Universität Ulm Protokoll zu den Grundübungen

Universität Ulm
Protokoll zu den Grundübungen Pflanzenphysiologie
und Molekulare Botanik
Wintersemester 2011/2012
Versuch F2: Proteine
Tutor:
Vorgelegt von:
Abgegeben am: 07.12.2011
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Inhaltsverzeichnis:
1. Theorie zum Versuch
2
1.1 Proteinogene Aminosäuren
2
1.2 Proteinstrukturen
4
1.3 Chaperone
6
1.4 Aufgaben der Proteine
6
1.5 Die tRNA
8
1.6 Die Translation – von der Umsetzung des Bauplans
9
1.7 Der Cotranslationale Transport
12
1.8 Posttranslationale Modifikation
13
2. Versuchsdurchführung
14
2.1 SDS- PAGE
14
2.2 PAL- Enzymaktivität und Proteinkonzentration
15
2.3 Anthocyanbestimmung
15
2.4 Leucocyanbestimung
15
3. Ergebnisse
16
3.1 SDS- PAGE
16
3.2 PAL- Enzymaktivität und Proteinkonzentration
16
3.3 Anthocyanbestimmung
20
3.4 Leucocyanbestimung
21
4. Diskussion
21
4.1 SDS- PAGE
21
4.2 PAL- Enzymaktivität und Proteinkonzentration
22
4.3 Anthocyanbestimmung
23
4.4 Leucocyanbestimung
23
5. Zusammenfassung
24
6. Quellen
24
2
1. Theorie zum Versuch
1.1 Proteinogene Aminosäuren
Proteine sind das wichtigste Baumaterial der Zellen. Diese aus Aminosäuren bestehenden
Makromoleküle können von der Zelle selbst nach ihren Ansprüchen synthetisiert und lysiert
werden. Es kommt aber auch vor, dass Viren oder andere Erreger diese empfindliche
Maschinerie zu ihrem eigenen Nutzen manipulieren und die Proteinsynthese „aus dem
Ruder läuft“.. Bekannt sind 20 proteinogene Aminosäuren. Seite Neuestem wird
Selenocystein, eine Modifikation des Cysteins, als 21. proteinogene Aminosäure bezeichnet.
Der menschliche Stoffwechsel ist je nach Entwicklungsstadium dazu befähigt, die meisten
dieser Aminosäuren selbst zu synthetisieren. Für einen erwachsenen Menschen sind die
Aminosäuren Leucin, Isoleucin, Valin, Phenylalanin, Methionin, Lysin, Threonin und Tryptophan
Trypt
essentiell. Proteinogene Aminosäuren bestehen alle aus der in Abbildung
Abbildung 1 gezeigten
Grundstruktur:
Abbildung 1: Grundstruktur einer proteinogenen Aminosäure. Quelle:
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/ac/Alpha Amino_Acids_V.1.png/250px-Alphahttp://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/a/ac/Alpha-Amino_Acids_V.1.png/250px
Amino_Acids_V.1.png abgeändert. Stand: 02.12.11
Amino_Acids_V.1.png,
Daraus wird ersichtlich, dass es sich bei allen proteinogenen Aminsoäuren um ߙ- LAminosäuren handelt. Das bedeutet,
bedeut
dass die Aminogruppe der vicinale
cinale Nachbar der
Carboxylgruppe ist und sich damit ein Kohlenstoffatom weiter befindet. Das L (lat. leavus für
links) ergibt sich aus der Nomenklatur der FischerFischer Projektion,, die Substituenten sind in ihrer
Priorität linksdrehend um das chirale KohlenstoffKohlenstoff Atom angeordnet. Der Rest ist variabel
und ist geminal zur Aminogruppe angeordnet. Je nach den Eigenschaften des Restes werden
Aminosäuren in polar, unpolar, aromatisch, aliphatisch, neutral, basisch, sauer und
schwefelhaltig unterteilt (Siehe hierzu Abbildung 2).
3
Abb. 2: Einteilung proteinogener Aminosäuren. Quelle: http://www.biokurs.de/skripten/bilder/!aminoac.gif.
Stand: 02.12.11
Elektrochemisch betrachtet sind Aminosäuren (= AS) Zwitterionen, d.h. dass die
Carboxylgruppe der AS ein Proton abgeben und die Aminogruppe ein Proton
aufnehmen kann. So liegen AS allerdings nur am isoelektrischen Punkt vor, der für
jede AS spezifisch ist. Dazu muss der pH- Wert bei basischen AS erhöht und bei
sauren AS gesenkt werden. Um nun ein Protein zu gewinnen, müssen die
4
Aminosäuren über eine Peptidbindung miteinander verknüpfen, es entsteht ein
Dipeptid.
Dabei
handelt
es
sich
um
eine
Kondensationsreaktion
(=
Substitutionsreaktion zweier Moleküle unter Abspaltung eines einfachen Moleküls.
Hier: Wasser) zwischen der Aminogruppe der einen AS und der Carboxylgruppe einer
anderen AS unter Ausbildung einer polar kovalenten Bindung. Diese wird, wie in
Abbildung 3 gezeigt, mesomer stabilisiert. Daraus resultierend sind 4 Atome
nebeneinander planar angeordnet.
Abb. 3: Amin–Amid–Mesomerie. Quelle: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d7/AmidMesomerie.png. Stand: 02.12.11
Geschieht dies mindestens 100 mal, so hat sich ein Polypeptid gebildet. Dabei endet eine
Seite auf einer Carboxylgruppe (C – Terminus) und die Andere auf einer Aminogruppe (N –
Terminus). Der N- Terminus wird auch als Proteinanfang bezeichnet, weil an diesem mit der
Proteinsynthese begonnen wird und der C- Terminus als Proteinende, da er zuletzt
synthetisiert wird.
1.2 Proteinstrukturen
Aus der beträchtlichen Länge der Proteinmoleküle ergibt sich eine unübersichtliche
Strukturvielfalt. Um eine Proteinstruktur vernünftig erklären zu können, wird diese in vier
Strukturebenen aufgeteilt.
Die Primärstruktur beschreibt die Aminosäureabfolge eines Proteins. Diese wird oft auch als
Sequenz bezeichnet.
5
Die Sekundärstruktur beschreibt die Anordnung des Proteinrückgrats im Raum, die sich
durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Carboxyl- und Aminogruppen ergeben. Es
ergeben sich mehrere Strukturen:
1) Die – Helix ist eine meist rechtswindende Helix. Eine Windung hat eine Ganghöhe von
0,54 nm und enthält dabei circa 3,6 Aminosäuern. Die äußeren Seitenketten sind aufgrund
sterischer Wechselwirkungen gestaffelt (= staggerd) angeordnet.
2) Das - Faltblatt ist eine ziehharmonikaähnliche, geriffelte Struktur. Die einzelnen Stränge
können parallel zueinander angeordnet sein, d.h. die Enden stimmen überein, antiparallel,
d.h. die Enden sind gegenläufig, oder gemischt, wo es sich, wie der Name schon sagt, um
eine Mischform der beiden ersten handelt. Aufgrund der Sterik besitzen – Faltblätter im
Vergleich zur – Helix oft kleinere Seitenketten. Es sei hierbei erwähnt, dass das
antiparallele Faltblatt dabei das stabilste ist, weil die Reste benachbarter Stränge hier
gegeneinander angeordnet sind. Daher kommt dieses Faltblatt in der Natur am häufigsten
vor.
3) Bei der – Schleife oder auch – Turn handelt es sich um eine aus 4 Aminosäuren
bestehende Schlinge. Dabei sind die Carboxylgruppe der ersten AS und die Aminogruppe der
vierten AS über eine Wasserstoffbrücke miteinander verbunden. Oft kommt sie als Struktur
zwischen Faltblatt und Helix vor, weil sie die Torsionsspannung zwischen den beiden
Strukturen herabsetzt.
4) Ω- Loops. Hier handelt es sich ebenfalls eine Schleife, die aber keiner streng periodischen
Struktur unterliegt. Solche Schleifen dienen dazu, die AS des Schleifenanfangs und des Endes
näher aneinander zu bringen. Daraus können sich stabilisierende Wechselwirkungen
ergeben.
Weitere Wechselwirkungen der AS untereinander werden unter der Tertiärstruktur
zusammengefasst. Hierbei beteiligte Kräfte sind die Ausbildung von Disulfidbrücken, Van
der Waals– Wechselwirkungen, Ionenbindungen und Wasserstoffbrückenbindungen der
Reste zueinander. Diese Wechselwirkungen sind zudem noch vom Milieu abhängig. Daraus
ergeben sich wiederum verschiedene Proteinfaltungen.
Polypeptide können auch untereinander interagieren, bzw. wechselwirken. Sich daraus
ergebende Anordnungen werden als Quartärstruktur bezeichnet. Bekanntester Vertreter
6
hierfür ist das Hämoglobin, das aus 4 Proteinketten gebildet wird. Als Beispiel für
Disulfidbrücken fungiert das Insulin, dessen Proteinketten durch ebensolche Brücken
zusammengehalten werden.
1.3 Chaperone
Wenn ein Ei in der Pfanne brät, wird das Eiweiß undurchsichtig. Dieses Phänomen beruht auf
der Denaturierung der betroffenen Proteine – sie verändern ihre Struktur und verlieren
daher ihre Funktion. Unter solch drastischen Bedingungen ist die Denaturierung irreversibel.
Bei geringeren Hitzeschwankungen kann die Zelle ihre Proteine mithilfe von Chaperonen vor
der Denaturierung und dem damit verbundenen Funktionsverlust schützen. Chaperons
können also als Hitzeschockproteine fungieren und werden bei Hitzestress vermehrt
gebildet. In Pflanzen sind dies meist kleine, 5-20 kDa schwere Proteine, die wie ein „Fass“
mit 2 „Deckeln“ aussehen, in welchen die Proteine richtig gefaltet bleiben. Außerdem
spielen Chaperone eine Rolle zur korrekten Faltung der Proteine nach deren Synthese, was
sonst, bezieht man sich auf das Levinthal – Paradoxon, unadäquat lange dauern würde.
Chaperone besitzen in ihrem Inneren ein bis zwei Kammern, welche jeweils hydrophil oder
hydrophob sein können. Ein hydrophiles Protein erfährt in diesem Innenraum infolge der
Ladungsbeschaffenheit (elektrische Wechselwirkungen) eine Konformationsänderung zu
dessen nativen Form hin. Das Levinthal- Paradoxon führt vor Augen, dass, wenn jeder
Aminosäurerest 2 mögliche Konformationen annehmen kann, sich bei einer Polypeptidlänge
von n die Anzahl möglicher Faltungsvarianten auf 2 erhöht. Dauert in einem 150
Aminosäuren langen Polypeptid eine Konformationsänderung 10 , so dauert die
korrekte Proteinfaltung im schlechtesten Fall 10 Jahre. Chaperons findet man auch
extrazellulär, da Proteine zum Verlassen der Zelle oftmals ausreichend „schlank“ sein
müssen. Ihre Funktion können sie dann erst nach extrazellulärer Faltung aufnehmen.
1.4 Aufgaben der Proteine
Aufgrund der immensen Diversität können Proteine die unterschiedlichsten Aufgaben
übernehmen. Hier seien einige davon genannt:
1) Proteine katalysieren Reaktionen. Als Enzyme setzen Proteine die Aktivierungsenergien
vieler Reaktionen herab und greifen somit kinetisch in den Zellmetabolismus ein. Ein Enzym
7
setzt sich aus einem Proteinanteil, dem Apoenzym und einem Nichtproteinteil, dem
Koenzym zu einem Holoenzym zusammen. Sind beide Enzymanteile kovalent gebunden, so
wird der Kofaktor als prosthetische Gruppe bezeichnet. Als Beispiel sei hier die DNA –
Polymerase III genannt, die bei der Replikation der DNA den komplementären Strang
synthetisiert.
2) Proteine können aber auch gespeichert werden. Von Mikroorganismen ist bekannt, dass
sie Proteine als Stickstoffquelle nutzen und Stickstoff auch in dieser Form speichern. Auch in
Pflanzensamen lassen sich in der Aleuronschicht membranumgebene Speicherproteine in
Form von wasserlosen Kristallen, die beim Auswachsen der Pflanze gebraucht werden,
finden. Speicherproteine werden nach ihrer Löslichkeit eingeteilt:
- Albumine sind wasserlöslich
- Globuline sind salzlöslich
- Prolamine sind in Alkohol löslich
- Gluteine sind in saurem oder basischem Milieu löslich
3) Strukturproteine befinden sich im Extra- und im Intrazellulären. Diese verleihen dem
Gewebe sowohl Festigkeit als auch Elastizität. Sie werden sowohl im Cytoskelett einer Zelle
als auch im Bindegewebe, Sehnen, Bändern, Knochen und Knorpeln verbaut. Hier sei das
Protein Kollagen erwähnt. Kollagen dient in erster Line der Festigkeit. Es handelt sich hierbei
um ein - helikales Protein, welches sich unüblicherweise links herum aufwindet. Drei sich
umschlingende Helices bilden zusammen eine rechtsgängige Superhelix, welche durch starke
Wechselwirkungen der Helices untereinander zusammengehalten wird (siehe hierzu
Abbildung 4).
8
Abbildung 4: Stuktur des Kollagens. Quelle
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/d1/Collagentriplehelix.png
imedia.org/wikipedia/commons/d/d1/Collagentriplehelix.png. Stand: 02.12.11
4) Kontraktile Proteine dienen der Fortbewegung eines Individuums. Muskeln sind
beispielsweise hochgeordnete Proteinanordnungen von Actin und Myosin, die unter
erheblichem Energieaufwand ineinander verschoben werden können.
5) Transportproteine können bestimmte kleine Moleküle durch einen Organismus
befördern,
rdern, wobei der Zielort in der selben Zelle, in einer anderen Zelle oder sogar außerhalb
des Organismus liegen kann.. Ein bekannter Vertreter hierfür ist das Hämoglobin, welches
unter Veränderung der Oxidationsstufe des Zentralatoms der prosthetischen Gruppe,
nämlich des Eisens, Sauerstoff und Kohlenstoffdioxid durch die Blutbahn transportieren
kann.
6) Bei der Immunabwehr kommen
ommen Proteine in Form von Antikörpern zum Einsatz, die
spezifisch gegen Antigene eingesetzt werden können.
7)) Proteine können der Signalübertragung zwischen Zellen dienen und damit als Hormon
fungieren. In Pflanzen spielen Hormone eine zentrale Rolle bei der Kommunikation. Der
Transport geschieht vertikal meist über das Phloem und Xylem oder horizontal, meist in
Form eines Parenchymtransports. Als Beispiel für ein
ein Phytohormon sei das Systemin
9
erwähnt. Systemin wird bei der Verletzung von Pflanzen freigesetzt und initiiert eine Kette
von Signaltransduktionsprozessen, die wiederum der Synthese von anderen Hormonen und
Proteinen, die z.b. dem Schutz vor Schädlingen dienen, anregen.
1.5 Die tRNA
Die
tRNA
ist
ein
aus
73
bis
93
Ribonukleotiden
bestehender,
funktioneller
Basenzusammenschluss, der dem Vorgang der Translation eines Proteins dient. Dazu später
mehr. Die Sekundärstruktur einer tRNA ähnelt einem Kleeblatt. Diese kommt durch das
Wirken von Wasserstoffbrückenbindungen zustande (Siehe Abbildung 5, schwarze Streifen).
Die tRNA ist am 5‘ – Ende phosphoryliert und trägt an ihrem 3‘ – Ende eine Hydroxylgruppe,
an der sich eine veresterte Aminosäure anlagern kann. Diesem Stamm gegenüber ist die
Anticodonschleife. Die Anticodonschleife besteht aus 3 spezifischen Basen, welche mit einer
komplementären Sequenz auf der mRNA interagieren. Die seitens des 5‘- Endes befindliche
D- Schleife (D für Dihydrouracil, das häufig vorhanden ist) dient der Erkennung der tRNA
durch die Aminoacyl- tRNA- Synthethase, welche die tRNA dann mit der richtigen AS belädt,
oder den Einbau einer falschen Aminosäure korrigiert. Dies geschieht durch Abspalten von
AMP vom Aminoacylmolekül, welches aus der Reaktion einer Aminosäure mit ATP
hervorgegangen ist und somit aktiviert wurde. Die rechte TΨC – Schleife (Ribothymidin,
Pseudouridin, Cytosin) heftet sich an die 5S- rRNA der großen Ribosomenuntereinheit.
Abbildung 5 fasst die Struktur der tRNA zusammen:
10
Abbildung 5: Struktur der tRNA. . Stand: 02.12.11 Quelle:
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/ae/The_tRNA_cloverleaf_general.svg
Aus der Wobble- Hypothese geht hervor, dass nicht mehr als 41 verschiedene tRNAs in einer
Zelle existieren, es also weniger tRNAs gibt wie mögliche Codons. Dies liegt daran, dass die
erste Stelle des Anticodons der tRNA z.T. mit abgeänderten Basen wie etwa Inosin besetzt
wird, welche schlechter Wasserstoffbrücken zum Codon ausbilden können. Folglich ist der
genetische Code degeneriert. Dies hat zur Folge, dass Aminosäuren durch verschiedene
Tripletts codiert werden können. Die höhere Anzahl kommt durch verschiedene tRNAs für
das gleiche Codon zustande.
1.6 Die Translation – von der Umsetzung des Bauplans
Bei der Translation wird im Ribosom anhand der mRNA das entsprechende Protein
synthetisiert. Dazu verbinden sich zu Beginn der Translation die mRNA und mehrere
Initiationsfaktoren. Schließlich bindet noch die kleine ribosomale Untereinheit an den
Komplex. Im Folgenden bindet eine Initiator tRNA, die mit Methionen oder mit
Formylmethionin bei Bakterien beladen ist. Anschließend bindet der Komplex an die große
Ribosomuntereinheit. An der Peptidyl- Stelle (P- Stelle) sitzt die tRNA mit wachsender
Peptidkette. An der Aminoacyl- Stelle (A- Stelle) bindet die tRNA, die mit der nächsten
Aminosäure beladen ist, an das Startcodon (AUG). Die neue tRNA, sowie die tRNA der PStelle zur verschieben sich. Die tRNA der P- Stelle wird zur E- Stelle (Exit- Stelle) hin
verschoben, von wo aus sie das Ribosom verlassen kann. Die mRNA wird in 5‘- 3‘- Richtung
gelesen und Proteine werden vom Amino- zum Carboxylende hin synthetisiert. Einen
Überblick hierzu verschafft Abbildung 6. Nun zu den einzelnen Teilschritten der
Peptidsynthese:
1) Initiation. Hierfür werden in prokaryotischen Zellen die Initiationsfaktoren IF1, IF2 und IF3
benötigt. IF1 verhindert eine frühzeitige Bindung beider ribosomaler Untereinheiten und IF3
entfernt Nichtinitiator- tRNA. IF2, ein G-Protein, bindet die Initiator fmet- tRNA, verbindet
sich mit der kleinen Untereinheit und hilft schließlich unter GTP- Hydrolyse beim Verbinden
mit der großen Untereinheit.
11
2) Elongation. Es kommt zur Bindung neuer tRNA, Ausbildung einer Peptidbindung, welche
von dem Enzym Peptidyltransferase katalysiert wird und der Vorbereitung auf den nächsten
Elongationsschritt, bis ein terminierendes Codon erreicht ist. Für die Bindung neuer tRNA
wird der Elongationsfaktor Tu, ein G- Protein, benötigt. Dieser schützt die Esterbindung
zwischen der tRNA und der Aminogruppe und entlässt die tRNA, nachdem sie an das
Ribosom gebunden hat. Dazu wird GTP hydrolysiert. Ferner garantiert Tu ein Einbauen der
richtigen AS, weil eine falsche tRNA nicht vom Tu weg dissoziieren kann. Tu erkennt kein
Initiator- tRNA. Spaltung der Esterbindung und Bildung einer Peptidbindung ist eine
exotherme, endergonische Reaktion. Eine katalytisch wirksame RNA des Ribosoms, ein sog.
Ribozym verschiebt die Energiehyperfläche so, dass die Reaktion spontan ablaufen kann. Der
Elongationsfaktor– G, ein weiteres G- Protein, verschiebt durch Hydrolyse die verbrauchte
tRNA von der P- zur E- Stelle und stellt damit die Ausgangssituation zu Beginn der Elongation
wieder her. Ferner wird die daran assoziierte mRNA um ein Triplett verschoben.
3) Termination. Sie wird durch das Auftreten der Codons UAG, UAA oder UGA ausgelöst, für
die es keine passenden tRNAs gibt. An deren Stelle treten die Terminationsfaktoren
(releasing factors) RF1 (an UAG oder UAA) und RF2 (an UAA oder UGA), welche vom Faktor
RF 3 dahin vermittelt werden. Um die letzte veresterte AS zu lösen, wird von den RFs genau
ein Molekül Wasser zum Ribosom transportiert, welches die Spaltungsreaktion dann selbst
als
Katalysator
begünstigt.
Bei
der
Termination
werden
außerdem
beide
Ribosomuntereinheiten wieder voneinander gelöst.
12
Abbildung 6: Translationsvorgang im Ribosom (cartoonhaft und ohne E- Stelle dargestellt. Stand: 02.12.11
Quelle: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/88/Ribosom_mRNA_translation_de.svg
Der Ablauf der Translation unterscheidet sich bei eu- und prokaryotischen Zellen. In
Eukaryoten gibt es keine fMet-tRNA, sondern eine unformylierte Initiator- Met- tRNA. In
Prokaryoten gibt es Shine- Dalgarno- Sequenzen auf der mRNA, die reich an purinhaltigen
Basen sind. Dadurch wird dem Ribosom vermittelt, an welcher AUG- Stelle es das
Formylmethionin setzen muss, da AUG auch in Prokaryoten normalerweise die AS Methionin
kodiert. Bei Eukaryoten übernimmt die Kozak- Sequenz diese Aufgabe. Diese bildet einen
Konsens aus Nukleinbasen, die häufig in der Nähe des Startcodons AUG auftreten.
Abweichungen von dieser Sequenz können sich auf die Proteinbiosynthese auswirken.
1.7 Der Cotranslationale Transport
Proteine können synthetisiert werden, während sie durch eine Biomembran wandern.
Beispielsweise können Proteine in Eukaryoten durch die Membran des Endoplasmatischen
Retikulums wandern. Dies geschieht durch Vesikeltransport. Nun zum Ablauf:
13
Ein Signalsequenzerkennungspartikel (SRP) bindet an die N-terminale Signalsequenz des
Polypeptids und am Ribosom. Die Synthesegeschwindigkeit wird herabgesetzt, um zu
verhindert, dass das Protein vor Ankunft am ER fertig synthetisiert ist. Das SRP leitet das
Ribosom zur ER- Membran. Dort wird es vom SRP- Rezeptor gebunden. Das Ribosom
interagiert zugleich mit dem Sec61- Komplex, durch den die Proteine später hindurch
befördert werden, um ins Lumen des ER zu gelangen. Unter GTP- Hydrolyse löst sich das SRP
vom Ribosom und dem Protein und übergibt diese an den Translokationsapparat. Im ERLumen kann das Protein seine native Form annehmen. Nach Erkennung durch sog. CurgoRezeptoren wird es hier in Transportvesikel verpackt und weiter transportiert werden. Nun
werden die Proteine zum Golgi- Apparat befördert und ein letztes Mal modifiziert. Danach
werden sie an ihren Bestimmungsort transportiert. In Abbildung 7 wird der Cotranslationale
Transport veranschaulicht.
Abbildung 7: Cotranslationaler Transport. Quelle: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/de/8/80/Cotrans.jpg.
Stand: 02.12.11
Beim Posttranslationalen Proteintransport müssen Proteine nach deren Synthese ebenfalls
durch
eine
Membran
transportiert
werden.
Verschiedene
Signalsequenzen
an
unterschiedlichen Orten im Protein dienen dazu, vom Zielort erkannt zu werden und damit
14
die richtige Membran zu passieren. Solche Zielorte können Organellen wie Mitochondrien,
aber auch der extrazelluläre Raum. Beim posttranslationalen Proteintransport kommen im
Gegensatz zum cotranslationalen eher hydrophilere Signalsequenzen zum Einsatz. Diese
Sequenzen werden im Allgemeinen nach Durchqueren der Membran abgespalten.
1.8 Posttranslationale Modifikation
Hierbei handelt es sich um Proteinveränderungen, die nach der Translation stattfinden. Dies
kann gewollt, aber auch ungewollt auftreten, beispielsweise durch die Einwirkung von
Radikalen oder von radioaktiver Strahlung. Beispiele für posttranslationale Modifikationen
sind phosphorylierungen durch Proteinkinasen oder das Ausbilden einer Disulfidbrücke
zwischen zwei Cysteinresten. Auch werden Enzymproteine in diesem Schritt an ihre
Cofaktoren gebunden oder Signalsequenzen abgespaltet, wenn ein Protein seinen Zielort
erreicht hat. Kurzum: Es gibt eine große Vielfalt posttranslationaler Modifikationen.
2. Versuchsdurchführung
Grundsätzlich kann zur Durchführung das Praktikumsskript zu Rate gezogen werden. Einige
Details wurden jedoch in der Praxis verändert. Die Versuchsabwandlungen werden in diesem
Abschnitt wiedergegeben.
2.1 SDS- PAGE
Zu Beginn soll kurz das Prinzip einer diskontinuierlichen Natrium- DodecylsulfatGelelektrophorese (= SDS- PAGE) erläutert werden. Hierbei handelt es sich um eine Methode
zur Auftrennung von Proteinen und kleinen Nukleinsäuren. Das Verfahren ist bekannt für
seine hohe Auflösung, die durch Verwendung von Polyacrylamid anstelle von Agarose erzielt
wird. Das eingesetzte SDS übernimmt zwei wichtige Aufgaben: Einerseits denaturiert es die
Proteine und andererseits umschließt es diese, indem sich ein SDS- Molekül an circa 3 ASReste anlagert. Dies hat eine Maskierung der Eigenladung der Proteine zur Folge, wodurch
eine Trennung nur noch durch das Molekulargewicht erfolgt. Leichtere Proteine wandern
weiter wie schwerere. Das Acrylamid wird nach Polymerisation zum Gel. Das Gel besteht aus
einem engeren Gitternetz, dem Trenngel und einem weitmaschigeren Gitternetz, dem
Sammelgel. Das Sammelgel hält die nicht abzentrifugierten Zellfragmente und nicht
denaturierte Proteine zurück. Vor allem die Diskontinuität des pH- Wertes zwischen den
15
beiden Gitternetzen ist für deren Eigenschaften entscheidend. Aufgrund der chemischen
Beschaffenheit des SDS wandern alle Proteine mehr oder weniger schnell zur Anode. Es
muss ein Puffer eingesetzt werden, da das Gel Wasser enthält, welches unter der angelegten
Spannung an der Spannungsquelle in seine Bestandteile zerfällt. An der Kathode entstehen
Wasserstoff und Hydroxidionen und an der Anode Sauerstoff und Hydronium- Ionen, die
ungepuffert das Ergebnis der SDS- Page verfälschen würden. Zum Anfärben der Proteine
wurde Coomassie Brilliant Blue zugegeben. Abbildung 8 zeigt die prospektive Laufweite des
Proteinmarkers. Je nachdem, wie schwer das Protein ist, an dem der Marker bindet, kann
dieser weiter oder weniger weit „wandern“.
Abbildung 8: Proteinmarker
2.2 PAL- Enzymaktivität und Proteinkonzentration
Es wurden 2 analoge Lösungen für etiolierte und nichtetiolierte Pflanzen hergestellt. Dazu
wird wie folgt vorgegangen:
0,4 ml Pflanzenextrakt wurden mit 0,4 ml Boratpuffer vermischt. Davon wurden 0,5 ml mit
0,5 ml Bradford – Lösung verdünnt, wovon wieder 0,5 ml mit 0,5 ml Bradford – Lösung
verdünnt wurden. Hiervon werden dann 1 ml photometrisch untersucht. Das bedeutet, dass
sich noch 62,5 µl Extrakt in der Lösung befinden und dieser 8 mal verdünnt wurde. Danach
wurden die Proben ins Photometer überführt (Siehe hierzu auch das Praktikumsskript).
16
2.3 Anthocyanbestimmung
Der Anthocyangehalt wurde photometrisch bei einer Wellenlänge von 515 nm bestimmt. Es
wurde wie vom Skript vorgeschlagen vorgegangen.
2.4 Leucocyanbestimung
Hierbei wurden die enthaltenen Leucocyane durch Dehydratisierung mit dreiwertigem Eisen
in saurem Millieu zu farbigen Cyanidin umgesetzt. Bei der Durchführung wurde wie im Skript
vorgeschlagen vorgegangen.
3. Ergebnisse
3.1 SDS- PAGE
Um die SDS- Page zu beschleunigen, wurde zuerst eine Spannung von 120 V und dann eine
Spannung von 200 V über den Zeitraum von ca. zwei Stunden angelegt.
Wie in Abbildung 9 ersichtlich wird, ist auf dem Gelbild lediglich eine Markerbande zu
erkennen, nicht aber die angefärbten Proteinstandorte. Dadurch ist kein Rückschluss auf die
in der Probe enthaltenen Gewichte, bzw. Orten einer Proteinakkumulation möglich.
Mögliche Fehlerquellen beim Vorgehen werden unter Abschnitt 4 diskutiert.
Abbildung 9: Ergebnis der Gelelektrophorese
3.2 PAL- Enzymaktivität und Proteinkonzentration
17
Es wurde eine Tabelle (Tabelle 1) zum Verlauf der Extinktion über die Zeit angelegt:
Tabelle 1: Verlauf der Extinktion bei Sinapis alba
Zeit [min]
0
0,263
0,247
10
0,262
0,245
20
0,261
0,246
35
0,260
0,245
40
0,261
0,245
Zeit [min]
50
0,260
0,245
60
0,266
0,250
70
0,266
0,249
80
0,268
0,250
90
0,268
0,250
Es lässt sich sowohl bei den etiolierten als auch bei den belichteten Pflanzen eine Zunahme
der Extinktion des Lichtes erkennen. Die Extinktion etiolierter Pflanzen ist höher als die der
belichteten Pflanzen.
Anhand der erhaltenen Ergebnisse wurde ein Diagramm angelegt, das den Extinktionsverlauf
grafisch veranschaulicht:
Diagramm 1: Grafik zum Extinktionsverlauf bei belichteten und unbelichteten Senfkeimlingen
18
0,27
0,265
Extinktion E
0,26
0,255
0,25
E unbelichtet
0,245
E belichtet
0,24
0,235
0,23
0
10
20
35
40
50
60
70
80
90
Zeit [min]
Es wird ersichtlich, dass der Anstieg der Extinktion nicht linear verläuft. Vielmehr handelt es
sich um einen schwankenden Anstieg der Extinktion. Generell wäre ein linearer Anstieg zu
erwarten.
Mit dem Lambert – Beer’schen Gesetz kann nun auf die Konzentration der im Extrakt
enthaltenen Zimtsäure geschlossen werden. Dies geschieht wie folgt:
= ∙ ∙ → Δä = ∙ ∙ .
mit ä = 10 ²/
(Extinktion der Zimtsäure), d = 1cm (Küvettendicke) und
. = 13 (Grad der Verdünnung)
Da sich die vorhandene Menge der PAL- Enzyme und deren Aktivität nicht direkt bestimmen
lässt, muss ein Umweg genommen werden. Mithilfe der Bradford- Bestimmung lässt sich die
im Extrakt enthaltene Gesamtproteinmenge bestimmen. Folgende Tabelle wird zu Rate
gezogen:
Tabelle 2: Messwerte zur Berechnung der Gesamtproteinkonzentration
BSA-Lösung in µg/ml
Mittelwert der Extinktionswerte
2
0,091
4
0,165
19
6
0,250
8
0,332
10
0,422
14
0,602
18
0,761
Anhand dieser Werte ließ sich Diagramm 2 erstellen. Ein nichtlinearer Graph entsteht.
Mithilfe
einer
Kalibrierungsgerade
wird
sich
der
in
der
Küvette
enthaltenen
Proteinkonzentration relativ präzise und mathematisch simpel angenähert:
Diagramm 2: Grafik zum Extinktionsverlauf bei belichteten und unbelichteten Senfkeimlingen
20
Mittelwert der Extinktionen E
18
y = 2,571x - 1,429
16
14
12
10
8
6
4
2
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
β(BSA) [µg/ml]
Durch Umstellen der Geradengleichung wird nach der enthaltenen Proteinmasse aufgelöst:
=
,
, → !
=
+1,4286
2,5714/µ
20
Die nachfolgende Tabelle zeigt die gemessenen Extinktionen, die berechneten enthaltenen
Proteinmassen und die Proteinmassenkonzentration des Extrakts (= !
), welche sich
mit !
"#
$"
=
ಸ೐ೞೌ೘೟೛ೝ೚೟೐೔೙೘೐೙೒೐
%,
berechnen lässt:
Tabelle 3: Enthaltene Proteinmassen und daraus resultierende Proteinmassenkonzentrationen in etiolierten und
belichteten Extrakten
Enthaltene Proteinmasse [mg/ml]
!
[mg/ml]
0,467
0,369
0,921
0,289
0,334
0,835
Die Extinktion etiolierter Pflanzen ist beinahe doppelt so hoch wie die der belichteten. Auch
die Proteinmasse und die Proteinkonzentration ist bei etiolierten Pflanzen höher.
Nun kann in die Formel für die PAL- Enzymaktivität eingesetzt werden:
' =
Δä [
]
∙ (")
* [
]
1) etioliert:
Δä = ∙ ∙ . =
' =
Δܼ݅݉‫ݏݐ‬ä‫[ ݁ݎݑ‬
0,268−0,263
107 ܿ݉2
∙1+,
݉‫݈݋‬
݉‫݈݋‬
]
݈݉
∙ 13 = 6,5
-,./
,/
, /
೘೒
01∙ಸ೐ೞೌ೘೟೛ೝ೚೟೐೔೙೘೐೙೒೐ [ ]
೘೗
= 2% 345∙%,2*/ = 7,84 ∙ 10 345∙*
2) belichtet:
0,25−0,247
Δä = ∙ ∙ . = 107 ܿ݉2
݉‫݈݋‬
' =
Δܼ݅݉‫ݏݐ‬ä‫[ ݁ݎݑ‬
∙ 13 = 3,9
∙1+,
݉‫݈݋‬
]
݈݉
-,./
,/
,2
/
೘೒
]
೘೗
01∙ಸ೐ೞೌ೘೟೛ೝ೚೟೐೔೙೘೐೙೒೐ [
= 2% 345∙%,
*/
= 5,19 ∙ 10 345∙*
Aus der Gesamtproteinmenge von 1 mg im Extrakt einer belichteten Pflanze setzt das PALEnzym 5,19 ∙ 10 mol Phenylalanin pro Minute zu Zimtsäure um. Bei etiolierten Pflanzen
sind es 7,84 ∙ 10 mol.
21
3.3 Anthocyanbestimmung
Für die Berechnung der Anthocyankonzentration % gilt:
1,00 [E] ≈ 0,37 µmol/ml = % . Daraus folgt: % = ∙ 0,37μ
/
Unsere gemessen Extinktionen sowie die Stoffmenge an Anthocyan in der Probe wurden in
Tabelle 2 festgehalten:
Tabelle 4: Extinktion zur Antocyanbestimmung und die daraus resultierende Stoffmenge
Lösung
E
% [nmol/ml]
0,160
59
0,246
91
Es wird ersichtlich, dass die Extinktion der belichteten Pflanze beinahe doppelt so hoch ist
wie die der etiolierten. Als Folge daraus ist in den belichteten Pflanzen ein höherer
Anthocyangehalt nachzuweisen.
3.4 Leucocyanbestimung
Zuerst
muss
6. =
der
("ö*
%, '7"#
Verdünnungsgrad
des
Extrakts
bestimmt
werden:
= 20. Wieder gilt:
1,00 [E] ≈ 0,37 µmol/ml = . Durch Umstellen der Formel und Subtraktion der bereits
vorhandenen Anthocyane ergibt sich die in der Probe enthaltene Leucocyanstoffmenge:
= ∙ 0,37μ
∙ 6. − %
Die Ergebnisse wurden in Tabelle 5 festgehalten:
Tabelle 5: Extinktion zur Leucocyanbestimmung und die daraus resultierende Stoffmenge
Lösung
E
% [nmol/ml]
[nmol/ml]
0,015
59
52
0,035
91
168
22
Wieder erhält wird bei dem Extrakt aus belichteten Pflanzen eine höhere Extinktion, die sich
auf die Menge der nachgewiesenen Leucocyane auswirkt, nachgewiesen (Siehe hierzu
Tabelle 5). Der Leucocyangehalt belichteter Pflanzen ist mehr als dreimal so hoch wie der
der etiolierten.
4. Diskussion
4.1 SDS- PAGE
Bei diesem Verfahren sollte die unterschiedliche Proteinlandschaft von etiolierten und
belichteten Keimlingen nachgewiesen werden. Dies konnte nicht gezeigt werden, da auf dem
fertig entwickelten Gel lediglich ein blauer „Strich“, nämlich die Markerbanden zu erkennen
sind. Es gibt mehrere Gründe, warum keine Proteinbanden zu erkennen sind:
1) Fehler bei der Anfärbung: Möglicherweise wurden Fehler bei der Anfärbung des Gels
gemacht. Hierbei ist es wichtig, dass das Gel vor jedem Waschschritt in der Mikrowelle
ausreichend erhitzt wird. Entweder ist hierbei nicht die erwünschte Temperatur erreicht
worden, oder das Gel wurde gekocht, was zu einer erheblichen Verfälschung der
Proteinbanden führt.
2) Keine Bindung der Proteine zum Farbstoff: Coomassie- Brillant- Blue lagert sich an die
basischen Seitenketten der Aminosäuren an. Um dies zu garantieren, wird ein Puffer in der
SDS- Page eingesetzt, um die Bindungsstellen aktiv zu halten. Möglicherweise war die
Zusammensetzung des Puffers versehentlich falsch und es herrschte nicht der richtige pH im
System. Ferner kann es zu diesen „Negativbanden“ gekommen sein, weil es sich
gegebenenfalls um schwer zu färbende Proteine gehandelt haben könnte, die nur schwer
eine Bindung zum Farbstoff ausbilden.
3) Pipettierfehler: Es ist möglich, dass bei Vorbereitung der SDS- PAGE falsch pipettiert
wurde. Das kann zum einen bedeuten, dass die falschen Mengen der benötigten Agenzien in
die Taschen gegeben wurden, oder, dass die falschen Lösungen verwendet wurden.
4) Zu kurze Entfärbungsphase: Das Gel wurde im letzten Schritt mit einer EssigsäureEthanol- Lösung entfärbt. Zu kurzes Entfärben, kann dazu führen, dass die Banden nicht
erkennbar werden, da kein ausreichender Kontrast zum Hintergrund besteht.
23
4.2 PAL- Enzymaktivität und Proteinkonzentration
Sowohl in belichteten als auch in unbelichteten Keimlingen konnte die Aktivität des PALEnzyms nachgewiesen werden. Phenylalanin- Amonium- Lyase setzt die Aminosäure
Phenylalanin in trans- Zimtsäure um. Trans- Zimtsäure ist ein wichtiges Intermediat des
Sekundärmetabolismus, von dem aus sowohl Phenylpropanoide als auch Flavonoide wie
Leucocyane und schließlich Anthocyane synthetisiert werden können. Dabei ist die
Enzymaktivität in belichteten Pflanzen ungefähr viermal so hoch wie in etiolierten. Das liegt
daran, dass der Stoffwechsel bei belichteten jungen Keimlingen mehr auf die Synthese von
Anthocyanen ausgelegt ist. Warum die Proteinmassenkonzentration in etiolierten Pflanzen
höher sein sollte wie in belichteten lässt sich nicht mit Sicherheit sagen, da vor allem der
Stoffwechsel belichteter Pflanzen auf Hochtouren läuft, um möglichst schnell Gewebe für die
Photosynthese aufzubauen und Lichtenergie nutzen zu können. Es könnte aber sein, dass die
beiden Küvetten miteinander vertauscht haben, da unglücklicherweise auf deren
Markierung verzichtet wurde. Zudem könnte ein Pipettierfehler beim Verdünnen entstanden
sein. Eine mögliche Erklärung liegt in den Speicherproteinen. Etiolierte Pflanzen benötigen
diese, um Energie zu erhalten. Belichtete Pflanzen enthalten zwar auch Speicherproteine,
jedoch weniger, da sie sich durch die Synthese von energiereicher Glucose mittels
Photosynthese selbst versorgen können.
4.3 Anthocyanbestimmung
Aus den Ergebnissen geht hervor, dass der Gehalt an Anthocyanen in belichteten Pflanzen
beinahe doppelt so hoch ist wie in unbelichteten. Der Grund für eine verstärkte Aktivität
dieses Sekundärstoffwechselweges ist, dass die Anthocyan- Farbstoffe die junge Pflanze vor
schädlicher UV- Strahlung schützen, die sonst durch Radikalreaktionen die DNA schädigen
könnte.
In
etiolierten
Keimlingen
spielen
die
Anthocyane
und
der
gesamte
Sekundärmetabolismus eine untergeordnete Rolle. Anthocyane werden höchstens präventiv
in ihrer Vorstufe als Leucocyane im Organismus gespeichert, bis sie benötigt werden. Für die
etiolierten Pflanzen ist dies naheliegender, da sie sich bereits unter ungünstigen
Bedingungen entwickeln müssen und von ihren Proteinreserven zehren müssen. Daher
können
sie
weniger
Energie
in
momentan
„unwichtige“
Stoffwechselprozesse
24
verschwenden. Eine weitaus geringere Anthocyansynthese hilft der der etiolierten Pflanze
also ihre Überlebenschancen zu steigern, bzw. konkurrenzfähig zu werden.
4.4 Leucocyanbestimung
Die in 3.2 und 3.3 vorgebrachten Behauptungen werden weiter von der Tatsache
untermauert, dass belichtete Pflanzen mehr als die dreifache Stoffmenge an Leucocyanen
besitzen, wie etiolierte.
Es wurde bei etiolierten Pflanzen eine geringfügig höhere
Stoffmenge von Anthocyanen als die von Leucocyanen bestimmt. Dies trifft in der Realtät
vermutlich nicht zu. Etiolierte Pflanzen nutzen Leucocyane als Speicherproteine zur
Energiegewinnung, nicht aber Anthocyane. Mithilfe des Enzyms Oxygenase können
Leucocyane in Succinat umgewandelt werden. Succinat ist ein Intermediat des Citrat- Zyklus,
aus dem Reduktionsäquivalente gewonnen werden können, welche in der Atmungskette
dann die ATP- Synthese antreiben und damit Energie liefern. Mögliche Fehlerquellen sind:
1) Das Benutzen von Pflanzenextrakten verschiedener Testkörbchen, die möglicherweise
unterschiedlich behandelt worden sind. Vermutlich kam es auch zu einem Lichteinfluss beim
Arbeiten, u.a. beim zeitaufwändigem „Ernten“ des Hypokotyls.
2) Messfehler am Photometer.
5. Zusammenfassung
Bis auf die SDS- PAGE haben alle Versuche grob unseren Erwartungen entsprochen. Es wurde
ein deutlicher Unterschied der PAL- Enzymaktivität und damit der Leuco- und
Anthocyansynthese zwischen etiolierten und nicht etiolierten Pflanzen beobachtet. Daraus
folgten dann auch ein höherer Anthocyan- und Leucocyangehalt in belichteten Pflanzen.
Etiolierte und belichtete Keimlinge wiesen in etwa die Selbe Proteinkonzentration auf, es
wurde aber erarbeitet, dass es sich hierbei um verschiedene Arten handelt.
6. Quellen
1) Stryer; Biochemie 6.Auflage 2007 Spektrum akademischer Verlag
2) Heß, Dieter; Pflanzenphysiologie, 10. Auflage, 1999, Ulmer Verlag
25
3) Skript zum Grundpraktikum Pflanzenphysiologie und molekulare Botanik WS 2011/12
4) Campbell, Neil A.; Biologie, 2. Korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum Verlag
5) www.wikipedia.de
26