Thema44 Replikation PCR 12

Biochemieseminar 4.4: Replikation und PCR
4.4
erstellt von H. Wolfes und J. Alves
Replikation und PCR
Ablauf der Replikation in vivo: Die Replikation wird von einer DNA-abhängigen DNAPolymerase katalysiert. Jede DNA-Polymerase synthetisiert den neuen Strang in 5’3’
Richtung, hierzu werden die Nukleotidbausteine dATP, dCTP, dGTP und dTTP benötigt. Das
Enzym benötigt ferner einen doppelsträngigen Bereich, an dem es die Synthese starten kann.
Der kurze doppelsträngige Bereich wird mit einem RNA-Primer, einem kurzen
Oligonukleotid erzeugt.
Während der Synthese synthetisiert die Polymerase den neuen Strang in 5’3’ Richtung und
bewegt sich in 3’5’-Richtung am Matrizenstrang entlang:
Bei der Replikation erfolgt die DNA-Synthese am Doppelstrang. Weil die DNA antiparallel
ist, gibt es am Führungsstrang eine kontinuierliche, am Verzögerungsstrang eine
diskontinuierliche Synthese:
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Die replikative DNA-Polymerase (in Bakterien die DNA-Polymerase III), synthetisiert
kontinuierlich am Führungsstrang. Am Verzögerungsstrang werden durch die Primase RNAPrimer synthetisiert, die dann von der replikativen DNA-Polymerase zu Okazakifragmenten
verlängert werden:
Am Verzögerungsstrang werden mehrere Okazakifragmente gebildet. Die RNA-Primer an
ihrem Anfang werden abgebaut und eine Reparatur-DNA-Polymerase (in Bakterien die DNAPolymerase I) füllt die entstandenen Lücken mit DNA auf:
Die letzte Phosphodiesterbindung wird durch die Ligase geschlossen.
Proteine
an
der
Replikationsgabel:
Neben der replikativen und der Reparatur-DNA-Polymerase, der Primase und
der Ligase gibt es weitere Hilfsenzyme
an der Replikationsgabel:
Die DNA-Helikase entwindet den ElternDNA-Doppelstrang in zwei Einzelstränge. Sie erzeugt dabei vor der Replika-
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tionsgabel ein positives Supercoil, das durch Topoisomerasen bereinigt werden muss. Damit
sich der Verzögerungsstrang nicht zu stabilen Haarnadelstrukturen rückfaltet, wird er durch
Einzelstrangbindungsproteine (Single-stranded binding Protein, SSB) stabilisiert.
Polymerasekettenreaktion (PCR) = Replikation in vitro: Der DNA-Doppelstrang kann durch
Hitze in die beiden Einzelstränge zerlegt werden.
Je kürzer die Doppelhelix ist, desto niedriger liegt auch der Schmelzpunkt. Bei hohen
Temperaturen (95°C) liegen auch lange DNA-Helices als Einzelstränge vor:
Die PCR läuft zyklisch ab: zunächst wird bei hoher Temperatur der DNA-Doppelstrang in
Einzelstränge denaturiert. Von dieser DNA müssen zwei Sequenzen bekannt sein, an die die
Primer binden (hybridisieren) können. Dies erfolgt bei niedrigerer Temperatur. Nun sind
Doppelstränge gebildet, an denen die Polymerase die Synthese beginnen kann:
Die Voraussetzungen zur Synthese sind die gleichen wie bei der Replikation in vivo: Eine
DNA-abhängige Polymerase synthetisiert einen neuen Strang in 5’3’ Richtung mit einem 3’
OH-Ende, hierzu werden die Nukleotidbausteine dATP, dCTP, dGTP und dTTP benötigt. Das
Enzym benötigt ferner einen doppelsträngigen Bereich, an dem es die Synthese starten kann.
Der kurze doppelsträngige Bereich wird mit einem DNA-Primer, einem synthetischen
Oligonukleotid erzeugt. Die PCR-Reaktion wird so oft wiederholt, bis die gewünschte Menge
DNA produziert worden ist.
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Bestandteile einer PCR-Reaktion:
•
zu untersuchende DNA, von der mindestens zwei kurze Bereiche bekannt sein
müssen, hier werden die Primer binden
•
Taq-Polymerase (hitzestabile DNA-Polymerase)
•
2 DNA Primer (Oligodesoxynukleotide, ca 20 Basen lang)
•
Puffer, Synthesebausteine: dATP; dCTP; dGTP; dTTP
Die PCR Reaktion läuft in 3 Schritten ab:
Wichtig: Bei Schritt drei werden zunächst DNA-Fragmente mit einem definierten 5’-Ende
und einem unbestimmten 3’-Ende produziert. Dies ändert sich, wenn ein zweiter Zyklus
durchlaufen wird, da dann zum ersten Mal Fragmente synthetisiert werden, die am Ende des
Templates aufhören. Diese werden dann exponentiell weiter amplifiziert.
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Theoretisch wird in jedem Schritt der PCR die DNA Menge verdoppelt. Dies gilt aber
praktisch nur bis zu etwa 20 Zyklen, weil dann die Enzym-, Primer- und DNA-Mengen
begrenzend werden (Plateauphase). Daher werden üblicherweise nicht mehr als 25-30 Zyklen
durchgeführt.
Anwendungsbeispiele:
Nachweis viraler RNA (RT-PCR): Seit 1. 6. 1999 ist das Screening aller Plasmapools in der
EU auf das Vorhandensein von HCV RNA (Hepatitis C Virus) obligatorisch. Hierzu muss die
virale RNA in eine cDNA (copy DNA)
umgeschrieben werden. Dies erfolgt durch das
Enzym Reverse Transkriptase:
An der cDNA kann nun eine normale PCR
Reaktion ausgeführt werden. Der Nachweis ist
erbracht, wenn mit HCV-spezifischen Primern
ein Produkt der richtigen Länge erzeugt werden
kann.
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Nachweis der Chromosomentranslokationen bei CML (Chronische Myeloische Leukämie):
Bei mehr als 95% der Patienten mit Chronischer
myeloischer Leukämie ist
das BCR Gen (Chromosom 22) mit dem ABLGen (Chromosom 9) fusioniert. Das resultierende
Philadelphia-Chromosom
kann auch im Karyotyp nachgewiesen werden. Die Translokation kann durch zwei PCR
Primer, von denen einer auf Chromosom 22 und der andere auf Chromosom 9 hybridisiert,
nachgewiesen werden. Nur bei der Translokation erhält man ein definiertes PCR Produkt.
Nachweis von bakteriellen Kontaminationen: Die klassische Methode zum Nachweis eines
Bakterienstammes erfordert die Anzucht der Bakterien sowie eine spezifische Farbreaktion.
Die Untersuchung kann bis zu drei Tage dauern. Der PCR-Nachweis erfolgt mithilfe eines
Primerpaares das spezifisch für den betreffenden Stamm ist, innerhalb von wenigen Stunden.
In der MHH sind Nachweise von Mykobakterien, EHEC und anderen seltenen Erregern
etabliert.
Nachweis einer HIV-Infektion (nested PCR): Die in das Wirtsgenom integrierte DNA des
Humanen Immundefizienz-Virus lässt sich
über eine PCR-Reaktion nachweisen. Ein
positives Ergebnis ist hierbei eine DNA einer
bestimmten Länge. Um den Nachweis empfindlicher zu gestalten, wird eine zweite
PCR-Reaktion mit der DNA aus der ersten
Reaktion als Template durchgeführt. Außerdem besteht die Chance, dass ein Primerpaar an einer anderen Stelle im Genom zufälliger-6-
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weise ein Produkt der gewünschten Länge erzeugt (falsch positives Ergebnis). Deshalb wird
in der zweiten PCR ein neues Primerpaar eingesetzt, das innerhalb der erzeugten
Primärsequenz hybridisiert (nested PCR). Es ist unwahrscheinlich, dass das zweite Primerpaar
innerhalb des falsch positiven Produktes passt. Neben HIV werden in der MHH eine ganze
Reihe weiterer Viren (z. B. Cytomegalo-Virus (CMV), Hepatitis-B-Virus (HBV), HepatitisC-Virus (HCV), verschiedene Herpesviren, Influenzaviren, Noroviren und weitere) über PCR
nachgewiesen.
Grundlegende Literatur:
Löffler, Basiswissen Biochemie, 7. Auflage S. 220-228
Löffler Petrides Heinrich, Biochemie & Pathobiochemie, 8. Auflage S. 228-236, 247248, 1154-1155
Rassow Hauser Netzker Deutzmann, Biochemie, 3. Auflage S. 425-431, 482-484
Themen, die im Vortrag angesprochen werden sollten:
Ablauf der Replikation in vivo
Ablauf der PCR
PCR-Anwendungen
• Nachweis viraler RNA (RT-PCR)
• Nachweis von Chromosomentranslokationen (z.B. bei CML)
• Nachweis von bakteriellen Kontaminationen
• Nachweis einer HIV-Infektion (nested PCR)
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