Kalibriergerade des Markers

A) Einleitung
Proteine tragen wesentlich zum Aufbau und Funktionieren einer Zelle bei. Nachfolgend soll
der Aufbau, die Einteilung und die Bildung von Proteinen besprochen werden.
1. Aufbau
Proteine sind aufgebaut aus Aminosäuren, deren allgemeine Formel hier abgebildet ist.
Abb.: 1 Aufbau Aminosäure (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)
Ein solches Molekül bildet einen Baustein eines Proteins. Im Molekül sind zwei funktionelle
Gruppen zu sehen: die Carboxylgruppe -COOH und die Aminogruppe -NH2. Mit diesen
Gruppen wird die Verbindung zu den anderen Aminosäuren geknüpft. Es gibt 20 für den
Proteinaufbau wichtige Aminosäuren. Manchmal wird auch noch eine 21 Aminosäure, das
selten vorkommende Selenocystein, zu diesen dazugezählt. In eukaryotischen Zellen kommen
nur die so genannten L – Aminosäuren vor. In der Fischer-Projektion liegt bei der
L-Konfiguration die Aminogruppe auf der linken Seite des Moleküls, bei der D-Aminosäure
auf der rechten Seite (von dexter, lat. rechts und laevus, lat. links).
Man unterscheidet Aminosäuren mit hydrophoben (Rest nicht wasserlöslich), hydrophilen
(Rest
wasserlöslich),
sauren
(Protonendonator),
aromatischen (Phenylring) Resten.
1
basischen
(Protonenakzeptor)
und
Abb.: 2 Einteilung Aminosäuren (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)
Es gibt zwei Aminosäuren die eine Sonderrolle spielen. Zum einen das Glycin, welches an
seinem α – C-Atom keine Chiralitätszentrum hat und zum anderen das Prolin, welches mittels
der Amino-Gruppe und seinem Rest einen Ringschluss vollzieht.
2
Die Bindung zwischen zwei Aminosäuren über die Carboxyl-gruppe der einen und
Aminogruppe der anderen heißt Peptidbindung. Dabei wird ein Wassermolekül abgespalten.
Solche Reaktionen, bei denen Wasser abgespalten wird, heißen Kondensationsreaktionen. Die
Spaltung dieser Bindung nennt man Hydrolyse. Dazu wird je ein H2O-Molekül benötigt.
Die Abbildung unten zeigt relativ gut, dass die Verbindung der Aminosäuren über die
Peptidbindung räumlich zu einer "Zick-Zack"-Kette führt.
Abb.: 3 Peptitbindung (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)
2. Struktur der Proteine
Betrachtet man die Struktur der Proteine so kann man diese in verschiedene Unterstrukturen
unterteilen.
Zum einen gibt es die Primärstruktur welche nur aus der spezifischen Reihenfolge der
Aminosäuren gegeben ist.
Die Primärstruktur des blutzuckersteigernden Hormons Glucagon sieht z.B. so aus:
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe
Val Gln Trp Leu Met Asn Thr
3
Eine weitere Struktur ist die Sekundärstruktur.
Abb.: 4 α-Helix und β-Faltblatt (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)
Man unterscheidet zwischen der helikal angeordeten α-Helix und dem antiparallel laufenden
β-Faltblatt. Die Ausbildung der Strukturen wird durch Wasserstoffbrückenbindungen
stabilisiert. Bin Übergang von der einen Struktur in die andere kommt es oft zur aus
Ausbildung einer so genannten β-Schleife. Meist ist die Ursache für die Schleifenbildung die
Aminosäure Prolin.
Die Tertärstruktur wird durch die räumliche Faltung des Proteins gebildet. Hierbei haben
Van – der – Waals Kräfte, Dipol – Dipol – Wechselwirkungen, ionische Wechselwirkungen
sowie Disulfitbrücken eine wichtige stabilisierende Wirkung.
Abb.: 5 Tertiärstruktur von Porin (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)
4
Die letzte Struktur ist die Quartiärstruktur. Hier lagern sich mehrer räumlich gefaltete
Proteine zu einem Komplex zusammen.
Abb.: 6 GAPD (= Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase), (Ernst-Georg Beck)
3. Abbau von Proteinen
Er Abbau von Proteinen erfolgt über so genannte Peptidasen. Es gibt Exopeptidasen und
Endopeptidasen. Exopeptidasen schneiden die Polypeptitkette beliebig irgendwo der Mitte
auseinander während Endopeptidasen nur die Enden eines Proteins angreifen können. Dabei
unterscheidet man zwischen Carboxypeptidasen ( können nur am Carboxylende angreifen )
und Aminopeptidasen (greifen an der Aminogruppe an).
4. Bildung von Proteinen
Proteine werden in der Proteinbiosynthese gebildet. Dies besteht aus zwei zentralen
Vorgängen, der Transkription und der Translation. Hier soll nur näher auf die Translation
eingegangen werden. Die Information über die Bildung eines Proteins ist in der DNA
gespeichert. Die prä – mRNA entspricht einer Kopie der DNA, welche Informationen über die
Bildung eines Proteins einhält. Sie wird während der Transkription gebildet.
4.1 Processing
Diese prä – mRNA muss, bevor sie abgelesen werden kann noch verschiedene Stufen des
Processings durchlaufen. Beim Splicing werden mittels Spleißsosomen die Introns, welche
keine Information zur Realisierung der DNA enthalten, herausgeschnitten. An das 5’-Ende
der Prä-mRNA wird beim Processing ein 7-Methyl-GTP-Rest angehängt, welcher als 5’-Cap
bezeichnet wird. Er dient als Schutz der m-RNA vor der Hydrolyse durch Exonucleasen und
5
als Erkennungsmerkmal für die Ribosomen. An das 3’- Ende wird ein Poly-A-Schwanz
(Polyadenylat-Schwanz) angehängt. Dieser bewirkt ebenso Schutz vor Exonucleasen und
erleichtert der mRNA das Verlassen des Zellkerns.
4.2 Translation
In der Translation wird die Information zur Bildung eines Proteins, welche auf der mRNA
gespeichert ist, in Form von einer Aminosäuresequenz realisiert. Diese Information ist in
Form von Basentripletts gespeichert, welche die Aminosäuren nicht erkennen können. Als
Bindeglied zwischen Aminosäure und mRNA dient die tRNA. Sie sichert zu, dass die richtige
Aminosäure dem richtigen Basentriplett zugeordnet wird.
Nachfolgend ist ein t-RNA-Molekül dargestellt.
t-RNA-Moleküle bestehen aus ca. 90
Basen und bilden mit sich selbst
Wasserstoffbrückenbindungen aus. So
entsteht im zweidimensionalen die
typische Kleeblatt-Struktur mit drei
Schleifen. Im dreidimensionalen spricht
man von der L – Form. Am 3´-Ende
wird die Aminosäure angelagert.
Abb.: 7 Struktur einer tRNA (Biokurs 2001, Ernst-Georg
Beck)
Die T – Schleife spielt eine wichtige
Rolle bei der Anlagerung an die Aminoacyl – tRNA – Synthetase während die D-Schleife bei
der Anlagerung an die Ribosomen unterstützend wirkt. Das sogenannte Anticodon ist eine
Abfolge von 3 Nukleotiden in der Anticodonschleife, die spezifisch für die einzelnen t-RNAMoleküle ist und an die komplementären Basentripletts der mRNA bindet.
Die Bindung der Aminosäure an die tRNA erfolgt mit dem Enzym Aminoacyl – tRNA –
Synthetase. Unter ATP – Verbrauch wird die Aminosäure an das 3´-Ende der tRNA
gebunden.
Dies geschieht mittels folgender Reaktionen:
Aminosäure + ATP + Enzym Aminoacyl-AMP-Enzym + PPi
Aminoacyl-AMP-Enzym + tRNA Aminoacyl-tRNA + AMP + Enzym
6
In der nachfolgenden Abbildung ist das Schema dieser Reaktion noch einmal bildlich in Form
eines Kreislaufes dargestellt.
Abb.: 8 Beladen einer tRNA (Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)
Die Translation lässt sich grob in die Initiation, die Elongation und die Termination
unterteilen. Bei der Initiation lagert sich die
kleine Untereinheit der Ribosomen an ein
Startcodon am 5´- Cap – Ende der mRNA. Nun
bindet die Initiations – tRNA (bei Eukaryoten
immer Methionyl – tRNA) an der mRNA. Darauf
hin lagert sich noch die große ribosomale
Untereinheit an. Nun, da sich die A - (Aminoacyl
– tRNA) Stelle und die P – (Peptidyl – tRNA)
Stellen gebildet haben, kann mit der Elonation
begonnen werden. Die Methionyl – tRNA sitzt
auf der P – Stelle. An die A – Stelle kann sich
eine neue tRNA anlagern. In einem Schritt, den
die Peptit – Transferase katalysiert wird die
Aminosäure auf der P – Stelle mit der auf der A –
Stelle verknüpft. Nun wandert das Ribosom
weiter. Die tRNA, welches auf der P – Stelle war
Abb.: 9 Initiation der Translation (Campbell,
Biologie, 2.korrigierter Nachdruck 2000,
Spektrum-Verlag)
wird nun frei und die tRNA, welche auf der
7
A – Stelle war nimmt ihren
Platz ein. Die A – Stelle ist nun
frei und eine neue tRNA kann
sich anlagern. So wird der
Prozess immer weitergeführt
und
die
Peptitkette
immer
länger.
Abb.: 10 Elongation ( Biokurs 2001, Ernst-Georg Beck)
Beendet wird der Vorgang durch die Termination. Sie wird eingeleitet durch ein so genanntes
Stoppcoden z.B. UAG, UGA, UAA. Außerdem sind noch Release – Faktoren nötig. Befindet
sich ein Stoppcoden an der A-Stelle dann lagert sich keine tRNA, sondern der eben genannte
Release - Faktor an. Dieser Faktor bewirkt den Zerfall des Komplexes aus großer und kleiner
ribosomaler Untereinheit sowie der mRNA. Damit ist die Translation beendet und die
Polypeptitkette wird freigesetzt.
Abb.: 11 Termination der Translation (Campbell, Biologie, 2.korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum-Verlag)
8
5. Stickstofffixierung
Pflanzen benötigen Ammonium für den Aufbau von Proteinen. Dies bekommen sie entweder
direkt über Symbionten (z.B. Rhizobien), welche den Luftstickstoff fixieren können und der
Pflanze zur Verfügung stellen oder sie gewinnen mittels Nitrat- und Nitritreduktasen
Ammonium aus Nitrat oder Nitrit, welches sich im Boden befindet.
6. Sodiumdodecylsulfat – Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die SDS-PAGE ist eine molekularbiologische Methode zur Auftrennung von Proteinen nach
ihrem Molekulargewicht. Hierbei ist es wichtig, dass die Proteine dieselbe räumliche Struktur
aufweisen (eindimensional) und dieselbe Ladung tragen (negativ). Diese Voraussetzungen
werden in der denaturierenden, diskontinuierlichen PAGE durch die Zugabe der Detergens
SDS gewährleistet. SDS lagert sich an Proteine an, spaltet alle nichtkovalenten Bindungen
und verleiht dem Protein eine negative Gesamtladung. Um auch die kovalenten
Disulfidbrücken in einem Protein spalten zu können wird unterstützend ein Reduktionsmittel
wie z.B. β-Mercaptoethanol oder DTT, dazugegeben. Wird nun ein elektrisches Feld an das
Gel angelegt, so wandern kleine Proteine mit einem geringen Molekulargewicht schneller
durch die Maschen des Polyacrylamids in Richtung der Anode, als große Proteine mit einem
hohen Molekulargewicht.
9
B) Material und Methoden
1. SDS – PAGE
Zur Auftrennung der Proteine aus Senfkeimlingen, die zum einen unbelichtet (etioliert) waren
und zum anderen 14h vorbelichtet waren, wurde eine SDS – PAGE (siehe Theorie 1..........)
von der Betreuerin vorbereitet. Die Pufferkammern der PAGE wurden mit Laufmittel gefüllt
und anschließend die Proben geladen. Hierfür wurden je 2g Senfhypokotyle mit etwas
Seesand und 5ml Boratpuffer homogenisiert, 10min bei maximaler Stufe zentrifugiert und der
Überstand in Eis aufbewahrt. Vom Überstand wurden je 60µl der beiden Pflanzen mit 20µl
Ladepuffer versetzt und in die Taschen gefüllt. Außerdem wurde ein Standard in eine Tasche
gegeben. Die Anordnung sah wie folgt aus:
unbelichtete
belichtete
Senfpflanze Senfpflanze
Teilgr. 1
Marker
leer
unbelichtete
leer
belichtete
Senfpflanze Senfpflanze
Teilgr. 1
Teilgr. 2
Teilgr. 2
Zunächst wurde eine Spannung von 100 V angelegt, bis der Indikator Bromphenolblau die
Trennschicht zwischen Sammel- und Trenngel erreicht hatte. Dann wurde die Spannung auf
200 V erhöht, bis das Bromphenolblau das Gel verlassen hatte.
Anschließend wurde das Gel von der Betreuerin mit dem Farbstoff Coomassie angefärbt, über
Nacht wieder entfärbt und zur Kontrastverstärkung in Glycerinlösung gegeben.
2. Anthocyan – und Leucocyanbestimmung
2.1 Anthocyanbestimmung
2g eines belichteten und 2g eines nicht belichteten Senfkeimlings wurden jeweils mit etwas
Seesand und 10ml 1M HCl homogenisiert. Anschließend wurden beide Proben für 10min bei
höchster Stufe zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Von diesem wurde bei 515nm
die Absorption gemessen, wobei als Leerwert HCl verwendet wurde.
2.2 Leucocyanbestimmung
In drei große Reagenzgläser wurden je 8ml der Lösung A (konz. HCl und n-Butanol) und 2ml
der Lösung B (Lösung A und Eisensulfat) pipettiert. Anschließend wurden in zwei der Gläser
2g der beiden, unterschiedlichen Senfpflanzen gefügt und alle bei 95°C für 15min inkubiert.
Nachdem die Proben abgekühlt waren, wurden 0,15ml der Extrakte mit 2,85ml der Lösung A
10
vermischt und deren Extinktion bei 515nm gemessen. Hierbei diente das dritte Reagenzglas,
dem keine Hypokotyledonen zugefügt wurden als Leerwert.
3. Messung der PAL – Enzymaktivität
3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration
Hierzu wurden jeweils 1,0ml des Überstandes der beiden, unterschiedlich belichteten
Senfarten mit 4ml Trichloressigsäure gemischt und die Extinktion bei 600nm gemessen. Als
Leerwert wurde hier ein Gemisch aus 1,0ml Wasser mit 4ml Trichloressissäure verwendet.
3.2 Photometrische Detektion von Zimtsäure
Es wurden jeweils 1,5ml Boratpuffer mit 1,0ml Phenylalanin und 0,5ml des Überstandes aus
Versuch 1 in Quarzküvetten pipettiert und die Extinktion bei 290nm bestimmt. Als Nullwert
diente dabei ein Gemisch aus 2,0ml Boratpuffer und 1,0ml Phenylalanin. Die Extinktion
wurde alle 5 min gemessen, bis sich der ermittelte Wert nicht mehr veränderte.
11
C) Ergebnisse
1. SDS – PAGE
Die Betrachtung des PA-Gels zeigte keine deutlichen Banden, daher soll zur Auswertung das
Gel der Vorgruppe (Bild siehe Anhang) verwendet werden.
Zur Auswertung der Banden der Proben auf dem Polyacrylamidgel musste zunächst aus den
Laufweiten der Banden des Markers eine Kalibriergerade erstellt werden. Diese ist in der
folgenden Graphik dargestellt.
Graphik 1: Kalibriergerade des Markers
Kalibriergerade des Markers
2,3
log Molekulargewicht
2,2
2,1
2
1,9
1,8
y = -0,0527x + 2,4255
1,7
1,6
1,5
3
5
7
9
11
13
Laufweite der Banden [cm]
Die Ausmessung der Banden des Senfs (rechte Seite des Gels) ergab die in der folgenden
Tabelle gezeigten Laufweiten, und das daraus folgende Molekulargewicht.
Tab.: 1 Ermitteltes Molekulargewicht der Banden
Laufweite = x [cm]
y = -0,0527x + 2,5255
Molekulargewicht 10y [kDa]
6,5
2,08295
121,05
6,7
2,07241
118,14
7,9
2,00917
102,13
13,3
1,72459
53,04
12
Die ausgewerteten Banden waren sowohl bei der belichteen, als auch bei der unbelichteten
Pflanze zu erkennen.
2. Anthocyan – und Leucocyanbestimmung
2.1 Anthocyanbestimmung
In der nachfolgenden Tabelle…………….. sind die Ergebnisse der photometrischen
Bestimmung der beiden Senfpflanzen aufgeführt. Eine Extinktion E von 1 entspricht dabei
einem Cyanidingehalt von 0,37µmol.
Tab.2: Betimmung des Anthocyangehaltes
Senfpflanze
Extinktion E
Cyanidingehalt [µmol]
Unbelichtet
0,536
0,198
belichtet
0,906
0,335
In der etiolierten, Senfpflanze waren 0,198µmol Cyanidin enthalten. Die belichtete
Senfpflanze enthielt 0,335µmol Cyanidin.
2.2 Leucocyanbestimmung
Die gemessenen Extinktionswerte der Leucocyanbestimmung sind in Tabelle ……….
dargestellt. Da die Proben hierzu verdünnt wurden, müssen die Werte noch mit einem Faktor
von
20
multipliziert
werden.
Hierbei
entspricht
eine
Extinktion
von
1
einer
Cyanidinkonzentration von 0,37µmol. Von dem somit durch einen Dreisatz berechneten Wert
der Cyanidinkonzentration muss nun noch der Anthocyangehalt aus 2.1 abgezogen werden,
um auf den Leukocyangehalt zu kommen.
Tab. 3: Bestimmung des Leucocyangehaltes
Senfpflanze
Extinktion
Gesamtgehalt in
Anthocyangehalt Leucocyangehalt
µmol
aus 2.1 [µmol]
[µmol]
Unbelichtet
0,028
0,207
0,198
0,009
belichtet
0,083
0,614
0,335
0,279
Der Gehalt an Leucocyan in der unbelichteten, etiolierten Senfpflanze betrug 0,009 µmol. Der
Gehalt an Leuyocyan in der belichteten Senfpflanze war 0,279µmol.
13
3. Messung der PAL – Enzymaktivität
3.1 Bestimmung der Proteinkonzentration
Die im Photometer ermittelten Extinktionen sind in Tabelle ……….. aufgelistet. Hierbei
entspricht eine Extinktion von 0,22 einer Proteinmenge von 1mg.
Tab.4 : Bestimmung der Proteinmenge
Senfpflanze
Extinktion
Menge an Protein [mg]
Unbelichtet
0,878
3,991
belichtet
1,280
5,818
In 2g der unbelichteten, etiolierten Senfpflanze waren 3,991mg an Proteinen enthalten.
Dieselbe Menge der belichteten Pflanze wies hingegen 5,818mg an Proteinen auf.
3.2 Photometrische Detektion von Zimtsäure und Bestimmung der PAL-Aktivität
Die im Photometer ermittelten Extinktionen sind in Tabelle ………..erfasst.
Tab. 5: Detektion der Zimtsäure
Zeitpunkt der Messung
Extinktion E1 der
Extinktion E2 der belichteten
unbelichteten Senfpflanze
Senfpflanze
t0
1,892
2,226
t5
2,015
2,178
t10
2,226
2,226
Aus den obigen Werten lässt sich nun die Enzymaktivität der PAL im belichteten und im
unbelichteten Keimling berechnen. Die Formel für die Berechnung lautet:
AE =
Zimtsäure[nmol ]
t[min] * mPr otein [mg ]
Für den unbelichteten Keimling ergibt sich nun folgende Enzymaktivität:
-
dE = Et10 – Et0 = 2,226 – 1,892 = 0,334
Nach Lambert-Beer ergibt sich also folgende Konzentration der Zimtsäure:
c = ∆E / ε*d = 0,334/(107 cm2/mol * 1cm) = 33,4 nmol/ml
Da die Probe im Verhältnis 1:6 verdünnt war ergibt sich letztendlich eine Konzentration von
200 nmol/ml.
Die resultierende Enzymaktivität beträgt:
AE = 200nmol/ml / 10 min* 3,991mg = 5 nmol/ (min*mg*ml)
14
Da bei der belichteten Pflanze die Extinktionswerte zu Beginn und am Ende gleich sind, ist es
nicht sinnvoll eine Berechnung der Enzymaktivität durchzuführen, da hieraus eine
Konzentration der Zimtsäure von 0 resultieren würde und somit auch die Enzymaktivität 0
wäre.
15
D) Diskussion
1. SDS-PAGE
Durch die SDS-PAGE konnte gezeigt werden, dass sowohl in der unbelichteten Probe, als
auch in der belichteten Probe Proteine vorhanden waren. Es wäre jedoch zu erwarten
gewesen, dass das Bandenmuster nicht wie in unserem Fall identisch ist, denn im
unbelichteten Zustand werden andere Proteine synthetisiert als im belichteten. Außerdem
wären in der unbelichteten Probe mehrere verschiedene Proteinbanden zu erwarten gewesen,
da die Speicherproteine oftmals erst bei Belichtung abgebaut werden (siehe Aktivität der
PAL).
2. Anthocyan- und Leukocyanbestimmung
Bei der Bestimmung des Anthocyangehaltes zeigte sich, dass in der belichteten Probe mehr
Anthocyane enthalten waren, als in der unbelichteten (0,335 µmol gegenüber 0,198 µmol).
Dies war auch zu erwarten, da die Synthese dieser Farbstoffe durch die Aktivität der PAL
bestimmt wird, welche durch Belichtung induziert wird. Die PAL wandelt Phenylalanin in
trans-Zimtsäure um, aus der im Folgenden verschiedene sekundäre Pflanzenstoffe, u.a.
Anthocyane, synthetisiert werden.
Jedoch sollte man eigentlich erwarten, dass in der unbelichteten Pflanze gar keine Anthocyane
enthalten sind, da deren Synthese wie schon erwähnt lichtabhängig ist. Die geringen
Konzentrationen, die in unserem Fall vorhanden waren, lassen sich dadurch erklären, dass die
Proben im belichteten Raum bearbeitet wurden, so dass die PAL aktiv werden konnte.
Die Bestimmung der
Leukocyane zeigte, dass im unbelichteten Keimling bereits
Leukocyane, die Vorläufer der Anthocyane, enthalten waren. Es wäre zu erwarten gewesen,
dass im etiolierten Keimling viele Leukocyane enthalten sind, da die Pflanze diese als
Speicher anlegt, um bei Belichtung sofort mit der Synthese von Anthocyanen beginnen zu
können.
16
3. Messung der PAL-Aktivität
Die Bestimmung der Proteinmasse im belichteten und im unbelichteten Keimling ergab, dass
in der belichteten Pflanze mehr Proteinmasse vorhanden war, als im etiolierten Keimling.
Die Photometrie der Zimtsäure ergab keine zufrieden stellenden Ergebnisse. Die Werte für die
Extinktion bei der unbelichteten Pflanze zeigen den richtigen Trend, jedoch fiel beim
belichteten Keimling die Extinktion zunächst ab, um bei der nächsten Messung auf den
Ausgangswert zurück zu gelangen. Da der letzte Messwert bei beiden Pflanzen exakt
identisch war, liegt die Vermutung nahe, dass das etwas ältere Photometer keine genauen
Werte lieferte. Es wäre zu erwarten gewesen, dass die Extinktion zu Beginn bei der
belichteten Pflanze höher ist, dass die Extinktion bei der unbelichteten Pflanze im Verlauf der
Messungen jedoch stärker zunimmt, als bei der belichteten Pflanze.
Die aus diesen Extinktionsmessungen resultierenden PAL-Aktivitäten sind daher keinesfalls
repräsentativ. Wie dem Ergebnisteil zu entnehmen ist, zeigte die PAL im belichteten Zustand
keinerlei Aktivität.
Es wäre zu erwarten gewesen, dass die PAL-Aktivität bei längerer Belichtung zunimmt.
17
Weiterführende Fragen
Was bedeutet -L-Aminosäure? Welche Aminosäure in Abb.1 des Praktikumsskripts
Proteine besitzt unter diesem Aspekt eine Besonderheit?
Eine α-L-Aminosäure ist eine Aminosäure, die eine Amino- und eine Carboxylgruppe an
einem chiralen (assymmetrischen) α - C-Atom gebunden hat. Dies verleiht dem Molekül eine
optische Aktivität. Das L bedeutet, dass das Molekül in der Fischer-Projektion, die
Aminogruppe auf der linken Seite des chiralen C-Atoms hat.
Die Aminosäure Threonin hat, im Gegensatz zu den anderen abgebildeten Aminosäuren, ein
zweites chirales Zentrum.
PAL wird in der Pflanzenentwicklung neu synthetisiert. Können sie andere
Mechanismen der Regulierung der Enzymaktivität nennen?
Andere Mechanismen zur Regulierung der Enzymaktivität sind zum Beispiel die EndproduktRepression, die allosterische Hemmung oder Feedforward-Stimulierung. Bei der EndproduktRepression wird durch die Anhäufung des Endproduktes die Enzymsynthese gehemmt
(Feedback-Hemmung). Bei der allosterische Hemmung werden die Enzyme durch so
genannte Regulator-Moleküle (Effektoren oder Modulatoren) beeinflusst. Diese Moleküle
hemmen das Enzym durch Binden an ein allosterisches Zentrum am Enzym. Dadurch kommt
es zu einer Konformationsänderung des Enzyms und es verliert seine Funktion. Bei den
Regulatoren kann es sich um das Substrat der vom Enzym katalysierten Reaktion oder um
andere Stoffe handeln. Viele Enzyme sind auch nur in Kombination mit einem Cofaktor aktiv.
Fehlt dieser, hat das Enzym keine Wirkung. Eine andere Form der Enzymregulierung ist die
Interkonversion. Hier wird das Enzym durch eine Modifikation, zum Beispiel eine
Phosphorylierung, verändert. Dies kann, je nach Enzym und Modifikation zu einer
Aktivierung oder einer Deaktivierung des Enzyms führen. Wird die Enzymsynthese durch ein
Produkt eines vorgeschalteten Stoffwechsels gesteuert, spricht man von einer FeedforwardStimulierung.
18
Warum wandern bei der SDS-PAGE alle Proteine zur Anode?
Bei der SDS-PAGE werden die Proteine der Probe mit SDS (Natriumdodecylsulfat), einer
Seife, denaturiert. SDS-Moleküle haben einen hydrophoben Schwanz und einen polaren,
negativ geladenen Kopf. Diese Moleküle lagern sich mit den negativen Ladungen nach
außen an die Proteine an, die somit Kationen gleichen. Kationen wandern immer in Richtung
der Kathode.
Sehen Sie bei der Gelelektrophorese im Vergleich des Materials Unterschiede?
Im Gegensatz zur „normalen“ Gelelektrophorese wird hier ein Gel verwendet, das aus zwei
Phasen besteht. Bei der Gelelektrophorese läuft die Probe durch ein einphasiges Gel.
Der Vorteil des zweiphasigen Gels ist, dass die Proben auf ein Level gebracht werden und
so alle den gleichen Startpunkt haben. Ein weiterer Vorteil gegenüber der Gelelektrophorese
ist die Verwendung eines ungiftigen Farbstoffes (Coomassie Brilliant Blue G), bei der
Gelelektrophorese wird toxisches Ethidiumbromid verwendet. Doch auch bei der SDS-PAGE
werden giftige Substanzen verwendet (Acrylamid und Bisacrylamid, Bestandteile des
Trenngels), die aber nach dem Polymerisieren nicht mehr toxisch sind. Ein auf den
Farbstoffen beruhender Unterschied ist, dass das Gel aus der Gelelektrophorese nur auf der
UV-Box betrachtet werden kann, bei dem PAGE-Gel kann man ohne Hilfsmittel das Ergebnis
ablesen.
19