzten Antikörper hatten. Beide Antikörper zeigten auch bei der höchsten Konzentration der Formalinlösung (4%) eine spezifische Färbung des γδ T-Zell Rezeptors auf der Oberfläche der Zellen. Jedoch zeigte der eingesetzte Antikörper der Firma Pierce eine stärkere Färbung, deshalb wurden die Tests zur Etablierung eines γδ T-Zell Antikörpers am Paraffinmaterial dieser Antikörper verwendet. Als Positivkontrolle für die Färbungen am Paraffinmaterial wurde eine B-Zelllinie verwendet, die mit dem bereits etablierten CD20 Antikörper spezifisch nachgewiesen werden kann. Nach der Formalinfixierung wurden die Zellen in Paraffin eingebettet und nach Aushärtung des Blockes Schnitte hergestellt, die zur Glättung in lauwarmes H2O gelegt und anschließend auf Objektträger gezogen wurden. Nach dem Trocknen der einzelnen Schnitte wurde die ABC-Färbemethode angewandt. Nach Beendigung der ABC-Methode wurde zusätzlich eine Kerngegenfärbung mit Hämalaun durchgeführt. 40 2. Ergebnisse Dadurch lässt sich eine spezifische Färbung deutlicher erkennen, da die Zellkerne dunkelblau sind und die Färbung mittels Chromogen bräunlich erscheinen. Die ABC Methode wurde nach den im Methodenteil beschriebenen Protokoll durchgeführt. Die vom Hersteller angegebenen Demaskierungsbedingungen für den CD20 Antikörper waren Kochen der Schnitte im Citratpuffer pH6 im Dampfkochtopf für 10 min.. Die ermittelte Antikörperverdünnung war 1:50 in PBS. Da für den γδ T Zell Antikörper keine Demaskierungsbedingungen bekannt sind, wurde die Behandlung der Schnitte identisch mit denen der B-Zelllinie durchgeführt. Um zu gewährleisten, dass der Primärantikörper an kultivierte γδ T-Zellen bindet, wurde der für die FACS-Analysen eingesetzte Antikörper der Firma Immunotech mit einer Verdünnung von 1:50 verwendet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2.8 dargestellt. Abbildung 2.8: Immunhistochemische Färbung einer B-Zelllinie mittels eines spezifischen antiCD20 Antikörpers. Das linke Bild zeigt die Negativkontrolle der immunhistochemischen Färbung. Die Zellkerne sind blau gefärbt, es ist keine spezifische Färbung des anti-CD20 Antikörpers zu erkennen. Das rechte Bild zeigt die spezifische Färbung des Oberflächenmarkers CD20 durch den spezifischen Antikörper. Der CD20 Oberflächenmarker lässt sich deutlich auf der Oberfläche der B-Zelllinie nachweisen. Die nichtmarkierten Zellkompartimente erscheinen blau und auf den Oberflächen der einzelnen Zellen weist die braune Färbung die Expression des CD20 Moleküls nach. Der verwendete γδ T-Zell Antikörper zeigte unter den eingesetzten Bedingungen keine spezifische Färbung. Da der γδ T-Zell-Rezeptor auf der Oberfläche der T41 2. Ergebnisse Zellen exprimiert wird, würde man bei einer spezifischen Färbung eine braune Markierung auf der Oberfläche der Zellen erkennen. Zur Etablierung des γδ T-Zell Antikörpers wurde eine große Anzahl an Färbungen in diversen Variationen durchgeführt. Der γδ TZell Antikörper wurde in unterschiedlichen Konzentrationen von 1:1 – 1:500 eingesetzt und bei jeder Konzentration wurden unterschiedliche Demaskierungsmethoden (siehe Methoden) zur Freilegung der Epitope eingesetzt. Bei keiner der durchgeführten Kombination aus Konzentration und Demaskierung konnte eine spezifische Färbung nachgewiesen werden. 2.2.4 Immunhistochemischer Nachweis von γδ T-Zellen in Gefrierschnitten Eine Alternative zur Formalinfixierung und anschließendem Einbetten in Paraffinblöcke stellt bei empfindlichen Antigenen die Gefriertechnik dar. Ein schonendes und schnelles Einfrieren sind für eine gute Strukturerhaltung essentiell. Da in der Diagnostik routinemäßig die Paraffinschnitte verwendet werden, stellt ein paraffingängiger Antikörper die nützlichere Alternative dar. Um jedoch γδ T-Zellen bei Tumoren nachweisen und somit eine Basis für weitere Untersuchungen dieser Tumore und Krankheiten im Bezug auf eine mögliche γδ T-Zell Expansion schaffen zu können wurde der γδ T-Zell Antikörper bei Färbungen an Gefrierschnitten getestet. Das Gewebe bzw. die Zellen wurde auf Dragant aufgeblockt und mittels einer CO2-Quelle aufgefroren. Das gefrorene Gewebe bzw. die Zellen wurden aufgeblockt und im Kryostaten bei –20°C geschnitten. Die Gefrierschnitte wurden am Objektträger angeschmolzen, getrocknet und unfixiert weiterverarbeitet. Die getrockneten Gefrierschnitte wurden bei –20°C, die aufgeblockten Gewebs- und Zellstücke bei –80°C aufbewahrt. Als Färbemethode wurde ebenfalls die ABC-Methode verwendet. Bei Färbungen am Gefrierschnitt entfällt der Schritt der Demaskierung, da die Zellen bzw. das Gewebe nicht formalinfixiert wurden. Die Färbung wurde zuerst an mittels FACS überprüften γδ T-Zellen durchgeführt. 42 2. Ergebnisse Parallel wurden Gefrierschnitte aus Tumormaterial von 4 Patienten angefertigt. Von jedem Patienten wurde ein Teil des Tumors und zum Vergleich tumorfreies Gewebe verwendet. Untersucht wurde ein Patient mit einem Adenomknoten der Schilddrüse, ein Patient mit Colonkarzinom und eine Patientin mit Ovarialkarzinom. Die Ergebnisse der Färbungen sind in Grafik 2.9 dargestellt. Abbildung 2.9: Immunhistochemische Färbungen an Gefrierschnitten mittels eines spezifischen anti-γγδ-TCR-Antikörpers. Die Abbildung zeigt Färbungen an Gefrierschnitten von unterschiedlichem Tumormaterial. Die linke Spalte zeigt Normalgewebe des jeweiligen Patienten, in der rechten Spalte ist das angefärbte Tumormaterial des Patienten dargestellt. Die immunhistochemischen Färbungen an den Gefrierschnitten zeigen eine spezifische Färbung des γδ-T-Zell-Rezeptors an der Oberfläche der Zellen. Bei dem untersuchten Tumorgewebe des Colons zeigte sich eine spezifische Anfärbung der Drüsenzellen, während im Normalgewebe des Patienten keine spezifische Färbung zu erkennen war. 43 2. Ergebnisse Das Ovarialtumorgewebe zeigte Anfärbungen einzelner Zellen, die im gesamten Schnitt zu finden waren, das Normalgewebe der Patientin zeigte keine spezifische Anfärbung. Das verwendete Tumorgewebe der Schilddrüse, ein Adenomknoten, zeigte starke Färbung, konnte jedoch keinem bestimmte Zell- oder Gewebetyp zugeordnet werden, da die angefärbten Zellen ebenfalls im gesamten Schnitt zu finden waren. Auch hier zeigte das Normalgewebe keine spezifische Anfärbung. γδ-T-Zellen konnten in unterschiedlichen Tumorgeweben verstärkt nachgewiesen werden. Eine Akkumulation von γδ-T-Zellen in Gewebe könnte im Zusammenhang mit dem Verlauf verschiedener Krankheiten stehen. Könnte eine γδ-T-Zell-Färbung in die Routine der Pathologie aufgenommen werden, wäre eventuell eine Früherkennung bestimmter Krankheiten möglich. Dafür müsste jedoch ein paraffingängiger Antikörper etabliert werden. 2.3 γδ T-Zell Expansion am Beispiel eines Patienten mit invasivem Thymom und viszeraler Leishmaniose 2.3.1 Krankheitsverlauf Die primären Symptome des 35-Jahre alten Patienten A waren Fieber, Nachtschweiß und Müdigkeit. Eine abdominale Unltraschalluntersuchung und anschließende Computertomographie zeigten eine allgemeine Lymphadenopathie einschließlich des Mediastinums, eine Hepatosplenomegalie und und pleurale Knoten. Eine Lymphknoten- und Knochenmarksbiopsie und serologische Untersuchungen zeigten eine Invasion von Leishmanien-Parasiten (viszerale Leishmaniose) des Stammes L. donovani. Nach Behandlung mit Amphotericin B sank das Fieber und Lymphknoten, Leber und Milz bildeten sich auf ihre normale Größe zurück. Die mediastinale Masse schien unverändert, jedoch bemerkte der Patient den Beginn einer Ptose und Diplopia. Eine Biopsie der mediastinalen Masse zeigte ein invasives Thymom. Der Patient wurde mit 6 Zyklen einer VIP-E Chemotherapie (Etopsid, Ifosfamid, Cisplatin, Epirubicin) behandelt. Diese ging jedoch mit einem klinischen Rückfall der Leishmaniose einher, die mit liposomalem Amphotericin und später mit der Gabe von oralem Miltefosin behandelt 44 2. Ergebnisse wurde. Danach war ein Rückgang des Thymoms zu erkennen. Innerhalb des Thymoms wurde eine massive Invasion von Amastigoten (geißellose Form der Leishmania Flagellaten) entdeckt, während jedoch im Knochenmark keine Anzeichen von Parasiten zu finden waren. Ein Jahr nach der Thymektomie wurde ein Rückfall des Thymoms histologisch bestätigt. Eine erneute Chemotherapie wurde durchgeführt die mit einer Reaktivierung der viszeralen Leishmaniose einherging. Die Behandlung des Patienten wurde erfolgreich mit oralem Miltefosin gegen die Leishmaniose und Strahlentherapie gegen das Thymom vorerst beendet. 2.3.2 Untersuchungen zur γδ T Zell Expansion durch Infektion mit L. donovani Bei Patienten mit Infektionen durch Pathogene und Parasiten, wie Mycobakterien, Epstein-Barr-Virus und Leishmania (Saha et al., 1999) wurde zunehmend eine Expansion der γδ T-Zellen im Blut entdeckt. Bei dem in 2.3.1 beschriebenen Patienten A wurde eine enorme Expansion der γδ T-Zellen im peripheren Blut gefunden. Aufgrund seiner beiden Krankheitsbilder, dem invasiven Thymom und der viszeralen Leishmaniose, war es jedoch unklar auf welche der Krankheiten die Expansion zurückzuführen ist. Die folgenden Untersuchungen besitzen ihren Focus darin, dass die Infektion mit L. donovani Antigenen die Expansion der γδ T-Zellen im peripheren Blut des Patienten induziert hat und die γδ T-Zellen eine mögliche Rolle bei der Immunantwort gegen das Antigen übernehmen. Zuerst wurde der immunologische Status des Patienten analysiert. Der HIV Antikörper Titer war negativ. Es wurde jedoch eine enorme Expansion von T-Zellen gefunden, die den γδ T-Zell Rezeptor exprimieren, gleichzeitig zeigte das Blutbild eine fast komplette Depletion der NK-Zellen. Um diese Ergebnisse zu manifestieren und detaillierter zu analysieren wurden die Blutzellen mittels spezifischer Antikörper gegen die verschiedenen gamma- und delta- Ketten am FACS untersucht. Dazu wurden die peripheren Blutlymphozyten (PBL) aus 30 ml Blut des Patienten (A) und einer gesunden Kontrollperson (NR) mittels eines Ficoll-Gradienten isoliert. Die isolierten PBL wurden mit spezifischen Antikörpern gegen die einzelnen γ- und δ-Ketten gefärbt und am FACS analysiert und quantifiziert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2.10 dargestellt. 45 2. Ergebnisse SC weist eine deutliche Expansion der γδ T-Zellpopulation an der Gesamtpopulation der T-Zellen auf. Die signifikante Zunahme um mehr als den Faktor drei verglichen mit dem Durchschnitt in der Gesamtbevölkerung (2-7% γδ T-Zellen) bietet einen ersten Hinweis auf eine mögliche Rolle der γδ T-Zellen in der Thymom-Genese und/oder dem Krankheitsbild der Leishmaniose. Um diesen Sachbestand näher zu charakterisieren wurden die Subtypen der γ- sowie der δ-Kette bestimmt und quantifiziert. 25 20 15 A 10 NR 5 A NR TCR γδ 24.8 6.1 Vδ1 16 1.7 Vδ2 4.8 4.2 Vδ3 4.2 0.23 Vγ2,3,4 0.19 0.15 Vγ4 6.6 0.16 Vγ5 4.6 0.26 Vγ8 6.4 0.6 Vγ9 5 4.9 Vg 9 Vg 8 Vg 5 Vg 4 Vg 2, 3, 4 Vd 3 Vd 2 TC R Vd 1 0 gd Anteile der γ - und δ- Ketten in Prozent Expressionsmuster der Vγγ - und Vδ δ - Ketten des Patienten A Abbildung 2.10 und dazugehörige Wertetabelle: Expressionsmuster der γδ T Zell Rezeptoren auf der Oberfläche der PBL des Patienten A und eines gesunden Kontrollspenders NR. 46 2. Ergebnisse Mittels FACS Analysen wurde die Expression der einzelnen γ- und δ- Ketten auf der Oberfläche der PBL des Patienten und eines Kontrollspenders bestimmt und quantifiziert. Die ermittelten Werte sind in Prozent angegeben. Bei gesunden Spendern, wie auch der Kontrollperson NR exprimiert der größte Teil der γδ T-Zellen die Vδ2 Kette, die Zellen des Patienten A weisen jedoch eine hohe Expression der Vδ1 Kette auf. Eine Überexpression der Vδ1-Kette im peripheren Blut findet man bei einer Anzahl von Infektions-Krankheiten, wie HIV (Autran et al., 1989), Onchocerca volvulus-Infektionen (Munk et al., 1993) oder CMV-Infektionen (Déchanet et al, 1999). Bei der Expressionsanalyse der γ-Ketten zeigt der Patient A eine signifikante Überexpression der Vγ4-, Vγ5- und Vγ8-Ketten. Bei gesunden Spendern stellt die Vγ9-Kette, den größten Anteil der γδ T Zellpopulation dar. Eine Expansion der beschriebenen γδ Subpopulationen wurde schon in früheren Studien bei Leishmania Erkrankungen entdeckt. Es wurde gezeigt, dass der Stamm Leishmania donovani, an dem der Patient A erkrankt ist, in der Lage ist, humane TZellen in vitro zu infizieren, und damit eine Expansion der γδ T-Zellen auszulösen. 2.3.3 Experimentelle Untersuchungen zur Auswirkung einer Stimulation mit Antigenen verschiedener Leishmanien-Stämme auf die T-Zell Proliferation Die Rolle der antigenspezifischen γδ T-Lymphozyten bei humanen Immunantworten gegen pathogene Organismen ist noch weitgehend unbekannt. Es wurde gezeigt, dass Leishmanien-Antigene in der Lage sind humane T-Zellen in vitro zu infizieren. Die folgenden Experimente sollen zeigen, wie sich periphere Blutlymphozyten von einem bereits infizierten Patienten gegenüber peripheren Blutlymphozyten gesunder Spender verhalten, nachdem sie erneut mit Leishmanien-Antigenen stimuliert wurden. Die isolierten PBL des Patienten wurden getestet, ob sie nach Stimulation mit Antigenen verschiedener Leishmanien-Stämme in der Lage sind zu proliferieren. Die Prolifera47 2. Ergebnisse tion der T-Zellen wurde mittels Einbau von 3H-Thymidin analysiert. Getestet wurden die Stämme Leishmania donovani und Leishmania mexicana. Diese zwei Stämme gehören unterschiedlichen Gruppen an, da die Leishmaniose in die viszerale, die kutane und die mukokutane Form eingeteilt werden, welche von unterschiedlichen Spezies hervorgerufen werden. Die Einteilung der Leishmaniose-Formen ist in Tabelle 2.6 dargestellt. Viszerale Leishmaniose L. donovani-Komplex: donovani, infantum, chagasi L. tropica L. amazonensis Kutane Leishmaniose L. tropica Der Alten Welt L. major L. aetiopica L. infantum L. donovani Kutane Leishmaniose L. brasiliensis Der Neuen Welt L.mexicana-Komplex: mexicana, pifanoi, amazonensis, venezuelensis L. chagasi Subgenius Viannia Mukokutane Leishmanio- L. brasiliensis-Komplex: brasiliensis, peruviai, panase mensis, guyanensis, L.mexicana-Komplex L. amazonensis Subgenius Viannia Tabelle 2.6: Verlaufsformen der Leishmaniose und ihre Erreger Um die Proliferation der stimulierten Blutlymphozyten zu untersuchen wurden PBL aus dem peripheren Blut des Patienten A und zwei gesunden Kontrollspendern mittels eines Ficollgradienten isoliert und gezählt. Auf einer 96-well Platte wurden 1x105 Zellen pro well ausplattiert. Zu den ausplattierten Zellen wurden Antigenlösungen in linearen Verdünnungen hinzugefügt. Die Verdünnungen der Antigenlösungen wurden in Vorversuchen ermittelt und nach den Ergebnissen von 1:50 bis 1:3200 gewählt. Mittels des Ein- 48 2. Ergebnisse baus von 3H-Thymidin wurde die Proliferation der stimulierten Zellen des Patienten und den Zellen der Kontrollspender gemessen und analysiert. Proliferationstest L. donovani T Zell Proliferation in cpm 12000 10000 8000 Patient A Spender 1 6000 Spender 2 4000 2000 1: 50 1: 10 0 1: 20 0 1: 40 0 1: 80 0 1: 16 00 1: 32 00 M ed iu m 0 Antigenkonzentrat Verdünnung L. donovani Verdünnung Patient A Spender 1 Spender 2 1:50 9538 1228 1230 1:100 7583 784 1108 1:200 6504 713 841 1:400 5509 376 777 1:800 3047 446 458 1:1600 1454 231 225 1:3200 645 231 231 Medium 167 228 244 Abbildung 2.11 und dazugehörige Wertetabelle: T Zell Proliferationsassay mit PBL des Patienten SC nach Stimulation mit steigenden L. donovani Antigenkonzentrationen. PBL des Patienten sowie zweier Kontrollspender wurden mit steigenden Antigenkonzentrationen stimuliert und anschließend die Proliferation der T-Zellen mit Hilfe von radioaktiv markiertem Thymidin (3H Thymidin) bestimmt. 49 2. Ergebnisse Die Zellen des Patienten zeigten eine heftige Reaktion auf die Stimulation durch den Antigenstamm L. donovani. Die Zell-Proliferation nimmt linear zur Verdünnung des Antigenkonzentrats zu, während die Zellen der gesunden Kontrollspender, die zuvor keinen Kontakt mit Leishmanien-Antigenen hatten, nur eine geringe Reaktion zeigten. Bei Antigenkonzentrationen unter einem gewissen Schwellenwert (1:800) zeigte sich keinerlei Reaktion der Zellen auf die Stimulation. Erst bei höheren Konzentrationen wurde, und dann auch nur in geringem Maße, eine Erhöhung der T Zell Proliferation festgestellt. Dem gegenüber konnte bei dem Patienten ein signifikanter Anstieg der T Zell Proliferation mit steigenden Antigenkonzentrationen experimentell bestimmt werden. Bereits bei der niedrigsten Konzentration (1:3200) zeigte sich bei dem Patienten eine Erhöhung der Proliferationsrate um Faktor drei gegenüber den beiden Kontrollspendern. Bei der höchsten getesteten Konzentration (1:50) wurde eine um den Faktor acht höhere Proliferationsrate gemessen. Aufgrund der beobachteten Reaktivität der T-Zellen des Patienten auf Stimulation mit hochverdünntem Antigen, kann man von einer spezifischen Immunantwort ausgehen. Dahingegen setzt die T Zell Antwort der Kontrollspender erst bei hohen Konzentrationen in einem weitaus geringeren Maße ein. Dies könnte für eine unspezifische Immunantwort sprechen. T Zell Proliferation als Reaktion auf die Leishmanien-Stimulation zeigte der Patient A nicht ausschließlich bei dem Stamm L. donovani an dem er erkrankt war, sondern auch nach Stimulation mit dem Stamm L. mexicana (s. Abbildung 2.12). 50 2. Ergebnisse Proliferationstest L. mexicana 10000 Patient A 8000 Spender 1 Spender 2 6000 4000 2000 0 1: 5 0 10 1: 0 20 1: 1: 40 0 0 80 1: 60 0 1: 1 M 1: 3 ed 20 0 0 iu m T Zell Proliferation in cpm 12000 Antigenkonzentrat Verdünnung L. mexicana Verdünnung Patient A Spender 1 Spender 2 1:50 9806 791 1335 1:100 10024 657 1275 1:200 7753 594 1072 1:400 5323 289 617 1:800 3131 107 424 1:1600 1571 97 191 1:3200 124 129 175 Medium 73 141 239 Abbildung 2.12 und dazugehörige Wertetabelle: T Zell Proliferationsassay mit PBL des Patienten A nach Stimulation mit steigenden L. mexicana Antigenkonzentrationen. PBL des Patienten sowie zweier Kontrollspender wurden mit steigenden Antigenkonzentrationen stimuliert und anschließend die Proliferation der T-Zellen mit Hilfe von radioaktiv markiertem 3 Thymidin ( H Thymidin) bestimmt. In Analogie zu den Experimenten mit dem Antigenstamm L. donovani wurden PBL des Patienten A und der beiden Kontrollspender in T Zell Proliferationsassays mit unterschiedlichen Konzentrationen Antigenstamm L. mexicana getestet. Mit zunehmenden Konzentrationen an Antigen wiesen die T-Zellen des Patienten nach der Stimulation durch den Antigenstamm L. mexicana einen starken, nahezu linearen Anstieg der Proliferationsrate bis zu einem Sättigungspunkt (bei einer Verdünnung von 1:100) auf. 51 2. Ergebnisse Dahingegen zeigten die Zellen der gesunden Kontrollspender nur eine geringe Reaktivität gegenüber der Stimulation mit L. mexicana. Bei Antigenkonzentrationen unter einem gewissen Schwellenwert (1:800) konnte keinerlei Reaktion der Zellen auf die Stimulation nachgewiesen werden. Auch in dieser experimentellen Reihe wurde erst bei höheren Konzentrationen, und dann wiederum nur in geringem Maße, eine Erhöhung der T Zell Proliferation festgestellt. Dem gegenüber konnte bei dem Patienten ein signifikanter Anstieg der T Zell Proliferation mit steigenden Antigenkonzentrationen experimentell bestimmt werden. Bereits bei der niedrigsten Konzentration (1:3200) zeigte sich bei dem Patienten eine Erhöhung der Proliferationsrate um Faktor fünf gegenüber den beiden Kontrollspendern. Bei der höchsten getesteten Konzentration (1:50) wurde eine um den Faktor acht höhere Proliferationsrate gemessen. Interessanterweise wies Spender 2 gegenüber Spender 1 eine durchgängig erhöhte Proliferationsrate nach der Stimulation mit L.mexicana auf, was möglicherweise auf eine zurückliegende unterschwellige Exposition hinweist. 2.3.4 Die Funktion von γδ T-Zellen und αβ T-Zellen bei der Proliferation nach Stimulation mit L.donovani-Antigen Es wurden gezeigt, dass durch eine Leishmania Infektion eine Expansion der γδ TZellen induziert wird und dass die T-Zellen in der Lage sind nach Stimulation mit den Leishmanien-Antigenen zu proliferieren und eine Immunantwort zu erzeugen. Die Aufgabe der γδ T-Zellen bei der Immunantwort auf Infektionen mit Pathogenen ist noch weitestgehend unklar, jedoch deuten einige Hinweise darauf hin, dass γδ T-Zellen bei der ersten Linie der Immunabwehr eine Rolle spielen und zusätzlich eine schützende Funktion dabei übernehmen. T-Zellen, die den γδ T-Zell Rezeptor exprimieren, sind in der Lage in einem frühen Stadium der Immunabwehr zwischen intrazellulären und extrazellulären Pathogenen zu unterscheiden und entsprechend Interferon-γ oder Interleukin-4 zu produzieren (Ferrick et al., 1995). 52 2. Ergebnisse Um die Funktion der einzelnen Subspezies der T-Zellen bei der induzierten Immunantwort gegen die Leishmanien-Antigene exakter zu analysieren, wurden die peripheren Blutlymphozyten des Patienten in αβ- und γδ-T Zellfraktionen getrennt, mit L.donovaniAntigen stimuliert und die Immunantwort anhand der Proliferation gemessen. Dazu wurden PBL aus dem peripheren Blut des Patienten mittels eines Ficollgradienten isoliert und die so gewonnenen Zellen mittels MACS (Magnetic Activated Cell Separation) in die einzelnen Zellfraktionen aufgetrennt. Die Zellen der einzelnen Fraktionen wurden auf einer 96-well Platte ausplattiert. Die Hälfte der Zellen wurden mit L. donovani Antigen stimuliert, die andere Hälfte blieb unstimuliert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2.13 dargestellt. Proliferation von γδ T Zellen und αβ T Zellen nach Stimulation mit L.donovani γδ+ pat + med. γδ− pat + L. Donovani γδ+ / γδ− 0 2000 4000 6000 8000 10000 T Zell Proliferation in cpm Zellfraktionen Medium L. donovani γδ + 247 209 γδ - 258 6035 γδ+ / γδ- 222 8333 Abbildung 2.13 und dazugehörige Wertetabelle: Proliferationsassay mit isolierten γδ- und αβ- TZellen nach Stimulation mit L. donovani Antigen Die mittels MACS separierten T Zellfraktionen wurden in definierter Anzahl auf einer 96-well Platte ausplattiert und mit dem L. donovani Antigen stimuliert. Die Proliferationsrate der T Zell Fraktionen wurde über den Einbau von 3H-Thymidin ermittelt und an einem TopCount in cpm gemessen. Die T Zell Fraktionen (γγδ+ und γδ-) wurden einzeln und in Kombination getestet. 53 2. Ergebnisse Die γδ T-Zell Fraktion des Patienten war alleine nicht in der Lage eine Immunantwort auf die Stimulation mit dem L. donovani Antigen auszulösen. Im Vergleich zu den unstimulierten Zellen zeigte sich keinerlei Proliferation nach Zugabe des Antigens. Das lässt darauf schließen, dass die Stimulation durch das Antigen eine Expansion der γδ TZellen induziert, die γδ T-Zellen alleine jedoch nicht in der Lage sind nach erneuter Stimulation durch dasselbe Antigen zu proliferieren. Die γδ T-Zellen könnten eine Cofunktion bei der weiteren Immunantwort spielen. Wie von Ferrick et al. beschrieben könnte dies eine Schutzfunktion während der Antwort sein. Bei der γδ-Negativfraktion, die eine Anreicherung der αβ T-Zellen darstellt, wurde im Vergleich zu den unstimulierten Zellen ein Anstieg der Proliferation um einen Faktor größer 20. Dies zeigt, dass die αβ T-Zellen eine aktive Funktion bei der Immunabwehr gegen die Leishmanien-Antigene spielen könnten, da sie in der Lage sind nach Stimulation mit dem Antigen zu proliferieren. Ein interessantes Ergebnis zeigt die Kombination der beiden T-Zell Fraktionen. Die zuvor separierten Fraktionen wurden wieder zusammen ausplattiert und mit dem Antigen stimuliert. Im Vergleich zu den unstimulierten Zellen zeigte sich ein Anstieg der Proliferationsrate um Faktor 37. Im Gegensatz zu der γδNegativfraktion bedeutet das ein erneuter Anstieg um Faktor 1,3. Dies könnte darauf schließen lassen, dass die γδ T-Zellen eine helfende Cofunktion bei der Immunantwort spielen, da sie alleine nicht in der Lage sind zu proliferieren, jedoch in Kooperation mit den αβ T-Zellen für eine deutliche Erhöhung der Proliferation verantwortlich zu sein scheinen. Die bisherigen Ergebnisse haben gezeigt, dass Leishmanien-Antigene eine Expansion der γδ T-Zellen verursachen können, diese γδ T-Zellen alleine aber nicht in der Lage sind auf eine erneute Stimulation mit dem Antigen zu proliferieren. Eine mögliche Funktion der γδ T-Zellen besteht als Cofaktor bei der Immunantwort auf parasitäre Pathogene. Es stellt sich die Frage, in wieweit sich die Expression der Rezeptoren auf der Oberfläche der γδ T-Zellen durch eine erneute Stimulation mit dem Antigen ändert. Dazu wurden unstimulierte PBL des Patienten mit Antigen-stimulierten PBL (PrimeLymphocyte-Test= PLT) des Patienten verglichen, und das Vorkommen der einzelnen Oberflächenmerkmale bestimmt. Das Ergebnis ist in Abbildung 2.14 dargestellt. 54 2. Ergebnisse 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% PBLs 3 Vd 2 Vd 1 Vd 3, 5 4 Vg Vg ,4 2, 3 Vg R gd 56 TC 8 C D C D 4 PLT C D Expression der Rezeptoren in % Expression von Oberflächenrezeptoren des Patienten A auf PBL und PLT Oberflächenrezeptoren PBLs PLT CD4 32.98% 28.50% CD8 27% 18.46% CD56 2.89% 6.59% TCR γδ 16.02% 21.26% Vγ 2,3,4 8.40% 6.29% Vγ4 5.14% 6.29% Vγ3,5 3.07% 0.33% Vδ1 11.33% 12.29% Vδ2 4.25% 2.74% Vδ3 4.45% 1.29% Grafik 2.14 und dazugehörige Wertetabelle: Expression der Oberflächenrezeptoren des Patienten A auf der Oberfläche von PBL und Zellen des PLT. Die isolierten PBL des Patienten wurden mit den Zellen des PLT (Prime Lymphocyte Test) auf die Quantität der Expression ihrer Oberflächenrezeptoren verglichen. Die ermittelten Werte wurden durch Färbungen mit spezifischen Antikörpern am FACS ermittelt und sind in % angegeben. Der prozentuale Anteil der exprimierten Oberflächenmerkmale auf den peripheren Blutlymphozyten des Patienten unterliegt nur geringen Unterschieden zwischen den PBL und den Zellen des PLT. Die prozentualen Verhältnisse der einzelnen Merkmale änderten sich im Wesentlichen nicht, die meiste exprimierte δ-Kette bleibt die Vδ1-Kette, auch der hohe Anteil der exprimierten Vγ2,3,4-Kette bleibt erhalten. Die erneute Stimulation 55 2. Ergebnisse mit dem Leishmania donovani-Antigen verursacht keine signifikante Änderung des Expressionsmusters der Oberflächenmerkmale. Das Expressionsmuster des Patienten, das sich, wie in 2.X dargestellt, von dem der gesunden Kontrollspendern in Bezug auf die γδ T-Zellen erheblich unterscheidet, wird durch das Krankheitsbild der L. donovaniInfektion und der Thymomerkrankung geprägt. Eine erneute Stimulierung der PBL durch das Antigen zeigt demnach keine signifikante Wirkung auf das Expressionsmuster der γδ T-Zell Subtypen. Erwähnenswert ist jedoch der Anstieg der CD56 positiven Fraktion um den Faktor 2,2. CD56 ist ein Rezeptor, der spezifisch auf der Oberfläche von NK Zellen exprimiert wird. Da der Patient im Laufe seiner Erkrankung eine fast komplette Depletion der NK-Zellen aufwies, stellte sich die Frage, in wieweit dieser kleine Anteil der Zellpopulation noch zytotoxisch aktiv ist, bzw. ob der Anstieg der NK-Zellpopulation einen möglichen Einfluß auf deren Funktion besitzt. Die zytotoxische Aktivität der NK-Zellpopulation wurde mittels eines Chromium Release Assays ermittelt. Dazu wurden PBL des Patienten und zweier gesunder Kontrollspender mittels eines Ficollgradienten isoliert und aus einem Teil mittels MACS die CD 56 positive Zellfraktion isoliert. Die so erhaltenen Zellen wurden als Effektorzellen gegen die NK-spezifische Targetzelllinie K562 eingesetzt und die zytolytische Aktivität der Zellen ermittelt. Die Zellen wurden in definierten E/T-Ratios ausplattiert, d.h. das Verhältnis der Effektorzellen zu den eingesetzten Targetzellen wurde quantitativ definiert, um eine Spezifität der zytolytischen Aktivität gegenüber der Targetzelllinie zu gewährleisten. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2.15 dargestellt. 56 2. Ergebnisse Lyseverhalten der PBL des Patienten A gegen K562 8000 Lyse in cpm 7000 6000 PBL SA 5000 PBL NR 4000 PBL A 3000 Medium 2000 1000 0 12:1 25:1 50:1 100:1 Effektor/Target Verhältnis Abbildung 2.15 Lyseverhalten der peripheren Blutlymphozyten des Patienten A gegen K562 Das Lyseverhalten der PBL des Patienten und zweier Kontrollspender (SA und NR) wurde in einem Chromium Release Assays auf die NK-sensitive Zelllinie K562 getestet um die Funktion der NK-Zellen des Patienten zu analysieren. Um eine spezifische Lysereaktion nachzuweisen wurden die Effektorzellen in definierten Mengen gegenüber den Targetzellen eingesetzt. Die zytolytische Aktivität wurde in cpm an einem TopCount gemessen und mit der Hintergrundsaktivität in Relation gesetzt. Eine zytolytische Aktivität der PBL des Patienten gegen die NK-Zell spezifische Zelllinie K562 war nicht zu beobachten. Die PBL der beiden gesunden Kontrollpersonen zeigten dagegen mit zunehmendem E/T-Verhältnis ein steigendes Lyseverhalten gegenüber K562. Dies deutet auf eine spezifische Reaktion der NK Zellen im peripheren Blut der Spender gegenüber der Targetzelllinie hin. Um inhibitorische Faktoren bei der Zytolyse innerhalb der peripheren Blutlymphozyten auszuschließen wurde die isolierte CD56+ Fraktion der PBL des Patienten alleine auf ihre zytolytische Aktivität untersucht. Die zytolytische Funktion der NK Zellen des Patienten wurde ebenfalls gegen die NK-sensitive Zelllinie K562 getestet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2.16 dargestellt. 57 2. Ergebnisse Lyse in cpm Lyseverhalten der isolierten NK Zellen des Patienten A gegen K562 10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Medium NK Zellen A f 5:1 2,5:1 Effektor/Target Verhältnis Abbildung 2.16: Lyseverhalten von NK Zellen des Patienten A gegen K562 Das Lyseverhalten der mittels MACS isolierten CD56+ Fraktion wurde auf die NK sensitive Zelllinie K562 getestet. Die Lyse wurde mit einem Chromium Release Assay in cpm gemessen und mit der Hintergrundaktivität verglichen. Die Effektorzellen wurden in definierten Mengen zu den Targetzellen (5:1 und 2,5:1) eingesetzt, um eine spezifische Reaktion nachzuweisen. 2.4 Etablierung einer Methode zur Analyse des T-Zell-Repertoires: Spectratyping T Zell Rezeptoren sind Heterodimere, die entweder eine Kombination aus unterschiedlichen α- und β- oder γ- und δ-Ketten exprimieren, wovon jede von den rearrangierten V(D)J-Gen Segmenten und einer C-Region codiert wird. Die Anzahl der V- und J- Regionen der Maus und des Menschen sind bekannt und in Tabelle 2.7 dargestellt. Vα / Vδ Vβ Vγ Jα Jβ Jγ Jδ Maus > 87 25 6 61 12 3 3 Mensch >64 60 12 61 13 5 3 Tabelle 2.7: Anzahl der V- und J- Regionen der Maus und des Menschen 58 2. Ergebnisse So umfasst das potentielle T-Zell Repertoire allein für die β-Ketten nahezu 2500 unterschiedliche Möglichkeiten, da 24 verschiedene V-Regionen, 13 J-Regionen und 8 verschiedene CDR3 Regionen bekannt sind (24x13x8). Konventionelle Ansätze die sich auf die Charakterisierung der V-Regionen beschränken können so nur einen Bruchteil des tatsächlichen Repertoires abbilden. Dies beschreibt in anschaulicher Weise die Mächtigkeit des Spectratyping-Ansatzes, bei dem durch eine geschickte Kombination PCR-basierter Ansätze mit anschließender Analyse an einem DNA-Sequenzer das gesamte T-Zell Repertoire einer Person dargestellt und sowohl quantitativ als auch qualitativ analysiert werden kann. Abbildung 2.17: Schematische Darstellung der Primer-Loci flankierend der CDR3-Region. a) zeigt die Loci der Vβ β-, Cβ β- und Jβ β-Primer flankierend der CDR3-Region für die Präamplifikation und die anschließende run-off Reaktion. b) stellt die polyklonale und monoklonale Darstellung der PCRs nach Analyse am DNA Sequenzer dar. Verglichen mit den α- und γ-Familien, sind die β- und δ-Familien mittels PCR einfacher zu analysieren, da sie eine geringere Anzahl von V- und J- Segmenten aufweisen. Die Etablierung dieser Analysemethode wurde demnach anhand des β-Rearrangments durchgeführt. Einige Ansätze zur Analyse des Repertoires beruhen auf einer direkten Amplifikation von cDNA zwischen Cβ- und Vβ-spezifischen Primern, bzw. auf Ampli59 2. Ergebnisse fikation von genomischer DNA zwischen Cβ- und Jβ-spezifischen Primern. Einer der beiden Primer trägt eine Fluoreszenzmarkierung, damit die Produkte anhand ihrer Peakgröße an einem DNA Sequenzer ausgewertet werden können. Abbildung 2.18: Schematischer Ablauf der Spectratyping Technologie (nach Pannetier und Kourilsky). Der Ablauf der Spectratyping Methode zeigt die RNA-Extraktion, die anschließende RT-PCR, die Präamplifikation, die Run-off-Reaktion und die Analyse am DNA-Sequenzer. Die Methode des Spectratyping wurde erstmals von Pannetier und Kourilsky beschrieben und beruht auf der Amplifikation mittels unmarkierten Vβ- und Cβ- oder Jβspezifischen Primern, die zur detaillierteren Analyse durch eine so genannte „Run-off“ Reaktion komplettiert wird. Diese „Run-off“ Reaktion beinhaltet einen fluoreszenzmarkierten Primer um die Ergebnisse sichtbar zu machen. Die „Run-off“ Produkte, welche 60 2. Ergebnisse die CDR3 Region beinhalten, können an einem DNA Sequenzer anhand der Peakgröße und ihres Bereiches analysiert werden. Der Ablauf der Spectratyping Methode ist in Abbildung 2.18 dargestellt. Um die Spectratyping Technologie im Labor experimentell zu etablieren wurde folgendes sequentielles Vorgehen gewählt: Als erstes wurde der Fokus auf die Optimierung der Präamplifikation, als zentraler Ausgangspunkt dieser Technologie, gelegt. Dieses Vorgehen beinhaltet verschiedene Vorteile. Erstens ist die Qualität der Präamplifikation von entscheidender Bedeutung für alle weiteren Schritte und zweitens erlaubt bereits die Analyse des Präamplifikats im DNA-Sequenzer konkrete Aussagen über das T-Zell Repertoire und eventuelle Auffälligkeiten dieses Repertoires. Vor diesem Hintergrund wurde zunächst das T-Zell Repertoire anhand der β-Segmente bestimmt. Alle bekannten humanen Vβ Segmente können mit der Hilfe von 25 Vβ-spezifischen Primern amplifiziert werden. Initial wurden als Kontrollen periphere Blutlymphozyten von zwei gesunden Kontrollspendern mittels Ficollgradienten isoliert. Aus den PBL wurde RNA isoliert, die in einer reversen Transkriptase Reaktion (RT-PCR) in cDNA transkribiert wurde. Zur Kontrolle der synthetisierten cDNA, wurde eine RT-PCR auf die Actin-RNA, als „housekeeping“ RNA, durchgeführt. Die Actin RT-PCR ist in Abbildung 2.19 dargestellt. Die synthetisierte und kontrollierte cDNA wurde als Matrize für die Amplifikation der βSegmente eingesetzt. Es wurden 25 Ansätze mit je einem spezifischen Vβ Primer und einem spezifischen Cβ Primer durchgeführt. Um die optimalen Bedingungen für die Präämplifikation zu bestimmen wurde ein fluoreszenzmarkierter Cβ Primer eingesetzt, der eine direkte Analyse dieser Amplifikation auf dem DNA Sequenzer ermöglicht. Die Ergebnisse der Amplifikationen der beiden Kontroll-cDNAs sind auszugsweise in Abbildung 2.20 dargestellt. 61 2. Ergebnisse Abbildung 2.19: Agarose-Gel-Analyse der RT-PCR mit spezifischen Primern für das Housekeeping-Gen Actin. Spur 1 zeigt den Längenstandardmarker, die Spuren 2 und 3 zeigen die PCR-Produkte isolierter PBL, die Spuren 4 und 5 zeigen αβ T-Zellen isoliert mittels MACS, die Spuren 5 und 7 zeigen die γδ T-ZellFraktion isoliert mittels MACS und Spur 8 zeigt die H2O-Kontrolle. Die Zellen stammen alle von einem gemeinsamen Spender. Abbildung 2.20: Specratyping Analyse der Vβ β-Kette zweier Kontrollspender. 62 2. Ergebnisse Die Abbildung zeigt auszugsweise 8 Amplifikationen der 25 etablierten Vβ β-Primer mit der DNA zweier Kontrollspender. Wie erwartet, lässt sich bei den Amplifikationen des humanen β-Segments eine charakteristische Verteilung erkennen. Sie besteht aus einer Ansammlung von durchschnittlich acht Peaks, die mit einem Abstand von drei Nukleotiden und im Normalfall einer gaußschen Verteilung auftreten. Das Vβ Repertoire lässt sich somit als eine Ansammlung von 25 x 8 = 200 Messungen umfassend beschreiben. Die acht Peaks, die als pseudogaußsche Verteilung vorliegen waren bei fast allen Amplifikaten der beiden Kontrollen zu erkennen. In etwa 5% der Messungen war nur eine schwache Amplifikation zu beobachten. 2.4.1 Anwendung der Spectratyping Technologie zur Analyse des γδ T Zell Repertoires von zwei Patienten mit γδ T Zell Expansion Die Spectratyping Technologie erlaubt es, das γδ T-Zell Repertoire schon anhand der Produkte der Präamplifikation zu charakterisieren. Die Etablierung der Analyse der δKette erfolgte anhand zweier Kontrollspender, die eine normale Verteilung der γδ TZellen im Blut aufwiesen. Es wurden mehrere Messungen zur Etablierung der Analyse des Vδ Repertoires durchgeführt, da derartige Analysen bislang noch nicht beschrieben wurden. Zu diesem Zweck wurden die PBL der beiden Kontrollspender wie oben beschrieben gewonnen. Aus den PBL wurde RNA isoliert und mittels RT-PCR in cDNA transkribiert. Nach einer Kontroll-Actin PCR wurde die Präamplifikation als erster Schritt der Spectratyping Technologie durchgeführt. Eingesetzt wurden sechs Vδ Primer Vδ1, Vδ2, Vδ3, Vδ4, Vδ5 und Vδ6 und ein fluoreszenzmarkierter Cδ Primer zur direkten Analyse am DNA Sequenzer. Vδ4, Vδ5 und Vδ6 sind Gene, deren Loci sich überlappend mit den Vα-Genen auf dem α-Locus befinden. Die Vδ4-, Vδ5- und Vδ6- Gene werden selten exprimiert und rearrangieren nicht mit der Vγ-Kette. Die Analyse des δ-Repertoires zweier Kontrollspender sind in Abbildung 2.21 dargestellt. 63 2. Ergebnisse Abbildung 2.21: Analyse des δ-Repertoires zweier Konrollspender D und Z Zur Analyse des δ Repertoires wurden sechs Vδ δ Primer (Vδ δ1-6) und ein fluoreszenzmarkierter Cδ δ Primer eingesetzt. Die Analyse erfolgte auf dem DNA Sequenzer Das δ-Repertoire der beiden Kontrollspender zeigte nicht die charakteristische Verteilung die das β-Repertoire gesunder Spender zeigt. Die Analyse des δ-Repertoires zeigt kein regelmäßiges Verteilungsmuster bzw. keine pseudo-gaußsche Verteilung. Bei gesunden Spendern ist das γδ T-Zell Repertoire nur im sehr geringen Masse exprimiert, eine Verteilung der Peaks kann dadurch nicht adäquat gemessen werden. Den größten Anteil der γδ T-Zellen stellt bei gesunden Spendern die Vγ9/Vδ2 Subpopulation dar. Die Messungen der Vδ2-Kette bei den beiden Kontrollspendern zeigt eine polyklonale Expression bei einer pseudo-gaußschen Verteilung der Peaks. Diese Verteilung lässt sich ausschließlich aufgrund der höher exprimierten Vγ9/Vδ2 Subpopulation nachweisen. Die Spectratyping Technologie erlaubt eine detaillierte Analyse des Repertoires der einzelnen T Zell Rezeptor Ketten. Minimale Veränderungen des Repertoires und der Klo64 2. Ergebnisse nalität der Zellen sind deutlich nachzuweisen. Da Anhäufungen von γδ T-Zellen im peripheren Blut und in Geweben bei verschiedenen Krankheiten beobachtet wurde, die Ursache und Funktion dieser Expansion jedoch weitestgehend unbekannt ist, stellt die Spectratyping Technologie eine sinnvolle, alternative Methode dar das T Zell Repertoire zu charakterisieren und zu analysieren. Bei dem in Kapitel 2.3 beschriebenen Patient A, der durch eine Leishmania donovani Infektion und/oder ein invasives Thymom eine Expansion der γδ T-Zellen aufweist wurde eine Analyse der δ Kette des TCR mittels sechs spezifischen Vδ (Vδ1-6) Primern und einem spezifischen, fluoreszenzmarkierten Cδ Primer durchgeführt. Die Messungen wurden zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten in einem Abstand von 30 Tagen durchgeführt, um eine potentielle Veränderung des Repertoires direkt erkennen und dokumentieren zu können. Die Ergebnisse sind in Abbildung 2.22 dargestellt. Abbildung 2.22: Darstellung des δ Repertoires des Patienten A Zur Analyse des δ Repertoires wurden sechs Vδ δ Primer (Vδ δ1-6) und ein fluoreszenzmarkierter Cδ δ Primer eingesetzt. Die Analyse erfolgte auf dem DNA Sequenzer. Die Messungen wurden zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten im Abstand von 30 Tagen durchgeführt um eine Veränderung des δ Repertoires bzw. der Klonalität der Zellen erkennen zu können. 65 2. Ergebnisse Die Analyse des δ Repertoires zeigt eine polyklonale Verteilung der γδ T-Zellpopulation. Bedingt durch die Überexpression der γδ T-Zellpopulation bei dem Patienten zeigt sich eine charakteristische pseudo-gaußsche Verteilung der Peaks bei den Subpopulationen Vδ1-Vδ5. Die Vδ6 Subpopulation wird bei dem Patienten nur gering exprimiert, dadurch ist hier keine charakteristische Verteilung der messbaren Peaks nachzuweisen. Das gemessene Repertoire zeigt zu den untersuchten Zeitpunkten keine Veränderung in der Klonalität der exprimierten δ-Ketten. Die in Kapitel 2.3 beschriebenen Ergebnisse zeigten, dass die Infektion des Patienten A mit L. donovani eine Expansion der γδ T-Zellpopulation induzieren kann, die γδ T-Zellen alleine jedoch keine Rolle bei der Immunantwort gegen die Leishmanien Antigene übernehmen. Die Methode der Spectratyping Analyse bietet nun die Möglichkeit das γδ T Zell Repertoire des Patienten A mit dem γδ T Zell Repertoire eines weiteren an einem invasiven Thymom erkrankten Patienten (B) zu vergleichen, der ebenfalls eine Expansion der γδ T-Zellpopulation aufweist. Ein Thymom ist ein Tumor, der von der Thymusdrüse ausgeht und sich meist im Kindes- oder Jugendalter manifestiert. Das Thymom ist der bekannteste Tumor des vorderen Mediastinums und ist mit einzelnen Symptomen des paraneoplastischen Syndrom wie z.B. Myasthenia gravis, Hypogammaglubulinämie und Pure red cell aplasia assoziiert. Die Diagnose erfolgt meist mittels Computertomographie des vorderen Mediastinums. Zu Beginn wurde das γδ T-Zell Repertoire des Patienten B mittels FACS analysiert. Dazu wurden PBL des Patienten mit Hilfe eines Ficollgradienten isoliert und mit spezifischen Antikörpern gegen die γ- und δ-Ketten gefärbt. Die Analyse und die Quantifizierung der γδ T-Zell Subpopulationen wurden am FACS durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2.8 dargestellt. 66 2. Ergebnisse Pat. A Pat. B TCR γδ 24,8 41,2 Vδ1 16 28,7 Vδ2 4,8 0,8 Vδ3 4,2 9,9 Vγ2,3,4 0,19 14,2 Vγ4 6,6 n.d. Vγ5 4,6 11,9 Vγ8 6,4 13,6 Vγ9 5 0,8 Tabelle 2.8: Expression und Quantifizierung der γδ T Zell Subpopulationen des Patienten B im Vergleich zu dem Patienten A. Mittels FACS Analysen wurde die Expression der einzelnen γ- und δ- Ketten auf der Oberfläche der PBL der Patienten B und A bestimmt und quantifizert. Die ermittelten Werte sind in Prozent dargestellt. Zur weiteren Charakterisierung wurden die PBL des Patienten B mittels der Methode des Spectratyping analysiert. Die Isolation der RNA und die anschließender Transkription wurden parallel zum Patienten A unter denselben Bedingungen wie beschrieben durchgeführt. Nach der Kontroll-Actin PCR wurde die Präamplifikation der Spectratyping Technologie durchgeführt. Eingesetzt wurden die sechs Vδ Primer Vδ1, Vδ2, Vδ3, Vδ4, Vδ5 und Vδ6 und ein fluoreszenzmarkierter Cδ Primer zur direkten Analyse am DNA Sequenzer. Die PCR-Messungen und die anschließende Analyse wurden zu den gleichen Zeitpunkten wie beim Patienten A im Abstand von 30 Tagen durchgeführt. Die Ergebnisse der Analysen des Vδ Zell Repertoires sind in Abbildung 2.23 dargestellt. 67 2. Ergebnisse Abbildung 2.23: Darstellung des δ Repertoires des Patienten B Zur Analyse des δ Repertoires wurden sechs Vδ δ Primer (Vδ δ1-6) und ein fluoreszenzmarkierter Cδ δ Primer eingesetzt. Die Analyse erfolgte auf dem DNA Sequenzer. Die Messungen wurden im zu zwei unterschiedlichen Zeitpunkten in einem Abstand von 30 Tagen durchgeführt um eine Veränderung des δ Repertoires bzw. der Klonalität der Zellen erkennen zu können. Das gemessene δ-Repertoire des Patienten B zeigt im Vergleich zum Patienten A eine oligoklonale Expression der einzelnen δ-Ketten. Es lässt sich keine pseudo-gaußsche Verteilung nachweisen, der Patient zeigt eine für ihn charakteristische Verteilung der Peaks, welche sich bei einer zweiten Messung nach 30 Tagen reproduzieren ließ. Das Expressionsmuster änderte sich bei der zweiten durchgeführten Messungen nicht wesentlich. Bei der zweiten Messung konnte bei der Expression der Vδ6-Kette nur ein Peak nachgewiesen werden. Die Expression des zweiten signifikanten Peaks konnte nicht mehr gezeigt werden. Bei der Vδ5-Kette wurde bei beiden Messungen nur ein Peak nachgewiesen , was auf eine monoklonale Expression hindeutet. Die Expansion der γδ T-Zell Subklasse, welche 68 2. Ergebnisse die Vδ5-Kette exprimiert lässt sich auf einen einzelnen Klon zurückführen, nicht auf eine Expansion der gesamten Subklasse. Das oligoklonale Expressionsmuster des Patienten B deutet auf eine spezifische antigen-abhängige Expression der γδ T-Zellen hin, da ausschließlich einzelne Klone stark expandiert sind. Bei dem Patienten A hingegen spricht die polyklonale Expression der δ-Ketten eher für eine antigen-unabhängige Expression, da nicht einzelne Klone, sondern die gesamten Subpopulationen expandiert sind. Die Expansion der γδ T-Zellen scheint auf sein gesamtes Krankheitsbild zurückzuführen zu sein, nicht auf ein bestimmtes Antigen . 69 3. Diskussion 3. Diskussion 3.1 Phänotypische und funktionale Charakterisierung von γδ T-Zell Subklassen In der vorliegenden Arbeit wurde die phänotypische und funktionale Charakterisierung von γδ T-Zell Subklassen gezeigt. Eine wichtige Rolle für die Regulation der T-Zell Funktion spielt die Expression von NK-Zellrezeptoren (NKRs) auf der Oberfläche der TZell Populationen. NKRs gehören zu der Immunglobulin-Superfamilie und sind verantwortlich für NK-Zell-Aktivierung bei der natürlichen Zytotoxitität. Einige dieser Rezeptoren werden auf T-Zell Subpopulationen exprimiert (Mingari et al., 1996). Eine derartige Coexpression von NK- und T-Zellrezeptoren kann die T-Zell-Rezeptor-vermittelte Aktivierung entsprechend modulieren - in Form einer Verstärkung durch die Expression eines aktivierenden NKR (NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46), oder in Form einer Inhibition durch die Expression eines inhibierenden Rezeptors (CD94, NKG2A, p58.1, p58.2, p140). Als Liganden für die meisten inhibitorischen und aktivierenden NKRs fungieren HLA-Klasse-Ia und -Ib-Moleküle. Im Vordergrund stand bisher die Charakterisierung der inhibitorischen Rezeptoren, während noch wenig über die aktivierenden Rezeptoren und deren Ligandensysteme bekannt ist, wobei insbesondere die Liganden der aktivierenden Rezeptoren noch unbekannt sind (Moretta et al., 2001). Eine Ausnahme bildet der C-Typ Lektin-ähnliche Rezeptor NKG2D, der mit den MHC-Klasse I-ähnlichen MICund ULBP-Molekülen interagiert. NKG2D wird nicht nur von NK-Zellen, sondern auch von CD8 αβ T-Zellen und γδ T-Zellen exprimiert und bildet mit dem Adaptor DAP10 einen aktivierenden Immunrezeptorkomplex (Bauer et al., 1999; Wu et al., 1999). Die etablierten und analysierten γδ T-Zell Klone exprimierten fast alle, unabhängig ihrer VγKetten und unabhängig der Spender, den Rezeptor NKG2D. Bindung von NKG2D an seine MHC-Klasse I ähnlichen Liganden löst Effektormechanismen, wie Zytotoxizität und Zytokinsekretion, aus und kostimuliert CD8 T-Zellen (Bauer et al., 1999; Cosman et al., 2001; Groh et al., 2001). Auf der Oberfläche der etablierten Vγ2,3,4- und Vγ4-Klonen wurde keine Expression eines weiteren aktivierenden Rezeptors nachgewiesen. Jedoch zeigten die etablierten Vγ4-Klone, die fast ausschließlich die Vδ1-Kette exprimierten, eine große Anzahl von 70 3. Diskussion inhibierenden NK-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche. Die Affinität der inhibitorischen KIR und CD94/NKG2 Rezeptoren für MHC-Klasse I Moleküle ist höher als die der aktivierenden Rezeptoren. Dies hat eine Dominanz des inhibitorischen Signals zur Folge. KIRs und CD94/NKG2-Rezeptoren decken nur partiell das gleiche Spektrum von MHCKlasse I Molekülen ab, so dass man von einer komplementären Aufgabenteilung der Überwachung von Biosynthese und Expression der meisten HLA-Klasse I Moleküle ausgehen kann (Lopez-Botet et al., 2000). In beiden Rezeptorsystemen ist die jeweilige Bindungsaffinität des inhibitorischen Rezeptors (CD94/NKG2A) höher als die des aktivierenden Rezeptors (CD94/NKG2C). Dies stellt die Dominanz des inhibitorischen Signals sicher (Vales-Gomez et al., 1999). NKG2D scheint im Gegensatz dazu aber die Signale inhibitorischer Rezeptoren zu überdecken und löst somit trotz der inhibitorischen Signale eine Zelllyse aus (Cerwenka und Lanier, 2001). Dies bestätigen die Zytotoxititätsuntersuchungen der etablierten Vγ4Klone gegenüber unterschiedlichen Tumorzelllinien. Fast alle der charakterisierten Klone zeigen ein auffällig hohes Lyseverhalten gegenüber einer oder mehrerer Tumorzelllinien bei gleichzeitiger Expression des NKG2D-Rezeptors. Auffällig zeigte sich das Lyseverhalten nahezu aller Vγ4-Klone des Spenders A gegenüber der Zelllinie DG75. DG75 ist eine EBV-negative lymphoide Zelllinie, die klinisch und histologisch einer Burkitt-Lymphomlinie ähnelt. Sie besitzt IgM-kappa Immungobuline auf der Zelloberfäche, die normalerweise auf unreifen B-Zellen zu finden sind. IgM-Immunglobuline besitzen eine geringe Bindungsstärke, zeigen jedoch hohe biologische Aktivität wie Antigenaggregation und Agglutination. Bislang wurde gezeigt, dass Vγ9/δ2 T-Zell Klone aus dem peripheren Blut gesunder Spender in der Lage sind, DG75 Zellen zu lysieren (Kaur et al., 1994). Die etablierten Vγ4-Klone des Spenders M zeigten ein identisches Expressionsmuster der aktivierenden und inhibierenden NK-Rezeptoren und zeigten auch in ihrem Lyseverhalten gegenüber unterschiedlichen Tumorzelllinien ein ähnliches Verhalten. Sie alle waren in der Lage die Tumorzelllinien Rael, ST486, Bjab, Namalva und BL29 zu lysieren. Diese Tumorzelllinien sind humane, humane EBV-positive Burkitt-LymphomZelllinien. Dieses signifikante Lyseverhalten könnte im Zusammenhang mit den exprimierten Oberflächenrezeptoren stehen. 71 3. Diskussion Neben der Expression des NKG2D Rezeptors zeigten alle Klone eine Expression des CD94/NKG2A Heterodimers und von CD158k. NKG2A und NKG2C binden beide das nicht-klassische HLA-Molekül HLA-E (Braud, 1998; Wada, 2004), wobei NKG2A und NKG2C nie auf ein und der selben Zelle vorkommen (Jabri, 2002; Cantoni, 1998) und NKG2A eine höhere Affinität zu seinem Liganden aufweist (Vales-Gomez, 2000). Auf der Oberfläche exprimiert, kann HLA-E mit CD94/NKG2A auf der Zelle interagieren und die Lyse der HLA-E-positiven Zielzellen inhibieren. Ist die HLA-A, - B oder –C Expression oder der TAP-Komplex in Folge von Virusinfektionen oder in Tumorzellen gestört, so kann HLA-E nicht die Zelloberfläche erreichen, und es kann keine Inhibition über CD94/NKG2A erfolgen (Yokoyama, 1998; O’Callaghan, 2000). Die etablierten Vγ5- und Vγ8- Klone zeigten fast ausschließlich eine Expression von aktivierenden Rezeptoren. Zu dem NKG2D-Rezeptor zeigten einige der analysierten Zell-Klone Expression des NCRs (natural cytotoxicity receptors) NKp30. Die Gruppe der NCRs stehen für die Vermittlung der Zytotoxizität gegenüber MHC-Klasse I negativen Zielzellen (Moretta et al., 2000). Bestimmte NCRs (NKp30, NKp46) kommen auf ruhenden und aktivierten NK-Zellen vor, während ein anderer NCR (NKp44) nur von IL-2aktivierten NK-Zellen exprimiert wird. Die korrespondierenden Liganden auf den Targetzellen sind noch nicht identifiziert (Moretta et al. 2000; Moretta et al. 2001). Die charakterisierten Vγ5-Klone zeigten nur geringe zytolytische Aktivität gegenüber meist nur einer der getesteten Tumorzelllinien. Da man den NCRs eine eher costimulatorische Wirkungsfunktion zuschreibt und der NKp30 Rezeptor sowohl auf aktiven als auch auf ruhenden Zellen exprimiert wird, scheint dieser alleine keine große Rolle bei der zytolytischen Funktion der Vγ5 Klone zu spielen. Die Vγ9/Vδ2 T-Zell Subpopulation stellt die größte Fraktion der γδ T-Zellen dar und ist die bislang am Besten analysierte Subklasse. Beide etablierten Klone dieser Klasse exprimieren den aktivierenden Rezeptor NKG2D. Auch zeigen beide Vγ9-Klone die inhibitorischen Rezeptoren CD94 und NKG2A, die an der Zelloberfläche als Heterodimer vorliegen. 80% der Vγ9/δ2-Zellenden exprimieren den CD94/NKG2A Rezeptor auf ihrer Oberfläche (Battistini et al., 1997). Die Vγ9 Klone exprimierten zusätzlich inhibitorische Rezeptoren (p140, p58.2) der KIR-Klasse. KIR Gene haben sich in Primaten entwickelt 72 3. Diskussion um eine Rezeptorfamilie mit einer einzigartigen Struktur zu generieren, die in der Lage ist, MHC Klasse I Moleküle mit Locus und Allelspezifität zu erkennen. 3.2 Die Rolle der NK-Rezeptoren in der T-Zell-vermittelten Tumorbekämpfung Bestimmte Tumorzelllinien werden allein durch NKR erkannt und lysiert, Melanome und Leukämien hingegen bedürfen einer Interaktion von NKR und NKG2D. NKR und NKG2D agieren komplementär in Abhängigkeit von dem jeweiligen Rezeptorrepertoire der Tumorzelle. Die Affinität der inhibitorischen KIR und CD94/NKG2 Rezeptoren für MHC-Klasse I Moleküle ist höher als die der aktivierenden Rezeptoren. Dies hat eine Dominanz des inhibitorischen Signals zur Folge. NKG2D scheint im Gegensatz dazu aber die Signale inhibitorischer Rezeptoren zu überdecken und löst somit trotz der inhibitorischen Signale eine Zelllyse aus (Cerwenka und Lanier, 2001). Der genaue Mechanismus dieses Vorganges ist nicht bekannt, scheint aber durch eine höhere Affinität des NKG2D für die Liganden hervorgerufen zu werden (Li et al., 2001). Einige Tumore exprimieren äußerst zahlreich MHC-Klasse I Moleküle und verschiedene MHC-Klasse I ähnliche Moleküle, so dass die höhere NKG2D Affinität in der Integration der verschiedenen inhibitorischen und aktivierenden Signale unterzugehen scheint (Pende et al., 2001). Demnach scheint jede einzelne T-Zelle ihr ganz spezifisches, inhibitorisches und aktivierendes Rezeptorrepertoire zu exprimieren. Die Zytotoxizität wird durch die Balance der inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren, welche mit MHC-Klasse I Molekülen der Zielzelloberfläche oder MHC-unabhängig reagieren, reguliert. 3.3 Bestimmung des Zytokinexpressionsprofils der isolierten γδ T- Zellklone Zytokine sind hormonähnliche Proteine, die von Leukozyten und einer Vielzahl weiterer Zellen produziert werden. Sie wirken regulatorisch auf entzündliche Prozesse. Im Ge73 3. Diskussion gensatz zu Hormonen, die von einem spezifischen Zelltyp gebildet werden, können Zytokine eines Typs auch von verschiedenen Zellen produziert werden. Sie haben pleiotrope und durch verschiedene Zellen redundant gewährleistete Funktionen. Zytokine wirken autokrin, parakrin, juxtakrin und nur selten endokrin. Zu den Zytokinen zählen Interferone, koloniestimulierende Faktoren, Wachstumsfaktoren, Chemokine und Interleukine. Tabelle 4.1: Übersicht der im Expressionsprofil dargestellten Zytokine: Übersicht der getesteten Zytokine IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γγ und TNF-α α, die Zellen, die sie sezernieren, ihre immunologischen Funktionen und ihre Zielzellen 74 3. Diskussion Die Wirkung der Zytokine ist von der Zielzelle abhängig, sie wirken auf B-Zellen, TZellen Makrophagen, Gewebezellen und hämatopoetische Zellen. Die Sekretion von Zytokinen ist wesentlich für die Beseitigung einer Infektion durch zytotoxische T-Zellen. Die meisten zytotoxischen T-Zellen sind aber auch in der Lage Interferon-γ (IFN-γ) und TNF-α freisetzen, die ebenfalls zur Wirtsverteidigung beitragen. Zur weiteren Funktionsanalyse der etablierten γδ T-Zellklone wurde ein Zytokinexpressionsprofil erstellt, welches die Expression der Zytokine Interferon-γ, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5 und IL-10 beeinhaltet. Die immunologische Funktion dieser Zytokine und ihre jeweiligen Zielzellen sind in Tabelle 4.1 dargestellt. Alle getesteten Klone zeigten nach Stimulation einen deutlichen Anstieg der beiden Zytokine TNFα- und IFN-γ. Beide Zytokine stehen im Zusammenhang mit der zytolytischen Aktivität der Zellen und deren Lyseverhalten gegenüber Tumorzelllinien. TNF-α stimuliert die Proliferation von T-Zellen in Abwesenheit von IL-2 und wirkt als Proliferationsfaktor bzw. Differenzierungsfaktor für B-Lymphozyten. Rezeptoren der TNFαFamilie besitzen die Eigenschaft, zytotoxische Signale in das Zytoplasma weiterzuleiten. Daneben erfüllen die meisten dieser Rezeptoren noch weitere Funktionen, wie z. B. Zellaktivierung, Zelldifferenzierung und Zellproliferation. Fast alle Zellen exprimieren Rezeptoren für TNF-α. Eine Rezeptoraktivierung der Zielzelle führt schließlich zur Induktion von Genen, die zur Entzündungsreaktion oder Akutphasenreaktion beitragen. Interferon-γ (IFN-γ), wird von Mitogen- oder Antigen-stimulierten T-Lypmphozyten produziert. Es induziert die Expression von Klasse-II-Molekülen bei einer großen Vielzahl von Zellen, inklusive T-Lymphozyten, Mastzellen, Fibroblasten, Neuronen, Melanozyten und bei einer Zahl von Zellinien, die von Tumoren stammen. IFN-γ scheint bei der Aktivierung der Zytotoxizität gegen Tumorzellen und der antimikrobiellen Aktivität von Makrophagen eine große Rolle zu spielen. Da das Erscheinen von Klasse-II-Molekülen viele dieser Zellen dazu befähigt, den T-Lymphozyten Fremdantigen zu präsentieren, wird angenommen, dass IFN-γ als einer der Regulatoren des Immunsystems. Die erstellten Zytokinprofile lassen den Schluß zu, dass die Expression der Zytokine abhängig vom jeweiligen Subtyp der γδ T-Zell Fraktion ist. Denn obwohl alle Klone die Zytokine TNF-α und IFN-γ exprimieren zeigen sich bei den getesteten Interleukinen 75 3. Diskussion durchaus eine Spezifität hinsichtlich der Vγ-Ketten. Die Expression von Zytokinen lässt durchaus auf eine immunologische Reaktion der Zellen gegenüber dem eingesetzten Antigen schließen, jedoch wird die Zytotoxizität durch ein Zusammenspiel der Zytokinexpression und der Balance der inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren auf jeder einzelnen T-Zelle reguliert. 3.4 Immunhistochemischer Nachweis von γδ T-Zellen in Paraffin- und Gefrierschnitten Die Immunhistochemie oder Immunhistologie dient dem Nachweis von Zellstrukturen (meist Oberflächenproteinen) durch Antikörper. Unterschiedliche industriell erzeugte Antikörper gegen verschiedene zelluläre Proteine sind zum Nachweis von Tumoren oder auch Krankheitserregern geeignet. Um die Rolle der γδ T Zellen bei Tumoren und anderen Krankheiten besser untersuchen zu können, wäre es von Vorteil, γδ T Zellen spezifisch am Gewebeschnitt des Tumors nachweisen zu können. Da die Funktion der γδ T-Zellen weitestgehend unbekannt ist, wurde bislang kein Antikörper gegen den γδ TZell-Rezeptor an Paraffinmaterial beschrieben, da er für die Routinediagnostik bislang nicht eingesetzt wurde. Da in der Diagnostik die häufigste Form des Gewebeschnitts der Paraffinschnitt ist wurde der Fokus in dieser Arbeit auf die Etablierung eines paraffingängigen γδ T-Zell Antikörpers gelegt. Bei Paraffinschnitten wird das Gewebe zuvor fixiert. Durch diese Fixierung des Gewebes mit Formalin sind die Epitope oft verändert und für die spezifischen Antikörper nicht zugänglich. In diesem Fall müssen die Antigene im Gewebe durch eine spezielle Vorbehandlung wieder freigelegt werden (Antigendemaskierung). Für jeden in der Immunhistologie eingesetzten Antikörper muss die Konzentration, die Inkubationszeiten und bedingungen und die Demaskierungsmethode etabliert werden. Die Bindungsfähigkeit der eingesetzten Antikörper wurde in vivo an γδ T-Zell Klonen gezeigt. Alle eingesetzten Antikörper binden spezifisch an den γδ T-Zell Rezeptor. Die Vernetzung der Proteine durch die Formalinfixierung, kann zur Zerstörung antigener Strukturen führen. Um dies auszuschließen wurde an lebenden Zellen auf Adhäsionsobjektträgern gezeigt, dass die verwendete 4%ige Formalinlösung keinen Einfluss auf das Bindungsverhalten der ein76 3. Diskussion gesetzten γδ T-Zell Antikörper hat. Die Färbungen zeigten, dass der eingesetzte γδ TZell Antikörper an T-Zell Klonen in vivo in der Lage ist den γδ T-Zell Rezeptor spezifisch nachzuweisen und dass auch nach einer Fixierung mit 4%Formalin das Epitop der TZellen nicht zerstört wird. Nach Herstellung der Paraffinschnitte auf Objektträgern und anschließendem Färben der Schnitte mittels der ABC Methode war keine spezifische Färbung erkennbar. Der zur Kontrolle eingesetzte CD20 Antikörper zeigte eine spezifische Färbung an der eingesetzten B-Zelllinie. Der γδ T-Zell Antikörper wurde in unterschiedlichen Konzentrationen eingesetzt und gleichzeitig wurden verschiedene enzymatische und temperaturabhängige Demaskierungsmethoden verwendet. Bei keiner der eingesetzten Kombinationen war eine spezifische Färbung des γδ T-Zell Rezeptors nachzuweisen. Probleme beim immunhistologischen Nachweis an Paraffinschnitten können übermäßig verdünnte oder zu stark konzentrierte Reagenzien sein. Ein weiteres Problem kann die Dissoziation der Primärantikörper-Antigen Bindung während der Waschschritte oder der Inkubation mit Brückenantikörpern sein. Eine weitere Möglichkeit der ausbleibenden Färbung ist ein zu hoher Natriumazid- (NaN3) Gehalt im Verdünnungs- oder Waschpufferbad. Dass der eingesetzte γδ T-Zell Antikörper eine spezifische Färbung am Gefrierschnitt aufweist, lässt darauf schließen, dass das Problem beim Paraffinmaterial an der Einbettung, der Entparaffinierung oder der Demaskierung zu finden ist. Die Immunreaktivität kann durch die Einbettung oder die Entparaffinierung vermindert oder zerstört sein. Die eingesetzten Schritte zur Antigendemaskierung können für die Freilegung des Epitops ungeeignet sein. Die Etablierung der optimalen Demaskierungsmethode ist sehr aufwändig, da die Notwendigkeit der Vorbehandlung von der Art und Dauer der Fixierung, den spezifischen Eigenschaften des Antigens und der Art des verwendeten Primärantikörpers abhängt. Es gibt keine Vorbehandlung, die für alle Antigene oder Anwendungen geeignet ist. Die Immunhistochemische Untersuchung gewinnt immer mehr an Bedeutung, da mit ihrer Hilfe tumorspezifische Proteine erkannt werden können - dies erleichtert die Tumordiagnose. Außerdem können Tumoren schon vor der Therapie auf ihre Empfindlichkeit gegenüber speziellen Medikamenten getestet werden (Herceptin beim Mammakarzinom, Wachstumsfaktor beim Dickdarmkarzinom). Zusätzlich könnte eine Früherken- 77 3. Diskussion nung bestimmter Krankheiten möglich sein, die im Zusammenhang mit der Akkumulation von bestimmten Zellen im Gewebe stehen. Dies zeigen auch die Färbungen der Gefrierschnitte, an denen gezeigt werden konnte, dass γδ-T-Zellen spezifisch in Tumorgewebe vorkommen und akkumulieren. Für den Nachweis von γδ-T-Zell-Anhäufungen im Gewebe in er Routine der Pathologie müsste jedoch ein paraffingängiger γδ-TCR-Antikörper etabliert werden. 3.5 Die Rolle der γδ T-Lymphozyten bei Infektionen und Tumorerkrankungen Die Mehrheit der T-Lymphozyten im peripheren Blut exprimiert den αβ T-Zell Rezeptor (TCR) und nur etwa 1-10 % der T-Lymphozyten im peripheren Blut gesunder Spender exprimieren den γδ TCR. Die αβ- und γδ-T-Zellen verhalten sich unterschiedlich bei der Immunabwehr. Die immunologische Funktion der γδ-T-Zellen ist noch weitestgehend unklar, jedoch wird ihnen eine bedeutende Rolle als „first line of defense“ (Hiromatsu et al., 1992) sowie ein starkes immunmodulatorisches Potential und Schutzfunktionen (Mombaerts et al., 1993; Fu et al., 1994) zugeschrieben. Sie sind, anders als die αβ-TZellen, nicht MHC restringiert und exprimieren meistens weder in der Maus noch im Menschen CD4 oder CD8 Korezeptoren. Anhäufungen von γδ T-Zellen im peripheren Blut und in Geweben wurden bei verschiedenen Krankheiten beobachtet. Bei Patienten mit Infektionen durch Pathogene und Parasiten, wie Mycobakterien, Epstein-Barr-Virus und Leishmania (Saha et al., 1999) wurde zunehmend eine Expansion der γδ T-Zellen im Blut entdeckt. T-Zellen, die den γδ TZell Rezeptor exprimieren, sind in einem frühen Stadium in der Lage zwischen intrazellulären und extrazellulären Pathogenen zu unterscheiden und daraufhin spezifisch Interferon-γ oder Interleukin-4 zu produzieren (Ferrick et al., 1995). In dieser Arbeit wurden Untersuchungen zur Expansion von γδ-T-Zellen, ihrer Ursache und Funktion am Beispiel eines Patienten mit viszeraler Leishmaniose und invasivem 78 3. Diskussion Thymom durchgeführt. Die von dem Erreger Leishmania donovani, einem protozoen Parasiten, verursachte viszerale Leishmaniose ist eine Krankheit mit hoher Morbidität, verbunden mit Hepatosplenomegalie, Anämie, Hypergammaglobulinämie und Fieber, die unbehandelt innerhalb von drei Jahren zum Tode führen kann (Raziuddin et al., 1992). Der immunologische Status des Patienten wies eine Expansion der γδ-T-Zellen im peripheren Blut bis zu einem Anteil von 25% an der T-Zell Gesamtpopulation verglichen mit dem Durchschnitt in der Gesamtbevölkerung (2-7% γδ T-Zellen) auf und gleichzeitig war eine nahezu vollständige Depletion der NK-Zellen zu beobachten. Die signifikante Zunahme um mehr als den Faktor drei bietet einen ersten Hinweis auf eine mögliche Rolle der γδ T-Zellen in der Thymom-Genese und / oder dem Krankheitsbild der Leishmaniose. Der größte Anteil der γδ-T-Zellen im peripheren Blut gesunder Spender exprimiert die variablen Regionen Vγ9 des TCR γ-Gens und Vδ2 des TCR δ-Gens. Bei Patienten mit Krankheiten wie Tuberkulose (Falini et al., 1989), Lepra (Modlin et al., 1989), Malaria (Ho et al., 1990), Toxoplasmose (Scalise et al., 1992) und EBV-Infektionen (De Paoli et al., 1990) wurde eine Expansion des Vγ9/δ2 Subtyps beschrieben. Die genauere Analyse der Subtypen des Patienten A zeigt jedoch, dass die Mehrheit der γδ T-Zellen im Blut des Patienten A eine Expression der variablen Region Vδ1 aufweist. Eine Expansion der Vδ1-T Zellen im peripheren Blut ist sehr selten und wurde bislang nur bei Patienten mit HIV-Infektionen (Autran et al., 1989), Onchocerca volvulus-Infektionen (Munk et al., 1993) oder bei Patienten mit Morbus Crohn (Giacomelli et al., 1994) beschrieben. Eine Expansion der Vδ1 T-Zellen ist ausgehend von der jeweiligen Krankheit in der Regel lokal begrenzt und nur selten mit einer Anhäufung der T-Zellen im peripheren Blut verbunden. Obwohl der Mechanismus der Expansion der γδ T-Zellen in vivo bei Patienten mit HIV noch unklar ist, wäre es möglich, dass ein Zusammenhang mit der γδ T-Zell Expansion bei Patienten mit Infektionskrankheiten, wie CMV oder Leishmania, besteht. In allen Fällen findet man auf definierte Stimuli als Reaktion eine γδ T-Zell Expansion einzelner 79 3. Diskussion Vδ-Subklassen, bei HIV-Patienten Vδ1, bei CMV- und Leishmania-Patienten Vδ1 und Vδ3. Bei HIV- und CMV-Patienten wurde wie bei dem Patienten A ebenfalls eine Reduktion der Vγ9/Vδ2-exprimierenden T-Zellen nachgewiesen. Die viszerale Leishmaniose tritt auch als HIV-assoziierte opportunistische Infektion auf. Dies legt die Vermutung nahe, dass Leishmanien einen synergistischen Kofaktor in der Pathogenese einer HIV-Infektion darstellen könnten, da die Transkription des HI-Virus in CD4 Zellen durch ein Oberfächenbestandteil von L. donovani induziert wird. Die Analyse der Vγ-Regionen des Patienten A ergab, dass die Expression der variablen Regionen Vγ4, Vγ5 und Vγ8 signifikant erhöht ist, und nur ein kleiner Anteil der γδ TZellen exprimiert die Vγ9 Kette. Diese selektive Expansion der γδ T-Zell Subtypen lässt darauf schließen, dass das verzerrte γδ T-Zell Repertoire durch eine Stimulation von definierten Antigenen stammt. Obwohl die Expansion der γδ T-Zellen während einer Leishmanien-Infektion im Blut beobachtet wurde, ist der Hauptort der γδ T-Zell Aktivierung noch unbekannt. Aufgrund der beiden Krankheitsbilder, dem invasiven Thymom und der viszeralen Leishmaniose, ist es jedoch unklar auf welche der Krankheiten oder, als denkbare Alternative, auf eine spezifische Kombination dieser beiden Erkrankungen die Expansion kausal zurückzuführen ist. Einige klinische Formen der humanen Leishmaniose stehen in Verbindung mit einer erhöhten Anzahl der γδ T-Zellen im peripheren Blut. Unterschiedliche Studien haben gezeigt, dass diese Zellen durch Stimulation mit Leishmanien-Antigenen in der Lage sind zu expandieren (Rosso et al., 1993). Dies lässt vermuten, dass γδ T-Zellen eine spezifische Rolle bei der Immunantwort gegen Infektionen durch Leishmanien spielen können. Die Untersuchungen des Patienten A zeigten, dass durch Stimulation mit Leishmania donovani Antigenen, die T-Zellen des Patienten proliferieren. Die Expansion der γδ TZellen in vivo, gezeigt an PBL und in vitro an Zellkulturen, nach Stimulation mit Leishmanien-Antigenen, war nicht ausschließlich auf Leishmania donovani beschränkt. Eine spezifische Proliferation der T-Zellen zeigte sich ebenso nach Stimulation mit Leishmania mexicana, welche einer anderen Gruppe der Leishmanien zuzuordnen sind. Auf80 3. Diskussion grund der beobachteten Reaktivität der T-Zellen des Patienten auf Stimulation mit hochverdünntem Antigen, kann man von einer spezifischen Immunantwort der T-Zellen gegenüber den Leishmanien-Antigenen ausgehen. Nach Separation der T-Zell Fraktionen zeigten die Experimente jedoch, dass die γδ T-Zell Fraktion des Patienten alleine nicht in der Lage war die Immunantwort auf die Stimulation mit dem L. donovani Antigen auszulösen. Das lässt darauf schließen, dass die Stimulation durch das Antigen zwar eine Expansion der γδ T-Zellen induziert (Russo et al., 1993), die γδ T-Zellen alleine jedoch nicht in der Lage sind nach erneuter Stimulation durch dasselbe Antigen zu proliferieren. Die αβ T-Zellen zeigten nach Stimulation durch die Leishmanien-Antigene eine hohe Proliferationsrate, was auf eine aktive Funktion bei der Immunabwehr schließen lässt. Diese Proliferationsrate wurde durch Zugabe von isolierten γδ T-Zellen signifikant erhöht. Dies lässt die Vermutung zu, dass die γδ T-Zellen eine Cofunktion bei der Immunantwort spielen, da sie alleine nicht in der Lage waren eine spezifische Immunantwort zu zeigen, jedoch in Kooperation mit den αβ T-Zellen für eine deutliche Erhöhung der Proliferation verantwortlich zu sein scheinen. Eine Möglichkeit der Cofunktion der γδ-T-Zellen stellt die Induzierung der T-HelferAntwort dar. Es wurde gezeigt, dass T Zellen, die den γδ T- Zell Rezeptor exprimieren, in einem frühen Stadium der Infektion zwischen unterschiedlichen Pathogenen unterscheiden können, indem sie spezifisch Zytokine produzieren um die entsprechende THelfer-Antwort zu induzieren. Eine weitere Rolle der γδ T-Zellen in der Pathogenese der viszeralen Leishmaniose wurde von Raziuddin et al. beschrieben. γδ T-Zellen von akut infizierten Patienten sezernierten hohe Level an IL-4 und IL-6, was darauf hin deutet, dass die γδ T-Zellen bei der Zytokin-vermittelten Regulierung der humoralen Immunantwort gegen Leishmania eine unmittelbare Rolle spielen. Die bisherigen Ergebnisse haben gezeigt, dass Leishmanien-Antigene eine Expansion der γδ T-Zellen induzieren, diese γδ T-Zellen alleine aber nicht in der Lage sind auf eine erneute Stimulation durch das Antigen zu proliferieren. γδ T- Zellen spielen eine Rolle in 81 3. Diskussion der frühen Abwehr bei Erkrankungen mit parasitären Pathogenen und sind in der Lage, eine Schutzfunktion bzw. die T-Helfer-Antwort zu induzieren. Im Vergleich dazu zeigten die T-Zellen der gesunden Kontrollspender keine spezifische Primärantwort auf die Stimulation durch Leishmanien-Antigene. Desweiteren lassen die Ergebnisse des Prime-Lymphocyte-Tests darauf schließen, dass das verwendete Amastigoten-Lysat keine mitogene Funktion auf die γδ T-Zellen ausübt, sondern von den spezifisch „geprimeten“ γδ T-Zellen als konventionelles Antigen erkannt wird. Aufgrund der beiden Krankheitsbilder, die der Patient A aufweist, dem invasiven Thymom und der viszeralen Leishmaniose, ist es jedoch möglich, dass die Expansion γδ TZellen zusätzlich auf das invasive Thymom oder einer Kombination aus beiden Krankheiten zurückzuführen ist. Um diese Möglichkeiten genauer zu untersuchen, wurde eine Methode etabliert, die es erlaubt, das T-Zell Repertoire des Patienten anhand der CDR3 Größenverteilung zu analysieren. 3.6 Analyse des γδ T-Zell Repertoires mittels der Spectratyping-Technologie Mittels der Methode des Spectratypings bietet sich nun die Möglichkeit, das γδ T Zell Repertoire des Patienten A mit dem γδ T Zell Repertoire eines weiteren an einem invasiven Thymom erkrankten Patienten (B) und zweier gesunder Kontrollspender zu vergleichen. Das Repertoire der Kontrollspender zeigte eine polyklonale Verteilung der CDR3-Größen mit ähnlich dominanten Peaks. Diese Beobachtung zeigt, dass dominante γδ T-Zellen im peripheren Blut weit verbreitet sind. Anhand der Expressionsprofile lässt sich erkennen, dass bei den gesunden Personen die Expression der Vδ2-Kette am höchsten ist, die anderen Vδ-Subklassen werden nur schwach exprimiert. Der immunologische Status des Patienten B zeigte ebenfalls eine signifikante γδ T-Zell Expansion, vor allem der Zellen, welche die Vδ1- und die Vδ3-Kette exprimieren, was ebenfalls auf eine Antigen-abhängige Stimulation schließen lässt. Das γδ T-Zell Repertoire der beiden Patienten zeigt ein unterschiedliches Expressionsmuster der δ-Ketten. 82 3. Diskussion Die CDR3-Größenanalyse des Patienten A zeigte eine polyklonale, pseudogaußsche Verteilung, während die Größenverteilung des Patienten FH eine deutliche Expression einzelner δ-Ketten aufweist. Die genetische Vielfalt der J-Regionen der Vδ-Ketten des Patienten B zeigte eine mono- bzw. oligoklonale Verteilung. Die Verteilung zeigt eine Dominanz einzelner Peaks, die auch bei einer zweiten Messung im Abstand von 30 Tagen deutlich nachzuweisen war. Dies lässt darauf schließen, dass durch eine Stimulation mittels spezifischer Antigene eine Expression einzelner γδ T-Zell Klone induziert werden, die nur 1-4 CDR3 Größen exprimieren. Das oligoklonale Expressionsmuster des Patienten FH deutet auf eine spezifische antigen-abhängige Expression der γδ TZellen hin, da die CDR3-Verteilung eine Dominanz einzelner Vδ-Ketten zeigt. Dies betont die Bedeutung der γδ T-Zell Selektion und die daraus folgende Expansion dieser Zellen. Bei dem Patienten A hingegen, welcher eine polyklonale Verteilung der CDR3-Größen aufweist, deutet das Expressionsmuster auf eine antigen-unabhängige Expression hin, da nicht einzelne Klone, sondern die gesamten Subpopulationen expandiert sind, was sich auch bei der zweiten Messung bestätigte. Die Expansion der γδ T-Zellen scheint auf sein gesamtes Krankheitsbild zurückzuführen zu sein, nicht auf ein bestimmtes Antigen. 83 4. Material und Methoden 4. Material und Methoden 4.1 Material Plastik- und Einwegartikel Art Tips, 10 µl MβP Molecular BioProducts Art Tips, 100 µl MβP Molecular BioProducts Art Tips, 1000 µl MβP Molecular BioProducts Art Tips, 20 µl MβP Molecular BioProducts Art Tips, 200 µl MβP Molecular BioProducts Centricon® Plus-80, PL-30 Amicon® Bioseparations Millipore Centriprep®, YM-30 Millipore ® Amicon Bioseparations Millipore Combitips Plus Eppendorf Comply Indicator Tape 3M Deckelkette für 0,2 ml Kette Sarstedt Disposable Scalpel No.10 Feather Easy Flask, Filter Cap, Nunclon, 25 cm2 Nunc Easy Flask, Filter Cap, Nunclon, 75 cm2 Nunc ES-Kompressen, 5 cm x 5 cm Hartmann Graduated Conical Tubes with Cap, 225 ml Falcon LumaPlate™-96, white, 96-well, Perkin Elmer Uni Filter GF/C Perkin Elmer Solid Scintillator Coated Perkin Elmer MACS Separation Columns, LS Miltenyi Biotech MACS Separation Columns, MS Miltenyi Biotech Mikro-Schraubröhre, Polypropylen, 1,5 ml Sarstedt Multiply®-µStrip Kette, 0,2 ml Sarstedt Neolus Kanüle 18 G, 1,2 mm Terumo Nitra Tex Powder Free Einmalhandschuhe Ansell 84 4. Material und Methoden No Powder Exam Ansell non-sterile Latex examination gloves Omnifix, Luer Lock, 20 ml Braun Omnifix-F, Luer, 1ml Braun Optical Adhesive Cover Starter Kit Applied Biosystems Original-Perfusor-Spritze OPS, Braun Luer Lock, 50 ml Luer Parafilm Packaging Pechiney Plastic Pasteurpipetten aus Glas, 150 mm Brand Pasteurpipetten aus Glas, 230 mm Brand PCR Tubes, 0,2 ml Biozym Polypropylene Round Bottom Tubes, 14 ml Falcon Polypropylen-Röhrchen, 15 ml Greiner Bio-One Polypropylen-Röhrchen, 50 ml Greiner Bio-One Rundfilter, 185 mm Durchmesser Schleicher & Schuell Safe-Lock Tubes, 1,5 ml Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 ml Eppendorf Storage Bottle with Cap, 500 ml Corning Incorporated Costar Stripette, disp. Serological Pipette , 2ml Corning Incorporated Costar Stripette, disp. Serological Pipette, 10 ml Corning Incorporated Costar Stripette, disp. Serological Pipette, 25 ml Corning Incorporated Costarr Stripette, disp. Serological Pipette, 5 ml Corning Incorporated Costar Stripette, disp. Serological Pipette, 50 ml Corning Incorporated Costar TC Flask, Filter Cap, Nunclon, 175 cm ® 2 Thermo-Fast 96 PCR Plates, semi-skirted ™ Nunc Peqlab Top Seal -A: 96 well-Microplates Perkin Elmer Universal Fit Pipette Tips, 1-200 µl Corning Incorporated Venofix Venenpunktionsbesteck Braun Zellkulturplatte, 96 Vertiefungen, Falcon Zellschaber, 25 cm Greiner Zellsieb, 40 µm Falcon Zellstoffpapier Greiner 85 4. Material und Methoden Geräte -20°C-Gefrierschrank Liebherr 4°C-Kühlschrank Liebherr -80°C-Gefrierschrank Hera Freeze Heraeus Brutschrank Heraeus 6000 Heraeus Cyclogene Thermal Cycler Techne Eismaschine Ziegra Feinwaage MC1 Laboratory CL 420 Sartorius Geldokumentationsgerät UVT-20 S/M Herolab Gelkammer Case Block Biozym Harvester Packard Heizblock 100°C Liebisch Heizblock 37°C Liebisch Heizofen SUT 6060 Heraeus ® Heizplatte / Magnetrührer Ikamag Rec-G Janke & Kunkel IKA®-Labortechnik Magnetic Separator Vario MACS Miltenyi Biotec Microplate Scintillation Counter Packard Multi Screen 96-well filtration plate Millipore Mikroskop DM IL Leica Mikrowelle Siemens Mini-Gelkammer, Model NO EM 100 Cambridge Electrophoresis Multikanalpipette für 12 Spitzen Costar Peltier Thermal Cycler PTC 200 MJ Research Pipetboy Acu IBS Integra Biosciences Pipetman P10 Gilson Pipetman P1000 Gilson Pipetman P20 Gilson Pipetman P200 Gilson ® Spectrophotometer DU 640 ® Sterilbank LaminAir HB 2448 Beckman Heraeus Sterilbank Microflow Biological Safety Cabinet Nunc 86 4. Material und Methoden Stickstofftank Arpege 170 Air Liquide Thermomixer Comfort Eppendorf Tischzentrifuge Centrifuge 5415R Eppendorf Tischzentrifuge Centrifuge 5417R Eppendorf Top Count Packard Ultraschallwasserbad Sonifier 450 Branson Ultrazentrifuge J2-HS Beckman Vortex VF2 J & K IKA®-Labortechnik Wasserbad F10 Julabo ® Wasserbad Thermomix BU Braun Zentrifuge Megafuge 1.0R Heraeus Zentrifuge Varifuge 3.0R Heraeus Kits AP Conjugate substrate kit BioRad Cytometric Bead Array (CBA) BD Biosciences First-strand cDNA Synthesis Kit Amersham Pharmacia Biotech Inc MACS NK Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec MACS γδ T Cell Isolation Kit Miltenyi Biotec QIAamp® Blood Mini Kit Qiagen QIAGEN® Plasmid Maxi Kit Qiagen QIAGEN® Plasmid Midi Kit Qiagen QIAprep® Spin Miniprep Kit Qiagen ™ QIAquick PCR Purification Kit ™ QIAshredder Columns ® Qiagen Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen Vecta stain ABC Kit Serva Medien, Zusätze und Lösungen für die Zellkultur 87 4. Material und Methoden 2-Mercaptoethanol 50 MM Gibco Invitrogen Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco Invitrogen Fetal Bovine Serum Hyclone Perbio Hepes Buffer 1M Bio Whittaker HL-1 Medium Bio Whittaker Human Albumin 20% Immuno Baxter Deutschland GmbH Human Serum Bio Whittaker IL-2 (Proleukin) Chiron Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium Gibco Invitrogen L-Glutamine 200 MM (100x) Gibco BRL Life Technologies Liquemin Roche Lymphoprep™ Fresenius Kabi Norge Penicillin-Streptomycin, 10000 U/ml Gibco Invitrogen Phosphate Buffered Saline (PBS) Dulbecco’s Gibco Invitrogen Pooled Human Serum, AB Donor Pel-Freez® Bron Deer Purified Phytohaemagglutinin (PHA) Remel Inc. for Murex Biotech Ltd. Trypsin-EDTA (1x) in HBSS Gibco Invitrogen Chemikalien 1M TRIS-HCl pH 7,5 ultra pure BRL Life Technologies 2-Propanol Roth 3-Amino-9-Ethylcarbazol Sigma AG501-X8 (D) Resin Biorad Agarose ultra pure Gibco BRL Life Technologies Aluminiumkaliumsulfat Sigma Ameisensäure Merck Aqua ad iniectabilia Delta Select Borsäure Merck Bovine Albumin Fraction V Sigma Bromphenolblau Sigma Calciumchlorid Sigma 88 4. Material und Methoden Cetrimide Sigma Chelex Biorad Chloralhydrat Sigma Chloroform J.T. Baker Chloroquine Sigma DEAE-Dextran Sigma Desoxyribonukleinsäure (salmon sperm DNA) Sigma Dextran Amersham Pharmacia Dimethylsulfoxid (DMSO) J.T. Baker Dodecylsulfat, Natriumsalz Serva Essigsäure 100% (Eisessig) Merck Ethanol J.T. Baker Ethidiumbromidlösung 0,07% AppliChem Extravidin-AP BioRad Ficoll 400 Merck Floureszein Sigma Glucose Merck Glycerin Roth Glycerol Serva Glyoxal Fluka Hämatoxylin Sigma Kaliumacetat Merck LMP-Agarose ultra pure Gibco BRL Life Technologies Magnesiumacetat Merck Magnesiumchlorid Sigma Natriumacetat Merck Natriumazid Sigma Natriumchlorid Merck Natriumcitratdihydrat Sigma Natriumdihydrogenphosphat-Monohydrat Merck Natriumhydroxid Merck Natriumjodat Sigma Natriumphosphat Sigma 89 4. Material und Methoden Natriumphosphat, dibasisch, wasserfrei Calbiochem NP40 Calbiochem Polyvinylpyrolidon PVP 360 Sigma Protein A-Sepharose Sigma-Aldrich Roti®-Phenol Roth Stopsolution (Sequenzierkit) USB Titriplex III (EDTA) Merck Transfer Ribonucleinsäure (tRNA) Sigma Trinatriumacetat Sigma Trinatriumcitrat-Dihydrat Merck Trizma Base Sigma Xylen Sigma Xylencyanol Merck Zitronensäure Sigma Zitronensäuremonohydrat Sigma Radioaktive Chemikalien [Na251CrO4] Chromium 10 mCi/ml Perkin Elmer [Methyl-3H] Thymidin 5,0 Ci/ml Amersham Biosciences PCR-Reagenzien Alle PCR-Reagenzien wurden von der Firma Qiagen oder der Firma Appliedbiosystems/ Roche bezogen. PCR-Primer wurden entweder von der Firma Biometra bezogen oder bei der Arbeitsgruppe Igloi inder Fakultät für Biologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg in Auftrag gegeben. Die Primer für die Spectratyping-Analysen wurden Primersequenzen 90 4. Material und Methoden Actin F 5’- TCT ACA ATG AGC TGC GTG TGG CTC - 3’ Actin B 5’- TAG CTC TTC TCC AGG GAG GAG CTG - 3’ Vβ2 5’- AAC TAT GTT TTG GTA TCG TCA – 3’ Vβ4 5’- CAC GAT GTT CTG GTA CCG TCA GCA – 3’ Vβ5/1 5’- CAG TGT GTC CTG GTA CCA ACA G –3’ Vβ6a/11 5’- AAC CCT TTA TTG GTA CCG ACA – 3’ Vβ6b/25 5’- ATC CCT TTT TTG GTA CCA ACA G – 3’ Vβ6c 5’- AAC CCT TTA TTG GTA TCA ACA G – 3’ Vβ7 5’- CGC TAT GTA TTG GTA CAA GCA – 3’ Vβ8a 5’- CTC CCG TTT TCT GGT ACA GAC AGA C – 3’ Vβ9 5’- CGC TAT GTA TTG GTA TAA ACA G – 3’ Vβ10 5’- TTA TGT TTA CTG GTA TCG TAA GAA GC – 3’ Vβ11 5’- CAA AAT GTA CTG GTA TCA ACA A – 3’ Vβ12a 5’- ATA CAT GTA CTG GTA TCG ACA AGA C – 3’ Vβ13b 5’- GGC CAT GTA CTG GTA TAG ACA AG – 3’ Vβ13c 5’- GTA TAT GTC CTG GTA TCG ACA AGA – 3’ Vβ16 5’- TAA CCT TTA TTG GTA TCG ACG TGT – 3’ Vβ17 5’- GGC CAT GTA CTG GTA CCG ACA – 3’ Vβ18 5’- TCA TGT TTA CTG GTA TCG GCA G – 3’ Vβ19 5’- TTA TGT TTA TTG GTA TCA ACA GAA TCA – 3’ Vβ20 5’- CAA CCT ATA CTG GTA CCG ACA – 3’ Vβ21 5’- TAC CCT TTA CTG GTA CCG GCA G – 3’ Vβ22 5’- ATA CTT CTA TTG GTA CAG ACA AAT CT – 3’ Vβ23 5’- CAC GGT CTA CTG GTA CCA GCA – 3’ Vβ24 5’- CGT CAT GTA CTG GTA CCA GCA – 3’ *CβB2 5’- ACA CAG CGA CCT CGG GTG GG – 3’ Vδ1 5’- ATG CAA AAA GTG GTC GCT ATT – 3’ Vδ2 5’- ATA CCG AGA AAA GGA CAT CTA TG – 3’ Vδ3 5’- GTA CCG GAT AAG GCC AGA TTA – 3’ Vδ4 5’- ATG ACC AGC AAA ATG CAA CAG – 3’ Vδ5 5’- ACC CTG CTG AAG GTC CTA CAT – 3’ 91 4. Material und Methoden Vδ6 5’- CCC TGC ATT ATT GAT AGC CAT – 3’ *CδB2 5’- CGG ATG GTT TGG TAT GAG GC – 3’ Enzyme für die Immunhistologie, Restriktionsenzyme und –puffer Sämtliche in dieser Arbeit verwendeten Enzyme, Restriktionsenzyme sowie die dazugehörigen Puffer wurden von der Firma Boehringer Mannheim oder der Firma New Englan Biolabs bezogen. Antikörper Alle in dieser Arbeit verwendeten kommerziellen Antikörper für die zellbiologischen Arbeiten wurden von der Firma Becton Dickinson und der Firma Immunotech bezogen. Die Antikörper für die Immunhistochemie wurden von der Firma DAKO bezogen. Rezepte für Lösungen und Medien Plasmid-Minipreps: Lyse-Puffer (GTE) 50 ml Lyse-Puffer: 25 mM Tris pH 8,0 1,25 ml 1M Tris 10 mM EDTA pH 8,0 1 ml 500 mM EDTA 50 mM Glucose 0,45 g Glucose H2O ad 50 ml Lösung steril filtrieren, bei 4°C lagern. Alkalines SDS 92 100 ml alkalines SDS: 0,2 N NaOH 10 ml 2M NaOH 1% SDS 10 ml 10% SDS 4. Material und Methoden H2O ad 100 ml RNA-Extraktion: Lysepuffer 100 ml Lysepuffer: 0,15 M NaCl 7,5 ml 2M NaCl 10 mM Tris pH 7,4 1 ml 1M Tris pH 7,4 1mM MgCl2 0,1 ml 1M MgCl2 0,5 % NP40 0,5 ml NP40 H2O ad 100 ml DNA-Extraktion: Proteinase K-Puffer 100 ml Proteinase K- Puffer: 100 mM NaCl 2 ml 5M NaCl 10 mM Tris pH 8 1 ml 1M Tris pH 8 25 mM 0,5 M EDTA 5 ml 0,5 M EDTA 0,5 % SDS 5 ml 10% SDS H2O ad 100 ml Immunhistologie Hämalaun nach Mayer 1g Hämatoxylin in 1000ml ddH2O 0,2 g Natriumjodat 50 g Aluminiumkaliumsulfat 50 g Chloralhydrat 1 g Zitronensäure 93 4. Material und Methoden H2O2-Blockierungslösung 3 ml 30% iges H2O2 ad 100 ml ddH2O Proteinase K-Lösung 0,05 g Proteinase K (13 units) in 5 ml PBS (20x) ad 100 ml ddH2O 10 mM Citratpuffer 15 ml Stammlösung A ad 1000 ml ddH2O mit Stammlösung M auf pH 6 einstellen Stammlösung A 21,1 g Citronensäuremonohydrat ad 1000 ml ddH2O Stammlösung B 29,41 g Natriumcitratdihydrat ad 1000 ml ddH2O PBS-Stammlösung, 20x 29,25 g Na2HPO4 x H2O 4,90 g KH2PO4 160 g NaCl ad 1000 ml ddH2O einstellen auf pH 6,8-7,0 DMSO/Triton (9+1) 90 ml DMSO 10 ml Triton 100 Acetat-Puffer 20x 10,97 ml absolute Essigsäure 148,25 g Natriumacetat wasserfrei ad 1000 ml ddH2O Chromogenlösung 5 ml Acetat-Puffer ad 100 ml ddH2O 94 4. Material und Methoden 30 mg 3-Amino-9-Ethylcarbazol in 2 mlDMSO/Triton 10 µl 30% H2O2 95 4. Material und Methoden 4.2 Methoden 4.2.1 Molekularbiologische Methoden RNA-Extraktion mittels Phenol/Chloroform Die Zellen für die RNA-Extraktion wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen. Die erhaltenen Zellpellets wurden bei –80°C gelagert oder sofort weiterverarbeitet. Zur Extraktion der RNA wurden die Zellpellets auf Eis in je 400 µl Lysepuffer resuspendiert, in Eppendorfröhrchen überführt und fünf Minuten auf Eis inkubiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei 13200 rpm bei 4°C wurden alle weiteren Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt. Der Überstand wurde in ein neues Eppendorfröhrchen mit 200 µl Phenol und 50 µl 10% SDS überführt und gut gemischt. Nach Zentrifugation bei 13200 rpm für drei Minuten wurde der Überstand in ein neues Eppendorfröhrchen mit 100 µl Phenol und 100 µl Chlorform überführt und wieder gut gemischt. Nach erneuter Zentrifugation bei 13200 rpm für drei Minuten wurde der Überstand in ein neues Eppendorfröhrchen mit 200 µl Chloroform überführt und gut gemischt. Im Anschluß an die Zentrifugation bei 13200 rpm für drei Minuten wurde der Überstand in ein neues Eppendorfröhrchen gegeben und 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat pH 5,2 und 2,5 Volumen 100 % Ethanol dazupipettiert. Der Ansatz wurde gut gemischt und die RNA entweder zwei Stunden bei –80°C oder über Nacht bei –20°C gefällt. Nach dieser Fällung wurden die Proben für 15 Minuten bei 13200 rpm bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Pellets mit 1 ml kaltem 70% Ethanol gewaschen. Nach Zentrifugation für zehn Minuten bei 13200 rpm bei 4°C und Abnahme des Überstandes wurden die Pellets bei Raumtemperatur getrocknet und anschließend in 50 µl Wasser resuspendiert. RNA-Extraktion mittels des RNeasy® Mini Kits Die Homogenisierung der Zellpellets für die RNA-Extraktion erfolgte über QIAshredder™ Säulen. Die Extraktion der RNA aus den Proben mit dem RNeasy® Mini Kit wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt und die RNA in 30 µl Wasser resuspendiert. 96 4. Material und Methoden Bestimmung der optischen Dichte am Photometer Die Eigenschaft der Basen der DNA-bzw. RNA-Nucleotide, Licht der Wellenlänge 260 nm zu absorbieren, macht man sich bei der spektralphotometrischen Konzentrationsbestimmung dieser Moleküle zunutze. Durch die Messung der Absorption einer Nukleinsäurehaltigen Lösung bei 260 und bei 280 nm und dem hieraus gebildeten Verhältnis (A260/A280) lässt sich zusätzlich der Reinheitsgrad der Präparation ermitteln. Zur Bestimmung der Konzentration von RNA- oder DNA-Proben wurde je 1 µl der Probe 1:100 mit H2O verdünnt, das Gesamtvolumen der Meßprobe betrug 100 µl. Die Messung der optischen Dichte erfolgte bei 260 nm und 280 nm Wellenlänge. Zur Berechnung der Probenkonzentration wurde folgende Formel verwendet: OD260 x Verdünnungsfaktor x 40 µg/ml (RNA) bzw. 50 µg/ml (DNA) : 1000 = Konzentration der RNA bzw. DNA in µg/µl. Auftrennung von RNA-bzw. DNA-Fragmenten durch Gelelektrophorese Agarose-Gelelektrophorese Sowohl DNA- als auch RNA-Fragmente lassen sich mit Hilfe der Gel-Elektrophorese ihrer Größe nach auftrennen. Die Gelelektrophorese wurde in Flachbett-Agarosegelen durchgeführt. Das Giessen und der Lauf des Gels erfolgte im Wesentlichen nach den von Sambrook et al., 1989, beschriebenen Standardbedingungen. Die Agarosekonzentrationen wurde je nach Grösse der aufzutrennenden Fragmente zwischen 1 und 2% gewählt. Zur Detektion der DNA- Banden wurde den Gelen der Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid (0,5 µg/ml) zugesetzt. Als Gel- und Laufpuffer wurde 1x TBE-Puffer verwendet. Den Proben mit den zu auftrennenden DNA-Fragmenten wurde vor dem Auftragen 1/6 Volumen Probenpuffer zugesetzt. Nach Beendigung des Laufes wurde das Gel zur Dokumentation im UV-Licht (254 nm bei analytischen Gelen) mit einer Videokamera zunächst digitalisiert und das Bild anschliessend ausgedruckt. 97 4. Material und Methoden Zur Kontrolle extrahierter RNA wurde ein RNA-Gel verwendet. Die Gelkammer wurde 15 Minuten in 10% SDS inkubiert. 1 µl RNA wurde zusammen mit 7 µl H2O und 1 µl Stopsolution (Sequenzierkit Fa. USB) auf ein einprozentiges Agarosegel aufgetragen. Zur Detektion der RNA- Banden wurde den Gelen der Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid (0,5 µg/ml) zugesetzt. Die Detektion der RNA-Banden erfolgte mittels UVLicht (254 nm). cDNA-Synthese Die Synthese von cDNA aus RNA wurde mit dem First-strand cDNA Synthesis Kit der Firma Amersham Pharmacia Biotech nach Anleitung durchgeführt. Es wurden jeweils 8 µl RNA unter Verwendung des Not I-d(T)18-Primers eingesetzt. Bei Verwendung der Proben für die quantitative PCR (TaqMan) entsprach dieses Volumen einer Menge von 1 µg totaler RNA. Anschließend wurden die Proben mit Wasser auf ein Endvolumen von 100 µl aufgefüllt. DNA-Extraktion mit dem QIAamp® Blood Mini Kit Die Extraktion der DNA aus Zellpellets mit dem QIAamp® Blood Mini Kit wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt und die DNA in 50 µl Wasser eluiert. Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und RT-PCR Die Polymerasekettenreaktion (PCR von engl. Polymerase Chain Reaction) ermöglicht die exponentielle Vermehrung eines bestimmten DNA (PCR) oder cDNA-Fragments (RT-PCR) in mehreren Reaktionszyklen. Die Amplifikationsreaktion wurde wie von Saiki et al., 1988 beschrieben, durchgeführt. Bei analytischen PCRs betrug das Endvolumen 50 µl, bei präparativen Ansätzen wurde das Volumen auf 100 µl erhöht. 98 4. Material und Methoden Bei RT-PCRs wurde als Ausgangsmaterial RNA eingesetzt, die mit Hilfe einer reversen Transkriptase (RT) in cDNA umgeschrieben wurde, wodurch es möglich ist, Aussagen über die Expression eines bestimmten Gens im Ausgangsmaterial zu machen. PCRs zur Überprüfung des Ausgangsmaterials Zur Kontrolle der mittels First-strand cDNA Synthesis Kit der Firma Amersham Pharmacia Biotech synthetisierten cDNA, wurden PCRs auf „housekeeping“-Gene durchgeführt. Das Actingen findet sich in der DNA aller Zellen; so daß dieses Gen als „housekeeping“-Gen dienen kann. Actin-PCR Die Überprüfung der cDNA erfolgte mit für das Actin-Gen spezifischen Primern unter folgenden Bedingungen: Reaktionsansatz: cDNA 5,0 µl PCR-Puffer (10 x) 5,0 µl MgCl2 (2 mM) 6,0 µl dNTPs (2 mM) 5,0 µl Primer Actin F (20 pmol/µl) 5,0 µl Primer Actin B (20 pmol/µl) 5,0 µl Taq-Polymerase 0,5 µl H2O 18,5 µl Cyclerbedingungen: 2 min 95°C 1 min 95°C 1 min 58°C 1 min 72°C 10 min 72°C 99 35 x 4. Material und Methoden Spectrotyping PCRs Als Ausgangsmaterial wurde die mittels First-strand cDNA Synthesis Kit der Firma Amersham Pharmacia Biotech synthetisierte cDNA eingesetzt. Die Reaktionen, welche direkt am GeneScan analysiert wurden, wurden mit einem floureszenzmarkierten Rückwärtsprimer durchgeführt. Reaktionsansatz: cDNA 5,0 µl PCR-Puffer (10 x) 5,0 µl MgCl2 (2 mM) 3,0 µl dNTPs (2 mM) 5,0 µl Primer F (10 pmol/µl) 1,0 µl Primer B (10 pmol/µl) 1,0 µl Ampli Taq Gold Polymerase 0,25 µl H2O 29,75 µl Cyclerbedingungen: 30 s 94°C 25 s 94°C 45 s 60°C 45 s 72°C 5 min 40 x 72°C Run off Reaktionen Die Spectrotyping PCRs wurden durch sog. Run off Reaktionen weiteranalysiert. Diese wurden mit einem floureszenzmarkierten Rückwärtsprimer* durchgeführt. Dazu wurde folgender Mastermix hergestellt: 100 4. Material und Methoden PCR-Puffer (10 x) 110 µl MgCl2 (25 mM) 130 µl dNTPs (2 mM) 110 µl Primer* (1 pmol/µl) 1 µl Ampli Taq Gold Polymerase 4 µl H2O 530 µl Je Ansatz wurden 8 µl des Mastermixes vorpipettiert, dazu 2 µl des Spectrotyping PCR Produkts als Matritze. Die Reaktion erfolgte unter folgenden Bedingungen: Cyclerbedingungen: 30 s 94°C 25 sec 94°C 45 sec 60°C 45 sec 72°C 5 min 72°C 5x Anschließend wurden die Proben auf den GeneScan aufgetragen und analysiert. Aufreinigung von PCR-Produkten Die Aufreinigung von PCR-Produkten erfolgte mit dem QIAquick™ PCR Purification Kit und wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die DNA wurde in 50 µl Wasser von der Säule eluiert. 4.2.2 Zellbiologische Methoden Isolierung humaner peripherer Blutlymphozyten aus Buffy Coats und Vollblut Mittels eines Ficoll-Gradienten werden die peripheren Blutlymphozyten (PBL) durch isopyknische Zentrifugation von Erythrozyten, Granulozyten und toten Zellen getrennt. Die Dichte der Ficoll-Lösung ist so eingestellt, daß Erythrozyten und tote Zellen die Fi101 4. Material und Methoden collschicht passieren und sich während der Zentrifugation als Pellet am Boden des Reaktionsgefäßes sammeln. Granulozyten dringen in die Ficollschicht ein, während sich die PBL als weiße Schicht in der Interphase sammeln. Zur Gewinnung der PBL wurden als Ausgangsmaterial Buffy Coats oder Heparin-Vollblut gesunder Spender verwendet. Bei den Buffy Coats handelt es sich um Vollblutkonzentrate, denen für den klinischen Gebrauch das Serum entzogen wurde. Die Buffy Coats bzw. das Vollblut wurden im Verhältnis 1:2 mit PBS (25°C) verdünnt. In 50 ml Falcon-Tubes wurden 15 ml Ficoll vorgelegt und mit je 30 ml verdünntem Buffy Coat bzw. Vollblut überschichtet. Nach Zentrifugation bei 1800 rpm (ohne Bremse) bei 25°C für 30 min wurde die Interphase, in der sich die PBL befinden, abgenommen und zweimal mit PBS gewaschen. Zellzählung Zur Zählung der Zellen wurden 10 µl der Zellsuspension 1:100 mit Eosinlösung verdünnt. Unter dem Mikroskop wurden bei hundertfacher Vergrößerung zwei Großquadrate einer Neubauer Zählkammer ausgezählt. Der Mittelwert dieser beiden Zählergebnisse ergibt die Anzahl der Zellen in Millionen pro Milliliter Zellsuspension. Durchflusszytometrie (FACS) und Zellsorting Mit Hilfe der Durchflusszytometrie (FACS, Fluorescence Activated Cell Sorting) lassen sich die physikalischen und molekularen Eigenschaften von Zellen analysieren. Grundlage der floureszenzaktivierten Zellanalyse ist die Antigen-Antikörper-Reaktion, die mit Fluoreszenzfarbstoff-markierten Antikörpern durchgeführt wird. Zur Analyse werden die Zellen einer Einzelzellsuspension an einem gebündelten Laserstrahl geeigneter Wellenlänge vorbeigeleitet. Zur Färbung der zu messenden Zellen wurden zunächst etwa 200.000 Zellen mit FACS-Puffer in einem FACS-Röhrchen gewaschen. Die Zellpellets wurden in 50 µl FACS-Puffer resuspendiert. Die eingesetzte Menge an Antikörper entsprach bei kommerziellen Antikörpern der vom jeweiligen Hersteller empfohlenen Menge, bei Hybridomüberständen wurden pro Färbung je 50 µl Überstand verwendet, bei nicht-kommerziellen Antikörpern in 0,1 % Ascites je 10 µl. Nach Zugabe des Antikör102 4. Material und Methoden pers wurden die Proben gevortext und 30 Minuten im Dunkeln bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben erneut mit FACS-Puffer gewaschen, um überschüssigen, nicht gebundenen Antikörper zu entfernen. Bei einer Doppelfärbung mit FITC- und PE-markierten Antikörpern wurden beide Antikörper gleichzeitig zu den Zellen gegeben und gemeinsam inkubiert. Bei indirekten FACS-Färbungen wurde zunächst mit dem nicht-floureszenzmarkierten Antikörper gefärbt. Nach dem Waschen wurde eine Färbung mit dem floureszenzmarkierten Zweitantikörper durchgeführt. Die Messung der Proben erfolgte an einem FACS Calibur-Gerät (Becton Dickinson). Sortierung von Zellen Zur Sortierung von Zellen mittels floureszenzmarkierter Antikörper wurde ein MoFlo®Cytometer der Firma Dako Cytomation verwendet, bei dem die Zellen nach Passieren des Laserstrahls nach den gewünschten Floureszenzeigenschaften sortiert und in einem Röhrchen mit geeignetem Medium aufgefangen wurden. Isolierung von γδ T-Lymphozyten aus PBL mittels MACS Die MACS-Technologie (Magnetic Activated Cell Separation) basiert auf der magnetischen Markierung von Zellpopulationen mittels superparamagnetischer Partikel, auch Microbeads genannt. Diese Microbeads sind an hochspezifische monoklonale Antikörper gebunden. Durch ein starkes Megnetfeld ist es möglich, die markierten Zellen von den unmarkierten Zellen zu trennen. Dieses starke Magnetfeld wird durch einen Permanentmagenten im MACS-Separator erzeugt, in welchen eine Stahlwolle enthaltende MACS-Säule eingespannt wird. Nach Auftragen der Probe auf die Säule werden die unmarkierten Zellen durch Spülung der Säule mit MACS-Puffer ausgewaschen, während die magnetisch markierten Zellen an der Stahlwolle haften bleiben. Durch Entfernung der Säule aus dem Magnetfeld können die markierten Zellen gewonnen werden. Bei der Separation von Zellpopulationen durch Depletion werden alle nicht erwünschten Zellpopulationen mittels spezifischer Microbeads magnetisch markiert und so aus der Zellsuspension entfernt. Die nichtmagnetische Zellfraktion bildet die Zielpopulation. Der 103 4. Material und Methoden hier verwendete γδ T-Zell-Kit ist ein indirektes magnetisches Markierungssystem. Die Isolierung der γδ T-Lymphozyten wurde nach Anleitung des Herstellers mit dem γδ Tcell Isolation Kit der Firma Miltenyi durchgeführt. Anschließend wurden die so gewonnenen γδ T-Lymphozyten klonal (eine Zelle pro well) auf 96-well-Platten ausplattiert und bei 37°C und 7% CO2-Sättigung inkubiert. Chromium-Release-Assay Sowohl die Funktion von T-Zellen als auch die Funktion von Natürlichen Killerzellen (NK) kann über die Lyse von Zielzellen durch diese Zellen gemessen werden. Lebende Zellen sind in der Lage, radioaktiv markiertes Natriumchromat (Na251CrO4) aufzunehmen, setzen dieses aber nicht spontan wieder frei. Werden diesen markierten Zellen nun von T-Zellen oder NK lysiert, wird das radioaktive Chromat aus der Zelle freigesetzt und kann im Überstand des Reaktionsansatzes nachgewiesen und auch quantifiziert werden. Chromium-Release-Assay als Screening der etablierten Zell-Klone Zur Überprüfung der Lysefähigkeit der isolierten T-Zell-Klone wurde zunächst ein sogenanntes Screening durchgeführt, in dem von jedem Klon Duplikate getestet wurden. Hierzu wurden die Targetzellen (z.B. K562) für das Screening in 15 ml Falcons überführt, fünf Minuten bei 1200 rpm zentrifugiert und der Überstand komplett abgenommen. Anschließend wurden zu den Zellpellets auf Eis je 25 µl radioaktiv markiertes Chrom gegeben, die Pellets durch Klopfen resuspendiert und mit leicht geöffnetem Deckel eine Stunde bei 37°C und 5% CO2-Sättigung im Brutschrank inkubiert. Nach 30 min. wurden die Zellen durch leichtes Klopfen erneut gemischt. Nach Ende der Inkubation wurden diese zweimal mit Medium gewaschen, um nicht aufgenommenes Chrom zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen in einem Milliliter Medium resuspendiert, gezählt und auf Eis gestellt. Von jedem zu testenden Klon (Effektor) wurden je zweimal 100 µl in zwei Wells ein 96-well-Platte übertragen. Die radioaktivmarkierten Targetzellen wurden auf eine Konzentration von 5 x 104 Zellen pro Milliliter eingestellt und je 100 µl der Zell104 4. Material und Methoden suspension in jedes Well der vorbereiteten 96-Well-Platte zu den Klonen gegeben. Als Negativkontrolle wurde in je sechs bis 12 Wells zu den Targetzellen je 100 µl Medium gegeben, um die spontane Freisetzung von Chrom aus den Zellen messen zu können. Desgleichen wurde in je sechs bis 12 wells zu den Targetzellen je 100 µl 1:20 verdünntes Detergenz gegeben, um ein Maß für die maximale Freisetzung von Chrom aus den Zellen bei kompletter Lyse zu erhalten. Die Platten wurden fünf Minuten bei 800 rpm zentrifugiert und drei bis fünf Stunden bei 37°C und 5% CO2-Sättigung im Brutschrank inkubiert. Nach Ende der Inkubation wurden die Platten erneut für fünf Minuten bei 800 rpm zentrifugiert und je 50 µl des Überstandes von jedem Well auf 96-Well-Lumaplatten übertragen, welche einen festen Szintillator enthalten. Die Lumaplatten wurden über Nacht unter dem Abzug getrocknet, mit einer Top Seal™-A Folie abgeklebt und im Top Count gemessen. Chromium-Release-Assay mit definierten Effektor/Target-Verhältnissen Um die Spezifität des Lyseverhaltens von T-Zell-Klonen gegenüber Lymphomzell-Linien und Kontroll-Zell-Linien zu unterstreichen, wurden Chromium-Release-Assays mit definierten Effektor/Target-Verhältnissen durchgeführt. Hierzu wurden die Targetzellen wie beschrieben mit radioaktiv markiertem Chrom inkubiert. Während dieser Inkubation wurden die zu testenden Klone abgeerntet bzw. frische PBL aus Heparin-Vollblut gesunder Spender isoliert. Anschließend wurden diese Effektorzellen gezählt und in einem Volumen von 150 µl pro Well in Triplikaten in die erste Reihe einer 96-Well-Platte übertragen. Hiervon wurden auf derselben Platte jeweils 50 µl pro Well in der zweiten Reihe der Platte in ein Well mit 100 µl Chromtestmedium pipettiert und gut mit dem Medium gemischt. Dieser Vorgang wurde mit dem Übertrag von 50 µl aus jedem Well der zweiten Reihe auf die dritte Reihe mit je 100 µl vorgelegtem Medium pro Well wiederholt und anschließend 50 µl aus jedem Well der dritten Reihe verworfen. Die so entstehenden 1:3-Verdünnungen wurden bei Klonen mit einer Ausgangskonzentration von 5 x 105 Zellen pro Milliliter ausgeführt, so daß folgende drei Effektor/Target-Verhältnisse entstanden: 1. Reihe 10 : 1 (Effektor : Target) 2. Reihe 3,3 : 1 105 4. Material und Methoden 3. Reihe 1,1 : 1 Bei Versuchen mit frischen PBL wurde eine Ausgangskonzentration von 5 x 106 Zellen pro Milliliter eingesetzt, was in folgenden Effektor/Target-Verhältnissen resultierte: 1. Reihe 100 : 1 2. Reihe 33 : 1 3. Reihe 11 : 1 Alle weiteren Schritte wurden wie beschrieben durchgeführt. Proliferations-Assay Bei einem Proliferationstest werden aktivierte T-Zellen mit radioaktiv markiertem [methyl-3H] Thymidin inkubiert. Thymidin wird von proliferierenden Zellen aufgenommen. Dieses kann nach Freisetzung des Thymidins durch die radioaktive Markierung an einem Top Count gemessen werden. Dazu wurden auf Flachboden 96-well Platten eine definierte Anzahl in 100 µl pro well der zu testenden Zellen ausplattiert. Bei den Titrationsexperimenten mit Leishmania-Antigenen wurden pro Spender 100µl einer 1x106 Zellen/ml Suspension auf Flachboden-96-well Platten ausplattiert. Verdünnungen von 1:50 bis 1:3200 der Leishmania-Antigene wurden hergestellt und in einem Volumen von je 100µl zu den Zellen gegeben. Bei Aktivierung durch PBL (inaktiviert) wurde eine definierte Zellzahl in 100 µl pro well ausplattiert. Als Negativkontrolle wurde Medium eingesetzt. Nach einer Inkubation von 3-5 Tagen bei 37°C und 7% CO2 Sättigung wurden zu dem Zell-Antigen Gemisch 50µl/well [methyl-3H] Thymidin (1:40 in serumfreiem Medium) zugegeben. Nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die Zellen mittels eines Harvesters auf Multiscreen 96-well Filtration Platten, die mit einem Trägermaterial beschichtet sind übertragen. Durch mehrmaliges Waschen mit H2O dest. werden die Zellen zum Platzen gebracht und das radioaktive [methyl-3H] Thymidin wird freigesetzt. Nach Trocknen der Platten wurden 25 µl pro well Szintillationsflüssigkeit dazupipettiert, mit einer Top Seal™-A Folie abgeklebt und die Platten im Top Count gemessen. 106 4. Material und Methoden Cytometric Bead Array (CBA) Mittels des CBA Kits ist es möglich im Überstand von kultivierten Zellen mehrere von den Zellen produzierten Cytokine parallel nachzuweisen. Die Methode basiert auf einer Fluoreszenzmessung mittels eines FACS-Gerätes. In dieser Arbeit wurde ein CBA Kit benutzt, der die Cytokine IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ und TNF α nachweist. Die Zellüberstände wurden mit den spezifischen capture-Antikörpern für IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-γ und TNF α inkubiert. Die Bedingungen und Inkubationszeiten wurden für den Kit angegebenen Bedingungen durchgeführt. Die capture-Antikörper wurden mit PEkonjugierten Detektionsantikörpern gemischt um Sandwich-Komplexe zu bilden. Als Kontrollen wurden die im Kit enthaltenen Standards eingesetzt. Die unterschiedlichen Fluoreszenz-Intensitäten der Antikörper wurden an einem FACS-Gerät gemessen und analysiert. EBV-Tansformation Es wurden 7x106 Zellen zur EBV Transformation eingesetzt. Diese wurden in einem 15 ml Falcon Tube 5 min bei 1200 rpm abzentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in B95.8 (EBV-Lösung) resuspendiert. Nach 2-stündiger Inkubation im Wasserbad bei 37°C wurden die Zellen 1x mit PBS gewaschen und das Pellet in 10 ml Medium zzgl. Cyclosporin A resuspendiert. Die transformierten Zellen wurden auf einer 6-wellPlatte ausplattiert. Prime Lymphocyte Test Zur Aktivierung der γδ T-Zellen durch Leishmania-Antigene wurde ein Prime Lymphocyte Test durchgeführt. Pro Spender wurden 10x106 mittels eines Ficoll Gradienten isolierten PBL in 10 ml IMDM in eine Zellkulturflasche ausplattiert. Die Zellen wurden mit einer ermittelten Verdünnung der Leishmania-Antigene versetzt und 5 Tage bei 37°C und 7% 107 4. Material und Methoden CO2-Sättigung inkubiert. Die Aktivierung der γδ-T-Zellen wurde mittels FACS oder mittels eines Proliferationstests ermittelt. Immunhistochemische Methoden Fixierung der Zellen und des Gewebes Für die Fixierung der Zellen und des Gewebes wurde die Formalinfixierung verwendet, die eine gute Durchdringung und Erhaltung des Gewebes ermöglicht. Die Zellen wurden in einer 4%igen Formalinlösung (in ddH2O) 2 Stunden bei RT inkubiert, anschließend wurde das Formalin vorsichtig entfernt und die Zellen in Paraffin eingebettet. Einbettung von Zellen und Zellklonen in Paraffin Die Zellen bzw. Zellklone wurden 5 min bei 1200 rpm in einem 15 ml Falcon Röhrchen abzentrifugiert, 2 mal mit PBS gewaschen und 1-5 h mit 4% Formalin fixiert. Nach Inkubation wurde das Formalin vorsichtig abgenommen und die Zellen 2 mal mit PBS gewaschen um das Formalin vollständig zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen 30 min im Brutschrank bei 40°C vorgewärmt. Auf die Zellen wurde 2% Agarose (gelöst in dd H2O) getropft, die ebenfalls auf 40°C temperiert wurde. Die überschichteten Zellen wurden 2 min bei 13000 rpm abzentrifugiert und anschließend 30 min auf Eis inkubiert. Das gekühlte Agarose-Pellet wurde vorsichtig mit einem Spatel aus dem Röhrchen gelöst und entwässert: 50% Ethanol 10 min. 70% Ethanol 10 min. 90% Ethanol 10 min. 96% Ethanol 10 min. 100% Ethanol 2 x 10 min. Xylol 2 x10 min. 108 4. Material und Methoden Nach der Entwässerung wurden die Zellen 30 min. in Paraffin inkubiert und anschließend mittels eines Einbett-Gerätes in Paraffin eingebettet. Herstellen von Paraffin- bzw. Gefrierschnitten Die Paraffinschnitte von den eingebetteten Zellen und Zellklonen wurden vom Immunhistologischen Labor des pathologischen Instituts des Uniklinikums Freiburg hergestellt. Die Gefrierschnitte des analysierten Tumorgewebes wurden von Bernd Wassmer aus der molekularpathologischen Abteilung des pathologischen Instituts des Uniklinikums Freiburg hergestellt. Entparaffinierung von Paraffinschnitten Für die Entparaffinierung müssen die Schnitte gut getrocknet sein. Die Schnitte wurden entweder über Nacht im Brutschrank bei 37°C oder für 1 h bei 65°C inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte wie folgt entparaffiniert: Xylol 1 45 min. Xylol 2 2 min. 100% Ethanol 2 min. 96% Ethanol 2 min. 80% Ethanol 2 min. 70% Ethanol 2 min. 2-3 mal in H2O dest. waschen Hämatoxylin/Eosin-Färbung Um die Qualität der Paraffinschnitte zu analysieren wurden bei jeder Zellprobe bzw. bei jedem Zellklon HE-Färbungen durchgeführt. Die entparaffinierten Schnitte wurden in einer Hämalaun-Färbelösung 20 min. inkubiert, mit Leitungswasser abgespült und an- 109 4. Material und Methoden schließend mit Eosin gegengefärbt. Hämalaum färbt die Membran und einige Zellkompartimente des Cytoplasmas an während Eosin ausschliesslich die Kerne färbt. Demaskierungsmethoden für Paraffinschnitte Um die Epitope der in eingebetteten Paraffinschnitten für die Bindung des Primärantikörpers wieder zugänglich zu machen, benötigt es mehrere Schritte. Der erste liegt in der Entparaffinierung der Schnitte durch Xylol und einer absteigenden Ethanolreihe. Um die Epitope gänzlich freizulegen folgt eine Vorbehandlung der Schnitte, die abhängig vom Primärantikörper angewandt wird: Kochen der Schnitte in Citratpuffer (pH6) 1 Liter des angesetzten Citratpuffers (pH6) wurden in einen Drucktopf gegeben. Die Objektträger wurden in einen temperaturbeständigen Plastikständer gestellt und in den Citratpuffer gegeben. Wenn der maximale Druck des Drucktopfes erreicht war, wurde die Zeit gemessen die für die einzelnen Schnitte benötigt wurde. Für viele in der Immunhistologie eingesetzte Antikörper wird eine Kochzeit von 4 min. empfohlen. Da der γδ TCR Antikörper in der Immunhistologie noch etabliert werden muss, wurden unterschiedliche Kochzeiten getestet. Nach der gewünschten Kochzeit wurde der Dampf abgelassen und langsam kaltes H2O dest. zu dem Citratpuffer zugegeben bis der Topfinhalt wieder die Raumtemperatur erreichte um ein langsames Abkühlen der Schnitte zu gewährleisten. Eine weitere Methode der Vorbehandlung in Citratpuffer ist das Kochen der Objektträger in der Mikrowelle. Dazu wurde der angesetzte Citratpuffer in eine temperaturbeständige Plastikform gegeben und die Schnitte in einem Plastikständer in den Citratpuffer gestellt. Dann wurde die gewünschte Kochzeit exakt eingestellt und nach Ablauf dieser Zeit wurden die Schnitte langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. 110 4. Material und Methoden Kochen der Schnitte in einer basischen Retrieval-Lösung (pH10) Für einige Antikörper ist das Kochen in einer basischen Lösung mit pH10 erforderlich. Die hier eingesetzte Retrieval-Lösung wurde kommerziell bei der Firma DAKO erworben und wurde nach den angegebenen Bedingungen eingesetzt. Enzymatische Vorbehandlungsmethoden Um die Epitope für den Primärantikörper zugänglich zu machen, ist bei einigen Antikörpern ein enzymatischer Verdau erforderlich. Die eingesetzten Enzyme wurden auf die jeweilig erforderliche Konzentration eingestellt, direkt auf die Schnitte pipettiert und in einer feuchten Kammer inkubiert. Die Konzentration und die Inkubationszeit und Temperatur sind von dem jeweils eingesetzten Enzym abhängig. Enzymatischer Verdau mittels Trypsin Das Trypsin wurde in einer Konzentration von 0,01% in CaCl2 (pH 7,8) eingesetzt. Die Schnitte wurden entweder bei Raumtemperatur oder bei 37°C im Brutschrank 10-30 min. inkubiert. Die Inkubationszeit wurde variiert um eine optimale Vorbehandlungszeit zu ermitteln. Enzymatischer Verdau mittels Proteinase K Proteinase K wurde in einer Konzentration von 0,1% in PBS eingesetzt. Der Verdau von Proteinase K wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die empfohlene Inkubationszeit betrug 10 min., die Dauer des enzymatischen Verdaus wurde jedoch ebenfalls variiert und betrug zwischen 10 und 30 Minuten. Enzymatischer Verdau mittels Pepsin Das verwendete Pepsin wurde in einer Konzentration von 4mg/ml in 0,9% NaCl (pH1,5) eingesetzt. Die Inkubationszeit des Verdaus mittels Pepsin betrug 10 min. bei 37°C (im Brutschrank). Vorbehandlung der Schnitte mit Ameisensäure 111 4. Material und Methoden Eine weitere Methode zur Vorbehandlung der Schnitte ist eine Inkubation mit Ameisensäure. Dazu wurde eine 10%ige Ameisensäurelösung hergestellt (in PBS) und direkt auf die Schnitte gegeben. Die Inkubation fand bei Raumtemperatur statt, und es wurden unterschiedliche Inkubationszeiten zwischen 10 und 60 Minuten getestet. Avidin-Biotin-Färbung Für die immunhistologischen Färbungen wurde die Avidin-Biotin-Methode verwendet. Paraffinschnitte wurden vor der Färbung entparaffiniert, Gefrierschnitte wurden direkt verwendet. Die Schnitte wurden nach Spülen mit ddH2O 30 min in einer 0,3% H2O2Blockierungslösung bei RT inkubiert. Danach wurden die Schnitte mit ddH2O gewaschen und 3x5 min in PBS inkubiert. Anschließend wurden die Paraffinschnitte unterschiedlichen Vorbehandlungsmethoden (siehe unten) unterzogen um die Epitope für den Antikörper freizulegen. Für die erste Färbung wurden unterschiedliche Verdünnungen des Primärantikörpers (TCR γδ) herstellt, da jeder Antikörper bei unterschiedlichen Bedingungen und Verdünnungen ein optimales Färbeergebnis erzielt. Der Primärantikörper (TCR γδ) wurde in unterschiedlichen Verdünnungen zwischen 1:50 und 1:1000 (in PBS) auf die Schnitte aufgetragen und in der feuchten Kammer 1-2 h im Dunkeln inkubiert. Die Inkubationszeiten des Primärantikörpers wurden bei den unterschiedlichen Färbeansätzen variiert, um die optimale Zeit zu ermitteln. Die kommerziellen Antikörper der Firma DAKO, die als Kontrolle dienten, wurden in der von der Firma angegebenen Verdünnung aufgetragen. Als Positivkontrolle wurde ein T-Zell spezifischer Antikörper CD3 und als Negativkontrolle ein B-Zell spezifischer Antikörper CD20 eingesetzt. Nach Inkubation des Primärantikörpers wurden die Schnitte 3x5 min. mit PBS-Puffer in der Färbeküvette gewaschen und anschließend 10 min. mit 3-4 Tropfen des Normalserums inkubiert. Das Normalserum, der biotinylierte Sekundärantikörper und der ABCKomplex stammen aus einem kommerziell erworbenen Vecta stain ABC-Kit der Firma Serva und wurden in den angegebenen Konzentrationen eingesetzt. Das Normalserum wurde durch vorsichtiges Abschütten von den Objektträgern entfernt. Anschließend folgte eine Inkubation mit dem biotinylierten Sekundärantikörper (3-4 Tropfen) von 4560 min. in der feuchten Kammer. Der überschüssige Sekundärantikörper wurde nach der Inkubation durch 3x5 min. Waschen mit PBS von den Objektträgern entfernt. Der 112 4. Material und Methoden ABC-Komplex wurde nach den vom Hersteller angegebenen Bedingungen erzeugt, auf die Schnitte gegeben und 60 min in der feuchten Kammer inkubiert. Nach neuerlichem Waschen der Schnitte mit PBS (3x5 min.) folgte eine 15 minütige Chromogenfärbung in der Färbeküvette. Zur Kerngegenfärbung wurden die Schnitte anschließend eine Minute mit einer Hämalaunlösung inkubiert und 5 min. mit Leitungswasser gewaschen. Die Objektträger wurden mit Aquatex eingedeckt und am Mikroskop analysiert. 113 5. Abkürzungsverzeichnis 5. Abkürzungsverzeichnis ABC-Methode Avidin-Biotin-Complex-Methode AK Antikörper APC Antigenpräsentierende Zelle β2M β2-Mikroglobulin CBA Cytometric Bead Array cDNA copy DNA CMV Cytomegalo-Virus CTL cytotoxische T-Lymphozyten DNA Desoxyribonukleinsäure cpm counts per minute DMEM Dulbecco´s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid EBV Epstein-Barr-Virus Fa Firma FACS Fluorescence Activated Cell Sorting HIV Human Immunodeficiency Virus HLA human leukocyte antigen Ig Immunglobulin IMDM Iscove´s Modified Dulbecco´s Medium ITAM Immuno-tyrosine-based activation motif kD Kilodalton KIR killer cell immunglobulin-like receptor LCL Lymphoid Cell Line MACS Magnetic Activated Cell Separation MHC Major histocompatibility complex min Minuten NCR Natural Cytotoxicity Receptors NKR Natürliche Killerzell-Rezeptoren NK-Zellen Natürliche Killerzellen PBS Phosphate Buffered Saline Dulbecco´s PCR Polymerasekettenreaktion 114 5. Abkürzungsverzeichnis PLT Prime Lymphocyte Test RNA Ribonukleinsäure RT-PCR Reverse Transkriptase-PCR SDS Dodecylsulfat, Natriumsalz TCR T cell receptor 115 6. Literaturverzeichnis 6. Literaturverzeichnis Agrati C., D´Offizi G., Narciso P., Abrignani S., Ippolito G., Coalizzi V. and Poccia F. (2001): Vδ1 T lymphocytes expressing a Th1 phenotype are the major γδ T cell subset infiltrating the liver of HCV-infected persons. Mol. Med. 7(1): 11-19 Aljurf M., Ezzat A. und O Musa M. (2002): Emerging role of gamma/delta T-cells in health and disease. Blood 16(4): 203-6 Allison T.J., Winter C.C, Fournié J.J., Bonneville M. and Garboczi D.N. (2001): Structure of a human gamma-delta T-cell antigen receptor. Nature 14; 411(6839):820-24 Aramburu J., Balboa M.A., Ramirez A., Silva A., Acevedo A., Sanchez-Madrid F., De Landazuri M.O. and Lopez-Botet M. (1990): A novel functional cell surface dimer (Kp43) expressed by natural killer cells and T cell receptor-gamma/delta+ T lymphocytes. I. 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Sippel für die Betreuung an der Fakultät für Biologie der AlbertLudwigs-Universität Freiburg und für seine moralische Unterstützung. Meinen Labormädels Silke, Sylvia, Sabine und Daniela für den Spaß in- und außerhalb des Labors. Den gesamten Kollegen des Labors Nothnagel für die freundlichen Worte und den guten Ratschlägen zu sämtlichen Problemchen. Andreas Gaa und Bernd Wassmer für die tatkräftige Unterstützung bei der Benutzung der Geräte in der Pathologie und für die Herstellung der Paraffin- und Gefrierschnitte. Meinen Mädels Katha, Dagmar und Gabi für die vielen lustigen Zeiten ausserhalb des Labors und für ihre moralische Unterstützung in allen Belangen. Meinen Eltern, die mich wo immer es nur ging unterstützt haben und die immer für mich da sind. Lorenz, Moritz und Elin, die wichtigsten Menschen in meinem Leben, dafür, dass sie mir grosse Freude und Spass bringen und dafür, dass sie einfach da sind. 134 8. Lebenslauf 8. Lebenslauf Daten Name: Nicole Rupp Geburtsort: 88250 Weingarten, BW Geburtsdatum: 06.06.1973 Familienstand: Verheiratet Kinder: Moritz, geb. 07.10.1996 Elin Mia, geb. 19.03.2004 Adresse: Wallstraße 26 Wohnort: 79098 Freiburg i. Br. Telefon: 0761-8814571 E-Mail: [email protected] Schulausbildung 1979-1983 Grundschule Unterankenreute 1983-1992 Gymnasium Weingarten, Abschluss Abitur Au-Pair Zeit 1992-1993 Familie Benoit Bucaille, Paris Besuch einer Sprachschule Studium 1993-1996 Grundstudium der Biologie an der Albert-LudwigsUniversität Freiburg. 1996-1997 Erziehungsurlaub 1997-2000 Hauptstudium der Biologie mit Schwerpunkt Molekularbiologie und Genetik an der Albert-Ludwigs Universität Freiburg 2000-2001 Diplomarbeit in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. A. E. Sippel, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Promotion 135 8. Lebenslauf 2001-2005 Dissertation im Labor von Prof. Dr. Paul Fisch im Institut für Pathologie der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg mit dem Titel: Untersuchungen zur Funktion und zum Repertoire humaner γδ T-Zell-Subpopulationen 136 9. Erklärungen 9. Erklärungen Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Die aus anderen Quellen direkt oder indirekt übernommenen Daten und Konzepte sind unter Angabe der Quellen gekennzeichnet. Insbesondere habe ich hierfür nicht die entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- beziehungsweise Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Die Arbeit wurde bisher weder im In- noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Freiburg, den 10.12.2005 ____________________ Nicole Rupp, Die Bestimmungen der Promtionsordnung der Fakultät für Biolgie der Universität Freiburg sind mir bekannt; insbesondere weiß ich, dass ich vor Vollzug der Promotion zur Führung des Doktortitels nicht berechtigt bin. Freiburg, den 10.12.2005 _____________________ Nicole Rupp 137
